CN116239679B - 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116239679B
CN116239679B CN202211657669.9A CN202211657669A CN116239679B CN 116239679 B CN116239679 B CN 116239679B CN 202211657669 A CN202211657669 A CN 202211657669A CN 116239679 B CN116239679 B CN 116239679B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
aav
antigen
binding fragment
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211657669.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116239679A (zh
Inventor
王成
潘兴华
和会娟
周晓晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Innovic Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Innovic Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Innovic Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Beijing Innovic Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority to CN202211657669.9A priority Critical patent/CN116239679B/zh
Publication of CN116239679A publication Critical patent/CN116239679A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116239679B publication Critical patent/CN116239679B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human Parvovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了能够靶向多种血清型腺相关病毒(AAV)的纳米抗体或其抗原结合片段，可用于AAV的检测或纯化。

Description

一种可结合多种AAV血清型的纳米抗体及其应用
技术领域
本文涉及靶向腺相关病毒的抗体，尤其是可靶向多种血清型腺相关病毒的纳米抗体。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是基因治疗主流的载体。不同AAV的血清型可以感染不同的细胞，组织和器官。传统上针对于不同血清型的AAV需要不同的抗体来做相关的检测和纯化，这增加了检测和纯化成本。
发明内容
在一方面，本文提供了靶向多种腺相关病毒(AAV)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列为LYAMG(SEQ ID NO：14)，所述HCDR2的氨基酸序列为VQDLSASNTYYSSAVKG(SEQ ID NO：15)，以及所述HCDR3的氨基酸序列为GPTIMSGNYNSAREYDY(SEQ ID NO：16)。
在一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包括Fc片段。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够靶向AAV5。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够靶向AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8中的至少两种。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够靶向AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO：6或10所示氨基酸序列。
另一方面，本文提供了融合蛋白，其包括一个或更多个抗原结合功能部分，其中所述抗原结合功能部分包括上述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包括检测标签或纯化标签。
另一方面，本文提供了核酸分子，其编码上述抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。
在一些实施方案中，所述核酸分子其包括SEQ ID NO：5或9所示核苷酸序列。
另一方面，本文提供了表达载体，其包括上述核酸分子。
另一方面，本文提供了宿主细胞，其包括上述核酸分子或表达载体，或表达上述抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。
另一方面，本文提供了在样品中检测的AAV方法，其包括让上述抗体或其抗原结合片段或融合蛋白与所述样品接触，并检测所形成的免疫复合物的量。
另一方面，本文提供了检测试剂盒，其包括上述抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。
在一些实施方案中，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及其任意组合。
另一方面，本文提供了固相载体，其表面偶联有上述抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本文提供了纯化AAV的方法，包括：
1)让包括AAV的样品与所述固相载体接触；
2)将所述固相载体与所述样品分离；以及
3)从所述固相载体洗脱所述AAV，
其中所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及其任意组合。
本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段对多种血清型的AAV具有结合亲和力，尤其是AAV5，可用于AAV的检测或纯化。
附图说明
图1显示了AAVi1和AAVi2纳米抗体对多种血清型AAV结合能力测试结果。
图2显示了AAVi1和AAVi2纳米抗体对AAV5亲和纯化时不同pH洗脱结果。
图3显示了用AAVi1和AAVi2纯化AAV5后的纯度检测结果。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
除非上下文明确地另外指出，术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
术语“包含”或“包括”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包括”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“腺相关病毒(AAV)”是细小病毒科的非包膜二十面体衣壳病毒，包括单链DNA病毒基因组。细小病毒科包括依赖病毒属，其包括AAV，依赖于辅助病毒如腺病毒的存在来进行其复制。野生型AAV病毒基因组是一个线性、单链DNA(ssDNA)分子，长度为约5,000个核苷酸(nt)。反向末端重复序列(ITR)通常在5'和3'末端对病毒基因组封端，为病毒基因组提供复制起点。AAV病毒基因组通常包括两个ITR序列。这些ITR具有特征性T形发夹结构。双链发夹结构包括多种功能，包括但不限于通过充当宿主病毒复制细胞的内源DNA聚合酶复合物的引物来充当DNA复制的起点。野生型AAV病毒基因组还包括两个开放阅读框的核苷酸序列，一个为四个非结构性Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，由Rep基因编码)，并且另一个为三个衣壳蛋白VP的亚基编码(VP1、VP2、VP3，由衣壳基因或Cap基因编码)。交替的剪接和交替的起始密码子和启动子导致从单个开放阅读框产生四种不同的Rep蛋白，并从单个开放阅读框产生三种衣壳蛋白。Rep蛋白与复制和包装相关，而衣壳蛋白则组装形成AAV的蛋白外壳或AAV衣壳。VP蛋白由三种亚基VP1、VP2和VP3组成，通过相互作用形成二十面体对称的衣壳。提及AAV情况下所用的术语“血清型”用于指AAV的衣壳蛋白在血清学上不同于其它AAV血清型的区别。血清学独特性的确定通常是基于一种抗体与一种AAV之间具有反应性，而与其他或另一种AAV缺乏交叉反应性。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原表位的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)所致。目前已经发现了多种AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12，以及它们的突变体。本文在提及AAV时，还包括重组AAV(rAAV)，其基因组与野生AAV基因组不同：通过使用分子生物学方法从AAV基因组中去除部分野生型基因(例如Rep基因和Cap基因)，并以异源核酸序列(例如用于治疗目的的蛋白或RNA的编码序列)替换。归因于结构相对简单，能够感染多种细胞(包括静止和分裂细胞)而不整合到宿主基因组中以及其相对温和的免疫原性特征，AAV已被证明可用作生物学工具用于在体内进行目的基因的表达。本文在提及具体的AAV血清型时，例如AAV5，不仅包括野生型AAV5，还包括其各种突变体，只要其能够与本文提供的纳米抗体特异性结合即可。
本文使用的术语“抗体”以它的最广泛意义使用，包括包含一个或更多个特异性结合抗原的抗原结合结构域的免疫球蛋白或其他类型分子，为对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或多肽。抗体的具体实例可包括完整抗体(例如经典四链抗体分子)、单链抗体、纳米抗体、多特异性抗体等。经典抗体分子通常为由2个相同重链和2个相同轻链通过二硫键相互连接组成的四聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。可变区用于识别和结合抗原，恒定区(如Fc片段)用于启动下游效应，比如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在重链和轻链的可变区内，分别有三个局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变异程度，为抗体与抗原结合的关键位置，因而也称为互补决定区(CDR)。CDR的氨基酸序列可以使用本领域公认的编号方案，例如Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact容易地确定。重链的三个互补决定区分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链的三个互补决定区分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。每个重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在一个具体实施方案中，根据Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR序列。
抗体分子的“抗原结合片段”指包括了来源抗体的部分序列(尤其是CDR序列)并且同时具有来源抗体结合特异性的多肽。该抗原结合片段通常至少包括来源抗体的重链可变区，并具备抗原结合能力。抗原结合片段的形式有多种，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)等。本领域技术人员已知如何获得这些抗原结合片段。例如，经典抗体分子可经木瓜蛋白酶消化而得到Fab片段，经胃蛋白酶消化得到F(ab’)2，通过以还原剂处理断开F(ab’)2铰链区之间的二硫键而形成Fab’片段。“单链抗体(scFv)”是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。
“纳米抗体(nanobody)”，也称“单域抗体(single domain antibody，sdAb)”或“VHH抗体”，指具有抗原结合能力，包括重链可变区而无轻链的抗体分子。从结构上看，纳米抗体也可以认为是经典四链抗体分子的片段。纳米抗体首先在骆驼科动物中被发现，随后，研究人员通过抗体库(例如噬菌体展示文库)筛选发现了更多的具有抗原结合能力的纳米抗体。纳米抗体相对于普通抗体分子(例如，经典抗体分子)具有一些优势，例如包括但不限于：分子量更小，使用于人体时易于到达普通抗体分子难以到达的组织或部位，或者，能够接触到蛋白或多肽中普通抗体分子难以接触到的抗原表位；更加稳定，能够耐受例如温度和pH的变化以及变性剂和蛋白酶的作用。
术语“融合蛋白”指人为生成(例如通过基因工程技术)的由至少两个不同肽段构成的蛋白分子。这些肽段在自然界中不存在，或者不存在于同一个蛋白分子中。常见的包括抗体片段的融合蛋白的实例包括多特异性抗体、用于免疫检测的酶标抗体等。
术语“表位”，也称为“抗原决定簇”，指抗原上与对应抗体分子结合的部位。表位可以为序列表位或构象表位。序列表位由连续排列的氨基酸残基构成。构象表位则包括不连续排列的氨基酸残基，但它们在空间上彼此接近可形成特定构象，例如，多肽中，在该多肽的主要序列上不相邻、但在该多肽的三级或四级结构中彼此足够靠近以被相应抗体识别并结合的氨基酸残基。
“Fc片段”指Y”形抗体分子的柄部区域，即可结晶片段(fragmentcrystallizable，Fc)包括重链的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3结构域)。可通过蛋白水解酶(如木瓜蛋白酶)水解抗体分子得到抗体Fc区。在一些实例中，Fc区可包含铰链、CH2和CH3。当Fc区包含铰链时可介导两个含Fc的多肽之间的二聚化。Fc片段可来自IgG、IgM、IgD、IgE或IgA。在一些实例中，Fc区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。“Fc片段”还包括来自天然Fc片段，经改动但仍保持其效应功能的变体Fc片段。“变体Fc片段”包含在天然Fc片段的氨基酸序列上具有至少一个氨基酸变动的氨基酸序列。
对于抗体或其抗原结合片段来说，术语“靶向”或“特异性结合”指，相对于环境中同时存在的其他分子，一种分子(例如抗体或其抗原结合片段)对另一种分子(如抗原)具有更高的结合亲和力。一种分子可以靶向、针对或特异性结合一种以上的分子，如果这些分子中包括相同或相似的抗原表位。可以通过一些参数测量来衡量抗体对抗原的结合亲和力，例如在酶联免疫吸附测定(ELISA)中测定抗体与抗原结合的EC50值。EC50指引起50％最大效应的浓度。用于表示抗体分子与对应抗原的结合能力时，可指产生最大检测信号(如比色或荧光强度)一半时的抗体分子浓度。EC50值越低，则与抗原的结合亲和力越大。
提及抗体或其抗原结合片段时，本文所用的术语“变体”或“功能性变体”指，在母体抗体分子基础上引入一个或多个氨基酸插入、缺失或替换后所获得的蛋白，其仍然保留了母体抗体分子的至少部分功能(尤其是所关注的功能，例如与对应抗原的结合能力)。例如，抗体分子的性变体可保留其母体抗体分子对抗原结合能力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或甚至具有比母体抗体分子更高的结合能力。在一些实施方案中，抗体分子的变体可保留其母体抗体分子对抗原结合亲和力的至少80％、85％、90％、95％或甚至100％或以上。对于抗体分子或其抗原结合片段来说，其变体通常包括在可变区骨架序列和/或恒定区存在氨基酸改变，但并不排除可对CDR区序列进行一个或少数几个氨基酸改动。因此，本领域技术人员还可以理解的是，在本文提供的具体抗体序列基础上，可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与相应抗原的结合能力或生物学活性，从而获得本发明提供的纳米抗体的相应变体，这些变体也应包括在本发明的范围内。
本文中，术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA和PNA。“核酸序列”指包含于核酸分子或多核苷酸中的核苷酸线性序列。
术语“载体”指可经工程改造以含有目的多核苷酸(例如目的多肽的编码序列)的核酸分子或可在宿主细胞中复制的核酸分子(例如，核酸、质粒或病毒等)。载体可包括以下组件中的一个或更多个：复制起点、一或更多个调控目的多核苷酸的表达的调控序列(诸如启动子和/或增强子)和/或一个或更多个可选择标记物基因(诸如抗生素抗性基因和可用于比色分析中的基因，例如β-半乳糖)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达目的多肽的载体。
“宿主细胞”指可为或已为载体或经分离多核苷酸的接受体的细胞。
靶向AAV的抗体或其抗原结合片段
本文提供了特异性结合AAV或其VP蛋白的抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段以相对较高的结合亲和力结合VP蛋白。例如下文实施例中所阐述的，本文提供的抗体或其抗原结合片段与AAV或其VP蛋白的结合亲和力可通过诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)的测定方法来进行测量。另外，也可通过本领域已知的其他蛋白相互作用测定方法来测定，例如，生物膜层干涉(BLI)技术。
在一些实施方案中，该抗体为纳米抗体。在一些实施方案中，该纳米抗体为通过免疫羊驼获得。在另一些实施方案中，该纳米抗体噬菌体展示文库获得。在已知抗体序列后，该纳米抗体通过基因工程技术获得，例如通过向宿主细胞中引入表达该抗体或其抗原结合片段的表达载体并培养所述宿主细胞而获得。本文提供的纳米抗体的一个特性是其能够同时靶向多种血清型的AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8。
在一些实施方案中，本文提供的靶向多种血清型AAV的纳米抗体的重链CDR序列，它们分别如SEQ ID NO：11-13所示。该纳米抗体能够同时靶向多种血清型的AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8。
在一些实施方案中，本文提供的靶向多种血清型AAV的纳米抗体的重链CDR序列，它们分别如SEQ ID NO：14-16所示。该纳米抗体能够同时靶向多种血清型的AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8。相对于AAV8，该纳米抗体对AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6和AAV7有更高的结合能力。
在本文已提供这些CDR序列基础上，本领域技术人员可构建各种具有AAV或其VP蛋白结合能力的多肽构建体(包括抗体或其抗原结合片段)，这包括使用来自不同抗体分子的骨架区(FR)和/或恒定区与这些CDR序列进行组合。这些骨架区包括来自人抗体或动物(如小鼠、大鼠、羊、骆驼等)抗体的天然骨架区序列。这些骨架区还可以包括对天然骨架区序列改动所产生的骨架区序列变体。通过使本文提供的CDR序列与不同的骨架区序列组合形成重链可变区，并检测其与AAV或其VP蛋白的结合能力，可容易地获得特异性结合AAV或其VP蛋白的多肽构建体。
在一些实施方案中，本文提供的靶向多种血清型AAV的纳米抗体具有SEQ ID NO：1所示序列，或者与SEQ ID NO：1所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的靶向多种血清型AAV的纳米抗体具有SEQ ID NO：2所示序列，或者与SEQ ID NO：2所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“序列一致性(Sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。
本领域技术人员可以理解的是，在本文提供的具体序列基础上，可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与AAV或其VP蛋白的结合能力或生物学活性，从而获得本文提供的靶向AAV或其VP蛋白的抗体分子的相应变体，这些变体也应包括在本发明的范围内。例如，本文提供的抗体分子在其全长或可变区序列或CDR序列上，可以有至少1个且不超过10个，例如不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变。例如，可以在SEQ IDNO:1或2所示的重链可变区序列上有至少1个且不超过10个，例如不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变，还可以在SEQ ID NO：的CDR序列中具有总计不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变，或者所述抗体具有以上修饰的任意组合。
预期本文描述的抗体或其抗原结合片段可包含保守氨基酸取代。保守氨基酸取代通常可被描述为一种氨基酸残基被类似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有或基本上没有影响。保守氨基酸取代是本领域众所周知的。保守性取代可例如是下列(a)-(e)组中的一个氨基酸被同组内的另一个氨基酸取代：(a)小的脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳族残基：Phe、Tyr和Trp。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段可以进一步包含转译后修饰。转译后蛋白修饰的示例包括：磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化、生物素化或加入多肽侧链或疏水基团。因此，经修饰的可溶性多肽可以包含非氨基酸成分，例如类脂、多聚糖或单糖、以及磷酸盐。糖基化的一种优选形式是唾液酸化修饰，将一个或多个唾液酸基团与多肽结合。
融合蛋白
本文提供了含有至少一个本文提供的特异性结合AAV或其VP蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段以及至少一个其他功能部分的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以与Fc片段连接形成融合蛋白。Fc片段可位于的所述抗体或其抗原结合片段的C末端和N末端。优选地，Fc片段可位于所述抗体或其抗原结合片段的的C末端。
在一些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段可以与可检测标签连接形成融合蛋白。所述可检测标签可以有利于对纳米抗体或其抗原结合片段的检测，或者有利于对该抗体或其抗原结合片段与对应抗原(AAV(或VP蛋白))形成的免疫复合物(即抗原抗体复合物)的检测。因此，可检测标签可用于指示样品中AAV或其VP蛋白的存在或含量。可检测标签的实例包括免疫检测中可使用的各种酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等；荧光蛋白，例如GFP。由于本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段与AAV或其VP蛋白的特异性结合能力，可通过与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测标签的量来确定所述纳米抗体或其抗原结合片段的量，并进而确定样品中AAV或其VP蛋白的含量。
在一些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段可以与可纯化标签连接形成融合蛋白。可纯化标签的实例包括但不限于His6标签、Flag标签、MBP标签、GST标签、SUMO)标签等，它们有利从包括所述纳米抗体或其抗原结合片段的样品(如细胞培养上清液)中分离出所述纳米抗体或其抗原结合片段。
核酸、载体和宿主细胞
本文提供了分离的核酸分子，其可编码上文描述的抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。在一些实施方案中，该分离的核酸分子可包含SEQ ID NO：3、5、7或9所示的核酸序列或其功能性变体。这里所用的“功能性变体”指由于密码子简并性而编码相同氨基酸序列的不同核苷酸序列。这些核酸分子可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
本文还提供了表达载体，其可包含上述核酸分子。所述表达载体可选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体中的一种或多种。此外，所述表达载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该表达载体的标记基因。此外，所述表达载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。
本文还提供了一种宿主细胞，其可包含上述核酸分子或表达载体。该宿主细胞可用于制备本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括(但不限于)CHO细胞、HEK-293细胞、BHK细胞或PER-C6细胞，以及其衍生细胞，诸如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S和CHO-DS细胞。在一些实施方案中，本文提供的纳米抗体可由哺乳动物细胞分泌产生。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且后代可能由于自然、偶然或故意突变而不一定与原始亲代细胞完全一致(在形态或基因组DNA互补方面)。宿主细胞可以分离的细胞或细胞系，也包括在活体内经本文提供的核酸分子或表达载体转染的细胞。
检测试剂盒和亲和固相载体
本文提供的抗体或其抗原结合片段可用于检测样品中AAV(或VP蛋白)的存在或其含量。本领域有多种利用抗体进行抗原检测方法，包括但不限于，抗原抗体沉淀反应、免疫扩散实验、免疫比浊、免疫电泳(包括免疫印迹)、免疫荧光技术、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中ELISA方法还可以细分为直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA等多种类型。直接ELISA是所有ELISA中步骤最简单的一种，方法为将抗原按一定的比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上，包被完成后简单洗涤，再加入封闭液，封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液，加入稀释好的特异性的酶标抗体，37℃温育1h或4℃温育过夜后，洗涤除去多余的抗体，加入底物显色并判读结果。间接ELISA的步骤与直接ELISA步骤前面的部分基本一致，不同的是，间接ELISA中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶标的(一抗)，另外再引入经过酶标的二抗与一抗特异性结合。最后加入底物显色并判读结果。双抗体夹心ELISA的方法是：将第一抗体(捕获抗体)包被在固相载体上，封闭后加入待检抗原，温育后加入第二抗体(检测抗体)，捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种抗体，也可以是针对同一抗原的相同抗体，前提是该抗原含有多个相同表位。这些检测方法均可用于利用本文提供的纳米抗体进行AAV检测。优选地，采用直接ELISA或夹心ELISA进行AAV检测。
相应地，本文提供了AAV检测试剂盒，其包括本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。在融合蛋白中包括免疫检测中可使用的各种酶(如HRP)或荧光蛋白(GFP)，可方便对AAV的检测。
本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段可用于AAV或其VP蛋白的分离和/或纯化。在一些实施方案中，分离和/或纯化过程包括：将本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段偶联至固相载体，让包括AAV的样品与该固相载体接触，随后将固相载体与样品分离并洗脱吸附的AAV。本文提供的纳米抗体其抗原结合片段可通过偶联剂与固相载体表面的羟基、羧基、氨基等官能团结合而被固着在固相载体表面。所用的固相载体包括聚合物微球、琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、聚碳酸脂、消化纤维、二氧化硅或磁性微球等。在一些实施方案中，将固相基质作为层析填料用于AAV或其VP蛋白的分离和/或纯化。在另一些实施方案中，固相基质为磁珠形式，在将偶联有本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段磁珠加入含AAV的样品中，再通过磁力分离磁珠(及其吸附的AAV)，随后通过洗脱分离出AAV。
相应地，本文提供了用于AAV(或其VP蛋白)的分离和/或纯化的固相载体，该固相载体偶联有本文提供的纳米抗体或其抗原结合片段。
下面将通过实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1单域抗体的获得
我们通过羊驼免疫和噬菌体展示得到以下两株纳米抗体序列。
(1)AAVi1：(SEQ ID NO：1)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTHGLYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTLMSGNYNSAREYDYWGQGTQVTVSS
HCDR1的氨基酸序列为LYAMG(SEQ ID NO：11)，HCDR2的氨基酸序列为VQDLSASNTYYSSAVKG(SEQ ID NO：12)，HCDR3的氨基酸序列为GPTLMSGNYNSAREYDY(SEQ IDNO：13)。
(2)AAVi2：(SEQ ID NO：2)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTHGLYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTiMSGNYNSAREYDYWGQGTQVTVSS
HCDR1的氨基酸序列为LYAMG(SEQ ID NO：14)，HCDR2的氨基酸序列为VQDLSASNTYYSSAVKG(SEQ ID NO：15)，HCDR3的氨基酸序列为GPTIMSGNYNSAREYDY(SEQ IDNO：16)。
实施例2质粒构建
把AAVi1和AAVi1分别与小鼠IgG2a的Fc片段融合，得到AAVi1-mFc和AAVi2-mFc，其核酸和氨基酸序列如下。核酸序列通过基因合成得到。
AAVi1-mFc核酸序列(SEQ ID NO：3)
atgggatggtcatgtatcatcctttttctagtagcaactgccaccggtgtacattcccaagtgcagctgcaggagagcggcggcggcctggtgcaggctggaggaagcctgagactgagctgcgccgcctctggccgcacacacggcctctacgccatgggctggttcagacaggcccctggcaaagagcgggaattcgtggccgtgcaggacctgagcgccagcaacacctactacagctccgctgttaagggccggtttacaatcagcagagataacgccaagaataccgtctatctgcagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactactgtgccgctggacctacactgatgagcggcaactacaactccgccagagaatacgactactggggccagggcacccaggtgaccgtgtcttctggatccgagccccgcggccccaccatcaagccctgccccccctgcaagtgccccgcccccaacctgctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagatcaaggacgtgctgatgatcagcctgagccccatcgtgacctgcgtggtggtggacgtgagcgaggacgaccccgacgtgcagatcagctggttcgtgaacaacgtggaggtgcacaccgcccagacccagacccaccgcgaggactacaacagcaccctgcgcgtggtgagcgccctgcccatccagcaccaggactggatgagcggcaaggagttcaagtgcaaggtgaacaacaaggacctgcccgcccccatcgagcgcaccatcagcaagcccaagggcagcgtgcgcgccccccaggtgtacgtgctgcccccccccgaggaggagatgaccaagaagcaggtgaccctgacctgcatggtgaccgacttcatgcccgaggacatctacgtggagtggaccaacaacggcaagaccgagctgaactacaagaacaccgagcccgtgctggacagcgacggcagctacttcatgtacagcaagctgcgcgtggagaagaagaactgggtggagcgcaacagctacagctgcagcgtggtgcacgagggcctgcacaaccaccacaccaccaagagcttcagccgcacccccggcaagtga
AAVi1-mFc氨基酸序列(SEQ ID NO：4)
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTHGLYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTLMSGNYNSAREYDYWGQGTQVTVSSGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
AAVi2-mFc核酸序列(SEQ ID NO：5)
atgggatggtcatgtatcatcctttttctagtagcaactgccaccggtgtacattcccaagtgcagctgcaggagagcggcggcggcctggtgcaggctggaggaagcctgagactgagctgcgccgcctctggccgcacacacggcctctacgccatgggctggttcagacaggcccctggcaaagagcgggaattcgtggccgtgcaggacctgagcgccagcaacacctactacagctccgctgttaagggccggtttacaatcagcagagataacgccaagaataccgtctatctgcagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactactgtgccgctggacctacaatcatgagcggcaactacaactccgccagagaatacgactactggggccagggcacccaggtgaccgtgtcttctggatccgagccccgcggccccaccatcaagccctgccccccctgcaagtgccccgcccccaacctgctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagatcaaggacgtgctgatgatcagcctgagccccatcgtgacctgcgtggtggtggacgtgagcgaggacgaccccgacgtgcagatcagctggttcgtgaacaacgtggaggtgcacaccgcccagacccagacccaccgcgaggactacaacagcaccctgcgcgtggtgagcgccctgcccatccagcaccaggactggatgagcggcaaggagttcaagtgcaaggtgaacaacaaggacctgcccgcccccatcgagcgcaccatcagcaagcccaagggcagcgtgcgcgccccccaggtgtacgtgctgcccccccccgaggaggagatgaccaagaagcaggtgaccctgacctgcatggtgaccgacttcatgcccgaggacatctacgtggagtggaccaacaacggcaagaccgagctgaactacaagaacaccgagcccgtgctggacagcgacggcagctacttcatgtacagcaagctgcgcgtggagaagaagaactgggtggagcgcaacagctacagctgcagcgtggtgcacgagggcctgcacaaccaccacaccaccaagagcttcagccgcacccccggcaagtga
AAVi2-mFc氨基酸序列(SEQ ID NO：6)
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTHGLYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTIMSGNYNSAREYDYWGQGTQVTVSSGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
在AAVi1和AAVi2后面加上His-Tag，得到AAVi1-His和AAVi2-His。其核酸和氨基酸序列如下。
AAVi1-His核酸序列(SEQ ID NO：7)
ATGCAAGTTCAACTGCAGGAATCTGGTGGCGGTCTGGTTCAGGCTGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCTGGCCGTACCCATGGTCTGTACGCTATGGGTTGGTTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGAACGCGAGTTCGTGGCGGTTCAGGATCTGTCTGCATCTAACACTTATTATAGCTCTGCAGTGAAAGGCCGTTTCACCATCAGCCGCGACAACGCAAAAAACACCGTATACCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCGGTATACTACTGTGCTGCTGGTCCGACCCTGATGAGCGGTAACTACAACTCTGCTCGTGAATATGACTACTGGGGCCAAGGTACCCAGGTAACGGTCTCTAGCGGCTCCCATCACCACCACCACCACTAA
AAVi1-His氨基酸序列(SEQ ID NO：8)
MQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTHGLYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTLMSGNYNSAREYDYWGQGTQVTVSSGSHHHHHH
AAVi2-His核酸序列(SEQ ID NO：9)
ATGCAAGTTCAACTGCAGGAATCTGGTGGCGGTCTGGTTCAGGCTGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCTGGCCGTACCCATGGTCTGTACGCTATGGGTTGGTTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGAACGCGAGTTCGTGGCGGTTCAGGATCTGTCTGCATCTAACACTTATTATAGCTCTGCAGTGAAAGGCCGTTTCACCATCAGCCGCGACAACGCAAAAAACACCGTATACCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCGGTATACTACTGTGCTGCTGGTCCGACCATCATGAGCGGTAACTACAACTCTGCTCGTGAATATGACTACTGGGGCCAAGGTACCCAGGTAACGGTCTCTAGCGGCTCCCATCACCACCACCACCACTAA
AAVi2-His氨基酸序列(SEQ ID NO：10)
MQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTHGLYAMGWFRQAPGKEREFVAVQDLSASNTYYSSAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGPTiMSGNYNSAREYDYWGQGTQVTVSSGSHHHHHH
将以上序列用于表达质粒的构建。
实施例3蛋白的表达，纯化及浓度检测。
对AAVi1-mFc和AAVi2-mFc，我们用LIPO3000转染到293T细胞,48小时后，收集上清，用ELISA的方法浓度的检测。对AAVi1-His和AAVi2-His，用细菌表达后，然后用镍柱纯化。
实施例4测试AAVi1和AAVi2对AAV的亲和力
将AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8分别加入到包被缓冲液中，然后加入到96孔酶标板中，100μl/孔，置于4℃孵育过夜。用1％ BSA封闭后，每孔加入100ng AAVi1-mFc(或AAVi2-mFc)。孵育后加入山羊抗鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Cat.No.115-035-144)，并用TMB显色液进行显色，使用酶标仪检测各孔的OD450值。
实验结果：我们测试AAVi1和AAVi2对不同血清型AAV的结合能力。用AAV1，AAV2，AAV3，AAV5，AAV6，AAV7和AAV8包被后，再加入AAVi1-mFc或者AAVi2-mFc，我们发现AAVi1对各种测试的血清型都有较好的结合能力。AAVi2对AAV5有较强的结合能力，对AAV1，2，3，6，7有中等强度的结合能力，对AAV8的结合能力较差(图1)。
实施例5AAVi1和AAVi2用于ELISA的开发
用外购的商品化试剂盒(PROGE Cat.No.PRAAV5)标定的AAV5样品作为本发明ELISA方法的标准品，另外购得4个批次的AAV5样品作为本发明ELISA方法和商品化试剂盒的待测样品。其中商品化试剂盒方法参照试剂盒说明书，本发明ELISA方法如下：用AAVi1-His(或AAVi2-His)做包被抗体，然后加入稀释过的样本，然后加入100ng/孔AAVi1-mFc(或AAVi2-mFc)，孵育后加入有HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearchCat.No.115-035-144)，然后用TMB显色液进行显色，读取OD450值。
实验结果：我们利用AAVi1和AAVi2来开发AAV衣壳检测的ELISA方法及试剂盒。用AAVi1-His(或AAVi2-His)抗体作为包被抗体，AAVi1-mFc(或AAVi1-mFc)抗体作为结合抗体，采用双夹心ELISA方法对AAV5进行衣壳滴度检测，如表1所示，本发明纳米抗体检测结果与商品化试Elisa剂盒检测误差在15％以内，说明AAVi1和AAVi2适合用作开发AAV检测的ELISA试剂盒。
表1用纳米抗体进行AAV5衣壳滴度ELISA检测的结果。
实施例6用纳米抗体交联的亲和填料纯化AAV
用AAVi1-His(或AAVi2-His)纳米抗体与NHS填料(Biorad Affi Gel 102MediaCat.No.115-035-144)交联得到可用于AAV纯化的亲和填料，并装入重力柱当中。加入上游处理过的含有AAV5的病毒溶液进行孵育后，用10倍体积的平衡液清洗，分别用pH4.5、pH3.5、pH2.5的溶液进行洗脱，用数字PCR方法检测不同PH洗脱下来的样品基因组滴度，用SDS-PAGE银染的方法对不同PH洗脱下来的样品进行纯度检测。
实验结果：用AAVi1-His(或AAVi2-His)抗体制备亲和填料，并对上游发酵AAV5样品进行亲和纯化，用不同PH的洗脱液进行洗脱，结果显示在图2中。由结果中可以看出，在pH为2.5时，AAVi1的洗脱率较高，在pH3.5时，AAVi2的洗脱率较高。用AAVi1-His(或AAVi2-His)抗体制备亲和填料，并对上游发酵AAV5样品进行亲和纯化，从图3中可以看出，纳米抗体制备的亲和填料用于AAV的亲和纯化得到的AAV收率高、纯度高。
在pH 2.5中，AAV比较容易失活(Lins-Austin B,et al.Adeno-Associated Virus(AAV)Capsid Stability and Liposome Remodeling During Endo/Lysosomal pHTrafficking.Viruses.2020；12(6):668)，所以在洗脱AAV的时候，我们必须使AAV在pH2.5的溶液环境中待比较短的时间。这对于大规模纯化AAV是一个比较大的挑战。洗脱pH的升高为以后开发大规模AAV纯化柱提供更可能。
这里我们得到了一种可以结合多种AAV血清型的纳米抗体，这种纳米抗体可以用来做AAV外壳的ELISA检测，也可以用做AAV纯化的亲和配基。

Claims (18)

1.靶向多种血清型腺相关病毒AAV的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列为LYAMG(SEQID NO：14)，所述HCDR2的氨基酸序列为VQDLSASNTYYSSAVKG(SEQ ID NO：15)，以及所述HCDR3的氨基酸序列为GPTIMSGNYNSAREYDY(SEQ ID NO：16)；
所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7及其任意组合；
所述抗体为纳米抗体。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，还包括Fc片段。
4.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其能够靶向AAV5。
5.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其能够靶向AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6和AAV7中的至少两种。
6.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其能够靶向AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6和AAV7。
7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO：6或10所示氨基酸序列。
8.融合蛋白，包括一个或更多个抗原结合功能部分，其中所述抗原结合功能部分包括权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，还包括检测标签或纯化标签。
10.核酸分子，其编码权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求8或9所述的融合蛋白。
11.如权利要求10所述的核酸分子，其包括SEQ ID NO：5或9所示核苷酸序列。
12.表达载体，其包括权利要求10或11所述的核酸分子。
13.宿主细胞，其包括权利要求10或11所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体或表达权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求8或9所述的融合蛋白。
14.在样品中检测AAV的方法，包括让权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求8或9所述的融合蛋白与所述样品接触，并检测所形成的免疫复合物的量；所述在样品中检测AAV的方法为非疾病治疗或诊断方法。
15.检测试剂盒，包括权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求8或9所述的融合蛋白。
16.权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求8或9所述的融合蛋白纯化AAV的用途，其中所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7及其任意组合。
17.固相载体，其表面偶联有权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
18.纯化AAV的方法，包括：
1)让包括AAV的样品与权利要求17所述的固相载体接触；
2)将所述固相载体与所述样品分离；以及
3)从所述固相载体洗脱所述AAV，
其中所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7及其任意组合。
CN202211657669.9A 2022-12-22 2022-12-22 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用 Active CN116239679B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211657669.9A CN116239679B (zh) 2022-12-22 2022-12-22 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211657669.9A CN116239679B (zh) 2022-12-22 2022-12-22 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116239679A CN116239679A (zh) 2023-06-09
CN116239679B true CN116239679B (zh) 2023-08-18

Family

ID=86630439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211657669.9A Active CN116239679B (zh) 2022-12-22 2022-12-22 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116239679B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114196638A (zh) * 2021-12-28 2022-03-18 武汉美博尔津生物科技有限公司 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114196638A (zh) * 2021-12-28 2022-03-18 武汉美博尔津生物科技有限公司 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN116239679A (zh) 2023-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20180179265A1 (en) Engineered human anti-aav antibodies and uses thereof
CN116199773B (zh) 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用
JP7497292B2 (ja) 遺伝子組換え単鎖免疫グロブリン
WO2022166949A1 (zh) 抗aav2单克隆抗体及其制备方法和应用
CA3140386A1 (en) Modified viral particles and uses thereof
CN116589564B (zh) 抗aav5抗体及快速aav5滴度测定elisa试剂盒
WO2022156653A1 (en) Expression vector for anti-sars-cov-2 neutralizing antibodies
CN116239679B (zh) 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用
KR20210021552A (ko) Aav 요법의 방법
WO2021136249A1 (zh) Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途
CN117229393B (zh) 特异性结合腺相关病毒5的抗体及其应用
WO2024140629A1 (zh) 抗aav8的单克隆抗体及其制备方法和用途
KR20210084509A (ko) 항체 라이브러리 및 방법
CN117186212A (zh) 宽pH下用于纯化不同AAV的纳米抗体
US20240168018A1 (en) Methods for detecting and evaluating viruses and virus-like particles
CN117129675B (zh) 用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒
WO2024140628A1 (zh) 抗aav2的单克隆抗体及其制备方法和用途
Bae et al. Identification of the amino acid residues involved in human IgG transport into egg yolks of Japanese quail (Coturnix japonica)
WO2024140627A1 (zh) 抗多种血清型aav衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN117126270B (zh) 一种2型人博卡病毒型别特异性抗体及其应用
CN117126269B (zh) 一种1型人博卡病毒型别特异性抗体及其应用
CN118085066B (zh) 一种抗aav的单克隆抗体及其用途
Mann et al. Enhanced transduction of P2X7-expressing cells with recombinant rAAV vectors
WO2022244861A1 (ja) 抗ノロウイルス抗体
WO2022244862A1 (ja) ノロウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant