KR20210021552A - Aav 요법의 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 아데노 연관 바이러스 (AAV) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 AAV에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함한다.

Description

AAV 요법의 방법

개시내용의 분야

본 개시내용은 아데노 연관 바이러스 (AAV) 요법을 사용하여 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 방법은 대상체 내의 항-AAV 항체의 전체 수준을 검출함으로써 AAV 요법에 적합한 환자를 확인하고, 항-AAV 항체 역가가 낮은 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 포함한다.

개시내용의 배경

트랜스진을 운반하는 아데노 연관 바이러스 (AAV)는 돌연변이체 또는 무효 단백질 발현을 초래하는 유전적 결함의 수정 또는 기존의 낮은 수준의 단백질 발현의 강화 (문헌 [Nathwani et al.] 내지 [A.M Keeler et al.]), 잠재적으로는 유전자 녹다운, 게놈 편집 또는 변형, 및 비-코딩 RNA 조정 (Valdmanis et al. 2017)을 위한 유전자 요법에서의 중요한 도구이다. 그러나, 인간은 생애 초기에 AAV에 노출되고, 중화 항-AAV 항체를 포함하는 항-AAV 항체가 발생되며, 이는 AAV 벡터를 중화시킴으로써 유전자 치료 약물 효능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다 (Blacklow et al., 1967; Boutin et al., 2010; Calcedo et al., 2009, 2011; Liu et al., 2013).

기존의 중화 AAV-특이적 항체의 수준이 높은 환자의 사전-스크리닝 및 배제는 더 높은 약물 효능을 달성하는 하나의 방식이다. 소정의 집단 내의 중화 항체의 빈도를 결정하고, AAV 요법에 반응할 가능성이 적은 환자를 배제하기 위해, 시험관내 세포-기반 리포터 검정법이 가장 종종 사용된다 (Amine M et al., 2015, Manno C et al., 2006). 그러나, 세포-기반 중화 항체 검정법은 처리량이 낮고, 노동 집약적이며, 일반적으로, 높은 변동성 및 낮은 감도 문제를 겪어서, 다수의 환자로부터의 샘플을 스크리닝하는 것을 어렵게 만든다. 따라서, 덜 가변적이고 더욱 강건한, 기존의 항체의 존재에 관한 정보를 제공하는 방법, 및 환자 배제 목적을 위해 다수의 대상체를 스크리닝하는 데 잠재적으로 사용될 수 있는 고처리량 및 자동화를 위해 보다 적용가능한 방법이 여전히 관련 기술 분야에서 요구된다.

개시내용의 개요

특정 측면에서, 본 개시내용은 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

특정 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체는 ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정 시 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

특정 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환을 치료하는 것에서 사용하기 위한 AAV 요법이고, 여기서 대상체는 ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정 시 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 AAV 요법에 관한 것이다.

특정 측면에서, 본 개시내용은 (1) ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 단계이며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 단계, (2) 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

특정 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환을 치료하는 것에서 사용하기 위한 AAV 요법이고, 여기서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가가 ELISA에서 측정되고, 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법이 투여되는 것인 AAV 요법에 관한 것이다.

특정 측면에서, 본 개시내용은 (1) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, (2) ELISA에서 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 단계이며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 단계, (3) 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

특정 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환을 치료하는 것에서 사용하기 위한 AAV 요법이고, 여기서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가가 ELISA에서 측정되고, 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법이 투여되는 것인 AAV 요법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 질환은 심장, 간, 폐, 눈, 혈액, 신경계, 림프계, 근육, 줄기 세포 또는 그의 임의의 조합에서의 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 심장 질환이다.

특정 측면에서, 본 개시내용은 ELISA를 사용하여 상응하는 복수의 대상체로부터 수득된 복수의 생물학적 샘플 각각 내의 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 고처리량 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 약 5명/마리 내지 약 10명/마리, 약 10명/마리 내지 약 20명/마리, 약 30명/마리 내지 약 40명/마리, 또는 약 40명/마리 내지 약 50명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 생물학적 샘플 각각에서의 역가는 병행으로 또는 순차적으로 측정된다.

일부 실시양태에서, 항-AAV 항체의 역가는 중화 항-AAV 항체의 역가, 비-중화 항-AAV 항체의 역가, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, ELISA는 중화 항-AAV 항체 또는 비-중화 항-AAV 항체에 결합하는 2차 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, ELISA는 중화 항-AAV 항체 및 비-중화 항-AAV 항체에 결합하는 2차 항체를 포함한다.

일부 실시양태에서, AAV 요법은 재조합 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 요법은 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV (3A형 및 3B형 포함), 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 뱀 AAV, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 요법은 5형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 요법은 9형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 요법은 2형 AAV를 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-1형 AAV 항체, 항-2형 AAV 항체, 항-3A형 AAV 항체, 항-3B형 AAV 항체, 항-4형 AAV 항체, 항-5형 AAV 항체, 항-6형 AAV 항체, 항-7형 AAV 항체, 항-8형 AAV 항체, 항-9형 AAV 항체, 항-10형 AAV 항체, 항-11형 AAV 항체, 항-12형 AAV 항체, 항-13형 AAV 항체, 항-뱀 AAV 항체, 항-조류 AAV 항체, 항-솟과 AAV 항체, 항-갯과 AAV 항체, 항-말과 AAV 항체, 항-양 AAV 항체, 항-염소 AAV 항체, 또는 항-새우 AAV 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-5형 AAV 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-9형 AAV 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-2형 AAV 항체이다.

일부 실시양태에서, AAV 요법을 위한 AAV는 항-AAV 항체가 결합하는 AAV와 상이한 혈청형이다.

일부 실시양태에서, ELISA는 화학발광 ELISA를 포함한다. 일부 실시양태에서, ELISA는 집단 ELISA이다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 ELISA 전에 희석된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 1:2, 적어도 약 1:3, 적어도 약 1:4, 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 적어도 약 1:20, 적어도 약 1:30, 적어도 약 1:40, 적어도 약 1:50, 적어도 약 1:100, 적어도 약 1:150, 적어도 약 1:200, 적어도 약 1:250, 적어도 약 1:300, 적어도 약 1:350, 적어도 약 1:400, 적어도 약 1:450, 적어도 약 1:500, 적어도 약 1:1000만큼 희석된다.

일부 실시양태에서, 항-AAV 항체 역가는 약 800 미만 내지 약 40,000 미만이다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체 역가는 약 40,000 미만, 약 35,000 미만, 약 30,000 미만, 약 25,000 미만, 약 20,000 미만, 약 15,000 미만, 약 10,000 미만, 약 5000 미만, 약 4000 미만, 약 3000 미만, 약 2000 미만, 약 1000 미만, 약 900 미만, 또는 약 800 미만이다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체 역가는 약 800 미만이다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체 역가는 약 40,000 미만이다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 100,000 미만, 약 10,000 미만, 약 1000 미만, 약 950 미만, 약 900 미만, 약 850 미만, 약 800 미만, 약 750 미만, 약 700 미만, 약 650 미만, 약 600 미만, 약 550 미만, 또는 약 500 미만의 화학발광 단위를 방출하는 경우에 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 700 미만의 화학발광 단위를 방출하는 경우에 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체의 낮은 역가는 중화 항-AAV 항체의 낮은 역가와 상관관계가 있다.

일부 실시양태에서, AAV 요법은 관심 유전자를 포함하는 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, AAV는 조절 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직 특이적 프로모터는 심장, 간, 폐, 눈, 신경계, 림프계, 근육 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에서 관심 유전자의 발현을 유도한다.

실시양태

E1. 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법.

E2. E1에 있어서, 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

E3. 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체는 ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정 시 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.

E4. (1) ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 단계이며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 단계, (2) 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.

E5. (1) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, (2) ELISA에서 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 단계이며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 단계, (3) 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.

E6. E3 내지 E5 중 어느 하나에 있어서, 질환이 심장, 간, 폐, 눈, 혈액, 신경계, 림프계, 근육, 줄기 세포 또는 그의 임의의 조합에서의 질환인 방법.

E7. E3 내지 E6 중 어느 하나에 있어서, 질환이 심장 질환인 방법.

E8. ELISA를 사용하여 상응하는 복수의 대상체로부터 수득된 복수의 생물학적 샘플 각각 내의 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 고처리량 방법.

E9. E8에 있어서, 복수의 대상체가 약 5명/마리 내지 약 10명/마리, 약 10명/마리 내지 약 20명/마리, 약 30명/마리 내지 약 40명/마리, 또는 약 40명/마리 내지 약 50명/마리의 대상체를 포함하는 것인 고처리량 방법.

E10. E8 또는 E9에 있어서, 복수의 생물학적 샘플 각각에서의 역가가 병행으로 또는 순차적으로 측정되는 것인 고처리량 방법.

E11. E1 내지 E10 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체의 역가가 중화 항-AAV 항체의 역가, 비-중화 항-AAV 항체의 역가, 또는 둘 모두를 포함하는 것인 방법.

E12. E11에 있어서, ELISA가 중화 항-AAV 항체 또는 비-중화 항-AAV 항체에 결합하는 2차 항체를 포함하는 것인 방법.

E13. E11에 있어서, ELISA가 중화 항-AAV 항체 및 비-중화 항-AAV 항체에 결합하는 2차 항체를 포함하는 것인 방법.

E14. E1 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, AAV 요법이 재조합 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

E15. E1 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, AAV 요법이 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV (3A형 및 3B형 포함), 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 뱀 AAV, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

E16. E1 내지 E15 중 어느 하나에 있어서, AAV 요법이 5형 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

E17. E1 내지 E16 중 어느 하나에 있어서, AAV 요법이 9형 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

E18. E1 내지 E17 중 어느 하나에 있어서, AAV 요법이 2형 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

E19. E1 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체가 항-1형 AAV 항체, 항-2형 AAV 항체, 항-3A형 AAV 항체, 항-3B형 AAV 항체, 항-4형 AAV 항체, 항-5형 AAV 항체, 항-6형 AAV 항체, 항-7형 AAV 항체, 항-8형 AAV 항체, 항-9형 AAV 항체, 항-10형 AAV 항체, 항-11형 AAV 항체, 항-12형 AAV 항체, 항-13형 AAV 항체, 항-뱀 AAV 항체, 항-조류 AAV 항체, 항-솟과 AAV 항체, 항-갯과 AAV 항체, 항-말과 AAV 항체, 항-양 AAV 항체, 항-염소 AAV 항체, 또는 항-새우 AAV 항체인 방법.

E20. E1 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체가 항-5형 AAV 항체인 방법.

E21. E1 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체가 항-9형 AAV 항체인 방법.

E22. E1 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체가 항-2형 AAV 항체인 방법.

E23. E1 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, AAV 요법을 위한 AAV가 항-AAV 항체가 결합하는 AAV와 상이한 혈청형인 방법.

E24. E1 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, ELISA가 화학발광 ELISA를 포함하는 것인 방법.

E25. E1 내지 E24 중 어느 하나에 있어서, ELISA가 집단 ELISA인 방법.

E26. E1 내지 E25 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청 샘플을 포함하는 것인 방법.

E27. E1 내지 E26 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플을 포함하는 것인 방법.

E28. E1 내지 E27 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플이 ELISA 전에 희석되는 것인 방법.

E29. E1 내지 E28 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플이 적어도 약 1:2, 적어도 약 1:3, 적어도 약 1:4, 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 적어도 약 1:20, 적어도 약 1:30, 적어도 약 1:40, 적어도 약 1:50, 적어도 약 1:100, 적어도 약 1:150, 적어도 약 1:200, 적어도 약 1:250, 적어도 약 1:300, 적어도 약 1:350, 적어도 약 1:400, 적어도 약 1:450, 적어도 약 1:500, 적어도 약 1:1000만큼 희석되는 것인 방법.

E30. E1 내지 E29 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체 역가가 약 800 미만 내지 약 40,000 미만인 방법.

E31. E1 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체 역가가 약 40,000 미만, 약 35,000 미만, 약 30,000 미만, 약 25,000 미만, 약 20,000 미만, 약 15,000 미만, 약 10,000 미만, 약 5000 미만, 약 4000 미만, 약 3000 미만, 약 2000 미만, 약 1000 미만, 약 900 미만, 또는 약 800 미만인 방법.

E32. E1 내지 E31 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체 역가가 약 800 미만인 방법.

E33. E1 내지 E32 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 100,000 미만, 약 10,000 미만, 약 1000 미만, 약 950 미만, 약 900 미만, 약 850 미만, 약 800 미만, 약 750 미만, 약 700 미만, 약 650 미만, 약 600 미만, 약 550 미만, 또는 약 500 미만의 화학발광 단위를 방출하는 경우에 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인되는 것인 방법.

E34. E1 내지 E33 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 700 미만의 화학발광 단위를 방출하는 경우에 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인되는 것인 방법.

E35. E2 내지 E34 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체의 낮은 역가가 중화 항-AAV 항체의 낮은 역가와 상관관계가 있는 것인 방법.

E36. E1 내지 E35 중 어느 하나에 있어서, AAV 요법이 관심 유전자를 포함하는 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.

E37. E36에 있어서, 관심 유전자가 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.

E38. E36 또는 E37에 있어서, AAV가 조절 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.

E39. E38에 있어서, 조절 서열이 조직 특이적 프로모터를 포함하는 것인 방법.

E40. E38에 있어서, 조직 특이적 프로모터가 심장, 간, 폐, 눈, 신경계, 림프계, 근육 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에서 관심 유전자의 발현을 유도하는 것인 방법.

도면의 간단한 설명
도 1a-1b는 상업적으로 입수한 정상 인간 혈청 샘플 내의 항-9형 rAAV 항체의 화학발광 (도 1a) 및 비색 (도 1b) ELISA 검출의 결과의 그래프식 표현이다. SBT20 완충제를 사용하여 지시된 바와 같이 혈청 샘플을 희석하고, rAAV9S100A1 코팅 플레이트에 첨가하였다. 최적화된 양의 항-κ 및 항-λ 항체로 9형 rAAV에 결합된 항체를 검출한 후에 화학발광 (CL) (도 1a) 또는 흡광도 (도 1b) 단위가 수득되었다. 배경은 SBT20 완충제와 함께 인큐베이션된 대조군 웰을 항-κ 및 항-λ 항체로 검출했을 때 관찰된 CL (도 1a) 또는 흡광도 (도 1b) 단위이다.
도 2는 화학발광 (흑색 막대) 및 비색 (회색 막대) ELISA 검출 방법에 대한 신호-대-잡음 비의 비교를 나타내는 막대 그래프이다. 400배 혈청 희석물의 화학발광 또는 흡광도 단위를 항-κ 및 항-λ 검출 항체를 사용하여 수득하고, rAAV9 코팅 플레이트 상에서 단독 SBT20 완충제 인큐베이션 및 항-κ 및 항-λ 검출 항체로 수득된 데이터 단위로 나누었다.
도 3a는 화학발광과 비색 검출 방법 사이의 상관관계를 나타내는 산점도이다. 각각의 방법에 대한 혈청 희석의 선형 범위에서 데이터가 선택되어, 제시된 상관관계 플롯이 생성되었다. 도 3b는 도 3a에서 제시된 데이터의 통계적 분석을 제공한다.
도 4a-4c는 화학발광 ELISA에서의 항-rAAV9S100A1 항체 결합의 경쟁 결과의 그래프식 표현이다. 4개의 상이한 정상 인간 혈청 샘플을 희석하고, 각각의 희석물의 3개의 사본을 용액 내의 rAAV9와의 예비-인큐베이션의 존재 (경쟁) 및 부재 (비-경쟁) 하에 테스트하였다 (도 4a). 도 4b-4c는 1:4의 혈청 희석물 (도 4b) 및 모노클로날 항체 대조군 (1:1000의 ADK9; 도 4c)에서의 경쟁 ELISA 데이터를 나타낸다. 상자의 숫자는 경쟁 혈청 샘플에서의 신호의 퍼센트 억제이다 (도 4b-4c).
도 5a-5b는 화학발광 ELISA 방법에서의 항-AAV9 항체 검출의 재현성을 도해하는 그래프식 표현이다. 12개의 상이한 정상 인간 샘플을 40배 (도 5a) 또는 400배 (도 5b) 희석하고, 2개의 상이한 실험에서 전체 항-AAV9 항체에 대해 테스트하였다. 표 (도 5a 및 5b)는 각각의 희석물에서 각각의 샘플에 대한 실험간 정밀도를 나타낸다.
도 6a-6c는 트랜스진 (rAAV9S100A1; 회색 막대) 및 루시퍼라제 리포터 (rAAV9HLuc; 흑색 막대)를 함유하는 rAAV9 캡시드의 상호교환성을 도해하는 막대 그래프이다. 각각의 캡시드 유형을 동일한 농도로 코팅하고, 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 화학발광 전체 항체 결합 ELISA에서 정상 인간 혈청 (NHS) 샘플의 3개의 상이한 로트 (도 6a-6c)의 연속 희석물로 검출하였다.
도 7은 심장 질환 환자 혈청 샘플 내의 전체 항-AAV9 항체와 중화 항체 사이의 상관관계를 도해하는 산점도이다. 100명의 환자를 1:400의 혈청 희석물에서의 전체 결합 항체 및 1:10의 희석물에서의 중화 항체에 대해 평가하고, 스피어만 순위-순서 방법을 사용하여 상관시켰다. 파선으로 제시된 임의 차단값이 각각의 검정법에 대해 설정된다.
도 8은 심장 질환 환자 혈청 샘플 내의 전체 항-AAV 항체와 AAV9 중화 항체 사이의 상관관계를 도해하는 산점도이다. 100명의 환자를 ELISA에서 AAV9와의 경쟁 후 1:400의 혈청 희석물에서 AAV 특이적 항체에 대해, 그리고 세포-기반 중화 항체 검정법에서 1:10의 희석물에서 중화 항체에 대해 평가하고, 스피어만 순위-순서 방법을 사용하여 상관시켰다. 파선으로 제시된 임의 차단값이 각각의 검정법에 대해 설정된다.
도 9는 심장 질환 환자 혈청 샘플 내의 전체 2형 AAV-결합 항체와 중화 항체 사이의 상관관계를 도해하는 산점도이다. 36명의 환자를 ELISA에서 1:400의 혈청 희석물에서 AAV 특이적 항체에 대해, 그리고 세포-기반 중화 항체 검정법에서 1:10의 희석물에서 중화 항체에 대해 평가하였다. 파선으로 제시된 임의 차단값이 각각의 검정법에 대해 설정된다.
도 10은 100명의 환자 샘플에서의 AAV9 중화 항체, 전체 항-AAV9 항체, 및 특이적인 (경쟁 단계를 기초로 함, 실시예 참조) 전체 항-AAV9 항체 사이의 관계를 도시하는 비-척도화 벤다이어그램이다. 각각의 데이터 세트에 대해 괄호 안에 임의 차단값이 도시된다. 전체 항체 (tAb) 데이터 세트에 대한 차단값은 세포-기반 중화 항체 검정법에서의 중화 및 비-중화 집단의 분할을 기초로 하였다.
도 11a-11b는 화학발광 (흑색 막대) 및 비색 (회색 막대) ELISA 검출 방법에 대한 신호-대-잡음 비의 비교를 나타내는 막대 그래프이다. 4배 (도 11a) 및 40배 (도 11b) 혈청 희석물에서의 화학발광 또는 흡광도 단위를 항-κ 및 항-λ 검출 항체를 사용하여 수득하고, rAAV9 코팅 플레이트 상에서 단독 SBT20 완충제 인큐베이션 및 항-κ 및 항-λ 검출 항체로 수득된 데이터 단위로 나누었다.
도 12는 rAAV9 Ab의 HRP-접합 항-κ 및 항-λ 검출과 HRP-접합 항-IgG 검출의 비교를 나타내는 막대 그래프이다.

개시내용의 상세한 설명

본 개시내용의 특정 측면은 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 대상체는 ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정 시 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 ELISA를 사용하여 상응하는 복수의 대상체로부터 수득된 복수의 생물학적 샘플 각각 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 고처리량 방법에 관한 것이다.

I. 용어

본 개시내용이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어들이 먼저 정의된다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기의 용어 각각은 하기에 기재된 의미를 가질 것이다. 추가적인 정의가 출원 전반에 걸쳐 기재된다.

본원에서 사용된 경우의 용어 "및/또는"은 2개의 명시된 특색 또는 성분 각각을 함께 또는 따로 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 구절에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함하도록 의도된다. 유사하게, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구절에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 측면들 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).

본원에서 "포함하는"이라는 언어와 함께 기술되는 경우마다, "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는"의 관점에서 기술된 다른 면에서 유사한 측면들이 또한 제공되는 것으로 이해된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 통상의 기술자에게 본 개시내용에서 사용된 다수의 용어의 일반적인 사전을 제공한다.

단위, 접두사 및 기호는 이의 국제 단위 시스템 (Systeme International de Unites (SI)) 허용 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다. 본원에서 제공된 제목은 명세서를 전체적으로 참조함으로써 이해되어야 하는 본 개시내용의 다양한 측면들을 제한하지 않는다. 하기에 정의된 용어들은 명세서 전문을 참조로 이해되어야 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV"는 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV (3A형 및 3B형 포함), 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 뱀 AAV, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 문헌 [Gao et al. (J. Virol. 78:6381 (2004))] 및 [Moris et al. (Virol. 33:375 (2004))]에 개시된 AAV 혈청형 및 클레이드, 및 현재 공지되어 있거나 또는 추후에 발견될 임의의 다른 AAV를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다. AAV는 파르보비리다에(Parvoviridae) 바이러스 과 내의 디펜도파르보바이러스(Dependoparvovirus) (속)를 지칭한다. 예를 들어, AAV는 천연 발생 "야생형" 바이러스로부터 유래된 AAV, 천연 발생 cap 유전자에 의해 코딩되는 캡시드 단백질로부터 유래된 캡시드 내로 패키징된 재조합 AAV (rAAV) 게놈 및/또는 비-천연 캡시드 cap 유전자에 의해 코딩되는 캡시드 단백질로부터 유래된 캡시드 내로 패키징된 rAAV 게놈으로부터 유래된 AAV일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "AAV"는 바이러스 자체 또는 그의 유도체를 지칭하도록 사용될 수 있다. 구체적으로 달리 지시된 경우를 제외하고는, 이러한 용어는 모든 아유형, 및 천연 발생 및 재조합 형태 둘 모두를 포괄한다. AAV는 1형 AAV (AAV-1), 2형 AAV (AAV-2), 3형 AAV (AAV-3), 4형 AAV (AAV-4), 5형 AAV (AAV-5), 6형 AAV (AAV-6), 7형 AAV (AAV-7), 8형 AAV (AAV-8), 9형 AAV (AAV-9), 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하며, "솟과 AAV"는 소과 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하는 등이다. 예를 들어, 문헌 [BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (3 d ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.

용어 "rAAV"는 "재조합 AAV"를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 rep 및 cap 유전자의 일부분 또는 전체가 이종 서열로 교체된 AAV 게놈을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같은 "rAAV 벡터"는 AAV 기원의 것이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, AAV에 대해 이종인 폴리뉴클레오티드), 전형적으로는 세포의 유전적 형질전환을 위한 관심 서열을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 일반적으로, 이종 폴리뉴클레오티드에 적어도 1개, 일반적으로는 2개의 AAV 역전 말단 반복 서열 (ITR)이 플랭킹된다. 용어 rAAV 벡터는 rAAV 벡터 입자 및 rAAV 벡터 플라스미드 둘 모두를 포괄한다.

"캡시드-프리" 또는 "캡시드-리스" (또는 이의 변형) 벡터 또는 핵산 분자는 캡시드가 없는 벡터 구축물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 캡시드-리스 벡터 또는 핵산 분자는 예를 들어 AAV Rep 단백질을 코딩하는 서열을 함유하지 않는다.

"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 1개의 AAV 캡시드 단백질 (전형적으로는 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의한 것) 및 캡시드화된 폴리뉴클레오티드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 바이러스 또는 입자가 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 경우, 이는 "rAAV 벡터 입자"로 지칭될 수 있다. 따라서, rAAV 입자의 생산은 rAAV 벡터의 생산을 반드시 포함하는데, 이같은 벡터가 rAAV 입자 내에 함유되기 때문이다.

AAV용 "헬퍼 바이러스"는 AAV (예를 들어, 야생형 AAV)가 포유동물 세포에 의해 복제 및 패키징되도록 허용하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스 예컨대 우두를 포함하여 이같은 AAV용 헬퍼 바이러스가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 아데노바이러스는 다수의 상이한 아군을 포함하지만, C 아군의 5형 아데노바이러스가 가장 통상적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 수많은 아데노바이러스가 공지되어 있고, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수가능하다. 헤르페스 과의 바이러스는, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 뿐만 아니라 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및 거짓광견병 바이러스 (PRV)를 포함하고, 이들 또한 ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, "역전 말단 반복물" (또는 "ITR")은 뉴클레오티드 세트 (초기 서열)의 하류에 이의 역전 상보물이 이어지는 것, 즉 회문식 서열을 포함하는, 단일 가닥 핵산 서열의 5' 또는 3' 끝부분에 위치하는 핵산 하위서열을 지칭한다. 초기 서열과 역전 상보물 사이의 뉴클레오티드의 개재 서열은 임의의 길이일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "향성"은 하나 이상의 특정 세포 유형을 감염시키는 AAV 벡터 또는 비리온의 능력을 지칭하지만, 하나 이상의 특정 세포 유형에서 어떻게 벡터가 세포에 형질도입되도록 기능하는지를 또한 포함할 수 있다; 즉, 향성은 AAV 벡터 또는 비리온의 특정 세포 또는 조직 유형(들)으로의 우선적인 진입 및/또는 특정 세포 또는 조직 유형 내로의 진입을 용이하게 하는 세포 표면과의 우선적인 상호작용을 지칭하고, 임의적으로 및 바람직하게는, 세포 내에서의 AAV 벡터 또는 비리온이 보유하는 서열의 발현 (예를 들어, 전사, 및 임의적으로는 번역), 예를 들어, 재조합 바이러스의 경우, 이종 뉴클레오티드 서열(들)의 발현이 이어진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질도입"은 하나 이상의 특정 세포 유형을 감염시키는 AAV 벡터 또는 비리온의 능력을 지칭하고, 즉, 형질도입은 AAV 벡터 또는 비리온이 세포 내로 진입하고, AAV 벡터 또는 비리온 내에 함유된 유전 물질 세포 내로 전달되어, 벡터 게놈으로부터의 발현을 수득하는 것을 지칭한다. 모든 경우는 아니지만, 일부 경우에, 형질도입 및 향성이 상관관계가 있을 수 있다.

"투여함"은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 치료제를 대상체에 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 예를 들어, AAV 요법의 경우에, 예시적인 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복막내, 척추 또는 기타 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "비경구 투여"라는 구절은 일반적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 치료제는 비-비경구 경로를 통해 또는 경구로 투여될 수 있다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 질, 직장, 설하 또는 국소를 포함한다. 또한 투여는, 예를 들어, 1회, 복수회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.

용어 "항체" (Ab)는, 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하고, 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린을 포함한다. 각각의 H 쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 V _H 로 약기됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 적어도 3개의 불변 도메인 C _H1 , C _H2 및 C _H3 을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 V _L 로 약기됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 불변 도메인 C _L 을 포함한다. V _H 및 V _L 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해지는 더욱 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 V _H 및 V _L 은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.

용어 "항체" (Ab)는, 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하고 본원에서 정의된 바와 같은 면역글로불린의 임의의 항원-결합 부분을 또한 포함한다.

면역글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG, 및 IgM을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 통상적으로 공지된 이소형 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. IgG 서브클래스 또한 관련 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 또는 서브클래스 (예를 들어, 각각 IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 용어 "항체"는, 예를 들어, 천연 발생 및 비-천연 발생 항체 둘 모두; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 또는 비-인간 항체; 전체적으로 합성인 항체; 및 단일쇄 항체를 포함한다. 비-인간 항체는 인간에서의 이의 면역원성을 감소시키도록 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 명시적으로 언급되지 않은 경우, 그리고 문맥적으로 달리 지시되지 않으면, 용어 "항체"는 상기 언급된 면역글로불린 중 임의의 것의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 부분을 또한 포함하고, 1가 및 2가 단편 또는 일부분, 및 단일쇄 항체를 포함한다.

"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, AAV에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 AAV 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

용어 "모노클로날 항체" (mAb)는 단일한 분자 조성의 항체 분자, 즉 1차 서열이 본질적으로 동일하고 특정 에피토프에 대한 단일한 결합 특이성 및 친화력을 나타내는 항체 분자의 비-천연 발생 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체는 단리된 항체의 예이다. 모노클로날 항체는 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 하이브리도마, 재조합, 트랜스제닉, 또는 기타 기술에 의해 생산될 수 있다.

용어 "중화 항체" (nAb)는 표적에 결합하여 표적의 기능을 억제 또는 차단하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, AAV-9에 결합하는 중화 항체는 AAV-9에 결합하여 AAV-9의 기능을 파괴할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중화 AAV 항체는 바이러스 입자가 표적 세포에 결합하고 진입하기 전에 AAV 바이러스 입자에 결합하여, 바이러스 입자가 표적 세포에 결합 및/또는 진입하고 세포 내에 트랜스진을 방출하는 것을 방지한다.

"항-항원 항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 항-AAV 항체는 AAV 바이러스 입자에 특이적으로 결합한다.

항체의 "항원-결합 부분" (또는 "항원-결합 단편"으로 칭해짐)은 전체 항체가 결합하는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다.

"고처리량 방법"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 단일 검정법에서 복수의 생물학적 샘플의 특성화를 허용하는 방법 또는 검정법을 지칭한다. 예를 들어, 고처리량 방법은 단일 검정법에서 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 또는 적어도 100개의 생물학적 샘플 내의 항체 역가를 측정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고처리량 방법 또는 검정법은 멀티웰 플레이트를 사용한다. 일부 실시양태에서, 복수의 생물학적 샘플이 병행으로 측정된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "병행"으로 측정되는 샘플은 동시에 측정된다. 일부 실시양태에서, 복수의 생물학적 샘플은 순차적으로 측정된다.

대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환과 연관된 증상, 합병증, 병태 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전시키거나, 완화시키거나, 호전시키거나, 억제시키거나, 느리게 하거나, 또는 방지하는 목적으로 대상체에 수행되는 임의 유형의 개입 또는 프로세스 또는 대상체에게 활성 작용제를 투여하는 것을 지칭한다.

"대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 척추동물 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 및 설치류 예컨대 마우스, 래트, 및 기니 피그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

"역가" 또는 "항체 역가"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 특정 항체의 양을 지칭한다. 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 항체의 역가를 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체를 함유하는 샘플을 항체가 더 이상 배경을 초과하여 검출되지 않을 때까지 연속적으로 희석하는 것에 의해 항체의 역가가 측정된다. 이같은 예에서, 항체의 역가는 이러한 배수 희석 미만에서 항체의 농도가 배경 수준으로 감소되는 배수 희석으로 표현된다. 예를 들어, 1:800의 희석이 배경 수준을 초과하여 검출되는 연속 희석에서의 최고 희석이면, 항체의 역가가 800으로 표현된다. 1:40,000의 희석이 배경 수준을 초과하여 검출되는 연속 희석에서의 최고 희석이면, 항체의 역가가 40,000으로 표현된다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체의 역가는 약 40,000 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체의 역가는 약 800 미만이다.

일부 실시양태에서, 항체 역가는 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 측정된다. 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 ELISA가 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다. ELISA는 시험관내에서 샘플 내의 표적의 존재를 검출하기 위한 일련의 항체 상호작용을 특징으로 한다. ELISA는 직접 검정법, 간접 검정법, 또는 포착 검정법 (즉, 샌드위치 검정법)을 포함할 수 있다. 직접 검정법에서, 항원이 표면에 결합된다. 효소에 접합된 1차 항체가 표면에 적용되고, 1차 항체가 항원에 결합한다. 그 후, 효소에 의해 작용되는 기질이 첨가되어, 검출가능한 신호를 생산하고, 이는 표면 상의 항원의 존재를 지시한다. 간접 검정법에서, 항원이 표면에 결합된다. 그 후, 1차 항체가 표면에 적용되고, 1차 항체가 항원에 결합한다. 그 후, 효소에 접합된 2차 항체가 표면에 적용된다. 2차 항체는 1차 항체에 결합할 수 있다. 그 후, 효소에 의해 작용되는 기질이 첨가되어, 검출가능한 신호를 생산하고, 이는 표면 상의 항원의 존재를 지시한다. 포착 검정법에서, 항체가 표면에 결합되고, 항원을 포함하는 샘플이 표면에 적용된다. 그 후, 간접 검정법에서와 같이 1차 항체 및 2차 항체가 적용된다.

일부 실시양태에서, ELISA는 "화학발광 ELISA"이다. "화학발광 ELISA" 또는 "발광 검정법" 또는 "화학발광 검정법"은 빛의 방출을 표적이 존재하는 지표로 사용하는 ELISA 유형이다. 그 후, 방출된 빛의 강도를 측정하고, 샘플 내의 표적의 풍부도와 상관시킬 수 있다. 화학발광 ELISA에서는, 효소가 기질을 빛의 광자를 방출하는 반응 생성물로 전환시킨다. 발광은 물질이 전자적으로 여기된 상태에서 기저 상태로 돌아갈 때 물질로부터 빛이 방출되는 것으로 기술된다. 화학발광은 화학 반응에 의해 생산되는 빛이다. 여기된 중간체가 이의 안정적인 기저 상태로 돌아갈 때, 광자가 방출되고, 이는 발광 신호 기구에서 센서에 의해 검출된다. 발광 신호의 강도가 화학발광 단위로 표현될 수 있고, 여기서 검출된 화학발광 단위의 수가 클수록 생물학적 샘플 내의 표적의 역가가 더 높다.

임의의 화학발광 효소 및 기질을 본원에 개시된 방법에서 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학발광 효소는 알칼리성 포스파타제 (AP)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학발광 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학발광 효소는 베타 갈락토시다제 및 베타 락타마제를 포함한다.

일부 실시양태에서, ELISA 검정법은 (1) 표면을 AAV 표적, 예를 들어, AAV-9 바이러스 입자로 코팅하고; (2) 표면을 하나 이상의 항-AAV 항체를 포함하는 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플과 접촉시키고; (3) 표면을 효소, 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 융합된 2차 항체와 접촉시키고, 여기서 2차 항체는 항-AAV 항체에 결합할 수 있고; (4) 표면을 화학발광 기질과 접촉시키고; (5) 표면으로부터 방출되는 빛을 측정하는 것을 포함한다.

대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안들 중 하나, 둘 모두, 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나"는 "하나 이상"의 임의의 언급되거나 열거된 성분을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.

용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 분야의 통상의 기술자에 의해 결정되는 바와 같은 특정 값 또는 조성에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하고, 이는 값 또는 조성이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 제약에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 분야의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 20%까지의 범위를 의미할 수 있다. 더욱이, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 이러한 용어는 값의 10배까지 또는 5배까지를 의미할 수 있다. 특정 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에서 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 특정 값 또는 조성에 대한 허용가능한 오차 범위 내인 것으로 가정되어야 한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약 1주마다 1회", "약 2주마다 1회", 또는 임의의 다른 유사한 투약 간격 용어는 대략적인 횟수를 의미한다. "약 1주마다 1회"는 7일±1일마다, 즉 6일마다 내지 8일마다를 포함할 수 있다. "약 2주마다 1회"는 14일±3일마다, 즉 11일마다 내지 17일마다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약 3주마다 1회, 약 4주마다 1회, 약 5주마다 1회, 약 6주마다 1회, 및 약 12주마다 1회에 유사한 근사치가 적용된다. 일부 실시양태에서, 약 6주마다 1회 또는 약 12주마다 1회의 투약 간격은 제1 용량이 제1주의 임의의 날에 투여될 수 있고, 그 후 다음 용량이 각각 6번째 주 또는 12번째 주의 임의의 날에 투여될 수 있다는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 약 6주마다 1회 또는 약 12주마다 1회의 투약 간격은 제1 용량이 제1주의 특정일 (예를 들어, 월요일)에 투여되고, 그 후 다음 용량이 각각 6번째 주 또는 12번째 주의 동일한 날 (즉, 월요일)에 투여된다는 것을 의미한다.

본원에 기술된 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위, 또는 정수 범위는 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적합한 경우, 이의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 개시내용의 다양한 측면이 하기의 하위섹션에서 추가로 상세하게 기술된다.

II. 개시내용의 방법

본 개시내용의 특정 측면은 ELISA를 사용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

본 개시내용의 일부 측면은 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체는 ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정 시 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 (1) ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 단계, (2) 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 단계이며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 (1) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, (2) ELISA에서 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 단계, (3) 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 단계이며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 (1) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하거나 또는 수득하였고, (2) ELISA에서 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하거나 또는 측정하였고, (3) 대상체에게 AAV 요법을 투여하며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 개시내용의 방법은 AAV 요법으로 치료될 수 있는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 질환 또는 병태의 치료에 유용하다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은 대상체의 심장, 간, 폐, 눈, 혈액, 신경계, 림프계, 근육, 줄기 세포 및 그의 임의의 조합에 영향을 미치는 질환 또는 병태의 치료에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 중추 신경계에 영향을 미치는 질환 또는 병태이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 심장 질환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 병태는 심부전을 포함한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 병태는 급성 또는 만성 심부전을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 질환 또는 병태는 박출률이 감소된 심부전 (HFrEF)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 질환 또는 병태는 박출률이 보존된 심부전을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 낭성 섬유증, 혈우병 B, 관절염, 유전성 폐기종, 레베르 선천 흑암시, 황반 변성 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성), 뒤시엔느 근위축증 (DMD), 파킨슨병, 카나반병, 배튼병, 알츠하이머병, 척수 근위축증, 울혈성 심부전, 이중대립유전자 RPE65 돌연변이-연관 망막 이영양증, 또는 그의 임의의 조합이다.

본 개시내용의 일부 측면은 ELISA를 사용하여 상응하는 복수의 대상체로부터 수득된 복수의 생물학적 샘플 각각 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 고처리량 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 2명/마리, 적어도 약 3명/마리, 적어도 약 4명/마리, 적어도 약 5명/마리, 적어도 약 10명/마리, 적어도 약 15명/마리, 적어도 약 20명/마리, 적어도 약 25명/마리, 적어도 약 30명/마리, 적어도 약 35명/마리, 적어도 약 40명/마리, 적어도 약 45명/마리, 적어도 약 50명/마리, 적어도 약 55명/마리, 적어도 약 60명/마리, 적어도 약 65명/마리, 적어도 약 70명/마리, 적어도 약 75명/마리, 적어도 약 80명/마리, 적어도 약 85명/마리, 적어도 약 90명/마리, 적어도 약 95명/마리, 적어도 약 100명/마리, 적어도 약 150명/마리, 적어도 약 200명/마리, 적어도 약 250명/마리, 적어도 약 500명/마리, 적어도 약 750명/마리, 또는 적어도 약 1000명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 10명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 20명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 30명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 40명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 50명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 60명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 70명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 80명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 90명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 적어도 약 100명/마리의 대상체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 2 내지 약 100명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 2 내지 약 90명/마리의 대상체, 2 내지 약 85명/마리의 대상체, 2 내지 약 80명/마리의 대상체, 2 내지 약 75명/마리의 대상체, 2 내지 약 70명/마리의 대상체, 2 내지 약 65명/마리의 대상체, 2 내지 약 60명/마리의 대상체, 2 내지 약 55명/마리의 대상체, 2 내지 약 50명/마리의 대상체, 2 내지 약 45명/마리의 대상체, 2 내지 약 40명/마리의 대상체, 2 내지 약 35명/마리의 대상체, 2 내지 약 30명/마리의 대상체, 2 내지 약 25명/마리의 대상체, 2 내지 약 20명/마리의 대상체, 2 내지 약 15명/마리의 대상체, 2 내지 약 10명/마리의 대상체, 또는 2 내지 약 5명/마리의 대상체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 약 5 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 10 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 15 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 20 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 25 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 30 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 35 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 40 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 45 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 50 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 55 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 60 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 65 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 70 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 75 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 80 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 85 내지 약 100명/마리의 대상체, 약 90 내지 약 100명/마리의 대상체, 또는 약 95 내지 약 100명/마리의 대상체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 약 10 내지 약 90명/마리의 대상체, 약 20 내지 약 80명/마리의 대상체, 약 30 내지 약 70명/마리의 대상체, 약 40 내지 약 60명/마리의 대상체, 약 25 내지 약 50명/마리의 대상체, 약 50 내지 약 75명/마리의 대상체, 약 25 내지 약 75명/마리의 대상체, 또는 약 50 내지 약 100명/마리의 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 대상체는 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 30 내지 약 40, 또는 약 40 내지 약 50명/마리의 대상체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 복수의 생물학적 샘플 각각에서의 역가는 병행으로 측정된다. 일부 실시양태에서, 복수의 생물학적 샘플 각각에서의 역가는 순차적으로 측정된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 생물학적 샘플에서 또는 복수의 생물학적 샘플 각각에서 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 것을 포함한다. 항-AAV 항체는 단일 클래스의 항-AAV 항체, 예를 들어, 단독 중화 항-AAV 항체, 또는 1개를 초과하는 클래스의 항-AAV 항체, 예를 들어, 중화 및 비-중화 항-AAV 항체의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체의 역가는 중화 항-AAV 항체의 역가, 비-중화 항-AAV 항체의 역가, 또는 둘 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체의 역가는 중화 항-AAV 항체의 역가 또는 비-중화 항체의 역가만 포함한다. 특정 실시양태에서, ELISA는 중화 항-AAV 항체 또는 비-중화 항-AAV 항체에 결합하는 2차 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 중화 및 비-중화 항-AAV 항체 둘 모두를 검출한다. 특정 실시양태에서, ELISA는 중화 항-AAV 항체 및 비-중화 항-AAV 항체에 결합하는 2차 항체를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 개시내용은 놀랍게도 생물학적 샘플 내의 전체 항-AAV 항체 역가와 중화 항-AAV 항체의 역가 사이의 상관관계를 확인한다.

항-AAV 항체는 임의의 단일 유형 또는 클래스의 항-AAV 항체, 예를 들어, 항-AAV-9 항체 또는 항-AAV-2 항체 또는 AAV-5 항체, 또는 1개를 초과하는 항-AAV 항체, 예를 들어, 항-AAV-9 항체 및 항-AAV-2 항체; 항-AAV-9 항체 및 항-AAV-5; 항-AAV-2 항체 및 항-AAV-5의 혼합물일 수 있다. 항-AAV 항체는 또한 임의의 이소형, 예를 들어, IgG, IgM, IgD, IgA 또는 IgE, 또는 그의 조합물일 수 있다.

II.A. 아데노-연관 바이러스 (AAV)

본 개시내용의 특정 측면은 항-AAV 항체를 검출하고/하거나 AAV를 대상체에게 투여하는 방법에 관한 것이다. 아데노-연관 바이러스 (AAV)는 파르보비리다에 과의 외피가 없는 단일-가닥 DNA 바이러스이다. 파르보비리다에 과의 대부분의 다른 구성원과 대조적으로, AAV는 복제 결함성이고, 헬퍼 바이러스 예컨대 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스의 존재 하에서만 효율적으로 복제될 수 있다.

AAV는 1960년대 중반에 아데노바이러스의 바이러스 제제의 오염물로서 최초로 보고되었다. 문헌 [Atchison R W, Casto B C, HAMMON W M. Science. 149(3685), 754-756 (1965)]을 참조한다. 그 이후로, 점진적으로 AAV를 재조합 DNA 벡터로 사용하기 위한 더욱 안전하고 더욱 효과적인 방법이 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Hermonat P.L. and Muzyczka N. Proc Natl Acad Sci USA. 81(20), 6466-6470 (1984). 3. Laughlin C.A., et al. Gene, 23(1), 65-73 (1983). Matsushita T., et al. Gene Ther. 5(7), 938-945 (1998). Xiao X., et al. Journal of Virology. 72(3), 2224-2232 (1998)]을 참조한다. 낮은 개수의 AAV 게놈이 숙주 염색체 내로 통합될 수 있는 것으로 보고되었다 (Cheung AK, Hoggan MD, Hauswirth WW, et al. Integration of the adeno-associated virus genome into cellular DNA in latently infected human detroit 6 cells. J Virol 1980;33:739-748). AAV는 임의의 공지된 아데노바이러스 항원과 면역학적으로 별개이다. AAV 캡시드는 단일-가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 함유한다 (Rose JA, Berns KI, Hoggan MD, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1969;64:863-869).

AAV는 2개의 역전 말단 반복물 (ITR)이 플랭킹된 복제 (rep) 유전자 및 캡시드 (cap) 유전자를 코딩하는 단일 가닥의 4.7 kb DNA 게놈을 갖는다. 이는 주로 비-통합성이고, 비-분열 조직에서 안정적인 에피솜을 형성한다. 성인 집단에서의 이의 높은 혈청-유병률에도 불구하고, 이는 어떠한 인간 질환과도 연관되지 않았다. 문헌 [Goncalves, M. Virol. J.　2, 43 (2005)]을 참조한다. AAV의 조직에서의 안정적인 발현, 병원성 결여, 및 높은 역가 생산의 용이성은 이를 매우 매력적이고 대중적인 유전자 전달 플랫폼이게 만든다.

재조합 AAV는 rep 및 cap 유전자의 일부분 또는 모두가 이종 서열로 교체된 유전자 조작 AAV이다. 야생형 AAV와 같이, rAAV는 유사분열후 조직에서 장기 트랜스진 발현을 촉발할 수 있는데, 이는 rAAV의 재조합 게놈이 핵 내에서 대부분 원형인 에피솜으로서 지속되기 때문일 가능성이 높다. rAAV 생산에 요구되는 rAAV의 유일한 시스-요소는 AAV 역전 말단 반복물 (ITR)인 반면, rep,　cap, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 트랜스로 제공될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 일부 실시양태에서, rAAV는 ITR이 플랭킹된 트랜스진 DNA만 함유하고, 이러한 게놈은 혈청형-특이적 캡시드 내에 캡시드화된다.

AAV는 이를 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적이게 만드는 독특한 특색을 보유한다. 배양 중인 세포의 AAV 감염은 일반적으로 비-세포병변성이고, 인간 및 다른 동물의 천연 감염은 침묵성이고, 무증상이다. 또한, AAV는 다수의 상이한 유형의 포유동물 세포를 감염시켜 생체 내에서 다수의 상이한 조직을 표적화하는 가능성을 허용한다. AAV는 다른 형태의 유전자 전달에 비교하여 더 경미한 면역 반응의 촉진 및 비-통합 벡터로서의 분열 세포 및 휴지 세포 둘 모두에서의 지속적인 발현을 포함하여, 이를 유전자 전달을 위한 특히 매력적인 바이러스 시스템으로 만드는 추가적인 장점도 지닌다. 또한, AAV는 아데노바이러스를 불활성화시키는데 사용되는 조건 (수 시간 동안 56 내지 65℃)을 견뎌서, rAAV-기반 백신의 저온 보존을 덜 중요하게 만든다.

헬퍼 바이러스는 표적 세포 내로의 AAV 형질도입 및 AAV 게놈 진입에 요구되지 않는다. 추가로, AAV 복제, 게놈 캡시드화 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되기 때문에, 이에 따라 게놈의 내부 약 4.7 kb (복제 및 구조 캡시드 단백질을 코딩함, rep-cap)가 유전자-치료제로서의 AAV 용도에 결정적인 어떠한 기능성도 상실되지 않으면서 프로모터, 관심 DNA 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카세트와 같은 외래 DNA로 교체될 수 있다.

AAV 벡터는 시스 또는 트랜스로 기능하는 추가적인 요소를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 벡터 게놈을 포함하는 AAV 벡터는 도너 서열의 5' 또는 3' 말단에 플랭킹된 하나 이상의 역전 말단 반복물 (ITR) 서열; 도너 서열의 전사를 유도하는 발현 제어 요소 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서), 예컨대 구성적이거나 또는 조절가능한 제어 요소, 또는 조직-특이적 발현 제어 요소; 인트론 서열, 스터퍼(stuffer) 또는 충전제 폴리뉴클레오티드 서열; 및/또는 도너 서열의 3'에 위치하는 폴리-아데닌 서열을 또한 갖는다.

일부 실시양태에서, 헬퍼 바이러스를 사용하여 AAV가 복제된다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스 예컨대 우두를 포함하여 다양한 이같은 AAV용 헬퍼 바이러스가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 개별적인 아데노바이러스 유형은 다수의 상이한 아군을 포함하지만, C 아군의 5형 아데노바이러스가 가장 통상적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 수많은 아데노바이러스가 공지되어 있고, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수가능하다. 헤르페스 과의 바이러스는, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 뿐만 아니라 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및 거짓광견병 바이러스 (PRV)를 포함하고, 이들 또한 ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수가능하다.

예시적인 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 중 임의의 것의 캡시드 단백질, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 캡시드 변이체를 포함한다. 본 발명의 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 중 임의의 것으로부터의 캡시드 단백질, 및 그의 변이체를 또한 포함한다. 특정한 캡시드 변이체는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 캡시드 변이체, 예컨대 아미노산 치환, 결실 또는 삽입/부가가 있는 캡시드 단백질을 포함한다.

본 개시내용의 특정 측면은 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다. 항-AAV 항체는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 AAV, 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 AAV의 임의의 측면, 예를 들어, 표면 단백질에 대해 특이적일 수 있다. 예시적인 AAV는 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV (3A형 및 3B형 포함), 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 뱀 AAV, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-1형 AAV에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-1형 AAV 항체, 항-2형 AAV 항체, 항-3A형 AAV 항체, 항-3B형 AAV 항체, 항-4형 AAV 항체, 항-5형 AAV 항체, 항-6형 AAV 항체, 항-7형 AAV 항체, 항-8형 AAV 항체, 항-9형 AAV 항체, 항-10형 AAV 항체, 항-11형 AAV 항체, 항-12형 AAV 항체, 항-13형 AAV 항체, 항-뱀 AAV 항체, 항-조류 AAV 항체, 항-솟과 AAV 항체, 항-갯과 AAV 항체, 항-말과 AAV 항체, 항-양 AAV 항체, 항-염소 AAV 항체, 또는 항-새우 AAV 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-2형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-3형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-4형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-5형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-6형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-7형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-8형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-9형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-10형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-11형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-12형 AAV에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 항-13형 AAV에 결합한다.

일부 실시양태에서, 항-AAV 항체는 1가지를 초과하는 AAV 혈청형, 예를 들어, 2형 AAV 및 9형 AAV에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체는 1개의 AAV 혈청형, 예를 들어, 9형 AAV 또는 2형 AAV에 임의의 다른 AAV 혈청형에 대한 것보다 더 높은 친화력으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-AAV 항체는 1개의 AAV 혈청형, 예를 들어, 9형 AAV 또는 2형 AAV에만 특이적으로 결합한다.

본 개시내용의 특정 측면에서, 방법은 AAV 요법을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 요법은 재조합 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 관련 기술 분야에 공지되어 있고/거나 본원에 개시된 임의의 재조합 AAV가 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 요법은 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV (3A형 및 3B형 포함), 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 뱀 AAV, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 1형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 2형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 3형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 4형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 5형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 6형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 7형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 8형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 9형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 10형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 11형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 12형 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 13형 AAV를 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 독특한 조직 표적화 능력 (예를 들어, 조직 향성)을 갖는 AAV에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 AAV 캡시드 폴리펩티드는 비-변이체 양친 캡시드 폴리펩티드에 비교하여 하나 이상의 인간 줄기 세포 유형에서 증가된 형질도입 또는 향성을 추가로 나타낸다. 일부 실시양태에서, 인간 줄기 세포 유형은 배아 줄기 세포, 성인 조직 줄기 세포 (즉, 체세포 줄기 세포), 골수, 전구 세포, 유도형 만능성 줄기 세포, 및 리프로그래밍 줄기 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 성인 줄기 세포는 기관양 줄기 세포 (즉, 신체 내의 임의의 관심 기관 또는 기관계로부터 유래된 줄기 세포)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV의 표적 조직은 생식선, 횡격막, 심장, 위, 간, 지라, 췌장 또는 신장이다. 일부 실시양태에서, AAV는 피부, 모발, 손톱, 감각 수용체, 한선, 피지선, 뼈, 근육, 뇌, 척수, 신경, 뇌하수체, 송과체, 시상하부, 갑상선, 부갑상선, 흉선, 부신, 췌장 (섬 조직), 심장, 혈관, 림프절, 림프관, 흉선, 지라, 편도선, 코, 인두, 후두, 기관, 기관지, 폐, 입, 인두, 식도, 위, 소장, 대장, 직장, 항문관, 치아, 타액선, 혀, 간, 담낭, 췌장, 충수, 신장, 요관, 방광, 요도, 고환, 정관, 요도, 전립선, 음경, 음낭, 난소, 자궁관 (난관), 질, 외음부, 및 유선 (유방)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신체 기관을 표적화한다. 신체의 기관계는 외피계, 골격계, 근육계, 신경계, 내분비계, 심혈관계, 림프계, 호흡계, 소화계, 비뇨계, 및 생식계를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 형질도입 및/또는 향성이 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 65%, 약 70%%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 약 100%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 형질도입 및/또는 향성이 약 5% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60% 또는 약 30% 내지 약 60%만큼 증가된다.

일부 실시양태에서, AAV 요법을 위한 AAV는 항-AAV 항체가 결합하는 AAV와 상이한 혈청형이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, AAV 요법은 2형 AAV의 투여를 포함하고, 항-AAV 항체는 항-9형 AAV 항체이다. 일부 실시양태에서, AAV 요법을 위한 AAV는 항-AAV 항체가 결합하는 AAV와 동일한 혈청형이다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 재조합 9형 AAV의 투여를 포함하고, 항-AAV 항체는 항-9형 AAV 항체이다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 재조합 5형 AAV의 투여를 포함하고, 항-AAV 항체는 항-5형 AAV 항체이다. 특정 실시양태에서, AAV 요법은 재조합 2형 AAV의 투여를 포함하고, 항-AAV 항체는 항-2형 AAV 항체이다.

II.A.1. AAV 유전자의 복제, 캡시드, 및 어셈블리

AAV의 단일-가닥 게놈은 rep (복제), cap (캡시드), 및 aap (어셈블리)의 3개의 유전자를 포함한다. 이러한 3개의 유전자는 3개의 프로모터, 대안적인 번역 개시 부위, 및 차별적인 스플라이싱을 사용하는 것을 통해 적어도 9개의 유전자 생성물을 초래한다.

rep　유전자는 바이러스 게놈 복제 및 패키징에 필요한 4개의 단백질 (Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40)을 코딩한다.

Cap 유전자 발현은 바이러스 게놈을 보호하는 외부의 캡시드 껍질을 형성할 뿐만 아니라 세포 결합 및 내재화에서 적극적으로 수반되는 바이러스 캡시드 단백질 (VP1; VP2; VP3)을 생성한다. 바이러스 코트는 20면체 구조로 배열된 60개의 단백질로 구성되는 것으로 추정된다.

aap　유전자는 cap　유전자와 중첩되는 교대 리딩 프레임에서 어셈블리-활성화 단백질 (AAP)을 코딩한다. 이러한 핵 단백질은 캡시드 어셈블리를 위한 스캐폴딩 기능을 제공하는 것으로 생각되고, 일부 AAV 혈청형에서 VP 단백질의 핵 국소화에서 역할을 한다.

일부 실시양태에서, rep, cap, 또는 aap 유전자 중 하나 이상이 천연 발생이고, 예를 들어 rep, cap, 또는 app 유전자가 파르보바이러스 rep, cap, 또는 aap 유전자 전체 또는 이의 일부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, rep, cap, 또는 aap 유전자 중 하나 이상이 합성 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, rep 유전자가 합성 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, cap 유전자가 합성 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, aap 유전자가 합성 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, rep 및 cap 유전자가 합성 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, rep 및 aap 유전자가 합성 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, cap 및 aap 유전자가 합성 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, rep, cap, 및 aap 유전자가 합성 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, rep는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된 AAV 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV1 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV2 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV3 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV4 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV5 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV6 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV7 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV8 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV9 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV10 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, rep는 AAV11 게놈으로부터의 것이다.

일부 실시양태에서, cap은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된 AAV 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV1 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV2 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV3 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV4 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV5 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV6 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV7 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV8 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV9 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV10 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, cap은 AAV11 게놈으로부터의 것이다.

일부 실시양태에서, aap는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된 AAV 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV1 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV2 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV3 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV4 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV5 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV6 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV7 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV8 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV9 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV10 게놈으로부터의 것이다. 특정한 실시양태에서, aap는 AAV11 게놈으로부터의 것이다.

본원에서 기술된 특정한 AAV 게놈은 상이한 AAV 게놈들 (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 AAV11로부터의 게놈)로부터의 유전자를 가질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, rep, cap, 또는 aap의 임의의 가능한 순열을 포함하는 AAV가 본원에서 개시된다.

본원에 개시된 일부 실시양태에서, AAV는 재조합 AAV (rAAV)이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 rep　유전자, cap 유전자, 및 aap 유전자 중 하나 이상이 결여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 rep 유전자가 결여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 cap 유전자가 결여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 aap 유전자가 결여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 rep 유전자가 결여되고, cap 유전자가 결여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 rep 유전자가 결여되고, aap 유전자가 결여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 cap 유전자가 결여되고, aap 유전자가 결여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 rep 유전자, cap 유전자, 및 aap 유전자가 결여된다.

본원에 개시된 일부 실시양태에서, rAAV는 rep 유전자, cap 유전자, 및 aap 유전자 중 하나 이상이 돌연변이되도록 변형되어, AAV 유전자 중 하나 이상의 발현이 변형된다. 일부 실시양태에서, rep 유전자가 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, cap 유전자가 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, aap 유전자가 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, rep 유전자 및 cap 유전자가 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, rep 유전자 및 aap 유전자가 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, cap 유전자 및 aap 유전자가 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, cap 유전자, rep 유전자, 및 aap 유전자가 돌연변이된다.

II.A.2. 역전 말단 반복물

특정 실시양태에서, AAV는 제1 ITR, 예를 들어, 5' ITR, 및 제2 ITR, 예를 들어, 3' ITR을 포함한다. 전형적으로, ITR은 원핵생물 플라스미드로부터의 파르보바이러스 (예를 들어, AAV) DNA 복제 및 구출, 또는 절단에서 수반된다 (Samulski et al., 1983, 1987; Senapathy et al., 1984; Gottlieb 및 Muzyczka, 1988). 추가적으로, ITR은 AAV 프로바이러스 통합 및 AAV DNA가 비리온 내로 패키징되는 것에 필요한 최소 서열인 것으로 보고된다 (McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989). 이러한 요소는 파르보바이러스 게놈의 효율적인 조작에 필수적이다.

일부 실시양태에서, ITR은 천연 발생 ITR을 포함하고, 예를 들어, ITR은 파르보바이러스 ITR 전체 또는 이의 일부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, ITR은 합성 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR이 합성 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 ITR 및 제2 ITR 각각이 합성 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR이 천연 발생 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 ITR 및 제2 ITR 각각이 천연 발생 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, ITR은 AAV 게놈으로부터의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된 AAV 게놈의 ITR이다. 특정한 실시양태에서, ITR은 AAV2 게놈의 ITR이다. 또 다른 실시양태에서, ITR은 이의 3' 및 5' 끝부분에 AAV 게놈 중 하나 이상으로부터 유래된 ITR을 포함하도록 유전적으로 조작된 합성 서열이다. 일부 실시양태에서, ITR들은 동일한 게놈으로부터, 예를 들어, 동일한 바이러스의 게놈으로부터, 또는 상이한 게놈으로부터, 예를 들어, 2개 이상의 상이한 AAV 게놈의 게놈으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, ITR들은 동일한 AAV 게놈으로부터 유래된다. 구체적 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자 내에 존재하는 2개의 ITR은 동일하고, 특히 AAV2 ITR, AAV5 ITR 또는 AAV9 ITR일 수 있다. 한 특정한 실시양태에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일하다.

일부 실시양태에서, ITR은 헤어핀 루프 구조를 형성한다. 한 실시양태에서, 제1 ITR이 헤어핀 구조를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 ITR이 헤어핀 구조를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 ITR 및 제2 ITR 둘 모두가 헤어핀 구조를 형성한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산 분자 내의 ITR은 전사적으로 활성화된 ITR이다. 전사적으로 활성화된 ITR은 적어도 하나의 전사적으로 활성인 요소를 포함하는 것에 의해 전사적으로 활성화된 야생형 ITR 전체 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 다양한 유형의 전사적으로 활성인 요소가 이러한 맥락에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 전사적으로 활성인 요소는 구성적인 전사적으로 활성인 요소이다. 구성적인 전사적으로 활성인 요소는 지속적인 수준의 유전자 전사를 제공하고, 트랜스진이 지속적인 기반으로 발현되는 것을 원하는 경우에 선호된다. 다른 실시양태에서, 전사적으로 활성인 요소는 유도성의 전사적으로 활성인 요소이다. 유도성의 전사적으로 활성인 요소는 일반적으로 유도제 (또는 유도 조건)의 부재 하에 낮은 활성을 나타내고, 유도제 (또는 유도 조건으로의 전환)의 존재 하에 상향-조절된다. 유도성의 전사적으로 활성인 요소는 특정 시간에만 또는 특정 장소에서만 발현을 원하는 경우에, 또는 유도제를 사용하여 발현 수준을 적정하는 것이 바람직한 경우에 선호될 수 있다. 전사적으로 활성인 요소는 또한 조직-특이적일 수 있다; 즉, 이는 특정 조직 또는 세포 유형에서만 활성을 나타낸다.

전사적으로 활성인 요소는 다양한 방식으로 ITR 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전사적으로 활성인 요소는 ITR의 임의의 부분에 대해 5'으로 또는 ITR의 임의의 부분에 대해 3'으로 혼입된다. 다른 실시양태에서, 전사적으로 활성화된 ITR의 전사적으로 활성인 요소는 2개의 ITR 서열 사이에 놓인다. 전사적으로 활성인 요소가 이격되어야 하는 2개 이상의 요소를 포함하는 경우, 이러한 요소들은 ITR의 일부분과 교대될 수 있다. 일부 실시양태에서, ITR의 헤어핀 구조가 결실되고, 전사 요소의 역전 반복물로 교체된다. 이러한 후자의 배열은 구조 내에 결실 부분을 모사하는 헤어핀을 생성시킬 것이다. 다수의 직렬식인 전사적으로 활성인 요소가 전사적으로 활성화된 ITR 내에 또한 존재할 수 있고, 이들은 인접하거나 또는 이격될 수 있다. 추가적으로, 단백질 결합 부위 (예를 들어, Rep 결합 부위)가 전사적으로 활성화된 ITR의 전사적으로 활성인 요소 내로 도입될 수 있다. 전사적으로 활성인 요소는 RNA를 형성시키도록 RNA 중합효소에 의한 DNA의 제어된 전사를 가능하게 하는 임의의 서열을 포함할 수 있고, 예를 들어, 하기 기술된 바와 같은 전사적으로 활성인 요소를 포함할 수 있다.

전사적으로 활성화된 ITR는 비교적 제한된 뉴클레오티드 서열 길이에서 전사 활성화 및 ITR 기능 둘 모두를 핵산 분자에 제공하고, 이는 핵산 분자로부터 운반 및 발현될 수 있는 트랜스진의 길이를 효과적으로 최대화한다. ITR 내로의 전사적으로 활성인 요소의 혼입은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. ITR 서열의 비교, 및 전사적으로 활성인 요소의 서열 요건이 ITR 내의 요소를 코딩하는 방식에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 예를 들어, 전사적으로 활성인 요소의 기능성 요소를 복제하는 ITR 서열 내의 특이적인 변화의 도입을 통해 전사 활성이 ITR에 부가될 수 있다. 특이적인 부위에서 특정한 뉴클레오티드 서열을 효율적으로 부가, 결실 및/또는 변화시키도록 다수의 기술이 관련 기술 분야에 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Deng and Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200:81-88]을 참조한다). 전사적으로 활성화된 ITR을 생성시키는 또 다른 방식은 ITR 내의 원하는 위치에서 제한 부위를 도입하는 것을 수반한다. 추가적으로, 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 다수의 전사적으로 활성인 요소가 전사적으로 활성화된 ITR 내로 혼입될 수 있다.

예시적으로, 전사적으로 활성화된 ITR이 하나 이상의 전사적으로 활성인 요소 예컨대 TATA 박스, GC 박스, CCAAT 박스, Sp1 부위, Inr 영역, CRE (cAMP 조절 요소) 부위, ATF-1/CRE 부위, APBβ 박스, APBα 박스, CArG 박스, CCAC 박스, 또는 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 전사에서 수반되는 임의의 다른 요소를 포함하는 것에 의해 생성될 수 있다.

II.A.3. 관심 유전자 및 기타 서열

본 개시내용의 특정 측면은 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, AAV는 관심 유전자 (GOI)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 비-AAV 유전자이다. 일부 실시양태에서, GOI는 포유동물 유전자이다. 일부 실시양태에서, GOI는 인간 유전자이다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드는 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 응고 인자, 호르몬, 항체, 인슐린, 또는 그의 임의의 조합이다.

일부 실시양태에서, 관심 유전자는, 예를 들어, 치료 폴리펩티드 또는 이의 치료적으로 효과적인 일부분을 코딩한다. 관심 유전자는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 발현되는 유전자는 사용자가 원하는 임의의 필요한 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 오퍼레이터)가 있는, 단백질을 코딩하는 DNA 분절, 또는 분절의 전사로 일부 RNA-함유 분자, 예컨대 리보자임 또는 안티-센스 분자 전체 또는 이의 일부분이 생산되는 비-코딩 DNA 분절일 수 있다.

일부 실시양태에서, AAV는 1개를 초과하는 GOI를 포함한다. 1개를 초과하는 GOI가 있는 AAV에서, 일부 실시양태는 IRES 또는 2A와 같은 요소를 포함하여, 하나의 프로모터로부터 이들을 공동-발현시킨다. 일부 실시양태에서, AAV는 IRES 요소에 의해 분리되는 2개의 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV는 2A 요소에 의해 분리되는 2개의 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV는 관심 유전자들 사이의 IRES 요소에 의해 분리되는 3개의 관심 유전자를 포함한다 (예를 들어, GOI-IRES-GOI-IRES-GOI). 일부 실시양태에서, AAV는 관심 유전자들 사이의 2A 요소에 의해 분리되는 3개의 관심 유전자를 포함한다.

일부 실시양태에서, AAV는 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV는 비-코딩 조절 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 게놈은 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이같은 조절 서열이, 예를 들어, 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에서 기술된다. 관련 기술 분야의 기술자는 조절 서열의 선택을 포함하는 AAV의 디자인이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 좌우될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 게놈은 mRNA 스플라이스 도너/스플라이스 어셉터 부위를 포함한다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비-바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로, 상이한 공급원들로부터의 서열로 구성된 조절 요소, 예컨대 SV40 초기 프로모터 및 1형 인간 T 세포 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복물로부터의 서열을 함유하는 SRa 프로모터 시스템 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). 특정 실시양태에서, 조절 서열은 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직 특이적 프로모터는 심장, 간, 폐, 눈, 신경계, 림프계, 근육 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에서 관심 유전자의 발현을 유도한다.

II.B. ELISA

본 개시내용의 특정 측면은 ELISA를 사용하여 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 검출 및/또는 측정하는 방법에 관한 것이다. 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 ELISA가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, ELISA는 집단 ELISA이다. 특정 실시양태에서, ELISA는 발광 ELISA이다. 특정 실시양태에서, ELISA는 화학발광 ELISA이다.

본 개시내용의 특정 측면에서, ELISA는 표적 AAV를 표면, 예를 들어, 플레이트의 표면에 결합시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, ELISA는 그 후 표면에 결합된 AAV를 생물학적 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, ELISA는 그 후 2차 항체를 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 효소에 연결된다. 일부 실시양태에서, ELISA는 그 후 기질을 적용하는 것을 포함하고, 여기서 기질은 2차 항체에 연결된 효소에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, ELISA는 기질 상에 작용하는 효소의 생성물을 측정하는 것을 포함한다.

특정 실시양태에서, 표면에 결합되는 표적 AAV는 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV, 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면에 결합되는 표적 AAV는 2형 AAV를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면에 결합되는 표적 AAV는 2형 rAAV를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면에 결합되는 표적 AAV는 5형 AAV를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면에 결합되는 표적 AAV는5형 rAAV를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면에 결합되는 표적 AAV는 9형 AAV를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면에 결합되는 표적 AAV는 9형 rAAV를 포함한다.

특정 실시양태에서, ELISA의 표면에 생물학적 샘플이 적용된다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 수득된 임의의 샘플일 수 있고, 여기서 샘플은 하나 이상의 항-AAV 항체를 포함하거나 또는 포함하는 것으로 여겨진다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플을 포함한다.

생물학적 샘플은 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 수집 및/또는 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 직접적으로, 예를 들어, 대상체의 순환계로부터 샘플을 직접적으로 취함으로써 수득된다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 실험실로부터 수득되고, 여기서 실험실 또는 전임자는 이전에 대상체로부터 직접적으로 생물학적 샘플을 수득하였다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 신선하고, 예를 들어, 샘플이 장기간 동안 동결 또는 보관되지 않았다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 37℃ 미만의 온도에서 보관되었다.

특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 ELISA 전에 희석된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 1:2, 적어도 약 1:3, 적어도 약 1:4, 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 적어도 약 1:20, 적어도 약 1:30, 적어도 약 1:40, 적어도 약 1:50, 적어도 약 1:100, 적어도 약 1:150, 적어도 약 1:200, 적어도 약 1:250, 적어도 약 1:300, 적어도 약 1:350, 적어도 약 1:400, 적어도 약 1:450, 적어도 약 1:500, 적어도 약 1:1000, 적어도 약 1:2000, 적어도 약 1:3000, 적어도 약 1:4000, 적어도 약 1:5000, 적어도 약 1:10,000, 적어도 약 1:20,000, 적어도 약 1:30,000, 적어도 약 1:40,000, 적어도 약 1:50,000, 또는 적어도 약 1:100,000만큼 희석된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 1:4만큼 희석된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 1:40만큼 희석된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 1:400만큼 희석된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 1:4000만큼 희석된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 1:40,000만큼 희석된다. 이러한 환경에서 통상적으로 사용되고 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 희석 완충제를 사용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 이를 ELISA의 표면에 적용하기 전에 정제된다.

특정 실시양태에서, 2차 항체는 항-인간 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 항-인간 λ 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 항-인간 κ 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 항-인간 κ 항체 및 항-인간 λ 항체의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 염소 항-인간 λ 항체이다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 토끼 항-인간 κ 항체이다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 토끼 항-인간 λ 항체이다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 마우스 항-인간 κ 항체이다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 염소 항-인간 λ 항체이다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 마우스 항-인간 κ 항체이다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 래트 항-인간 λ 항체이다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 래트 항-인간 κ 항체이다.

일부 실시양태에서, 2차 항체는 효소에 연결된다. 효소는 ELISA용으로 관련 기술 분야에서 사용되는 임의의 효소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 알칼리성 포스파타제 (AP)에 연결된다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 연결된다. 특정 실시양태에서, 2차 항체는 HRP-접합 염소 항-인간 λ 항체이다. 특정 실시양태에서, 2차 항체는 HRP-접합 염소 항-인간 κ 항체이다. 일부 실시양태에서, 2차 항체는 HRP-접합 염소 항-인간 λ 항체 및 HRP-접합 염소 항-인간 κ 항체의 조합물을 포함한다.

본 개시내용의 특정 측면은 ELISA를 사용하여 항-AAV 항체의 역가가 낮은 대상체를 확인하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 항-AAV 항체의 낮은 역가는 약 800 미만 내지 약 40,000 미만이다. 일부 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 50,000 미만, 약 45,000 미만, 약 40,000 미만, 약 35,000 미만, 약 30,000 미만, 약 25,000 미만, 약 20,000 미만, 약 15,000 미만, 약 10,000 미만, 약 9000 미만, 약 8000 미만, 약 7000 미만, 약 6000 미만, 약 5000 미만, 약 4000 미만, 약 3000 미만, 약 2000 미만, 약 1000 미만, 약 900 미만, 약 800 미만, 약 700 미만, 약 600 미만, 또는 약 500 미만이다.

특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 40,000 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 10,000 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 4000 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 1000 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 900 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 850 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 800 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 750 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 700 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 650 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 600 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 550 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 500 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 400 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 300 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 200 미만이다. 특정 실시양태에서, 화학발광 ELISA에 의해 측정 시, 항-AAV 항체 역가는 약 100 미만이다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 100,000 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 100,000 미만, 약 50,000 미만, 약 45,000 미만, 약 40,000 미만, 약 35,000 미만, 약 30,000 미만, 약 25,000 미만, 약 20,000 미만, 약 15,000 미만, 약 10,000 미만, 약 9000 미만, 약 8000 미만, 약 7000 미만, 약 6000 미만, 약 5000 미만, 약 4000 미만, 약 3000 미만, 약 2000 미만, 약 1000 미만, 약 950 미만, 약 900 미만, 약 850 미만, 약 800 미만, 약 750 미만, 약 700 미만, 약 650 미만, 약 600 미만, 약 5500 미만, 또는 약 500 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다.

특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 10,000 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 4000 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 1000 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 900 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 850 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 800 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 750 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 700 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 650 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 600 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 550 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 500 미만의 화학발광 단위를 방출하면 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된다.

일부 실시양태에서, 항-AAV 항체의 낮은 역가는 중화 항-AAV 항체의 낮은 역가와 상관관계가 있다.

추가 제한으로 해석되지 않아야 하는 하기의 실시예에 의해 본 개시내용이 추가로 예시된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌의 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.

실시예

실시예 1

본 연구는 환자 배제 목적을 위해 세포-기반 검정법을 전체 항체 검정법으로 교체하는 것을 목표로, ELISA를 사용하여 측정된 항-AAV 항체의 전체 역가와 표준 세포-기반 검정법을 사용하여 측정된 중화 항체의 역가 사이에 상관관계가 있는지를 결정하도록 의도된다.

본 발명가들은 항-AAV9 항체에 대한 고도로 감수성인 화학발광 플레이트-기반 ELISA 검출 방법을 개발하였다. 또한 본 발명가들은 ELISA 신호의 특이성을 평가하기 위해 전체 항체 스크리닝 방법 내로 확증 단계를 구축하였다. 이러한 검정법을 사용하여, 100개를 초과하는 심장 질환 환자 혈청 샘플을 전체 AAV 항체에 대해 분석하였다. 동일한 샘플을 AAV 결합 및 세포 내로의 진입을 방지하는 항체의 능력을 측정한 전형적인 세포-기반 리포터 검정법에서 중화 항체에 대해 평가하였다.

본 발명가들의 결과는 AAV 혈청형 9에 대한 전체 항체 집단과 중화 항체 집단 사이의 강한 상관관계를 시사한다. 이러한 결과를 기초로, 본 발명가들은 AAV9 기반 유전자 치료제가 제공되는 환자를 스크리닝 및 선택하기 위한 전체 항체 ELISA 검정법의 용도를 제안한다.

물질 및 방법

시약

스코틀랜드의 유니버시티 오브 던디(University of Dundee)의 동의 환자로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 대상체는 HFrEF (박출률이 감소된 심부전) 또는 HFpEF (박출률이 보존된 심부전)의 심부전 환자였다. 혈청 샘플은 BMS와 유니버시티 오브 던디 사이의 물질 이전 계약 (MTA)에 따라 조달되었고, 사용할 때까지 BMS 바이오리포지토리(BMS Biorepository)에서 -80℃에서 보관되었다.

효소-연결 면역흡착 검정법

rAAV9S100A1 (AMT-120; 유니큐어 암스테르담(uniQure Amsterdam)) 또는 rAAV9HLuc (AAV9-CMV-루시퍼라제 924; 유니큐어 암스테르담) 스톡을 카르보네이트-비카르보네이트 완충제 (SRE0034; SIGMA)에서 2.5-5.1×10¹¹ 역가 입자/mL (약 4-8 ㎍/mL 전체 단백질 농도)로 희석하였다. 100 ㎕를 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 플레이트를 마이크로플레이트 밀봉제 (WHA77040001; 시그마(SIGMA))로 밀봉하고, 4 ℃ 냉장고에서 16-18시간 동안 인큐베이션하여, AAV9가 플레이트의 폴리스티렌 표면에 수동으로 흡착되도록 허용하였다. 비색 ELISA의 경우, 눈크(Nunc) 96웰 투명 폴리스티렌 플레이트 (써모 피셔(Thermo Fisher), 덴마크 로스킬데)를 사용하였다. 화학발광 ELISA의 경우, 코닝(Corning) 96웰 흑색 폴리스티렌 플레이트 (코닝 인크(Corning Inc.), 뉴욕)를 사용하였다. 다음날, 플레이트를 매회 자동화 플레이트 세정기 (바이오테크(Biotek) ELx405, 버몬트주 위누스키)에서 300 ㎕의 PBS/0.05% 트윈(Tween) 20 완충제 (카타 바이오시스템즈(Chata Biosystems))를 사용하여 3× 세정하였다. 추가 단계에서 비-특이적 단백질 검출을 차단하도록 플레이트에 300 ㎕의 수퍼블럭(Superblock) T20 (SBT20) 완충제 (써모사이언티픽(ThermoScientific))를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 진탕하지 않으면서 22℃ 인큐베이터에서 2.5-3시간 동안 인큐베이션하였다.

SBT20 완충제를 희석제로서 사용하여 폴리프로필렌 플레이트 (951031861; 에펜도르프(Eppendorf))에서 ADK9 항-rAAV9 모노클로날 항체 대조군 (651162; 프로젠(Progen)) 및 인간 혈청 희석물을 제조하였다. ADK9 대조군 항체는 도면 범례에 지시된 바와 같이 1:50, 1:100, 또는 1:1000의 희석물로 사용되었다. 혈청 샘플을 도면에 지시된 바와 같은 다양한 수준으로 희석하였다. 사용할 때까지 희석물을 4℃에서 보관하였다. 경쟁 ELISA의 경우, ADK9 대조군 및 혈청 희석물을 의도된 농도의 2×로 제조하고, 동일한 양을 8 ㎍/mL의 rAAV9 (경쟁 Ab) 또는 동일한 부피의 SBT20 완충제 (비경쟁 대조군)와 혼합하고, 사용하기 전에 2시간 동안 22℃에서 폴리프로필렌 플레이트에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 앞서 기술된 바와 같이 세정하고, 100 ㎕의 희석된 rAAV9 ADK9 대조군 항체 또는 인간 혈청을 플레이트에 첨가하였다. 배경 대조군의 경우, 100 ㎕의 SBT20 완충제를 대조군 웰에 첨가하였다. 경쟁 ELISA에서는, 100 ㎕의 경쟁 또는 비-경쟁 대조군 rAAV9 ADK9 항체 및 인간 혈청을 플레이트에 첨가하였다.

플레이트를 밀봉하고, 1.5-2시간 동안 약 200-250 rpm의 마이크로플레이트 진탕기 상의 22℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. HRP-접합 염소 항-마우스 IgA (62-6720; 써모 사이언티픽) 검출 항체를 1,000배 희석하고, HRP-접합 염소 항-인간 κ (2060-05; 써던바이오테크(SouthernBiotech)) 및 HRP-접합 염소 항-인간 λ (2070-05; 써던 바이오테크) 검출 항체를 SBT20 완충제에서 10,000배 희석하였다. 사용할 때까지 희석물을 4℃에서 보관하였다. 플레이트를 다시 세정하고, 100 ㎕의 희석된 검출 항체를 배경 대조군 웰을 포함하는 적합한 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 45분 내지 1.5시간 동안 22℃에서 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세정하고, 100 ㎕의 TMB 기질 (T5569; 시그마)을 비색 ELISA 플레이트에 첨가하거나, 또는 100 ㎕의 화학발광 기질 (37069; 써모 사이언티픽)을 화학발광 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 100 ㎕의 정지 시약 (S5814; 시그마)을 비색 ELISA 플레이트에 첨가하고, 스펙트라맥스(Spectramax) M5e 플레이트 판독기 (몰레큘러 디바이스(Molecular Device), 캘리포니아주 서니베일)에서 450 nM에서 흡광도를 판독하였다. 500 밀리세컨드의 통합 시간의 발광 설정으로 동일한 플레이트 판독기에서 화학발광 ELISA 플레이트를 판독하였다.

ELISA 계산

항-AAV9 ADK9 항체 또는 혈청 인큐베이션 웰에서 수득된 평균 화학발광 또는 흡광도 단위 (비색 ELISA)를 배경 대조군 웰 (SBT20 완충제 인큐베이션 단독)에서 수득된 평균 화학발광 또는 흡광도 단위로 나눠서 ELISA에서의 신호-대-잡음 (S/N)을 계산하였다. ADK9에 대한 S/N은 염소 항-마우스 검출 항체로 수득된 단위를 수반하였다. 인간 혈청에 대한 S/N은 염소 항-인간 κ 및 항-인간 λ 검출 항체로 수득된 단위를 수반하였다.

용액에서 rAAV9와 경쟁된 경우 (경쟁 ELISA)의 ELISA 플레이트에 코팅된 rAAV9에 대한 항체 결합의 퍼센트 억제를 하기 식을 사용하여 계산하였다: 100×{(평균 비경쟁 화학발광 단위 - 평균 경쟁 화학발광 단위)/평균 비경쟁 화학발광 단위}.

그래프 작성 및 통계적 분석

모든 그래프가 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v7.03 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. 동일한 소프트웨어를 사용하여 전체 ELISA 항체 및 중화 항체의 순위-순서 기반 스피어만 상관관계 분석도 행하였다. 양측 P 값 및 95% 신뢰 구간이 상관관계 분석에서 계산되었다.

중화 항체 검정법

Lec-2 세포 (CRL 1736; ATCC)를 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (카탈로그 #15140122; 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)) 및 2 mM L-글루타민 (카탈로그 #25030081; 써모피셔 사이언티픽)이 보충된 10% FBS (카탈로그 #10438; 깁코(Gibco)) 함유 MEM 배지 (M8042; 밀리포어 시그마(Millipore SIGMA))에서 20,000개의 Lec-2 세포/웰의 밀도로 37℃/5% CO2의 96웰 플레이트에서 밤새 배양하였다. 다음날, rAAV9HLuc 스톡을 FBS가 없는 MEM 배지에서 22,500 MOI로 희석하고, FBS가 없는 MEM 배지로 20배 희석된 인간 혈청 샘플과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 음성 대조군은 열-불활성화 FBS 단독과 혼합된 rAAVHLuc로 구성되었다. Lec-2 세포로부터 배양 배지를 흡인하고, 100 ㎕의 AAV9 및 혈청 혼합물 또는 대조군을 세포에 첨가하고, 30분 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배지를 10% FBS-DMEM으로 교체하고, 세포를 16-20시간 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배지 제거 및 100 ㎕ 1× DPBS (카탈로그 #14190094; 인비트로젠(Invitrogen)) 세정 후, 100 ㎕의 GLO 용해 완충제 (E2661: 프로메가(Promega))를 사용하여 세포를 용해시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎕ 루시퍼라제 기질 (E6120; 프로메가)을 제조사의 설명서에 따라 제조하고, 용해된 세포에 첨가하고, 3분 동안 인큐베이션하였다. 발광 신호를 플레이트 판독기 (엔스파이어(Enspire); 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 측정하였다. 혈청 샘플의 중화 활성이 음성 FBS 대조군의 백분율 (% FBS)로서 보고된다.

결과

마우스 모노클로날 항체 대조군을 사용한 전체 항-AAV9 항체에 대한 화학발광 및 비색 ELISA 검출 방법의 비교

비색 ELISA가 기존에 항-AAV Ab를 검출하기 위해 사용되었다. 일반적으로 단백질 특이적 항체를 검출하는 것에서의 화학발광 ELISA의 우수한 감도를 고려하여, 본 발명가들은 2가지 항-AAV 항체 검출 방법을 비교하였다. 투명 또는 흑색 폴리스티렌 플레이트를 카르보네이트 완충제 내의 8 ㎍/mL의 농도의 루시퍼라제 (rAAV9-HLuc) 또는 S100A1 (rAAV9-S100A1)에 대한 트랜스진을 함유하는 AAV9 캡시드로 밤새 코팅하고, 방법 섹션에 기술된 바와 같이 마우스 모노클로날 항-AAV9 항체인 ADK9로 검출하였다. rAAV9-HLuc 입자는 세포-기반 중화 항체 검정법에서 사용되는 반딧불이 루시퍼라제 리포터 구축물을 함유한다. 둘 모두의 AAV9 입자가 동일한 캡시드를 갖도록 구축되었지만, 캡시드 유사성을 입증하고 전체 항체 및 중화 항체 데이터 세트의 상관관계 질의를 가능하도록 하기 위해 루시퍼라제 캡시드가 ELISA에 포함되었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 1:50 및 1:100 ADK9의 희석에서, 그리고 루시퍼라제 및 트랜스진 함유 구축물 둘 모두의 경우에, 화학발광 ELISA가 비색 ELISA에 비교하여 신호-대-잡음 (S/N) 비에서 21-38배 개선을 나타냈다. rAAV9-S100A1 및 rAAV9-루시퍼라제의 검출에서 차이가 없었고, 이는 AAV9 캡시드가 항체 반응성의 관점에서 유사하였음을 입증한다.

<표 1> 마우스 모노클로날 항체 대조군을 사용한 항-rAAV9 항체에 대한 비색 및 화학발광 ELISA 검출 방법의 비교. ADK9 대조군을 SBT20 완충제에서 50 또는 100배 희석하고, 비색 또는 화학발광 ELISA 방법에서 rAAV9-S100A1 또는 rAAV9-HLuc를 검출하는 데 사용하였다. 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 ADK9 및 대조군 웰에 대한 삼중물의 평균을 사용하여 신호-대-잡음을 계산하였다.

인간 혈청 샘플 내의 전체 항-AAV9 항체의 검출을 위한 화학발광 ELISA의 평가

상기에서 인간 항-AAV9 항체의 검출에 적용된 마우스 모노클로날 대조군을 사용하여 결정된 조건을 확실하게 하기 위해, 상업적으로 입수한 정상 인간 혈청 (NHS) 샘플을 사용하여 2가지 ELISA 검출 방법을 다시 평가하였다. 코팅 최적화 실험 (데이터는 제시되지 않음)에 따라 플레이트를 4 ㎍/mL의 rAAV9S100A1로 코팅하였다. SBT20 완충제를 사용하여 4배 희석에서 시작하여 NHS 샘플의 8개의 상이한 로트의 10배 희석물을 제조하였다. 희석물의 분취량을 이중으로 분할하고, HRP-접합 항-κ 및 항-λ 검출 항체를 사용하여 화학발광 및 비색 검출 방법에서 테스트하였다. 화학발광 방법에서는 4배 내지 4000배 희석 범위에서 선형성이 관찰된 반면 (도 1a), 비색 방법에서는 400배 희석 범위까지 선형성이 검출되었다 (도 1b). 따라서, 화학발광 방법이 적어도 1 log의 동적 범위에서 개선을 나타낸다. 신호-대-잡음 비 (S/N)를 방법 섹션에 기술된 바와 같이 1:4, 1:40 및 1:400의 혈청 희석물에서 계산하였는데, 3가지 희석물 모두가 둘 모두의 방법에 대해 대략적인 선형 범위에 속하기 때문이다. 대표적인 비교기로서, 1:400배 희석에서의 S/N 계산이 제시된다 (도 2). 테스트된 모든 샘플에서, S/N이 비색 방법에 비교하여 화학발광 방법에서 더 높았다 (도 2). 테스트된 모든 샘플에서, S/N이 비색 방법에 비교하여 화학발광 방법에서 더 높았다 (도 2). CL 방법에서 17/21개의 샘플이 S/N > 4.0을 나타낸 반면, 비색 방법에서는 1/21개의 샘플만 S/N > 4.0을 나타냈다. 1:4 및 1:400배 혈청 희석물에서의 S/N 비교가 도 11a 및 도 11b에서 제시된다.

화학발광 ELISA를 사용하는 것의 실행가능성을 추가로 분석하기 위해, 4배 혈청 희석의 비색 ELISA 및 400배 혈청 희석의 화학발광 ELISA에서 획득된 데이터를 사용하여 순위-순서 기반 비-모수 상관관계 분석을 행하였다. 각각의 방법에 대한 선형 범위로부터 혈청 희석물이 선택되었다 (도 1a-1b). 2가지 방법 사이에서 유의한 상관관계가 관찰되었고 (도 3), 이는 테스트된 모든 샘플에 대해 비색 방법에 비해 화학발광 ELISA 검출 방법의 감도의 상관적 증가를 지시한다.

화학발광 ELISA에서의 항-rAAV9 항체 결합 특이성의 확증

플레이트에 직접적으로 결합하는 비-특이적 혈청 성분보다는 AAV9 특이적 항체가 검출되고 있었다는 것을 확실하게 하기 위하여 화학발광 ELISA에 특이성 단계가 도입되었다. 정상 인간 혈청 샘플을 제시된 농도의 2×로 제조하고, 폴리프로필렌 플레이트에서 2시간 동안 8 ㎍/mL rAAV9S100A1 (4 ㎍/mL 최종 농도)와 함께 예비-인큐베이션한 후, 세정 및 차단된 rAAV9S100A1 코팅 플레이트에 혈청 샘플을 첨가하였다 (도 4a-4c). 용액 내의 경쟁 AAV9 캡시드에 여전히 결합되어 있는 항체는 rAAV9S100A1 코팅 플레이트 상에서의 인큐베이션 후에 ELISA에서 세정될 것으로 예상되었다. 플레이트-코팅 AAV9 캡시드에 대한 경쟁 또는 항체 결합 특이성의 수준이 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 계산되었고, ELISA 신호의 퍼센트 억제로서 표현되었다. 이러한 방법을 사용하여, 4개의 테스트된 혈청 샘플이 경쟁 ELISA에서 50% 이상의 억제를 나타냈다 (도 4a-4b). 마우스 ADK9 모노클로날 항체 대조군은 96%의 억제를 나타냈고, 이는 경쟁 파라미터가 최대 수준에 가까운 억제 및 특이성 결정에 대해 최적이었음을 가리킨다.

화학발광 ELISA 방법의 재현성

정상 인간 혈청의 12개의 상이한 로트를 상이한 2일에 매회 상이한 분석자에 의해 화학발광 ELISA 방법에서 테스트하여, 방법의 재현성을 결정하였다 (도 5a-5b). 선형 범위의 2개의 혈청 희석물 (도 1a-1b 참조)이 실험에서 선택되었다. 결과는 둘 모두의 테스트된 희석물에서의 분석자 사이의 양호한 재현성, 및 30% 미만의 실험간 정밀도를 가리킨다 (도 5a-5b).

트랜스진 및 루시퍼라제 함유 구축물의 상호교환성

최종 목적은 심장 질환 집단으로부터의 혈청 샘플의 사전-스크린에서 항-rAAV9 전체 항체와 중화 항체 사이에 상관관계가 있었는지를 결정하는 것이었다. 그러나, 전체 항체 검정법은 S100A1 트랜스진을 캡슐화하는 rAAV9 캡시드를 사용하는 반면, 중화 항체 검정법은 루시퍼라제 리포터를 캡슐화하는 rAAV9 캡시드를 사용한다. 2개의 데이터 세트 사이에서 관찰된 임의의 비-상관관계가 각각의 검정법에서 사용된 AAV9 캡시드 물질의 차이로 인한 것이 아니였음을 확실하게 하기 위해, 둘 모두의 구축물을 정상 인간 혈청의 3개의 상이한 로트를 양성 대조군으로 사용하여 전체 항체 ELISA에서 먼저 테스트하였다. 동일한 양의 루시퍼라제 및 트랜스진 함유 rAAV9 캡시드를 ELISA 플레이트에 코팅하고, 정상 인간 혈청 샘플의 3가지 상이한 로트의 4개의 희석물을 사용하여, 차단 및 세정된 ELISA 플레이트에 프로빙하였다. 3가지 모두의 혈청 샘플로 프로빙했을 때, 그리고 테스트된 모든 희석물에서 양쪽 캡시드가 유사한 신호를 나타냈다 (도 6a-6c). 따라서, 전체 항체와 중화 항체 검정법 데이터 사이의 상관관계의 잠재적인 결여가 2가지 캡시드 유형 사이의 항체 결합 에피토프에서의 예상치 못한 변동에 기인하지 않았을 것이다.

심장 질환 혈청 샘플 내의 전체 및 중화 항-rAAV9 항체의 상관관계 분석

2가지 검정법, 즉 세포-기반 중화 항체 및 전체 항체 ELISA에서 사용된 캡시드가 면역반응성의 관점에서 유사하였음이 입증된 후, 본 발명가들은 심장 질환 환자로부터의 100개의 혈청 샘플의 패널에서 중화 항체 데이터와 전체 항체 데이터의 상관관계를 평가하는 것을 추진하였다. 세포-기반 검정법의 경우, 혈청 샘플을 20배 희석하고, rAAV9-HLuc 캡시드와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 배양 중인 Lec-2 세포에 첨가하였다. HLuc 캡시드 단독 또는 마우스 모노클로날 항체 ADK9로 이루어진 대조군. 그 후, 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 세포를 세정하고, 루시퍼라제 기질을 첨가하고, 검정법을 완료하였다.

FBS 음성 대조군 (항-rAAV9 중화 항체를 함유하지 않음)의 존재 하에 관찰된 rAAV9HLuc의 형질도입의 백분율로서 항체의 중화 잠재력이 표현되었다. rAAV9HLuc와 음성 대조군의 인큐베이션이 캡시드의 최대 세포 진입에 이어지는 루시퍼라제 발현을 초래할 것으로 예상되기 때문에, 임의의 혈청 샘플의 존재 하의 루시퍼라제 발현 수준의 감소는 샘플 내의 중화 항체의 존재를 지시한다.

동일한 샘플을 400배 (검정법의 선형 범위)로 희석하고, 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 ELISA에서 전체 항체에 대해 평가하였다. 원시 데이터 단위를 기초로 ELISA 데이터를 플롯팅하였다. 2개의 데이터 세트 사이의 순위-순서 기반 스피어만 상관관계 분석은 중화 항체와 전체 항체 사이의 유의한 음의 상관관계 (r -0.8286, p < 0.0001)를 나타냈다 (도 7, p 값 <0.0001). 50%의 임의적이지만 널리 사용되는 중화 차단값 기준에서 100개의 샘플 중 65개가 중화 항체-양성으로 확인되었다. 전체 항체 ELISA에서, 모든 중화 항체 양성 대상체가 >700 화학발광 단위를 나타냈다 (도 7). 전체 항체 검정법에서의 700 화학발광 단위의 차단값은 오른쪽 상단 사분면에 나타난 바와 같이 7명의 추가적인 중화 항체-음성 개체를 추가로 포착하였다 (도 7).

물질 및 방법에 기술된 바와 같이 비-경쟁 ELISA와 병행하여 100명의 대상체 모두에서 확증성 또는 경쟁 ELISA를 또한 수행하였다. 중화 항체와 확증성 ELISA 항체 데이터 세트 사이의 순위-순서 상관관계 분석 또한 유의한 음의 상관관계 (r -0.7193, p < 0.0001)를 초래하였다. 65명의 중화 항체-양성 대상체 중에서, 7명의 개체가 경쟁적 전체 항체 ELISA에서 30% 이하의 억제 수준으로 항체가 있었다 (도 8, 왼쪽 하단 사분면). 7명의 추가적인 중화 항체-음성 대상체가 30%의 임의 차단값에서 ELISA에서 특이적 항체가 있는 것으로 확인되었다 (도 8, 오른쪽 상단 사분면).

항-9형 AAV 항체에 대해 관찰된 것과 유사한 결과가 항-2형 AAV 항체에 대한 결과에서 관찰되었다 (도 9).

전반적인 통계는 세포-기반 중화 검정법 및 확증 전체 항체 ELISA에서 배제된 환자의 수가 비슷하다는 것을 가리킨다 (65 대 66) (표 2). 전체 항체 ELISA에서, 중화 항체 검정법 및 확증성 ELISA에 비교하여 각각 7명 또는 6명의 추가적인 대상체가 배제될 것이다. 3가지 데이터 세트를 중첩에 대해 주의깊게 검사하여, 환자 스크리닝 및 배제를 위해 3가지 검정법 중 어느 하나를 사용하는 것의 적합성을 결정하였다. 이러한 평가는 중화 항체 검정법에 대한 ≤50%, 스크리닝 또는 전체 항체 ELISA에서의 ≥700 단위 및 확증성 항체 ELISA에서의 ≥30%의 임의 차단값을 기초로 하였다. 중화 검정법-단독 기준은 ELISA에서 대상체의 항체가 양성으로 확증되지 않는 6명의 대상체의 배제를 수반할 것이다 (도 10). 전체 항체 ELISA-단독 기준을 기초로 하는 환자 선택은 중화 항체 집단의 일부가 아닌 7명의 대상체 (중화 항체 위양성), 및 ELISA에서 양성으로 확증되지 않는 11명의 대상체를 배제할 것이다. 확증성 전체 항체 ELISA를 기초로 하는 환자 선택은 중화 항체 검정법에서 양성인 6명의 대상체를 포함할 것이다.

<표 2> 3가지 검정법 각각에 대한 환자 배제 및 선택 통계.

AAV2 캡시드를 ELISA 및 중화 항체 검정법에서 사용하였고, 항-AAV9 항체가 아니라 항-AAV2 항체를 검출한 것을 제외하고는, 본원에 기술된 AAV9와 관련된 상관관계 분석이 수행된 것 (방법 및 도 7 참조)과 동일한 방식으로 36명의 개별적인 심장 질환 환자로부터의 혈청을 사용하여 AAV2와 관련된 상관관계 분석을 수행하였다 (도 9 참조).

HRP-접합 항-κ 및 항-λ 항체를 통한 rAAV9 항체의 검출을 HRP-접합 항-IgG 항체를 통한 검출과 비교하였다. rAAV9S100A1을 4 ㎍/mL로 코팅하고, 제시된 정상 인간 혈청 로트의 1:400배 희석물을 사용하여 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 ELISA를 수행하였다. 1:10,000 희석의 퍼옥시다제 접합 염소 항-인간 IgG (A6029 시그마)를 사용하였다.

토론

인간은 생애 초기에 야생형 AAV에 노출되도록 되고, 항-AAV 항체가 발달된다. 혈청형 1 내지 9로부터 유래된 AAV 벡터는 비-임상 및 임상 연구에서 가장 통상적으로 사용되는 혈청형이다. 이같은 기존의 항-AAV 항체는 다양한 실험 결과에서 명백한 바와 같이 유전자 요법을 위한 재조합 아데노바이러스의 생체내 적용에 대한 제약을 나타낸다. 예를 들어, 응고 인자 IX 트랜스진을 코딩하는 AAV8 벡터의 투여 전의 정제된 인간 IgG로의 비-임상 모델의 수동 면역화가 간의 형질도입을 차단하는 것으로 나타났다 (Mingozzi et al., 2012). 마우스 또는 비-인간 영장류에서의 AAV 혈청형의 순차적 투여를 수반하는 또 다른 연구에서, 하나의 혈청형에 반응하여 생성된 중화 항체가 동일한 혈청형에 의한 형질도입을 완전히 억제했지만, 상이한 혈청형에 의한 형질도입은 억제하지 않았다 (Majowicz et al., 2014). 항-AAV2 중화 항체의 상대적 역가에서의 차이가 인간 임상 시험에서 혈우병 B 트랜스진 형질도입의 예방에 잠재적으로 기여한 것으로 보고되었다 (Manno et al., 2006). 이러한 관찰들의 견지에서, 기존의 AAV 항체가 있는 임상 시험 대상체 및 환자의 확인 및 배제가 트랜스진의 성공적인 형질도입의 기회를 증가시킬 수 있다.

일반적으로, 세포-표면 수용체에 대한 바이러스 부착 및 이어지는 숙주 세포 내로의 진입을 방지하는 AAV 중화 항체가 시험관내 세포-기반 검정법 및 비-표준화 검정법 조건 및 확인 기준을 사용하여 환자 혈청 샘플에서 검출된다. 중화 항체 검정법은 검정법 판독을 가능하도록 하기 위해 트랜스진 대신 리포터 유전자 (일반적으로 루시퍼라제)를 함유하는 AAV 바이러스 캡시드를 일반적으로 사용한다. 세포-기반 검정법은 힘들고, 처리량이 낮으며, 변동 경향이 있다. 표적화된 내인성 숙주 세포 수용체와 유사한 적합한 수용체를 발현하는 세포주의 선택을 포함하여, 고려 중인 각각의 AAV 혈청형에 대해 상당한 양의 검정법 최적화가 수반된다. 대조적으로, ELISA는 처리량이 더 높고, 덜 가변적이며, 개발, 자동화 및 검증이 더 용이하다. 추가적으로, AAV 유전자 치료제가 ELISA에서 플레이트 코팅 및 항-AAV 항체의 검출을 위한 시약으로서 직접적으로 사용될 수 있다. 세포-기반 중화 항체와 ELISA에서 검출되는 전체 또는 결합 항체 사이의 상관관계가 입증될 수 있으면, 후자를 사용하여, 임상 시험 및 약물 투여로부터 기존의 AAV 항체가 있는 개체를 확인하고 배제할 수 있다.

본 발명가들은 환자 집단 내의 중화 및 전체 둘 모두의 기존 항체의 빈도를 이해한 후, 세포-기반 중화 데이터와 전체 항체 데이터 사이의 강한 상관관계 (존재하는 경우)를 확립하기 위해 노력하였다. 이러한 목표를 향한 첫번째 단계로서, 본 발명가들은 항-AAV9 항체의 검출을 위한 고도로 민감하고 특이적인 화학발광 ELISA의 개발에 착수하였다. 정제된 인간 항-AAV 항체 양성 대조군의 결여로 인해, 본 발명가들은 상업적인 마우스 모노클로날 AAV9 항체 (ADK9)를 바이러스 입자 코팅 농도, 코팅 완충제 (PBS 대 CaCO₃), 차단 완충제 및 PBS-트윈으로의 세정 사이클의 횟수와 같은 파라미터를 포함하는 초기 검정법 개발 및 최적화에 사용하였다 (데이터는 제시되지 않음).

이어서 정상적인 건강한 인간 공여자로부터의 상업적으로 입수가능한 몇몇 혈청 샘플을 사용하여 광범위한 동적 검정법 범위 및 선형성 (약 4 log의 혈청 희석), 재현성 및 정밀도를 입증하였다. 플레이트-결합 rAAV9에 첨가하기 전에 혈청 샘플을 용액 내의 rAAV9와 함께 예비-인큐베이션함으로써 검정법 내로 확증성 또는 특이성 단계가 구축되었다. 마우스 모노클로날 ADK9 양성 대조군의 높은 수준의 ELISA 신호 억제 (96%)에 의해 나타난 바와 같이 확증성 검정법 조건이 최적이었다. 상이한 혈청 샘플 로트들에 대해 다양한 수준의 억제가 나타났고 (50-72% 범위), 이는 검정법 조건이 다양한 특이성의 항체들을 구별하는 데 또한 최적일 수 있다는 것을 시사한다. 항-인간 κ 및 λ 검출 항체에 비교하여 항-인간 IgG 검출 항체를 사용한 초기 테스트가 12개의 정상 인간 혈청 샘플 중 적어도 5개가 배경보다 상대적으로 더 낮거나 적은 신호를 나타내는 것을 초래하였다는 이유로, 본 발명가들이 범-이소형 항-인간 κ 및 λ 불변 영역 검출 항체를 CL ELISA에서 사용하였음을 주지하여야 한다 (도 12).

유전자 치료제 연구가 전통적으로 AAV 항체의 검출에 비색 ELISA를 사용하였기 때문에, 본 발명가들은 2가지 방법 (화학발광 대 비색)을 정면으로 비교하는 것이 중요하다고 생각하였다. 신호-대-잡음 비 (S/N)의 관점에서, 결과 섹션에 기술된 바와 같이, 화학발광 (CL) ELISA가 비색 ELISA보다 명백하게 우수하였다. CL 단백질 ELISA가 항체 검출에 사용된 적이 있지만, 본 발명가들이 아는 한, 이는 CL ELISA를 항-AAV 항체의 검출에 적용한 것의 최초의 보고이다. 이는 또한 항-AAV 항체 검출에 대한 확증성 또는 특이성 단계의 최초의 보고이다.

전체 항체 데이터 세트와 세포-기반 중화 항체 데이터를 상관시키려는 의도로 심장 질환이 있는 환자로부터의 100개의 혈청 샘플을 기존의 AAV9 항체에 대해 분석하였다. 상관관계 분석 전에, 본 발명가들은 정상 인간 혈청 샘플 또는 마우스 ADK9 모노클로날 대조군으로 프로빙했을 때의 항체 반응성과 관련하여 2개의 캡시드가 서로 유사하였음을 확실하게 하였다. 100개의 심장 질환 환자 혈청 샘플에 대한 전체 항체 및 중화 항체 데이터의 평가는 전체 항체와 중화 항체 데이터 세트 사이의 유의한 음의 상관관계를 나타냈고, 이는 CL ELISA에서 검출된 대부분의 전체 항체가 중화 성질을 가졌음을 가리킨다. 중화 항체 데이터와 확증성 ELISA 데이터 사이의 유사한 상관관계 분석은 더 낮은 음의 계수를 산출하였지만, 여전히 강한 유의성 수준을 나타냈다. 이러한 연구에서 관찰된 강한 상관관계로 인해, 전체 및/또는 확증성 항체 ELISA는 rAAV9-기반 유전자 치료제에 대한 대상체의 스크리닝 및 배제를 위한 세포-기반 중화 항체 검정법에 대한 실행가능한 대안이다.

소수의 개별적인 혈청 샘플의 중첩에서의 차이에도 불구하고, 전체 및 확증성 항체 ELISA는 대부분의 중화 항체-양성 집단을 포착하기 때문에 세포-기반 중화 항체 검정법에 대한 더 용이하고 더 신속한 대안을 나타낸다. 추가적으로, CL ELISA는 수용체-결합 및 진입과 독립적인 메커니즘에 의해 중화할 수 있는 항체를 확인하는 추가 장점을 갖는다. 둘 모두의 형식 (중화 항체 및 확증성 전체 항체)에서 항-AAV9 항체에 대해 양성으로 테스트된 개체의 높은 백분율, 및 연구 모집을 위해 다수의 환자 샘플의 스크리닝이 요구될 것으로 예상되는 것을 고려하여, 속도 및 낮은 변동성의 관점에서 획득된 장점이 더 높다. 충분한 약물 (트랜스진을 캡슐화하는 바이러스 캡시드)이 검정법의 경쟁적 억제 부분에 이용가능하지 않은 경우, 차단값이 ≥700 단위인 전체 항체 검정법이 대상체 스크리닝 및 배제를 위한 실행가능한 대안을 제시한다. 정제된 인간 IgG를 사용하여 상대적인 정량이 혼입되도록 전체 항체 ELISA가 추가로 개발될 수 있고, 중량 / 부피 항체 수준을 기초로 차단값이 확립될 수 있다.

과거의 몇몇 연구가 ELISA에서 검출된 항체 역가 (결합 항체)와 세포-기반 검정법에서 측정된 중화 항체 역가 사이에 관계가 있을 수 있는지 여부를 다루었지만, 세포-기반 검정법을 ELISA 방법으로 교체하는 것이 교시되지 않았다. 또한, 이러한 연구들은 ELISA에서 비색 검출 방법을 사용하였고, AAV1, AAV2, AAV9 및 기타 AAV 혈청형에 대한 항체를 검출하기 위해 β-갈락토시다제, AAV 복제 단백질 및 루시퍼라제를 포함하여 세포-기반 중화 검정법에서 다양한 리포터를 사용하였다. 이러한 연구 중 2개는 AAV2 항체에 대한 2가지 검정법 사이의 불량한 상관관계를 나타냈다 (Chirmule et al., 1999; Erles et al., 1999). 51명의 건강한 공여자 혈청에서 AAV1 역가를 검사한 한 연구가 그러한 특정 경우에 ELISA에서의 IgG 역가와 중화 역가 사이에 상관관계가 있을 수 있다는 것을 가리켰지만 (Veron et al., 2012), 또 다른 연구는 100명의 건강한 인간 공여자 샘플에서 AAV9 ELISA 및 중화 항체 역가에서의 상관관계를 평가하였고, 대부분의 항-AAV9 IgG 역가가 사실상 비-중화성이었음을 보고하였다 (Thwaite et al., 2015). 본 발명가들은 AAV9 및 AAV2에 대해 전체 ELISA 항체와 중화 항체 사이의 강한 상관관계를 입증하였다; CL 방법의 증가된 감도 및 본 발명가들이 ELISA에서 범-이소형 항-인간 κ 및 λ 불변 영역 검출 항체를 사용하였다는 사실이 도움이 되었을 수 있다. 본 발명가들은 방법 개발 초기에 항-인간 IgG 검출 항체를 테스트하였고, 항-인간 κ 및 λ 검출 항체와 비교하여 12개의 정상 인간 혈청 샘플 중 적어도 5개가 배경보다 상대적으로 낮거나 적은 신호를 나타냈음을 주지하였다 (도 12).

요약하면, 본 발명가들은 항-AAV9 항체의 검출을 위한 고도로 감수성인 화학발광 ELISA를 개발하였고, AAV9 중화 역가와의 유의한 상관관계를 입증하였다. 이는 FDA-승인 AAV9 양식으로의 임상 시험 및 환자 치료에서 환자 스크리닝 및 배제를 위해 세포-기반 중화 항체 검정법 대신 AAV9 ELISA를 사용하도록 허용한다. 본 발명가들은 제2 스크리닝 단계를 용이하게 하는 AAV9 ELISA에 대한 확증성 단계를 또한 구축하였다. 이는 특이성을 또한 평가하는 화학발광 방법에서 AAV 항체를 검출하는 것에 대한 최초의 보고이다. 적정과 조합되어, 이러한 검정법은 차단값이 치료 경험이 없는 대상체를 기초로 설정되는 3-단계 스크린, 확증성 및 역가 접근법에서 AAV9-기반 유전자 치료제에 반응하여 생성된 항-약물 항체 (ADA)를 확인하는 데 또한 사용될 수 있다.

구체적 실시양태의 상기 설명은 과도한 실험 없이, 그리고 본 개시내용의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 다른 이들이 관련 기술 분야의 기술 내에 속하는 지식을 적용함으로써 다양한 용도를 위해 특정 실시양태를 변형하고/하거나 개조할 수 있도록 본 개시내용의 일반적인 성질을 충분히 밝힌다. 따라서, 본원에서 제시된 교시내용 및 지침을 기초로, 이같은 개조 및 변형은 개시된 실시양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 명세서의 용어 또는 술어가 전반적으로 교시내용 및 지침의 견지에서 숙련된 기술자에 의해 해석되도록, 본원에서의 술어 또는 용어는 설명을 위한 것이지, 제한을 위한 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다.

본 개시내용의 다른 실시양태들이 본 개시내용의 명세서 및 실행을 고려하여 관련 기술 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 본 개시내용의 진정한 범주 및 취지는 하기 청구범위에 의해 지시되면서, 명세서 및 실시예는 예시적인 것으로만 고려되는 것으로 의도된다.

본원에서 참조된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원의 개시내용은 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원의 개시내용이 이의 전문이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로, 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 그의 전문이 참조로 포함된다.

본 출원은 2018년 6월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/687,564를 우선권 주장하고, 이는 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (40)

1. 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
3. 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체는 ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정 시 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
4. (1) ELISA에서 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 단계이며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 단계, (2) 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
5. (1) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, (2) ELISA에서 생물학적 샘플 내의 항-AAV 항체의 역가를 측정하는 단계이며, 여기서 대상체는 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 것인 단계, (3) 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인된 대상체에게 AAV 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 심장, 간, 폐, 눈, 혈액, 신경계, 림프계, 근육, 줄기 세포 또는 그의 임의의 조합에서의 질환인 방법.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 심장 질환인 방법.
8. ELISA를 사용하여 상응하는 복수의 대상체로부터 수득된 복수의 생물학적 샘플 각각 내의 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분 ("항-AAV 항체")의 역가를 측정하는 것을 포함하는, AAV 요법에 적합한 대상체를 확인하는 고처리량 방법.
9. 제8항에 있어서, 복수의 대상체가 약 5명/마리 내지 약 10명/마리, 약 10명/마리 내지 약 20명/마리, 약 30명/마리 내지 약 40명/마리, 또는 약 40명/마리 내지 약 50명/마리의 대상체를 포함하는 것인 고처리량 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 복수의 생물학적 샘플 각각에서의 역가가 병행으로 또는 순차적으로 측정되는 것인 고처리량 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체의 역가가 중화 항-AAV 항체의 역가, 비-중화 항-AAV 항체의 역가, 또는 둘 모두를 포함하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, ELISA가 중화 항-AAV 항체 또는 비-중화 항-AAV 항체에 결합하는 2차 항체를 포함하는 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, ELISA가 중화 항-AAV 항체 및 비-중화 항-AAV 항체에 결합하는 2차 항체를 포함하는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 요법이 재조합 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 요법이 1형 AAV, 2형 AAV, 3형 AAV (3A형 및 3B형 포함), 4형 AAV, 5형 AAV, 6형 AAV, 7형 AAV, 8형 AAV, 9형 AAV, 10형 AAV, 11형 AAV, 12형 AAV, 13형 AAV, 뱀 AAV, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 요법이 5형 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 요법이 9형 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 요법이 2형 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체가 항-1형 AAV 항체, 항-2형 AAV 항체, 항-3A형 AAV 항체, 항-3B형 AAV 항체, 항-4형 AAV 항체, 항-5형 AAV 항체, 항-6형 AAV 항체, 항-7형 AAV 항체, 항-8형 AAV 항체, 항-9형 AAV 항체, 항-10형 AAV 항체, 항-11형 AAV 항체, 항-12형 AAV 항체, 항-13형 AAV 항체, 항-뱀 AAV 항체, 항-조류 AAV 항체, 항-솟과 AAV 항체, 항-갯과 AAV 항체, 항-말과 AAV 항체, 항-양 AAV 항체, 항-염소 AAV 항체, 또는 항-새우 AAV 항체인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체가 항-5형 AAV 항체인 방법.
21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체가 항-9형 AAV 항체인 방법.
22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체가 항-2형 AAV 항체인 방법.
23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 요법을 위한 AAV가 항-AAV 항체가 결합하는 AAV와 상이한 혈청형인 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, ELISA가 화학발광 ELISA를 포함하는 것인 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ELISA가 집단 ELISA인 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청 샘플을 포함하는 것인 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플을 포함하는 것인 방법.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 ELISA 전에 희석되는 것인 방법.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 적어도 약 1:2, 적어도 약 1:3, 적어도 약 1:4, 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 적어도 약 1:20, 적어도 약 1:30, 적어도 약 1:40, 적어도 약 1:50, 적어도 약 1:100, 적어도 약 1:150, 적어도 약 1:200, 적어도 약 1:250, 적어도 약 1:300, 적어도 약 1:350, 적어도 약 1:400, 적어도 약 1:450, 적어도 약 1:500, 적어도 약 1:1000만큼 희석되는 것인 방법.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체 역가가 약 800 미만 내지 약 40,000 미만인 방법.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체 역가가 약 40,000 미만, 약 35,000 미만, 약 30,000 미만, 약 25,000 미만, 약 20,000 미만, 약 15,000 미만, 약 10,000 미만, 약 5000 미만, 약 4000 미만, 약 3000 미만, 약 2000 미만, 약 1000 미만, 약 900 미만, 또는 약 800 미만인 방법.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체 역가가 약 800 미만인 방법.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 100,000 미만, 약 10,000 미만, 약 1000 미만, 약 950 미만, 약 900 미만, 약 850 미만, 약 800 미만, 약 750 미만, 약 700 미만, 약 650 미만, 약 600 미만, 약 550 미만, 또는 약 500 미만의 화학발광 단위를 방출하는 경우에 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인되는 것인 방법.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 화학발광 ELISA에서 약 700 미만의 화학발광 단위를 방출하는 경우에 대상체가 항-AAV 항체의 역가가 낮은 것으로 확인되는 것인 방법.
35. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항-AAV 항체의 낮은 역가가 중화 항-AAV 항체의 낮은 역가와 상관관계가 있는 것인 방법.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 요법이 관심 유전자를 포함하는 AAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, 관심 유전자가 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
38. 제36항 또는 제37항에 있어서, AAV가 조절 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
39. 제38항에 있어서, 조절 서열이 조직 특이적 프로모터를 포함하는 것인 방법.
40. 제38항에 있어서, 조직 특이적 프로모터가 심장, 간, 폐, 눈, 신경계, 림프계, 근육 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에서 관심 유전자의 발현을 유도하는 것인 방법.

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