CN112513641A

CN112513641A - Aav疗法的方法

Info

Publication number: CN112513641A
Application number: CN201980051640.6A
Authority: CN
Inventors: U·卡皮坦; 戴燕山; L·萨尔瓦多
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2021-03-16
Also published as: WO2019246237A1; JP2021528639A; US20210122807A1; EP3811082A1; KR20210021552A

Abstract

本公开文本提供了用于鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量从所述受试者获得的生物样品中的与AAV特异性结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。

Description

AAV疗法的方法

技术领域

本公开文本涉及用于使用腺相关病毒(AAV)疗法治疗受试者的疾病的方法。在某些方面，所述方法包括通过检测受试者的抗AAV抗体的总水平来鉴定适合于AAV疗法的患者，并且向具有低抗AAV抗体滴度的受试者施用AAV疗法。

背景技术

携带转基因的腺相关病毒(AAV)是基因疗法中的重要工具，用于纠正导致突变或无效蛋白质表达的遗传缺陷或用于增强现有低水平的蛋白质表达(Nathwani等人至A.MKeeler等人)以及潜在地用于基因敲低、基因组编辑或修饰以及非编码RNA调节(Valdmanis等人2017)。然而，人类在生命中很早就暴露于AAV并且产生抗AAV抗体(Blacklow等人,1967；Boutin等人,2010；Calcedo等人,2009,2011；Liu等人,2013)，包括中和抗AAV抗体，所述抗AAV抗体可以通过中和AAV载体而负面影响基因治疗药物的功效。

预筛选和排除具有高水平的预先存在的中和AAV特异性抗体的患者是实现较高药物功效的一种方法。最常使用体外基于细胞的报告分子测定来确定给定群体中的中和抗体的频率以及排除可能不太可能对AAV疗法产生反应的患者(Amine M等人,2015，Manno C等人,2006)。然而，基于细胞的中和抗体测定的通量低并且劳动强度大，并且通常遭受高变化性和低灵敏度的问题，使得难以从大量患者中筛选样品。因此，本领域中仍然需要开发变化性较小并且鲁棒性较大的提供关于预先存在的抗体的存在的信息的方法，以及对于高通量和自动化更可修改的方法，其可以出于患者排除目的而潜在地用于筛选大量受试者。

发明内容

在某些方面，本公开文本涉及一种鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的方法，其包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量从所述受试者获得的生物样品中的与AAV特异性结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度的受试者施用AAV疗法。

在某些方面，本公开文本涉及一种治疗受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者施用AAV疗法，其中所述受试者被鉴定为具有如在ELISA中使用从所述受试者获得的生物样品测量的低的抗AAV抗体滴度。

在某些方面，本公开文本涉及一种用于治疗受试者的疾病的AAV疗法，其中所述受试者被鉴定为具有如在ELISA中使用从所述受试者获得的生物样品测量的低的抗AAV抗体滴度。

在某些方面，本公开文本涉及一种治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)在ELISA中测量从所述受试者获得的生物样品中的抗AAV抗体的滴度，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度，以及(2)向被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度的所述受试者施用AAV疗法。

在某些方面，本公开文本涉及一种用于治疗受试者的疾病的AAV疗法，其中在ELISA中测量从所述受试者获得的生物样品中的抗AAV抗体的滴度，并且其中被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度的受试者有待被施用所述AAV疗法。

在某些方面，本公开文本涉及一种治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)从所述受试者获得生物样品，(2)在ELISA中测量所述生物样品中的抗AAV抗体的滴度，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度，以及(3)向被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度的所述受试者施用AAV疗法。

在某些方面，本公开文本涉及一种用于治疗受试者的疾病的AAV疗法，其中在ELISA中测量从受试者获得的生物样品中的抗AAV抗体的滴度，并且其中被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度的受试者有待被施用所述AAV疗法。

在一些实施方案中，所述疾病是心脏、肝脏、肺、眼睛、血液、神经系统、淋巴系统、肌肉、干细胞或其任何组合中的。在一些实施方案中，所述疾病是心脏病。

在某些方面，本公开文本涉及一种鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的高通量方法，其包括使用ELISA测量从相应的多个受试者获得的多个生物样品中的每一个中的与AAV特异性结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。在一些实施方案中，所述多个受试者包括约5至约10、约10至约20、约30至约40、或约40至约50个受试者。在一些实施方案中，平行或顺序地测量所述多个生物样品中的每一个中的滴度。

在一些实施方案中，抗AAV抗体的滴度包括中和抗AAV抗体的滴度、非中和抗AAV抗体的滴度、或两者。在一些实施方案中，所述ELISA包括与所述中和抗AAV抗体或所述非中和抗AAV抗体结合的第二抗体。在一些实施方案中，所述ELISA包括与所述中和抗AAV抗体和所述非中和抗AAV抗体结合的第二抗体。

在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用重组AAV。在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用AAV，所述AAV选自1型AAV、2型AAV、3型AAV(包括3A型和3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、蛇AAV、鸟类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、及其任何组合。在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用5型AAV。在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用9型AAV。在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用2型AAV。

在一些实施方案中，所述抗AAV抗体是抗1型AAV抗体、抗2型AAV抗体、抗3A型AAV抗体、抗3B型AAV抗体、抗4型AAV抗体、抗5型AAV抗体、抗6型AAV抗体、抗7型AAV抗体、抗8型AAV抗体、抗9型AAV抗体、抗10型AAV抗体、抗11型AAV抗体、抗12型AAV抗体、抗13型AAV抗体、抗蛇AAV抗体、抗鸟类AAV抗体、抗牛AAV抗体、抗犬AAV抗体、抗马AAV抗体、抗绵羊AAV抗体、抗山羊AAV抗体、或抗虾AAV抗体。在一些实施方案中，所述抗AAV抗体是抗5型AAV抗体。在一些实施方案中，所述抗AAV抗体是抗9型AAV抗体。在一些实施方案中，所述抗AAV抗体是抗2型AAV抗体。

在一些实施方案中，用于所述AAV疗法的AAV是与结合所述抗AAV抗体的AAV不同的血清型。

在一些实施方案中，所述ELISA包括化学发光ELISA。在一些实施方案中，所述ELISA是群体ELISA。

在一些实施方案中，所述生物样品包括血清样品。在一些实施方案中，所述生物样品包括血液样品。在一些实施方案中，在所述ELISA之前将所述生物样品稀释。在一些实施方案中，所述生物样品被稀释至少约1:2、至少约1:3、至少约1:4、至少约1:5、至少约1:10、至少约1:20、至少约1:30、至少约1:40、至少约1:50、至少约1:100、至少约1:150、至少约1:200、至少约1:250、至少约1:300、至少约1:350、至少约1:400、至少约1:450、至少约1:500、至少约1:1000。

在一些实施方案中，所述抗AAV抗体滴度小于约800至小于约40,000。在一些实施方案中，所述抗AAV抗体滴度小于约40,000、小于约35,000、小于约30,000、小于约25,000、小于约20,000、小于约15,000、小于约10,000、小于约5000、小于约4000、小于约3000、小于约2000、小于约1000、小于约900、或小于约800。在一些实施方案中，所述抗AAV抗体滴度小于约800。在一些实施方案中，所述抗AAV抗体滴度小于约40,000。

在一些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约100,000、小于约10,000、小于约1000、小于约950、小于约900、小于约850、小于约800、小于约750、小于约700、小于约650、小于约600、小于约550、或小于约500化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在一些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约700化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在一些实施方案中，所述低的抗AAV抗体滴度与低的中和抗AAV抗体滴度相关联。

在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用包含目的基因的AAV。在一些实施方案中，所述目的基因编码生物活性多肽。在一些实施方案中，所述AAV进一步包含调节序列。在一些实施方案中，所述调节序列包含组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子驱动所述目的基因在选自心脏、肝脏、肺、眼睛、神经系统、淋巴系统、肌肉和干细胞的组织中表达。

实施方案

E1.一种鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的方法，其包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量从所述受试者获得的生物样品中的与AAV特异性结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。

E2.根据E1所述的方法，其进一步包括向被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度的受试者施用AAV疗法。

E3.一种治疗受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者施用AAV疗法，其中所述受试者被鉴定为具有如在ELISA中使用从所述受试者获得的生物样品测量的低的抗AAV抗体滴度。

E4.一种治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)在ELISA中测量从所述受试者获得的生物样品中的抗AAV抗体的滴度，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度，以及(2)向被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度的所述受试者施用AAV疗法。

E5.一种治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)从所述受试者获得生物样品，(2)在ELISA中测量所述生物样品中的抗AAV抗体的滴度，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度，以及(3)向被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度的所述受试者施用AAV疗法。

E6.根据E3至E5中任一项所述的方法，其中所述疾病是心脏、肝脏、肺、眼睛、血液、神经系统、淋巴系统、肌肉、干细胞或其任何组合中的。

E7.根据E3至E6中任一项所述的方法，其中所述疾病是心脏病。

E8.一种鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的高通量方法，其包括使用ELISA测量从相应的多个受试者获得的多个生物样品中的每一个中的与AAV特异性结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。

E9.根据E8所述的高通量方法，其中所述多个受试者包括约5至约10、约10至约20、约30至约40、或约40至约50个受试者。

E10.根据E8或E9所述的高通量方法，其中平行或顺序地测量所述多个生物样品中的每一个中的滴度。

E11.根据E1至E10中任一项所述的方法，其中抗AAV抗体的滴度包括中和抗AAV抗体的滴度、非中和抗AAV抗体的滴度、或两者。

E12.根据E11所述的方法，其中所述ELISA包括与所述中和抗AAV抗体或所述非中和抗AAV抗体结合的第二抗体。

E13.根据E11所述的方法，其中所述ELISA包括与所述中和抗AAV抗体和所述非中和抗AAV抗体结合的第二抗体。

E14.根据E1至E13中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用重组AAV。

E15.根据E1至E14中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用AAV，所述AAV选自1型AAV、2型AAV、3型AAV(包括3A型和3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、蛇AAV、鸟类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、及其任何组合。

E16.根据E1至E15中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用5型AAV。

E17.根据E1至E16中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用9型AAV。

E18.根据E1至E17中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用2型AAV。

E19.根据E1至E18中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体是抗1型AAV抗体、抗2型AAV抗体、抗3A型AAV抗体、抗3B型AAV抗体、抗4型AAV抗体、抗5型AAV抗体、抗6型AAV抗体、抗7型AAV抗体、抗8型AAV抗体、抗9型AAV抗体、抗10型AAV抗体、抗11型AAV抗体、抗12型AAV抗体、抗13型AAV抗体、抗蛇AAV抗体、抗鸟类AAV抗体、抗牛AAV抗体、抗犬AAV抗体、抗马AAV抗体、抗绵羊AAV抗体、抗山羊AAV抗体、或抗虾AAV抗体。

E20.根据E1至E19中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体是抗5型AAV抗体。

E21.根据E1至E19中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体是抗9型AAV抗体。

E22.根据E1至E19中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体是抗2型AAV抗体。

E23.根据E1至E19中任一项所述的方法，其中用于所述AAV疗法的AAV是与结合所述抗AAV抗体的AAV不同的血清型。

E24.根据E1至E23中任一项所述的方法，其中所述ELISA包括化学发光ELISA。

E25.根据E1至E24中任一项所述的方法，其中所述ELISA是群体ELISA。

E26.根据E1至E25中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血清样品。

E27.根据E1至E26中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血液样品。

E28.根据E1至E27中任一项所述的方法，其中在所述ELISA之前将所述生物样品稀释。

E29.根据E1至E28中任一项所述的方法，其中所述生物样品被稀释至少约1:2、至少约1:3、至少约1:4、至少约1:5、至少约1:10、至少约1:20、至少约1:30、至少约1:40、至少约1:50、至少约1:100、至少约1:150、至少约1:200、至少约1:250、至少约1:300、至少约1:350、至少约1:400、至少约1:450、至少约1:500、至少约1:1000。

E30.根据E1至E29中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体滴度小于约800至小于约40,000。

E31.根据E1至E30中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体滴度小于约40,000、小于约35,000、小于约30,000、小于约25,000、小于约20,000、小于约15,000、小于约10,000、小于约5000、小于约4000、小于约3000、小于约2000、小于约1000、小于约900、或小于约800。

E32.根据E1至E31中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体滴度小于约800。

E33.根据E1至E32中任一项所述的方法，其中如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约100,000、小于约10,000、小于约1000、小于约950、小于约900、小于约850、小于约800、小于约750、小于约700、小于约650、小于约600、小于约550、或小于约500化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。

E34.根据E1至E33中任一项所述的方法，其中如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约700化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。

E35.根据E2至E34中任一项所述的方法，其中所述低的抗AAV抗体滴度与低的中和抗AAV抗体滴度相关联。

E36.根据E1至E35中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用包含目的基因的AAV。

E37.根据E36所述的方法，其中所述目的基因编码生物活性多肽。

E38.根据E36或E37所述的方法，其中所述AAV进一步包含调节序列。

E39.根据E38所述的方法，其中所述调节序列包含组织特异性启动子。

E40.根据E38所述的方法，其中所述组织特异性启动子驱动所述目的基因在选自心脏、肝脏、肺、眼睛、神经系统、淋巴系统、肌肉和干细胞的组织中表达。

附图说明

图1A-1B是商业获得的正常人类血清样品中的抗9型rAAV抗体的化学发光(图1A)和比色(图1B)ELISA检测的结果的图示。将血清样品使用SBT20缓冲液如所指示进行稀释，并且添加到rAAV9S100A1包被的板中。在用优化量的抗κ和抗λ抗体检测9型rAAV结合的抗体之后，获得化学发光(CL)(图1A)或吸光度(图1B)单位。背景是当用抗κ和抗λ抗体检测与SBT20缓冲液一起孵育的对照孔时观察到的CL(图1A)或吸光度(图1B)单位。

图2是柱状图，其表示化学发光(黑色柱)和比色(灰色柱)ELISA检测方法的信噪比的比较。使用抗κ和抗λ检测抗体获得在400倍血清稀释度下的化学发光或吸光度单位，并且将其除以在仅SBT20缓冲液孵育以及抗κ和抗λ检测抗体在rAAV9包被的板上的情况下获得的数据单位。

图3A是散点图，其示出了化学发光检测方法与比色检测方法之间的相关性。对于每种方法，在血清稀释度的线性范围内选择数据以生成所示的相关性图。图3B提供了对图3A中呈现的数据的统计分析。

图4A-4C是在化学发光ELISA中抗rAAV9S100A1抗体结合竞争的结果的图示。将四种不同的正常人类血清样品稀释，并且在具有(竞争)和没有(非竞争)在溶液中用rAAV9预孵育的情况下测试每种稀释度的三个重复(图4A)。图4B-4C示出了在1:4的血清稀释度下(图4B)以及单克隆抗体对照(ADK9，在1:1000下；图4C)的竞争ELISA数据。带框的数字是竞争血清样品中信号抑制的百分比(图4B-4C)。

图5A-5B是展示了在化学发光ELISA方法中抗AAV9抗体检测的再现性的图示。将12个不同的正常人类样品稀释40倍(图5A)或400倍(图5B)，并且在两个不同的实验中测试总抗AAV9抗体。表(图5A和5B)示出了在相应的稀释度下各样品的实验间精密度。

图6A-6C是柱状图，其展示了含有转基因(rAAV9S100A1；灰色柱)和荧光素酶报告分子(rAAV9HLuc；黑色柱)的rAAV9衣壳的互换性。将每种衣壳类型以相等浓度包被，并且在如材料和方法中所述的化学发光总抗体结合ELISA中用三种不同批次(图6A-6C)的正常人类血清(NHS)样品的系列稀释液检测。

图7是散点图，其展示了在心脏病患者血清样品中的总抗AAV9抗体与中和抗体之间的相关性。评估100名患者的在1:400的血清稀释度下的总结合抗体和在1:10的稀释度下的中和抗体，并且使用Spearman等级次序法进行相关性分析。对于每种测定，设置由虚线所示的任意截止限。

图8是散点图，其展示了在心脏病患者血清样品中的总抗AAV抗体与AAV9中和抗体之间的相关性。评估100名患者的在ELISA中用AAV9竞争后在1:400的血清稀释度下的AAV特异性抗体以及在基于细胞的中和抗体测定中在1:10的稀释度下的中和抗体，并且使用Spearman等级次序法进行相关性分析。对于每种测定，设置由虚线所示的任意截止限。

图9是散点图，其展示了在心脏病患者血清样品中的总2型AAV结合抗体与中和抗体之间的相关性。评估36名患者的在ELISA中在1:400的血清稀释度下的AAV特异性抗体以及在基于细胞的中和抗体测定中在1:10的稀释度下的中和抗体。对于每种测定，设置由虚线所示的任意截止限。

图10是非比例维恩图，其描绘了在100个患者样品中的AAV9中和抗体、总抗AAV9抗体与特异性(基于竞争步骤，参见实施例)总抗AAV9抗体之间的关系。对于每个数据集的括号内描绘了任意截止限。对于总抗体(tAb)数据集的截止限基于在基于细胞的中和抗体测定中，中和群体与非中和群体的划分。

图11A-11B是柱状图，其表示化学发光(黑色柱)检测方法和比色(灰色柱)ELISA检测方法的信噪比的比较。使用抗κ和抗λ检测抗体获得在4倍(图11A)和40倍(图11B)血清稀释度下的化学发光或吸光度单位，并且将其除以在仅SBT20缓冲液孵育以及抗κ和抗λ检测抗体在rAAV9包被的板上的情况下获得的数据单位。

图12是柱状图，其表示对rAAV9 Ab的HRP缀合的抗κ和抗λ检测与HRP缀合的抗IgG检测的比较。

具体实施方式

本公开文本的某些方面涉及鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的方法，其包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量从所述受试者获得的生物样品中的与AAV结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。本公开文本的一些方面涉及治疗受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用AAV疗法。在某些方面，所述受试者被鉴定为具有如在ELISA中使用从所述受试者获得的生物样品测量的低的抗AAV抗体滴度。在一些方面，本公开文本涉及一种鉴定适合于AAV疗法的受试者的高通量方法，其包括使用ELISA测量从相应的多个受试者获得的多个生物样品中的每一个中的抗AAV抗体的滴度。

I.术语

为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请中所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。

在本文中使用的情况下，将术语“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如本文在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

应当理解，本文中无论用语言“包括/包含(comprising)”描述任何方面，还提供了以“由……组成”和/或“本质上由……组成”描述的其他类似方面。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开文本相关领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,学术出版社；以及OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,牛津大学出版社，为本领域技术人员提供本公开文本中所使用的许多术语的一般解释。

单位、前缀和符号均以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面应通过参考说明书作为整体来理解。下面紧接着定义的术语应通过以其整体参考说明书来理解。

如本文所用，术语“腺相关病毒”或“AAV”包括但不限于1型AAV、2型AAV、3型AAV(包括3A型和3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、蛇AAV、鸟类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、由Gao等人(J.Virol.78:6381(2004))和Moris等人(Virol.33:375(2004))公开的那些AAV血清型和进化枝、现在已知或将来发现的任何其他AAV。参见例如，FIELDS等人VIROLOGY,第2卷,第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers)。AAV是指细小病毒科(Parvoviridae)中的Dependoparvovirus(属)。例如，AAV可以是源自天然存在的“野生型”病毒的AAV、源自包装到源自由天然存在的cap基因编码的衣壳蛋白的衣壳中的重组AAV(rAAV)基因组和/或包装到源自由非天然衣壳cap基因编码的衣壳蛋白的衣壳中的rAAV基因组的AAV。如本文所用，“AAV”可以用来指病毒本身或其衍生物。除非另有特定指示，否则所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的形式和重组形式两者。AAV包括1型AAV(AAV-1)、2型AAV(AAV-2)、3型AAV(AAV-3)、4型AAV(AAV-4)、5型AAV(AAV-5)、6型AAV(AAV-6)、7型AAV(AAV-7)、8型AAV(AAV-8)、9型AAV(AAV-9)、鸟类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV、和绵羊AAV。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物AAV等。参见例如BERNARD N.FIELDS等人,VIROLOGY,第2卷,第69章(第3d版,Lippincott-Raven Publishers)。

术语“rAAV”是指“重组AAV”。在一些实施方案中，重组AAV具有AAV基因组，其中rep和cap基因的一部分或全部已被异源序列替代。如本文所用的“rAAV载体”是指包含非AAV源的多核苷酸序列(即，对于AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，典型地是用于细胞遗传转化的目的序列。通常，异源多核苷酸的侧翼是至少一个并且通常是两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体涵盖rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。

“无衣壳(capsid-free)”或“无衣壳(capsid-less)”(或其变型)载体或核酸分子是指不具有衣壳的载体构建体。在一些实施方案中，无衣壳载体或核酸分子不含编码例如AAV Rep蛋白的序列。

“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(典型地是野生型AAV的所有衣壳蛋白)和包壳的多核苷酸rAAV载体构成的病毒颗粒。如果病毒或颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，诸如有待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则可以将其称为“rAAV载体颗粒”。因此，rAAV颗粒的产生必然包括rAAV载体的产生，因为此类载体包含在rAAV颗粒内。

AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如，野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。用于AAV的多种此类辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(诸如牛痘)。腺病毒涵盖多种不同子群，但子群C的5型腺病毒是最常用的。人类、非人哺乳动物和鸟类来源的许多腺病毒是已知的，并且可从诸如ATCC的保藏机构获得。疱疹科病毒包括例如单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)；它们也可从诸如ATCC的保藏机构获得。

如本文所用，“反向末端重复”(或“ITR”)是指位于单链核酸序列的5’端或3’端的核酸子序列，其包含一组核苷酸(初始序列)，之后下游是其反向补体，即回文序列。初始序列与反向补体之间的插入核苷酸序列可以具有任何长度。

如本文所用的术语“嗜性(tropism)”是指AAV载体或病毒体感染一种或多种特定细胞类型的能力，但也可以涵盖载体如何作用以转导所述一种或多种特定细胞类型的细胞；即，嗜性是指AAV载体或病毒体优先进入某一种或多种细胞或组织类型和/或与细胞表面优先相互作用，所述相互作用促进进入某些细胞或组织类型，任选并且优选地随后在所述细胞中表达(例如，转录以及任选地翻译)由AAV载体或病毒体携带的序列，例如对于重组病毒而言，表达一个或多个异源核苷酸序列。如本文所用，术语“转导”是指AAV载体或病毒体感染一种或多种特定细胞类型的能力；即，转导是指使AAV载体或病毒体进入细胞并且将AAV载体或病毒体中所含的遗传材料转移到细胞中以获得从载体基因组的表达。在一些情况下，但并非所有情况，转导和嗜性可能相关联。

“施用”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任何一种将治疗剂物理引入受试者。示例性施用途径(例如对于AAV疗法)包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠施用和外用施用以外的施用方式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。可以经由非肠胃外途径或口服施用治疗剂。其他非肠胃外途径包括外用、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内地、经阴道、经直肠、舌下或外用。施用还可以例如进行一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段。

术语“抗体”(Ab)是指但不限于特异性结合至抗原并且包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白。每条H链包含重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含至少三个恒定结构域：C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域：C_L。V_H和V_L区可以进一步细分为高变性区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个V_H和V_L包含三个CDR和四个FR，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

术语“抗体”(Ab)还包括但不限于免疫球蛋白的任何抗原结合部分，其与抗原特异性结合并且是如本文所定义的。

免疫球蛋白可以源自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别或亚类(例如，分别为IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体两者；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。可以通过重组方法将非人抗体人源化以降低其在人体中的免疫原性。在没有明确说明的情况下，并且除非上下文另有指示，否则术语“抗体”还包括任何上述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分以及单链抗体。

“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与AAV特异性结合的分离的抗体基本上不含与除AAV以外的抗原特异性结合的抗体)。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

术语“单克隆抗体”(mAb)是指具有单一分子组成的抗体分子的非天然存在的制剂，即其一级序列基本上相同并且对特定表位展现出单一结合特异性和亲和力的抗体分子。单克隆抗体是分离的抗体的例子。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术产生。

术语“中和抗体”(nAb)是指与靶标结合并且抑制或阻断靶标的功能的抗体。例如，结合AAV-9的中和抗体能够结合AAV-9并且破坏AAV-9的功能。在一些实施方案中，中和AAV抗体在病毒颗粒结合并且进入靶细胞之前结合AAV病毒颗粒，从而防止病毒颗粒结合和/或进入靶细胞并且在细胞内释放转基因。

“抗抗原抗体”是指与抗原特异性结合的抗体。例如，抗AAV抗体与AAV病毒颗粒特异性结合。

抗体的“抗原结合部分”(也称为“抗原结合片段”)是指抗体的一个或多个片段，其保留与完整抗体结合的抗原特异性结合的能力。

如本文所用，“高通量方法”是指允许在单一测定中表征多个生物样品的方法或测定。例如，可以使用高通量方法在单一测定中测量至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、或至少100个生物样品中的抗体滴度。在一些实施方案中，高通量方法或测定使用多孔板。在一些实施方案中，平行测量多个生物样品。如本文所用，“平行”测量的样品是同时测量的。在一些实施方案中，顺序地测量多个生物样品。

受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理或者向受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症、病症或与疾病相关的生化指标的发作、进展、发展、严重程度或复发。

“受试者”包括任何人类或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗和啮齿动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)。在一些实施方案中，受试者是人类。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。

如本文所用，“滴度”或“抗体滴度”是指样品(例如从受试者获得的生物样品)中的特定抗体的量。抗体的滴度可以使用本领域已知的任何方法来测量。在一些实施方案中，通过连续稀释含有抗体的样品直到不再检测到抗体超过背景来测量抗体的滴度。在此类例子中，抗体的滴度表述为倍数稀释度，在所述倍数稀释度之下，抗体的浓度降低至背景水平。例如，如果在被检测高于背景水平的一系列稀释度中1:800的稀释度是最高稀释度，则抗体的滴度表述为800。如果在被检测高于背景水平的一系列稀释度中1:40,000的稀释度是最高稀释度，则抗体的滴度表述为40,000。在一些实施方案中，抗AAV抗体的滴度小于约40,000。在某些实施方案中，抗AAV抗体的滴度小于约800。

在一些实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗体滴度。本领域已知的任何ELISA可以用于本公开文本的方法。ELISA的特征是一系列抗体相互作用，以在体外检测样品中靶标的存在。ELISA可以包括直接测定、间接测定或捕获测定(即，夹心测定)。在直接测定中，抗原与表面结合。将与酶缀合的第一抗体应用于所述表面，并且第一抗体结合所述抗原。然后添加受酶作用的底物，产生可检测的信号，所述信号指示表面上抗原的存在。在间接测定中，抗原与表面结合。然后将第一抗体应用于所述表面，并且第一抗体结合所述抗原。然后将与酶缀合的第二抗体应用于所述表面。第二抗体能够结合第一抗体。然后添加受酶作用的底物，产生可检测的信号，所述信号指示表面上抗原的存在。在捕获测定中，将抗体结合至表面，并且将包含抗原的样品应用于所述表面。然后，如在间接测定中那样，应用第一抗体和第二抗体。

在一些实施方案中，所述ELISA是“化学发光ELISA”。“化学发光ELISA”或“发光测定”或“化学发光测定”是一种ELISA类型，其使用光的发射作为对靶标存在的指示。然后可以测量发射的光的强度，并且将其与样品中靶标的丰度相关联。在化学发光ELISA中，酶将底物转化为反应产物，所述反应产物发射出光的光子。发光被描述为在物质从电子激发态返回基态时从其中发射光。化学发光是由化学反应产生的光。当激发的中间体返回到其稳定的基态时，释放出光子，所述光子被发光信号仪器中的传感器检测到。发光信号的强度可以以化学发光单位表述，其中检测到的化学发光单位的数量越大，生物样品中的靶标的滴度就越高。

任何化学发光酶和底物均可以用于本文公开的方法。在一些实施方案中，化学发光酶包括碱性磷酸酶(AP)。在一些实施方案中，化学发光酶包括辣根过氧化物酶(HRP)。在一些实施方案中，化学发光酶包括β半乳糖苷酶和β内酰胺酶。

在一些实施方案中，ELISA测定包括(1)用AAV靶标(例如AAV-9病毒颗粒)包被表面；(2)使所述表面与包含一种或多种抗AAV抗体的样品(例如从受试者获得的生物样品)接触；(3)使所述表面与融合至酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))的第二抗体接触，其中第二抗体能够结合抗AAV抗体；(4)使所述表面与化学发光底物接触；以及(5)测量从所述表面发射出的光。

替代方案(例如，“或”)的使用应当理解为意指替代方案之一、两者或其任何组合。如本文所用，不定冠词“一个/种”(“a”或“an”)应被理解为是指任何所列举或枚举的组分中的“一个/种或多个/种”。

术语“约”或“基本上包含……”是指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上包含……”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。可替代地，“约”或“基本上包含……”可以意指高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指高达值的一个数量级或高达值的5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上包含……”的含义在所述特定值或组成的可接受误差范围内。

如本文所用的术语“大约每周一次”、“大约每两周一次”或任何其他类似的给药间隔术语意指近似数。“大约每周一次”可以包括每七天±一天，即每六天至每八天。“大约每两周一次”可以包括每十四天±三天，即每十一天至每十七天。例如，类似的近似适用于大约每三周一次、大约每四周一次、大约每五周一次、大约每六周一次和大约每十二周一次。在一些实施方案中，大约每六周一次或大约每十二周一次的给药间隔分别意指可以在第一周的任何一天施用第一剂量，然后可以在第六周或第十二周的任何一天施用下一剂量。在其他实施方案中，大约每六周一次或大约每十二周一次的给药间隔分别意指在第一周的特定日期(例如，星期一)施用第一剂量，然后在第六周或第十二周的同一天(即，星期一)施用下一剂量。

如本文所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。

在以下小节中进一步详细描述了本公开文本的各个方面。

II.本公开文本的方法

本公开文本的某些方面涉及鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的方法，其包括使用ELISA测量从所述受试者获得的生物样品中的与特异性AAV结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度的受试者施用AAV疗法。

本公开文本的一些方面涉及治疗受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者施用AAV疗法，其中所述受试者被鉴定为具有如在ELISA中使用从所述受试者获得的生物样品测量的低的抗AAV抗体滴度。本公开文本的一些方面涉及治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)在ELISA中测量从所述受试者获得的生物样品中的抗AAV抗体的滴度，以及(2)向受试者施用AAV疗法，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度。在一些方面，本公开文本涉及一种治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)从所述受试者获得生物样品，(2)在ELISA中测量所述生物样品中的抗AAV抗体的滴度，以及(3)向受试者施用AAV疗法，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度。在一些方面，本公开文本涉及一种治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)从所述受试者获得或已获得生物样品，(2)在ELISA中测量或已测量所述生物样品中的抗AAV抗体的滴度，以及(3)向受试者施用AAV疗法，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度。

本公开文本的方法可用于治疗可以使用AAV疗法治疗的本领域已知的任何疾病或病症。例如，本文公开的方法可以用于治疗影响受试者的心脏、肝脏、肺、眼睛、血液、神经系统、淋巴系统、肌肉、干细胞及其任何组合的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是影响中枢神经系统的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括心脏病。在某些实施方案中，所述疾病或病症包括心力衰竭。在某些实施方案中，所述疾病或病症包括急性或慢性心力衰竭。在特定实施方案中，所述疾病或病症包括射血分数(HFrEF)降低的心力衰竭。在特定实施方案中，所述疾病或病症包括具有保留的射血分数的心力衰竭。在一些实施方案中，所述疾病或病症是囊性纤维化、B型血友病、关节炎、遗传性肺气肿、伯氏先天性黑内障、黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性)、杜氏肌营养不良症(DMD)、帕金森氏病、卡纳万病、贝敦氏病、阿尔茨海默氏病、脊髓性肌萎缩症、充血性心力衰竭、双等位基因RPE65突变相关的视网膜营养不良、或其任何组合。

本公开文本的一些方面涉及一种鉴定适合于AAV疗法的受试者的高通量方法，其包括使用ELISA测量从相应的多个受试者获得的多个生物样品中的每一个中的抗AAV抗体的滴度。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约500、至少约750、或至少约1000个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约10个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约20个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约30个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约40个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约50个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约60个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约70个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约80个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约90个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括至少约100个受试者。

在一些实施方案中，所述多个受试者包括2至约100个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括2至约90个受试者、2至约85个受试者、2至约80个受试者、2至约75个受试者、2至约70个受试者、2至约65个受试者、2至约60个受试者、2至约55个受试者、2至约50个受试者、2至约45个受试者、2至约40个受试者、2至约35个受试者、2至约30个受试者、2至约25个受试者、2至约20个受试者、2至约15个受试者、2至约10个受试者、或2至约5个受试者。

在一些实施方案中，所述多个受试者包括约5至约100个受试者、约10至约100个受试者、约15至约100个受试者、约20至约100个受试者、约25至约100个受试者、约30至约100个受试者、约35至约100个受试者、约40至约100个受试者、约45至约100个受试者、约50至约100个受试者、约55至约100个受试者、约60至约100个受试者、约65至约100个受试者、约70至约100个受试者、约75至约100个受试者、约80至约100个受试者、约85至约100个受试者、约90至约100个受试者、或约95至约100个受试者。

在一些实施方案中，所述多个受试者包括约10至约90个受试者、约20至约80个受试者、约30至约70个受试者、约40至约60个受试者、约25至约50个受试者、约50至约75个受试者、约25至约75个受试者、或约50至约100个受试者。在一些实施方案中，所述多个受试者包括约5至约10、约10至约20、约30至约40、或约40至约50个受试者。

在一些实施方案中，平行测量多个生物样品中的每一个中的滴度。在一些实施方案中，顺序地测量多个生物样品中的每一个中的滴度。

在一些实施方案中，本公开文本的方法包括测量生物样品中或多个生物样品中的每一个中的抗AAV抗体的滴度。抗AAV抗体可以包括单一类的抗AAV抗体，例如仅中和抗AAV抗体；或多于一类抗AAV抗体的混合物，例如中和抗AAV抗体和非中和抗AAV抗体。在一些实施方案中，抗AAV抗体的滴度包括中和抗AAV抗体的滴度、非中和抗AAV抗体的滴度、或两者。在某些实施方案中，抗AAV抗体的滴度仅包括中和抗AAV抗体的滴度或非中和抗体的滴度。在某些实施方案中，所述ELISA包括与所述中和抗AAV抗体或所述非中和抗AAV抗体结合的第二抗体。在一些实施方案中，本公开文本的方法检测中和抗AAV抗体和非中和抗AAV抗体两者。在某些实施方案中，所述ELISA包括与所述中和抗AAV抗体和所述非中和抗AAV抗体结合的第二抗体。如本文所述，本公开文本令人惊讶地鉴定生物样品中的总抗AAV抗体滴度与中和抗AAV抗体滴度之间的相关性。

抗AAV抗体可以是任何单一类型或类的抗AAV抗体，例如抗AAV-9抗体或抗AAV-2抗体或AAV-5抗体，或多于一种抗AAV抗体的混合物，例如抗AAV-9抗体和抗AAV-2抗体；抗AAV-9抗体和抗AAV-5；抗AAV-2抗体和抗AAV-5。抗AAV抗体也可以是任何同种型，例如IgG、IgM、IgD、IgA或IgE、或其组合。

II.A.腺相关病毒(AAV)

本公开文本的某些方面涉及检测抗AAV抗体和/或向受试者施用AAV的方法。腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvoviridae)的非包膜单链DNA病毒。与细小病毒科的大多数其他成员相反，AAV具有复制缺陷并且只能在辅助病毒(诸如腺病毒或疱疹病毒)的存在下进行有效复制。

AAV最早在1960年代中期被报道为腺病毒的病毒制剂的污染物。参见Atchison RW,Casto B C,HAMMON W M.Science.149(3685),754-756(1965)。从那时起，已经开发出逐渐更安全且更有效的使用AAV作为重组DNA载体的方法。参见例如Hermonat P.L.和Muzyczka N.Proc Natl Acad Sci USA.81(20),6466-6470(1984)。3.Laughlin C.A.,等人Gene,23(1),65-73(1983)。Matsushita T.,等人Gene Ther.5(7),938-945(1998)。XiaoX.,等人Journal of Virology.72(3),2224-2232(1998)。据报道，少量AAV基因组可以整合到宿主染色体中(Cheung AK,Hoggan MD,Hauswirth WW等人Integration of the adeno-associated virus genome into cellular DNA in latently infected human detroit6cells.J Virol 1980；33:739–748)。AAV在免疫学上不同于任何已知的腺病毒抗原。AAV衣壳含有单链DNA(ssDNA)基因组(Rose JA,Berns KI,Hoggan MD等人Proc Natl Acad SciUSA 1969；64:863-869。

AAV具有单链4.7kb DNA基因组，其编码复制(rep)基因和衣壳(cap)基因，所述基因的侧翼是两个反向末端重复序列(ITR)。它主要是非整合性的并且在非分裂组织中形成稳定的附加体。尽管其在成年人类群体中的血清流行率高，但它不与任何人类疾病相关联。参见

M.Virol.J.2,43(2005)。AAV在组织中的稳定表达、其病原性的缺乏、以及其易于产生高滴度使其成为非常有吸引力且受欢迎的基因转移平台。

重组AAV是遗传操纵的AAV，其中rep和cap基因的一部分或全部已被异源序列替代。正如野生型AAV一样，rAAV可以触发在有丝分裂后组织中的长期转基因表达，这很可能是因为rAAV的重组基因组在核内以主要环状附加体持续存在。rAAV的产生所需的rAAV仅顺式元件是AAV反向末端重复序列(ITR)，而rep、cap和腺病毒辅助基因可以以反式提供。因此，在本文公开的一些实施方案中，rAAV仅含有侧翼为ITR的转基因DNA，并且此基因组包壳在血清型特异性衣壳内。

AAV具有使其作为将外源DNA递送到细胞的载体而具有吸引力的独特特征。对培养物中的细胞的AAV感染通常是不致细胞病变的，并且人类和其他动物的自然感染是沉默且无症状的。此外，AAV感染许多不同类型的哺乳动物细胞，从而允许在体内靶向许多不同组织的可能性。AAV还具有使其成为对于基因递送特别有吸引力的病毒系统的另外优点，包括与其他形式的基因递送相比促进更温和的免疫应答以及在分裂细胞和休眠细胞两者中作为非整合载体持续表达。另外，AAV承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续若干小时)，从而使基于rAAV的疫苗的冷藏变得不太关键。

AAV转导和AAV基因组进入靶细胞不需要辅助病毒。此外，由于指导AAV复制、基因组包壳和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此所述基因组的内部大约4.7kb(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以被外源DNA(诸如含有启动子、目的DNA和聚腺苷酸化信号的基因盒)替代，而不丧失于AAV作为基因治疗剂的用途至关重要的任何功能。

AAV载体可以包含以顺式或反式起作用的另外元件。在特定实施方案中，包含载体基因组的AAV载体还具有在5’或3’末端侧翼为供体序列的一个或多个反向末端重复(ITR)序列；驱动供体序列转录的表达控制元件(例如，启动子或增强子)，诸如组成型或可调节的控制元件或组织特异性表达控制元件；内含子序列、填塞(stuffer)或填充多核苷酸序列；和/或位于供体序列的3’的多腺嘌呤序列。

在一些实施方案中，AAV使用辅助病毒进行复制。用于AAV的多种此类辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(诸如牛痘)。单独的腺病毒类型涵盖多种不同子群，但子群C的5型腺病毒是最常用的。人类、非人哺乳动物和鸟类来源的许多腺病毒是已知的，并且可从诸如ATCC的保藏机构获得。疱疹科病毒包括例如单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)；它们也可从诸如ATCC的保藏机构获得。

示例性AAV载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8中的任何一种的衣壳蛋白，或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8的衣壳变体。本发明的重组AAV载体还包括来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8及其任何变体中的任何一种的衣壳蛋白。特定的衣壳变体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8的衣壳变体，诸如具有氨基酸取代、缺失或插入/添加的衣壳蛋白。

本公开文本的某些方面涉及检测生物样品中的抗AAV抗体的方法。抗AAV抗体可以对本领域已知的任何AAV或本领域已知的任何AAV的任何方面(例如表面蛋白)具有特异性。示例性AAV包括但不限于1型AAV、2型AAV、3型AAV(包括3A型和3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、蛇AAV、鸟类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、和虾AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗1型AAV。在一些实施方案中，所述抗AAV抗体是抗1型AAV抗体、抗2型AAV抗体、抗3A型AAV抗体、抗3B型AAV抗体、抗4型AAV抗体、抗5型AAV抗体、抗6型AAV抗体、抗7型AAV抗体、抗8型AAV抗体、抗9型AAV抗体、抗10型AAV抗体、抗11型AAV抗体、抗12型AAV抗体、抗13型AAV抗体、抗蛇AAV抗体、抗鸟类AAV抗体、抗牛AAV抗体、抗犬AAV抗体、抗马AAV抗体、抗绵羊AAV抗体、抗山羊AAV抗体、或抗虾AAV抗体。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗2型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗3型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗4型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗5型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗6型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗7型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗8型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗9型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗10型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗11型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗12型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体结合抗13型AAV。

在一些实施方案中，抗AAV抗体结合多于一种AAV血清型，例如2型AAV和9型AAV。在一些实施方案中，抗AAV抗体以比任何其他AAV血清型更高的亲和力结合一种AAV血清型，例如9型AAV或2型AAV。在某些实施方案中，抗AAV抗体仅特异性结合一种AAV血清型，例如9型AAV或2型AAV。

在本公开文本的某些方面，所述方法进一步包括向受试者施用AAV疗法。在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用重组AAV。本领域已知和/或本文公开的任何重组AAV可以用于本公开文本的方法。在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用AAV，所述AAV选自1型AAV、2型AAV、3型AAV(包括3A型和3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、蛇AAV、鸟类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、及其任何组合。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用1型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用2型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用3型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用4型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用5型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用6型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用7型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用8型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用9型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用10型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用11型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用12型AAV。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用13型AAV。

在一些方面，本公开文本涉及具有不同的组织靶向能力(例如，组织嗜性)的AAV。在一些实施方案中，与非变体亲本衣壳多肽相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种人类干细胞类型中进一步展现出增加的转导或嗜性。在一些实施方案中，人类干细胞类型包括但不限于胚胎干细胞、成年组织干细胞(即体干细胞)、骨髓、祖细胞、诱导性多能干细胞、和重编程干细胞。在一些实施方案中，成年干细胞可以包括类器官干细胞(即，源自身体内感兴趣的任何器官或器官系统的干细胞)。在一些实施方案中，AAV的靶组织是性腺、隔膜、心脏、胃、肝脏、脾脏、胰腺或肾脏。在一些实施方案中，AAV靶向身体器官，包括但不限于皮肤、毛发、指甲、感觉受体、汗腺、油腺、骨、肌肉、脑、脊髓、神经、脑垂体、松果体、下丘脑、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、肾上腺、胰腺(胰岛组织)、心脏、血管、淋巴结、淋巴管、胸腺、脾脏、扁桃体、鼻、咽、喉、气管、支气管、肺、嘴、咽、食道、胃、小肠、大肠、直肠、肛管、牙齿、唾液腺、舌、肝脏、胆囊、胰腺、阑尾、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、睾丸、输精管(ductus deferens)(输精管(vas deferens))、尿道、前列腺、阴茎、阴囊、卵巢、子宫、输卵管(uterine tube)(输卵管(fallopian tube))、阴道、外阴、和乳腺(乳房)。身体的器官系统包括但不限于外皮系统、骨骼系统、肌肉系统、神经系统、内分泌系统、心血管系统、淋巴系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、和生殖系统。在一些实施方案中，转导和/或嗜性增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、65％、约70％％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％。在一些实施方案中，转导和/或嗜性增加约5％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％或约30％至约60％。

在一些实施方案中，用于所述AAV疗法的AAV是与结合所述抗AAV抗体的AAV不同的血清型。例如，在一些实施方案中，所述AAV疗法包括施用2型AAV，并且所述抗AAV抗体是抗9型AAV抗体。在一些实施方案中，用于所述AAV疗法的AAV是与结合所述抗AAV抗体的AAV相同的血清型。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用重组9型AAV，并且所述抗AAV抗体是抗9型AAV抗体。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用重组5型AAV，并且所述抗AAV抗体是抗5型AAV抗体。在某些实施方案中，所述AAV疗法包括施用重组2型AAV，并且所述抗AAV抗体是抗2型AAV抗体。

II.A.1.复制、衣壳、和组装AAV基因

AAV的单链基因组包含三个基因：rep(复制)、cap(衣壳)和aap(组装)。通过使用三个启动子、替代翻译起始位点、和差异剪接，这三个基因产生至少九种基因产物。

rep基因编码四种蛋白质(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，它们是病毒基因组复制和包装所必需的。

Cap基因表达产生病毒衣壳蛋白(VP1；VP2；VP3)，所述病毒衣壳蛋白形成保护病毒基因组的外部衣壳外壳，并且主动参与细胞结合和内化。据估计，病毒外衣由排列成二十面体结构的60种蛋白质构成。

aap基因在重叠cap基因的交替阅读框中编码组装激活蛋白(AAP)。这种核蛋白被认为为衣壳组装提供了支架功能，并且在一些AAV血清型中VP蛋白的核仁定位中发挥作用。

在一些实施方案中，rep、cap或aap基因中的一个或多个是天然存在的，例如rep、cap或app基因包括细小病毒rep、cap或aap基因的全部或一部分。在一些实施方案中，rep、cap或aap基因中的一个或多个包括合成序列。

在一个实施方案中，rep基因包括合成序列。在一个实施方案中，cap基因包括合成序列。在一个实施方案中，aap基因包括合成序列。在一个实施方案中，rep和cap基因包括合成序列。在一个实施方案中，rep和aap基因包括合成序列。在一个实施方案中，cap和aap基因包括合成序列。在一个实施方案中，rep、cap和aap基因包括合成序列。

在一些实施方案中，rep来自AAV基因组，其选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 AAV11、及其任何组合。在特定实施方案中，rep来自AAV1基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV2基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV3基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV4基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV5基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV6基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV7基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV8基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV9基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV10基因组。在特定实施方案中，rep来自AAV11基因组。

在一些实施方案中，cap来自AAV基因组，其选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 AAV11、及其任何组合。在特定实施方案中，cap来自AAV1基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV2基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV3基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV4基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV5基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV6基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV7基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV8基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV9基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV10基因组。在特定实施方案中，cap来自AAV11基因组。

在一些实施方案中，aap来自AAV基因组，其选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 AAV11、及其任何组合。在特定实施方案中，aap来自AAV1基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV2基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV3基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV4基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV5基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV6基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV7基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV8基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV9基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV10基因组。在特定实施方案中，aap来自AAV11基因组。

应当理解，本文所述的特定AAV基因组可以具有来自不同AAV基因组(例如，来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、和AAV11的基因组)的基因。因此，本文公开了包含任何可能排列的rep、cap或aap的AAV。

在本文公开的一些实施方案中，AAV是重组AAV(rAAV)。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因、cap基因和aap基因中的一个或多个。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因。在一些实施方案中，rAAV缺少cap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少aap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因并且缺少cap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因并且缺少aap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少cap基因并且缺少aap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因、cap基因和aap基因。

在本文公开的一些实施方案中，修饰rAAV，使得rep基因、cap基因和aap基因中的一个或多个突变，使得一个或多个AAV基因的表达被修饰。在一些实施方案中，rep基因突变。在一些实施方案中，cap基因突变。在一些实施方案中，aap基因突变。在一些实施方案中，rep基因和cap基因突变。在一些实施方案中，rep基因和aap基因突变。在一些实施方案中，cap基因和aap基因突变。在一些实施方案中，cap基因、rep基因和aap基因突变。

II.A.2.反向末端重复序列

在某些实施方案中，AAV包含第一ITR(例如5’ITR)和第二ITR(例如3’ITR)。典型地，ITR参与细小病毒(例如，AAV)从原核质粒进行DNA复制和拯救或切除(Samulski等人,1983,1987；Senapathy等人,1984；Gottlieb和Muzyczka,1988)。另外，据报道，ITR是AAV原病毒整合以及将AAV DNA包装到病毒体中所需的最小序列(McLaughlin等人,1988；Samulski等人,1989)。这些元件是细小病毒基因组的有效操纵所必需的。

在一些实施方案中，ITR包括天然存在的ITR，例如ITR包括细小病毒ITR的全部或一部分。在一些实施方案中，ITR包括合成序列。在一个实施方案中，第一ITR或第二ITR包括合成序列。在另一个实施方案中，第一ITR和第二ITR各自包括合成序列。在一些实施方案中，第一ITR或第二ITR包括天然存在的序列。在另一个实施方案中，第一ITR和第二ITR各自包括天然存在的序列。

在一些实施方案中，ITR包括来自AAV基因组的ITR。在一些实施方案中，ITR是选自以下的AAV基因组的ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、及其任何组合。在特定实施方案中，ITR是AAV2基因组的ITR。在另一个实施方案中，ITR是经遗传工程化以在其5’和3’端包括源自一个或多个AAV基因组的ITR的合成序列。在一些实施方案中，ITR源自相同的基因组，例如源自相同病毒的基因组；或源自不同的基因组，例如源自两种或更多种不同AAV基因组的基因组。在某些实施方案中，ITR源自相同的AAV基因组。在具体实施方案中，本发明核酸分子中存在的两个ITR相同，并且特别地可以是AAV2 ITR、AAV5ITR或AAV9 ITR。在一个特定实施方案中，第一ITR和第二ITR相同。

在一些实施方案中，ITR形成发夹环结构。在一个实施方案中，第一ITR形成发夹结构。在另一个实施方案中，第二ITR形成发夹结构。仍然在另一个实施方案中，第一ITR和第二ITR两者都形成发夹结构。

在一些实施方案中，本文所述的核酸分子中的ITR是转录激活的ITR。转录激活的ITR可以包含已经通过包括至少一个转录活性元件而被转录激活的野生型ITR的全部或一部分。多种类型的转录活性元件适合于在此背景下使用。在一些实施方案中，转录活性元件是组成型转录活性元件。组成型转录活性元件提供持续水平的基因转录，并且在希望持续表达转基因时是优选的。在其他实施方案中，转录活性元件是诱导型转录活性元件。诱导型转录活性元件通常在诱导物(或诱导条件)不存在下展现出低的活性，并且在诱导物存在下(或切换至诱导条件)上调。当希望仅在某些时间或在某些位置表达时或当希望使用诱导剂逐步增加表达水平时，诱导型转录活性元件可能是优选的。转录活性元件也可以是组织特异性的；也就是说，其仅在某些组织或细胞类型中展现出活性。

可以以多种方式将转录活性元件并入ITR中。在一些实施方案中，将转录活性元件并入ITR的任何部分的5’或ITR的任何部分的3’。在其他实施方案中，转录激活的ITR的转录活性元件位于两个ITR序列之间。如果转录活性元件包含必须被间隔开的两个或更多个元件，则这些元件可以与ITR的部分交替。在一些实施方案中，ITR的发夹结构缺失并且被转录元件的反向重复序列替代。这后一种排列将产生模拟结构中的缺失部分的发夹。多个串联转录活性元件也可以存在于转录激活的ITR中，并且这些元件可以相邻或间隔开。另外，可以将蛋白质结合位点(例如，Rep结合位点)引入转录激活的ITR的转录活性元件中。转录活性元件可以包含使得能够通过RNA聚合酶受控转录DNA以形成RNA的任何序列，并且可以包含例如如下文所定义的转录活性元件。

转录激活的ITR向具有相对受限的核苷酸序列长度的核酸分子提供转录激活和ITR功能二者，这有效地使可以携带并且从核酸分子表达的转基因的长度最大化。将转录活性元件并入ITR中可以以多种方式来完成。对ITR序列和转录活性元件的序列需求的比较可以提供对编码ITR内的元件的方式的了解。例如，可以通过在复制转录活性元件的功能元件的ITR序列中引入特定变化将转录活性添加至ITR。本领域中存在多种技术可有效添加、缺失和/或改变特定位点的具体核苷酸序列(参见例如，Deng和Nickoloff(1992)Anal.Biochem.200:81-88)。产生转录激活的ITR的另一种方式涉及在ITR中的所希望的位置引入限制位点。另外，可以使用本领域中已知的方法将多个转录激活元件并入转录激活的ITR中。

通过说明，可以通过包括一个或多个转录活性元件来产生转录激活的ITR，所述一个或多个转录活性元件诸如：TATA盒、GC盒、CCAAT盒、Sp1位点、Inr区、CRE(cAMP调控元件)位点、ATF-1/CRE位点、APBβ盒、APBα盒、CArG盒、CCAC盒、或如本领域中已知的参与转录的任何其他元件。

II.A.3.目的基因和其他序列

本公开文本的某些方面涉及向受试者施用AAV疗法的方法。在一些实施方案中，AAV包含目的基因(GOI)。在一些实施方案中，目的基因是非AAV基因。在一些实施方案中，GOI是哺乳动物基因。在一些实施方案中，GOI是人类基因。在一些实施方案中，所述目的基因编码生物活性多肽。在一些实施方案中，生物活性多肽是细胞因子、趋化因子、生长因子、凝结因子、激素、抗体、胰岛素、或其任何组合。

在一些实施方案中，目的基因例如编码治疗性多肽或其治疗有效部分。目的基因可以是编码多肽的任何多核苷酸。被表达的基因可以是编码蛋白质的DNA节段，其具有用户希望的任何必需的控制元件(例如，启动子、操纵子)；或是非编码DNA节段，其转录产生一些含RNA的分子(诸如核酶或反义分子)的全部或一部分。

在一些实施方案中，AAV包含多于一个GOI。在具有多于一个GOI的AAV中，一些实施方案包括诸如IRES或2A的元件，以从一个启动子共表达它们。在一些实施方案中，AAV包含被IRES元件分隔的两个目的基因。在一些实施方案中，AAV包含被2A元件分隔的两个目的基因。在一些实施方案中，AAV包含三个目的基因，所述目的基因之间被IRES元件分隔(例如，GOI-IRES-GOI-IRES-GOI)。在一些实施方案中，AAV包含三个目的基因，所述目的基因之间被2A元件分隔。

在一些实施方案中，AAV包含调节序列。在一些实施方案中，AAV包含非编码调节DNA。在一些实施方案中，AAV基因组包含调节序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调节序列”旨在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子、和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调节序列例如描述在Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,圣地亚哥，加利福尼亚州(1990))中。本领域技术人员应认识到，AAV的设计(包括调节序列的选择)可以取决于诸如有待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等因素。在一些实施方案中，AAV基因组包含mRNA剪接供体/剪接受体位点。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，诸如源自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，诸如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。再进一步地，调节元件由不同来源的序列构成，诸如SRa启动子系统，其含有来自人类T细胞白血病1型病毒的SV40早期启动子和长末端重复序列的序列(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。在某些实施方案中，所述调节序列包含组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子驱动所述目的基因在选自心脏、肝脏、肺、眼睛、神经系统、淋巴系统、肌肉和干细胞的组织中表达。

II.B.ELISA

本公开文本的某些方面涉及使用ELISA检测和/或测量生物样品中的抗AAV抗体的滴度的方法。本领域已知的任何ELISA可以用于本文公开的方法。在一些实施方案中，所述ELISA是群体ELISA。在某些实施方案中，所述ELISA是发光ELISA。在某些实施方案中，所述ELISA是化学发光ELISA。

在本公开文本的某些方面，所述ELISA包括将靶AAV结合至表面，例如板的表面。在一些实施方案中，ELISA然后包括使结合至表面的AAV与生物样品接触。在一些实施方案中，ELISA然后包括应用第二抗体。在一些实施方案中，第二抗体与酶连接。在一些实施方案中，ELISA然后包括应用底物，其中底物对与第二抗体连接的酶具有特异性。在一些实施方案中，所述ELISA包括测量作用在底物上的酶的产物。

在某些实施方案中，结合到表面的靶AAV包括1型AAV、2型AAV、3型AAV、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、或其任何组合。在某些实施方案中，结合到表面的靶AAV包括2型AAV。在某些实施方案中，结合到表面的靶AAV包括2型rAAV。在某些实施方案中，结合到表面的靶AAV包括5型AAV。在某些实施方案中，结合到表面的靶AAV包括5型rAAV。在某些实施方案中，结合到表面的靶AAV包括9型AAV。在某些实施方案中，结合到表面的靶AAV包括9型rAAV。

在某些实施方案中，将生物样品应用于ELISA的表面。所述生物样品可以是从受试者获得的任何样品，其中样品包含或被认为包含一种或多种抗AAV抗体。在一些实施方案中，所述生物样品包括血液样品。在一些实施方案中，所述生物样品包括血浆样品。在一些实施方案中，所述生物样品包括血清样品。

可以通过本领域已知的任何方法收集和/或获得生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品是直接从受试者获得的，例如通过直接从受试者的循环系统中抽取样品。在其他实施方案中，所述生物样品是从实验室获得的，其中实验室或前身先前直接从受试者获得生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品是新鲜的，例如所述样品尚未被冷冻或储存延长的时间段。在其他实施方案中，所述生物样品已经被储存在小于37℃的温度下。

在某些实施方案中，在所述ELISA之前将所述生物样品稀释。在一些实施方案中，所述生物样品被稀释至少约1:2、至少约1:3、至少约1:4、至少约1:5、至少约1:10、至少约1:20、至少约1:30、至少约1:40、至少约1:50、至少约1:100、至少约1:150、至少约1:200、至少约1:250、至少约1:300、至少约1:350、至少约1:400、至少约1:450、至少约1:500、至少约1:1000、至少约1:2000、至少约1:3000、至少约1:4000、至少约1:5000、至少约1:10,000、至少约1:20,000、至少约1:30,000、至少约1:40,000、至少约1:50,000、或至少约1:100,000。在一些实施方案中，所述生物样品被稀释至少约1:4。在一些实施方案中，所述生物样品被稀释至少约1:40。在一些实施方案中，所述生物样品被稀释至少约1:400。在一些实施方案中，所述生物样品被稀释至少约1:4000。在一些实施方案中，所述生物样品被稀释至少约1:40,000。可以使用在这些情况下通常使用并且本领域已知的任何稀释缓冲液。

在某些实施方案中，在将生物样品应用于ELISA的表面之前，将其纯化。

在某些实施方案中，第二抗体包括抗人抗体。在一些实施方案中，第二抗体包括抗人λ抗体。在一些实施方案中，第二抗体包括抗人κ抗体。在一些实施方案中，第二抗体包括抗人κ抗体和抗人λ抗体的组合。在一些实施方案中，第二抗体是山羊抗人λ抗体。在一些实施方案中，第二抗体是兔抗人κ抗体。在一些实施方案中，第二抗体是兔抗人λ抗体。在一些实施方案中，第二抗体是小鼠抗人κ抗体。在一些实施方案中，第二抗体是山羊抗人λ抗体。在一些实施方案中，第二抗体是小鼠抗人κ抗体。在一些实施方案中，第二抗体是大鼠抗人λ抗体。在一些实施方案中，第二抗体是大鼠抗人κ抗体。

在一些实施方案中，第二抗体与酶连接。所述酶可以是本领域用于ELISA的任何酶。在一些实施方案中，第二抗体与碱性磷酸酶(AP)连接。在一些实施方案中，第二抗体与辣根过氧化物酶(HRP)连接。在某些实施方案中，第二抗体是HRP缀合的山羊抗人λ抗体。在某些实施方案中，第二抗体是HRP缀合的山羊抗人κ抗体。在一些实施方案中，第二抗体包括HRP缀合的山羊抗人λ抗体和HRP缀合的山羊抗人κ抗体的组合。

本公开文本的某些方面涉及使用ELISA鉴定具有低的抗AAV抗体滴度的受试者的方法。在一些实施方案中，所述低的抗AAV抗体滴度小于约800至小于约40,000。在一些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约50,000、小于约45,000、小于约40,000、小于约35,000、小于约30,000、小于约25,000、小于约20,000、小于约15,000、小于约10,000、小于约9000、小于约8000、小于约7000、小于约6000、小于约5000、小于约4000、小于约3000、小于约2000、小于约1000、小于约900、小于约800、小于约700、小于约600、或小于约500，如通过化学发光ELISA测量的。

在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约40,000，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约10,000，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约4000，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约1000，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约900，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约850，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约800，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约750，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约700，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约650，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约600，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约550，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约500，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约400，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约300，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约200，如通过化学发光ELISA测量的。在某些实施方案中，抗AAV抗体滴度小于约100，如通过化学发光ELISA测量的。

在一些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约100,000化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在一些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约100,000、小于约50,000、小于约45,000、小于约40,000、小于约35,000、小于约30,000、小于约25,000、小于约20,000、小于约15,000、小于约10,000、小于约9000、小于约8000、小于约7000、小于约6000、小于约5000、小于约4000、小于约3000、小于约2000、小于约1000、小于约950、小于约900、小于约850、小于约800、小于约750、小于约700、小于约650、小于约600、小于约5500、或小于约500化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度。

在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约10,000化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约4000化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约1000化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约900化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约850化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约800化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约750化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约700化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约650化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约600化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约550化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。在某些实施方案中，如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约500化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。

在一些实施方案中，低的抗AAV抗体滴度与低的中和抗AAV抗体滴度相关联。

通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应被解释为进一步限制。将贯穿本申请引用的所有参考文献的内容均通过引用明确地并入本文。

实施例

实施例1

本研究旨在确定在使用ELISA测量的抗AAV抗体的总滴度与使用标准基于细胞的测定测量的中和抗体的滴度之间是否存在相关性，目的是出于患者排除目的用总抗体测定取代基于细胞的测定。

我们开发了针对抗AAV9抗体的高度灵敏的化学发光板基ELISA检测方法。我们还在总抗体筛选方法中建立了确认性层级，以评估ELISA信号的特异性。使用这种测定，分析100个心脏病患者血清样品的总AAV抗体。在典型的基于细胞的报告分子测定中评价相同样品的中和抗体，所述测定测量抗体预防AAV结合和进入细胞的能力。

我们的结果表明对于AAV血清型9，总抗体群体与中和抗体群体之间强的相关性。基于这些结果，我们提出了使用总抗体ELISA测定来筛选和选择接受基于AAV9的基因治疗药的患者。

材料和方法

试剂

在苏格兰邓迪大学(University of Dundee)从同意的患者收集血清样品。受试者是患有HFrEF(射血分数降低的心力衰竭)或HFpEF(射血分数保留的心力衰竭)的心力衰竭患者。血清样品是根据BMS与邓迪大学之间的材料转让协议(MTA)合同采购的，并且在BMS生物贮藏库中在-80℃下储存直到使用。

酶联免疫吸附测定

将rAAV9S100A1(AMT-120；uniQure Amsterdam)或rAAV9HLuc(AAV9-CMV-荧光素酶924；uniQure Amsterdam)储备物在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(SRE0034；SIGMA)中稀释至2.5-5.1 x 10¹¹滴度颗粒/mL(大约4-8μg/mL总蛋白质浓度)。将100μL包被在ELISA板上，并且将板用微板密封剂(WHA77040001；SIGMA)密封，并且在4℃冰箱中孵育16-18小时以允许AAV9被动吸附到板的聚苯乙烯表面。对于比色ELISA，使用Nunc96孔透明聚苯乙烯板(Thermo Fisher Roskilde，丹麦)。对于化学发光ELISA，使用Corning 96孔黑色聚苯乙烯板(Corning Inc.纽约)。在第二天，使用300μL PBS/0.05％Tween 20缓冲液(ChataBiosystems)将板洗涤3次，每次在自动洗板机(Biotek ELx405，威努斯基，佛蒙特州)中进行。将300μL Superblock T20(SBT20)缓冲液(ThermoScientific)添加到板中，以在另外步骤中阻断非特异性蛋白质检测。将板密封并且在22℃培养箱中在不摇动的情况下孵育2.5-3小时。

使用SBT20缓冲液作为稀释剂在聚丙烯板(951031861；Eppendorf)中制备ADK9抗rAAV9单克隆抗体对照(651162；Progen)和人类血清稀释液。如图例所指示，以1:50、1:100、或1:1000的稀释度使用ADK9对照抗体。如图所指示，将血清样品稀释至各种水平。将稀释液储存在4℃直到使用。对于竞争ELISA，以预期浓度的2倍制备ADK9对照和血清稀释液，并且将相等的量与8μg/mL rAAV9(竞争的Ab)或等体积的SBT20缓冲液(未竞争的对照)混合，并且在使用前在聚丙烯板中在22℃下孵育2小时。如较早所述将板洗涤，并且向板中添加100μL稀释的rAAV9 ADK9对照抗体或人类血清。对于背景对照，将100μL SBT20缓冲液添加到对照孔中。在竞争ELISA中，将100μL竞争或未竞争的对照rAAV9 ADK9抗体和人类血清添加到板中。

将板密封并且在微板摇床上在大约200-250rpm下在22℃培养箱中孵育1.5-2小时。将HRP缀合的山羊抗小鼠IgA(62-6720；Thermo Scientific)检测抗体稀释1,000倍，并且将HRP缀合的山羊抗人κ(2060-05；SouthernBiotech)和HRP缀合的山羊抗人λ(2070-05；Southern Biotech)检测抗体在SBT20缓冲液中稀释10,000倍。将稀释液储存在4℃直到使用。将板再次洗涤，并且将100μL稀释的检测抗体添加到适当的孔中，包括背景对照孔，并且将板密封并且在摇床上在22℃下孵育45分钟至1.5小时。将板再次洗涤，并且将100μL TMB底物(T5569；SIGMA)添加到比色ELISA板中，或将100μL化学发光底物(37069；ThermoScientific)添加到化学发光ELISA板中。将100μL停止试剂(S5814；SIGMA)添加到比色ELISA板中，并且在Spectramax M5e读板器(Molecular Device，森尼韦尔，加利福尼亚州)中在450nM处读取吸光度。在相同的读板器中以积分时间为500毫秒的发光设置读取化学发光ELISA板。

ELISA计算

通过将在抗AAV9 ADK9抗体或血清孵育孔中获得的平均化学发光或吸光度单位(比色ELISA)除以在背景对照孔(仅SBT20缓冲液孵育)中获得的平均化学发光或吸光度单位来计算ELISA中的信噪比(S/N)。对于ADK9的S/N需要用山羊抗小鼠检测抗体获得的单位。对于人类血清的S/N需要用山羊抗人κ和抗人λ检测抗体获得的单位。

使用以下公式计算当在溶液中与rAAV9竞争(竞争ELISA)时抗体与包被在ELISA板上的rAAV9结合的抑制百分比：100x{(平均未竞争化学发光单位-平均竞争化学发光单位)/平均未竞争化学发光单位}。

图形和统计分析

使用GraphPad Prism v 7.03软件生成所有图形。还使用相同软件对总ELISA抗体和中和抗体进行基于等级次序的Spearman相关性分析。在相关性分析中计算双尾P值和95％置信区间。

中和抗体测定

将Lec-2细胞(CRL 1736；ATCC)以20,000个Lec-2细胞/孔的密度在96孔板中在37℃/5％CO2下在补充有1％青霉素和链霉素(目录号15140122；ThermoFisher Scientific)和2mM L-谷氨酰胺(目录号25030081；ThermoFisher Scientific)的含有10％FBS(目录号10438；Gibco)的MEM培养基(M8042；Millipore SIGMA)中培养过夜。在第二天，将rAAV9HLuc储备物在无FBS的MEM培养基中稀释至22,500MOI并且用被无FBS的MEM培养基稀释20倍的人类血清样品在室温下孵育1小时。阴性对照由与单独的热灭活的FBS混合的rAAVHLuc组成。从Lec-2细胞吸出培养基，并且将100μL AAV9和血清混合物或对照添加至细胞，并且在37℃/5％CO2下孵育30分钟。将培养基用10％FBS-DMEM替换，并且将细胞在37℃/5％CO2下孵育16-20小时。除去培养基并且进行100μL 1X DPBS(目录号14190094；Invitrogen)洗涤后，使用100μL GLO裂解缓冲液(E2661：Promega)裂解细胞，并且在室温下孵育5分钟。根据制造商的说明制备100μL荧光素酶底物(E6120；Promega)，并且将其添加到裂解的细胞中，并且孵育3分钟。使用读板器(Enspire；Perkin Elmer)测量发光信号。血清样品的中和活性报告占阴性FBS对照的百分比(％FBS)。

结果

使用小鼠单克隆抗体对照针对总抗AAV9抗体比较化学发光ELISA检测方法与比色ELISA检测方法

比色ELISA先前已用于检测抗AAV Ab。鉴于通常化学发光ELISA在检测蛋白质特异性抗体中的优越灵敏度，我们比较了两种方法的抗AAV抗体检测。将透明或黑色聚苯乙烯板用在碳酸盐缓冲液中8μg/mL的浓度的含有荧光素酶(rAAV9-HLuc)的转基因或S100A1(rAAV9-S100A1)的AAV9衣壳包被过夜，并且用ADK9(如方法部分中所述的小鼠单克隆抗AAV9抗体)检测。rAAV9-HLuc颗粒含有在基于细胞的中和抗体测定中使用的萤火虫荧光素酶报告分子构建体。尽管两种AAV9颗粒均被构建为具有相同的衣壳，但荧光素酶衣壳包含在ELISA中以证明衣壳相似性以及能够对总抗体数据集与中和抗体数据集进行相关性审查。如表1所示，在1:50和1:100ADK9的稀释度下并且对于含有荧光素酶和转基因的两种构建体，化学发光ELISA显示出与比色ELISA相比信噪(S/N)比21-38倍的提高。rAAV9-S100A1和rAAV9-荧光素酶的检测不存在差异，证明了AAV9衣壳在抗体反应性方面相似。

表1：使用小鼠单克隆抗体对照针对抗rAAV9抗体比较比色ELISA检测方法与化学发光ELISA检测方法。将ADK9对照在SBT20缓冲液中稀释50倍或100倍，并且用于在比色ELISA方法或化学发光ELISA方法中检测rAAV9-S100A1或rAAV9-HLuc。如材料和方法部分所述，使用ADK9和对照孔的三次重复的平均值计算信噪比。

S/N＝信噪比

化学发光ELISA检测人类血清样品中的总抗AAV9抗体的评估

为了确保使用以上小鼠单克隆对照确定的条件适用于检测人抗AAV9抗体，使用商业获得的正常人类血清(NHS)样品重新评估两种ELISA检测方法。在包被优化实验(数据未示出)后，将板用4μg/mL rAAV9S100A1包被。使用SBT20缓冲液从4倍稀释度开始制备8种不同批次的NHS样品的10倍稀释液。将稀释液的等分试样分成两份，并且在化学发光检测方法和比色检测方法中使用HRP缀合的抗κ和抗λ检测抗体进行测试。在化学发光方法中，从4倍至4000倍稀释度范围内观察到线性度(图1A)，而在比色方法中，在最高400倍稀释度范围内检测到线性度(图1B)。因此，化学发光方法显示出动态范围提高至少一个log。如方法部分所述计算在1:4、1:40和1:400的血清稀释度下的信噪比(S/N)，因为对于两种方法，所有三种稀释度均落在近似线性范围内。作为代表性的比较器，示出了在1:400倍稀释度下的S/N计算(图2)。在所有测试样品中，与比色方法相比，化学发光方法中的S/N更高(图2)。在所有测试样品中，与比色方法相比，化学发光方法中的S/N更高(图2)。在CL方法中17/21个样品显示出S/N>4.0，而在比色方法中仅1/21个样品显示出S/N>4.0。图11A和图11B中示出了在1:4和1:400倍血清稀释度下的S/N比较。

为了进一步分析使用化学发光ELISA的可行性，使用在比色ELISA中在4倍血清稀释度下以及在化学发光ELISA中在400倍血清稀释度下获得的数据进行基于等级次序的非参数相关性分析。对于每种方法，从线性范围中选择血清稀释度(图1A-1B)。在两种方法之间观察到显著相关性(图3)，表明对于所有测试样品，化学发光ELISA检测方法相对于比色方法的灵敏度的相关性增加。

在化学发光ELISA中确认抗rAAV9抗体结合特异性

将特异性层级引入化学发光ELISA中，以确保检测到AAV9特异性抗体，而不是直接结合板的非特异性血清组分。以所示浓度的2倍制备正常人类血清样品，并且在聚丙烯板中用8μg/mL rAAV9S100A1(4μg/mL最终浓度)预孵育2小时，然后将血清样品添加到洗涤和封闭的rAAV9S100A1包被板中(图4A-4C)。在rAAV9S100A1包被板上孵育之后，预期在ELISA中洗掉在溶液中保持与竞争AAV9衣壳结合的抗体。如材料和方法中所述计算抗体对板包被AAV9衣壳的竞争或结合特异性的水平，并且表述为ELISA信号的抑制百分比。使用这种方法，四个测试血清样品在竞争ELISA中显示出50％或更大的抑制(图4A-4B)。小鼠ADK9单克隆抗体对照显示出96％的抑制，表明所述竞争参数对于接近最大抑制水平和特异性确定而言是最佳的。

化学发光ELISA方法的再现性

在化学发光ELISA方法中在不同的两天测试12个不同批次的正常人类血清，每次由不同的分析者进行，以确定方法的再现性(图5A-5B)。在实验中选择在线性范围内的两种血清稀释度(参见图1A-1B)。结果表明，在两种测试稀释度下分析者之间的再现性良好，并且实验间精密度低于30％(图5A-5B)。

含有转基因和荧光素酶的构建体的互换性

最终目标是在从心脏病群体中进行血清样品的预筛选中确定在抗rAAV9总抗体与中和抗体之间否存在相关性。然而，总抗体测定利用包壳S100A1转基因的rAAV9衣壳，而中和抗体测定利用包壳荧光素酶报告分子的rAAV9衣壳。为了确保在两个数据集之间观察到的任何非相关性不是由于每种测定中使用的AAV9衣壳材料的不同，最初使用三种不同批次的正常人类血清作为阳性对照在总抗体ELISA中测试两种构建体。将相等量的含有荧光素酶和转基因的rAAV9衣壳包被在ELISA板上，并且使用三种不同批次的正常人类血清样品的四种稀释度来探测封闭和洗涤的ELISA板。当用所有三种血清样品并且在所有测试稀释度下进行探测时，两种衣壳都显示出相似的信号(图6A-6C)。因此，总抗体测定数据与中和抗体测定数据之间的相关性的潜在缺乏将不是由于两种衣壳类型之间抗体结合表位的不可预见的变化。心脏病血清样品中的总抗体和中和抗rAAV9抗体的相关性分析

已经证明了在两种测定(即，基于细胞的中和抗体和总抗体ELISA)中使用的衣壳在免疫反应性方面相似，我们继续评估一组来自心脏病患者的100个血清样品的中和抗体数据与总抗体数据的相关性。对于基于细胞的测定，将血清样品稀释20倍并且与rAAV9-HLuc衣壳一起孵育1小时，并且添加到在培养物中的Lec-2细胞中。对照由单独的HLuc衣壳或小鼠单克隆抗体ADK9组成。然后洗涤细胞，添加荧光素酶底物，并且如材料和方法中所述完成测定。

抗体的中和潜力表述为占在FBS阴性对照(不含抗rAAV9中和抗体)的存在下观察到的rAAV9HLuc的转导的百分比。由于将rAAV9HLuc与阴性对照一起孵育预期会导致衣壳的最大细胞进入，然后是荧光素酶表达，在任何血清样品的存在下荧光素酶表达水平的降低指示样品中的中和抗体的存在。

将相同样品稀释400倍(测定的线性范围)并且在ELISA中评估总抗体，如材料和方法中所述。基于原始数据单位绘制ELISA数据。两个数据集之间基于等级次序的Spearman相关性分析显示出中和抗体与总抗体之间显著的负相关性(r-0.8286，p<0.0001)(图7，p值<0.0001)。任意但广泛使用的50％中和截止限标准鉴定出100样品中的65个呈中和抗体阳性。在总抗体ELISA中，所有中和抗体阳性受试者均显示出>700化学发光单位(图7)。总抗体测定中700化学发光单位的截止限还捕获了另外7个中和抗体阴性个体，如右上象限所示(图7)。

与非竞争性ELISA平行地，对所有100个受试者进行确认性或竞争性ELISA，如材料和方法中所述。中和抗体数据集与确认性ELISA抗体数据集之间的等级次序相关性分析还导致显著的负相关性(r-0.7193，p<0.0001)。在65个中和抗体阳性受试者中，7名个体具有在竞争性总抗体ELISA中抑制水平为30％或更低的抗体(图8，左下象限)。另外7个中和抗体阴性受试者被鉴定为在ELISA中在30％的任意截止限下具有特异性抗体(图8，右上象限)。

在针对抗2型AAV抗体的结果中观察到针对抗9型AAV抗体观察到的结果相似的结果(图9)。

总体统计表明，在基于细胞的中和测定和确认总抗体ELISA中排除的患者数量接近(65比66)(表2)。在总抗体ELISA中，相对于中和抗体测定和确认性ELISA，将分别排除另外7或6个受试者。仔细检查这三个数据集的重叠，以确定使用三种测定中的任何一种用于患者筛选和排除的适当性。这些评价基于的是对于中和抗体测定而言任意截止限≤50％、在筛选或总抗体ELISA中≥700单位、以及在确认性抗体ELISA中≥30％。仅中和测定的标准将需要排除6个其抗体在ELISA中未确认阳性的受试者(图10)。基于仅总抗体ELISA的标准的患者选择将排除7个不属于中和抗体群体的受试者(中和抗体假阳性)和11个在ELISA中未确认阳性的受试者。基于确认性总抗体ELISA的患者选择将包括6个在中和抗体测定中呈阳性的受试者。

表2：三种测定中的每一种的患者排除和选择统计。

使用来自36名个体心脏病患者的血清以与进行本文所述的关于AAV9的相关性分析相同的方式进行关于AAV2的相关性分析(参见方法和图7)，不同之处在于在ELISA和中和抗体测定中使用AAV2衣壳，并且检测抗AAV2抗体而不是抗AAV9抗体(参见图9)。

将经由HRP缀合的抗κ和抗λ抗体对rAAV9抗体的检测与经由HRP缀合的抗IgG抗体进行的检测进行比较。以4μg/mL包被rAAV9S100A1，并且使用1:400倍稀释度的所示正常人类血清批次如材料和方法中所述进行ELISA。使用以1:10,000稀释度的过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG(A6029SIGMA)。

讨论

人类在生命的早期就暴露于野生型AAV并且产生抗AAV抗体。源自血清型1至9的AAV载体是非临床研究和临床研究中最常用的血清型。此类预先存在的抗AAV抗体代表针对基因疗法体内应用重组腺病毒的局限性，如在多种实验结果中显而易见。例如，显示在施用编码凝聚因子IX转基因的AAV8载体之前用纯化人IgG对非临床模型进行被动免疫会阻断肝脏的转导(Mingozzi等人,2012)。在涉及在小鼠或非人灵长类动物中顺序地施用多种AAV血清型的另一项研究中，响应于一种血清型而产生的中和抗体完全抑制相同血清型的转导，但不抑制不同血清型的转导(Majowicz等人,2014)。据报道，抗AAV2中和抗体的相对滴度的不同潜在地有助于在人类临床试验中防止B型血友病转基因转导(Manno等人,2006)。根据这些观察结果，具有预先存在的AAV抗体的临床试验受试者和患者的鉴定和排除可以增加成功转导转基因的机会。

通常，使用体外基于细胞的测定以及非标准化的测定条件和鉴定标准，在患者血清样品中检测防止病毒附着于细胞表面受体并且随后进入宿主细胞的AAV中和抗体。中和抗体测定通常使用AAV病毒衣壳，所述AAV病毒衣壳含有报告基因(通常是荧光素酶)而不是转基因，从而能够实现测定读出。基于细胞的测定费力、通量低且易于变化。针对所考虑的每种AAV血清型涉及到相当量的测定优化，包括表达与靶内源宿主细胞受体相似的适当受体的细胞系的选择。相比之下，ELISA具有更高的通量，可变性较小且更易于开发、自动化并且验证。此外，AAV基因治疗剂可以直接用作用于板包被和在ELISA中检测抗AAV抗体的试剂。如果可以在基于细胞的中和抗体与在ELISA中检测到的总抗体或结合抗体之间证明相关性，则后者可以用于从临床试验和药物施用来鉴定和排除具有预先存在的AAV抗体的个体。

我们试图了解患者群体中预先存在的抗体(中和抗体和总抗体两者)的频率，并且然后建立基于细胞的中和数据与总抗体数据之间的强相关性(如果有的话)。作为朝着这个目标的第一步，我们着手开发用于检测抗AAV9抗体的高度灵敏且特异性的化学发光ELISA。由于缺乏纯化人抗AAV抗体阳性对照，我们使用商业小鼠单克隆AAV9抗体(ADK9)进行初始测定开发和优化，包括诸如病毒颗粒包被浓度、包被缓冲液(PBS与CaCO₃)、封闭缓冲液和用PBS-Tween的洗涤循环数的参数(数据未示出)。

随后使用来自正常健康人类供体的若干可商购血清样品，以证明其宽的动态测定范围和线性度(大约4log的血清稀释度)、再现性和精密度。在添加到板结合的rAAV9之前通过将血清样品与在溶液中的rAAV9一起预孵育来在测定中建立确认性或特异性层级。如通过小鼠单克隆ADK9阳性对照的高ELISA信号抑制水平(96％)所示，所述确认性测定条件是最佳的。对于不同的血清样品批次看到各种抑制水平(50％-72％范围)，表明测定条件对于区分各种特异性的抗体也可能是最佳的。应注意，我们在CL ELISA中使用广谱(pan)同种型抗人κ和λ恒定区检测抗体，原因是使用抗人IgG检测抗体的早期测试会导致与抗人κ和λ检测抗体相比，12个正常人类血清样品中的至少5个显示出相对低于或小于背景信号(图12)。

由于基因治疗研究历来采用比色ELISA来检测AAV抗体，因此我们认为在两种方法之间进行头对头(head-to-head)比较(化学发光与比色)是重要的。就信噪比(S/N)而言，化学发光(CL)ELISA明显优于比色ELISA，如结果部分所述。尽管CL蛋白ELISA已用于检测抗体，但据我们所知，这是将CL ELISA应用于检测抗AAV抗体的首次报道。这也是对关于抗AAV抗体检测的确认性或特异性层级的首次报道。

分析100个来自患有心脏病的患者的血清样品的预先存在的AAV9抗体，意图是将总抗体数据集与基于细胞的中和抗体数据相关联。在相关性分析之前，我们确保当用正常人类血清样品或小鼠ADK9单克隆对照探测时，两种衣壳在抗体反应性方面彼此相似。对100个心脏病患者血清样品的总抗体数据和中和抗体数据的评估显示出总抗体数据集与中和抗体数据集之间显著的负相关性，表明在CL ELISA中检测到的大多数总抗体具有中和特性。中和抗体数据与确认性ELISA数据之间的相似相关性分析得出较低的负系数，但仍显示出强的显著性水平。由于在这项研究中观察到强的相关性，总抗体ELISA和/或确认性抗体ELISA是基于细胞的中和抗体测定的可行替代方案，用于针对基于rAAV9的基因治疗药筛选和排除受试者。

尽管几个单独的血清样品的重叠不同，但是总抗体ELISA和确认性抗体ELISA代表基于细胞的中和抗体测定的更容易且更快的替代方案，因为它们捕获中和抗体阳性群体中的大多数。此外，CL ELISA具有鉴定抗体的附加优势，所述抗体可以通过独立于受体结合和进入的机制进行中和。鉴于检测呈两种形式(中和抗体和确认性总抗体)的抗AAV9抗体阳性的个体的高百分比以及针对研究募集而筛选大量患者样品的预期需要，在速度和低变化性方面获得的优点较高。在没有足够的药物(包壳转基因的病毒衣壳)可用于测定的竞争抑制部分的情况下，截止限≥700单位的总抗体测定代表受试者筛选和排除的可行替代方案。可以进一步开发总抗体ELISA以使用纯化人IgG并入相对定量，并且可以基于重量/体积抗体水平来建立截止限。

尽管过去的几项研究已经解决了在ELISA(结合抗体)中检测到的抗体滴度与在基于细胞的测定中测量的中和抗体滴度之间是否存在联系，但均未教导用ELISA方法取代基于细胞的测定。此外，这些研究在ELISA中使用检测比色方法以及在基于细胞的中和测定中使用多种报告分子，包括β-半乳糖苷酶、AAV复制蛋白和荧光素酶，以检测针对AAV1、AAV2、AAV9和其他AAV血清型的抗体。这些研究中的两项显示出对于AAV2抗体，这两种测定之间差的相关性(Chirmule等人,1999；Erles等人,1999)。尽管检查51个健康供体血清中的AAV1滴度的一项研究表明在ELISA中的IgG滴度与在所述特定情况下的中和滴度之间可能存在相关性(Veron等人,2012)，但是另一项研究评价了100个健康人类供体样品的AAV9 ELISA与中和抗体滴度之间的相关性并且报告了大多数抗AAV9 IgG滴度在本质上是非中和的(Thwaite等人,2015)。我们已经证明了对于AAV9和AAV2，总ELISA抗体与中和抗体之间强的相关性；CL方法的灵敏度增加以及我们在ELISA中使用广谱同种型抗人κ和λ恒定区检测抗体的事实可能有帮助。我们在方法开发期间的早期测试了抗人IgG检测抗体并且注意到与抗人κ和λ检测抗体相比，12个正常人类血清样品中的至少5个显示出相对低于或小于背景信号(图12)。

总之，我们已经开发了用于检测抗AAV9抗体的高度灵敏的化学发光ELISA，并且证明了与AAV9中和滴度的显著相关性。这允许我们使用AAV9 ELISA替代基于细胞的中和抗体测定，以在临床试验中进行患者筛选和排除以及以FDA批准的AAV9方式治疗患者。我们还在AAV9 ELISA中建立了确认性层级，其促进了第二层级的筛选。这是在化学发光方法中检测AAV抗体的首个此类报道，所述化学发光方法还评价特异性。与滴定组合，这种测定还可以用于在其中基于治疗幼稚的受试者设置截止限的三层级筛选、确认和滴度方法中鉴定响应于基于AAV9的基因治疗药而产生的抗药物抗体(ADA)。

具体实施方案的前述描述充分揭示了本公开文本的一般性质，其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在无需过度实验并且不偏离本公开文本的一般概念的情况下容易针对各种应用修改和/或调整所述具体实施方案。因此，基于本文给出的传授内容和指导，此类调整和修改旨在包含在所公开的实施方案的等效方案的含义和范围内。应理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据总体的传授内容和指导来解释。

考虑到本公开文本的说明书和实践，本公开文本的其他实施方案对于本领域技术人员而言将是清楚的。所述说明书和实施例旨在仅被视为示例性的，所附权利要求指示了本公开文本的真实范围和精神。

将本文参考的所有出版物、专利和专利申请的公开内容均通过引用以其整体并入，其程度就如同特定且单独地指示将每个单独的出版物、专利或专利申请的公开内容通过引用以其整体并入一样。

本申请要求2018年6月20日提交的美国临时申请号62/687,564的权益，将其通过引用以其整体并入本文。

Claims

1.一种鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的方法，其包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量从所述受试者获得的生物样品中的与AAV特异性结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括向被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度的受试者施用AAV疗法。

3.一种治疗受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者施用AAV疗法，其中所述受试者被鉴定为具有如在ELISA中使用从所述受试者获得的生物样品测量的低的抗AAV抗体滴度。

4.一种治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)在ELISA中测量从所述受试者获得的生物样品中的抗AAV抗体的滴度，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度，以及(2)向被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度的所述受试者施用AAV疗法。

5.一种治疗受试者的疾病的方法，其包括(1)从所述受试者获得生物样品，(2)在ELISA中测量所述生物样品中的抗AAV抗体的滴度，其中所述受试者被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度，以及(3)向被鉴定为具有低的抗AAV抗体滴度的所述受试者施用AAV疗法。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述疾病是心脏、肝脏、肺、眼睛、血液、神经系统、淋巴系统、肌肉、干细胞或其任何组合中的。

7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述疾病是心脏病。

8.一种鉴定适合于腺相关病毒(AAV)疗法的受试者的高通量方法，其包括使用ELISA测量从相应的多个受试者获得的多个生物样品中的每一个中的与AAV特异性结合的抗体或其抗原结合部分(“抗AAV抗体”)的滴度。

9.根据权利要求8所述的高通量方法，其中所述多个受试者包括约5至约10、约10至约20、约30至约40、或约40至约50个受试者。

10.根据权利要求8或9所述的高通量方法，其中平行或顺序地测量所述多个生物样品中的每一个中的滴度。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中抗AAV抗体的滴度包括中和抗AAV抗体的滴度、非中和抗AAV抗体的滴度、或两者。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述ELISA包括与所述中和抗AAV抗体或所述非中和抗AAV抗体结合的第二抗体。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述ELISA包括与所述中和抗AAV抗体和所述非中和抗AAV抗体结合的第二抗体。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用重组AAV。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用AAV，所述AAV选自1型AAV、2型AAV、3型AAV(包括3A型和3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、蛇AAV、鸟类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、及其任何组合。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用5型AAV。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用9型AAV。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用2型AAV。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体是抗1型AAV抗体、抗2型AAV抗体、抗3A型AAV抗体、抗3B型AAV抗体、抗4型AAV抗体、抗5型AAV抗体、抗6型AAV抗体、抗7型AAV抗体、抗8型AAV抗体、抗9型AAV抗体、抗10型AAV抗体、抗11型AAV抗体、抗12型AAV抗体、抗13型AAV抗体、抗蛇AAV抗体、抗鸟类AAV抗体、抗牛AAV抗体、抗犬AAV抗体、抗马AAV抗体、抗绵羊AAV抗体、抗山羊AAV抗体、或抗虾AAV抗体。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体是抗5型AAV抗体。

21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体是抗9型AAV抗体。

22.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体是抗2型AAV抗体。

23.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中用于所述AAV疗法的AAV是与结合所述抗AAV抗体的AAV不同的血清型。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述ELISA包括化学发光ELISA。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述ELISA是群体ELISA。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血清样品。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血液样品。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中在所述ELISA之前将所述生物样品稀释。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述生物样品被稀释至少约1:2、至少约1:3、至少约1:4、至少约1:5、至少约1:10、至少约1:20、至少约1:30、至少约1:40、至少约1:50、至少约1:100、至少约1:150、至少约1:200、至少约1:250、至少约1:300、至少约1:350、至少约1:400、至少约1:450、至少约1:500、至少约1:1000。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体滴度小于约800至小于约40,000。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体滴度小于约40,000、小于约35,000、小于约30,000、小于约25,000、小于约20,000、小于约15,000、小于约10,000、小于约5000、小于约4000、小于约3000、小于约2000、小于约1000、小于约900、或小于约800。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述抗AAV抗体滴度小于约800。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约100,000、小于约10,000、小于约1000、小于约950、小于约900、小于约850、小于约800、小于约750、小于约700、小于约650、小于约600、小于约550、或小于约500化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中如果在化学发光ELISA中所述生物样品发射出小于约700化学发光单位，则受试者被鉴定为具有低的所述抗AAV抗体的滴度。

35.根据权利要求2至34中任一项所述的方法，其中所述低的抗AAV抗体滴度与低的中和抗AAV抗体滴度相关联。

36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述AAV疗法包括施用包含目的基因的AAV。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述目的基因编码生物活性多肽。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述AAV进一步包含调节序列。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述调节序列包含组织特异性启动子。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述组织特异性启动子驱动所述目的基因在选自心脏、肝脏、肺、眼睛、神经系统、淋巴系统、肌肉和干细胞的组织中表达。