ES2945427T3 - Secuencias de AAV ancestrales y usos de las mismas - Google Patents
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Abstract
Se describen métodos para predecir secuencias ancestrales de virus o partes de los mismos. También se describen secuencias ancestrales pronosticadas para polipéptidos de la cápside del virus adenoasociado (AAV). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Secuencias de AAV ancestrales y usos de las mismas
Campo técnico
Esta descripción se refiere en general a virus.
Antecedentes
Eludir y evitar una respuesta inmunitaria neutralizante o tóxica contra un vector de terapia génica es un reto importante con todos los tipos de vectores de transferencia de genes. Hasta la fecha, la transferencia de genes se ha conseguido de forma más eficaz usando vectores basados en virus que circulan en humanos y animales, como los adenovirus y los virus adenoasociados (AAV). Sin embargo, si los sujetos han sido infectados naturalmente por un virus, un tratamiento posterior con un vector basado en ese virus conlleva mayores riesgos de seguridad y una menor eficacia de la transferencia de genes debido a las respuestas inmunitarias celular y humoral. Los antígenos de la cápside son principalmente responsables de la inmunidad innata y/o adaptativa hacia las partículas de virus, sin embargo, los polipéptidos codificados por genes virales también pueden ser inmunogénicos.
Resumen
Esta descripción describe métodos de predicción y síntesis de secuencias víricas ancestrales o porciones de las mismas, y también describe partículas víricas que contienen tales secuencias víricas ancestrales. Los métodos descritos en el presente documento se aplicaron al virus adenoasociado (AAV); por tanto, esta descripción describe secuencias de AAV ancestral predichas y partículas de virus de AAV que contienen dichas secuencias de AAV ancestral. Esta descripción también describe la seroprevalencia presentada por las partículas de virus que contienen secuencias ancestrales en relación con las partículas de virus que contienen secuencias contemporáneas.
En un aspecto, se proporciona un polipéptido de la cápside de virus adenoasociado (AAV) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, un polipéptido de la cápside de AAV de este tipo, o una partícula de virus que comprende dicho polipéptido de la cápside de AAV, presenta aproximadamente la misma o más baja seroprevalencia que un polipéptido de la cápside AAV9 o una partícula de virus que comprende un polipéptido de la cápside AAV9. En algunas realizaciones, un polipéptido de la cápside de AAV de este tipo, o una partícula de virus que comprende el polipéptido de la cápside de AAV, se neutraliza a un grado similar o menor por el suero humano que es un polipéptido de la cápside AAV9 o una partícula de virus que comprende un polipéptido de la cápside AAV9. En algunas realizaciones, un polipéptido de la cápside de AAV de este tipo se purifica. En algunas realizaciones, un polipéptido de la cápside de AAV de este tipo está codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 43.
También se proporciona una partícula de virus purificada que incluye un polipéptido de la cápside de AAV de este tipo. En algunas realizaciones, una partícula de virus purificado de este tipo incluye además un transgén.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la cápside de virus adenoasociado (AAV) que tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, se proporciona un vector que incluye una molécula de ácido nucleico de este tipo. En algunas realizaciones, se proporciona una célula huésped que incluye un vector de este tipo.
En otro aspecto, se proporciona un método de transferencia de genes y/o vacunación con un transgén. Un método de este tipo incluye típicamente administrar una partícula de virus tal como se describe en el presente documento a un sujeto que necesita transferencia de genes o vacunación, en donde la partícula de virus presenta aproximadamente la misma o una menor seroprevalencia que una partícula de virus AAV9. En algunas realizaciones, una partícula de virus de este tipo se neutraliza al mismo o en menor grado por el suero humano que es una partícula de virus AAV9.
En otro aspecto, se proporciona un método para vacunar un sujeto. Un método de este tipo incluye típicamente administrar un antígeno diana unido operativamente a un polipéptido de la cápside de AAV tal como se describe en el presente documento a un sujeto que necesita vacunación, en donde el polipéptido de la cápside de AAV presenta aproximadamente la misma o una menor seroprevalencia que un polipéptido de cápside AAV9. En algunas realizaciones, un polipéptido de la cápside de AAV de este tipo se neutraliza al mismo o en menor grado por el suero humano que es un polipéptido de la cápside AAV9.
Por tanto, la presente descripción proporciona virus ancestrales o porciones de los mismos que presentan una susceptibilidad reducida a la inmunidad preexistente en las poblaciones de humanos actuales que los virus actuales o porciones de los mismos. Generalmente, la susceptibilidad reducida a la inmunidad preexistente presentada por los virus ancestral o porciones de las mismas en las poblaciones humanas de días actuales se refleja como una susceptibilidad reducida a los anticuerpos neutralizantes.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenecen los métodos y composiciones de la materia.
Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Descripción de los dibujos
La figura 1 es un esquema que muestra las relaciones entre infecciones víricas ancestrales/contemporáneas y respuesta inmunitaria del huésped ancestral/contemporánea.
Las figuras 2A a 2D son una serie de esquemas que muestran un ejemplo de un procedimiento de reconstrucción ancestral. Los datos mostrados se derivan de un conjunto de datos completo y representan los residuos 564-584 (numeración AAV2-VP1).
La figura 3 ilustra un árbol filogenético de secuencias contemporáneas de AAV generadas usando los métodos descritos en el presente documento.
La figura 4 ilustra un alineamiento de polipéptidos VP1 de AAV ancestral.
Las figuras 5A y 5B juntas ilustran una alineación de polipéptidos de VP1 de AAV ancestral funcionales y polipéptidos de VP1 de AAV contemporáneos.
La figura 6 es un gel electroforético que demuestra que las secuencias de VP1 de AAV ancestral se transcriben y se cortan alternativamente de una manera similar a la de las secuencias de VP1 de AAV contemporáneas.
La figura 7 es un gráfico que muestra la actividad de luciferasa en células HEK293 transducidas con vectores de AAV ancestrales.
La figura 8 es un gráfico que muestra la comparación de secuencias (% arriba de la diagonal, n.° de diferencias de aa abajo) entre la biblioteca Anc80 y Anc80L65.
Las figuras 9A-D son imágenes de resultados experimentales que demuestran que Anc80L65 es capaz de ensamblarse y producir partículas de alto título. El panel A muestra que Anc80L65 es capaz de producir rendimientos de vector equivalentes a AAV2; el panel B es una imagen TEM de partículas de virus que incluyen Anc80L65; el panel C muestra que las partículas de virus que incluyen Anc80L65 son capaces de producir proteínas VP1,2 y 3 de cápsula de AAV basadas en gel SDS-PAGE en condiciones de desnaturalización; y el panel D muestra una inmunotransferencia de tipo Western de Anc80L65 usando el anticuerpo de la cápside de AAV, B1.
Las figuras 10A-C son imágenes de resultados experimentales que demuestran que Anc80L65 es capaz de infectar células in vitro en células HEK293 usando GFP como lectura (panel A) o luciferasa (panel B) frente a controles de AAV2 y/o AAV8 y también es eficaz para dirigir el hígado después de una inyección IV de AAV que codifica para un transgén de LacZ nuclear (fila superior, panel C: hígado), tras la inyección IM directa de un AAV que codifica GFP (fila media, panel C: músculo), y tras la inyección subretiniana con AAV que codifica para GFP (fila inferior, panel C: retina).
Las figuras 11A y 11B son matrices de identidad de secuencias producidas usando MAFFT que muestran las secuencias de aminoácidos de las proteínas VP1 de vectores ancestrales alineadas con las de AAV representativos existentes (figura 11A), y las secuencias de aminoácidos de las proteínas VP3 de vectores ancestrales alineadas con las de AAV representativos existentes (figura 11B).
La figura 12 es un gráfico que demuestra que los vectores AAV se produjeron por triplicado en pequeña escala (placas de 6 pocillos). Los virus en bruto se evaluaron mediante qPCR para determinar la producción absoluta de cada vector. La figura 13 es una tabla que muestra los títulos de cada vector, promediado y comparados, a aquellos de AAV8.
La figura 14 son fotografías que muestran los resultados de los experimentos en los que se añadieron 1,9E3 GC/célula de cada vector a células HEK293 (excepto para Anc126, en cuyo caso se lograron MOI de 2,51-3,1E2 GC/célula). Sesenta horas después, se evaluó la infectividad mediante microscopía de fluorescencia.
La figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de los experimentos en los que las mismas células de la figura 14 se lisaron y se sometieron a ensayo para determinar la expresión de luciferasa. Al igual que en la figura 14, Anc126 no se controló por título con los otros vectores, sino que osciló entre una MOI de 2,5E2 - 3,1E2 GC/célula.
La figura 16 es una tabla que muestra la luminiscencia de las células transducidas por cada vector, que se promediaron y compararon con las de AAV8.
La figura 17 es un gráfico que proporciona un resumen de experimentos in vitro para determinar la producción relativa e infectividad de los vectores de AAV ancestral descritos en el presente documento.
La figura 18 es una filogenia y ASR del linaje evolutivo de AAV creado usando filogenia de la probabilidad máxima y 75 aislados diferentes de AAV. Los círculos de color rojo representan intermediarios evolutivos reconstruidos a través de ASR. El círculo azul representa una biblioteca de espacio probabilístico construido alrededor de Anc80. Los subclados se han contraído para mayor claridad. La filogenia completa se presenta en la figura 24.
La figura 19 muestra la secuencia y el análisis estructural de los vectores Anc80. El panel A es una alineación de la estructura de la secuencia de las proteínas VP3 de Anc80 (SEQ ID NO:37), AAV2 (SEQ ID NO:38) y AAV8 (SEQ ID NO:39). Una alineación estructural derivada de las estructuras cristalinas de AAV2 (PDB 1LP3) y AAV8 (Pd B 2QA0) VP3 y la estructura predicha de Anc80L65 VP3, generada con UCSF Chimera (Pettersen y col., 2004, J. Comp. Chem., 25:1605-12) se muestra en impresión negra. La región azul es una alineación no estructural de los dominios VP1NP2 de AAV2, AAV8 y An80 (Notredame y col., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17). Los residuos ambiguos de la biblioteca Anc80 se representan en rojo, correspondiendo la posición inferior a los residuos Anc80L65. Las hebras beta y las hélices alfa se representan en verde y amarillo, respectivamente. Las posiciones de las nueve hebras beta que forman el barril beta antiparalelo de AAV se representan con flechas planas, mientras que la posición de la hélice alfa central conservada se representa con una flecha punteada. Las posiciones aproximadas de las regiones variables (RV) I-IX están representadas por los números romanos encima de la alineación de secuencias. El panel B muestra una matriz de divergencia de secuencias AAV Cap. Por encima de la diagonal, la matriz representa el porcentaje de divergencia de secuencia de los serotipos de AAV seleccionados, así como rh.10, la secuencia de VP1 más homóloga determinada por BLAST. Por debajo de la diagonal, se presenta el número de diferencias de aminoácidos por posición. El panel C muestra la superposición de las estructuras cristalinas de VP3 de AAV2 y AAV8 con la estructura predicha de Anc80L0065 VP3. El código de colores representa la conservación de aminoácidos entre las 3 secuencias alineadas del panel A (rojo: mayor conservación; azul: la conservación más baja). Las regiones variables I-IX y C/M-terminales se indican en negro. Las posiciones aproximadas de los ejes doble, triple y quíntuple están representadas por la elipse, el triángulo y el pentágono negros, respectivamente. El panel D es el mapa estructural de los cambios de aminoácidos en comparación con AAV2 (izquierda) y AAV8 (derecha) en el trímero VP1, visualizando el exterior (arriba) y el interior (abajo) del virión. Los residuos coloreados son divergentes en Anc80. Los residuos coloreados en rojo son ambiguos mediante ASR y, por tanto, dimórficos en Anc80Lib.
La figura 20 muestra los resultados de la caracterización biofísica y bioquímica de Anc80L65. El panel A muestra microscopía electrónica de transmisión (TEM) con tinción negativa de Anc80L65, demostrando que Anc80L65 forma partículas de aproximadamente 20-25 nm de diámetro. El panel B es la composición de VP de Anc80L65. Las preparaciones purificadas de Anc80L65 y de tres virus existentes se analizaron mediante SDS-PAGE. Anc80 muestra niveles similares de incorporación de los monómeros VP1, 2 y 3. El panel C muestra una composición de partículas vacías:llenas de preparaciones de AAV purificadas. Las distribuciones del coeficiente de sedimentación se obtuvieron a partir de los perfiles de sedimentación adquiridos con los sistemas de medición óptica del índice de refracción durante la ultracentrifugación analítica de preparaciones de AAV8 y Anc80L65. El panel D muestra la termoestabilidad del AAV. La medición de la fluorescencia intrínseca de triptófano de las partículas de AAV a diferentes temperaturas ilustra las distintas temperaturas de fusión de los serotipos de AAV en comparación con Anc80L65.
La figura 21 muestra los resultados de la evaluación in vivo de Anc80L65. El panel A, superior, muestra la transducción hepática y la comparación de la expresión del transgén lacZ de AAV-2, AAV-8 y Anc80L65.TBG.nLacZ en el hígado 28 días después de la administración intraperitoneal a una dosis de 7,2 * 1010 GC. El panel A, el panel central, muestra tropismo muscular de AAV2, AAV8 y Anc80L6528 días después de una administración intramuscular a una dosis de 1*1010 GC al muslo trasero-derecho (músculos gemelos/bíceps femoris). El panel A, el panel inferior, muestra una comparación de la expresión del transgén eGFP entre AAV2, AAV8 y Anc80L65 en la retina después de la administración subretiniana a una dosis de 2 * 109 GC. El AAV2 muestra una gran afinidad por las células del RPE, mientras que tanto RPE como los fotorreceptores se seleccionan como diana usando los vectores AAV8 y Anc80L65, mostrando Anc80L65 una mayor eficacia de transducción en comparación con AAV2 y AAV8. El panel B es un análisis cualitativo de la respuesta a la dosis de expresión de eGFP a 1011 (panel superior), 1010 (panel central) y 1009 (panel inferior) GC comparando AAV-8 y Anc80L65 mediante administración intravenosa en el seno retro-orbital. Tanto AAV8 como Anc80L65 muestran una expresión de eGFP comparable a dosis iguales a lo largo de la dosis que varía. El Panel C muestra un análisis cuantitativo de la respuesta a la dosis de AAV que mide los niveles séricos de ratón de la expresión transgénica de la expresión de alfa 1-antitripsina humana (hA1AT) a partir de AAV-8 (símbolos negros: cuadrado-1011 GC, círculo-1010 GC y cuatricuadrado-109 GC) y Anc80L65 (símbolos grises: rombo-1011 GC, cuadrado-1010 GC y triángulo-109 GC). El panel D es un gráfico de la transferencia de genes en hígado de macaco de la India de AAV-8 y Anc80L65 expresando gonadotropina coriónica de macaco de la India (rhCG) tras la inyección en vena safena de una dosis de 1*1012 GC/kg. El ADN genómico se recolectó de los lóbulos hepáticos de macaco y el genoma viral (vg) por genoma diploide (dμg) se midió mediante un ensayo de qPCR. Un animal AAV8 y los tres animales Anc80L65 recibieron con éxito ~1-3 vg por célula diploide del lóbulo hepático caudal, mientras que 2 animales AAV8 probablemente tenían un nivel bajo de NAB, lo que provocó la neutralización del vector y una transferencia limitada del gen hepático. El panel E es un gráfico que muestra la expresión de ARNm transgénico de AAV8 y Anc80L65 en lóbulos hepáticos caudal, derecho, izquierdo y medio de NHP mediante PCR cuantitativa de transcriptasa
inversa (qRT-PCR) específica de sonda TaqMan. La cuantificación de la transcripción de rhCG se normalizó con los niveles de ARNm de GAPDH endógenos.
La figura 22 son resultados de experimentos en los que Anc80L65 se caracterizó inmunológicamente. El panel A es un gráfico que muestra la reactividad cruzada del suero de conejo anti-AAV: el antisuero de conejo producido contra serotipos de AAV (eje Y) se sometió a prueba para NAB a Anc80L65 frente al serotipo homólogo de AAV con el fin de evaluar la seroreactividad cruzada. Los valores (eje X) representan la dilución más pequeña a la que se logra el 50 % de neutralización. La relación filogenética entre serotipos de inmunización se representa a la izquierda. El panel B son tablas que muestran la neutralización cruzada por transferencia de genes in vivo en ratones: los ratones C57B1/6 recibieron una inyección IV de AAV8 o Anc80L65.CASI.EGFP.2A.A1AT 25 días después de una inyección IM con solución salina o AAV8.TBG.nLacZ. 14 días después de las segundas inyecciones, el suero se tituló mediante ELISA para la expresión de hA1AT. Las tablas presentan los niveles relativos de hA1AT de los ratones preinmunizados frente a los no inmunizados para cada vector (% de control), y las diluciones del título NAB para AAV8 (nAb8) y Anc80L65 (NAB80) 24 h antes de la segunda inyección en el grupo inmunizado (n=5). Las flechas grises divergentes de los paneles A y B ilustran esquemáticamente la evolución fenotípica de los linajes AAV2 y AAV8. El panel C es una alineación de secuencias múltiples no estructurales entre las secuencias VP3 de Anc80, Anc126, Anc127 y AAV2 que se generó usando el paquete de alineación T-coffee. La estructura del trímero AAV2 se generó con UCSF Chimera. Los residuos de color azul representan los residuos variables con respecto a Anc80. Los residuos de color naranja representan epítopos T y B definidos previamente en AAV2. Los residuos de color verde son solapamientos entre mutaciones relativas a Anc80L65 y epítopos de células B/T.
La figura 23 muestra que la reconstrucción del linaje de AAV modula la producción, la infectividad y la termoestabilidad. El panel A es un gráfico que muestra la producción de nueve vectores víricos ancestrales y dos existentes que contienen un gen notificador de luciferasa dirigido por un promotor de CMV, según se determinó mediante qPCR. Las barras de error representan la desviación estándar de tres réplicas biológicas. El panel B es un gráfico que muestra que se usaron vectores víricos ancestrales y existentes para transducir células HEK293 a una razón partícula-célula de 1,9 * 103. Las barras de error representan la desviación estándar de tres lotes distintos de vector. *Se añadió Anc126 a razones entre 2,1 * 102 y 3,5 * 102 GC/célula debido al bajo rendimiento del vector. El panel C muestra un ensayo de termoestabilidad sypro-orange que indica las temperaturas de desnaturalización de vectores AAV ancestrales y existentes seleccionados.
La figura 24 muestra la expresión de eGFP después de la inyección intramuscular del vector vírico (véase también la figura 21). Para los experimentos eGFP dirigidos al músculo, los ratones recibieron una sola inyección en los músculos gemelos. Se observó expresión de eGFP en secciones musculares transversales y longitudinales (primera y segunda columnas). La tinción azul marca los núcleos (DAPI). La morfología del músculo no cambió como se observa en secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) (tercera columna).
La figura 25 es una alineación de secuencias múltiples de los polipéptidos VP1 de los aislados de AAV usados en la reconstrucción de la secuencia ancestral (véanse también las figuras 18 y 23 anteriores). AAV2 (SEQ ID NO:31); AAV5 (SEQ ID NO:40); AAV7 (SEQ ID NO:34); And 13 (SEQ ID NO:13); AAV8 (SEQ ID NO:27); Anc83 (SEQ ID NO:7); Anc84 (SEQ ID NO:9); rh10 (SEQ ID NO:41); Anc82 (SEQ ID NO:5); And 10 (SEQ ID NO:42); Anc81 (SEQ ID NO:3); Anc80 (SEQ ID NO:1); Anc126 (SEQ ID NO:15); AAV3 (SEQ ID NO:32); AAV3B (SEQ ID NO:33); Anc127 (SEQ ID NO:17); AAV6 (SEQ ID NO:29); AAV1 (SEQ ID NO:30); AAV9 (SEQ ID NO:28); AAV4 (SEQ ID NO:44); rh32.33 (SEQ ID NO:45).
La figura 26 muestra una filogenia completa y nodos reconstruidos del linaje evolutivo del AAV (véase también la figura 18). La filogenia máxima de la probabilidad relacionó 75 aislados de AAV. Los círculos de color rojo representan intermediarios evolutivos reconstruidos a través de ASR. El círculo de color azul representa una biblioteca de espacio probabilístico incorporado alrededor de Anc80.
La figura 27 es un gráfico que muestra la transducción hepática de luciferasa de Anc80, Anc81, Anc82 y And 10 en comparación con AAV9 después de la administración IV en ratones C57BI/6.
Descripción detallada
La transferencia de genes, o bien para fines experimentales o bien terapéuticos, se basa en un vector o sistema vectorial para transportar información genética en células diana. El vector o sistema de vectores se considera el principal determinante de la eficacia, especificidad, respuesta del huésped, farmacología y longevidad de la reacción de transferencia de genes. Actualmente, la forma más eficiente y efectiva de lograr la transferencia de genes es mediante el uso de vectores o sistemas de vectores basados en virus que se han realizado con replicación defectuosa.
Los estudios de seroprevalencia, sin embargo, indican que proporciones significativas de las poblaciones humanas de todo el mundo han estado preexpuestas (por ejemplo, por infección natural) a un gran número de los virus usados actualmente en la transferencia de genes y, por tanto, albergan inmunidad preexistente. Se sabe que los anticuerpos neutralizantes hacia el vector vírico en estos individuos preexpuestos limitan, a veces significativamente, el grado de transferencia de genes o incluso redirigen el virus lejos de la diana. Véase, por ejemplo, Calcedo et al. (2009, J. Infect. Dis., 199:381-90) y Boutin y col. (2010, Human Gene Ther., 21: 704-12). Por tanto, la presente descripción se basa en el reconocimiento de que los virus ancestrales o partes de los mismos muestran una susceptibilidad reducida a la
inmunidad preexistente (por ejemplo, susceptibilidad reducida a los anticuerpos neutralizantes) en las poblaciones humanas actuales que los virus contemporáneos o porciones de los mismos.
La figura 1 es un esquema que muestra las relaciones entre infecciones víricas ancestrales y contemporáneas y respuesta inmunitaria del huésped ancestral y contemporánea. La figura 1 muestra cómo los AAV de ancestral pueden ser refractarios para la inmunidad preexistente actual. Se presume que un virus contemporáneo existente (Vc) evolucionó a partir de una especie ancestral (Vane), principalmente bajo presiones evolutivas de la inmunidad del huésped a través de mecanismos de escape inmunitario. Cada una de estas especies, Vane y Vc, tiene la capacidad de inducir inmunidad adaptativa, incluida la inmunidad de células B y T (Ianc e Ic, respectivamente). Se planteó la hipótesis, y se confirmó en el presente documento, de que la inmunidad inducida por virus contemporáneos no necesariamente produce reacciones cruzadas con una especie vírica ancestral, que puede ser sustancialmente diferente en cuanto a composición de epítopos que el virus actual.
Esta descripción proporciona métodos para predecir la secuencia de un virus ancestral o una porción del mismo. Una o más de las secuencias de virus ancestral predichas usando los métodos descritos en el presente documento pueden generarse y ensamblarse en una partícula de virus. Tal como se demuestra en el presente documento, las partículas de virus ensambladas a partir de secuencias víricas ancestrales predichas pueden presentar menos, a veces significativamente menos, seroprevalencia que las partículas de virus actualmente actuales. Por tanto, las secuencias de virus ancestral descritas en la presente descripción son adecuadas para su uso en vectores o sistemas de vectores para la transferencia de genes.
Métodos de predicción y síntesis de una secuencia vírica ancestral
Para predecir una secuencia vírica ancestral, en primer lugar se recopilan secuencias de nucleótidos o aminoácidos a partir de una pluralidad de virus contemporáneos o porciones de los mismos. Aunque los métodos descritos en el presente documento se ejemplificaron usando secuencias de la cápside del virus adeno-asociado (AAV), los mismos métodos pueden aplicarse a otras secuencias del AAV (por ejemplo, el genoma completo, secuencias rep, secuencias ITR) o a cualquier otro virus o porción del mismo. Los virus distintos de AAV incluyen, sin limitación, adenovirus (AV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), retrovirus, lentivirus, virus del herpes simple (VHS), sarampión, virus vaccinia, virus de la viruela, virus de la gripe, virus sincicial respiratorio, virus paragripal, virus espumoso, o cualquier otro virus al que la inmunidad preexistente se considera un problema.
Pueden usarse secuencias de tan sólo dos virus contemporáneos o porciones de los mismos; sin embargo, se entiende que es deseable un mayor número de secuencias de virus contemporáneos o porciones de los mismos para incluir la mayor parte posible del paisaje de la diversidad de secuencias de hoy en día, pero también porque un mayor número de secuencias puede aumentar la capacidad de predicción de los algoritmos descritos y usados. Por ejemplo, pueden usarse secuencias de 10 o más virus contemporáneos o porciones de los mismos, secuencias de 50 o más virus contemporáneos o porciones de los mismos, o pueden usarse secuencias de 100 o más virus contemporáneos o porciones de los mismos.
Tales secuencias pueden obtenerse, por ejemplo, de cualquier número de bases de datos públicas incluyendo, sin limitación, GenBank, UniProt, EMBL, International Nucleotide Sequence Database Collaboration (INSDC), o European Nucleotide Archive. Adicional o alternativamente, tales secuencias pueden obtenerse de una base de datos que es específica de un organismo particular (por ejemplo, base de datos del VIH). Las secuencias contemporáneas pueden corresponder a todo el genoma, o puede usarse sólo una porción del genoma como, sin limitación, las secuencias que codifican para uno o más componentes de la cápside viral, la proteína de replicación o las secuencias ITR.
A continuación, las secuencias contemporáneas se alinean mediante un algoritmo de alineación múltiple de secuencias (MSA). La figura 2(a) es un esquema que muestra un alineamiento de secuencias múltiples. Los algoritmos de MSA son bien conocidos en la técnica y, por lo general, están diseñados para aplicarse a conjuntos de datos de diferentes tamaños y diferentes entradas (por ejemplo, ácido nucleico o proteína), y para alinear las secuencias de una manera particular (por ejemplo, programación dinámica, progresiva, heurística) y aplicar diferentes esquemas de puntuación en la alineación (por ejemplo, basados en matrices o en consistencia, por ejemplo, entropía mínima, suma de pares, matriz de similitud, puntuaciones de brecha). Los algoritmos de MSA bien conocidos incluyen, por ejemplo, ClustalW (Thompson y col., 1994, Nuc. Acids Res., 22:4673-90), Kalign (Lassmann y col., 2006, Nuc. Acids Res., 34:W596-99), MAf Ft (Katoh y col., 2005, Nuc. Acids Res., 33:511-8), MUSCLE (Edgar, 2004, BMC Bioinform., 5:113), y T-Coffee (Notredame y col., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17).
Tal como se describe en el presente documento, una de las características principales cuando se selecciona un algoritmo de MSA para su uso en los métodos descritos en el presente documento es la manera en que el algoritmo trata un hueco en la alineación. A los huecos en un alineamiento de secuencias se les puede asignar un valor de penalización que depende o es independiente del tamaño del hueco. En los presentes métodos, se prefiere que el algoritmo de MSA usado en los métodos descritos en el presente documento aplique información filogenética para predecir si un hueco en la alineación es el resultado de una deleción o una inserción en oposición a un tratamiento sesgado y no filogenético de huecos debido, por ejemplo, a inserciones y/o deleciones. Un método adecuado para tratar huecos en alineamientos y análisis evolutivo se describe en Loytynoja y Goldman, 2008, Science, 320:1632-5, y algoritmos disponibles comercialmente que aplican huecos en alineamientos de una manera que es adecuada para
su uso en los métodos descritos en este documento es un kit de alineación probabilística (PRANK; Goldman Group Software; Loytynoja and Goldman, 2005, PNAS USA, 102:10557-62), y variaciones del algoritmo PRANK.
A continuación se aplica un modelo evolutivo a la alineación resultante para obtener una filogenia ancestral predicha (véase la figura 2(b)). Hay varios modelos evolutivos disponibles en la técnica, cada uno de los cuales aplica matrices ligeramente diferentes de tasas de reemplazo para aminoácidos. Sin limitación, los algoritmos para aplicar modelos de evolución incluyen los modelos Dayhoff (por ejemplo, PAM120, PAM160, PAM250; Dayhoff y otros, 1978, en Atlas of Protein Sequence and Structure (ed. Dayhoff), págs. 345-52, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C.), el modelo JTT (Jones y col., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82), el modelo WAG (Whelan y Goldman, 2001, Mol. Biol. Evol., 18:691-9), y los modelos Blosum (por ejemplo, Blosum45, Blosum62, Blosum80; Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS USA, 89:10915-9).
Además, las restricciones que la estructura y la función imponen a un modelo evolutivo pueden modelarse por sí mismas, por ejemplo, considerando que algunas posiciones son invariantes (“ I” ; Reeves, 1992, J. Mol. Evol., 35:17-31), que algunas posiciones experimentan diferentes velocidades de cambio (“ G” ; Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401), y/o que las frecuencias de equilibrio de nucleótidos o aminoácidos son las mismas que las de la alineación (“ F” ; Cao y col., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27).
La idoneidad de uno o más modelos de evolución puede evaluarse mediante el criterio de información de Aikake (AIC; Akaike, 1973, en Second International Symposium on Information Theory, Petrov y Csaki, eds., págs. 267-81, Budapest, Akademiai Kiado), el criterio de información bayesiano (BIC; Schwarz, 1978, Ann. Statist. 6:461-4), o variaciones o combinaciones de las mismas. Además, AIC, BIC, o variaciones o combinaciones de los mismos se pueden usar para evaluar la importancia relativa de incluir uno o más parámetros (por ejemplo, las restricciones comentadas anteriormente) en el modelo evolutivo.
Tal como se explica en la sección Ejemplo a continuación, se puede usar ProTest3 (Darriba y col., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5) para determinar, basándose en el AIC más bajo, que un algoritmo JTT+G+F era el modelo más adecuado para la evolución del AAV. Un experto entendería que el algoritmo JTT+G+F también puede usarse para predecir secuencias víricas ancestrales distintas de los polipéptidos de la cápside del AAV; sin embargo, un experto entendería que, dependiendo del conjunto de datos y de la puntuación de aptitud, un modelo de evolución diferente puede ser más adecuado.
Una vez que se ha seleccionado un modelo de evolución y se determina su aptitud, se puede construir un árbol filogenético de las secuencias de virus o porciones de los mismos. La construcción de árboles filogenéticos es conocida en la técnica y normalmente emplea métodos de máxima verosimilitud tales como los implementados por PhyML (Guindon y Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704)), MOLPHY (Adachi y Hasegawa, 1996, ed. Tokyo Institute of Statistical Mathematics), BioNJ (Gascuel, 1997, Mol. Biol. Evol., 14:685-95), o PHYLIP (Felsenstein, 1973, Systematic Biology, 22:240-9). Un experto entendería que es deseable un equilibrio entre la complejidad computacional y la bondad del ajuste en un modelo de sustituciones de aminoácidos.
Si se desea, se puede evaluar la significación del árbol filogenético. Existen varios métodos estadísticos que se usan habitualmente para evaluar la significación de un modelo, tal como bootstrap, jackknife, validación cruzada, pruebas de permutación o combinaciones o variaciones de los mismos. La significación también puede evaluarse usando, por ejemplo, una prueba aproximada de razón de verosimilitud (aLRT; Anisimova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52)).
En cualquier nodo filogenético de la filogenia (por ejemplo, un nodo filogenético interior), la secuencia puede reconstruirse estimando la probabilidad evolutiva de un determinado nucleótido o residuo de aminoácido en cada posición de la secuencia (figura 2(c)). Un nodo filogénico se refiere a un punto de ramificación evolutivo intermedio dentro de la filogenia ancestral predicha. Tal como se usa en el presente documento, “ probabilidad evolutiva” se refiere a la probabilidad de la presencia de un nucleótido o aminoácido concreto en una posición determinada basada en un modelo evolutivo en contraposición a un modelo que no tiene en cuenta, por ejemplo, un cambio evolutivo en el uso del codón. Los modelos a modo de ejemplo que tienen en cuenta la probabilidad evolutiva de un determinado nucleótido o residuo de aminoácido en una posición concreta pueden estimarse usando, por ejemplo, cualquier número de métodos de máxima verosimilitud incluyendo, sin limitación, el análisis filogenético por máxima verosimilitud (PAML; Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6) o análisis filogenético usando parsimonia (PAUP; Sinauer Assoc., Inc., Sunderland, MA).
Basándose en la probabilidad evolutiva estimada de un residuo de nucleótido o aminoácido particular en cada posición, la secuencia predicha de un virus ancestral o porción del mismo puede ensamblarse para formar una secuencia de ácido nucleico o polipéptido sintético completo o parcial. Si se desea, se puede calcular la probabilidad de que cualquier residuo en un estado dado en un nodo dado a lo largo del nodo, y se pueda identificar cualquier posición a lo largo de la secuencia que tenga una probabilidad posterior calculada bajo un umbral particular (figura 2(d)). De esta manera, se puede generar una secuencia de andamiaje ancestral, que puede incluir variaciones en esas posiciones que tienen una probabilidad por debajo del umbral particular.
Si la secuencia ancestral que se predice usando los métodos en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico, la secuencia entonces puede optimizarse con codones para que pueda traducirse eficazmente en una secuencia de aminoácidos. En la técnica se conocen tablas de uso de codones para diferentes organismos. Opcionalmente, sin embargo, una tabla de uso de codones puede diseñarse basándose en una o más secuencias contemporáneas que tienen homología (por ejemplo, al menos el 90 % de identidad de secuencia) con respecto a la secuencia de andamiaje ancestral, y una secuencia ancestral tal como se describe en el presente documento puede optimizarse con codones para el uso de codones de mamífero (por ejemplo, humano).
Cualquiera o todas las etapas descritas en el presente documento para predecir una secuencia vírica ancestral se pueden realizar o simular en un ordenador (por ejemplo, in silico) usando un procesador o un microprocesador.
Secuencias ancestrales del andamiaje del virus adenoasociado (AAV)
Los métodos descritos en el presente documento se aplicaron al virus adenoasociado (AAV) usando secuencias de cápside contemporáneas (descritas con detalle en los ejemplos a continuación). El AAV se considera ampliamente como un vector de transferencia de genes terapéutico y un vehículo de vacuna genética, pero presenta una alta seroprevalencia en poblaciones humanas. Usando los métodos descritos en el presente documento, se ensambló un árbol filogenético usando secuencias de AAV contemporáneas (véase la figura 3) y se obtuvieron secuencias de andamiaje ancestral predichas en el nodo filogénico designado (tabla 1). Tal como se usa en el presente documento, una secuencia de andamiaje ancestral se refiere a una secuencia que se construye usando los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, usando probabilidades evolutivas y modelado evolutivo) y que no se sabe si ha existido en la naturaleza. Tal como se usa en el presente documento, las secuencias de andamiaje ancestral son diferentes de las secuencias consenso, que típicamente se construyen usando la frecuencia de nucleótidos o residuos de aminoácidos en una posición particular.
Tabla 1.
Las secuencias del polipéptido de andamiaje y del ácido nucleico, así como el conjunto de posibles nucleótidos o residuos en posiciones de probabilidad, se muestran en el listado de secuencias. Por ejemplo, la secuencia de andamiaje del polipéptido Anc80 se muestra en la SEQ ID NO: 1, que está codificada por la secuencia de andamiaje del ácido nucleico Anc80 mostrado en SEQ ID NO: 2. Tal como se muestra en el listado de secuencias, la secuencia de andamiaje de Anc80 contiene 11 posiciones en las que eran probables cualquiera de los dos residuos. Por tanto, la secuencia del andamiaje Anc80 representa 2048 (211) secuencias diferentes. Otras secuencias de andamiaje de los polipéptidos Anc81, Anc82, Anc83, Anc84, Anc94, Anc1 13, Anc126, Anc127 y Anc110 se muestran en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 42; estos polipéptidos están codificados por la secuencia de andamiaje de los ácidos nucleicos Anc81, Anc82, Anc83, Anc84, Anc94, Anc113, Anc126, Anc127 y Anc110, respectivamente, que se muestran en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 43. Para cada secuencia ancestral, se indica el conjunto de nucleótidos o residuos posibles en cada posición de probabilidad.
Para demostrar la eficacia de los métodos descritos en el presente documento para predecir la secuencia ancestral de un virus o parte del mismo, se generó una biblioteca de las 2048 secuencias ancestrales predichas en el nodo AAV Anc80 y, tal como se describe en el presente documento, se demostró que formaban partículas víricas viables que mostraban menos seroprevalencia, en algunos casos, significativamente menos seroprevalencia, que las partículas virales ensambladas con polipéptidos de cápside contemporáneos.
Métodos de fabricación de partículas víricas ancestrales
Después de que se ha obtenido la secuencia ancestral predicha de un virus o porción del mismo, se puede generar la molécula y/o polipéptido(s) de ácido nucleico real. Los métodos para generar una molécula de ácido nucleico o un polipéptido a partir de una secuencia obtenida, por ejemplo, in silico, son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la síntesis química o la clonación recombinante. Los métodos adicionales para generar moléculas o polipéptidos de ácidos nucleicos son conocidos en la técnica y se comentan con más detalle a continuación.
Una vez que se ha producido un polipéptido ancestral, o una vez que se ha generado y expresado una molécula de ácido nucleico ancestral para producir un polipéptido ancestral, el polipéptido ancestral puede ensamblarse en una partícula de virus ancestral usando, por ejemplo, una célula huésped de empaquetamiento. Los componentes de una partícula vírica (por ejemplo, secuencias rep, secuencias cap, secuencias de repetición terminal invertida (ITR)) pueden introducirse, de manera transitoria o estable, en una célula huésped de empaquetamiento usando uno o más vectores según se describe en el presente documento. Uno o más de los componentes de una partícula de virus pueden basarse en una secuencia ancestral predicha tal como se describe en el presente documento, mientras que los componentes restantes pueden basarse en secuencias contemporáneas. En algunos casos, toda la partícula de virus puede basarse en secuencias ancestrales predichas.
Tales partículas de virus ancestrales pueden purificarse usando métodos rutinarios. Tal como se usa en el presente documento, las partículas víricas “ purificadas” se refieren a partículas víricas a las que se les han eliminado los componentes de la mezcla en la que se crearon, como, por ejemplo, componentes víricos (por ejemplo, secuencias rep, secuencias cap), células huésped de empaquetamiento y partículas víricas parcial o incompletamente ensambladas.
Una vez ensambladas, las partículas víricas ancestrales pueden examinarse para comprobar, por ejemplo, su capacidad de replicación; propiedades de transferencia de genes; capacidad de unión al receptor; y/o seroprevalencia en una población (por ejemplo, una población humana). Determinar si una partícula de virus puede replicarse es rutinaria en la técnica y típicamente incluye infectar una célula huésped con una cantidad de partículas de virus y determinar si las partículas de virus aumentan en número a lo largo del tiempo. Determinar si una partícula de virus es capaz de realizar la transferencia de genes también es rutinaria en la técnica y típicamente incluye infectar células huésped con partículas de virus que contienen un transgén (por ejemplo, un transgén detectable tal como un gen indicador, analizado con más detalle a continuación). Tras la infección y la eliminación del virus, se puede evaluar la presencia o ausencia del transgén en las células huésped. Determinar si una partícula de virus se une a su receptor es habitual en la técnica, y tales métodos pueden realizarse in vitro o in vivo.
Determinar la seroprevalencia de una partícula vírica se realiza de forma rutinaria en la técnica y normalmente incluye el uso de un inmunoensayo para determinar la prevalencia de uno o más anticuerpos en muestras (por ejemplo, muestras de sangre) de una población particular de individuos. La seroprevalencia se entiende en la técnica para referirse a la proporción de sujetos en una población que es seropositiva (es decir, se ha expuesto a un patógeno o inmunógeno particular), y se calcula como el número de sujetos en una población que produce un anticuerpo contra un patógeno o inmunógeno particular dividido entre el número total de individuos en la población examinada. Los inmunoensayos son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, una inmunotransferencia por puntos, inmunotransferencia de tipo Western, inmunoensayos enzimáticos (EIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA). Tal como se indica en el presente documento, las partículas víricas ancestrales muestran menos seroprevalencia que las partículas víricas contemporáneas (es decir, partículas víricas ensambladas usando secuencias víricas contemporáneas o porciones de las mismas). Simplemente a modo de ejemplo, véase Xu y col. (2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 196:43.e1-6); Paul y col. (1994, J. Infect. Dis., 169:801-6); Sauerbrei y col. (2011, Eurosurv., 16(44):3); y Sakhria y col. (2013, PLoS Negl. Trop. Dis., 7:e2429), cada uno de los cuales determinó seroprevalencia para un anticuerpo particular en una población dada.
Tal como se describe en el presente documento, las partículas de virus ancestrales se neutralizan en menor medida que las partículas de virus contemporáneas. Están disponibles varios métodos para determinar el grado de anticuerpos neutralizantes en una muestra de suero. Por ejemplo, un ensayo de anticuerpos neutralizantes mide el título en el que una muestra experimental contiene una concentración de anticuerpos que neutraliza la infección en un 50 % o más en comparación con una muestra de control sin anticuerpos. Véase, también, Fisher y col. (1997, Nature Med., 3:306-12) y Manning y col. (1998, Human Gene Ther., 9:477-85).
Con respecto a los polipéptidos de la cápside de AAV ancestral ejemplificados en el presente documento, la seroprevalencia y/o el grado de neutralización se pueden comparar, por ejemplo, con un polipéptido de la cápside de AAV8 o partícula de virus que incluye un polipéptido de la cápside de AAV8, o un polipéptido de la cápside de AAV2 o partícula de virus que incluye un polipéptido de la cápside de AAV2. Se entiende generalmente en la técnica que los polipéptidos de la cápside de AAV8 o las partículas de virus presentan una seroválvula y una neutralización resultante, en la población humana que se considera baja, mientras que el polipéptido de la cápside de AAV2 o las partículas de virus presentan una seroválvula y una neutralización resultante, en la población humana que se considera alta. Obviamente, la seroprevalencia particular dependerá de la población examinada, así como de los métodos inmunológicos usados, pero hay informes que indican que el AAV8 presenta una seroprevalencia de aproximadamente el 22 % hasta aproximadamente el 38 %, mientras que el AAV2 presenta una seroprevalencia de aproximadamente el 43,5 % hasta aproximdamente el 72 %. Véase, por ejemplo, Boutin y col., 2010, “ Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against AAV types 1,2, 5, 6, 8 and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors” , Hum. Gene Ther., 21:704-12. Véase, también, Calcedo y col., 2009, J. Infect. Dis., 199:381-90.
Secuencias nucleicas y polipeptídicas ancestrales predichas del virus adenoasociado (AAV)
Se secuenciaron varios clones diferentes de la biblioteca que codifican para polipéptidos de cápside ancestrales predichos del nodo Anc80, y las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de cápside ancestrales predichos de
AAV representativos se muestran en SEQ ID NO: 19 (Anc80L27); SEQ ID NO: 20 (Anc80L59); SEQ ID NO: 21 (Anc80L60); SEQ ID NO: 22 (Anc80L62); SEQ ID NO: 23 (Anc80L65); SEQ ID NO: 24 (Anc80L33); SEQ ID NO: 25 (Anc80L36); y SEQ ID NO: 26 (Anc80L44). Los expertos en la técnica apreciarán que la secuencia de ácido nucleico que codifica para cada secuencia de aminoácidos puede determinarse fácilmente.
Además de los polipéptidos de la cápside ancestrales predichos que tienen las secuencias mostradas en las SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26, se proporcionan polipéptidos que tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia) con los polipéptidos de cápside ancestrales predichos que tienen las secuencias mostradas en las SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26. De manera similar, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia) con las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de la cápside ancestral.
Al calcular el porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácidos entre las dos secuencias. El número de coincidencias idénticas está dividido entre la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o residuos de aminoácidos alineados) y multiplicado por 100 para llegar a un porcentaje de valor de identidad de secuencia. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una porción de una o ambas secuencias hasta el tamaño de longitud completa de la secuencia más corta. También se apreciará que una sola secuencia puede alinearse con más de otra secuencia y, por tanto, puede tener diferentes valores de identidad de secuencia por ciento en cada región alineada.
La alineación de dos o más secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede realizarse usando el algoritmo descrito por Altschul y col. (1997, Nucleic Acids Res., 25:3389 3402) como se incorpora en programas BLAST (herramienta básica de búsqueda de alineación local), disponibles en ncbi.nlm.nih.gov en Internet. Las búsquedas BLAST pueden realizarse para determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia (ácido nucleico o aminoácido) y cualquier otra secuencia o porción de la misma alineada usando el algoritmo Altschul y col. BLASTN es el programa usado para alinear y comparar la identidad entre secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP es el programa usado para alinear y comparar la identidad entre secuencias de aminoácidos. Cuando se utilizan programas BLAST para calcular el porcentaje de identidad entre una secuencia y otra secuencia, se usan generalmente los parámetros predeterminados de los programas respectivos.
Las alineaciones representativas se muestran en las figuras 4A y 4B y las figuras 5A y 5B. Las figuras 4A y 4B muestran una alineación de polipéptidos de la cápside VP1 de AAV ancestral, designados Anc80L65 (SEQ ID NO: 23), Anc80L27 (SEQ ID NO: 19), Anc80L33 (SEQ ID NO: 24), Anc80L36 (SEQ ID NO: 25), Anc80L44 (SEQ ID NO: 26), Anc80L59 (SEQ ID NO: 20), Anc80L60 (SEQ ID NO: 21) y Anc80L62 (SEQ ID NO: 22). La alineación mostrada en las figuras 4A y 4B confirma la variación predicha en cada uno de los 11 sitios, y una única mutación no sinónima en la posición 609E de Anc80L60 (SEQ ID NO: 21), que puede ser un artefacto de clonación. Las figuras 5A y 5B muestran una alineación entre los polipéptidos ancestrales de la cápside VP1 de AAV (Anc80L65 (SEQ ID NO: 23), Anc80L27 (SEQ ID NO: 19), Anc80L33 (SEQ ID NO: 24), Anc80L36 (SEQ ID NO: 25), Anc80L60 (SEQ ID NO: 21), Anc80L62 (SEQ ID NO: 22), Anc80L44 (SEQ ID NO: 26) y Anc80L59 (SEQ ID NO: 20)) y polipéptidos de cápside VP1 de AAV contemporáneos (AAV8 (SEQ ID NO: 27), AAV9 (SEQ ID NO: 28), AAV6 (SEQ ID NO: 29), AAV1 (SEQ ID NO: 30), AAV2 (SEQ ID NO: 31), AAV3 (SEQ ID NO: 32), AAV3B (SEQ ID NO: 33) y AAV7 (SEQ ID NO: 34)). La alineación en las figuras 5A y 5B muestra que las secuencias ancestrales de AAV tienen entre aproximadamente el 85 % y el 91 % de identidad de secuencia con las secuencias contemporáneas de AAV.
También se proporcionan vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican para polipéptidos. Los vectores, incluyendo los vectores de expresión, están disponibles comercialmente o pueden producirse mediante tecnología recombinante. Un vector que contenga una molécula de ácido nucleico puede tener uno o más elementos para la expresión unidos operablemente a una molécula de ácido nucleico de este tipo, y además puede incluir secuencias tales como las que codifican para un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos), y/o las que pueden usarse en la purificación de un polipéptido (por ejemplo, la etiqueta 6xHis). Los elementos para la expresión incluyen secuencias de ácido nucleico que dirigen y regulan la expresión de secuencias codificantes de ácido nucleico. Un ejemplo de un elemento de expresión es una secuencia promotora. Los elementos de expresión también pueden incluir uno o más intrones, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles que modulan la expresión de una molécula de ácido nucleico. Los elementos de expresión pueden ser de origen bacteriano, de levadura, de insecto, de mamífero o vírico y los vectores pueden contener una combinación de elementos de expresión de diferentes orígenes. Tal como se usa en el presente documento, operativamente unido significa que los elementos para la expresión se colocan en un vector con respecto a una secuencia codificante de tal manera que dirija o regule la expresión de la secuencia codificante.
Una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico en un vector (por ejemplo, un vector de expresión, un vector vírico) puede introducirse en una célula huésped. El término “ célula huésped” se refiere no sólo a la(s) célula(s) concreta(s) en la(s) que se ha introducido la molécula de ácido nucleico, sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Los expertos en la técnica conocen muchas células huésped adecuadas; las células huésped pueden ser células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células de levadura,
células de insecto, células vegetales, células de mamífero). Las células huésped representativas pueden incluir, sin limitación, A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293, Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y células primarias de fibroblastos, hepatocitos y mioblastos derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, monos, ratones, ratas, conejos y hámsters. Los métodos para introducir moléculas de ácido nucleico en las células huésped son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, la precipitación de fosfato de calcio, la electroporación, el choque térmico, la lipofección, la microinyección y la transferencia de ácido nucleico mediada por virus (por ejemplo, la transducción).
Con respecto a los polipéptidos, “ purificado” se refiere a un polipéptido (es decir, un péptido o un polipéptido) que ha sido separado o purificado de los componentes celulares que lo acompañan de manera natural. Típicamente, el polipéptido se considera “ purificado” cuando está al menos en un 70 % (por ejemplo, al menos en un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %) en peso seco, libre de los polipéptidos y moléculas naturales con los que está naturalmente asociado. Dado que un polipéptido sintetizado químicamente está, por naturaleza, separado de los componentes que lo acompañan de manera natural, un polipéptido sintético se considera “ purificado” , pero puede separarse aún más de los componentes usados para sintetizar el polipéptido (por ejemplo, los residuos de aminoácidos). Con respecto a las moléculas de ácido nucleico, “ aislada” se refiere a una molécula de ácido nucleico que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que suelen estar asociadas a ella en el genoma. Además, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico manipulada, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante o sintética.
Los polipéptidos pueden obtenerse (por ejemplo, purificarse) a partir de fuentes naturales (por ejemplo, una muestra biológica) mediante métodos conocidos tales como el intercambio iónico DEAE, la filtración en gel y/o la cromatografía de hidroxiapatita. También puede obtenerse un polipéptido purificado, por ejemplo, expresando una molécula de ácido nucleico en un vector de expresión o mediante síntesis química. El grado de pureza de un polipéptido puede medirse usando cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis por HPLC. De manera similar, las moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse (por ejemplo, aislarse) usando métodos rutinarios tales como, sin limitación, la tecnología de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, digestión con enzimas de restricción y ligamiento) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Además, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden sintetizarse químicamente.
Métodos de uso de virus ancestrales o porciones de los mismos
Un virus ancestral o una porción del mismo tal como se describe en el presente documento, en particular aquellos que presentan una seroprevalencia reducida en relación con los virus contemporáneos o porciones de los mismos, pueden usarse en una serie de aplicaciones de investigación y/o terapéuticas. Por ejemplo, un virus ancestral o una porción del mismo según se describe en el presente documento puede usarse en medicina humana o animal para terapia génica (por ejemplo, en un vector o sistema de vectores para transferencia de genes) o para vacunación (por ejemplo, para presentación de antígenos). Más específicamente, un virus ancestral o una porción del mismo según se describe en el presente documento puede usarse para la adición de genes, el aumento de genes, la administración genética de un polipéptido terapéutico, la vacunación genética, el silenciamiento de genes, la edición del genoma, la terapia génica, la administración de iARN, la administración de ADNc, la administración de ARNm, la administración de miARN, el esponjamiento de miARN, la inmunización genética, la terapia génica optogenética, la transgénesis, la vacunación con a Dn o la inmunización con ADN.
Una célula huésped puede transducirse o infectarse con un virus ancestral o una porción del mismo in vitro (por ejemplo, creciendo en cultivo) o in vivo (por ejemplo, en un sujeto). En el presente documento se describen células huésped que pueden ser transducidas o infectadas con un virus ancestral o una porción del mismo in vitro; las células huésped que pueden transducirse o infectarse con un virus ancestral o una porción del mismo in vivo incluyen, sin limitación, cerebro, hígado, músculo, pulmón, ojo (por ejemplo, retina, epitelio pigmentario de la retina), riñón, corazón, gónadas (por ejemplo, testículos, útero, ovarios), piel, fosas nasales, sistema digestivo, páncreas, células de los islotes, neuronas, linfocitos, αdo (por ejemplo, αdo interno), folículos pilosos y/o glándulas (por ejemplo, tiroides).
Un virus ancestral o una porción del mismo, tal como se describe en el presente documento, puede modificarse para incluir un transgén (en cis o trans con otras secuencias víricas). Un transgén puede ser, por ejemplo, un gen informador (por ejemplo, beta-lactamasa, beta-galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina cinasa, polipéptido verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), o luciferasa, o polipéptidos de fusión que incluyen un dominio de etiqueta de antígeno como hemaglutinina o Myc) o un gen terapéutico (por ejemplo, genes que codifican para hormonas o sus receptores, factores de crecimiento o sus receptores, factores de diferenciación o sus receptores, reguladores del sistema inmunitario (por ejemplo, citocinas e interleucinas) o sus receptores, enzimas, ARN (por ejemplo, ARN inhibitorios o ARN catalíticos), o antígenos diana (por ejemplo, antígenos oncogénicos, antígenos autoinmunitarios)).
El transgén particular dependerá, al menos en parte, de la enfermedad o deficiencia particular que se esté tratando. Simplemente a modo de ejemplo, la transferencia de genes o la terapia génica pueden aplicarse al tratamiento de la hemofilia, la retinosis pigmentaria, la fibrosis quística, la amaurosis congénita de Leber, los trastornos por almacenamiento lisosómico, los errores congénitos del metabolismo (por ejemplo, errores congénitos del metabolismo de los aminoácidos, incluida la fenilcetonuria, errores congénitos del metabolismo de los ácidos orgánicos, incluida la academia propiónica,
errores congénitos del metabolismo de los ácidos grasos, incluida la deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCAD)), cáncer, acromatopsia, distrofias de conos y bastones, degeneraciones maculares (por ejemplo, degeneración macular asociada a la edad), deficiencia de lipopolipéptido lipasa, hipercolesterolemia familiar, atrofia muscular espinal, distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, obesidad, trastorno inflamatorio intestinal, diabetes, insuficiencia cardíaca congestiva, hipercolesterolemia, pérdida de audición, cardiopatía coronaria, amiloidosis renal familiar, síndrome de Marfan, insomnio familiar fatal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, anemia falciforme, enfermedad de Huntington, degeneración lobar frontotemporal, síndrome de Usher, intolerancia a la lactosa, trastornos por almacenamiento de lípidos (por ejemplo, enfermedad de Niemann-Pick, tipo C), enfermedad de Batten, coroideremia, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo II (enfermedad de Pompe), ataxia telangiectasia (síndrome de Louis-Bar), hipotiroidismo congénito, inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y/o esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
Un transgén también puede ser, por ejemplo, un inmunógeno útil para inmunizar a un sujeto (por ejemplo, un ser humano, un animal (por ejemplo, un animal de compañía, un animal de granja, un animal en peligro de extinción). Por ejemplo, los inmunógenos pueden obtenerse de un organismo (por ejemplo, un organismo patógeno) o de una porción o componente inmunogénico del mismo (por ejemplo, un polipéptido de toxina o un subproducto del mismo). A modo de ejemplo, los organismos patógenos de los que pueden obtenerse polipéptidos inmunogénicos incluyen virus (por ejemplo, picornavirus, enterovirus, ortomixovirus, reovirus, retrovirus), procariotas (por ejemplo, neumococos, estafilococos, Listeria, Pseudomonas) y eucariotas (por ejemplo, amebiasis, malaria, leishmaniasis, nematodos). Se entenderá que los métodos descritos en el presente documento y las composiciones producidas por dichos métodos no están limitados por ningún transgén en particular.
Un virus ancestral o una porción del mismo, generalmente suspendido en un portador fisiológicamente compatible, puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un mamífero humano o no humano). Los portadores adecuados incluyen solución salina, que puede formularse con una variedad de disoluciones tamponadoras (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina y agua. El virus ancestral o una porción del mismo se administra en cantidades suficientes para transducir o infectar las células y proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, la administración directa a un órgano tal como, por ejemplo, el hígado o el pulmón, por vía oral, intranasal, intratraqueal, por inhalación, intravenosa, intramuscular, intraocular, subcutánea, intradérmica, transmucosa o por otras vías de administración. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea.
La dosis del virus ancestral o porción del mismo administrada a un sujeto dependerá principalmente de factores tales como la afección que se está tratando y la edad, peso y salud del sujeto. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente eficaz de un virus ancestral o de una porción del mismo que va a administrarse a un sujeto humano generalmente se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml de una disolución que contiene concentraciones de aproximadamente 1 * 101 a 1 * 1012 copias genómicas (GC) de virus ancestrales (por ejemplo, de aproximadamente 1 * 103 a 1 * 109 GC). La transducción y/o expresión de un transgén puede monitorizarse en diversos puntos de tiempo después de la administración por ensayos de ADN, ARN o proteínas. En algunos casos, los niveles de expresión del transgén pueden monitorizarse para determinar la frecuencia y/o cantidad de dosificación. Los regímenes de dosificación similares a los descritos con fines terapéuticos también se pueden utilizar para la inmunización.
Los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para modelar la evolución directa, para modificar o extirpar uno o más dominios inmunógenos de un virus o porción del mismo.
Según la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bioquímica y ADN recombinante dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de los métodos y composiciones de materia descritos en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1-Predicción computacional de secuencias ancestrales
Se obtuvo un conjunto de 75 secuencias de aminoácidos diferentes de cápsides de AAV de varias bases de datos públicas, incluido GenBank, y las secuencias se alinearon usando el algoritmo PRANK-MSA, versión 121002, con la opción “ -F” .
ProtTest3 (véase, por ejemplo, Darriba y col., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5; disponible en darwin.uvigo.es/software/prottest3 en Internet) se usó para evaluar diferentes modelos de evolución de polipéptidos (por ejemplo, los incluidos en ProT3, concretamente, JTT, LG, WAG, VT, CpRev, RtRev, Dayhoff, DCMut, FLU, Blosum62, VT, HlVb, MtArt, MtMam) en diferentes condiciones (por ejemplo, las incluidas en ProTest3, concretamente, “ 1” , “ F” , “ G” , y sus combinaciones). El modelo JTT (Jones y col., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82) con G y F (Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401; y Cao y col., 1994, J. Mol. Evol., 39:51 9-27)
se seleccionó basándose en su criterio de información Aikake (AIC; Hirotugu, 1974, IEEE Transactions on Automatic Control, 19:716-23) puntuación tal como se implementa en ProTest3.
Se construyó una filogenia de la evolución de AAV usando PhyML (Guindon y Gascuel, 2003, systemic Biology, 52:69 6-704). Véase la figura 3. El árbol se generó usando el modelo de sustitución JTT F con 4 categorías discretas de sustitución y un parámetro de forma Gamma estimado. Los árboles resultantes se mejoraron mediante el intercambio de vecinos más próximos (NNI) y la poda de subárboles e injertos (SPR), y se evaluó su significación mediante bootstrap y la prueba aproximada de la razón de verosimilitud (aLRT); Anisimova y Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52)) usando la variante “ SH-Like” .
A continuación, se usó el árbol filogénico construido anteriormente para estimar los estados ancestrales de la cápside del AAV en cada nodo interior de la filogenia. Las secuencias ancestrales de la cápside se reconstruyeron usando los principios de máxima verosimilitud mediante el programa informático Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood (PAML) (Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6; disponible en abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html en Internet) envuelto en Lazarus (Sourceforge en sf.net). Más específicamente, la reconstrucción Lazarus/PAML se configuró para generar una reconstrucción de aminoácidos usando el modelo de sustitución JTT+F con 4 categorías distribuidas gamma. AAV5 se usó como grupo externo. Por último, se añadió la opción “ I” para colocar los indels (es decir, codificados binariamente y colocados mediante máxima parsimonia usando el algoritmo de Fitch) una vez realizada la reconstrucción PAML.
Dado que la reconstrucción se ha realizado según el método de máxima verosimilitud, se puede calcular la probabilidad de que cualquier residuo se encuentre en una posición determinada en un nodo concreto. Para hacer esto, se escribió una secuencia de comandos adicional para identificar todas las posiciones a lo largo de la secuencia con una probabilidad posterior calculada bajo un cierto umbral. Se seleccionó un umbral de 0,3, lo que significa que se incluyó cualquier aminoácido con una probabilidad posterior calculada superior a 0,3 en la síntesis de la biblioteca. Estos residuos se seleccionaron como variantes de interés en la biblioteca.
Para finalizar la secuencia, una utilidad adicional tenía que codificarse para seleccionar codones. Se escribió una secuencia de comandos para derivar codones similares a los de otra secuencia de AAV (AVVRh10, que tiene aproximadamente el 92 % de identidad de secuencia con la secuencia de andamiaje Anc80) y aplicar un algoritmo novedoso para sustituir codones donde hubo emparejamientos erróneos de secuencia basándose en una matriz de sustitución de codones. El algoritmo novedoso se muestra a continuación:
Given: secuencia de aminoácidos, Pt, con la secuencia de nucleótidos correspondiente, Nt, donde Nt códigos para Pt; y la secuencia de la proteína, Pi, donde Pi presenta una fuerte homología con Pt.
Alinear Pi con Pt mediante Needleman-Wunsch usando la tabla Blosum62 para la puntuación. Generar una nueva secuencia de nucleótidos, Ni, recorriendo la alineación de proteínas, usando el codón correspondiente de Nt,
donde el aminoácido en Pt coincide exactamente con el de Pi,
el codón de “ mejor puntuación” de la matriz Codon-PAM (Schneider y col., 2005, BMC Bioinform., 6:134) en el que hay una sustitución,
un hueco en el que existe un hueco en Pi alineado contra un aminoácido en Pt, y
el nucleótido más frecuente en el Nt (que codifica para un aminoácido dado) donde existe un aminoácido en Pi alineado contra un hueco en Pt.
Además, se introdujeron dos cambios de nucleótido único para suprimir la transcripción de la proteína activadora del ensamblaje (AAP), que se codifica fuera de marco dentro del gen de la cápside del AAV en el AAV de tipo natural. Dado que la codificación de AAP (contemporánea o ancestral) no era una parte de esta reconstrucción, se extirpó la expresión de AAP haciendo una mutación sinónima en la secuencia cap, y se proporcionó la secuencia de AAP en trans durante la producción vírica.
Ejemplo 2-Expresión de secuencias VP1 de AAV ancestrales
Se realizaron experimentos para determinar si las secuencias ancestrales de cápside de AAV predichas pueden usarse para fabricar vectores virales.
Se clonaron varias de las secuencias de la cápside de AAV ancestral predichas. La biblioteca de cápsides ancestrales se transfirió a un plásmido de expresión rep-cap para permitir la formación de partículas víricas en transfección transitoria. Para mantener los niveles de expresión y el corte y empalme adecuados de VP1, VP2 y VP3, los genes cap de la biblioteca se clonaron cortando HindIII, situado a 5' de cap en la secuencia codificadora rep, y SpeI, que se diseñó entre el codón de parada de cap y la señal de poliadenilación. Por consiguiente, para
clonar las cápsides ancestrales en un constructo “ REP/CAP” más convencional, el plásmido de paso se digirió con HindlII y SpeI, se purificó en gel y se ligó a un plásmido rep/cap digerido de manera similar.
Los polipéptidos expresados se resolvieron en un gel de SDS al 10 %. Tal como se muestra en la figura 6, los polipéptidos de la cápside se expresaron y se cortaron y empalmaron adecuadamente en VP1, VP2 y VP3 a partir de varias secuencias ancestrales de AAV (Anc80L44, Anc80L27 y Anc80L65), así como a partir de una secuencia contemporánea de AAV, AAV2/8.
Ejemplo 3 - Valoración vírica
Se produjo AAV en células HEK293 mediante cotransfección transitoria de plásmidos que codifican para todos los elementos requeridos para el ensamblaje de partículas víricas. Brevemente, las células HEK293 se cultivaron hasta una confluencia del 90 % y se transfectaron con (a) el plásmido del genoma viral que codifica para el transgén de la luciferasa (expresado por el promotor CMV) flanqueado por ITR AAV2, (b) el plásmido de empaquetamiento AAV que codifica para AAV2 rep y las proteínas de cápside sintetizadas descritas en el presente documento, (c) la cápside que expresa AAV2-AAP, y (d) los genes ayudantes adenovirales necesarios para el empaquetamiento y ensamblaje AAV. Las células se incubaron a 37 °C durante 2 días y se recogieron las células y los medios.
La suspensión del medio celular se lisó mediante 3 ciclos consecutivos de congelación-descongelación. A continuación, el lisado se limpió por centrifugación y se trató con una enzima en condiciones de realizar una digestión exhaustiva del ADN, en este caso Benzonase™, para digerir cualquier ADN presente fuera de la partícula vírica. La preparación de AAV se diluyó para que quedara dentro del intervalo de medición lineal de un molde de ADN de control, en este caso plásmido linealizado con idéntica secuencia de unión del cebador TaqMan™ y la sonda en comparación con el genoma del vector. Se realizó PCR TaqMan™ con cebadores y sonda de recocido para el genoma del vector vírico elegido. El título se calculó sobre la base de la medición TaqMan™ en copias del genoma (GC) por mililitro (ml), tal como se muestra en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2
Los resultados de la producción de vectores a pequeña escala con partículas de cápside de AAV reconstruidas ancestralmente demostraron rendimientos similares a los de AAV2, pero reducidos en relación con AAV8, ambas preparaciones de vectores basadas en AAV contemporáneos.
Ejemplo 4- Transducción vírica in vitro
Se realizaron transducciones virales in vitro para evaluar la capacidad de los virus que contenían las secuencias AAV ancestrales predichas para infectar células.
Tras la producción de vectores de alto rendimiento usando la biblioteca de secuencias Anc80, se transdujeron células HEK293 con cada vector viral. Además de una secuencia Anc80, cada vector viral contenía un transgén de luciferasa. La luciferasa se midió mediante la cuantificación de la bioluminiscencia en un lector de placas de 96 pocillos tras la adición de sustrato de luciferina a las células transducidas o al lisado celular. Tras la cuantificación, se elaboró un mapa de calor de la expresión de la luciferasa en cuatro placas de 96 pocillos concatenadas (excluyendo una columna de controles en cada placa). Debido al gran número de inserciones, supresiones y transiciones asociadas al proceso de producción de vectores de alto rendimiento, muchos de los vectores no eran funcionales. A efectos del presente documento, sólo se evaluaron los virus que eran funcionales en este ensayo (es decir, capaces de transducir células HEK293 y expresar el transgén).
Se transdujeron células HEK293, a igual multiplicidad de infección (MOI) de 1 * 104 copias del genoma (GC) por célula, con dos vectores AAV contemporáneos (AAV2/2 y AAV2/8) y tres vectores AAV ancestrales predichos (Anc80L27, Anc80L44 y Anc80L65). Cada vector contenía un transgén que codificaba para luciferasa o un transgén que codificaba para eGFP. Las células se visualizaron 60 horas después usando el canal GFP de un microscopio óptico AMG EvosFl. La Figura 7 muestra la expresión de luciferasa después de la transducción in vitro. Cada uno de los virus AAV ancestrales demostró una transducción eficiente de las células HEK293.
Ejemplo 5-Transducción retiniana in vivo
Se realizaron transducciones retinianas para determinar si los vectores de AAV ancestral pueden dirigirse o no a células retinianas murinas in vivo.
Se transdujeron ojos murinos con 2 * 108 copias genómicas (GC) de tres AAV ancestrales diferentes (Anc80L27, Anc80L44 y Anc80L65) y un AAV contemporáneo (AAV2/8), todos los cuales incluían un transgén codificador de eGFP. Para las transducciones, cada vector de AAV se administró quirúrgicamente por debajo de la retina generando un espacio entre la capa de fotorreceptores y la de epitelio pigmentario de la retina mediante la administración de un bolo de vector con un dispositivo de inyección. El bolo vectorial se dejó en el espacio subretiniano y el desprendimiento subretiniano se resolvió con el tiempo. La expresión de GFP se monitorizó de manera no invasiva mediante fotografía de fondo de la retina del animal después de la dilatación de la pupila con Tropicamide™. Todas las retinas presentadas demostraron diversos grados de éxito en la orientación de los AAV ancestrales a la retina.
También se realizó la histología de la retina y se visualizó con microscopía fluorescente para identificar el tipo o tipos de células transducidas. Se realizó histología en una retina murina transducida con el vector AAV ancestral Anc80L65 tal como se describió anteriormente. La expresión de eGFP mediada por Anc80L65 fue evidente en la capa nuclear externa (ONL), los segmentos internos (IS) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE), lo que indica que el vector ancestral Anc80L65 se dirige a los fotorreceptores murinos y a las células epiteliales pigmentarias de la retina.
Ejemplo 6-Ensayo de anticuerpos neutralizantes
Se realizan ensayos de anticuerpos neutralizantes para evaluar si un virus AAV ancestral es o no más resistente a la neutralización de anticuerpos que un virus AAV contemporáneo. Los ensayos de anticuerpos neutralizantes miden la concentración de anticuerpos (o el título al que una muestra experimental contiene una concentración de anticuerpos) que neutraliza una infección en un 50 % o más en comparación con un control en ausencia del anticuerpo.
Las muestras de suero o la disolución madre de IGIV (200 mg/ml) se diluyen en serie al doble, y las muestras diluidas y sin diluir se coincuban con un virus AAV ancestral, Anc80L65, y un virus AAV contemporáneo, AAV2/8, a una MOI de 104 durante aproximadamente 30 minutos a 37 °C. Cada virus incluye un transgén de luciferasa. El vector mezclado y una muestra de anticuerpo luego se transducen en células HEK293. Para estos experimentos, la muestra de anticuerpos usada es la inmunoglobulina intravenosa (IVIG), IgG agrupadas extraídas del plasma de más de mil donantes de sangre (vendidas comercialmente, por ejemplo, como Gammagard™ (Baxter Healthcare; Deerfield, IL) o Gamunex™ (Grifols; Los Angeles, CA). 48 horas después del inicio de la transducción, las células se analizan mediante bioluminiscencia para detectar la luciferasa. El título de anticuerpos neutralizantes se determina identificando la dilución de la muestra para la que se alcanza el 50 % o más de neutralización (transducción de la muestra/transducción del virus de control en ausencia de la muestra).
Ejemplo 7-Caracterización de Anc80
Basándose en los métodos descritos en el presente documento, se obtuvo la secuencia más probable de Anc80 (determinada mediante probabilidad posterior) y se designó Anc80L1 (SEQ ID NO:35 muestra la secuencia de ácido nucleico de la cápside de Anc80L1 y SEQ ID NO:36 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido VP1 de Anc80L1). La biblioteca probabilística Anc80 también fue sintetizada usando las secuencias descritas en el presente documento por una empresa comercial y subclonada en vectores de expresión.
La biblioteca Anc80 se evaluó clonalmente para determinar el rendimiento del vector y la infectividad en ensayos combinados. De esta selección, se caracterizaron adicionalmente Anc80L65 (SEQ ID NO:23), así como varias otras variantes.
La biblioteca Anc80 y Anc80L65 se compararon en cuanto a diferencia de secuencia (figura 8; % arriba de la diagonal, n.° de diferencias de aminoácidos a continuación). Usando NCBI-BLAST, la secuencia públicamente disponible más cercana a Anc80L65 es rh10 (n.° de registro de GenBank AAO88201.1).
La figura 9 muestra que Anc80L65 produjo rendimientos de vectores equivalentes a AAV2 (panel A), generó partículas de virus bajo electroscopia de transmisión (TEM) (panel B), y produjo bioquímicamente la cápside de AAV y las proteínas VP1,2 y 3 basándose en la página SDS bajo condiciones desnaturalizantes (panel C) e inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo de la cápside de AAV, B1 (panel D). Estos experimentos se describen con más detalle en los siguientes párrafos.
Brevemente, se produjeron a pequeña escala vectores AAV2/8, AAV2/2, AAV2/Anc80L27, AAV2/Anc80L44 y AAV2/Anc80L65 que contenían un constructo informador compuesto por eGFP y luciferasa de luciérnaga bajo un promotor de CMV. Los títulos de estas preparaciones a pequeña escala de virus se obtuvieron a continuación mediante qPCR. Basándose en estos experimentos, se observó que los vectores Anc80L27, Anc80L44 y Anc80L65 producían niveles virales comparables a los de AAV2 (figura 9A).
Para confirmar que las proteínas de la cápside de Anc80L65 se ensamblaban en partículas víricas intactas del tamaño y la conformación adecuados, se obtuvieron micrografías mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Una preparación purificada a gran escala de Anc80-L065 se cargó en rejillas de cobre recubiertas de formvar y se tiñó con acetato de uranilo. Las micrografías revelaron partículas hexagonales intactas con diámetros entre 20 y 25 nm (figura 9B).
Para determinar si los genes ancestrales sintéticos de la cápside se procesaron correctamente (es decir, se cortaron y empalmaron y se expresaron), se cargaron preparaciones purificadas a gran escala de los vectores AAV2/8, AAV2/2 y AAV2/Anc80L65 en un gel SDS-PAGE (1E10 GC/pocillo) en condiciones desnaturalizantes. Las bandas que representaban las proteínas de la cápside viral VP1, VP2 y VP3 estaban claramente presentes en cada preparación de vector (figura 9C). La inmunotransferencia de tipo Western con el anticuerpo de la cápside de AAV B1 confirmó adicionalmente que estas bandas representaron las proteínas predichas (figura 9D).
Además, la figura 10 muestra que Anc80L65 infectó tejidos y células de mamíferos in vitro en células HEK293 a MOI 10E4 GC/célula usando GFP como lectura (panel A) o luciferasa (panel B) frente a los controles AAV2 y/o AAV8. Anc80L65 también fue eficaz en la selección del hígado tras una inyección IV del AAV indicado que codifica para un transgén LacZ nuclear (fila superior, panel C), tras una inyección intramuscular (IM) directa del AAV indicado que codifica para GFP (fila central, panel C) y tras una inyección subretiniana con el AAV indicado que codifica para GFP (fila inferior, panel C). Estos experimentos se describen con más detalle en los siguientes párrafos.
Para obtener una medida relativa de la infectividad de los viriones ancestrales, se usaron preparaciones en bruto de AAV2/2, AAV2/8, AAV2/Anc80L65, AAV2/Anc80L44, AAV2/Anc80L27, AAV2/Anc80L121, AAV2/Anc80L122, AAV2/Anc80L123, AAV2/Anc80L124 y AAV2/Anc80L125 que contienen un constructo reportero bicistrónico que incluye secuencias de eGFP y luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor de CMV. Las placas de 96 pocillos confluentes con células HEK293 después se sometieron a transducción con cada vector a una MOI de GC/célula 1E4 (títulos obtenidos mediante qPCR como anteriormente). 48 horas después, la microscopía fluorescente confirmó la presencia de GFP en células transducidas (figura 10A). Después, las células se analizaron para determinar la presencia de luciferasa (figura 10B), lo que determinó que la expresión de luciferasa en células transducidas con vectores derivados de Anc80 estaba entre la de las células transducidas con AAV8 (menor nivel de transducción) y AAV2 (mayor nivel de transducción).
Para evaluar la eficiencia relativa de la transferencia de genes en un contexto in vivo, se obtuvieron preparaciones purificadas de alto título de AAV2/2, AAV2/8 y AAV2/Anc80L65. Se inyectaron 3,9E10 GC de cada vector, que encapsulaban un transgén que codificaba para LacZ nuclear bajo el control de un promotor TBG, en ratones C57BL/6 (3 ratones por condición) mediante inyección IP tras anestesia general. 28 días después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos. Los hígados se seccionaron mediante técnicas histológicas convencionales y se tiñeron para la beta-galactosidasa. A continuación, las secciones se visualizaron al micros y en la figura 10C, fila superior, se muestran imágenes representativas.
A continuación, se obtuvieron vectores de los mismos serotipos que contenían un transgén bicistrónico que codificaba eGFP y hA1AT bajo el control de un promotor pCASI. Para evaluar la capacidad de Anc80L65 de transducir el músculo esquelético murino, se inyectó 1E10 GC de cada vector en el músculo esquelético de ratones C57BL/6 (5 ratones por condición) tras anestesia general. 28 días después de la inyección, se sacrificaron los ratones, se crioseccionaron los tejidos y se evaluó la presencia de eGFP mediante microscopía confocal fluorescente (azul es DAPI, verde es eGFP). En la figura 10C, fila central, se muestran imágenes representativas. Estos experimentos demostraron que los vectores Anc80L65 eran capaces de transducir el músculo esquelético murino mediante inyección intramuscular.
Se obtuvieron vectores de los mismos serotipos, esta vez encapsulando constructos que codificaban únicamente para un transgén eGFP bajo el control de un promotor de CMV. Las partículas 2E9 se inyectaron subretinalmente en ratones C57BL/6 después de la anestesia general. 28 días después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se recogieron los ojos, se crioseccionaron y se evaluó la presencia de eGFP mediante microscopía confocal fluorescente (azul es DAPI, verde es eGFP). Las imágenes representativas se muestran en la figura 10C, la fila inferior. Estos experimentos demuestran que los vectores Anc80L65 son capaces de transducir la retina murina a un nivel comparable al de los vectores AAV8.
Brevemente, se obtienen preparaciones purificadas de alto título de vectores virales AAV2/8, AAV2/2, AAV2/rh32.33 y AAV2/Anc80L65 que encapsulan un transgén bicistrónico que incluye eGFP y luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor de c Mv . A continuación, estos vectores se incuban con diluciones seriadas dobles de IGIV (10 mg, 5 mg, 2,5 mg, etc.) o se incuban sin IGIV (1E9 GC por condición). Tras la incubación, los vectores se utilizan para transducir células HEK293 a una MOI de 1E4 por pocillo (una dilución por pocillo). 48 horas después, se evalúan las cantidades relativas de luciferasa mediante un ensayo de luminiscencia.
Ejemplo 8-Generación de cápsides de AAV ancestrales adicionales
Las secuencias ancestrales más probables de la cápside de AAV (determinadas mediante probabilidad posterior) fueron sintetizadas por un laboratorio comercial (Gen9) y suministradas como ADNbc lineal. A continuación, estas secuencias de aminoácidos se compararon con las de los AAV existentes para determinar el grado en que diferían (figura 11). Cada proteína VP1 ancestral difiere de las de AAV existentes representativos seleccionados entre un 3,6 % y un 9,3 % (figura 11A), mientras que las proteínas VP3 ancestrales difieren entre un 4,2 y un 9,4 % (figura
11B). Con un 89 % de identidad de secuencia para VP1, And 10 es el vector ancestral reconstruido más cercano a AAV9, un potente vector transductor del SNC. Cada una de estas cápsides se subclonó en plásmidos de producción de AAV (pAAVector2/Empty) mediante digestión con enzimas de restricción (HindIII y SpeI) y ligamiento T4. Estos clones se confirmaron mediante digestión de restricción y secuenciación de Sanger, y a continuación se produjeron preparaciones a mediana escala de ADN plasmídico.
A continuación, cada uno de estos plásmidos se usó para producir vectores AAV que contenían un gen informador que codificaba tanto la eGFP como la luciferasa de luciérnaga. Estos vectores se produjeron por triplicado en pequeña escala tal como se describió anteriormente. A continuación, se analizaron preparaciones en bruto del virus mediante qPCR y se observó que producían entre un 2,71 % y un 183,1 % de partículas virales en relación con el AAV8 (figuras 12 y 13). Las cifras de producción e infectividad de And 10 son similares a las comunicadas para AAV9. A continuación, estos títulos se usaron para establecer un experimento controlado por títulos con el fin de evaluar la infectividad relativa. No se controló el título de Anc126 debido a su producción significativamente baja y, por consiguiente, los datos relativos a la infectividad de Anc126 no pueden compararse con exactitud con la infectividad de los demás virus del experimento. Los demás vectores se usaron para transducir células HEK293 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1,9E3 GC/célula.
60 horas después de la transducción, se evaluó la expresión de GFP en las células mediante microscopía de fluorescencia. Se detectaron células eGFP positivas en cada una de las condiciones, excepto en el control negativo (figura 14). Esto indica que cada una de las secuencias ancestrales que se predijeron, sintetizaron y clonaron, incluyendo And 10, es capaz de producir partículas víricas viables e infecciosas. Para tener una idea de los niveles relativos de infectividad, también se realizaron ensayos de luciferasa en las mismas células. Los resultados indican que cada uno de los vectores ancestrales es capaz de transducir células HEK293 entre un 28,3 % y un 850,8 % en relación con AAV8 (figuras 15 y 16). Cabe señalar que la eficacia de transducción de And 10 es similar a la notificada para AAV9. Anc126 se excluyó del análisis de la transducción relativa, ya que no se controló el título.
[0097] En resumen, se sintetizaron ocho nuevos genes ancestrales de cápside de AAV y se usaron en la producción de vectores virales funcionales junto con los vectores AAV8, AAV2, Anc110 y el anteriormente descrito Anc80L65. Se evaluaron la producción y la infectividad in vitro y se muestra un resumen de esos hallazgos en la figura 17. La producción y la infectividad in vitro de And 10 se situaron dentro del intervalo que cabría esperar para AAV9 y otros virus capaces de atravesar la barrera hematoencefálica.
Ejemplo 9-Inmunoprofilaxis vectorizada
En la inmunoprofilaxis vectorizada, se usan vehículos de terapia génica (tales como AAV) para administrar transgenes que codifican para anticuerpos ampliamente neutralizantes contra agentes infecciosos. Véase, por ejemplo, Balazs y col. (2013, Nat. Biotechnol., 31:647-52); Limberis y col. (2013, Sci. Transl. Med., 5:187ra72); Balazs y col. (2012, Nature, 481:81-4); y Deal y col. (2014, PNAS USA, 111:12528-32). Una ventaja de este tratamiento es que el huésped produce los anticuerpos en sus propias células, lo que significa que una sola administración tiene el potencial de conferir una protección de por vida contra los agentes etiológicos.
Ejemplo 10-Vehículos de administración de fármacos
LUCENTIS (ranibizumab) y AVASTIN (bevacizumab) son agentes antiangiogénicos basados en los mismos anticuerpos monoclonales de ratón humanizados contra el factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A). Aunque el bevacizumab es un anticuerpo completo y el ranibizumab un fragmento (Fab), ambos actúan en el tratamiento de la degeneración macular húmeda asociada a la edad mediante el mismo mecanismo, antagonizando VEGF. Véase, por ejemplo, Mao y col. (2011, Hum. Gene Ther., 22:1525-35); Xie y col. (2014, Gynecol. Oncol., doi: 10.1016/j.ygyno.2014.07.105); y Watanabe y col. (2010, Gene Ther., 17:1042-51). Dado que ambas moléculas son proteínas, pueden codificarse mediante ADN y producirse en células transducidas con vectores que contengan un transgén, y son lo suficientemente pequeñas como para empaquetarse en vectores de AAV.
Ejemplo 11-Reconstrucción de la secuencia ancestral de las cápsides de AAV
Las secuencias ancestrales de la cápside se reconstruyeron usando métodos de máxima verosimilitud tal como en Finnigan y col. (2012, Nature, 481:360-4). Se generó una alineación de 75 cápsides de AAV (números de registro de GenBank proporcionados en este documento) usando PRANK v.121002 usando la opción -F (Loytynoja & Goldman, 2005, PnAs USA, 102:10557-62; Loytynoja & Goldman, 2008, Science, 320:1632-5) y se determinó que el modelo JTT+F+G era el modelo filogenético de mejor ajuste mediante el Criterio de Información de Aikake implementado en ProtTest3 (Darriba y col., 2011, Bioinform., 27:1164-5). La alineación completa puede verse en la figura 25. A continuación, se usó el modelo de alineación y mejor ajuste para inferir una filogenia a través de PhyML 3.0 (Guindon y col., 2010, System. Biol., 59:307-21), que se evaluó mediante la prueba aproximada de cociente de verosimilitudes (aLRT) (Anismova & Gascuel, 2006, Syst. Biol., 55:539-52) tal como se implementa en PhyML. En la figura 26 se muestra una versión detallada de la filogenia con todos los AAV incluidos en el análisis. A continuación, se dedujeron las secuencias ancestrales de la cápside usando PAML 4.6 (Yang, 2007, Mol. Biol. Evol., 24:1586-91) mediante el paquete Lazarus desarrollado por el grupo Thornton. Tal como se indica en el presente documento, el vector ancestral reconstruido And 10 es evolutivamente próximo a AAV9 y Rh.8, ambos conocidos por ser potentes vectores transductores del SNC.
Para compensar la incertidumbre inherente a la reconstrucción, se escribió una secuencia de comandos para evaluar las probabilidades posteriores calculadas para identificar sitios reconstruidos de manera inequívoca. Se incluyeron todas las posiciones a lo largo de la cápside reconstruida ancestralmente que tuvieran más de un aminoácido con probabilidades posteriores superiores a 0,3. Se identificaron once de estos sitios, cada uno con dos aminoácidos probables. A continuación, estos once sitios dimórficos se incorporaron a una biblioteca de ADN usando los codones de un virus modem (rh. 10). Debido a que la reconstrucción no consideraba la evolución conjunta de AAP y la cápside, la trama de lectura abierta de AAP se sometió a ablación cambiando el codón de inicio de CTG no canónico a CAG durante el diseño de la biblioteca. Además, también se eliminó otra ATG aguas abajo en el ORF de AAP cambiando el codón a AAG. Estas modificaciones no alteraron los aminoácidos en el ORF de la cápside. Después, la biblioteca de ADN se sintetizó mediante DNA2.0 y posteriormente se subclonó en vectores de expresión mediante digestión con enzimas de restricción y ligamiento.
Ejemplo 12-Vectores y secuencias
Los vectores virales adenoasociados se pseudotipificaron con cápsides virales existentes o ancestrales. Las cápsides aisladas incluyen AAV1 (n.° de registro de GenBank AAD27757.1), AAV2 (n.° de registro de GenBank AAC03780,1), AAV5 (n.° de registro de GenBank AAD13756.1), AAV6.2 (n.° de registro de GenBank E368910), Rh.10 (n.° de registro de GenBank AAO88201.1), AAV8 (n.° de registro de GenBank AAN03857.1), AAV9 (n.° de registro de GenBank AAS99264.1) y Rh32.33 (n.° de registro de GenBank EU368926). Las cápsides de AAV ancestrales incluyen Anc80L65, Anc81, Anc82, Anc83, Anc84, And 10, Anc113, Anc126, y Anc127 (presentaciones a GenBank pendientes). Los vectores transgénicos incluían CMV.eGFP.T2A.ffLuciferase.SVPA, CMV.ffLucifease.SVPA.(estudios in vitro), TBG.LacZ.RBG (hígado), TBG.eGFP.WPRE.bGH (estudio de inmunización de hígado y músculo), CASI.hA1AT.FF2A.eGFP.RBG (hígado, músculo), y CMV.eGFP.WPRE (retina).
Ejemplo 13-Análisis de estructura de secuencia
Se generó un modelo pseudoatómico de VP3 de Anc80L65 con el servidor de modelado de homología estructural SWISS-MODEL (Biasini y col., 2014, Nucl. Acids Res., 42:W252-8), usando la estructura cristalina de AAV8 (PDB 2QA0) como molde. Las estructuras de VP3 de AAV2 (PDB 1L3), AAV8 (PDB 2QA0) y Anc80 se superpusieron adicionalmente y se codificaron en color según la conservación del residuo, usando el paquete UCSf Chimera (Pettersen y col., 2004, J. Comp. Chem., 25:1605-12). A continuación se generó una alineación estructural de VP3 de Anc80, AAV2 y AAV8, que se completó con una alineación no estructural de los dominios VP1/2 de estos tres serotipos, generado con el paquete de alineamiento T-coffee (Notredame y col., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17). La distribución espacial de las mutaciones que separan Anc80L65 y AAV8 también se visualizó en la superficie interior y exterior de la estructura del trímero AAV8, donde los residuos variables en la alineación estructural de Anc80L65 y AAV8 VP3 se representaron en azul, y los residuos polimórficos en rojo.
Ejemplo 14-Caracterización in vitro de vectores de linaje ancestral de AAV
Para identificar y caracterizar las cápsides de AAV funcionales dentro del Anc80Lib, se aislaron clones individuales de la biblioteca de ADN subclonada y se usaron para producir vectores que contienen luciferasa en un pocillo de 6 pocillos o 96 pocillos con AAP2 proporcionado en trans. El vector en bruto se aisló filtrando lisado celular a través de un filtro de 0,4 μm después de haber transcurrido 48 horas desde la transfección. A continuación, se añadieron volúmenes iguales de esta preparación en bruto de vectores a placas de 96 pocillos confluentes con células HEK293, cuya actividad luciferasa se evaluó 48 horas más tarde. En total, se evaluaron 776 clones. Se produjeron preparaciones en bruto de vectores que contenían una luciferasa impulsada por CMV mediante transfección triple en un formato de 6 pocillos, complementando AAP en trans a vectores AAV ancestrales. En total, se produjeron tres replicados biológicos independientes diferentes por vector. Los transgenes resistentes a DNAsel se cuantificaron como anteriormente. Estas preparaciones en bruto de virus se evaluaron cada una para determinar su capacidad para transducir células HEK293 en triplicados técnicos a una MOI de 1,9 * 103 GC/célula con la excepción de Anc126, que se añadió a MOI entre 2,1 x 102 y 3,5 * 102 GC/célula. Después de haber transcurrido 48 horas, las células transducidas se evaluaron para determinar la luciferasa mediante un ensayo de luminiscencia.
Ejemplo 15-Preparación del vector de AAV
Las transfecciones a gran escala con polietilenimina (PEI) de AAV cis, AAV trans y plásmido ayudante de adenovirus se realizaron en un hipertablero de 10 capas (Corning) con monocapas casi confluentes de células HEK 293. Los plásmidos se transfectaron a una razón de 2:1:1 (260 μg de plásmido auxiliar de adenovirus/130 μg de plásmido cis/130 μg de plásmido trans). Las transfecciones para la producción de vectores Anc se complementaron con pAAP2 en cantidades equivalentes a las del plásmido AAV cis. La razón PEI Max (Polysciences, Warrington, PA) / ADN se mantuvo en 1,375:1 (p/p). La transfección y el proceso de purificación posterior se realizaron tal como se describió previamente (Lock y col., 2010, Hum. Gene Ther., 21:1259-71). Se usaron copias de genomas de vectores resistentes a DNAseI para valorar las preparaciones de AAV mediante amplificación qPCR TaqMan (Applied Biosystems 7500, Life Technologies) con cebadores y sondas que detectan las regiones codificantes del promotor, el transgén o la señal de poliadenilación del casete transgénico. La pureza de las preparaciones a gran escala se evaluó mediante electroforesis en gel SDS-PAGE.
Ejemplo 16-Caracterización estructural y biofísica del vector
La morfología de las partículas Anc80L65 se evaluó mediante microscopía electrónica de transmisión cargando 5 |jl de una preparación purificada del vector Anc80L65 en rejillas de cobre de 400 mallas recubiertas de formvar y tiñendo con acetato de uranilo. Las razones de partículas vacías / llenas se determinaron mediante ultracentrifugación analítica. Se analizó el contenido de 500 j l de una muestra de Anc80L65 de 10-30 jg/ml, libre de glicerol, usando la ultracentrífuga analítica Beckman Coulter ProteomeLab XL-1 disponible en las instalaciones biofísicas del MIT. El experimento se realizó a 20 °C, 15.000 rpm, usando un rotor de ocho agujeros (50 Ti). Los perfiles de sedimentación se adquirieron en puntos temporales regulares mediante mediciones ópticas del índice de refracción. La ecuación de Lamm se resolvió con el programa SEDFIT (Schuck y col., 2002, Biophys. J., 82:1096-111), y se realizó un análisis de distribución del coeficiente de sedimentación para identificar las diferentes especies contenidas en la muestra de AAV. La estabilidad térmica de Anc80L065 se evaluó mediante espectroscopia de fluorescencia UV y fluorescencia diferencial de barrido (DSF). Para la fluorescencia del triptófano (Ausar y col., 2006, J. Biol. Chem., 281:19478-88) cada serotipo, se prepararon seis alícuotas de 4,5 j l en tubos Eppendorf de 200 jl, se incubaron durante 5 min a 30 °C, 45 °C, 60 °C, 75 °C, 90 °C o 99 °C, se centrifugaron, se enfriaron a temperatura ambiente durante 5 min y se cargaron por duplicado (2 j l cada una) en una placa Take 3TM Micro Volume Plate (Bio-Tek). Las muestras se irradiaron a 293 nm y se adquirieron espectros de emisión de 323 a 400 nm con una resolución de 1 nm, usando un lector de placas híbrido Synergy HI (Bio-Tek). Los espectros de emisión de la muestra y del blanco se suavizaron con un filtro de media móvil (lapso: 15). Después de la sustracción de fondo, se determinó la longitud de onda de emisión máxima para cada serotipo y para cada condición de temperatura. Estos valores de longitud de onda se trazaron posteriormente en función de la temperatura para obtener los perfiles de estabilidad térmica de los diferentes serotipos de AAV. Para la fluorescencia de barrido diferencial (Rayaprolu y col., 2013, J. Virol, 87:13150-60), se suplementaron 25 j l de cada AAV con 5X SYPRO® Orange (Life Technologies), se cargaron en una placa de PCR de 96 pocillos (Denville Scientific Inc.) y se centrifugaron durante 2 min a 2000 rpm, se expusieron a un gradiente de temperatura (30-99 °C, 0,1 °C/6 s) mientras se monitorizaba la fluorescencia del colorante SYPRO® Orange, utilizando una máquina de PCR en tiempo real Reaplex 2S MasterCycler (Eppendorf) (excitación: 450 nm; emisión: 550 nm). En cada ensayo, se usaron 25 j l de FFB (21-031, Corning) y 25 j l de una disolución de lisozima de 0,25 mg/ml (Sigma-Aldrich), ambas suplementadas con 5X SYPRO® Orange, como controles negativo y positivo, respectivamente. También se controló la fluorescencia de 25 j l de vectores AAV en ausencia del colorante para sustraer el fondo de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia se normalizó entre el 0 y el 100 % y se representó gráficamente en función de la temperatura.
Ejemplo 17-Experimentos murinos
Los ratones macho C57BL/6 (6-8 semanas de edad) se adquirieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y se mantuvieron en las instalaciones para animales del Schepens Eye Research Institute (SERI). Todos los procedimientos con animales se realizaron según protocolos aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales del SERI. Para los estudios de transferencia génica dirigida al hígado recibieron 100 j l de inyección intraperitoneal única o una inyección única en la vena del seno retro-orbital en 150 jl. Para los experimentos con eGFP dirigidos al músculo, se inyectaron 50 j l en el músculo gemelo posterior derecho. Se usaron lancetas para animales GoldenRod (MEDIpoint, Inc.) para la hemorragia submandibular del ratón. Para la recogida de suero se usaron tubos con tapón marrón (Micro tube 1,1 ml Z-Gel, Sarstedt). Los estudios de biodistribución del vector se realizaron en tejidos tal como hígado, corazón, riñón, pulmón y bazo de ratones sacrificados a los 28 dpi de la administración del vector. Para visualizar la expresión de eGFP en el hígado, los tejidos se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4 % (PFA), se lavaron en solución salina tamponada con fosfato PBS durante 30 minutos, se incubaron secuencialmente en gradientes de sacarosa al 10 %, 20 % y 30 % y se congelaron en compuesto O.C.T (Sakura Finetek USA, Torrance, CA). La expresión de lacZ en hígado de ratón se midió utilizando el kit de tinción p-Gal (Life Technologies). El tejido hepático fijado con paraformaldehído al 4 % se seccionó a 10 jm . Las secciones de tejido se lavaron con PBS para eliminar el fijador residual y se tiñeron a 37 °C usando disoluciones de tinción comerciales (ferricianuro de potasio 400 mM, ferrocianuro de potasio 400 mM, cloruro de magnesio 200 mM, 95-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido de X-gal) durante 0,5-2 h. Se prepararon criosecciones a 10 jm . Para visualizar la expresión de eGFP en el músculo, los tejidos se montaron en discos de corcho con un 10 % de goma tragacanto (n.° de cat. de Sigma-Aldrich G1128) y congelados rápidamente con nitrógeno líquido -150 c enfriado isopentano (Sigma-Aldrich 27,034-2). Se prepararon criosecciones musculares de 10 jm . Se realizaron inyecciones subretinianas con un volumen de 2 j l y una dosis absoluta por animal de 2 * 109 GC. Cada vector se inyectó en un total de 4 ojos por serotipo analizados. Los animales se sacrificaron a las 4 semanas después de la inyección y se recogieron los ojos para el análisis histológico. Los ojos enucleados se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 1 hora en hielo y, a continuación, se incrustaron en OCT y se congelaron antes de la criosección. Las secciones retinianas se tiñeron con DAPI (1 jg/m l) durante 10 minutos y los portaobjetos se montaron para obtener imágenes confocales.
Ejemplo 18-Modelos de primates no humanos
Los experimentos con macacos de la India se realizaron en New England Primary Research Center (Harvard Medical School). Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Oficina de Protección de Sujetos de Investigación, el Comité Permanente de Animales del Área Médica de Harvard (HMA), el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de Harvard. Los animales fueron sedados con ketamina o telazol en combinación con dexdomitor. Los vectores virales que expresan una rhCG secretada se administraron por vía intravenosa en un volumen de 20 ml a razón de 1 ml / min. Después de recuperarse de la inyección, se controló clínicamente el bienestar general de los animales y se les hizo un seguimiento durante 2
meses. Durante este tiempo, se realizaron flebotomías a intervalos regulares para evaluar la respuesta inmunitaria al AAV y la toxicidad. Después de 70 días, se sacrificaron los monos y se recogieron muestras de hígado.
Ejemplo 19-Cuantificación de alfa1-antitripsina humana (hA1AT)
El nivel de expresión de hAlAT en las muestras de suero se cuantificó mediante ELISA. Las placas se recubrieron con anticuerpo primario anti-A1AT de conejo (Sigma) a 1000 ng/pocillo y se incubaron a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron y se bloquearon durante 2 horas. Las muestras de suero se diluyeron cinco veces y se incubaron a 4 °C durante la noche. Se incubó el anticuerpo anti-A1AT de cabra conjugado con HRP (Abeam) durante 2 horas. Se añadió sustrato de peroxidasa ABTS; los valores de DO405 nm se midieron con un espectrofotómetro lector de placas en 1 hora.
Ejemplo 20-Biodistribución de tejidos
El tejido ultracongelado se digirió con proteinasa K y se extrajo ADN genómico (ADNg) con el kit Blood & Cell Culture DNA Mini (Qiagen), según se indica. El ADNg aislado se cuantificó usando el espectrofotómetro de lectura de placas BioTek (Biotek Instruments, Inc. Winooski, VT). La distribución del genoma viral (vg) en las células diploides se detectó y cuantificó mediante QPCR utilizando sistemas de PCR en tiempo real Applied Biosystems® 7500 con reactivos de mezcla maestra TaqMan ® PCR (Applied Biosystems®) y cebadores/sondas específicos de transgén según lo descrito previamente (Wang y col., 2010, Mol. Ther., 18:11 8-25).
Ejemplo 21-Expresión de ARNm
El ARN total se aisló utilizando Qiagen RNeasy mini kit (Qiagen). El ARN total (1 |jg) se trató con ADNasa y se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa Qiagen QuantiTect (Qiagen). La expresión de ARNm en tiempo real se detectó y cuantificó utilizando sistemas de PCR en tiempo real 7500 de Applied Biosystems® con reactivos de mezcla maestra TaqMan ®PCR con mezclas específicas de reacción cebador/sonda; GAPDH (Rh02621745_g1), gonadotropina coriónica de macaco de la India (Rb02821983_g1). Se aplicaron las condiciones de reacción sugeridas para el cebador / sonda TaqMan personalizado.
Ejemplo 22-Ensayo de anticuerpos neutralizantes
Se evaluaron NAB in vitro tal como se describió anteriormente (Calcedo y col., 2009., 2009, J. Infect. Dis., 199:381-90) con las siguientes modificaciones. El suero de conejos preinmunizados con AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, rh.10 y rh32.33 (obsequio del Dr. Roberto Calcedo y James M. Wilson, UPenn) (Gao y col., 2004, J. Virol., 78:6381-88) se diluyó en serie 1:40 a 1:20.971.520 y se incubó con 109 partículas GC del serotipo correspondiente o Anc80L65 que portan un constructo transgénico CMV.luciferase2.SVPA durante 1 h a 37 °C. Después, la mezcla se añadió a células HEK-293 en una placa de 96 pocillos infectada con MOI (multiplicidad de infección) = 20 de adenovirus humano 5 (hAd5) 24 h antes. Las células se incubaron durante 48 h, después de lo cual se añadió tampón con D-luciferina y se midió la luminiscencia con el lector de microplacas Synergy H1 (BioTek; Winooski, VT). La luminiscencia se normalizó frente a las células de control infectadas con a Av incubadas sin suero. Se determinó un título neutralizante en la dilución en la que la luminiscencia era <50 % en comparación con los pocillos de control.
Ejemplo 23-Reconstrucción in silico de la secuencia ancestral de la proteína de la cápside del AAV
En lugar de intentar aislar una secuencia vírica ancestral intacta a partir del ADN proviral o de muestras arqueológicas, se integraron datos de secuencias contemporáneas de AAV mediante análisis filogenético y ASR de máxima verosimilitud para inferir la secuencia putativa ancestral de aminoácidos del AAV Cap. Un total de 75 secuencias de serotipos de AAV aislados y variantes de anteriores esfuerzos de biominería (Gao y col., 2003, PNAS USA, 100:6081-6; Gao y col., 2004, J. Virol., 78:6381-8; Gao y col., 2005, Current Gene Ther., 5:285-97) condujo a una robusta filogenia AAV Cap generada con PHYML (Guindon y col., 2010, System. Biol., 59:307-21) con AAV5 como valor atípico. En este análisis sólo se incluyeron cápsides de AAV de longitud completa que (a) se encontraban de manera natural en poblaciones de primates, (b) habían demostrado previamente que se ensamblaban e infectaban de manera eficiente, y (c) no se sabía que habían surgido a través de eventos de recombinación en su historia natural, ya que el análisis filogénico tradicional y la a Sr no tienen en cuenta los eventos de evolución horizontal. El dendrograma de la figura 18 modela la trayectoria evolutiva del AAV con la especiación temprana del AAV4, y 5 serotipos, paralelos a un único nodo, denominado Anc80, a partir del cual evolucionaron la mayoría de los AAV contemporáneos conocidos. Estos serotipos incluyen AAV1, 2, 8 y 9, actualmente bajo desarrollo clínico en ensayos de terapia génica. Los nodos en esta filogenia se denominaron Anc y se numeraron secuencialmente. Para validar el enfoque descrito en el presente documento de ASR en AAV, se eligió Anc80 como un nodo para desarrollarse en un virus recombinante para el posible uso como un vector de terapia génica.
Se eligió Anc80 en parte porque la reconstrucción de este nodo se basó en gran medida en la abundancia de descendientes de AAV clínicamente relevantes de este producto intermediario evolutivo. Además, Anc80 está incrustado en la filogenia de los Dependoparvoviridae con AAV de primates dependientes de ayudante conocidos que surgieron antes de la especiación de Anc80 (figura 18), lo que hace más probable que la partícula reconstruida ancestralmente conserve las propiedades básicas compartidas dentro de esta familia. Usando métodos de máxima verosimilitud, se obtuvo una predicción de la secuencia proteica de Anc80 basada en las probabilidades posteriores
calculadas para cada residuo en una posición determinada. Para tener en cuenta la incertidumbre en la selección del aminoácido apropiado en cada posición, el objetivo era generar todas las permutaciones posibles de secuencias para posiciones con probabilidades posteriores de aminoácidos individuales con p>0,3. Una representación de esta biblioteca, Anc80Lib, se ilustra en la figura 19A en una alineación estructural parcial con una secuencia de cápside de referencia de AAV2 y AAV8. En la práctica, esto condujo a un espacio de secuencias probabilístico tal como el que se ilustra en la figura 18: para todas menos 11 de las 736 posiciones de aminoácidos de la cápside Anc80 prevaleció un único residuo en ASR, mientras que para esas 1l posiciones se proporcionaron 2 opciones de aminoácidos, lo que dio como resultado un espacio de secuencias que abarcaba 211=2048 permutaciones.
La alineación estructural y de secuencias de Anc80Lib con los AAV existentes y sus datos de cristalografía de rayos X ponen de manifiesto divergencias significativas con los AAV circulantes actualmente conocidos. El homólogo más cercano determinado mediante la búsqueda BLAST es rh.10, un aislado de macaco de la India dentro del clado E de los Dependoparvoviridae de primates, que difiere de Anc80Lib en un mínimo del 8,0 %, lo que supone 59 posiciones de aminoácidos divergentes (figura 19B). AAV8 y AAV2 difieren en un 9,5 % y un 12,0 %, respectivamente, y esos 70-87 sitios variables están repartidos por toda la proteína VP1, incluidos los dominios VP1, 2 únicos (figura 19A, 19B). La divergencia es mayor en los dominios hipervariables I, IV, VII y VIII, tanto en cuanto a secuencia como en base al modelado estructural de los clones Anc80Lib en superposición con las estructuras monoméricas AAV2 y 8 (figura 19A, 19C). El mapeo de los residuos variables de Anc80 en modelos de cristalografía de rayos X triméricos de AAV2 y AAV8 en la figura 19D destaca que la mayoría de los cambios ocurren en el pico y los flancos de las protuberancias alrededor del eje de simetría de 3 pliegues en la superficie externa del virión. Sin embargo, también se observó un número significativo de residuos variables en los dominios expuestos a la superficie fuera del eje de los 3 pliegues, además de un número menor de variaciones en la superficie interna de la partícula y en regiones de Cap que no se resuelven en las estructuras de rayos X.
Ejemplo 24-Síntesis de Anc80 y caracterización básica
Las secuencias de la proteína Anc80Lib se tradujeron posteriormente a la inversa y se generaron mediante síntesis génica en formato de biblioteca agrupada. Los genes de la cápside se clonaron en un plásmido de empaquetamiento AAV que codifica para AAV2 Rep en pAnc80Lib, tras lo cual la biblioteca se deconvolucionó clonalmente. Los clones individuales (denominados pAnc80LX, siendo X un número consecutivo) se evaluaron de manera aislada para evitar interacciones competitivas potencialmente interferentes en una población de bibliotecas mínimamente divergentes. Una parte de los clones Anc80 individuales se secuenciaron mediante Sanger para verificar su integridad y los requisitos de complejidad. Los plásmidos clonales Anc80 se cotransfectaron con un plásmido auxiliar adenoviral AF6, un constructo de expresión para AAP derivado de AAV2 (AAP2), y un constructo de expresión flanqueado por ITR que codifica luciferasa. Se produjeron un total de 776 clones de bibliotecas y se inocularon a igual volumen de lisado de células productoras en células HEK293 en un ensayo de rendimiento semiautomático destinado a evaluar el ensamblaje combinado de partículas y la eficacia de la transducción. Aproximadamente el 50 % de los clones Anc80 condujo a una señal detectable sobre el fondo en este ensayo de cribado rudimentario. Varios candidatos principales con la señal de luciferasa más alta avanzaron a la confirmación de la secuenciación y la valoración de las partículas genómicas resistentes a la ADNasa (GC) y la infectividad en células HEK293. Basándose en estos resultados, se seleccionó Anc80L65, el clon 65 de Anc80Lib que se evaluó, para su posterior caracterización. Los rendimientos del vector Anc80L65 a partir del lisado celular se sitúan entre el 82 y el 167 % de los rendimientos del AAV2, aunque fueron inferiores a los del AAV8 de alto rendimiento (3-5 % de los rendimientos relativos del AAV8). La infectividad in vitro en HEK293 es inferior a la de AAV2, pero superior a la de AAV8 en términos de partículas por célula.
Las preparaciones del vector Anc80L65 se produjeron y purificaron en un gradiente de iodixanol a escala siguiendo los protocolos tradicionales y se sometieron a diversos análisis bioquímicos, biofísicos y estructurales. Las partículas dentro de una preparación purificada de Anc80L65 se visualizaron bajo tinción negativa por microscopía electrónica (EM) (figura 20A). Los viriones de Anc80L65 se presentan como partículas de forma hexagonal relativamente uniformes con un diámetro de aproximadamente 20-25 nm, no muy diferente de otros capsómeros AAV. Las partículas desnaturalizadas se resolvieron mediante electroforesis SDS en 3 bandas de 60, 72 y 90 kDa, en una razón aproximada de 1:1:10 correspondiente a las proteínas VP 1-3 de las partículas AAV2 y AAV8 (figura 20B). La ultracentrifugación analítica (AUC) permitió determinar el coeficiente de sedimentación del genoma que contenía o contenía Anc80L65 completo en 88,9 S, ligeramente superior al de AAV8 (85,9 S) (figura 20C). Este análisis permitió determinar la abundancia relativa de partículas vacías o ensambladas con menor densidad, presumiblemente carentes de genoma vectorial, así como la pureza global. Una de las preocupaciones era que un modelado inexacto de la secuencia ancestral de la cápside podría haber dado lugar a una estructura deficiente en su capacidad para empaquetar genomas y daría lugar a una razón sesgada de vacío frente a: lleno en las preparaciones de Anc80L65. Los resultados indicaron aproximadamente un 16 % de partículas vacías frente a un 85 % de partículas llenas en la preparación, en línea con las observaciones con AAV8 (figura 20C). Además, se planteó la hipótesis de que la estabilidad de la partícula podría verse reducida debido a un modelado subóptimo de la composición ancestral de la cápside, y se sometió la partícula a ensayos de estabilidad al calor que determinaron, en contra de las expectativas indicadas, que Anc80L65 era 15-30 °C más estable al calor que sus presuntos AAV2 y AAV8 (figura 20D).
Ejemplo 25-Transferencia génica in vivo y transducción de Anc80L65 en modelo murino
A continuación, se evaluó la capacidad de liberación y expresión de los transgenes empaquetados con Anc80L65 a partir de 3 tejidos diana y vías de administración (ROA) clínicamente relevantes en el ratón C57B1/6: (a) hígado tras una inyección sistémica, (b) músculo esquelético tras una inyección intramuscular directa, y (c) una inyección subretiniana para la focalización en la retina externa. Se produjeron preparaciones a gran escala de Anc80L65 junto con controles AAV2 y AAV8 con genes reporteros y se inyectaron a dosis iguales para la transferencia génica dirigida al hígado, el músculo y la retina en ratones C57B1/6 macho adultos. La expresión, presentada en la figura 21, se monitorizó cualitativamente (eGFP y/o LacZ) para los tres tejidos diana y cuantitativamente mediante la medición ELISA en suero de la hAlAT secretada (hígado) en varios puntos temporales. Se observó que la transferencia génica dirigida al hígado era robusta a través de dos vías de administración y transgenes (figura 21A, 21B, 21C). De forma análoga al AAV8, los hepatocitos se dirigieron de forma eficiente, tal como se observó mediante la tinción con LacZ y GFP, superando la permisividad limitada descrita para el AAV2 (Nakai y col., 2005, J. Virol., 79:214-24.); Nakai y col., 2002, J. Virol., 76:11343-9). Cuantitativamente, Anc80 demostró una eficacia de transducción similar a la de AAV8 mediante un reportero intracelular y un producto transgénico de proteína sérica secretada. Los estudios de intervalo de dosis demostraron una linealidad de la transferencia génica con la dosis por encima de 1010 GC/ratón, pero un umbral por debajo del cual la linealidad no se mantuvo para hAlAT (y menos evidente para eGFP) (figura 21B, 21C). Se realizó un estudio de biodistribución a la dosis alta de 5 * 1011 GC/ratón en los días 7 y 28 tras la inyección para evaluar la distribución tisular de los genomas del vector en hígado, corazón, bazo, riñón y pulmón de Anc80L65, junto con AAV8 como control (tabla 3). Los resultados muestran intervalos similares de transferencia génica de Anc80 a AAV8 en los tejidos ensayados, con aumentos moderados para Anc80L65 en bazo, corazón y pulmón. Mediante inyección intramuscular esquelética directa, Anc80 se dirigió eficazmente a las miofibras proximales al punto de inyección y se extendió longitudinalmente a lo largo de la fibra (figura 21A y figura 24). La transducción retiniana tras la inyección subretiniana es eficaz para dirigirse al epitelio pigmentario de la retina (RPE), al igual que ocurría con el AAV2 y el AAV8, tal como se señaló anteriormente. Se observó direccionamiento de fotorreceptores, una diana celular más difícil, tal como se documenta para AAV2, con AAV8 y Anc80L65. Aunque tanto el AAV8 como el Anc80L65 se dirigieron a la mayoría de las células fotorreceptoras, la transducción con Anc80L65 conduce sistemáticamente a mayores niveles de expresión por célula. También se observó que un número limitado de células de la retina interna eran positivas para GFP mediante la transducción de Anc80L65 (figura 21A).
Tabla 3. Distribución del genoma vectorial en hígado, corazón, bazo, riñón y pulmón de ratón
Ejemplo 26-Transferencia y expresión del gen Anc80L65 en el hígado de primates no humanos
Dado el robusto hepatotropismo de Anc80L65 en ratones, el objetivo era evaluar la transferencia de genes de Anc80L65 en un modelo animal de gran tamaño. Seis macacos de la India hembra que habían participado en estudios anteriores no relacionados con el AAV se inyectaron por vía safena con AAV8 o Anc80L65 a una dosis clínicamente relevante de 1012 GC/kg (tabla 4). Se usó un reportero rhCG para expresar el ADNc de macaco de la India de la subunidad p de la gonadotropina coriónica, un producto transgénico para el que se tolarizan los animales con el fin de evitar una respuesta inmunitaria no propia del transgén. Los animales inscritos en este experimento fueron preseleccionados para NAB a AAV8 y Anc80L65. Los niveles séricos de NAB semanas antes de la inyección eran inferiores a 1/4 de título para poder participar en este estudio. La transferencia de genes se evaluó mediante qPCR Taqman para vg de ADN hepático total (lóbulo caudal) 70-71 días después de la inyección (figura 21D). Sorprendentemente, 2 de cada 3 animales de control inyectados con AAV8 presentaron una transferencia de genes decepcionante (<0,1 vg/dg), probablemente debido a un bajo nivel de NAB en el momento de la inyección, indetectable mediante ensayos convencionales de NAB, tal como se señaló en estudios anteriores. Un animal AAV8, presumiblemente con NAB nulo o mínimo a AAV8, demostró niveles de transferencia de genes para el hígado dentro del intervalo esperado de 0,81 vg/dg. La transferencia de genes Anc80L65 aparentemente no se vio obstaculizada por NAB (no se detectó NAB de Anc80L65 antes de la inyección) y los 3 animales produjeron números de copias de transgenes hepáticos que oscilaban entre 0,73 y 3,56 vg/dg. La expresión hepática se monitorizó mediante RT-PCR cuantitativa (figura 21E): El Anc80L65 dio lugar a una expresión superior a la del AAV8, y alcanzó niveles de transcripción de rhCG entre el 13-26 % de las cantidades totales de ARNm de GAPDH en todos los lóbulos hepáticos.
Tabla 4. Características e historial clínico previo de macacos de la India tratados con vectores virales inyectados a través de la vena safena
Ejemplo 27-Seguridad, inmunología y toxicología de Anc80L65
La consideración de usar cualquier sistema de vector de administración de genes eficiente para aplicación terapéutica requiere una evaluación extensa de su seguridad para uso clínico. Además, el uso de un nuevo agente que puede aproximarse a un estado ancestral de un Dependoparvovirus puede aumentar aún más esas preocupaciones. En este caso, en un entorno preclínico no formal, se examinaron varios aspectos importantes que pueden limitar el Anc80L65 desde el punto de vista de la seguridad. Los estudios de expresión animal (figura 21) se supervisaron para detectar signos evidentes de toxicidad durante la fase del estudio en vida y, en la medida de lo posible, toxicidad específica del tejido diana. No se encontró ninguna adversidad notable asociada a la inyección del vector. Brevemente, la administración del vector tras la administración intraperitoneal (dosis máxima sometida a prueba [mdt]: 3,9 * 1010 GC/ratón), inyección en vena retroorbital (mdt: 5 * 1011 GC/ratón), subretiniana (mbt: 2 * 109 GC/ojo), intravítreo (mbt: 2 * 109 GC/ratón), e intramuscular directa (1010 GC/ratón) no se observó toxicidad manifiesta. Se realizó una evaluación más directa en una inyección intravenosa a dosis altas de 5 * 1011 GC/ratón (aproximadamente 2 * 1013 GC/kg) de Anc80L65.TBG.eGFP junto con los siguientes controles: (a) AAV8 con el mismo casete transgénico, y (b) una inyección salina de igual volumen. Los ratones fueron flebotomizados antes de la inyección, 2 h, 1 d, 3 d, 7 d, 14 d y 28 d después de la inyección y se analizó la sangre para recuentos de células sanguíneas (CBC) y química sérica (Chem) (tablas 5 y 6), que estaban dentro del intervalo o eran comparables a los controles para Anc80L65, y por tanto, no plantearon preocupaciones significativas. El suero de los puntos temporales de 2 h, 24 h, 3 d y 7 d se evaluó posteriormente en busca de citocinas como medida de la respuesta inmunitaria innata a los antígenos del vector mediante un análisis múltiplex de 23 citocinas (tabla 7). Las citocinas de Anc80L65 concordaron en general con las del suero salino y las del suero de control AAV8, y no se observaron elevaciones ni disminuciones importantes de citocinas; sin embargo, en algunos casos se situaron moderadamente fuera de los rangos establecidos por los valores del suero salino de control, de forma más evidente en el caso de Anc80L65 que en el de AAV8. Se realizaron análisis similares en la sangre de los estudios de macaco de la India descritos en las figuras 21D y 21E. De manera análoga a los estudios con ratones, a partir de los valores de CBC y Chem obtenidos, no se identificaron signos de toxicidad relacionados con el artículo de ensayo AAV8 o Anc80L65 (tablas 8 y 9).
Se sabe que la inmunidad preexistente a los serotipos de AAV bloquea la transferencia de genes, y puede poner al paciente en riesgo de adversidad debido al recuerdo de las células T de memoria hacia los antígenos del vector compartidos con el virus de tipo salvaje natural implicado en la infección primaria. Se usó un antisuero de conejo de alto título obtenido contra los serotipos 1, 2, 5, 6,2, 8, 9 y rh.32.33 del a Av . También se incluyó el rh.10, ya que su secuencia es la más homóloga al Anc80L65, con una diferencia del 8,0 % de los residuos. En la figura 22A, se analizó la capacidad de los sueros para neutralizar Anc80L65 frente a la cápside del vector homólogo contra el que se había criado. Los resultados demostraron la ausencia de reactividad cruzada con AAV5 y rh32.33, AAV estructuralmente muy divergentes, mientras que AAV2, 6,2 y 8, presuntos descendientes de Anc80L65, demostraron una reactividad cruzada de bajo nivel, aunque a niveles 16 veces o inferiores a los títulos antisuero homólogos. Entre los miembros del linaje Anc80, no se observó reactividad cruzada por encima del límite de sensibilidad para AAV9 y rh.10. A continuación, se trató de validar estos resultados en un modelo in vivo de neutralización preinmunizando a los animales con AAV8 por vía intramuscular, y evaluando la neutralización de Anc80L65 tras la inyección intravenosa en comparación con AAV8, 25 días después de la inmunización (figura 22B). La neutralización fue completa para AAV8 en los animales preinmunizados con AAV8. Anc80L65 se neutralizó en 215 animales, pero demostró entre un 60 117 % de transducción en 3/5 animales, a pesar de que se demostró AAV8 NAB en esos animales. Estos resultados demuestran una reactividad cruzada parcial de Anc80L65 con AAV8 en conejo y ratón.
Ejemplo 28-Análisis y reconstrucción del linaje de AAV
Fortalecidos por la exitosa síntesis de Anc80L65 basada en ASR y su demostración como agente producible, estable y altamente infeccioso para la terapia génica, el objetivo era proporcionar una validación adicional del enfoque y la metodología de modelado reconstruyendo aún más el linaje de AAV. La ambición de generar este conjunto adicional de reactivos era proporcionar intermediarios estructurales de Anc80 y AAV existentes que permitieran la evaluación empírica
de la relación estructura-función dentro de esta familia viral y destacar importantes acoplamientos epistáticos informativos para futuros enfoques de diseño racional de AAV. Se reconstruyeron un total de 8 intermediarios evolutivos adicionales de AAV mediante ASR y se sintetizaron en el laboratorio (figura 18): Anc81, Anc82, Anc83, Anc84, And 10 y And 13 se resolvieron en la ramificación que conduce hacia AAV7, 8 y/o 9, mientras que Anc126 y Anc127 se posicionan en la historia natural de AAV1, 2 y/o 3. Para cada uno de estos, la secuencia se determinó seleccionando el aminoácido con la probabilidad posterior más alta por posición. En primer lugar, se determinaron los rendimientos del vector viral GC en una transfección triple estándar HEK293 de los componentes del vector y la ayuda adenoviral mediante qPCR Taqman para los genomas del vector. Los resultados, mostrados en la figura 23A, demuestran una mayor productividad de Anc80 como el ancestro putativo en el linaje AAV7-9, en línea con los mayores rendimientos de producción de esos serotipos como AAV8. La rama AAV1-3 no presentó aumentos de rendimiento, y se observó un rendimiento de partículas muy pobre para Anc126. Es posible que los rendimientos de Anc126 puedan mejorarse mediante el aprovechamiento del espacio estadístico, como fue el caso de Anc80, sin embargo, es igualmente probable que Anc126 ASR esté menos informado debido al submuestreo de esta rama de la filogenia AAV. La infectividad de las partículas producidas a dosis iguales se comprobó in vitro en HEK293 mediante GFP y luciferasa. Todos los vectores de Anc recién sintetizados demostraron infectividad, sin embargo, en diversos grados (figura 23B). En el linaje AAV7-9, los títulos infecciosos fueron en general bajos y más similares al fenotipo AAV8 que al de Anc80. Anc127, el único intermediario en el linaje de Anc80 a AAV2 que pudo someterse a prueba a igual dosis demostró una menor eficacia de transducción en comparación tanto con Anc80 como con AAV2. Además, se comprobó el perfil de estabilidad térmica de intermediarios evolutivos seleccionados en ambas ramas de este linaje (figura 23C). Curiosamente, Anc81 y Anc82 demostraron una temperatura de fusión elevada, aunque moderadamente reducida, en un ensayo de termoestabilidad en comparación con Anc80L65, lo que sugiere quizá una reducción gradual de la termoestabilidad con la edad evolutiva en esta rama. En cambio, Anc127 demostró un aumento aún mayor con respecto al vector Anc80L65, ya altamente termoestable.
Por último, se exploró la capacidad de la ASR para interrumpir epítopos conocidos del AAV2. Hasta la fecha, sólo se han mapeado unos pocos epítopos de células B o T en AAV2, todos los cuales se mapearon en Anc80L65, Anc126, Anc127 y AAV2, que representan el linaje AAV2. La introducción de las mutaciones secuenciales entre estos intermediarios evolutivos putativos pone de relieve, en la figura 22C, el solapamiento entre las mutaciones y 2/4 epítopos de células T humanas y 2/2 epítopos de células B de ratón. Estos datos ponen de relieve el potencial de ASR para usarse como método para eliminar o modular regiones antigénicas en la cápside del AAV, y pueden sugerir que la inmunidad fue una presión selectiva importante en la historia natural del AAV.
Ejemplo 29-Funcionalidad in vivo de And 110
Se realizaron experimentos para evaluar la transducción hepática de luciferasa por Anc80, Anc81, Anc82 y And 10 en comparación con AAV9 en ratones C57B1/6. Los resultados de la figura 27 demuestran que, tras la inyección intravenosa del vector indicado, And 10 demostró niveles equivalentes de focalización hepática que AAV9 en ratones C57B1/6 basándose en la expresión transgénica del gen reportero de luciferasa. Notablemente, el AAV9 está actualmente en estudios clínicos.
Tabla 5 Valores de recuento sanguíneo completo en ratones inyectados con AAV8 y Anc80L65. Los valores fuera del intervalo de referencia se resaltaron en rojo (arriba) y amarillo (abajo).
a continuación
Tabla 6 Valores bioquímicos séricos de ratones inyectados con AAV8 y Anc80L65. Los valores fuera del rango de referencia se resaltaron en rojo (arriba) y amarillo (abajo).
Tabla 7. Niveles de citocinas séricas medidos en diferentes momentos en ratones inyectados con solución salina, AAV8 y Anc80L65. Los valores dentro del intervalo de referencia de solución salina se destacaron en verde.
a continuación
Tabla 8 Valores del recuento sanguíneo completo de primates no humanos inyectados con AAV8 y Anc80L65. Los valores fuera del intervalo de referencia se resaltaron en rojo (arriba) y amarillo (abajo).
Valores de referencia de CMB 3,4-11,2 K/ul
Valores de referencia de linfocitos 31-64 %
Valores de referencia de CMB 4,98- 6,42/ul
Valores de referencia de HCT 37,2-47,1 %
a continuación
Valores de referencia de PLT 190-536 K/ul
Valores de referencia de neutrófilos 40-68 %
Valores de referencia de monocitos 1,5-4 %
Valores de referencia de HGB 11,7-14,7
Valores de referencia de MCV 69-79 fl
a continuación
MPV referen normal 8,9-16,1
Tabla 9 Valores bioquímicos séricos de primates no humanos inyectados con AAV8 y Anc80L65. Los valores fuera del intervalo de referencia se resaltaron en rojo (arriba) y amarillo (abajo).
Valores de referencia de ALT 0-59 U/l
Valores de referencia de GGT 0-69,9 U/l
Valores de referencia de albúmina 3,3-4,7 g/dl
Valores de referencia de proteína totales 6-7 8 g/dl
a continuación
Valores de referencia de CK 0-1596 U/l
Valores de referencia de ALP 0-704 U/l
Valores de referencia de glucosa 33-95 mg/dl
Valores de referencia de AST 0-46 U/l
Valores de referencia de bilirrubina total 0-0,39 mg/dl
Valores de referencia de BUN 9-23 mg/dl
Valores de referencia de amilasa 18-612 U/l
Valores de referencia de LDH 0-785 IU/1
Valores de referencia de creatinina 0,7-1,1 mg/dl
Valores de referencia de colesterol 69-205 mg/dl
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Un polipéptido de la cápside de virus adenoasociado (AAV) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 42.2. El polipéptido de la cápside de AAV según la reivindicación 1, en donde el polipéptido de la cápside de AAV se purifica.3. El polipéptido de la cápside de AAV según la reivindicación 1, codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 43.4. Una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la cápside de virus adenoasociado (AAV) que tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 43.5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4.6. Una célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 5.Una partícula de virus purificado que comprende el polipéptido de la cápside de AAV según la reivindicación 1. La partícula de virus purificado según la reivindicación 7, que comprende además un transgén.9. Un transgén para su uso en un método de transferencia de genes y/o vacunación, comprendiendo el método administrar la partícula de virus según la reivindicación 8 a un sujeto que necesita transferencia de genes o vacunación, en donde la partícula de virus presenta aproximadamente la misma o una menor seroprevalencia que una partícula de virus AAV9.Un transgén para su uso según la reivindicación 9, en donde la partícula de virus se neutraliza a la misma o en menor medida por el suero humano que es una partícula de virus AAV9.11. Un antígeno diana unido operativamente al polipéptido de la cápside de AAV según la reivindicación 1, para su uso en un método de vacunación de un sujeto, comprendiendo el métodoadministrar un antígeno diana unido operativamente al polipéptido de la cápside de AAV según la reivindicación 1 a un sujeto que necesita vacunación, en donde el polipéptido de la cápside de AAV presenta aproximadamente la misma o una menor seroprevalencia que un polipéptido de cápside AAV9.
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