CN108603235A - 祖先病毒序列及其用途 - Google Patents
祖先病毒序列及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108603235A CN108603235A CN201680057177.2A CN201680057177A CN108603235A CN 108603235 A CN108603235 A CN 108603235A CN 201680057177 A CN201680057177 A CN 201680057177A CN 108603235 A CN108603235 A CN 108603235A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aav
- polypeptide
- virus
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
Abstract
描述了用于预测病毒或其部分的祖先序列的方法。还描述了腺伴随病毒(AAV)壳体多肽的经预测的祖先序列。本公开还提供了基因转移的方法和对受试者接种疫苗的方法,其通过施用可操作连接于AAV壳体多肽的靶抗原进行。
Description
发明领域
一般而言,本公开涉及病毒。
发明背景
规避和避免针对基因治疗载体的中和性或毒性免疫应答是所有基因转移载体类型面临的重大挑战。迄今为止的基因转移使用基于在人类和动物中循环的病毒的载体(例如腺病毒和腺伴随病毒(AAV))而得以最有效地实现。然而,如果受试者已经天然感染了病毒,那么由于细胞和体液免疫应答,用基于该病毒的载体的后续治疗导致基因转移的增加的安全风险和降低的效率。壳体抗原主要负责针对病毒颗粒的天然免疫和/或适应性免疫,然而,病毒基因编码的多肽也可以具有免疫原性。
发明概述
本公开描述了预测和合成祖先病毒(ancestral viral)序列或其部分的方法,并且还描述了含有此类祖先病毒序列的病毒颗粒。将本文中描述的方法应用到腺伴随病毒(AAV);因此,本公开描述了预测的祖先AAV序列和含有此种祖先AAV序列的AAV病毒颗粒。本公开还描述了相对于含有当代序列的病毒颗粒,由含有祖先序列的病毒颗粒展现的血清阳性率(seroprevalance)。
一方面,提供了腺伴随病毒(AAV)壳体多肽,其具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,此种AAV壳体多肽或包含此种AAV壳体多肽的病毒颗粒比AAV9壳体多肽或包含AAV9壳体多肽的病毒颗粒展现出大致相同或更低的血清阳性率。在一些实施方案中,此种AAV壳体多肽或包含所述AAV壳体多肽的病毒颗粒与AAV9壳体多肽或包含AAV9壳体多肽的病毒颗粒相比在相似或更小程度上被人血清中和。在一些实施方案中,此种 AAV壳体多肽是纯化的。在一些实施方案中,此种AAV壳体多肽由SEQ ID NO:43中所示的核酸序列编码。
还提供了包含此种AAV壳体多肽的纯化的病毒颗粒。在一些实施方案中,此种纯化的病毒颗粒进一步包含转基因。
另一方面,提供了编码腺伴随病毒(AAV)壳体多肽的核酸分子,其具有在SEQ IDNO:43中所示的核酸序列。在一些实施方案中,提供了包含此种核酸分子的载体。在一些实施方案中,提供包含此种载体的宿主细胞。
另一方面,提供了用转基因进行基因转移和/或疫苗接种的方法。此种方法通常包括将本文所述的病毒颗粒施用于需要基因转移或疫苗接种的受试者,其中所述病毒颗粒比AAV9病毒颗粒展现出大致相同或更低的血清阳性率。在一些实施方案中,此种病毒颗粒与AAV9病毒颗粒相比在相似或更小程度上被人血清中和。
另一方面,提供了对受试者接种疫苗的方法。此种方法通常包括将如本文所述的可操作连接于AAV壳体多肽的靶抗原施用于需要疫苗接种的受试者,其中所述AAV壳体多肽与AAV9壳体多肽相比展现出大致相同或更低的血清阳性率。在一些实施方案中,此种AAV壳体多肽与AAV9壳体多肽相比在相同或更小程度上被人血清中和。
因此,本公开提供了祖先病毒或其部分,其相比于当代病毒或其部分展现出降低的对当代人群中预先存在的免疫的易感性。通常,由祖先病毒或其部分在当前人群中展现的降低的对预先存在的免疫的易感性反映为降低的对中和性抗体的易感性。
除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语与方法和物质组合物所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于方法和物质组合物的实践或测试中,但是以下描述了合适的方法和材料。此外,材料,方法和实例仅是说明性的,并不意在进行限制。将本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其整体并入本文作为参考。
附图简述
本专利或申请文件包含以彩色制作的至少一幅附图。通过请求并支付必要的费用由当局提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本。
图1是显示祖先病毒/当代病毒感染和祖先宿主/当代宿主免疫应答之间的关系的示意图。
图2A至2D是显示祖先重构建(reconstruction)过程的实例的一系列示意图。显示的数据是从完整的数据集摘录并代表残基564-584(AAV2-VP1编号)。
图3显示了使用本文中所描述的方法产生的AAV当代序列的系统发生树。
图4显示了祖先AAV VP1多肽的比对。
图5A和5B一起显示了功能性祖先AAV VP1多肽和当代AAV VP1多肽的比对。
图6是电泳凝胶,其证明祖先AAV VP1序列以类似于当代AAV VP1序列的方式被转录并可变剪接。
图7是显示用祖先AAV载体转导的HEK293细胞中的萤光素酶活性的图。
图8是显示Anc80文库和Anc80L65之间的序列比较(从对角线向上%,以下的氨基酸差异#)的图。
图9A-D是实验结果的图像,其表明了Anc80L65能够组装并产生高滴度的颗粒。图A显示了Anc80L65能够产生与AAV2相当的载体产率;图B是包括 Anc80L65的病毒颗粒的TEM图像;图C显示了基于变性条件下的SDS-PAGE 凝胶,包括Anc80L65的病毒颗粒能够产生AAVcap VP1,2和3蛋白;并且图 D显示了使用AAV壳体抗体B1进行的Anc80L65的Western印迹。
图10A-C是实验结果的图像,其证明了使用GFP作为读数(图A)或萤光素酶(图B),Anc80L65相对于AAV2和/或AAV8对照能够对HEK293细胞在体外感染细胞,并且在编码核LacZ转基因的AAV的IV注射后(顶行,图C:肝),在编码GFP的AAV的直接IM注射后(中间行,图C:肌肉),和在编码GFP的 AAV的视网膜下注射后(底行,图C:视网膜)也有效靶向肝。
图11A和11B是使用MAFFT的序列同一性矩阵产生,其显示与代表性现存的AAV的VP1蛋白的氨基酸序列比对的祖先载体的VP1蛋白的氨基酸序列 (图11A),和与代表性现存的AAV的VP3蛋白的氨基酸序列比对的祖先载体的 VP3蛋白的氨基酸序列(图11B)。
图12是表明以小规模(6孔皿)一式三份产生AAV载体的图。通过qPCR评估粗制病毒以确定每一载体的绝对产生。
图13是显示取平均值并且与AAV8的滴度比较的每一载体的滴度的表。
图14是照片,其显示将每一载体的1.9E3 GC/细胞加入到HEK293细胞的实验结果(除了Anc126外,在Anc126的情况下实现了2.5E2-3.1E2 GC/细胞的 MOI)。60小时后,用荧光显微术评估了感染性。
图15是显示实验结果的图,其中裂解来自图14的相同细胞并测定萤光素酶表达。与在图14中一样,Anc126没有用其它载体控制滴度,但是范围却为 2.5E2-3.1E2 GC/细胞的MOI。
图16的表显示了由每一载体转导的细胞的发光,其取平均值并与AAV8 的发光相比较。
图17的图提供了测定本文中所述的祖先AAV载体的相对产生和感染性的体外实验的汇总。
图18是使用最大似然系统发生(phylogeny)和75种不同的AAV隔离群 (isolate)产生的AAV进化谱系的系统发生和ASR。红色的圆圈代表通过ASR 重构建的进化中间体。蓝色的圆圈代表了围绕Anc80建立的概率性空间文库。为了清晰起见,塌陷(collapse)了亚进化枝(subclade)。完整的系统发生如图24 所呈现。
图19显示了Anc80载体的序列和结构分析。小图A是Anc80(SEQ ID NO: 37),AAV2(SEQ ID NO:38)和AAV8(SEQ ID NO:39)VP3蛋白的序列结构比对。AAV2(PDB 1LP3)和AAV8(PDB 2QA0)VP3的晶体结构和由UCSF嵌合体 (Pettersen et al.,2004,J.Comp.Chem.,25:1605-12)产生的Anc80L65 VP3的预测结构衍生的结构比对显示为黑色印刷(blackprint)。蓝色区域是AAV2, AAV8和An80的VP1/VP2结构域的非结构比对(Notredame etal.,2000,J.Mol. Biol.,302:205-17)。Anc80文库中不明确的残基以红色表示,较低的位置对应于Anc80L65残基。β-链和α-螺旋分别以绿色和黄色表示。用平面箭头描绘形成AAV反平行β-桶的9个β链的位置,而用虚线箭头描绘保守核心α-螺旋的位置。可变区(VR)I-IX的近似位置由序列比对上方的罗马数字表示。小图B显示AAV Cap序列趋异矩阵。在对角线上方,矩阵表示与选定的AAV血清型以及最同源的VP1序列rh.10的百分比序列趋异(sequencedivergence),如由 BLAST确定的。在对角线下面,呈现每个位置的氨基酸差异的数目。小图C 显示了AAV2和AAV8 VP3晶体结构与Anc80L0065 VP3预测结构的叠加。颜色代码描述了小图A的3个比对序列之间的氨基酸保守性(红色:最高保守性;蓝色:最低保守性)。可变区域I-IX和C/M-末端用黑色表示。二重轴,三重轴和五重轴的近似位置分别表示为黑色椭圆,三角形和五边形。小图D是VP1 三聚体上的AAV2(左侧)和AAV8(右侧)相比较的氨基酸变化的结构绘图,可视化了病毒体的外部(顶部)和内部(底部)。Anc80中有色残基是趋异的。经由ASR的红色残基是不明确的,并且因此在Anc80Lib中是二态的(dimorphic)。
图20是Anc80L65的生物物理学和生物化学表征的结果。小图A显示 Anc80L65的负染色(negative staining)透射电子显微术(TEM),证明Anc80L65 形成直径约20-25nm的颗粒。小图B是Anc80L65 VP组合物。通过SDS-PAGE 分析Anc80L65和三种现存病毒的纯化的制备物。Anc80证实单体VP1,2和3 的相似掺入水平。小图C显示纯化的AAV制备物的空:全颗粒组合物。沉降系数分布来源于在AAV8和Anc80L65制备物的分析超速离心期间用折射率光学测量系统获得的沉降分布图。小图D显示AAV热稳定性。AAV颗粒在不同温度下的固有色氨酸荧光测量阐述了与Anc80L65相比,AAV血清型的不同解链温度(melting temperature)。
图21是来自Anc80L65的体内评估的结果。小图A,顶部小图,显示在以 7.2x 1010GC的剂量腹膜内递送后28天,肝脏中的AAV-2,AAV-8和 Anc80L65.TBG.nLacZ的肝脏转导和lacZ转基因表达的比较。小图A,中间的小图显示了在以1x1010GC的剂量肌肉内递送至后方右大腿(腓肠肌/股二头肌肌肉)后28天的AAV2,AAV8和Anc80L65的肌肉向性(tropism)。小图A,下图显示了在以2x 109GC剂量经视网膜下递送之后在视网膜中的AAV2, AAV8和Anc80L65之间的eGFP转基因表达的比较。AAV2对RPE细胞显示出高亲和力,而使用AAV8和Anc80L65载体靶向RPE和光感受器两者,与AAV2 和AAV8相比,Anc80L65显示更高的转导效率。小图B是在以1011(上图), 1010(中图)和1009(下图)GC的定性剂量反应eGFP-表达分析,通过眶后窦 (retro-orbital sinus)静脉内递送比较AAV-8和Anc80L65。在整个剂量范围内, AAV8和Anc80L65均以相等剂量显示可比较的eGFP表达。小图C显示测量来自AAV-8(黑色符号:方形-1011GC,圆形-1010GC和四方形-109GC)和 Anc80L65(灰色符号:菱形-1011GC,方形-1010GC和三角形-109GC)的重组人类α1-抗胰蛋白酶(hA1AT)转基因表达的小鼠血清水平的定量AAV剂量响应分析)。小图D是隐静脉注射1x1012GC/kg剂量后,表达猕猴绒毛膜促性腺激素(rhCG)的AAV-8和Anc80L65的猕猴肝脏基因转移的图。从猕猴肝叶(liver lobe)收获基因组DNA,并且通过qPCR测定法测量每个二倍体基因组(dpg)的病毒基因组(vg)。一只AAV8和所有三只Anc80L65动物成功地接受~1-3vg/ 尾部肝叶的二倍体细胞,而2只AAV8动物有可能具有低水平的NAB,导致载体中和以及有限的肝基因转移。小图E是通过TaqMan探针特异性的定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)显示NHP尾部,右,左和中间肝叶中AAV8和Anc80L65的转基因mRNA表达的图。rhCG转录物的定量相对于内源性GAPDH mRNA 水平标准化。
图22是免疫学表征Anc80L65的实验结果。小图A是显示兔抗AAV血清交叉反应性的图:为了评估血清-交叉反应性,对针对AAV血清型产生的兔抗血清(Y-轴)测试针对Anc80L65相对于同源AAV血清型的NAB。数值(X轴) 代表实现50%中和的最小稀释度。左边描绘了免疫血清型之间的系统发生关系。小图B是显示小鼠体内基因转移交叉中和的表:在用盐水或 AAV8.TBG.nLacZ IM注射后25天,C57B1/6小鼠接受IV注射的AAV8或Anc80L65.CASI.EGFP.2A.A1AT。第二次注射后14天,通过ELISA滴定血清中的hA1AT表达。表格呈现了对于每种载体的免疫前小鼠对未免疫者的相对 hA1AT水平(%对照),以及在第二次注射之前24小时在免疫组(n=5)中的针对 AAV8(NAB8)和Anc80L65(NAB80)的NAB滴度稀释度。小图A和B中的灰色发散箭头示意性说明AAV2和AAV8谱系表型进化。小图C是使用T-coffee比对包(T-coffee alignment package)产生的Anc80,Anc126,Anc127和AAV2 VP3序列之间的非结构多序列比对。使用UCSF嵌合体产生AAV2三聚体结构。蓝色残基代表相对于Anc80的可变残基。橙色残基代表AAV2上的先前定义的T 和B细胞表位。绿色残基是相对于Anc80L65的突变和B/T细胞表位之间的重叠。
图23是显示AAV谱系重构建调节生产,感染性和热稳定性的数据。小图 A的图显示产生含有由CMV启动子驱动的萤光素酶报道基因的九个祖先病毒载体和两个现存病毒载体,如通过qPCR测定。误差线表示三个生物学重复的标准偏差。小图B是显示使用祖先和现存病毒载体以1.9×103的颗粒与细胞的比例转导HEK293细胞的图。误差线代表三种不同批量的载体的标准偏差。由于低的载体产量,以在2.1×102和3.5×102GC/细胞之间的比率添加 *Anc126。小图C显示sypro-orange热稳定性测定,指示所选择的祖先和现存 AAV载体的变性温度。
图24显示了病毒载体肌内注射后的eGFP表达(也参见上面的图21)。对于肌肉靶向的eGFP实验,小鼠在腓肠肌中接受单次注射。在横向肌肉和纵向肌肉切片(第一和第二列)中观察到eGFP表达。蓝色染色标记核(DAPI)。如在苏木精和曙红(H&E)染色的切片(第三列)中观察到,肌肉的形态没有变化。
图25是来自用于祖先序列重构建的AAV隔离群的VP1多肽的多序列比对(也参见上面的图18和23)。AAV2(SEQ ID NO:31);AAV5(SEQ ID NO:40); AAV7(SEQ ID NO:34);Anc113(SEQ ID NO:13);AAV8(SEQ ID NO:27); Anc83(SEQ ID NO:7);Anc84(SEQ ID NO:9);rh10(SEQ ID NO:41); Anc82(SEQ ID NO:5);Anc110(SEQ ID NO:42);Anc81(SEQ IDNO:3); Anc80(SEQ ID NO:1);Anc126(SEQ ID NO:15);AAV3(SEQ ID NO:32); AAV3B(SEQID NO:33);Anc127(SEQ ID NO:17);AAV6(SEQ ID NO:29); AAV1(SEQ ID NO:30);AAV9(SEQ ID NO:28);AAV4(SEQ ID NO:44); rh32.33(SEQ ID NO:45)。
图26显示了AAV进化谱系的全系统发生和重构建节点(也参见上面的图 18)。最大拟然(Maximum-likelihood)系统发生涉及75个AAV分离株。红圈代表通过ASR重构建的进化中间体。蓝圈代表围绕Anc80建造的概率空间库(a library of probabilistic space)。
图27是显示在C57B1/6小鼠中IV施用后,与AAV9相比,Anc80,Anc81, Anc82和Anc110的萤光素酶肝脏转导的图。
发明详述
基因转移(出于实验或治疗目的)依赖于载体或载体系统将遗传信息穿梭到靶细胞中。认为载体或载体系统是基因转移反应的效率,特异性,宿主反应,药理学和寿命的主要决定因素。目前,实现基因转移的最高效且有效的的方式是通过使用基于已经变为复制缺陷型的病毒的载体或载体系统。
然而,血清阳性率研究指示相当大比例的全球人类群体已经预先暴露 (例如通过自然感染)于大量的目前在基因转移中使用的病毒,并且因此具有预先存在的免疫。已知在这些预先暴露的个体中针对病毒载体的中和抗体有时显著地限制基因转移的程度,或者甚至使病毒重定向远离靶标。参见例如 Calcedo等人,(2009,J.Infect.Dis.,199:381-90)和Boutin等人,(2010,Human Gene Ther.,21:704-12)。因此,本公开是基于如下的认识:祖先病毒或其部分比当代病毒或其部分在当前人类群体中展现出降低的对先前存在的免疫的易感性(例如,降低的对中和抗体的易感性)。
图1是显示祖先和当代病毒感染与祖先和当代宿主免疫应答之间的关系的示意图。图1显示了祖先AAV可以如何耐(refractory to)当代先前存在的免疫。推测当代的现存病毒(Vc)主要在宿主免疫的进化压力下通过免疫逃逸机制从祖先物种(Vanc)进化。这些物种Vanc和Vc中的每一种均具有诱导适应性免疫,包括B细胞和T细胞免疫(分别为Ianc和Ic)的能力。假设并且本文中确认,由当代病毒诱导的免疫不一定与祖先病毒种类起交叉反应,所述祖先病毒种类就表位组成而言可以与现存病毒实质上不同。
本公开提供了预测祖先病毒或其部分的序列的方法。可以产生使用本文中描述的方法预测的一个或多个祖先病毒序列并组装成病毒颗粒。如本文中证明,从预测的祖先病毒序列组装的病毒颗粒可以比当前的当代病毒颗粒展现出更小,有时显著更小的血清阳性率。因此,本文中公开的祖先病毒序列适合于在用于基因转移的载体或载体系统中使用。
预测和合成祖先病毒序列的方法
为了预测祖先病毒序列,首先从多个当代病毒或其部分编译(compile)核苷酸或氨基酸序列。尽管本文中所述的方法用腺伴随病毒(AAV)壳体序列示例,但相同的方法可应用于来自AAV的其他序列(例如,整个基因组,rep序列,ITR序列)或任何其他病毒或其部分。除AAV之外的病毒包括但不限于,腺病毒(AV),人免疫缺陷病毒(HIV),逆转录病毒,慢病毒,单纯疱疹病毒 (HSV),麻疹病毒,痘苗病毒,痘病毒,流感病毒,呼吸道合胞病毒,副流感病毒,泡沫病毒,或认为先前存在的免疫成问题的任何其它病毒。
可以使用来自少到两种当代病毒或部分的序列,但是,应当理解当代病毒或其部分的更大数目的序列是期望的,以便包括现代序列多样性的尽可能多的画卷(landscape),而且还因为更大数量的序列可以增加所描述和使用的算法的预测能力。例如,可以使用来自10种或更多种当代病毒或其部分的序列,可以使用来自50种或更多种当代病毒或其部分的序列,可以使用来自100 种或更多种当代病毒或其部分的序列。
此类序列可以例如从许多公共数据库获得,所述公共数据库包括但不限于GenBank,UniProt,EMBL,国际核苷酸序列数据库协作(International NucleotideSequence Database Collaboration)(INSDC)或欧洲核苷酸档案库 (EuropeanNucleotide Archive)。另外/或者,此类序列可以从特异于特定生物体的数据库(例如HIV数据库)中获得。当代序列可以对应于整个基因组,或可以仅使用基因组的一部分,诸如但不限于编码病毒壳体,复制蛋白,或ITR 序列的一个或多个组分的序列。
接着,使用多重序列比对(MSA)算法比对当代序列。图2(a)是显示多个序列的比对的示意图。MSA算法是本领域众所周知的,并且通常被设计成适用于不同大小的数据集和不同的输入(例如,核酸或蛋白质),以及适用于以特定方式(例如,动态编程,渐进(progressive),启发式(heuristic))比对序列并在比对中应用不同评分方案(例如,基于矩阵或基于一致性,例如,最小熵,配对总和,相似性矩阵,缺口得分)。公知的MSA算法包括,例如ClustalW (Thompson et al.,1994,Nuc.Acids Res.,22:4673-90),Kalign(Lassmannet al., 2006,Nuc.Acids Res.,34:W596-99),MAFFT(Katoh et al.,2005,Nuc.AcidsRes.,33:511-8),MUSCLE(Edgar,2004,BMC Bioinform.,5:113),和T-Coffee (Notredameet al.,2000,J.Mol.Biol.,302:205-17)。
如本文中所述的,当选择MSA算法用于本文中所述的方法中时的主要特征之一是其中所述算法处理比对中的缺口的方式。可以给序列比对中的缺口分配罚分值(penaltyvalue),其依赖于或不依赖于缺口大小。在本方法中,优选的是,与由例如插入和/或缺失所致的缺口的有偏的、非系统发生处理形成对比,在本文中所描述的方法中使用的MSA算法将系统发生信息应用于预测在比对中的缺口是否是缺失或者插入的结果。在比对和进化分析中处理缺口的合适的方法描述于Loytynoja and Goldman,2008,Science,320:1632-5中,并且将缺口以适合用于本文中所述的方法中的方式应用于比对中的商业上可获得的算法是概率比对套件(Probabilistic Alignment Kit)(PRANK;Goldman Group Software;Loytynoja and Goldman,2005,PNAS USA,102:10557-62)和 PRANK算法的变型。
然后,将进化模型应用到得到的比对以获得预测的祖先系统发生(参见图2(b))。在本领域中有许多可用的进化模型,其中的每个对氨基酸应用替换率的略微不同的矩阵。应用进化模型的算法包括但不限于Dayhoff模型(例如 PAM120,PAM160,PAM250;Dayhoffet al.,1978,In Atlas of Protein Sequence and Structure(ed.Dayhoff),pp.345-52,National Biomedical Research Foundation,Washington D.C.),JTT模型(Jones etal.,1992,Comp.Appl.Biosci., 8:275-82),WAG模型(Whelan and Goldman,2001,Mol.Biol.Evol.,18:691-9),和Blosum模型(例如Blosum45,Blosum62,Blosum80;Henikoffand Henikoff, 1992,PNAS USA,89:10915-9)。
此外,例如,通过考虑一些位置是不变的(“+I”;Reeves,1992,J.Mol. Evol.,35:17-31),一些位置经历不同速率的变化(“+G”;Yang,1993,Mol.Biol. Evol.,10:1396-1401),和/或核苷酸或氨基酸的平衡频率与比对中的那些是相同的(“+F”;Cao et al.,1994,J.Mol.Evol.,39:519-27),可以对结构和功能强加到进化模型的约束本身建模。
可以使用Aikake信息标准(AIC;Akaike,1973,In Second InternationalSymposium on Information Theory,Petrov and Csaki,eds.,pp 267-81,Budapest,Akademiai Kiado),Bayesian信息标准(BIC;Schwarz,1978,Ann.Statist. 6:461-4),或其变型或组合来评估一个或多个进化模型的适合度(fitness)。此外,AIC,BIC,或其变型或组合可以用于评估在进化模型中包括一个或多个参数(例如上面讨论的约束)的相对重要性。
如下文实施例部分中解释的,基于最低AIC,ProTest3(Darriba et al.,2011,Bioinformatics,27(8):1164-5)可用于确定JTT+G+F算法是最适合于AAV进化的模型。本领域技术人员将理解,JTT+G+F算法也可以用于预测与AAV壳体多肽不同的祖先病毒序列,然而,本领域技术人员也将理解,根据数据集和适合度评分,不同进化模型可以是更合适的。
一旦已经选择了进化模型并确定了它的适合度,可以构建病毒序列或其部分的系统发生树。构建系统发生树在本领域是已知的,并且通常使用最大似然法(maximumlikelihood method),如由PhyML(Guindon and Gascuel,2003, Systematic Biology,52:696-704)),MOLPHY(Adachi and Hasegawa,1996,ed. Tokyo Institute of StatisticalMathematics),BioNJ(Gascuel,1997,Mol.Biol. Evol.,14:685-95)或PHYLIP(Felsenstein,1973,Systematic Biology,22:240-9) 执行的那些方法。本领域技术人员将理解,在氨基酸取代的模型中计算复杂性和拟合优度(goodness of fit)之间的平衡是值得期望的。
根据需要,可以评估系统发生树的显著性。许多统计方法是可用的,并且常规用于评估模型的显著性,包括但不限于自助法(bootstrap),刀切法 (jackknife),交叉验证(cross-validation),置换检验(permutation test),或它们的组合或变型。显著性也可以使用例如近似似然比检验(approximate likelihood-ratio test)(aLRT;Anisimova andGascuel,2006,Systematic Biology, 55:539-52)进行评价。
在系统发生的任何系统发生节点(例如,内部系统发生节点),序列可以通过估计在序列的每个位置处特定核苷酸或氨基酸残基的进化概率来重构建(如图2(c))。系统发生节点是指在预测的祖先系统发生内的中间进化分支点。如本文中所使用的,“进化概率”是指与不考虑例如密码子选择中的进化偏移(evolutionary shift)的模型形成对比基于进化模型在特定位置上的特定核苷酸或氨基酸存在的概率。可使用例如任何数目的最大似然法,包括但不限于通过最大似然法进行的系统发生分析(Phylogenetic Analysis byMaximum Likelihood)(PAML;Yang,1997,Comp.Applic.BioSci.,13:555-6)或使用简约性进行的系统发生分析(Phylogenetic Analysis Using Parsimony) (PAUP;SinauerAssoc.,Inc.,Sunderland,MA)评估考虑了在特定位置上的特定核苷酸或氨基酸残基的进化概率的示例性模型。
基于在每个位置上的特定核苷酸或氨基酸残基的评估的进化概率,可以装配祖先病毒或其部分的预测序列以形成完整或部分的合成的核酸或多肽序列。根据需要,可以计算任何残基沿着节点在给定节点处为给定状态的可能性的,并且可以鉴定沿着序列具有特定阈值之下的计算的后验概率的任何位置(图2(d))。以这种方式,可以产生祖先支架序列,其可以包括在具有低于特定阈值的概率的那些位置上的变异。
如果使用本文中的方法预测的祖先序列是核酸序列,那么可以对该序列进行密码子优化,以便它可以被有效地翻译成氨基酸序列。针对不同生物体的密码子选择表是本领域已知的。任选地,然而,密码子选择表可以基于与祖先支架序列具有同一性(例如,至少90%的序列同一性)的一种或多种当代序列设计,并且可以将如本文中描述的祖先序列针对哺乳动物(例如,人类) 的密码子选择进行密码子优化。
本文中概述的用于预测祖先病毒序列的任何或全部有步骤可以使用处理器或微处理器在计算机上(例如用计算机(in silico))进行或模拟。
祖先腺伴随病毒(AAV)支架序列
使用当代壳体序列将本文中描述的方法应用到腺伴随病毒(AAV)(在以下实施例详细描述)。AAV被广泛认为是治疗性基因转移载体和遗传疫苗载体,但在人群中展现出高血清阳性率。使用本文中描述的方法,使用当代AAV 序列(见图3)装配了系统发生树,并在指定的系统发生节点获得预测的祖先支架序列(表1)。如本文中使用的,祖先支架序列是指使用本文所述的方法(例如,使用进化概率和进化建模)构建并且知道在自然界中不存在的序列。如本文中使用,祖先支架序列不同于共有序列,其通常使用在特定位置的核苷酸或氨基酸残基的频率构建。
表1
序列表中显示了支架多肽和核酸的序列,以及在可能性的位置处可能的核苷酸或残基组。例如,Anc80多肽的支架序列显示于SEQ ID NO:1,其由在SEQ ID NO:2中所示的Anc80核酸的支架序列编码。如序列表中所示, Anc80的支架序列包含两种残基的任一种均有可能的11个位置。因此,Anc80 支架序列代表2048(211)种不同的序列。Anc81,Anc82,Anc83,Anc84,Anc94, Anc113,Anc126,Anc127和Anc110多肽的另外的支架序列显示于SEQID NO:3、5、7、9、11、13、15、17和42;这些多肽分别由显示在SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18和43中的Anc81,Anc82,Anc83,Anc84, Anc94,Anc113,Anc126,Anc127和Anc110核酸的支架序列编码。对于每个祖先序列,指示每个有可能的位置处可能的核苷酸或残基组。
为了证明本文所述的方法用于预测病毒或其部分的祖先序列的有效性,产生了在AAV Anc80节点的2048种预测的祖先序列的文库,并如本文所述,证明形成活病毒颗粒,该活病毒颗粒比用当代壳体多肽装配的病毒颗粒展现出更小的血清阳性率,在一些情况下,显著更小的血清阳性率。
制备祖先病毒颗粒的方法
在已经获得了病毒或其部分的预测的祖先序列之后,可以产生实际的核酸分子和/或多肽。基于例如计算机获得的序列产生核酸分子或多肽的方法在本领域中是已知的,并且包括例如化学合成或重组克隆。用于产生核酸分子或多肽的其它方法在本领域中是已知的,并在下面更详细地讨论。
一旦已经产生了祖先多肽,或者一旦已经产生了祖先核酸分子并表达以产生祖先多肽,可以使用例如包装宿主细胞将祖先多肽装配成祖先病毒颗粒。使用如本文所描述的一个或多个载体可以将病毒颗粒的组分(例如,rep 序列,cap序列,末端反向重复(ITR)序列)瞬时或稳定地引入到包装宿主细胞中。病毒颗粒的一种或多种组分可以基于如本文所描述的预测的祖先序列,而其余组分可以基于当代序列。在一些情况下,整个病毒颗粒可以基于预测的祖先序列。
此类祖先病毒颗粒可以使用常规方法纯化。如本文所用,“纯化的”病毒颗粒指的是从制备它们的混合物中的组分取出的病毒颗粒,所述组分如但不限于病毒组分(例如,rep序列,cap序列),包装的宿主细胞,和部分或不完全装配的病毒颗粒。
一旦装配,可以针对例如复制的能力;基因转移特性;受体结合能力;和/或在群体(例如,人类群体)中的血清阳性率筛选祖先病毒颗粒。确定病毒颗粒是否可以复制在本领域中是常规的,并且通常包括用一定量的病毒颗粒感染宿主细胞,并且确定病毒颗粒的数目是否随时间增加。确定病毒颗粒是否能够执行基因转移在本领域中也是常规的并且通常包括用含有转基因(例如可检测的转基因,如报道基因,在下面更详细地讨论)的病毒颗粒感染宿主细胞。在病毒的感染和清除之后,可评估宿主细胞中转基因的存在或不存在。确定病毒颗粒是否结合到其受体在本领域中是常规的,并且这样的方法可以在体外或体内进行。
确定病毒颗粒的血清阳性率在本领域中是常规进行的并且通常包括使用免疫测定法来确定来自个体的特定群体的样品(例如,血液样品)中的一种或多种抗体的阳性率(prevalence)。血清阳性率在本领域中理解为指群体中呈血清阳性(即,已经暴露于特定病原体或免疫原)的受试者的比例,并计算为群体中产生针对特定病原体或免疫原的抗体的受试者的数目除以在检查的群体中个体的总数。免疫测定法是本领域众所周知的,并且包括但不限于,免疫点迹(immunedot),Western印迹,酶免疫测定(EIA),酶联免疫吸附测定(ELISA),或放射性免疫测定(RIA)。如本文所指出的,祖先病毒颗粒比当代病毒颗粒(即,使用当代病毒序列或其部分组装的病毒颗粒)展现出更小的血清阳性率。仅举例而言,参见Xuet al.(2007,Am.J.Obstet.Gynecol., 196:43.e1-6);Paul et al.(1994,J.Infect.Dis.,169:801-6);Sauerbrei et al.(2011, Eurosurv.,16(44):3);和Sakhriaet al.(2013,PLoS Negl.Trop.Dis.,7:e2429),其中每篇确定在给定的群体中特定抗体的血清阳性率。
如本文所述,祖先病毒颗粒比当代病毒颗粒以更小的程度被中和。确定血清样品中的中和抗体程度的几种方法是可用的。例如,中和抗体测定测量与没有抗体的对照样品相比,实验样品含有中和感染达50%或更多的抗体浓度的滴度。还可参见Fisher et al.(1997,Nature Med.,3:306-12)和Manning et al. (1998,Human Gene Ther.,9:477-85)。
就本文示例性的祖先AAV壳体多肽而言,可以例如与AAV8壳体多肽或者包括AAV8壳体多肽的病毒颗粒,或者AAV2壳体多肽或者包括AAV2壳体多肽的病毒颗粒比较血清阳性率和/或中和的程度。本领域通常理解AAV8壳体多肽或病毒颗粒在人类群体中展现出认为较低的血清阳性率和所得的中和,而AAV2壳体多肽或病毒颗粒在人类群体中展现出被认为较高的血清阳性率和所得的中和。显然,特定的血清阳性率将取决于检查的群体以及所用的免疫学方法,但也有报道称,AAV8展现出约22%直至约38%的血清阳性率,而AAV2展现出约43.5%直至约72%的血清阳性率。参见例如,Boutin et al., 2010,“Prevalence ofserum IgG and neutralizing factors against AAV types 1,2, 5,6,8and 9in thehealthy population:implications for gene therapy using AAV vectors,”Hum.GeneTher.,21:704-12。还参见,Calcedo et al.,2009,J.Infect. Dis.,199:381-90。
预测的腺伴随病毒(AAV)祖先核酸和多肽序列
对来自编码从Anc80节点预测的祖先壳体多肽的文库的多种不同克隆进行了测序,并且代表性AAV预测祖先壳体多肽的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:19(Anc80L27);SEQID NO:20(Anc80L59);SEQ ID NO:21(Anc80L60); SEQ ID NO:22(Anc80L62);SEQ ID NO:23(Anc80L65);SEQ ID NO:24 (Anc80L33);SEQ ID NO:25(Anc80L36);和SEQ ID NO:26(Anc80L44)。本领域技术人员将理解,编码每个氨基酸序列的核酸序列可以容易地确定。
除了具有在SEQ ID NO:19、20、21、22、23、24、25或26中所示序列的预测祖先壳体多肽之外,提供与在SEQ ID NO:19、20、21、22、23、24、 25或26中所示序列的预测祖先壳体多肽具有至少95%的序列同一性(例如,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%的序列同一性)的多肽。相似地,提供了核酸,其与编码祖先壳体多肽核酸分子具有至少95%的序列同一性(例如,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%的序列同一性)的核酸。
在计算百分比序列同一性时,比对两个序列并确定两个序列之间的核苷酸或氨基酸残基的相同匹配的数目。将相同匹配的数目除以比对区的长度 (即,比对的核苷酸或氨基酸残基的数目),并乘以100,以获得百分比序列同一性值。应该理解的是,比对区的长度可以是一个或两个序列的一部分直至最短序列的全长大小。还应当理解,单个序列可以与一个以上的其它序列比对,因此,相对于每一比对区可以具有不同的序列同一性百分比值。
可以使用由Altschul等人(1997,Nucleic Acids Res.,25:33893402)所描述的算法来进行两个或多个序列的比对以确定百分比序列同一性,所述算法并入BLAST(基本局部比对搜索工具)程序,可在万维网(World Wide Web)上以 ncbi.nlm.nih.gov获得。可以进行BLAST搜索,以确定使用Altschul等人的算法比对的序列(核酸或氨基酸)和任何其它序列或其部分之间的百分比序列同一性。BLASTN是用于比对和比较核酸序列之间的同一性的程序,而BLASTP 是用于比对和比较氨基酸序列之间的同一性的程序。当使用BLAST程序来计算一种序列与另一序列之间的同一性百分比时,通常使用各个程序的默认参数。
代表性比对显示于图4A和4B及图5A和5B中。图4A和4B显示了称为 Anc80L65(SEQID NO:23),Anc80L27(SEQ ID NO:19),Anc80L33(SEQ ID NO:24),Anc80L36(SEQ ID NO:25),Anc80L44(SEQ ID NO:26), Anc80L59(SEQ ID NO:20),Anc80L60(SEQ ID NO:21)和Anc80L62(SEQ ID NO:22)的祖先AAV VP1壳体多肽的比对。在图4A和4B中所显示的比对证实在11个位点之每处预测的变异,以及在Anc80L60(SEQ ID NO:21)的位置 609E的单个非同义突变,其可以是克隆假象(artifact)。图5A和5B显示了祖先 AAV VP1壳体多肽(Anc80L65(SEQ ID NO:23),Anc80L27(SEQ ID NO:19), Anc80L33(SEQ ID NO:24),Anc80L36(SEQ ID NO:25),Anc80L60(SEQ ID NO:21),Anc80L62(SEQ ID NO:22),Anc80L44(SEQ ID NO:26)和Anc80L59 (SEQ ID NO:20))和当代AAV VP1壳体多肽(AAV8(SEQ ID NO:27),AAV9 (SEQ ID NO:28),AAV6(SEQ ID NO:29),AAVl(SEQ ID NO:30),AAV2 (SEQ IDNO:31),AAV3(SEQ ID NO:32),AAV3B(SEQ ID NO:33),和AAV7 (SEQ ID NO:34)之间的比对。在图5A和5B的比对显示祖先AAV序列具有与当代AAV序列的约85%至91%之间的序列同一性。
还提供了含有编码多肽的核酸分子的载体。载体(包括表达载体)是商品化的或可通过重组技术来产生。含有核酸分子的载体可以具有可操作连接到此种核酸分子的一种或多种表达元件,并且还可以包括序列诸如编码可选择标记(例如,抗生素抗性基因)的那些序列,和/或可用于多肽纯化中的那些序列(例如,6xHis标签)。表达元件包括指导和调节核酸编码序列的表达的核酸序列。表达元件的一个实例是启动子序列。表达元件也可以包括下列一个或多个:内含子,增强子序列,反应元件,或者调节核酸分子表达的可诱导元件。表达元件可以是细菌,酵母,昆虫,哺乳动物,或病毒来源的,并且载体可以包含来自不同来源的表达元件的组合。如本文中所使用的,可操作连接意指相对于编码序列,表达元件以下述方式放置在载体中,从而指导或调节编码序列的表达。
可以将核酸分子,例如载体(例如,表达载体,病毒载体)中的核酸分子导入宿主细胞中。术语“宿主细胞”不仅指已经接受核酸分子导入的特定细胞,而且还指这种细胞的后代或潜在后代。许多合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的;宿主细胞可以是原核细胞(例如,大肠杆菌)或真核细胞(例如,酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞,哺乳动物细胞)。代表性的宿主细胞可以包括但不限于A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、 BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、HeLa、293cells、Saos、C2C12、 L细胞、HT1080、HepG2和来源于哺乳动物(包括人,猴,小鼠,大鼠,兔和仓鼠)的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞细胞。用于将核酸分子导入宿主细胞中的方法在本领域中是公知的,并且包括但不限于,磷酸钙沉淀,电穿孔,热休克,脂转染,显微注射和病毒介导的核酸转移(例如,转导)。
关于多肽,“纯化的”是指已经从天然伴随它的细胞组分分离或纯化的多肽(即,肽或多肽)。典型地,认为多肽当它按重量计至少70%(例如,至少75%,80%,85%,90%,95%或99%)不含与它天然相关的多肽和天然存在的分子时是“纯化的”。因为化学合成的多肽本来与天然伴随它的组分分离,所以认为合成多肽是“纯化的”,但是还可以从用于合成多肽的组分(例如,氨基酸残基)取出。关于核酸分子,“分离的”指的是与在基因组中与它通常相关的其它核酸分子分离的核酸分子。此外,分离的核酸分子可以包括工程化的核酸分子,如重组或合成的核酸分子。
可以通过已知的方法如DEAE离子交换,凝胶过滤,和/或羟磷灰石层析从天然来源(例如生物样品)获得(例如,纯化)多肽。纯化的多肽也可以例如通过在表达载体中表达核酸分子或通过化学合成来获得。可以使用任何合适的方法,例如,柱层析,聚丙烯酰胺凝胶电泳,或HPLC分析测量多肽的纯度。类似地,使用常规方法,如但不限于重组核酸技术(例如,限制性酶消化和连接)或聚合酶链式反应(PCR;参见例如PCR Primer:A LaboratoryManual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)可以获得(例如,分离)核酸分子。此外,可以化学合成分离的核酸分子。
使用祖先病毒或其部分的方法
如本文所述的祖先病毒或其部分,特别是相对于当代病毒或其部分展现出降低的血清阳性率的那些祖先病毒或其部分,可以用于许多的研究和/或治疗应用中。例如,如本文所述的祖先病毒或其部分可以用于人或动物医学中以用于基因治疗(例如,用于基因转移的载体或载体系统中)或用于疫苗接种 (例如,用于抗原呈递)。更具体地,如本文所述的祖先病毒或其部分可用于基因添加,基因增大(augmentation),多肽治疗剂的遗传递送,遗传疫苗接种,基因沉默,基因组编辑,基因疗法,RNAi递送,cDNA递送,mRNA递送, miRNA递送,miRNA海绵擦拭(miRNA sponging),遗传免疫,光遗传学基因治疗(optogenetic genetherapy),转基因作用(transgenesis),DNA疫苗接种或 DNA免疫。
可以用祖先病毒或其部分在体外(例如,在培养中生长)或在体内(例如,在受试者中)转导或感染宿主细胞。本文描述了可以用祖先病毒或其部分在体外转导或感染的宿主细胞;可以用祖先病毒或其部分在体内转导或感染的宿主细胞包,但不限于,脑,肝,肌肉,肺,眼(例如,视网膜,视网膜色素上皮),肾脏,心脏,性腺(例如,睾丸,子宫,卵巢),皮肤,鼻道,消化系统,胰,胰岛细胞,神经元,淋巴细胞,耳(例如,内耳),毛囊和/或腺体 (例如甲状腺)。
可以修饰如本文所述的祖先病毒或部分以包括转基因(与其它病毒序列为顺式或反式)。转基因可以是例如报道基因(例如,β-内酰胺酶,β-半乳糖苷酶(LacZ),碱性磷酸酶,胸腺激酶,绿色荧光多肽(GFP),氯霉素乙酰转移酶(CAT),或萤光素酶,或是融合多肽,其包括抗原标签域如血凝素或Myc) 或治疗性基因(例如,编码激素或其受体,生长因子或其受体,分化因子或其受体,免疫系统调节剂(例如,细胞因子和白细胞介素)或其受体,酶, RNA(例如,抑制性RNA或催化性RNA),或靶抗原(例如,致癌抗原,自身免疫抗原)的基因)。
特定转基因将至少部分取决于正在治疗的特定疾病或缺陷。仅举例而言,可将基因转移或基因治疗应用于以下疾病的治疗:血友病,色素性视网膜炎,囊性纤维化,利伯先天性黑朦(leber congenital amaurosis),溶酶体贮积症,先天性代谢缺陷(inbornerrors of metabolism)(例如,先天性氨基酸代谢缺陷(inborn errors of amino acidmetabolism),包括苯丙酮尿(phenylketonuria),先天性有机酸代谢缺陷(inborn errorsof organic acid metabolism),包括丙酸血症(propionic academia),先天性脂肪酸代谢缺陷(inborn errors of fatty acid metabolism),包括中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency,MCAD)),癌症,全色盲(achromatopsia),锥-视杆营养不良(cone-rod dystrophies),黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性),脂多肽脂酶缺陷,家族性高胆固醇血症,脊髓性肌萎缩,杜氏肌营养不良(Duchenne’s muscular dystrophy),阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease),帕金森氏病(Parkinson’s disease),肥胖,炎性肠紊乱(inflammatory bowel disorder),糖尿病,充血性心脏衰竭,高胆固醇血症(hypercholesterolemia),听力丧失,冠状动脉心脏疾病(coronary heart disease),家族性肾淀粉样变性(familial renal amyloidosis),马方综合征(Marfan’s syndrome),致死性家族性失眠(fatal familial insomnia),Creutzfeldt-Jakob病,镰状细胞病(sickle-cell disease),亨廷顿氏病(Huntington’sdisease),额颞叶退化(fronto-temporal lobar degeneration),Usher综合征,乳糖不耐受症(lactose intolerance),脂肪沉积症 (lipid storage disorder)(如C型Niemann-Pick症),Batten病,无脉络膜 (choroideremia),糖原贮积病II型(庞皮病(Pompedisease)),运动失调性毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia)(Louis-Bar综合征),先天性甲状腺功能减退症(congenital hypothyroidism),严重联合免疫缺陷(severecombined immunodeficiency,SCID),和/或肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis,ALS)。
转基因也可以是例如可用于免疫受试者(例如,人类,动物(例如,伴侣动物,农场动物,濒危动物)的免疫原。例如,免疫原可从获自生物体(例如,病原性生物体)或其免疫原性部分或组分(例如毒素多肽或其副产物)。举例而言,可以获得免疫原性多肽的病原性生物体包括病毒(例如,微小核糖核酸病毒,肠道病毒,正粘病毒,呼肠孤病毒(reovirus),逆转录病毒),原核生物 (例如,肺炎球菌(Pneumococci),葡萄球菌(Staphylococci),李斯特菌(Listeria),假单胞菌(Pseudomonas))和真核生物(例如,阿米巴病(amebiasis),疟疾(malaria),利什曼病(leishmaniasis),线虫)。将理解,本文描述的方法和通过此种方法产生的组合物不受任何特定转基因的限制。
可将通常悬浮在生理上相容的载体中的祖先病毒或其部分施用于受试者(例如人或非人哺乳动物)。合适的载体包括盐水(其可以用多种缓冲溶液 (例如,磷酸盐缓冲盐水)配制),乳糖,蔗糖,磷酸钙,明胶,葡聚糖,琼脂,果胶和水。以足够的量施用祖先病毒或其部分以转导或感染细胞,并提供基因转移和表达的足够水平从而提供治疗益处且没有不适当的副作用。常规和药学可接受的施用途径包括但不限于直接递送至器官,如例如肝或肺,经口,鼻内,气管内,通过吸入,静脉内,肌内,眼内,皮下,皮内,跨粘膜,或通过其它施用途径。根据需要,可以组合施用途径。
施用于受试者的祖先病毒或其部分的剂量将主要取决于诸如正在治疗的状况,以及受试者的年龄,体重,和健康等因素。例如,待施用于人类受试者的祖先病毒或其部分的治疗有效剂量通常是在从大约0.1ml至约10ml 溶液的范围中,所述溶液含有约1×101至1×1012基因组拷贝(GCS)的浓度的祖先病毒(例如,约1×103至1×109GCS)。转基因的转导和/或表达可以在施用后在多个时间点通过DNA,RNA或蛋白质测定法进行监测。在一些情况下,可以监测转基因的表达水平,以确定剂量的频率和/或量。与那些对治疗目的描述的剂量方案相似的剂量方案也可用于免疫。
本文描述的方法还可以用于对向前进化(forward evolution)建模,以便修饰或除去病毒或其部分的一种或多种免疫原性域。
根据本发明,可以采用本领域的技术范围内的常规分子生物学,微生物学,生物化学和重组DNA技术。这些技术在文献中充分解释。本发明将在以下实施例中进一步描述,所述实施例不限制权利要求书中描述的方法和组合物的范围。
实施例
实施例1:祖先序列的计算机预测
从许多公共数据库(包括GenBank)获得AAV壳体的一组75个不同的氨基酸序列,并使用PRANK-MSA算法,版本121002,用选项“-F”比对序列。
将ProtTest3(参见例如Darriba et al.,2011,Bioinformatics,27(8):1164-5;在万维网上以darwin.uvigo.es/software/prottest3可得到)用于在不同条件下(例如在ProTest3中包含的那些条件,即“+I”,“+F”,“+G”和其组合)评估多肽进化的不同模型(例如,在ProTest3中包含的那些模型,即JTT,LG,WAG,VT, CpRev,RtRev,Dayhoff,DCMut,FLU,Blosum62,VT,HIVb,MtArt,MtMam)。基于如在ProTest3中实施的Aikake信息标准(AIC;Hirotugu,1974,IEEE Transactions on Automatic Control,19:716-23)得分选择JTT模型(Jones et al., 1992,Comp.Appl.Biosci.,8:275-82)与+G和+F(Yang,1993,Mol.Biol.Evol., 10:1396-1401;及Cao et al.,1994,J.Mol.Evol.,39:519-27)。
使用PhyML(Guindon and Gascuel,2003,Systematic Biology,52:696-704) 构建AAV进化的系统发生。参见图3。使用具有4个离散取代类别和估计的 Gamma形参数的JTT+F取代模型产生树。通过近邻交换(Nearest Neighbor Interchange)(NNI)和子树修剪(Subtree Pruning)和再移植术(SPR)改进得到的树,并通过自助法和近似似然比检验(aLRT;Anisimova and Gascuel,2006, Systematic Biology,55:539-52)使用“SH-Like”变体评估显著性。
然后,将以上构建的系统发生树用于在系统发生内部的每个节点估计 AAV壳体的祖先状态。使用最大似然原则通过Lazarus(Sourceforge at sf.net) 中包括的最大似然系统发生分析(Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood,PAML)软件(Yang,1997,Comp.Applic.BioSci.,13:555-6;在万维网abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html上可得到)重构建祖先壳体序列。更具体地,设置了Lazarus/PAML重构建,使用JTT+F取代模型使用4-gamma分布类别以产生氨基酸的重构建。将AAV5用作外类群(outgroup)。最后,加入了“I”选项以在PAML重构建完成后放置插入缺失(indel)(即二元编码并使用 Fitch算法通过最大简约性(Maximum Parsimony)放置)。
因为以最大似然的方式进行重构建,所以可以计算在给定节点的给定位置的任何残基的可能性。要做到这一点,编写了其他脚本来鉴定沿着序列的具有某个阈值下方的计算的后验概率的所有位置。选择了0.3的阈值,这意味着将具有大于0.3的计算的后验概率的任何氨基酸包括在文库的合成中。将这些残基选择为文库中感兴趣的变体。
为了最终确定(finalize)序列,必须编码附加效用工具(additional utility)来选择密码子。编写了脚本以得出与另一个AAV序列(AVVRh10,其具有与 Anc80支架序列约92%的序列同一性)密码子类似的密码子,并应用新算法取代密码子,在那里基于密码子取代矩阵有序列错配。新算法显示如下:
给定:氨基酸序列,Pt,具有相应的核苷酸序列,NT,其中Nt编码Pt;和蛋白质序列,Pi,其中Pi展现出与Pt的强同源性。
使用Needleman-Wunsch使用用于评分的Blosum62表比对Pi与Pt。通过步进(stepping)通过蛋白质比对使用来自Nt的相应密码子产生新的核苷酸序列, Ni。
其中Pt中的氨基酸与Pi中的氨基酸完全匹配,
来自密码子-PAM矩阵(Codon-PAM matrix)(Schneider et al.,2005,BMCBioinform.,6:134))的“最好得分”密码子,在那里有取代,
缺口,在那里与Pt中的氨基酸比对的Pi中存在缺口,和
在Nt中最经常出现的核苷酸(编码给定氨基酸),在那里与Pt中的缺口比对的Pi中存在氨基酸。
此外,还产生两个单核苷酸变化以消除装配激活蛋白 (assembly-activatingprotein)(AAP)的转录,所述装配激活蛋白在野生型AAV 中的AAV壳体基因内的框外编码。因为AAP(当代或祖先)的编码不是本重构建的一部分,所以通过在cap序列中产生同义突变消除AAP的表达,并且在病毒产生期间以反式提供AAP序列。
实施例2:祖先AAV VP1序列的表达
进行实验以确定预测的祖先AAV壳体序列是否可用于制备病毒载体。
克隆了许多预测的祖先AAV壳体序列。将祖先壳体文库转移到rep-cap表达质粒,使得能够在瞬时转染中形成病毒颗粒。为了维持VP1,VP2和VP3 的适当的表达水平和剪接,通过切割位于rep编码序列中的cap的5’的HindIII 和在cap终止密码子和多聚腺苷酸化信号之间工程化改造的SpeI,克隆了文库 cap基因。因此,为了将祖先壳体克隆到更常规的“REP/CAP”构建体中,用HindIII和SpeI消化传代质粒,凝胶纯化,并连接到经相似消化的rep/cap质粒中。
表达的多肽分别在10%SDS凝胶上解析。如图6中所示,壳体多肽是适当表达的,并从多个祖先AAV序列(Anc80L44,Anc80L27和Anc80L65)以及从当代AAV序列,AAV2/8剪接成VP1,VP2和VP3。
实施例3:病毒滴定
通过瞬时共转染编码病毒颗粒装配需要的所有元件的质粒在HEK293细胞中产生了AAV。简言之,培养HEK293细胞至90%汇合,并用以下转染所述HEK293细胞:(a)编码侧翼是AAV2 ITR的萤光素酶转基因(通过CMV启动子表达)的病毒基因组质粒,(b)编码本文所公开的AAV2 rep和合成的壳体蛋白的AAV包装质粒,(c)AAV2-AAP表达壳体,以及(d)AAV包装和装配需要的腺病毒辅助基因。细胞在37℃培养2天,收获并收集细胞和培养基。
通过连续3次冻融循环裂解细胞培养基悬液。之后,通过离心澄清裂解物,并在进行彻底的DNA消化的条件下用酶(本文用BenzonaseTM)处理,以消化存在于病毒颗粒外的任何DNA。稀释AAV制备物以落入对照DNA模板的线性测量范围内,在这种情况下,与载体基因组相比具有相同的TaqManTM引物和探针结合序列的线性化质粒。用退火至选择的病毒载体基因组的引物和探针进行TaqManTM PCR。基于TaqManTM测量以每毫升(ml)中的基因组拷贝(GC)计算滴度,如下面的表2中显示。
表2
滴度(GC/ml) | 小规模#1 | 小规模#2 |
AAV2/2 | 1.12x 109 | 1.99x 109 |
AAV2/8 | 4.17x 1010 | 5.91x 1010 |
Anc80L27 | 8.01x 108 | 1.74x 109 |
Anc80L44 | 1.52x 109 | 1.43x 109 |
Anc80L65 | 1.42x 109 | 2.05x 109 |
无壳体对照 | 5.23x 105 | 7.25x 105 |
在祖先重构建的AAV壳体颗粒上的小规模载体生产结果表明类似于AAV2,但相对于AAV8减少(这两者都是基于当代AAV的载体制备物)的产率。
实施例4:体外病毒转导
进行体外病毒转导以评价含有预测的祖先AAV序列的病毒感染细胞的能力。
在使用Anc80序列文库进行高通量载体生产后,用每一病毒载体转导 HEK293细胞种。除了Anc80序列之外,每个病毒载体含有萤光素酶转基因。在将萤光素底物加入到经转导的细胞或细胞裂解物中之后,通过在96孔平板读数器中定量生物发光测量萤光素酶。在定量后,产生了在四个级联96孔板中的萤光素酶表达的热图(排除在每个板中的对照栏)。由于与高通量载体量生产过程相关联的大量插入,缺失,和转换,许多载体是非功能性的。对于本文的目的,仅进一步评估了在此测定中(即,能够转导HEK293细胞并表达转基因)的功能性病毒。
用两个当代AAV载体(AAV2/2和AAV2/8)和三个预测的祖先AAV载体 (Anc80L27,Anc80L44,和Anc80L65)以每细胞1×104个基因组拷贝(GC)的相等的多重感染(MOI)转导HEK293细胞。每个载体含有萤光素酶编码转基因或eGFP编码转基因。60小时后使用AMGEvosFl光学显微镜的GFP通道对细胞成像。图7显示在体外转导之后的萤光素酶表达。每一祖先AAV病毒表明 HEK293细胞的有效转导。
实施例5-体内视网膜转导
进行视网膜转导以确定祖先AAV载体是否能够在体内靶向鼠视网膜细胞。
用2×108基因组拷贝(GC)的三种不同的祖先AAV(Anc80L27,Anc80L44,和Anc80L65)和当代AAV(AAV2/8)转导鼠眼,它们全部包括eGFP编码转基因。对于转导,经由用注射装置递送载体推注(vector bolus),通过产生在光感受器和视网膜色素上皮层之间的空间以外科手术将每个AAV载体递送到视网膜下方。将载体推注留在视网膜下间隙,并且随着时间的推移解决视网膜分离。通过用TropicamideTM对瞳孔散大后的动物视网膜进行底部照相术非侵入性监测GFP表达。所有呈现的视网膜表明将祖先AAV不同程度成功靶向视网膜。
还进行视网膜组织学,并在荧光显微术下可视化以鉴定经转导的细胞类型。在用如上所述的Anc80L65祖先AAV载体转导的鼠视网膜上进行组织学。 Anc80L65介导的eGFP表达在外核层(ONL),内节(IS),和视网膜色素上皮 (RPE)中是明显的,指示祖先Anc80L65载体靶向鼠光感受器和视网膜色素上皮细胞。
实施例6:中和抗体测定
进行中和抗体测定,以评估祖先AAV病毒是否比当代AAV病毒对抗体中和更具抗性。中和抗体测定测量相比于不存在抗体的情况下的对照,中和感染达50%或以上的抗体浓度(或实验样品包含抗体浓度的滴度)。
2倍连续稀释血清样品或IVIG储备溶液(200mg/ml),并且未稀释和稀释的样品与104MOI的祖先AAV病毒,Anc80L65和当代AAV病毒,AAV2/8,在在37℃下共温育约30分钟。每个病毒包括萤光素酶基因。然后将混合载体和抗体样品转导到HEK293细胞中。对于这些实验,所用的抗体样品是静脉内免疫球蛋白(IVIG),从超过1000名血液供体(市售,例如,GammagardTM(Baxter Healthcare;Deerfield,IL)或GamunexTM(Grifols;Los Angeles,CA))的血浆中提取的汇集的IgG。转导起始后48小时,通过生物发光测定细胞以检测萤光素酶。中和抗体滴度通过鉴定达到50%或以上的中和(样品转导/在不存在样品的情况下的对照病毒的转导)的样品的稀释度确定的。
实施例7:Anc80的表征
根据本文中描述的方法,获得了最可能的Anc80序列(如通过后验概率确定的),并且称为Anc80L1(SEQ ID NO:35显示Anc80L1壳体的核酸序列并且 SEQ ID NO:36显示Anc80L1 VP1多肽的氨基酸序列)。还使用本文描述的序列通过商业公司合成Anc80概率文库并亚克隆到表达载体中。
在联合测定中克隆评估Anc80文库的载体产率和感染力。在筛选中,进一步表征了Anc80L65(SEQ ID NO:23)以及其他多种变体。
在序列差异方面比较了Anc80文库和Anc80L65(图8;从对角线向上%,以下的氨基酸差异#)。使用NCBI-BLAST,与Anc80L65最接近的公开可获得的序列是rh10(GenBank登记号AAO88201.1)。
图9显示了Anc80L65产生与AAV2相当的载体产率(图A),在透射电镜法(Transmission Electroscopy,TEM)下产生病毒颗粒(B图),并且基于变性条件下的SDSPAGE(C图)和使用AAV壳体抗体B1进行的Western印迹法(图D)在生物化学上产生AAV cap和VP1,2和3蛋白质。这些实验在下面的段落中更详细地描述。
简要地,小规模生产了含有报道构建体的AAV2/8,AAV2/2, AAV2/Anc80L27,AAV2/Anc80L44,和AAV2/Anc80L65载体,所述报告构建体由CMV启动子控制下的eGFP和萤火虫萤光素酶构成。然后通过qPCR获得病毒的这些小规模制备物的滴度。基于这些实验,发现Anc80L27,Anc80L44 和Anc80L65载体产生与AAV2的病毒水平相当的病毒水平(图9A)。
为了确认组装成合适大小和构象的完整病毒样颗粒的Anc80L65壳体蛋白,使用透射电子显微术(TEM)获得显微照片。将大规模的纯化的 Anc80-L065制备物装载到Formvar涂覆的铜网格上,然后用乙酸双氧铀 (uranyl acetate)染色。显微照片揭示了具有20至25nm之间直径的完整的,六角形的颗粒(图9B)。
为了确定是否适当地加工了(即剪接和表达)合成的祖先壳体基因,在变性条件下将AAV2/8,AAV2/2,和AAV2/Anc80L65载体的大规模纯化的制备物装载到SDS-PAGE凝胶(1E10 GC/孔)。对于每一种载体制备物,代表病毒壳体蛋白VP1,VP2和VP3的条带清楚地存在(图9C)。用AAV壳体抗体B1 进行的Western印迹法进一步证实这些条带代表预测的蛋白质(图9D)。
此外,图10显示相对于AAV2和/或AAV8对照,使用GFP作为读出(图A) 或萤光素酶(图B),Anc80L65以MOI 10E4GC/细胞在HEK293细胞上体外感染哺乳动物组织和细胞。在IV注射编码核LacZ转基因的指定AAV后(顶行,图 C),在直接肌内(IM)注射编码GFP的指定AAV后(中间行,图C),和在视网膜下注射编码GFP的指定AAV后(底行,图C),Anc80L65也有效靶向肝。这些实验在下面的段落中更详细地描述。
为获得祖先病毒体的感染性的相对测量,产生含有双顺反子报道构建体的AAV2/2,AAV2/8,AAV2/Anc80L65,AAV2/Anc80L44,AAV2/Anc80L27, AAV2/Anc80L121,AAV2/Anc80L122,AAV2/Anc80L123,AAV2/Anc80L124,和AAV2/Anc80L125的粗制制备物,所述双顺反子报道构建体包括在CMV启动子控制下的eGFP和萤火虫萤光素酶。然后以1E4GC/细胞的MOI(通过如上所述的qPCR获得的滴度)用每一载体转导以HEK293细胞汇合的96孔板。48 小时后,荧光显微术确认在经转导的细胞中GFP的的存在(图10A)。然后测定细胞的萤光素酶的存在(图10B),这确定了用Anc80衍生的载体转导的细胞中萤光素酶的表达是在用AAV8转导的细胞(较低水平的转导)和在用AAV2转导的细胞(较高水平的转导)的表达之间。
为了评估在体内情况下基因转移的相对效率,得到AAV2/2,AAV2/8和 AAV2/Anc80L65的纯化的高滴度的制备物。在全身麻醉后通过IP注射将 3.9E10 GC的每个载体(其壳体化在TBG启动子控制下的编码核LacZ的转基因)注射到C57BL/6小鼠(每个条件3只小鼠)中。注射后28天,将小鼠处死并收集组织。通过标准组织学技术对肝切片,并针对β-半乳糖苷酶染色。然后在显微镜下对切片成像,并且代表性图像显示于图10C,顶行。
然后获得相同血清型的载体,其含有pCASI启动子控制下的编码eGFP 和hA1AT的双顺反子转基因。为了评估Anc80L65转导鼠骨骼肌的能力,在全身麻醉后将1E10GC的每一载体注射到C57BL/6小鼠的骨骼肌中(每种条件5 只小鼠)。注射后28天,处死小鼠,冰冻切片组织,并且用荧光共焦显微术评估eGFP的存在(蓝色是DAPI,绿色是EGFP)。代表性的图像显示于图10C,中间行。这些实验表明,Anc80L65载体能够通过肌肉内注射转导鼠骨骼肌。
获得了相同血清型的载体,此次壳体化在CMV启动子控制下的仅编码 eGFP转基因的构建体。在全身麻醉后将2E9颗粒经视网膜下(sub-retinally)注射到C57BL/6小鼠中。注射后28天,处死小鼠,收集眼睛,冰冻切片,并且用荧光共焦显微镜评估eGFP的存在(蓝色是DAPI,绿色是EGFP)。代表性的图像显示于图10C,底行。这些实验表明,Anc80L65载体能够以与AAV8载体相当的水平转导鼠视网膜。
简言之,获得了AAV2/8,AAV2/2,AAV2/rh32.33和AAV2/Anc80L65病毒载体的纯化的高滴度制备物,所述病毒载体壳体化包括在CMV启动子控制下的eGFP和萤火虫萤光素酶双顺反子转基因。然后将这些载体与两倍连续稀释的IVIG(10mg,5mg,2.5mg等)一起温育或不与IVIG温育(每种条件1E9 GC)。温育后,以每孔1E4MOI(每孔一个稀释度)将载体用于转导HEK293细胞。48 小时后,通过发光测定法测定萤光素酶的相对量。
实施例8:其他祖先AAV壳体的产生
然后通过商业实验室(Gen9)合成最有可能的祖先AAV壳体序列(如通过后验概率确定)并以线性dsDNA提供。然后将这些氨基酸序列与现存AAV的氨基酸序列相比较以确定它们不同的程度(图11)。每一祖先VP1蛋白与选择的代表性现存AAV的VP1蛋白相差3.6%-9.3%(图11A),而祖先VP3蛋白相差 4.2%-9.4%(图11B)。在对VP1具有89%序列同一性的情况下,Anc110是与 AAV9(一种有效的CNS转导载体)最接近的重构建的祖先载体。将这些壳体各自通过限制酶消化(HindIII&SpeI)和T4连接亚克隆到AAV生产质粒 (pAAVector2/空)。这些克隆通过限制性消化和Sanger测序来确认,然后产生了中等规模的质粒DNA的制备物。
然后将这些质粒中的每一个用于产生AAV载体,其含有编码eGFP和萤火虫萤光素酶两者的报告基因。如前所述,小规模一式三份产生这些载体。然后通过qPCR滴定病毒的粗制备物并发现相对于AAV8产生2.71%至183.1%的病毒颗粒(图12和13)。Anc110的产量和感染性数目与报道的针对AAV9的那些相似。然后,将这些滴度用于设立滴度对照实验以评估相对感染性。 Anc126由于其显著降低的产生而没有滴度对照,因此,关于Anc126的感染性的数据不能与实验中其他病毒的感染性准确相比。以1.9E3GC/细胞的多重感染(MOI)将其它载体用于转导HEK293细胞。
转导后60小时,通过荧光显微术评估细胞的GFP表达。除了阴性对照外,在每一种条件下检测eGFP阳性细胞(图14)。这表明预测,合成并克隆的每一种祖先序列(包括Anc110)能够产生活的,感染性的病毒颗粒。为了获得感染性的相对水平的想法,也在相同的细胞上进行萤光素酶测定法。结果指示相对于AAV8,每一个祖先载体能够转导28.3%至850.8%的HEK293细胞(图15 和16)。应该注意的是Anc110的转导效率与报道的AAV9的转导效率相似。将 Anc126排除在相对转导的分析之外,因为它没有滴度对照。
总之,合成了八种新的祖先AAV壳体基因并与AAV8,AAV2,Anc110 和前面描述的Anc80L65载体一起用于产生功能性病毒载体。在体外评估了产生和感染,那些发现的总结显示于图17。Anc110的体外产生和感染性在对 AAV9和能够通过血脑屏障的其他病毒所预期的范围内。
实施例9:载体免疫预防
在有载体(vectored)的免疫预防中,将基因治疗载体(如AAV)用于递送编码针对传染原的广谱中和抗体的转基因。参见例如Balazs et al.(2013,Nat. Biotechnol.,31:647-52);Limberis et al.(2013,Sci.Transl.Med.,5:187ra72); Balazs et al.(2012,Nature,481:81-4);及Deal et al.(2014,PNAS USA, 111:12528-32)。这种处理的一个优点是,宿主在它们自己的细胞中产生抗体,这意味着单次施用具有赋予针对病原体(etiologic agent)的终生保护的潜力。
实施例10:药物递送载体
LUCENTIS(兰尼单抗(ranibizumab))和阿瓦斯丁(AVASTIN)(贝伐单抗) 均是基于针对血管内皮生长因子A(VEGF-A)的相同的人源化小鼠单克隆抗体的抗血管生成剂。虽然贝伐单抗是完整的抗体,而兰尼单抗是片段(Fab),它们通过相同机制-通过拮抗VEGF发挥作用以治疗湿性年龄相关性黄斑变性。参见例如Mao等人(2011,Hum.Gene Ther.,22:1525-35);Xie et al.(2014, Gynecol.Oncol.,doi:10.1016/j.ygyno.2014.07.105);和Watanabe et al.(2010, Gene Ther.,17:1042-51)。由于这两种分子是蛋白质,它们可以通过DNA编码,并在用含有转基因的载体转导的细胞中产生,并且足够小从而可以被包装到AAV载体中。
实施例11-AAV壳体的祖先序列重构建
使用如Finnigan et al.(2012,Nature,481:360-4)中的最大似然性方法重构建祖先壳体序列。使用PRANK v.121002,使用-F选项(Loytynoja&Goldman, 2005PNAS USA,102:10557-62;Loytynoja&Goldman,2008Science,320:1632-5)产生75个AAV壳体(本文提供的GenBank登录号)的比对并且通过如ProtTest3(Darriba et al.,2011,Bioinform.,27:1164-5)中执行的Aikake Information Criterion将JTT+F+G模型确定为最佳拟合的系统发生模型。完全比对可以见于图25。然后通过PhyML 3.0(Guindon et al.,2010,System.Biol., 59:307-21)将比对和最佳拟合模型用于推测系统发生,其通过如PhyML中执行的合适的似然性比测试(aLRT)(Anismova&Gascuel,2006,Syst.Biol., 55:539-52)进行评估。与分析中包括的所有AAV的系统发生的详细版本示于图26中。然后使用PAML 4.6(Yang,2007,Mol.Biol.Evol.,24:1586-91)通过 Thornton组开发的Lazarus包推测祖先壳体序列。如本文所示,Anc110重构建的祖先载体在进化上与AAV9和Rh.8(已知为有力的CNS转导载体)相近。
为了补偿重构建内在的不确定性,编写了一个脚本来评估计算后验概率以确定鉴定模糊重构建的位点。包括沿祖先重构建壳体的具有多于一个具有后验概率大于0.3的氨基酸的所有位置。鉴定了11个这样的位点,每个具有两个可能的氨基酸。然后使用来自现代病毒(rh.10)的密码子将这11个二态性位点掺入到DNA文库中。因为重构建不考虑AAP和壳体的共进化,所以在文库设计过程中通过将非典型CTG起始密码子转变成CAG来消除AAP开放阅读框。此外,通过将密码子改变成AAG来消除也在AAP ORF中的另一个下游 ATG。这些修饰不改变cap ORF中的氨基酸。然后通过DNA2.0来合成DNA文库,随后通过限制性内切酶消化和连接将其亚克隆至表达载体中。
实施例12-载体和序列
用现存或祖先病毒壳体假型化腺伴随病毒载体。现存的壳体包括AAV1 (GenBank登录号AAD27757.1),AAV2(GenBank登录号AAC03780.1),AAV5 (GenBank登录号AAD13756.1),AAV6.2(GenBank登录号EU368910),Rh.10 (GenBank登录号AAO88201.1),AAV8(GenBank登录号AAN03857.1),AAV9 (GenBank登录号AAS99264.1),和Rh32.33(GenBank登录号EU368926)。祖先AAV壳体包括Anc80L65,Anc81,Anc82,Anc83,Anc84,Anc110,Anc113, Anc126,和Anc127(提交给GenBank待定)。载体转基因盒包括CMV.eGFP.T2A.ffLuciferase.SVPA,CMV.ffLucifease.SVPA.(体外研究), TBG.LacZ.RBG(肝),TBG.eGFP.WPRE.bGH(肝和肌肉免疫研究), CASI.hA1AT.FF2A.eGFP.RBG(肝,肌肉),和CMV.eGFP.WPRE(视网膜)。
实施例13-序列-结构分析
使用AAV8晶体结构(PDB 2QA0)作为模板,用SWISS-MODEL结构同源性建模服务器(Biasini et al.,2014,Nucl.Acids Res.,42:W252-8)产生Anc80L65 VP3的假原子模型。使用UCSF Chimera包(Pettersen et al.,2004,J.Comp. Chem.,25:1605-12),根据残基保守性进一步叠加AAV2(PDB 1LP3), AAV8(PDB 2QA0)和Anc80 VP3结构并进行颜色编码。然后通过用T-coffee比对包(Notredame et al.,2000,J.Mol.Biol.,302:205-17)产生的这三种血清型的 VP1/2结构域的非结构比对来产生并完成Anc80,AAV2和AAV8VP3的结构比对。分离Anc80L65和AAV8的突变的空间分布也在AAV8三聚体结构的内表面和外表面可见,其中Anc80L65和AAV8VP3的结构比对中的可变残基以蓝色表示,而多态性残基以红色表示。
实施例14-AAV祖先谱系载体的体外表征
为了鉴定和表征Anc80Lib内的功能性AAV壳体,分离来自亚克隆的DNA 文库的单独克隆并用于在具有反式提供的AAP2的6孔或96孔中产生含萤光素酶的载体。自转染起48小时后,通过0.4μm过滤器过滤细胞裂解物来分离粗载体。接下来,将等体积的这种粗制载体制剂加入到与HEK293细胞汇合的96孔板中,再48小时后评估所述HEK293细胞的萤光素酶活性。总共评估了776个克隆。在将AAP反式补充至祖先AAV载体的情况下,在6孔格式中通过三重转染产生含有CMV驱动的萤光素酶的载体的粗制备物。每个载体总共产生三种不同的独立生物学重复。如上定量DNAseI抗性转基因。然后在一式三份技术重复中,以1.9x103GC/细胞的MOI来评估这些病毒粗制剂各自转导HEK293细胞的能力,除Anc126(其以2.1x102-3.5x 102GC/细胞的MOI 进行添加)以外。经过48小时后,通过发光测定评估转导的细胞的萤光素酶。
实施例15-AAV载体制备
在具有近汇合的单层HEK293细胞的10层Hyperflask(Corning)中进行 AAV顺式,AAV反式和腺病毒辅助质粒的大规模聚乙烯亚胺(PEI)转染。以 2∶1∶1(260μg腺病毒辅助质粒/130μg顺式质粒/130μg转染质粒)的比率转染质粒。以与AAV顺式质粒等量的pAAP2补充用于生产Anc载体的转染。将PEI Max(Polysciences,Warrington,PA)/DNA比率维持在1.375∶1(w/w)。如前所述进行转染和下游纯化过程(Lock et al.,2010,Hum.Gene Ther.,21:1259-71)。用检测转基因盒的启动子,转基因或聚腺苷酸化信号编码区的引物和探针,通过TaqMan qPCR扩增(Applied Biosystems 7500,Life Technologies),使用 DNAseI抗性载体基因组拷贝来滴定AAV制剂。通过SDS-PAGE凝胶电泳来评估大规模制剂的纯度。
实施例16-结构和生物物理学载体表征
将5μL纯化的Anc80L65载体制剂加载到formvar涂覆的400目铜网格上并用乙酸铀酰染色,通过透射电子显微术评估Anc80L65颗粒形态。通过分析超速离心确定空/满颗粒比率。使用MIT生物物理学设施处可得的Beckman Coulter ProteomeLab XL-I分析型超速离心机分析500μL的10-30μg/mL不含甘油的Anc80L65样品的含量。该实验使用八孔(50Ti)转子在20℃,15,000rpm 下进行。通过折射率光学测量在规则时间点获得沉降分布。使用软件SEDFIT(Schuck et al.,2002,Biophys.J.,82:1096-111)解析Lamm等式,并进行沉降系数分布分析以鉴定AAV样品中包含的不同种类。通过UV荧光光谱法和差示扫描荧光(DSF)评估Anc80L065的热稳定性。对于每种血清型的色氨酸荧光((Ausar et al.,2006,J.Biol.Chem.,281:19478-88),在200μL Eppendorf管中制备6个4.5μL等分试样,在30℃,45℃,60℃,75℃,90℃或99℃温育5分钟,旋转沉降,在室温下冷却5分钟,并一式两份(每份2μL)装载到Take 3TM Micro Volume Plate(Bio-Tek)上。使用Synergy HI Hybrid PlateReader(Bio-Tek),在293nm处对样品进行照射,并且以1nm的分辨率从323至 400nm获得发射光谱。使用移动平均滤波器(跨度:15)进一步平滑样品和空白发射光谱。扣除背景后,确定每种血清型和每种温度条件下的最大发射波长。随后将这些波长值绘制为温度的函数以得出不同AAV血清型的热稳定性曲线。对于差示扫描荧光(Rayaprolu et al.,2013,J.Virol.,87:13150-60),将 25μL每种AAV补充有5XOrange(LifeTechnologies)装载到96孔PCR板中(Denville Scientific Inc.)中并在2000rpm下旋转2分钟,暴露于温度梯度(30-99℃,0.1℃/6s),同时使用Reaplex 2S MasterCycler Real-Time PCR机器(Eppendorf)(激发:450nm;发射:550nm)监测Orange染料的荧光。在每个测定中,将25μL FFB(21-031,Corning)和25μL 0.25mg/mL溶菌酶溶液(Sigma-Aldrich)(均补充有Orange)分别用作阴性和阳性对照。在不存在染料的情况下,也监测25μL AAV载体的荧光用于荧光背景扣除。在0和100%之间进一步标准化荧光强度并将其作为温度的函数进行绘图。
实施例17-鼠类实验
从Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买C57BL/6雄性小鼠 (6-8周龄)并将其保存在Schepens Eye Research Institute(SERI)动物设施中。所有动物程序均按照SERI动物护理和使用委员会所批准的方案进行。对于肝靶向的基因转移研究,接受100μl单次腹膜内注射或单次眶后窦静脉注射150μl。对于肌肉靶向的eGFP实验,将50μl注射到右后腓肠肌中。GoldenRod动物采血针(MEDIpoint,Inc.)用于颌下腺小鼠出血。棕色加盖的管(微量管1.1ml Z-Gel,Sarstedt)用于血清收集。对在28dpi载体施用时处死的小鼠的组织,包括肝,心脏,肾,肺和脾上进行载体生物分布研究。为了观察肝中的eGFP 表达,将组织在4%的多聚甲醛(PFA)中固定过夜,在磷酸盐缓冲的盐水PBS 中洗涤30分钟,依次在10%,20%和30%蔗糖梯度中温育并冰冻在O.C.T化合物(Sakura Finetek USA,Torrance,CA)中。使用β-Gal染色试剂盒(Life Technologies)测量lacZ的小鼠肝表达。将4%的多聚甲醛固定的肝组织切成 10μm。用PBS洗涤组织切片以去除残留的固定剂,并使用商业染色溶液(400mM铁氰化钾,400mM亚铁氰化钾,200mM氯化镁,X-gal 95-溴-4-氯-3- 吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷))在37℃染色0.5-2小时。在10μm处制备冷冻切片。为了观察肌肉中的eGFP表达,将组织安装在含有10%黄蓍胶(Sigma-Aldrich Cat.No.G1128)的软木盘上并使用液氮-150c冷却的异戊烷(Sigma-Aldrich 27,034-2)快速冷冻。在10μm处制备肌肉冷冻切片。以2μl的体积和每只动物2 x 109GC的绝对剂量进行视网膜下注射。将每种载体注射到每种所分析的血清型总共4只眼睛中。注射后4周使动物安乐死,并收集眼睛用于组织学分析。将去核的眼在冰上固定在4%多聚甲醛(PFA)中1小时,然后包埋在OCT中并在冷冻切片前冷冻。将视网膜切片用DAPI(1μg/ml)染色10分钟,并将载玻片安装用于共焦成像。
实施例18-非人灵长类模型
在新英格兰灵长类动物研究中心(哈佛医学院)(New England Primate ResearchCenter(Harvard Medical School))进行猕猴实验。所有实验程序均由 Office forResearch Subject Protection,Harvard Medical Area(HMA)Standing Committee OnAnimals.the Harvard Medical School Institutional Animal Care and UseCommittee批准。用氯胺酮或telazol与dexdomitor组合将动物镇静。以 20ml体积,1ml/min的速率静脉内施用表达分泌的rhCG的病毒载体。从注射中恢复后,对动物进行临床监测以获得一般健康状况,并且跟踪2个月。在此期间,定期进行静脉切开术(phlebotomy)以评估对AAV的免疫反应和毒性。 70天后,对猴实施安乐死,并收集肝样品。
实施例19-人α1-抗胰蛋白酶(hA1AT)的定量
使用ELISA定量血清样品中hA1AT的表达水平。用包被的兔抗A1AT一抗 (Sigma)以1000ng/孔包被平板并在4℃下温育过夜。将平板洗涤并封闭2小时。将血清样品稀释5倍并在4℃温育过夜。将HRP偶联的山羊抗人A1AT抗体 (Abcam)温育2小时。加入ABTS过氧化物酶底物;在1小时内使用分光光度计读板器测量OD405nm值。
实施例20-组织生物分布
用蛋白酶K消化快速冷冻组织,并且使用如所示的Blood&Cell Culture DNA Mini试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA(gDNA)。使用BioTek平板读数分光光度计(BiotekInstruments,Inc.Winooski,VT)对分离的gDNA进行定量。如前所述(Wang et al.,2010,Mol.Ther.,18:118-25),使用Applied 7500Real-Time PCR系统,利用TaqManmaster混合试剂(Applied )和转基因特异性引物/探针,通过QPCR检测并定量二倍体细胞中的病毒基因组(vg)生物分布。
实施例21-mRNA表达
使用Qiagen RNeasy mini试剂盒(Qiagen)分离总RNA。将总RNA(1μg)用DNase处理并使用Qiagen QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen)反转录成cDNA。使用Applied7500Real-Time PCR系统,利用TaqMan master混合试剂,利用特异性引物/探针反应混合物;GAPDH (Rh02621745_g1),猕猴绒毛膜促性腺激素(Rh02821983_g1)检测并定量实时mRNA表达。应用TaqMan定制引物/探针推荐的反应条件。
实施例22-中和抗体测定
除以下修改,如前所述(Calcedo et al.,2009,J.Infect.Dis.,199:381-90),在体外评估NAB。用AAV1,AAV2,AAV5,AAV6,AAV8,AAV9,rh.10 和rh32.33(来自Dr.RobertoCalcedo和James M.Wilson,UPenn的友情馈赠)(Gao et al.,2004,J.Virol.,78:6381-88)预先免疫的兔血清以1∶40至 1∶20,971,520连续稀释,并与配对血清型或携带CMV.luciferase2.SVPA转基因构建体的Anc80L65的109个GC颗粒在37℃温育1小时。然后将混合物加入24 小时之前MOI(感染复数)=20的人腺病毒5(hAd5)感染的96孔板上的HEK-293 细胞中。将细胞温育48小时后,其后加入含D-萤光素的缓冲液并使用Synergy H1微板读板器(BioTek;Winooski,VT)测量发光。将发光相对于用无血清温育的AAV感染的对照细胞标准化。与对照孔相比,在发光<50%的稀释度确定中和滴度。
实施例23-AAV壳体蛋白的计算机上(in silico)祖先序列重构建
代替试图从原病毒DNA或考古学样品中分离出完整的祖先病毒序列,通过系统发生分析和最大似然性ASR来整合当前的AAV序列数据,以推断AAV Cap的推定的祖先氨基酸序列。来自先前生物挖掘努力的总共75个序列AAV 血清型隔离群和变体(Gao et al.,2003,PNAS USA,100:6081-6;Gao et al., 2004,J.Virol.,78:6381-8;Gao et al.,2005,Current Gene Ther.,5:285-97)导致用利用AAV5为离群值(outlier)的PHYML(Guindon etal.,2010,System.Biol., 59:307-21)产生的稳健的AAV Cap系统发生。在该分析中包括仅全长AAV壳体,其(a)自然发生在灵长类群体中,(b)先前证明有效地组装和感染,以及(c)不知道通过其自然历史中的重组事件而出现,因为传统的系统发生分析和 ASR不说明水平进化事件。图18中的树状图模拟了AAV的进化路径以及 AAV4和5种血清型的早期物种形成,其平行于单个节点,命名为Anc80,从其中进化了大多数已知的现代AAV。这些血清型包括AAV1,2,8和9,目前正处于基因治疗试验的临床开发阶段。该系统发生中的节点被命名为Anc并依次编号。为了对AAV验证ASR的本文所述的方法,选择Anc80作为节点以发展成可用作基因治疗载体的重组病毒。
选择Anc80部分是因为这个节点的这种重构建由来自这个进化中间体的自然发生的AAV临床相关后代的丰度高度告知。此外,将Anc80嵌入到Dependoparvoviridae的系统发生中,其具有Anc80物种形成之前产生的已知辅助依赖性灵长类AAV(图18),使得祖先重构建的颗粒更有可能保留在该家族中共享的基本性质。使用最大似然方法,基于对特定位置中每个残基的计算后验概率,为Anc80导出蛋白质序列预测。为了说明在每个位置选择适当的氨基酸时的不确定性,目的是为具有p≥0.3的单独氨基酸后验概率的位置产生所有可能的序列排列。该文库的代表Anc80Lib与AAV2和AAV8参考壳体序列的部分结构比对示于图19A中。实际上,这导致如图18所示的概率序列空间:对于736个Anc80壳体氨基酸位置中的除11个之外的所有位置,独特的残基在ASR中占优势,而对于那11个位置提供了2个氨基酸选项,导致包含 211=2048个排列的序列空间。
Anc80Lib与现存AAV及其X射线晶体学数据的结构和序列比对突出显示与目前已知的循环AAV的显著分歧。通过BLAST搜索确定的最接近的同源物是rh.10,其为灵长类动物Dependoparvoviridae的进化枝E中的猕猴隔离群,其与Anc80Lib的差异最小为8.0%,其说明59个不同的氨基酸位置(图19B)。 AAV8和AAV2分别有9.5%和12.0%的不同,并且那70-87个可变位点遍布整个 VP1蛋白,包括VP1,2个独特的结构域(图19A,19B)。在序列上以及基于 Anc80Lib克隆与AAV2和8单体结构重叠的结构建模(图19A,19C),高变结构域I,IV,VII和VIII中的分歧最高。将可变Anc80残基作图到图19D中AAV2 和AAV8的三聚体X-射线晶体学模型上突出显示了在病毒体外表面上围绕3 重对称轴的突起的峰和侧面上发生的大部分变化。然而,除了在颗粒的内表面上以及在Cap中未在X射线结构中解析的区域上较少数量的变化之外,还在3重轴外的表面暴露的结构域上注意到显著数量的可变残基。
实施例24-Anc80合成和基本表征
随后通过基因合成以集合的文库格式逆向翻译并产生Anc80Lib蛋白序列。将壳体基因克隆到将AAV2Rep编码成pAnc80Lib的AAV包装质粒中,之后以克隆方式去卷积所述文库。分开评估单独的克隆(命名为pAnc80LX,其中X为保守数字)以避免最小差异文库群体中的潜在干扰性竞争性相互作用。将单独Anc80克隆的一部分以Sanger测序,验证完整性和复杂性要求。克隆 Anc80质粒与ΔF6腺病毒辅助质粒,源自AAV2的AAP的表达构建体(AAP2),和侧翼有ITR的编码萤光素酶的表达构建体共转染。产生总共776个文库克隆,并在HEK293细胞中以等体积的产生细胞裂解物在半高通量测定中接种,以评估组合的颗粒组装和转导效率。在这个初步的筛选测定中,大约50%的 Anc80克隆产生超过背景的可检测信号。几种具有最高萤光素酶信号的先导候选物进展到测序确认和对DNA酶抗性基因组颗粒(GC)的滴定以及HEK293 细胞的感染性。基于这些结果,选择评估的第65个Anc80Lib克隆Anc80L65用于进一步表征。来自细胞裂解物的Anc80L65载体产量介于AAV2产量的 82-167%之间,但与高产量AAV8(3-5%相对AAV8产量)相比仍受抑制。 HEK293的体外感染性不如AAV2,然而,在每个细胞的颗粒基础上优于 AAV8。
按照传统方案在碘克沙醇梯度上规模产生并纯化Anc80L65载体制剂,并进行各种生物化学,生物物理学和结构学分析。通过电子显微术(EM)在阴性染色下观察Anc80L65的纯化制剂内的颗粒(图20A)。Anc80L65病毒颗粒以直径约20-25nm的相对均匀的六角形颗粒存在,不与其他AAV壳粒不同。变性颗粒在SDS电泳下以约1∶1∶10的大约比例解析为60,72和90kDa的3条条带,对应于来自AAV2和AAV8颗粒的VP1-3蛋白质(图20B)。分析超速离心(AUC)允许测定在88.9S处含有或全部Anc80L65的基因组的沉降系数,从AAV8 (85.9S)略微增加(图20C)。该分析允许进一步确定空的或较低密度的组装颗粒的相对丰度,推测其缺乏载体基因组,以及总体纯度。令人担忧的是,对祖先壳体序列的不准确建模可能导致其包装基因组的能力缺陷的结构,并且会导致Anc80L65制剂中空相对于饱满比例的偏斜。结果显示制剂中大约有 16%是空的而85%是饱满颗粒,与AAV8的观察结果一致(图20C)。此外,假设颗粒稳定性可能由于祖先壳体组合物的次最佳建模而降低,并使颗粒进行热稳定性测定,其相对于指示的期望确定Anc80L65比其假定的AAV2和 AAV8是15-30℃更为热稳定的(图20D)。
实施例25-鼠类模型中Anc80L65的体内基因转移和转导
接下来,从C57Bl/6小鼠中的3个临床相关的靶组织和施用途径(ROA): (a)全身注射后的肝,(b)直接肌内注射后的骨骼肌,和(c)用于外层视网膜靶向的视网膜下注射评估待递送和表达的Anc80L65包装的转基因的能力。利用报道基因与AAV2和AAV8对照一起产生Anc80L65的大规模制剂并在成年雄性C57Bl/6小鼠中等量注射用于肝、肌肉和视网膜指向的基因转移。通过在不同时间点上分泌的hA1AT(肝)的血清ELISA测量定性(eGFP和/或LacZ)和定量监测所有三种靶组织的表达,在图21中呈现。通过两种施用途径和转基因观察到肝指向的基因转移是稳健的(图21A,21B,21C)。类似于AAV8,如通过LacZ和GFP染色观察到的,肝细胞被有效靶向,这超过了对AAV2所有限允许描述的(Nakai et al.,2005,J.Virol.,79:214-24;Nakai et al.,2002,J.Virol.,76:11343-9)。在数量上,Anc80证明了细胞内报道物和分泌的血清蛋白转基因产物对AAV8的相似转导效率。剂量范围研究证明了剂量高于1010GC/小鼠的基因转移的线性,但低于该阈值hA1AT的线性无法维持(并且通过eGFP较不明显)(图21B,21C)。在注射后第7天和第28天进行高剂量5 x 1011GC/小鼠的生物分布研究,以评估Anc80L65的肝,心脏,脾,肾和肺中载体基因组的组织分布,其中AAV8作为对照(表3)。结果显示在测试的组织中Anc80到 AAV8的基因转移范围类似,其中Anc80L65在脾,心脏和肺中中度增加。通过直接骨骼肌内注射,Anc80有效地靶向注射部位近端的肌纤维,并纵向延伸穿过纤维(图21A和图24)。视网膜下注射后的视网膜转导在靶向视网膜色素上皮细胞(RPE)方面是有效的,如先前所述的AAV2和AAV8中的情况。使用AAV8和Anc80L65观察到光感受器靶向,如对AAV2所记录的,其为更困难的细胞靶标。尽管AAV8和Anc80L65均靶向大多数光感受器细胞,但用 Anc80L65转导始终导致每个细胞更高的表达水平。通过Anc80L65转导也观察到内视网膜中有限数量的细胞为GFP阳性(图21A)。
表3.小鼠肝,心脏、脾、肾和肺中的载体基因组分布
实施例26-非人灵长类肝中Anc80L65基因转移和表达
鉴于Anc80L65在小鼠中稳健的嗜肝性,其目的是评估大型动物模型中 Anc80L65的基因转移。以1012GC/kg的临床相关剂量的AAV8或Anc80L65经由隐静脉注射参加先前与AAV无关研究的六只雌性猕猴(表4)。使用rhCG报道基因来表达绒毛膜促性腺激素β亚基的猕猴cDNA以避免非自体转基因免疫应答,所述绒毛膜促性腺激素是使动物变得无反应性所针对(tolarized for) 的转基因产物。将参与本实验的动物针对AAV8和Anc80L65预筛选NAB。注射前数周的NAB血清水平低于1/4滴度以纳入本研究。在注射后70-71天通过 TaqmanqPCR评估总肝DNA(尾叶)的vg的基因转移(图21D)。令人惊讶的是,可能是由于在以前的研究中报道的标准NAB测定法不可检测的注射时的低水平NAB,3只对照AAV8注射的动物中有2只的基因转移不足(<0.1vg/dg)。一只AAV8动物(可能对AAV8没有或具有最少的NAB),证明肝的基因转移水平在0.81vg/dg的预期范围内。Anc80L65基因转移显然不受NAB的阻碍(注射前没有检测到Anc80L65 NAB)并且3只动物产生范围为0.73-3.56vg/dg的肝转基因拷贝数。通过定量RT-PCR监测肝表达(图21E):Anc80L65产生优于AAV8 的表达,并且在所有肝叶中实现总GAPDH mRNA量的13-26%的rhCG转录物水平。
表4.利用通过隐静脉注射的病毒载体处理的猕猴的表征和过去临床史
实施例27-Anc80L65的安全性、免疫性和毒性
考虑使用任何有效的基因递送载体系统用于治疗应用需要广泛评估其临床使用的安全性。另外,使用可能接近Dependoparvovirus的祖先状态的新型试剂可能进一步引起这些担忧。在本文中,在非正式的临床前设置中,检查了几个重要的方面,其可能会从安全性角度限制Anc80L65。在研究的生命周期阶段期间监测动物表达研究(图21)的明显毒性迹象,并在可能程度上监测靶标组织特异性毒性。没有发现显著的不利与病毒注射有关。简言之,没有观察到腹膜内(测试的最大剂量[mdt]:3.9x 1010GC/小鼠),眼眶后静脉注射(mdt:5x 1011GC/小鼠),视网膜下(mbt:2x 109GC/眼),玻璃体内(mbt: 2x 109GC/眼)和直接肌内(1010GC/小鼠)后的载体施用具有明显的毒性。以高剂量静脉注射5x 1011GC/小鼠(大约2x1013GC/kg)的Anc80L65.TBG.eGFP与下列对照一起进行更直接的评估:(a)具有相同转基因盒的AAV8,和(b)等体积生理盐水注射。在注射前,注射后2小时,1天,3天,7天,14天和28天将小鼠进行静脉切开术并分析血液的细胞血液计数(CBC)和血清化学 (Chem)(表5和表6),这在Anc80L65的对照的范围内或与其相当,因此没有引起重大担忧。通过多重23细胞因子分析对来自2小时,24小时,3天和7天时间点的血清进一步评估细胞因子作为对载体抗原的先天性免疫应答的量度 (表7)。用于Anc80L65的细胞因子与盐水和AAV8对照血清的那些细胞因子总体一致,并且没有观察到主要的细胞因子升高或降低,但是在一些情况下以对Anc80L65比对AAV8更明显的方式适度地在盐水对照值设定的范围外。对来自图21D和21E中描述的猕猴研究的血液上进行类似的分析。与小鼠研究类似,从获得的CBC和Chem值中未鉴定出与AAV8或Anc80L65测试物相关的毒性迹象(表8和9)。
已知对AAV-血清型的预存免疫性阻断基因转移,并且由于唤醒针对参与初次感染的天然发生的野生型病毒共有的载体抗原的记忆T细胞,可以使得患者处于不利风险中。使用针对AAV-血清型1,2,5,6.2,8,9和rh.32.33 产生的高滴度兔抗血清。也包括rh.10,因为它的序列与Anc80L65最接近同源,在8.0%的残基上有差异。在图22A中,对血清测试其中和Anc80L65相对于其生成所针对的同源载体壳体的能力。结果证明对AAV5和rh32.33(结构上高度不同的AAV)没有交叉反应性,而AAV2,6.2和8(Anc80L65的推测后代) 证明低水平的交叉反应性,尽管其水平是同源抗血清滴度的16倍或更低。在Anc80谱系成员中,在AAV9和rh.10的灵敏度极限以上没有观察到交叉反应。接下来,目的是通过肌内途径针对AAV8预免疫动物并且在免疫后25天评估静脉内注射后与AAV8相比的Anc80L65的中和而在体内模型中验证中和的这些结果(图22B)。在AAV8预免疫动物中对AAV8的中和是彻底的。在2/5只动物中Anc80L65被中和,但在3/5只动物中表现出60-117%的转导,尽管在那些动物中证明了AAV8 NAB。这些结果证明Anc80L65与AAV8在兔和小鼠中的部分交叉反应性。
实施例28-AAV谱系分析和重构建
通过基于ASR的Anc80L65的成功合成及其证明为基因治疗的可生产,稳定且高度感染性的试剂的加强,其目的在于通过进一步重构建AAV谱系来提供对方法和建模方法的额外验证。产生这些额外试剂组的目标是提供Anc80 的结构中间体和现存的AAV,其将使得能够对该病毒家族内的结构-功能关系进行实证评估,并突出显示对未来AAV合理设计方法有用的重要上位偶联。通过ASR重构建AAV总共8个额外的进化中间体并在实验室合成(图18): Anc81,Anc82,Anc83,Anc84,Anc110和Anc113在导向AAV7,8和/或9的分枝中被解析,而Anc126和Anc127位于AAV1,2和/或3的自然史中。对于这些中的每一个,通过选择每个位置具有最高后验概率的氨基酸来确定序列。首先,在载体组分的HEK293标准三重转染和使用Taqman qPCR(对于载体基因组)的腺病毒帮助中测定GC病毒载体产量。图23A中显示的结果证明Anc80 作为AAV7-9谱系中推测的祖先生产力提高,这与那些血清型如AAV8的更高产量一致。AAV1-3分枝没有呈现产量增加,并且观察到Anc126的非常差的颗粒产量。通过利用统计空间可以提高Anc126的产量是可能的,就像Anc80 的情况一样,然而,由于AAV系统发生的这一分枝的采样不足,同样可能不太了解Anc126 ASR。通过GFP和萤光素酶在HEK293上进一步体外测试在相同颗粒剂量下产生的颗粒的感染性。然而,所有新合成的Anc载体都表现出不同程度的感染性(图23B)。在AAV7-9谱系中,感染性滴度总体下降,并且与Anc80表型相比更类似于AAV8表型。与Anc80和AAV2相比,Anc127(Anc80 至AAV2谱系的唯一中间体,其可以以等剂量测试)证明下降的转导效率。进一步测试该谱系的两个分枝中所选的进化中间体的热稳定性谱(图23C)。有趣的是,与Anc80L65相比,Anc81和Anc82在热稳定性测定中证明高但适度降低的解链温度,表明该分枝中随着进化龄,热稳定性可能逐渐降低。相反,Anc127证明已经高度耐热的Anc80L65载体的甚至进一步增加。
最后,探讨了ASR破坏针对AAV2的已知表位的能力。迄今为止,仅有少数B或T细胞表位被作图到AAV2上,所有这些都被作图到代表AAV2谱系的Anc80L65,Anc126,Anc127和AAV2上。在图22C中,在这些推测的进化中间体之间引入连续突变突出显示了突变与2/4人T细胞表位和2/2小鼠B细胞表位之间的重叠。这些数据突出了ASR用作消除或调节抗原区域至AAV壳体上的方法的潜力,并且可能表明免疫力是AAV自然史中的主要选择性压力。
实施例29-Anc110的体内功能性
进行实验以评估C57B1/6小鼠中Anc80,Anc81,Anc82和Anc110相比于 AAV9对萤光素酶的肝转导。图27中的结果证明,在静脉内注射指示的载体后,基于萤光素酶报道基因的转基因表达,Anc110在C57B1/6小鼠中显示出与AAV9相同水平的肝靶向。值得注意的是,AAV9目前正在进行临床研究。
其他实施方案
应理解虽然本文中已经结合多个不同方面描述了方法和物质组合物,但是前述多个方面的描述旨在说明而不是限制方法和物质组合物的范围。其他方面,优点和修改均落入所附权利要求书的范围之内。
本文公开的是方法和组合物,它们可用于公开的方法和组合物的产物,可结合公开的方法和组合物的产物使用,可用于制备公开的方法和组合物的产物或者是公开的方法和组合物的产物。在本文中公开了这些和其他物质,并且应当理解公开了这些方法和组合物的组合,亚组,相互作用,组等。即,虽然可能没有明确地公开具体提到这些组合物和方法的每个不同个体和集体组合以及替换,但每一个是本文中特别考虑并且描述的。例如,如果公开并讨论了特定的物质组合物或特定方法并且讨论了多种组合物和方法,那么除非有明确相反的指示,明确涵盖组合物和方法的每一个组合以及替换。同样,也明确涵盖和公开了这些的任何亚组或组合。
序列表
SEQ ID NO:1:Anc80 VP1多肽
SEQ ID NO:2:Anc80 VP1 DNA
SEQ ID NO:3:Anc81 VP1多肽
SEQ ID NO:4:Anc81 VP1 DNA
SEQ ID NO:5:Anc82 VP1多肽
SEQ ID NO:6:Anc82 VP1 DNA
SEQ ID NO:7:Anc83 VP1多肽
SEQ ID NO:8:Anc83 VP1 DNA
SEQ ID NO:9:Anc84 VP1多肽
SEQ ID NO:10:Anc84 VP1 DNA
SEQ ID NO:11:Anc94 VP1多肽
SEQ ID NO:12:Anc94 VP1 DNA
SEQ ID NO:13:Anc113 VP1多肽
SEQ ID NO:14:Anc113 VP1 DNA
SEQ ID NO:15:Anc126 VP1多肽
SEQ ID NO:16:Anc126 VP1 DNA
SEQ ID NO:17:Anc127 VP1多肽
SEQ ID NO:18:Anc127 VP1 DNA
SEQ ID NO:19:Anc80L27 VP1多肽
SEQ ID NO:20:Anc80L59 VP1多肽
SEQ ID NO:21:Anc80L60 VP1多肽
SEQ ID NO:22:Anc80L62 VP1多肽
SEQ ID NO:23:Anc80L65 VP1多肽
SEQ ID NO:24:Anc80L33 VP1多肽
SEQ ID NO:25:Anc80L36 VP1多肽
SEQ ID NO:26:Anc80L44 VP1多肽
SEQ ID NO:27:AAV8 VP1多肽(YP 077180.1)
SEQ ID NO:28:AAV9 VP1多肽(AAS99264.1)
SEQ ID NO:29:AAV6 VP1多肽(AAB95450.1)
SEQ ID NO:30:AAV1 VP1多肽(NP 049542.1)
SEQ ID NO:31:AAV2 VP1多肽(YP 680426.1)
SEQ ID NO:32:AAV3 VP1多肽(NP 043941.1)
SEQ ID NO:33:AAV3B VP1多肽(3KIC A)
SEQ ID NO:34:AAV7 VP1多肽(YP 077178.1)
SEQ ID NO:35:Anc80L1 VP1
SEQ ID NO:36:Anc80L1 VP1
SEQ ID NO:37:Anc80 VP3多肽
SEQ ID NO:38:AAV2 VP3多肽(GenBank Accession No.AAC03779.1
SEQ ID NO:39:AAV8 VP3多肽
SEQ ID NO:40:AAV5 VP1多肽(GenBank Accession No.AAD13756.1
SEQ ID NO:41:rh10 VP1多肽(GenBank Accession No.AAo88201.1
SEQ ID NO:42:Anc110 VP1多肽
SEQ ID NO:43:Anc110 VP1 DNA
SEQ ID NO:44:AAV4 VP1多肽(GenBank Accession No.NP 044927.1)
SEQ ID NO:45:rh32.33 VP1多肽(GenBank Accession No.EU368926。
Claims (14)
1.腺伴随病毒(AAV)壳体多肽,其具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的AAV壳体多肽,其中所述AAV壳体多肽或包含所述AAV壳体多肽的病毒颗粒比AAV9壳体多肽或包含AAV9壳体多肽的病毒颗粒展现出大致相同或更低的血清阳性率(seroprevalence)。
3.权利要求1的AAV壳体多肽,其中所述AAV壳体多肽或包含所述AAV壳体多肽的病毒颗粒与AAV9壳体多肽或包含AAV9壳体多肽的病毒颗粒相比在相似或更小程度上被人血清中和。
4.权利要求1的AAV壳体多肽,其中所述AAV壳体多肽是纯化的。
5.权利要求1的AAV壳体多肽,其由SEQ ID NO:43中所示的核酸序列编码。
6.核酸分子,其编码具有在SEQ ID NO:43中所示的核酸序列的腺伴随病毒(AAV)壳体多肽。
7.载体,其包含权利要求6的核酸分子。
8.宿主细胞,其包含权利要求7的载体。
9.纯化的病毒颗粒,其包含权利要求1的AAV壳体多肽。
10.权利要求9的纯化的病毒颗粒,其进一步包含转基因。
11.用转基因进行基因转移和/或疫苗接种的方法,所述方法包括
将权利要求10的病毒颗粒施用于需要基因转移或疫苗接种的受试者,其中所述病毒颗粒比AAV9病毒颗粒展现出大致相同或更低的血清阳性率。
12.权利要求11的方法,其中所述病毒颗粒与AAV9病毒颗粒相比在相同或更小程度上被人血清中和。
13.对受试者接种疫苗的方法,所述方法包括
将可操作连接于权利要求1的AAV壳体多肽的靶抗原施用于需要疫苗接种的受试者,其中所述AAV壳体多肽与AAV9壳体多肽相比展现出大致相同或更低的血清阳性率。
14.权利要求13的方法,其中所述AAV壳体多肽与AAV9壳体多肽相比在相同或更小程度上被人血清中和。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562199059P | 2015-07-30 | 2015-07-30 | |
US62/199,059 | 2015-07-30 | ||
US201562203002P | 2015-08-10 | 2015-08-10 | |
US62/203,002 | 2015-08-10 | ||
PCT/US2016/044819 WO2017019994A2 (en) | 2015-07-30 | 2016-07-29 | Ancestral virus sequences and uses thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108603235A true CN108603235A (zh) | 2018-09-28 |
Family
ID=57885044
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680057177.2A Pending CN108603235A (zh) | 2015-07-30 | 2016-07-29 | 祖先病毒序列及其用途 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10738087B2 (zh) |
EP (3) | EP3872085B1 (zh) |
JP (2) | JP7166168B2 (zh) |
CN (1) | CN108603235A (zh) |
AU (1) | AU2016298394C1 (zh) |
CA (2) | CA3126951A1 (zh) |
DK (1) | DK3872085T3 (zh) |
ES (1) | ES2945427T3 (zh) |
FI (1) | FI3872085T3 (zh) |
HK (1) | HK1254848A1 (zh) |
HU (1) | HUE061388T2 (zh) |
LT (1) | LT3872085T (zh) |
PL (1) | PL3872085T3 (zh) |
PT (1) | PT3872085T (zh) |
WO (1) | WO2017019994A2 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114207196A (zh) * | 2019-10-16 | 2022-03-18 | 上海药明康德新药开发有限公司 | 新的aav文库 |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2359867T3 (en) * | 2005-04-07 | 2015-01-05 | Univ Pennsylvania | A method for increasing an AAV vector function |
US10577627B2 (en) | 2014-06-09 | 2020-03-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Chimeric capsids |
CA2966620A1 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease |
EP3218484A4 (en) | 2014-11-14 | 2018-05-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
US10570395B2 (en) | 2014-11-14 | 2020-02-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | Modulatory polynucleotides |
US11697825B2 (en) | 2014-12-12 | 2023-07-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the production of scAAV |
JP7166168B2 (ja) * | 2015-07-30 | 2022-11-07 | マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリー | 祖先ウイルス配列およびその使用 |
PT3356390T (pt) | 2015-09-28 | 2021-04-21 | Univ Florida | Métodos e composições para vetores virais que se evadem a anticorpos |
AU2016362477A1 (en) | 2015-12-02 | 2018-06-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies |
WO2017189959A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
WO2017189964A2 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
KR102427379B1 (ko) | 2016-05-18 | 2022-08-02 | 보이저 테라퓨틱스, 인크. | 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 |
SG11201809699XA (en) | 2016-05-18 | 2018-12-28 | Voyager Therapeutics Inc | Modulatory polynucleotides |
WO2018022608A2 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Novel adeno-associated virus capsid proteins |
CN110225975A (zh) | 2016-08-23 | 2019-09-10 | 阿库斯股份有限公司 | 用于治疗人受试者中非年龄相关的听力损害的组合物和方法 |
CA3035522A1 (en) | 2016-08-30 | 2018-03-08 | The Regents Of The University Of California | Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same |
JP2020518258A (ja) | 2017-05-05 | 2020-06-25 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics,Inc. | 筋萎縮性側索硬化症(als)治療組成物および方法 |
CN111108198A (zh) | 2017-05-05 | 2020-05-05 | 沃雅戈治疗公司 | 治疗亨廷顿病的组合物和方法 |
CA3061968A1 (en) * | 2017-05-10 | 2018-11-15 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Methods and compositions for modifying assembly-activating protein (aap)-dependence of viruses |
JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
WO2019018342A1 (en) | 2017-07-17 | 2019-01-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM |
JP7221275B2 (ja) | 2017-08-03 | 2023-02-13 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | Aavを送達するための組成物および方法 |
WO2019067982A2 (en) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | PRODUCTION OF ADENO-ASSOCIATED VIRUSES IN INSECT CELLS |
EP3697905A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
WO2019079242A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
WO2019217513A2 (en) | 2018-05-09 | 2019-11-14 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Methods of treating phenylketonuria |
TW202005978A (zh) | 2018-05-14 | 2020-02-01 | 美商拜奧馬林製藥公司 | 新穎肝靶向腺相關病毒載體 |
UY38407A (es) | 2018-10-15 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Anticuerpos estabilizadores de trem2 |
JP2022530633A (ja) * | 2019-04-29 | 2022-06-30 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 新規aavカプシドおよびそれを含む組成物 |
CN110423778B (zh) * | 2019-07-26 | 2023-04-21 | 上海科技大学 | 一种逆行性重组2型腺相关病毒在感染螺旋神经元中的应用 |
US20220403414A1 (en) * | 2019-10-16 | 2022-12-22 | Wuxi Apptec (Shanghai) Co., Ltd. | Novel aav variant |
AU2020367532A1 (en) | 2019-10-17 | 2022-05-12 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Adeno-associated viral vectors for treatment of Niemann-Pick disease type C |
BR112022016596A2 (pt) | 2020-02-21 | 2022-11-16 | Akouos Inc | Composições e métodos para o tratamento de debilitação auditiva não associada à idade em um indivíduo humano |
CA3201533A1 (en) | 2020-11-11 | 2022-05-19 | European Molecular Biology Laboratory | Modified viral particles for gene therapy |
IL308356A (en) | 2021-05-12 | 2024-01-01 | Fond Telethon | Vector system |
WO2023214346A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | Novartis Ag | Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102212558A (zh) * | 2003-09-30 | 2011-10-12 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用 |
WO2015054653A2 (en) * | 2013-10-11 | 2015-04-16 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Methods of predicting ancestral virus sequences and uses thereof |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US242997A (en) * | 1881-06-14 | Reversible seat | ||
US368925A (en) * | 1887-08-30 | Feed mechanism for sewing-machines | ||
US5037384B2 (en) | 1988-01-12 | 1995-12-26 | Cornell Res Foundation Inc | Method and apparatus for the treatment of complicated retinal detachments |
US20040115621A1 (en) | 2000-02-18 | 2004-06-17 | Allen Rodrigo | Ancestral viruses and vaccines |
US6692526B1 (en) | 2000-03-15 | 2004-02-17 | Michael E. Snyder | Ophthalmological surgery colorant and delivery system |
DK2359867T3 (en) | 2005-04-07 | 2015-01-05 | Univ Pennsylvania | A method for increasing an AAV vector function |
US8388668B2 (en) | 2005-08-05 | 2013-03-05 | Gholam A. Peyman | Methods to regulate polarization of excitable cells |
WO2014160092A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Adeno-associated virus vectors and methods of use thereof |
JP7166168B2 (ja) * | 2015-07-30 | 2022-11-07 | マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリー | 祖先ウイルス配列およびその使用 |
CA3061968A1 (en) * | 2017-05-10 | 2018-11-15 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Methods and compositions for modifying assembly-activating protein (aap)-dependence of viruses |
-
2016
- 2016-07-29 JP JP2018504699A patent/JP7166168B2/ja active Active
- 2016-07-29 CA CA3126951A patent/CA3126951A1/en not_active Abandoned
- 2016-07-29 EP EP21161372.4A patent/EP3872085B1/en active Active
- 2016-07-29 LT LTEP21161372.4T patent/LT3872085T/lt unknown
- 2016-07-29 CA CA2994160A patent/CA2994160C/en active Active
- 2016-07-29 DK DK21161372.4T patent/DK3872085T3/da active
- 2016-07-29 EP EP16831443.3A patent/EP3329017B1/en not_active Withdrawn - After Issue
- 2016-07-29 WO PCT/US2016/044819 patent/WO2017019994A2/en unknown
- 2016-07-29 AU AU2016298394A patent/AU2016298394C1/en active Active
- 2016-07-29 US US15/748,738 patent/US10738087B2/en active Active
- 2016-07-29 CN CN201680057177.2A patent/CN108603235A/zh active Pending
- 2016-07-29 HU HUE21161372A patent/HUE061388T2/hu unknown
- 2016-07-29 PT PT211613724T patent/PT3872085T/pt unknown
- 2016-07-29 FI FIEP21161372.4T patent/FI3872085T3/fi active
- 2016-07-29 ES ES21161372T patent/ES2945427T3/es active Active
- 2016-07-29 PL PL21161372.4T patent/PL3872085T3/pl unknown
- 2016-07-29 EP EP22182170.5A patent/EP4134375A1/en not_active Withdrawn
-
2018
- 2018-10-31 HK HK18113943.1A patent/HK1254848A1/zh unknown
-
2020
- 2020-08-10 US US16/989,454 patent/US20210017235A1/en active Pending
-
2021
- 2021-06-16 JP JP2021099934A patent/JP7222028B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102212558A (zh) * | 2003-09-30 | 2011-10-12 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用 |
WO2015054653A2 (en) * | 2013-10-11 | 2015-04-16 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Methods of predicting ancestral virus sequences and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J SANTIAGO-ORTIZ等: "AAV ancestral reconstruction library enables selection of broadly infectious viral variants", 《GENE THERAPY》 * |
栗世方等: "重组腺相关病毒载体在中枢神经系统转基因研究中的应用", 《中华神经医学杂志》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114207196A (zh) * | 2019-10-16 | 2022-03-18 | 上海药明康德新药开发有限公司 | 新的aav文库 |
CN114207196B (zh) * | 2019-10-16 | 2024-01-26 | 上海药明康德新药开发有限公司 | 新的aav文库 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3329017A4 (en) | 2018-12-26 |
EP3329017B1 (en) | 2021-03-10 |
CA2994160C (en) | 2021-08-10 |
DK3872085T3 (da) | 2023-04-03 |
AU2016298394C1 (en) | 2024-02-15 |
JP2018521670A (ja) | 2018-08-09 |
HK1254848A1 (zh) | 2019-07-26 |
JP7166168B2 (ja) | 2022-11-07 |
FI3872085T3 (fi) | 2023-04-19 |
US20190100560A1 (en) | 2019-04-04 |
EP4134375A1 (en) | 2023-02-15 |
LT3872085T (lt) | 2023-05-10 |
US20210017235A1 (en) | 2021-01-21 |
PL3872085T3 (pl) | 2023-06-05 |
CA3126951A1 (en) | 2017-02-02 |
CA2994160A1 (en) | 2017-02-02 |
EP3329017A2 (en) | 2018-06-06 |
HUE061388T2 (hu) | 2023-06-28 |
AU2016298394B2 (en) | 2022-07-28 |
JP7222028B2 (ja) | 2023-02-14 |
AU2016298394A1 (en) | 2018-02-22 |
WO2017019994A2 (en) | 2017-02-02 |
EP3872085B1 (en) | 2023-03-01 |
US10738087B2 (en) | 2020-08-11 |
ES2945427T3 (es) | 2023-07-03 |
PT3872085T (pt) | 2023-04-13 |
EP3872085A1 (en) | 2021-09-01 |
JP2021175397A (ja) | 2021-11-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7222028B2 (ja) | 祖先ウイルス配列およびその使用 | |
US11466258B2 (en) | Methods of predicting ancestral virus sequences and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |