JP7166168B2 - 祖先ウイルス配列およびその使用 - Google Patents
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Description
本開示は、概して、ウイルスに関する。
遺伝子治療ベクターに対する中和または毒性免疫応答を逃れ回避することは、全ての遺伝子移入ベクタータイプを用いる場合に大きな課題である。これまでの遺伝子移入は、ヒトおよび動物内を循環するウイルスに基づくベクター、例えば、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いることで最も効率的に達成される。しかしながら、対象がウイルスに自然に感染している場合は、そのウイルスに基づくベクターによるその後の治療は、細胞性および体液性免疫応答に起因して、安全リスクの増加と遺伝子移入効率の低下をもたらす。キャプシド抗原は、主に、ウイルス粒子に対する先天性免疫および／または適応免疫の原因となるが、しかしながら、ウイルス遺伝子によりコードされたポリペプチドもまた免疫原性であり得る。
本開示は、祖先ウイルス配列またはその一部を予測および合成する方法を記載し、さらに、このような祖先ウイルス配列を含有するウイルス粒子を記載する。本明細書に記載される方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された；したがって、本開示は、予測された祖先ＡＡＶ配列、およびこのような祖先ＡＡＶ配列を含有するＡＡＶウイルス粒子を記載する。本開示はまた、同時代の（contemporary）配列を含有するウイルス粒子と比較して、祖先配列を含有するウイルス粒子によって示された血清有病率を記載する。
一態様において、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチド、またはこのようなＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチド、またはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。いくつかの実施形態では、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは精製されている。いくつかの実施形態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは、配列番号４３に示される核酸配列によってコードされる。
このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む精製されたウイルス粒子もまた提供される。いくつかの実施形態において、このような精製されたウイルス粒子は導入遺伝子をさらに含む。
別の態様において、配列番号４３に示される核酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、このような核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態において、このようなベクターを含む宿主細胞が提供される。
別の態様において、導入遺伝子を用いて遺伝子移入および／またはワクチン接種する方法が提供される。このような方法は、典型的には、遺伝子移入またはワクチン接種を必要とする対象に本明細書に記載されるウイルス粒子を投与することを含み、ウイルス粒子はＡＡＶ９ウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、このようなウイルス粒子は、ＡＡＶ９ウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。
別の態様において、対象にワクチン接種する方法が提供される。このような方法は、典型的には、ワクチン接種を必要とする対象に本明細書に記載されるＡＡＶキャプシドポリペプチドに作動可能に連結した標的抗原を投与することを含み、ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドとほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、このようなＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドと同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。
このように、本開示は、同時代のウイルスまたは一部と比較して、現在のヒト集団において既存の免疫に対する感受性の低減を示す祖先ウイルスまたはその一部を提供する。一般的に、現在のヒト集団における祖先ウイルスまたはその一部によって示される既存の免疫に対する感受性の低減は、中和抗体に対する感受性の低減として反映される。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、対象とする方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、対象とする方法および組成物の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、全体として参照により組み込まれる。
特許または出願ファイルは、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開の写しは、要求および必要とされる手数料の支払いにより特許庁によって提供される。
実験目的または治療目的のための遺伝子移入は、遺伝情報を標的細胞に往復させるためのベクターまたはベクターシステムを利用する。ベクターまたはベクターシステムは、遺伝子移入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理学および寿命の主要な決定要因であると考えられる。現在、遺伝子移入を達成するための最も効率的かつ効果的な方法は、複製欠損がなされているウイルスに基づくベクターまたはベクターシステムの使用を介するものである。
しかしながら、血清有病率の研究は、世界的なヒト集団のかなりの割合が、現在、遺伝子移入に使用されている大多数のウイルスに（例えば、自然感染によって）予め曝露され、したがって、既存の免疫を保有していることを示す。これらの予め曝露された個体中のウイルスベクターに対する抗体を中和することは、遺伝子移入の程度を時には有意に制限し、またはウイルスを標的から離れるように変えることが知られている。例えば、Calcedo et al. （2009, J. Infect. Dis., 199:381-90）、およびBoutin et al. （2010, Human Gene Ther., 21:704-12）を参照されたい。このように、本開示は、祖先ウイルスまたはその一部が、同時代のウイルスまたはその一部よりも、現在のヒト集団において既存の免疫に対する感受性の低減（例えば、中和抗体に対する感受性の低減）を示すという認識に基づく。
図１は、祖先および同時代のウイルス感染と祖先および同時代の宿主免疫応答の間の関係を示す概略図である。図１は、祖先ＡＡＶが、どのようにして同時代の既存の免疫に不応性であり得るかを示す。同時代の、現存のウイルス（Ｖｃ）は、免疫回避のメカニズムを介して、主に宿主免疫の進化的圧力下で祖先種（Ｖａｎｃ）から進化してきたことが推定される。これらの種ＶａｎｃおよびＶｃの各々は、Ｂ細胞免疫およびＴ細胞免疫（それぞれＩａｎｃおよびＩｃ）を含む適応免疫を誘導する能力を有する。同時代のウイルスによって誘導される免疫は、現存のウイルスよりもエピトープ組成の点で実質的に異なる可能性がある祖先ウイルス種と必ずしも交差反応しないことが仮定され、本明細書において確認された。
本開示は、祖先ウイルスまたはその一部の配列を予測する方法を提供する。本明細書に記載の方法を用いて予測される祖先ウイルス配列の１つまたは複数が生成され、ウイルス粒子にアセンブルすることができる。本明細書において実証されるように、予測される祖先ウイルス配列からアセンブルされるウイルス粒子は、現在の同時代のウイルス粒子よりも少ない、時として有意に低い血清有病率を示し得る。したがって、本明細書に開示されている祖先ウイルス配列は、遺伝子移入のためのベクターまたはベクターシステムにおける使用に適している。
祖先ウイルス配列を予測および合成する方法
祖先ウイルス配列を予測するために、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を最初に複数の同時代のウイルスまたはその一部から集める。本明細書に記載される方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド配列を用いて例示されが、同じ方法は、ＡＡＶ由来の他の配列（例えば、ゲノム全体、ｒｅｐ配列、ＩＴＲ配列）に適用され、または任意の他のウイルスまたはその一部に適用され得る。ＡＡＶ以外のウイルスとしては、限定されないが、アデノウイルス（ＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、泡沫状ウイルス、または既存する免疫が問題であると考えられる任意の他のウイルスが挙げられる。
祖先ウイルス配列を予測するために、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を最初に複数の同時代のウイルスまたはその一部から集める。本明細書に記載される方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド配列を用いて例示されが、同じ方法は、ＡＡＶ由来の他の配列（例えば、ゲノム全体、ｒｅｐ配列、ＩＴＲ配列）に適用され、または任意の他のウイルスまたはその一部に適用され得る。ＡＡＶ以外のウイルスとしては、限定されないが、アデノウイルス（ＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、泡沫状ウイルス、または既存する免疫が問題であると考えられる任意の他のウイルスが挙げられる。
わずか２つの同時代のウイルスまたはその一部由来の配列を用いることができるが、しかしながら、同時代のウイルスまたはその一部の大多数の配列は、できるだけ多くの現在の配列多様性の状況を含むように所望されるが、さらに、大多数の配列が記載され、使用されるアルゴリズムの予測能力を増加させ得るためであることが理解される。例えば、１０個以上の同時代のウイルスもしくはその一部由来の配列を用いることができ、５０個以上の同時代のウイルスもしくはその一部由来の配列を用いることができ、または１００個以上の同時代のウイルスまたはその一部由来の配列を用いることができる。
このような配列は、例えば、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＥＭＢＬ、国際塩基配列データベースコラボレーション（ＩＮＳＤＣ）または欧州ヌクレオチドアーカイブを含む任意の数の公共のデータベースから取得することができる。追加的にまたは代替的に、このような配列は、特定の生物に特異的なデータベース（例えば、ＨＩＶデータベース）から取得することができる。同時代の配列は、ゲノム全体に対応し得、またはゲノムの一部のみ、例えば、限定されないが、ウイルスキャプシド、複製タンパク質またはＩＴＲ配列の１つまたは複数の構成成分をコードする配列を使用することができる。
次に、同時代の配列は、複数の配列アラインメント（ＭＳＡ）アルゴリズムを用いて整列される。図２（ａ）は複数配列のアラインメントを示す概略図である。ＭＳＡアルゴリズムは当技術分野において周知であり、一般的に、異なるサイズのデータセットと異なる入力（例えば、核酸またはタンパク質）に適用され、および特定の方法（例えば、動的プログラミング、プログレッシブ、ヒューリスティック）で配列を整列するように設計され、アラインメントにおける異なるスコアリングスキーム（例えば、マトリックスベースまたは整合性ベース、例えば、最小エントロピー、対の合計、類似性マトリックス、ギャップスコア）を適用する。周知のＭＳＡアルゴリズムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson et al., 1994, Nuc. Acids Res., 22:4673-90）、Ｋａｌｉｇｎ（Lassmann et al., 2006, Nuc. Acids Res., 34:W596-99）、ＭＡＦＦＴ（Katoh et al., 2005, Nuc. Acids Res., 33:511-8）、ＭＵＳＣＬＥ（Edgar, 2004, BMC Bioinform., 5:113）およびＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（Notredame et al., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17）が挙げられる。
本明細書に記載されるように、本明細書に記載される方法において使用するためのＭＳＡアルゴリズムを選択する場合の主な特徴の１つは、アルゴリズムがアラインメント中のギャップを処理する方法である。配列アラインメント中のギャップは、ギャップの大きさに依存するまたは独立であるペナルティ値を割り当てることができる。本方法において、本明細書に記載される方法において使用されるＭＳＡアルゴリズムは、ギャップのバイアスされた非系統発生学的処理とは対照的に、例えば、挿入および／または欠失に起因して、アラインメント中のギャップが欠失または挿入の結果であるかどうかを予測するために系統発生学的情報を適用することが好ましい。アラインメント中のギャップを処理する適切な方法および進化分析は、Loytynoja and Goldman, 2008, Science, 320:1632-5に記載され、本明細書に記載される方法における使用に適した方法でアラインメント中のギャップを適用する市販のアルゴリズムは、確率的アラインメントキット（ＰＲＡＮＫ；Goldman Group Software；Loytynoja and Goldman, 2005, PNAS USA, 102:10557-62）であり、ＰＲＡＮＫアルゴリズムのバリエーションである。
次に、進化モデルは、予測された祖先系統発生を得るために、得られたアラインメントに適用される（図２（ｂ）参照）。当技術分野において利用可能な多数の進化モデルが存在し、その各々は、アミノ酸について代替率のわずかに異なるマトリックスを適用する。限定されないが、進化のモデルを適用するためのアルゴリズムとしては、Ｄａｙｈｏｆｆモデル（例えば、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ１６０、ＰＡＭ２５０；Dayhoff et al., 1978, In Atlas of Protein Sequence and Structure (ed. Dayhoff), pp. 345-52, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C.）、ＪＴＴモデル（Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82）、ＷＡＧモデル（Whelan and Goldman, 2001, Mol. Biol. Evol., 18:691-9）、およびＢｌｏｓｕｍモデル（例えば、Ｂｌｏｓｕｍ４５、Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｂｌｏｓｕｍ８０；Henikoff and Henikoff, 1992, PNAS USA, 89:10915-9）が挙げられる。
さらに、構造と機能が進化モデルに課す制約はそれ自体、例えば、いくつかの位置は不変であること（「＋Ｉ」；Reeves, 1992, J. Mol. Evol., 35:17-31）、いくつかの位置は異なる速度の変化を受けること（「＋Ｇ」；Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401）、および／またはヌクレオチドもしくはアミノ酸の平衡頻度がアラインメントと同じであること（「＋Ｆ」；Cao et al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27）を考慮することによってモデリングされ得る。
進化の１つまたは複数のモデルの適応度は、赤池情報量規準（ＡＩＣ；Akaike, 1973, In Second International Symposium on Information Theory, Petrov and Csaki, eds., pp 267-81, Budapest, Akademiai Kiado）、ベイズ情報量規準（ＢＩＣ；Schwarz, 1978, Ann. Statist. 6:461-4）、またはそれらのバリエーションもしくは組合せを用いて評価することができる。さらに、ＡＩＣ、ＢＩＣまたはそれらのバリエーションもしくは組合せは、進化モデルにおける１つまたは複数のパラメータ（例えば、上記で検討した制約）を含むという相対的な重要性を評価するために使用され得る。
以下の実施例の項で説明されるように、ＰｒｏＴｅｓｔ３（Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5）は、最小ＡＩＣに基づいて、ＪＴＴ＋Ｇ＋ＦアルゴリズムがＡＡＶ進化のために最も適したモデルであったということを決定するために用いることができる。ＪＴＴ＋Ｇ＋Ｆアルゴリズムはまた、ＡＡＶキャプシドポリペプチド以外の祖先ウイルス配列を予測するために用いられてもよいことが当業者に理解されるであろうが、しかしながら、また、データセットと適応度スコアに応じて、進化の異なるモデルがより適切であり得ることが当業者に理解されるであろう。
進化のモデルが選択され、その適応度が決定されると、ウイルス配列またはその一部の系統樹を構築することができる。系統樹を構築することは、当技術分野において公知であり、典型的には、最大尤度法を採用し、例えば、ＰｈｙＭＬ（Guindon and Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704)）、ＭＯＬＰＨＹ（Adachi and Hasegawa, 1996, ed. Tokyo Institute of Statistical Mathematics）、ＢｉｏＮＪ（Gascuel, 1997, Mol. Biol. Evol., 14:685-95）、またはＰＨＹＬＩＰ（Felsenstein, 1973, Systematic Biology, 22:240-9）によって実施されるものが挙げられる。当業者は、コンピュータ計算の複雑さと適応度の有益部分とのバランスがアミノ酸置換のモデルにおいて望ましいことを理解するであろう。
所望により、系統樹を有意性について評価することができる。多数の統計的方法が、モデルの有意性を評価するために利用可能であり、日常的に使用され、限定されないが、ブートストラップ、ジャックナイフ、交差検定、並べ替え検定またはそれらの組合せもしくはバリエーションが挙げられる。有意性はまた、例えば、おおよその尤度比検定（ａＬＲＴ；Anisimova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52）を用いて評価され得る。
系統発生のいずれかの系統発生的な節（例えば、内部系統発生の節）において、配列は、配列の各位置で特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を概算することによって再構築することができまる（図２（ｃ））。系統発生的な節は、予測された祖先の系統樹内の中間進化の分岐点を指す。本明細書で使用するとき、「進化の確率」とは、考慮されないモデル、例えば、コドン使用における進化シフトとは対照的に、進化モデルに基づいて、特定の位置に特定のヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する確率を指す。特定の位置で特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を考慮する例示的なモデルは、例えば、限定されないが、最大尤度法による系統発生学的分析（ＰＡＭＬ；Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6）または節約法を用いる系統発生学的分析（ＰＡＵＰ；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）を含む任意の数の最大尤度法を用いて概算され得る。
各位置での特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の概算された進化の確率に基づいて、祖先ウイルスまたはその一部の予測される配列はアセンブルされ、完全または部分的に合成の核酸またはポリペプチド配列を形成することができる。所望により、任意の残基が節に沿って所定の節で所定の状態にあった尤度を計算することができ、特定の閾値下に計算された事後確率を有する配列に沿った任意の位置を同定することができる（図２（ｄ））。このようにして、特定の閾値未満の確率を有するそれらの位置でバリエーションを含み得る祖先足場配列を生成することができる。
本明細書に記載の方法を用いて予測される祖先配列が核酸配列である場合、配列は、アミノ酸配列に効率的に翻訳され得るように最適化されたコドンであり得る。様々な生物のコドン使用頻度表は当技術分野において公知である。しかしながら、場合により、コドン使用頻度表は、祖先足場配列に対する相同性（例えば、少なくとも９０％の配列同一性）を有する１つまたは複数の同時代の配列に基づいて設計することができ、本明細書に記載される祖先配列は哺乳動物（例えば、ヒト）コドン使用頻度に向けて最適されたコドンであり得る。
祖先ウイルス配列を予測するための、本明細書に概説されているいずれかまたは全てのステップは、プロセッサまたはマイクロプロセッサを使用したコンピュータ（例えば、インシリコ）上で実行またはシミュレートすることができる。
祖先アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）足場配列
本明細書に記載される方法は、（下記の実施例において詳細に説明される）同時代のキャプシド配列を用いてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された。ＡＡＶは、治療用遺伝子移入ベクターおよび遺伝子ワクチンビヒクルとして考えられるが、ヒト集団において高い血清有病率を示す。本明細書に記載される方法を用いて、系統樹は、同時代のＡＡＶ配列によりアセンブルされ（図３を参照）、予測された祖先足場配列は、指定された系統発生学的な節で得られた（表１）。本明細書で使用されるとき、祖先足場配列は、本明細書に記載される方法を用いて（例えば、進化可能性と進化モデリングを用いて）構築され、自然界に存在していたことが知られていない配列を意味する。本明細書で使用するとき、祖先足場配列は、典型的には、特定の位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸残基の頻度を用いて構築されるコンセンサス配列とは異なる。
本明細書に記載される方法は、（下記の実施例において詳細に説明される）同時代のキャプシド配列を用いてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された。ＡＡＶは、治療用遺伝子移入ベクターおよび遺伝子ワクチンビヒクルとして考えられるが、ヒト集団において高い血清有病率を示す。本明細書に記載される方法を用いて、系統樹は、同時代のＡＡＶ配列によりアセンブルされ（図３を参照）、予測された祖先足場配列は、指定された系統発生学的な節で得られた（表１）。本明細書で使用されるとき、祖先足場配列は、本明細書に記載される方法を用いて（例えば、進化可能性と進化モデリングを用いて）構築され、自然界に存在していたことが知られていない配列を意味する。本明細書で使用するとき、祖先足場配列は、典型的には、特定の位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸残基の頻度を用いて構築されるコンセンサス配列とは異なる。
足場ポリペプチドおよび核酸の配列ならびに確率の位置での可能なヌクレオチドまたは残基のセットを配列表に示す。例えば、Ａｎｃ８０ポリペプチドの足場配列を配列番号１に示し、これは、配列番号２に示されるＡｎｃ８０核酸の足場配列によってコードされる。配列表に示されるように、Ａｎｃ８０の足場配列は、２つの残基のいずれかが推定された１１位を含有する。したがって、Ａｎｃ８０足場配列は、２０４８（２１１）個の異なる配列を表す。Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ９４、Ａｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡｎｃ１１０ポリペプチドの追加の足場配列を配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および４２に示す；これらのポリペプチドは、それぞれＡｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ９４、Ａｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡｎｃ１１０核酸の足場配列によってコードされ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および４３に示される。各祖先配列について、確率の各位置における可能なヌクレオチドまたは残基のセットが示される。
ウイルスまたはその一部の祖先配列を予測するための本明細書に記載される方法の有効性を実証するために、ＡＡＶ Ａｎｃ８０節での２０４８個の予測された祖先配列のライブラリーを作製し、本明細書に記載されるように、同時代のキャプシドポリペプチドでアセンブルされたウイルス粒子と比較して、低い血清有病率、いくつかの例では有意に低い血清有病率を示す生存するウイルス粒子を形成することが実証された。
祖先ウイルス粒子を作製する方法
ウイルスまたはその一部の予測された祖先配列を取得した後、実際の核酸分子および／またはポリペプチド（単数または複数）を生成することができる。例えばインシリコで得られた配列に基づいて、核酸分子またはポリペプチドを生成する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、化学合成または組換えクローニングを含む。核酸分子またはポリペプチドを生成するためのさらなる方法は、当技術分野において公知であり、以下により詳細に検討される。
ウイルスまたはその一部の予測された祖先配列を取得した後、実際の核酸分子および／またはポリペプチド（単数または複数）を生成することができる。例えばインシリコで得られた配列に基づいて、核酸分子またはポリペプチドを生成する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、化学合成または組換えクローニングを含む。核酸分子またはポリペプチドを生成するためのさらなる方法は、当技術分野において公知であり、以下により詳細に検討される。
祖先ポリペプチドが生成されると、または祖先核酸分子が生成され、祖先ポリペプチドを生成するように発現されると、祖先ポリペプチドは、例えば、パッケージング宿主細胞を用いて、祖先ウイルス粒子にアセンブルされ得る。ウイルス粒子の構成成分（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列）は、本明細書に記載される１つまたは複数のベクターを使用してパッケージング宿主細胞に、一過性または安定に導入することができる。ウイルス粒子の構成成分の１つまたは複数は、本明細書に記載される予測された祖先配列に基づくことができ、一方、残りの構成成分は同時代の配列に基づくことができる。いくつかの例において、ウイルス粒子全体は、予測された祖先配列に基づくことができる。
このような祖先ウイルス粒子は、通常の方法を用いて精製することができる。本明細書で使用するとき、「精製された」ウイルス粒子とは、作製された混合物中の構成成分、例えば、限定されないが、ウイルス構成成分（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列）、パッケージング宿主細胞および部分的にまたは不完全にアセンブルされたウイルス粒子から取り除かれるウイルス成分を意味する。
アセンブルされると、祖先ウイルス粒子は、例えば、複製する能力；遺伝子移入特性；受容体結合能；および／または集団（例えば、ヒト集団）における血清有病率についてスクリーニングすることができる。ウイルス粒子が複製し得るかどうかの決定は当技術分野において通常行われ、典型的には、ある量のウイルス粒子で宿主細胞を感染させ、ウイルス粒子が経時的に数が増加するかどうかを決定することを含む。また、ウイルス粒子が遺伝子移入を行うことができるかどうかの決定は当技術分野において通常行われ、典型的には、導入遺伝子（例えば、以下でより詳細に検討されるレポーター遺伝子などの検出可能な導入遺伝子）を含有するウイルス粒子で宿主細胞を感染させることを含む。ウイルスの感染およびクリアランス後、宿主細胞は導入遺伝子の存在または非存在について評価され得る。ウイルス粒子がその受容体に結合するかどうかの決定は当技術分野において通常行われ、このような方法はインビトロまたはインビボで行うことができる。
ウイルス粒子の血清有病率の決定は当技術分野において通常行われ、典型的には、個体の特定の集団からの試料（例えば、血液試料）中の１つまたは複数の抗体の有病率を決定するためのイムノアッセイの使用を含む。血清有病率は、血清反応陽性である（すなわち、特定の病原体または免疫原に曝露されている）集団中の対象の割合を意味することが当技術分野において理解され、調べられた集団における個体の総数によって割った、特定の病原体または免疫原に対する抗体を産生する集団における対象の数として計算される。イムノアッセイは、当技術分野において周知であり、限定されないが、イムノブロット、ウェスタンブロット、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。本明細書に示されるように、祖先ウイルス粒子は、同時代のウイルス粒子（すなわち、同時代のウイルス配列またはその一部を用いてアセンブルされたウイルス粒子）よりも低い血清有病率を示す。単に一例として、Xu et al. （2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 196:43.e1-6）；Paul et al. （1994, J. Infect. Dis., 169:801-6）；Sauerbrei et al. （2011, Eurosurv., 16(44):3）；およびSakhria et al. （2013, PLoS Negl. Trop. Dis., 7:e2429）を参照されたい。それぞれは、所定の集団における特定の抗体についての血清有病率を決定した。
本明細書に記載されるように、祖先ウイルス粒子は、同時代のウイルス粒子よりも低い程度に中和される。血清試料中の抗体を中和する程度を決定するためにいくつかの方法が利用可能である。例えば、中和抗体アッセイは、実験試料が、抗体を含まない対照試料と比較して５０％以上の感染を中和する抗体濃度を含有する力価を測定する。また、Fisher et al. （1997, Nature Med., 3:306-12）およびManning et al. （1998, Human Gene Ther., 9:477-85）を参照されたい。
本明細書において例示される祖先ＡＡＶキャプシドポリペプチドに関して、血清有病率および／または中和の程度は、例えば、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドもしくはＡＡＶ８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子、またはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドもしくはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と比較することができる。一般的に、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはウイルス粒子は、低いと考えられるヒト集団において、血清有病率および結果として得られる中和を示し、一方、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドまたはウイルス粒子は、高いと考えられるヒト集団において、血清有病率および結果として中和を示すことが当技術分野において理解される。明らかに、特定の血清有病率は、調べられる集団と使用される免疫学的方法に依存するが、ＡＡＶ８は約２２％から最大約３８％の血清有病率を示し、一方、ＡＡＶ２は約４３．５％から最大約７２％の血清有病率を示す。例えば、Boutin et al. 2010, “Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against AAV types 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors,” Hum. Gene Ther., 21:704-12を参照されたい。さらに、Calcebo et al. 2009, J. Infect. Dis., 199:381-90を参照されたい。
予測されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）祖先核酸配列およびポリペプチド配列
Ａｎｃ８０節の予測される祖先キャプシドポリペプチドをコードするライブラリーからの多数の異なるクローンを配列決定し、代表的なＡＡＶの予測されるキャプシドポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１９（Ａｎｃ８０Ｌ２７）；配列番号２０（Ａｎｃ８０Ｌ５９）；配列番号２１（Ａｎｃ８０Ｌ６０）；配列番号２２（Ａｎｃ８０Ｌ６２）；配列番号２３（Ａｎｃ８０Ｌ６５）；配列番号２４（Ａｎｃ８０Ｌ３３）；配列番号２５（Ａｎｃ８０Ｌ３６）；および配列番号２６（Ａｎｃ８０Ｌ４４）に示す。当業者は、それぞれのアミノ酸配列をコードする核酸配列が容易に決定され得ることを理解する。
Ａｎｃ８０節の予測される祖先キャプシドポリペプチドをコードするライブラリーからの多数の異なるクローンを配列決定し、代表的なＡＡＶの予測されるキャプシドポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１９（Ａｎｃ８０Ｌ２７）；配列番号２０（Ａｎｃ８０Ｌ５９）；配列番号２１（Ａｎｃ８０Ｌ６０）；配列番号２２（Ａｎｃ８０Ｌ６２）；配列番号２３（Ａｎｃ８０Ｌ６５）；配列番号２４（Ａｎｃ８０Ｌ３３）；配列番号２５（Ａｎｃ８０Ｌ３６）；および配列番号２６（Ａｎｃ８０Ｌ４４）に示す。当業者は、それぞれのアミノ酸配列をコードする核酸配列が容易に決定され得ることを理解する。
配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に示される配列を有する予測される祖先キャプシドポリペプチドに加えて、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に示される配列を有する予測される祖先キャプシドポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するポリペプチドが提供される。同様に、祖先キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有する核酸分子が提供される。
配列同一性パーセントの計算において、２つの配列が整列され、２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一の合致数が決定される。同一の合致数は、整列された領域の長さ（すなわち、整列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）によって割られ、パーセント配列同一性の値に到達させるために１００を乗じる。整列された領域の長さは、最も短い配列の全長サイズまでの１つまたは両方の配列の一部であり得ることが理解される。また、単一の配列は、１を超える他の配列と整列させることができ、したがって、それぞれの整列された領域に対する、異なる配列同一性パーセントの値を有することができることが理解される。
配列同一性パーセントを決定するための２つ以上の配列のアラインメントは、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＢＬＡＳＴ（基礎局所的アラインメント検索ツール）プログラムに組み込まれた、Altschul et al. （1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402）によって記載されるアルゴリズムを用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴ検索は、Altschul et al.のアルゴリズムを用いて整列された、配列（核酸またはアミノ酸）と任意の他の配列またはその一部の間の配列同一性パーセントを決定するために行うことができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を整列させ、核酸配列間の同一性を比較するために使用されるプログラムであり、一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を整列させ、アミノ酸配列間の同一性を比較するために使用されるプログラムである。配列と別の配列の間の同一性パーセントを計算するためのＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを一般的に使用する。
代表的なアラインメントを図４Ａと４Ｂおよび図５Ａと５Ｂに示す。図４Ａと４Ｂは、祖先ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチドのアラインメントを示し、Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２３）、Ａｎｃ８０Ｌ２７（配列番号１９）、Ａｎｃ８０Ｌ３３（配列番号２４）、Ａｎｃ８０Ｌ３６（配列番号２５）、Ａｎｃ８０Ｌ４４（配列番号２６）、Ａｎｃ８０Ｌ５９（配列番号２０）、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）およびＡｎｃ８０Ｌ６２（配列番号２２）と指定される。図４Ａと４Ｂに示されるアラインメントは、１１部位のそれぞれで予測されたバリエーションと、クローニングのアーティファクトであり得る、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）の６０９Ｅ位での１つの非同義突然変異を確認する。図５Ａと５Ｂは、祖先ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチド（Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２３）、Ａｎｃ８０Ｌ２７（配列番号１９）、Ａｎｃ８０Ｌ３３（配列番号２４）、Ａｎｃ８０Ｌ３６（配列番号２５）、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）、Ａｎｃ８０Ｌ６２（配列番号２２）、Ａｎｃ８０Ｌ４４（Ｓ配列番号２６）およびＡｎｃ８０Ｌ５９（配列番号２０））と同時代のＡＡＶ ＶＰ１キャプシドポリペプチド（ＡＡＶ８（配列番号２７）、ＡＡＶ９（配列番号２８）、ＡＡＶ６（配列番号２９）、ＡＡＶ１（配列番号３０）、ＡＡＶ２（配列番号３１）、ＡＡＶ３（配列番号３２）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号３３）およびＡＡＶ７（配列番号３４））の間のアラインメントを示す。図５Ａと５Ｂにおけるアラインメントは、祖先ＡＡＶ配列が、同時代のＡＡＶ配列と約８５％～９１％の配列同一性を有することを示す。
また、ポリペプチドをコードする核酸分子を含有するベクターが提供される。発現ベクターを含むベクターは市販され、または組換え技術によって生成することができる。核酸分子を含有するベクターは、このような核酸分子に作動可能に連結した、発現のための１つまたは複数のエレメントを有することができ、さらに、選択可能なマーカーをコードする核酸分子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、および／またはポリペプチド（例えば、６ｘＨｉｓタグ）の精製に使用され得る核酸分子を含むことができる。発現のためのエレメントには、核酸コード配列に指向し、その発現を制御する核酸配列を含む。発現エレメントの一例はプロモーター配列である。また、発現エレメントは、１つまたは複数のイントロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または核酸分子の発現を調節する誘導可能なエレメントを含むことができる。発現エレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物またはウイルス起源であってもよく、ベクターは、異なる起源からの発現エレメントの組合せを含有することができる。本明細書で使用するとき、作動可能に連結したとは、発現のためのエレメントが、コード配列に指向し、またはその発現を調節するような方法で、コード配列に対してベクターに配置されることを意味する。
核酸分子、例えば、ベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター）中の核酸分子は、宿主細胞に導入され得る。「宿主細胞」なる用語は、核酸分子が導入された特定の細胞（単数または複数）を意味するだけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後代もまた意味する。多数の適切な宿主細胞は当業者に公知である；宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（E. coli））または真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞）であり得る。代表的な宿主細胞としては、限定されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来するＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびに初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞が挙げられる。宿主細胞に核酸分子を導入する方法は当技術分野において公知であり、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入（例えば、形質導入）が含まれる。
ポリペプチドに関して、「精製された」とは、自然にそれに付随する細胞構成成分から分離または精製されたポリペプチド（すなわち、ペプチドまたはポリペプチド）を意味する。典型的には、ポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％）である場合に「精製された」と考えられ、ポリペプチドと自然に会合される天然に存在する分子を含まない。化学的に合成されるポリペプチドは、本質的に、自然にそれに付随する構成成分から分離されるため、合成ポリペプチドは「精製された」と考えられるが、さらに、ポリペプチドを合成するために使用される構成成分（例えば、アミノ酸残基）から取り除くことができる。核酸分子に関して、「単離された」とは、通常、ゲノム中で関連付けられる他の核酸分子から分離された核酸分子を意味する。さらに、単離された核酸分子は、組換えまたは合成の核酸分子などの遺伝子操作された核酸分子を含むことができる。
ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲルろ過および／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法により天然供給源（例えば、生物学的試料）から取得（例えば、精製）され得る。精製されたポリペプチドはまた、例えば、発現ベクターに核酸分子を発現させることによって、または化学合成によって得ることができる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて測定することができる。同様に、核酸分子は、通常行われる方法、例えば、限定されないが、組換え核酸技術（例えば、制限酵素消化およびライゲーション）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995参照）を用いて取得（例えば、単離）され得る。さらに、単離された核酸分子は、化学的に合成することができる。
祖先ウイルスまたはその一部を使用する方法
本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部、特に、同時代のウイルスまたはその一部と比較して低減した血清有病率を示すものは、多数の研究および／または治療用途において使用することができる。例えば、本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、ヒトまたは動物の医療において、遺伝子治療（例えば、遺伝子移入のためのベクターもしくはベクターシステムにおいて）またはワクチン接種（例えば、抗原提示用）のために使用することができる。より具体的には、本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、遺伝子付加、遺伝子増加、ポリペプチド製剤の遺伝子送達、遺伝子ワクチン接種、遺伝子サイレンシング、ゲノム編集、遺伝子治療、ＲＮＡｉ送達、ｃＤＮＡ送達、ｍＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡスポンジング、遺伝子免疫、光遺伝学的遺伝子治療、遺伝子組換え、ＤＮＡワクチン接種またはＤＮＡ免疫のために使用することができる。
本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部、特に、同時代のウイルスまたはその一部と比較して低減した血清有病率を示すものは、多数の研究および／または治療用途において使用することができる。例えば、本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、ヒトまたは動物の医療において、遺伝子治療（例えば、遺伝子移入のためのベクターもしくはベクターシステムにおいて）またはワクチン接種（例えば、抗原提示用）のために使用することができる。より具体的には、本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、遺伝子付加、遺伝子増加、ポリペプチド製剤の遺伝子送達、遺伝子ワクチン接種、遺伝子サイレンシング、ゲノム編集、遺伝子治療、ＲＮＡｉ送達、ｃＤＮＡ送達、ｍＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡスポンジング、遺伝子免疫、光遺伝学的遺伝子治療、遺伝子組換え、ＤＮＡワクチン接種またはＤＮＡ免疫のために使用することができる。
宿主細胞は、インビトロで（例えば、培養下で増殖中に）またはインビボで（例えば、対象において）祖先ウイルスまたはその一部により形質導入あるいは感染され得る。インビトロで祖先ウイルスまたはその一部により形質導入または感染され得る宿主細胞は本明細書に記載される；インビボで祖先ウイルスまたはその一部により形質導入または感染され得る宿主細胞としては、限定されないが、脳、肝臓、筋肉、肺、眼（例えば、網膜、網膜色素上皮）、腎臓、心臓、生殖腺（例えば、精巣、子宮、卵巣）、皮膚、鼻腔、消化器系、膵臓、膵島細胞、神経細胞、リンパ球、耳（例えば、内耳）、毛包および／または腺（例えば、甲状腺）が挙げられる。
本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、（他のウイルス配列とシスまたはトランスである）導入遺伝子を含むように修飾することができる。導入遺伝子は、例えば、レポーター遺伝子（例えば、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もしくはルシフェラーゼ、または赤血球凝集素もしくはＭｙｃなどの抗原タグドメインを含む融合ポリペプチド）または治療遺伝子（例えば、ホルモンもしくはそれらの受容体、増殖因子またはその受容体、分化因子またはその受容体、免疫系調節因子（例えば、サイトカインおよびインターロイキン）またはその受容体、酵素、ＲＮＡ（例えば、阻害性ＲＮＡもしくは触媒ＲＮＡ）または標的抗原（例えば、発癌性抗原、自己免疫抗原）をコードする遺伝子）であり得る。
特定の導入遺伝子は、少なくとも部分的に、治療される特定の疾患または欠損症に依存する。単に一例として、遺伝子移入または遺伝子治療は、血友病、網膜色素変性症、嚢胞性線維症、レーバー先天性黒内障、リソソーム貯蔵障害、先天性代謝異常（例えば、フェニルケトン尿症などのアミノ酸代謝の先天性異常、プロピオン酸血症などの有機酸代謝の先天性異常、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤ）などの脂肪酸代謝の先天異常）、癌、色覚異常、コーンロッドジストロフィー、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性症）、リポポリペプチドリパーゼ欠損症、家族性高コレステロール血症、脊髄性筋萎縮症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満症、炎症性腸疾患、糖尿病、うっ血性心不全、高コレステロール血症、難聴、冠状動脈性心臓病、家族性腎アミロイドーシス、マルファン症候群、致死性家族性不眠症、クロイツフェルトヤコブ病、鎌状赤血球病、ハンチントン病、前頭側頭葉変性症、アッシャー症候群、乳糖不耐症、脂質蓄積障害（例えば、ニーマンピック病、Ｃ型）、バッテン病、先天性脈絡膜欠如、ＩＩ型糖原病（ポンペ病）、毛細血管拡張性運動失調症（ルイバー症候群）、先天性甲状腺機能低下症、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）および／または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療に適用することができる。
また、導入遺伝子は、対象（例えば、ヒト、動物（例えば、コンパニオンアニマル、家畜、絶滅寸前の動物）の免疫に有用である免疫原であり得る。例えば、免疫原は、生物（例えば、病原生物）またはその免疫原性部分もしくはその構成成分（例えば、毒素ポリペプチドまたはその副生成物）から得ることができる。一例として、免疫原性ポリペプチドを得ることができる病原生物としては、ウイルス（例えば、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、オルトミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルス）、原核生物（例えば、肺炎球菌（Pneumococci）、ブドウ球菌（Staphylococci）、リステリア菌（Listeria）、シュードモナス属（Pseudomonas））および真核生物（例えば、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、線虫）が挙げられる。本明細書に記載される方法およびこのような方法によって製造される組成物は、任意の特定の導入遺伝子によって限定されるものではないことが理解される。
通常、生理学的に適合した担体中に懸濁される祖先ウイルスまたはその一部を対象（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適切な担体としては、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を用いて製剤化されてもよい生理食塩水、ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチンおよび水が含まれる。祖先ウイルスまたはその一部は、細胞に形質導入または感染させ、過度の副作用なしに治療上の利益を提供するために、遺伝子移入および発現の十分なレベルを与えるのに十分な量で投与される。従来のおよび医薬として許容される投与経路としては、限定されないが、例えば、肝臓もしくは肺などの臓器への直接送達、経口、鼻腔内、気管内、吸入による、静脈内、筋肉内、眼内、皮下、皮内、経粘膜、または他の投与経路によるものが挙げられる。所望により、投与経路を組み合わせることができる。
対象に投与される祖先ウイルスまたはその一部の用量は、主に、治療される状態、ならびに対象の年齢、体重および健康などの因子に依存する。例えば、ヒト対象に投与される祖先ウイルスまたはその一部の治療的有効量は、一般的に、祖先ウイルスの約１×１０１～１×１０１２のゲノムコピー（ＧＣ）（例えば、約１×１０３～１×１０９ＧＣ）の濃度を含有する約０．１ｍｌ～約１０ｍｌの溶液の範囲にある。導入遺伝子の導入および／または発現は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質アッセイによって、投与後の種々の時点でモニターすることができる。いくつかの例において、導入遺伝子の発現レベルは、投薬の頻度および／または量を決定するためにモニターすることができる。また、治療目的のために記載されたものと類似する投薬計画を免疫化のために利用することができる。
また、本明細書に記載される方法は、ウイルスまたはその一部の１つまたは複数の免疫原性ドメインを修飾または除去するように、前方進化をモデリングするために使用することができる。
本発明によれば、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学、生化学および組換えＤＮＡ技術を採用してもよい。このような技術は、文献に十分に説明されている。本発明は、特許請求の範囲に記載される、対象とする方法および組成物の範囲を限定するものではない以下の実施例においてさらに説明される。
実施例
実施例
祖先配列のコンピュータ計算による予測
ＡＡＶキャプシドの７５個の異なるアミノ酸配列のセットは、ＧｅｎＢａｎｋなどの多数の公共データベースから取得し、配列は、ＰＲＡＮＫ－ＭＳＡアルゴリズム、バージョン１２１００２を用いて整列し、オプションは「－Ｆ」である。
ＡＡＶキャプシドの７５個の異なるアミノ酸配列のセットは、ＧｅｎＢａｎｋなどの多数の公共データベースから取得し、配列は、ＰＲＡＮＫ－ＭＳＡアルゴリズム、バージョン１２１００２を用いて整列し、オプションは「－Ｆ」である。
ＰｒｏｔＴｅｓｔ３（例えば、Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5；ワールドワイドウェブ上のdarwin.uvigo.es/software/prottest3で利用可能である）は、様々な条件下（例えば、ＰｒｏＴｅｓｔ３に含まれるもの、すなわち、「＋Ｉ」、「＋Ｆ」、「＋Ｇ」およびそれらの組合せ）でポリペプチド進化の様々なモデル（例えば、ＰｒｏＴｅｓｔ３に含まれるもの、すなわち、ＪＴＴ、ＬＧ、ＷＡＧ、ＶＴ、ＣｐＲｅｖ、ＲｔＲｅｖ、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＤＣＭｕｔ、ＦＬＵ、Ｂｌｏｓｕｍ６２、ＶＴ、ＨＩＶｂ、ＭｔＡｒｔ、ＭｔＭａｍ）を評価するために使用された。＋Ｇおよび＋Ｆ（Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401; およびCaoet al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27）を用いたＪＴＴモデル（Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82）は、ＰｒｏＴｅｓｔ３において実行されるその赤池情報量規準（ＡＩＣ；Hirotugu, 1974, IEEE Transactions on Automatic Control, 19:716-23）に基づいて選択した。
ＡＡＶ進化の系統発生をＰｈｙＭＬ（Guindon and Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704）を用いて構築した。図３を参照されたい。系統樹は、ＪＴＴ＋Ｆ置換モデルを用いて作成し、４つの離散置換カテゴリと概算ガンマ形状パラメータを有した。得られた系統樹は、最近隣交換（Nearest Neighbor Interchange）（ＮＮＩ）とサブツリー枝刈りおよび再移植（Subtree Pruning and Re-Grafting）（ＳＰＲ）を介して改善し、「ＳＨ様」バリアントを用いて、ブートストラップと近似尤度比テスト（ａＬＲＴ；Anisimova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52）を介して有意性について評価した。
次に、上記で構築された系統樹は、系統発生内部の全ての節でＡＡＶキャプシドの祖先状態を概算するために使用した。祖先キャプシド配列は、Ｌａｚａｒｕｓ（ｓｆ．ｎｅｔのＳｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ）に含まれる最大尤度の系統発生学的分析（ＰＡＭＬ）ソフトウェア（Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6；ワールドワイドウェブ上のabacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.htmlで利用可能である）を介した最大尤度原理を用いて再構築した。より具体的には、Ｌａｚａｒｕｓ／ＰＡＭＬ再構築は、４ガンマ分布カテゴリを用いたＪＴＴ＋Ｆ置換モデルによるアミノ酸再構築を生成するように設定した。ＡＡＶ５を外集団として使用した。最後に、「Ｉ」オプションは、ＰＡＭＬ再構築を行った後、インデルを配置するために追加した（すなわち、フィッチアルゴリズムを用いた最大節約を介して二値コード化し、配置した）。
再構築が最大尤度法で行われたため、任意の残基を所定の節で所定の位置にあった尤度を計算することができる。これを行うために、追加のスクリプトは、特定の閾値下に計算された事後確率を有する配列に沿った全ての位置を同定するために記述した。０．３の閾値を選択し、これは、０．３を超える計算された事後確率を有する任意のアミノ酸がライブラリーの合成に含まれたことを意味する。これらの残基は、ライブラリー中の目的とするバリアントであるように選択した。
配列を確定するために、追加の有用性は、コドンを選択するようにコード化されなければならなかった。スクリプトは、別のＡＡＶ配列（ＡＮＣ８０足場配列と約９２％の配列同一性を有するＡＡＶＲｈ１０）と同様のコドンを導き出し、コドン置換マトリックスに基づく配列の不一致があった場合にコドンを置換するための新規なアルゴリズムを適用するように記述した。新規なアルゴリズムを以下に示す：
前提：アミノ酸配列、Ｐｔ、対応するヌクレオチド配列を有する、Ｎｔ、この場合、ＮｔはＰｔをコードする；およびタンパク質配列、Ｐｉ、この場合、ＰｉはＰｔに強い相同性を示す。
スコアリングのためのＢｌｏｓｕｍ６２表を用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ－ＷｕｎｓｃｈによりＰｉとＰｔを整列させる。Ｎｔからの対応するコドンを用いて、タンパク質アラインメントに踏み込むことによって、新しいヌクレオチド配列、Ｎｉを生成する。
この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸はＰｉに正確に合致し、
コドン－ＰＡＭマトリックス（Schneider et al., 2005, BMC Bioinform., 6:134）からの「最良スコアリング」コドン、この場合、置換が存在する、
ギャップ、この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸に対して整列されたＰｉにギャップが存在する、および
Ｎｔ（所定のアミノ酸をコードする）において最も頻繁に生じるヌクレオチド、この場合、Ｐｔにおけるギャップに対して整列されるＰｉにアミノ酸が存在する。
前提：アミノ酸配列、Ｐｔ、対応するヌクレオチド配列を有する、Ｎｔ、この場合、ＮｔはＰｔをコードする；およびタンパク質配列、Ｐｉ、この場合、ＰｉはＰｔに強い相同性を示す。
スコアリングのためのＢｌｏｓｕｍ６２表を用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ－ＷｕｎｓｃｈによりＰｉとＰｔを整列させる。Ｎｔからの対応するコドンを用いて、タンパク質アラインメントに踏み込むことによって、新しいヌクレオチド配列、Ｎｉを生成する。
この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸はＰｉに正確に合致し、
コドン－ＰＡＭマトリックス（Schneider et al., 2005, BMC Bioinform., 6:134）からの「最良スコアリング」コドン、この場合、置換が存在する、
ギャップ、この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸に対して整列されたＰｉにギャップが存在する、および
Ｎｔ（所定のアミノ酸をコードする）において最も頻繁に生じるヌクレオチド、この場合、Ｐｔにおけるギャップに対して整列されるＰｉにアミノ酸が存在する。
さらに、２つの単一ヌクレオチド変化は、野生型ＡＡＶにおけるＡＡＶキャプシド遺伝子内のフレームのうちコードされているアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の転写を除去するために行った。ＡＡＰ（同時代または祖先）のコーディングは、この再構築の一部ではなかったので、ＡＡＰの発現はｃａｐ配列中に同義突然変異を作製することによって除去し、ＡＡＰ配列はウイルス生成中にトランスで提供した。
祖先ＡＡＶ ＶＰ１配列の発現
実験は、予測された祖先ＡＡＶキャプシド配列がウイルスベクターを作製するために使用され得るかどうかを決定するために行った。
実験は、予測された祖先ＡＡＶキャプシド配列がウイルスベクターを作製するために使用され得るかどうかを決定するために行った。
多数の予測された祖先ＡＡＶキャプシド配列をクローニングした。祖先キャプシドのライブラリーは、一過性トランスフェクションにおいてウイルス粒子の形成を可能にするようにｒｅｐ－ｃａｐ発現プラスミドに移した。適切な発現レベルならびにＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のスプライシングを維持するために、ライブラリーｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐコード配列におけるｃａｐの５’に位置したＨｉｎｄＩＩＩと、ｃａｐ終止コドンとポリアデニル化シグナルの間で遺伝子操作されたＳｐｅＩとを切断することによってクローニングした。結果として、より従来の「ＲＥＰ／ＣＡＰ」構築物に祖先キャプシドをクローニングするために、継代プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで消化し、ゲル精製し、同様に消化されたｒｅｐ／ｃａｐプラスミドにライゲーションした。
発現されたポリペプチドを１０％ＳＤＳゲル上で分離した。図６に示されるように、キャプシドポリペプチドは適切に発現し、多数の祖先ＡＡＶ配列（Ａｎｃ８０Ｌ４４、Ａｎｃ８０Ｌ２７およびＡｎｃ８０Ｌ６５）ならびに同時代のＡＡＶ配列のＡＡＶ２／８からＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にスプライシングされた。
ウイルス力価
ＡＡＶは、ウイルス粒子アセンブリに必要とされる全てのエレメントをコードするプラスミドの一過性共トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞中で産生した。簡単には、ＨＥＫ２９３細胞を９０％コンフルエントになるまで増殖させ、（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲによって挟まれたルシフェラーゼ導入遺伝子（ＣＭＶプロモーターによって発現される）をコードするウイルスゲノムプラスミド、（ｂ）ＡＡＶ２ ｒｅｐと本明細書に開示されている合成されたキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶパッケージングプラスミド、（ｃ）キャプシドを発現するＡＡＶ２－ＡＡＰ、および（ｄ）ＡＡＶパッケージングとアセンブルに必要とされるアデノウイルスヘルパー遺伝子を用いてトランスフェクトした。細胞を３７℃にて２日間インキュベートし、細胞および培地を採取し、回収した。
ＡＡＶは、ウイルス粒子アセンブリに必要とされる全てのエレメントをコードするプラスミドの一過性共トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞中で産生した。簡単には、ＨＥＫ２９３細胞を９０％コンフルエントになるまで増殖させ、（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲによって挟まれたルシフェラーゼ導入遺伝子（ＣＭＶプロモーターによって発現される）をコードするウイルスゲノムプラスミド、（ｂ）ＡＡＶ２ ｒｅｐと本明細書に開示されている合成されたキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶパッケージングプラスミド、（ｃ）キャプシドを発現するＡＡＶ２－ＡＡＰ、および（ｄ）ＡＡＶパッケージングとアセンブルに必要とされるアデノウイルスヘルパー遺伝子を用いてトランスフェクトした。細胞を３７℃にて２日間インキュベートし、細胞および培地を採取し、回収した。
細胞－培地懸濁液を３回連続した凍結融解サイクルによって溶解した。次に、溶解物を遠心分離によって清澄化し、徹底的なＤＮＡ消化を行う条件下で酵素、ここではＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を用いて処置し、ウイルス粒子の外側に存在する任意のＤＮＡを消化した。ＡＡＶ調製物は、対照ＤＮＡテンプレート、この場合は、ベクターゲノムと比べて、同一のＴａｑＭａｎ（商標）プライマーとプローブ結合配列を含む線状化プラスミドの線形測定範囲に含まれるように希釈した。ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲは、選択したウイルスベクターゲノムにアニーリングするプライマーとプローブを用いて行った。以下の表２に示すように、ミリリットル（ｍｌ）あたりのゲノムコピー（ＧＣ）におけるＴａｑＭａｎ（商標）測定に基づいて力価を計算した。
祖先的に再構築されたＡＡＶキャプシド粒子による小規模ベクター生成結果は、ＡＡＶ２に類似したが、ＡＡＶ８に対して低減した収量を実証し、これらの両方は同時代のＡＡＶに基づくベクター調製物である。
インビトロのウイルス形質導入
インビトロのウイルス形質導入は、細胞を感染させる、予測された祖先ＡＡＶ配列を含有するウイルスの能力を評価するために行った。
インビトロのウイルス形質導入は、細胞を感染させる、予測された祖先ＡＡＶ配列を含有するウイルスの能力を評価するために行った。
配列のＡｎｃ８０ライブラリーを使用したハイスループットベクター生成後、ＨＥＫ２９３細胞をそれぞれのウイルスベクターで形質導入した。Ａｎｃ８０配列に加えて、それぞれのウイルスベクターはルシフェラーゼ導入遺伝子を含有した。ルシフェラーゼは、形質導入細胞または細胞溶解物にルシフェリン基質を添加後、９６ウェルプレートリーダーで生物発光を定量することによって測定した。定量化後、４つの連結された９６ウェルプレートにおけるルシフェラーゼ発現のヒートマップを作製した（各プレートにおいて対照の列を除く）。ハイスループットベクター生成のプロセスに関連した、大多数の挿入、欠失および遷移に起因して、多数のベクターは非機能的であった。本明細書の目的のために、このアッセイにおいて機能的である（すなわち、ＨＥＫ２９３細胞を形質導入し、導入遺伝子を発現することができる）ウイルスだけをさらに評価した。
ＨＥＫ２９３細胞は、２つの同時代のＡＡＶベクター（ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８）と３つの予測された祖先ＡＡＶベクター（Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡｎｃ８０Ｌ６５）を用いて、細胞あたり１×１０４ゲノムコピー（ＧＣ）の等しい感染の多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。各ベクターは、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子またはｅＧＦＰをコードする導入遺伝子のいずれかを含有した。細胞は、６０時間後、ＡＭＧ ＥｖｏｓＦｌ光学顕微鏡のＧＦＰチャネルを用いて撮像した。図７は、インビトロで形質導入後のルシフェラーゼ発現を示す。祖先ＡＡＶウイルスの各々は、ＨＥＫ２９３細胞の効率的な形質導入を実証した。
インビボでのレチナール形質導入
レチナール形質導入は、祖先ＡＡＶベクターがインビボでマウス網膜細胞を標的とすることができるかどうかを決定するために行った。
レチナール形質導入は、祖先ＡＡＶベクターがインビボでマウス網膜細胞を標的とすることができるかどうかを決定するために行った。
マウスの目は、２×１０８個のゲノムコピー（ＧＣ）の３種の異なる祖先ＡＡＶ（Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡｎｃ８０Ｌ６５）と同時代のＡＡＶ（ＡＡＶ２／８）で形質導入し、それらの全てはｅＧＦＰをコードする導入遺伝子を含んでいた。形質導入のために、各ＡＡＶベクターは、注射装置を用いたベクターボーラスの送達を介して、光受容体と網膜色素上皮層の間に空間を生成することにより網膜下に外科的に送達した。ベクターボーラスは網膜下空間に残存し、サブ網膜下の剥離を経時的に解決した。ＧＦＰ発現は、Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ（商標）を用いた瞳孔拡張後、動物の網膜の眼底撮影により非侵襲的にモニターした。示された網膜の全ては、網膜への祖先ＡＡＶの、様々な程度の成功した標的化を実証した。
また、網膜組織学を行い、形質導入された細胞型を同定するために蛍光顕微鏡下で可視化した。組織学は、上述したＡｎｃ８０Ｌ６５祖先ＡＡＶベクターで形質導入されたマウス網膜上で行った。Ａｎｃ８０Ｌ６５を媒介したｅＧＦＰ発現は、外核層（ＯＮＬ）、内部セグメント（ＩＳ）および網膜色素上皮（ＲＰＥ）において明らかであり、祖先Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターがマウス光受容体と網膜色素上皮細胞を標的とすることを示した。
中和抗体アッセイ
中和抗体アッセイは、祖先ＡＡＶウイルスが、同時代のＡＡＶウイルスよりも抗体中和に対してより抵抗性であるか否かを評価するために行われる。中和抗体アッセイは、抗体の不存在下における対照と比較して、５０％以上の感染を中和する抗体濃度（または実験試料が抗体濃度を含有する力価）を測定する。
中和抗体アッセイは、祖先ＡＡＶウイルスが、同時代のＡＡＶウイルスよりも抗体中和に対してより抵抗性であるか否かを評価するために行われる。中和抗体アッセイは、抗体の不存在下における対照と比較して、５０％以上の感染を中和する抗体濃度（または実験試料が抗体濃度を含有する力価）を測定する。
血清試料またはＩＶＩＧ原液（２００ｍｇ／ｍｌ）を連続して２倍希釈し、希釈していない試料および希釈した試料は、１０４のＭＯＩで約３０分間３７℃にて、祖先ＡＡＶウイルス、Ａｎｃ８０Ｌ６５、および同時代のＡＡＶウイルス、ＡＡＶ２／８と同時にインキュベートされる。各ウイルスはルシフェラーゼ導入遺伝子を含む。次に、混合ベクターおよび抗体試料をＨＥＫ２９３細胞に形質導入する。これらの実験について、使用された抗体試料は、静注用イムノグロブリン（ＩＶＩＧ）、１０００を超える血液ドナーの血漿から抽出し、プールされたＩｇＧ（例えば、Ｇａｍｍａｇａｒｄ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）またはＧａｍｎｅｘ（商標）（Ｇｒｉｆｏｌｓ；Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）として市販されている）である。形質導入の開始から４８時間後、細胞は、ルシフェラーゼを検出するために生物発光によりアッセイされる。中和抗体力価は、５０％以上の中和（試料の形質導入／試料の不存在下での対照ウイルスの形質導入）が到達する試料の希釈を同定することによって決定される。
Ａｎｃ８０の特徴付け
本明細書に記載される方法に基づいて、最も可能の高いＡｎｃ８０配列（事後確率によって決定される）が得られ、Ａｎｃ８０Ｌ１（配列番号３５はＡｎｃ８０Ｌ１キャプシドの核酸配列を示し、配列番号３６はＡｎｃ８０Ｌ１ ＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す）と指定された。Ａｎｃ８０確率ライブラリーは、営利企業によって、本明細書に記載される配列を用いて合成し、発現ベクターにサブクローニングした。
本明細書に記載される方法に基づいて、最も可能の高いＡｎｃ８０配列（事後確率によって決定される）が得られ、Ａｎｃ８０Ｌ１（配列番号３５はＡｎｃ８０Ｌ１キャプシドの核酸配列を示し、配列番号３６はＡｎｃ８０Ｌ１ ＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す）と指定された。Ａｎｃ８０確率ライブラリーは、営利企業によって、本明細書に記載される配列を用いて合成し、発現ベクターにサブクローニングした。
Ａｎｃ８０ライブラリーは、組合せアッセイにおいてベクター収率および感染力についてクローン的に評価した。このスクリーニングのうち、Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２３）、およびいくつかの他の変異体をさらに特徴付けた。
Ａｎｃ８０ライブラリーとＡｎｃ８０Ｌ６５を配列の相違の観点から比較した（図８；対角線から上は％、下はアミノ酸の相違数）。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを用いて、Ａｎｃ８０Ｌ６５に最も近い公的に利用可能な配列はｒｈ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８８２０１．１）である。
図９は、Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡＡＶ２に相当するベクター収率を生成したこと（パネルＡ）、透過型顕微鏡検査（ＴＥＭ）下でウイルス粒子を生成したこと（パネルＢ）、変性条件下でのＳＤＳ ｐａｇｅに基づくＡＡＶ ｃａｐとＶＰ１、２および３タンパク質を生化学的に生成したこと（パネルＣ）、およびＡＡＶキャプシド抗体、Ｂ１を用いたウェスタンブロット（パネルＤ）を示す。これらの実験は、以下の段落でより詳細に記載される。
簡単には、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ２７、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターは、ｅＧＦＰで構成されるレポーター構築物を含有する小規模において生成し、ＣＭＶプロモーター下のホタルルシフェラーゼは小規模において生成した。次に、ウイルスのこれらの小規模製剤の力価は、定量ＰＣＲを介して得た。これらの実験に基づいて、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターは、ＡＡＶ２に匹敵するウイルスレベルを生成することが見出された（図９Ａ）。
Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシドタンパク質が、適切な大きさおよび立体構造の完全なウイルス様粒子にアセンブルされていることを確認するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて顕微鏡写真を得た。Ａｎｃ８０－Ｌ０６５の大規模の精製された調製物は、フォルムバール被覆した銅グリッドに装填し、次に、酢酸ウラニルで染色した。顕微鏡写真は、２０～２５ｎｍの直径を有する無傷な六角形の粒子を示した（図９Ｂ）。
合成祖先キャプシド遺伝子が正常に処理（すなわち、スプライスおよび発現）されたかどうかを決定するために、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターの大規模で精製された調製物を変性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに装填した（１Ｅ１０ ＧＣ／ウェル）。ウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を表すバンドは、明らかに、各ベクター調製物に存在した（図９Ｃ）。ＡＡＶキャプシド抗体Ｂ１を用いたウェスタンブロットにより、さらに、これらのバンドが予測されたタンパク質を表すことを確認した（図９Ｄ）。
さらに、図１０は、Ａｎｃ８０Ｌ６５が、読み出し（パネルＡ）またはルシフェラーゼ（パネルＢ）対ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ８対照として、ＧＦＰを用いて、ＭＯＩ １０Ｅ４ ＧＣ／細胞でＨＥＫ２９３細胞においてインビトロで哺乳動物組織および細胞を感染させたことを示す。また、Ａｎｃ８０Ｌ６５は、核のＬａｃＺ導入遺伝子をコードする指示されたＡＡＶのＩＶ注射後（上段の行、パネルＣ）、ＧＦＰをコードする指示されたＡＡＶの直接的な筋肉内（ＩＭ）注射後（中段の行、パネルＣ）、およびＧＦＰをコードする指示されたＡＡＶによる網膜下注射後（下段の行、パネルＣ）に肝臓の標的に効果的であった。これらの実験は、以下の段落でより詳細に記載される。
祖先ビリオンの感染度の相対的尺度を得るために、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰ配列とホタルルシフェラーゼ配列を含む二シストロン性の受容体構築物を含有するＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ４４、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ２７、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２３、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２４およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２５を生成した。次に、ＨＥＫ２９３細胞でコンフルエントした９６ウェルプレートを、１Ｅ４ ＧＣ／細胞のＭＯＩ（上記したｑＰＣＲにより取得された力価）で各ベクターによる形質導入に供した。４８時間後、蛍光顕微鏡検査により、形質導入された細胞中のＧＲＰの存在を確認した（図１０Ａ）。次に、細胞をルシフェラーゼの存在についてアッセイし（図１０Ｂ）、これは、Ａｎｃ８０由来のベクターで形質導入された細胞におけるルシフェラーゼの発現が、ＡＡＶ８（低レベルの形質導入）とＡＡＶ２（高レベルの形質導入）の間にあることを決定した。
インビボという事情において遺伝子移入の相対的効率を評価するために、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５の精製された高力価の調製物を得た。３．９Ｅ１０ ＧＣの各ベクターは、ＴＢＧプロモーターの制御下で核のＬａｃＺをコードする導入遺伝子を封入し、一般的な麻酔後にＩＰ注射によりＣ５７ＢＬ／６マウス（条件あたり３匹）に注射した。注射から２８日後、マウスを屠殺し、組織を回収した。肝臓は、標準的な組織学的技術により切片にし、β－ガラクトシダーゼについて染色した。次に、切片を顕微鏡で画像化し、代表的な画像を図１０Ｃの上段の行に示す。
続いて、ｐＣＡＳＩプロモーターの制御下でｅＧＦＰおよびｈＡ１ＡＴをコードする二シストロン性の導入遺伝子を含有する同じ血清型のベクターを得た。マウス骨格筋を形質導入するＡｎｃ８０Ｌ６５の能力を評価するために、１Ｅ１０ＧＣの各ベクターは、一般的な麻酔後、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（条件あたり５匹のマウス）の骨格筋に注射した。注射から２８日後、マウスを屠殺し、組織を凍結切片し、ｅＧＦＰの存在を蛍光共焦点顕微鏡を用いて評価した（青色はＤＡＰＩであり、緑色のｅＧＦＰである）。代表的な画像を図１０Ｃの中段の行に示す。これらの実験は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターが筋肉内注射によりマウスの骨格筋を形質導入することができたことを実証した。
今回、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰ導入遺伝子のみをコードする構築物をキャプシド形成する、同じ血清型のベクターを取得した。２Ｅ９粒子は、一般的な麻酔後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに網膜下注射した。注射から２８日後、マウスを屠殺し、眼を回収し、凍結切片し、およびｅＧＦＰの存在を蛍光共焦点顕微鏡を用いて評価した（青色はＤＡＰＩであり、緑色はｅＧＦＰである）。代表的な画像を図１０Ｃの下段に示す。これらの実験は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターが、ＡＡＶ８ベクターに匹敵するレベルでマウス網膜に形質導入することができることを実証する。
簡単には、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰとホタルルシフェラーゼを含む二シストロン性の導入遺伝子を封入するＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ウイルスベクターの精製された高力価調製物を得る。次に、これらのベクターは、ＩＶＩＧの２倍連続希釈物（１０ｍｇ、５ｍｇ、２．５ｍｇなど）と共にインキュベートし、またはＩＶＩＧなし（条件あたり１Ｅ９ ＧＣ）でインキュベートする。インキュベーション後、ベクターを用いて、ウェルあたり１Ｅ４のＭＯＩ（ウェルあたり１希釈）でＨＥＫ２９３細胞に形質導入する。４８時間後、ルシフェラーゼの相対量を発光アッセイによりアッセイする。
追加の祖先ＡＡＶキャプシドの産生
次に、最も可能性の高い祖先ＡＡＶキャプシド配列（事後確率により決定される）は、民間の研究所（Ｇｅｎ９）を介して合成し、線形ｄｓＤＮＡとして提供した。続いて、これらのアミノ酸配列は、それらが異なる程度を確認するために、現存のＡＡＶの配列と比較した（図１１）。各々の祖先ＶＰ１タンパク質は、３．６％～９．３％で選択された代表的な現存のＡＡＶのものと相違し（図１１Ａ）、一方、祖先ＶＰ３タンパク質は４．２～９．４％で相違する（図１１Ｂ）。Ａｎｃ１１０は、ＶＰ１について８９％の配列同一性であり、強力なＣＮＳ形質導入ベクターであるＡＡＶ９に最も近い再構築された祖先ベクターである。これらのキャプシドは、それぞれ、制限酵素消化（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＳｐｅＩ）およびＴ４ライゲーションによりＡＡＶ産生プラスミド（ｐＡＡベクター２／空）にサブクローニングされた。これらのクローンを制限消化およびサンガー配列決定により確認し、その後、プラスミドＤＮＡの中規模調製物を生成した。
次に、最も可能性の高い祖先ＡＡＶキャプシド配列（事後確率により決定される）は、民間の研究所（Ｇｅｎ９）を介して合成し、線形ｄｓＤＮＡとして提供した。続いて、これらのアミノ酸配列は、それらが異なる程度を確認するために、現存のＡＡＶの配列と比較した（図１１）。各々の祖先ＶＰ１タンパク質は、３．６％～９．３％で選択された代表的な現存のＡＡＶのものと相違し（図１１Ａ）、一方、祖先ＶＰ３タンパク質は４．２～９．４％で相違する（図１１Ｂ）。Ａｎｃ１１０は、ＶＰ１について８９％の配列同一性であり、強力なＣＮＳ形質導入ベクターであるＡＡＶ９に最も近い再構築された祖先ベクターである。これらのキャプシドは、それぞれ、制限酵素消化（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＳｐｅＩ）およびＴ４ライゲーションによりＡＡＶ産生プラスミド（ｐＡＡベクター２／空）にサブクローニングされた。これらのクローンを制限消化およびサンガー配列決定により確認し、その後、プラスミドＤＮＡの中規模調製物を生成した。
次に、これらのプラスミドの各々を、ｅＧＦＰとホタルルシフェラーゼの両方をコードするレポーター遺伝子を含有するＡＡＶベクターを生成させるために使用した。前述のように、これらのベクターを小規模で三連で生成した。その後、ウイルスの粗調製物を、ｑＰＣＲを介して力価測定し、ＡＡＶ８と比較して２．７１％～１８３．１％のウイルス粒子を生成することを見出した（図１２および１３）。Ａｎｃ１１０の産生および感染数はＡＡＶ９について報告されたものと同様である。続いて、これらの力価を用いて、相対感染力を評価するために力価制御実験を設定した。Ａｎｃ１２６は、その産生が有意に低下したため、力価制御されなかった。その結果、Ａｎｃ１２６の感染力に関するデータは、この実験における他のウイルスの感染力と正確に比較することができない。他のベクターを用いて、１．９Ｅ３ ＧＣ／細胞の感染の多重度（ＭＯＩ）でＨＥＫ２９３細胞を形質導入した。
形質導入から６０時間後、細胞を、蛍光顕微鏡検査によりＧＦＰ発現について評価した。ｅＧＦＰ陽性細胞は、陰性対照を除き、各条件下で検出された（図１４）。これは、Ａｎｃ１１０を含む、予測され、合成されおよびクローン化された祖先配列の各々が、生存可能な感染性ウイルス粒子を生成することができることを示す。感染力の相対的レベルという概念を得るために、ルシフェラーゼアッセイをまた、同じ細胞について行った。結果は、祖先ベクターの各々が、ＡＡＶ８と比較して２８．３％～８５０．８％でＨＥＫ２９３細胞に形質導入することが可能であることを示す（図１５および１６）。Ａｎｃ１１０の形質導入効率は、ＡＡＶ９について報告されたものと同様であることに留意されたい。力価制御されなかったため、Ａｎｃ１２６は相対的な形質導入の分析から除外した。
まとめると、８つの新規な祖先ＡＡＶキャプシド遺伝子を合成し、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２、Ａｎｃ１１０および前述のＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターと一緒に機能的ウイルスベクターの生成に用いた。生成および感染力をインビトロで評価し、それらの知見の概要を図１７に示す。Ａｎｃ１１０のインビトロ産生および感染力は、ＡＡＶ９および血液脳関門を通過することができる他のウイルスについて期待される範囲内であった。
ベクター免疫予防
ベクター免疫予防において、遺伝子治療用ビヒクル（ＡＡＶなど）は、感染性物質に対する広範に中和する抗体をコードする導入遺伝子を送達するために使用される。例えば、Balazs et al. （2013, Nat. Biotechnol., 31:647-52）； Limberis et al.（2013, Sci. Transl. Med., 5:187ra72）； Balazs et al.（2012, Nature, 481:81-4）； およびDeal et al.（2014, PNAS USA, 111:12528-32）を参照されたい。この治療の１つの利点は、宿主がそれら自体の細胞に抗体を産生することであり、これは、単一の投与が病因物質に対する保護の寿命を付与する可能性を有することを意味する。
ベクター免疫予防において、遺伝子治療用ビヒクル（ＡＡＶなど）は、感染性物質に対する広範に中和する抗体をコードする導入遺伝子を送達するために使用される。例えば、Balazs et al. （2013, Nat. Biotechnol., 31:647-52）； Limberis et al.（2013, Sci. Transl. Med., 5:187ra72）； Balazs et al.（2012, Nature, 481:81-4）； およびDeal et al.（2014, PNAS USA, 111:12528-32）を参照されたい。この治療の１つの利点は、宿主がそれら自体の細胞に抗体を産生することであり、これは、単一の投与が病因物質に対する保護の寿命を付与する可能性を有することを意味する。
ドラッグデリバリービヒクル
ＬＵＣＥＮＴＩＳ（ラニビズマブ）およびＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）は共に、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に対して同じヒト化マウスモノクローナル抗体に基づく抗血管形成剤である。ベバシズマブは全長抗体であり、ラニビズマブは断片（Ｆａｂ）であるが、それらは共に、ＶＥＧＦを拮抗することによって、同じメカニズムを介して滲出型加齢黄斑変性症を治療するように作用する。例えば、Mao et al.（2011, Hum. Gene Ther., 22:1525-35）； Xie et al.（2014, Gynecol. Oncol., doi: 10.1016/j.ygyno.2014.07.105）； およびWatanabe et al.（2010, Gene Ther., 17:1042-51）を参照されたい。これらの両分子はタンパク質であるため、それらはＤＮＡにコードされ、導入遺伝子を含有するベクターを用いて形質導入された細胞において産生され、ＡＡＶベクターにパッケージングされるのに十分小さい。
ＬＵＣＥＮＴＩＳ（ラニビズマブ）およびＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）は共に、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）に対して同じヒト化マウスモノクローナル抗体に基づく抗血管形成剤である。ベバシズマブは全長抗体であり、ラニビズマブは断片（Ｆａｂ）であるが、それらは共に、ＶＥＧＦを拮抗することによって、同じメカニズムを介して滲出型加齢黄斑変性症を治療するように作用する。例えば、Mao et al.（2011, Hum. Gene Ther., 22:1525-35）； Xie et al.（2014, Gynecol. Oncol., doi: 10.1016/j.ygyno.2014.07.105）； およびWatanabe et al.（2010, Gene Ther., 17:1042-51）を参照されたい。これらの両分子はタンパク質であるため、それらはＤＮＡにコードされ、導入遺伝子を含有するベクターを用いて形質導入された細胞において産生され、ＡＡＶベクターにパッケージングされるのに十分小さい。
ＡＡＶキャプシドの祖先配列再構築
祖先キャプシド配列は、Ｆｉｎｎｉｇａｎら（2012, Nature, 481:360-4）のような最大尤度法を用いて再構築した。７５個のＡＡＶキャプシド（本明細書に提供されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号）のアラインメントは、ＰＲＡＮＫ ｖ．１２１００２を使用して、－Ｆオプション（Loytynoja & Goldman, 2005, PNAS USA, 102: 10557-62；Loytynoja & Goldman, 2008, Science, 320: 1632-5）を用いて生成し、ＪＴＴ＋Ｆ＋Ｇモデルは、ＰｒｏｔＴｅｓｔ３（Darriba et al., 2011, Bioinform., 27: 1164-5）において実行される赤池（Aikake）情報量規準により、最良適合の系統発生モデルであることが決定された。完全アライメントを図２５に見ることができる。次に、アラインメントおよび最適適合モデルを使用して、ＰｈｙＭＬ３．０（Guindon et al ., 2010, System. Biol, 59:307-21）による系統発生を推測し、ＰｈｙＭＬにおいて実行される近似尤度比検定（ａＬＲＴ）（Anismova & Gascuel, 2006, Syst. Biol., 55:539-52）により評価した。分析に含まれる全てのＡＡＶを有する系統発生の詳細なバージョンを図２６に示す。次に、Ｔｈｏｒｎｔｏｎグループによって開発されたＬａｚａｒｕｓパッケージにより、ＰＡＭＬ４．６（Yang, 2007, Mol. Biol. Evol., 24: 1586-91）を用いて祖先キャプシド配列を推測した。本明細書に示されるように、Ａｎｃ１１０再構築祖先ベクターは、進化的に、ＡＡＶ９およびＲｈ．８に近く、両者は強力なＣＮＳ形質導入ベクターであることが知られている。
祖先キャプシド配列は、Ｆｉｎｎｉｇａｎら（2012, Nature, 481:360-4）のような最大尤度法を用いて再構築した。７５個のＡＡＶキャプシド（本明細書に提供されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号）のアラインメントは、ＰＲＡＮＫ ｖ．１２１００２を使用して、－Ｆオプション（Loytynoja & Goldman, 2005, PNAS USA, 102: 10557-62；Loytynoja & Goldman, 2008, Science, 320: 1632-5）を用いて生成し、ＪＴＴ＋Ｆ＋Ｇモデルは、ＰｒｏｔＴｅｓｔ３（Darriba et al., 2011, Bioinform., 27: 1164-5）において実行される赤池（Aikake）情報量規準により、最良適合の系統発生モデルであることが決定された。完全アライメントを図２５に見ることができる。次に、アラインメントおよび最適適合モデルを使用して、ＰｈｙＭＬ３．０（Guindon et al ., 2010, System. Biol, 59:307-21）による系統発生を推測し、ＰｈｙＭＬにおいて実行される近似尤度比検定（ａＬＲＴ）（Anismova & Gascuel, 2006, Syst. Biol., 55:539-52）により評価した。分析に含まれる全てのＡＡＶを有する系統発生の詳細なバージョンを図２６に示す。次に、Ｔｈｏｒｎｔｏｎグループによって開発されたＬａｚａｒｕｓパッケージにより、ＰＡＭＬ４．６（Yang, 2007, Mol. Biol. Evol., 24: 1586-91）を用いて祖先キャプシド配列を推測した。本明細書に示されるように、Ａｎｃ１１０再構築祖先ベクターは、進化的に、ＡＡＶ９およびＲｈ．８に近く、両者は強力なＣＮＳ形質導入ベクターであることが知られている。
再構築に内在する不確実性を補うために、コンピュータ計算された事後確率を評価して、あいまいな再構築部位を同定するためのスクリプトを作成した。事後確率が０．３より大きい１を超えるアミノ酸を有する祖先的に再構築されたキャプシドに沿った全ての位置が含まれた。１１個のこのような部位を同定し、それぞれ２つの可能性のあるアミノ酸を有する。次に、これらの１１個の二形性部位は、現代のウイルス由来のコドンを用いてＤＮＡライブラリーに組み込まれた（ｒｈ．１０）。再構築はＡＡＰおよびキャプシドの共進化を考慮しなかったため、ライブラリー設計中に非標準的ＣＴＧ開始コドンをＣＡＧに変えることによってＡＡＰオープンリーディングフレームを除去した。さらに、ＡＡＰ ＯＲＦ中の別の下流ＡＴＧもまた、コドンをＡＡＧに変えることによって除去した。これらの修飾は、キャップＯＲＦ中のアミノ酸を変更させなかった。次に、ＤＮＡライブラリーをＤＮＡ２．０により合成し、続いて制限酵素消化およびライゲーションを介して発現ベクターにサブクローニングした。
ベクターおよび配列
アデノ随伴ウイルスベクターは、現存または祖先のウイルスキャプシドのいずれかを用いて偽型とした。現存のキャプシドには、ＡＡＶ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ２７７５７．１）、ＡＡＶ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０．１）、ＡＡＶ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６．１）、ＡＡＶ６．２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３６８９１０）、Ｒｈ．１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８８２０１．１）、ＡＡＶ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＮ０３８５７．１）、ＡＡＶ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４．１）、およびＲｈ３２．３３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３６８９２６）が含まれる。祖先ＡＡＶキャプシドには、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃｌ２７（ＧｅｎＢａｎｋ保留中の提出物）が含まれる。ベクター導入遺伝子カセットには、ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ｆｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＳＶＰＡ、ＣＭＶ．ｆｆＬｕｃｉｆｅａｓｅ．ＳＶＰＡ（インビトロ試験）、ＴＢＧ．ＬａｃＺ．ＲＢＧ（肝臓）、ＴＢＧ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（肝臓および筋肉免疫試験）、ＣＡＳＩ．ｈＡ１ＡＴ．ＦＦ２Ａ．ｅＧＦＰ．ＲＢＧ（肝臓、筋肉）およびＣＭＶ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ（網膜）が挙げられる。
アデノ随伴ウイルスベクターは、現存または祖先のウイルスキャプシドのいずれかを用いて偽型とした。現存のキャプシドには、ＡＡＶ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ２７７５７．１）、ＡＡＶ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０．１）、ＡＡＶ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６．１）、ＡＡＶ６．２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３６８９１０）、Ｒｈ．１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８８２０１．１）、ＡＡＶ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＮ０３８５７．１）、ＡＡＶ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４．１）、およびＲｈ３２．３３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３６８９２６）が含まれる。祖先ＡＡＶキャプシドには、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃｌ２７（ＧｅｎＢａｎｋ保留中の提出物）が含まれる。ベクター導入遺伝子カセットには、ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ｆｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＳＶＰＡ、ＣＭＶ．ｆｆＬｕｃｉｆｅａｓｅ．ＳＶＰＡ（インビトロ試験）、ＴＢＧ．ＬａｃＺ．ＲＢＧ（肝臓）、ＴＢＧ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（肝臓および筋肉免疫試験）、ＣＡＳＩ．ｈＡ１ＡＴ．ＦＦ２Ａ．ｅＧＦＰ．ＲＢＧ（肝臓、筋肉）およびＣＭＶ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ（網膜）が挙げられる。
配列－構造分析
ＡＡＶ８結晶構造（ＰＤＢ ２ＱＡ０）を鋳型として用いて、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ構造相同性モデリングサーバー（Biasini et al., 2014, Nucl. Acids Res., 42:W252-8）を用いてＡｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ３の擬似原子モデルを作成した。ＵＣＳＦキメラパッケージ（Pettersen et al ., 2004, J. Comp. Chem., 25: 1605-12）を用いて、ＡＡＶ２（ＰＤＢ １ＬＰ３）、ＡＡＶ８（ＰＤＢ ２ＱＡ０）およびＡｎｃ８０ ＶＰ３構造をさらに重ね合わせ、残基保存に従って色分けした。次に、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８ ＶＰ３の構造的アライメントを生成し、Ｔ－コーヒーアライメントパッケージ（Notredame et al., 2000, J. Mol . Biol., 302:205-17）で生成されたこれらの３つの血清型のＶＰ１／２ドメインの非構造的アラインメントによって完成した。Ａｎｃ８０Ｌ６５およびＡＡＶ８を分離する突然変異の空間分布はまた、ＡＡＶ８三量体構造の内外表面で視覚化し、この場合、Ａｎｃ８０Ｌ６５およびＡＡＶ８ ＶＰ３の構造的アラインメントにおける可変残基を青で表し、多型残基を赤で表した。
ＡＡＶ８結晶構造（ＰＤＢ ２ＱＡ０）を鋳型として用いて、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ構造相同性モデリングサーバー（Biasini et al., 2014, Nucl. Acids Res., 42:W252-8）を用いてＡｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ３の擬似原子モデルを作成した。ＵＣＳＦキメラパッケージ（Pettersen et al ., 2004, J. Comp. Chem., 25: 1605-12）を用いて、ＡＡＶ２（ＰＤＢ １ＬＰ３）、ＡＡＶ８（ＰＤＢ ２ＱＡ０）およびＡｎｃ８０ ＶＰ３構造をさらに重ね合わせ、残基保存に従って色分けした。次に、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８ ＶＰ３の構造的アライメントを生成し、Ｔ－コーヒーアライメントパッケージ（Notredame et al., 2000, J. Mol . Biol., 302:205-17）で生成されたこれらの３つの血清型のＶＰ１／２ドメインの非構造的アラインメントによって完成した。Ａｎｃ８０Ｌ６５およびＡＡＶ８を分離する突然変異の空間分布はまた、ＡＡＶ８三量体構造の内外表面で視覚化し、この場合、Ａｎｃ８０Ｌ６５およびＡＡＶ８ ＶＰ３の構造的アラインメントにおける可変残基を青で表し、多型残基を赤で表した。
ＡＡＶ祖先系統ベクターのインビトロにおける特徴付け
Ａｎｃ８０Ｌｉｂ内の機能的ＡＡＶキャプシドを同定および特徴付けるために、サブクローニングされたＤＮＡライブラリーからの個々のクローンを単離し、６ウェルまたは９６ウェルのいずれかにおいて、トランスで提供されるＡＡＰ２を含むルシフェラーゼ含有ベクターを産生させるために使用した。トランスフェクションから４８時間が経過した後、細胞溶解物を、０．４μｍフィルターを通してろ過することにより粗ベクターを単離した。次に、この粗ベクター調製物の等量をＨＥＫ２９３細胞がコンフルエントである９６ウェルプレートに添加し、さらに４８時間後にルシフェラーゼ活性について評価した。合計７７６クローンを評価した。ＣＭＶ由来ルシフェラーゼを含有するベクターの粗調製物を６ウェルフォーマットの三連トランスフェクションによって産生させ、祖先ＡＡＶベクターに対してトランスでＡＡＰを補充した。合計で、３種の独立した異なる生物学的複製物がベクターごとに産生された。ＤＮＡｓｅＩ耐性導入遺伝子を上記のように定量した。次に、これらの粗ウイルス調製物は、各々、２．１×１０２～３．５×１０２ＧＣ／細胞のＭＯＩで添加されたＡｎｃ１２６を除いて、１．９×１０３ＧＣ／細胞のＭＯＩでＨＥＫ２９３細胞を技術的に三連にして形質導入する粗ウイルス調製物の能力について評価された。４８時間が経過した後、形質導入された細胞をルミネッセンスアッセイによってルシフェラーゼについて評価した。
Ａｎｃ８０Ｌｉｂ内の機能的ＡＡＶキャプシドを同定および特徴付けるために、サブクローニングされたＤＮＡライブラリーからの個々のクローンを単離し、６ウェルまたは９６ウェルのいずれかにおいて、トランスで提供されるＡＡＰ２を含むルシフェラーゼ含有ベクターを産生させるために使用した。トランスフェクションから４８時間が経過した後、細胞溶解物を、０．４μｍフィルターを通してろ過することにより粗ベクターを単離した。次に、この粗ベクター調製物の等量をＨＥＫ２９３細胞がコンフルエントである９６ウェルプレートに添加し、さらに４８時間後にルシフェラーゼ活性について評価した。合計７７６クローンを評価した。ＣＭＶ由来ルシフェラーゼを含有するベクターの粗調製物を６ウェルフォーマットの三連トランスフェクションによって産生させ、祖先ＡＡＶベクターに対してトランスでＡＡＰを補充した。合計で、３種の独立した異なる生物学的複製物がベクターごとに産生された。ＤＮＡｓｅＩ耐性導入遺伝子を上記のように定量した。次に、これらの粗ウイルス調製物は、各々、２．１×１０２～３．５×１０２ＧＣ／細胞のＭＯＩで添加されたＡｎｃ１２６を除いて、１．９×１０３ＧＣ／細胞のＭＯＩでＨＥＫ２９３細胞を技術的に三連にして形質導入する粗ウイルス調製物の能力について評価された。４８時間が経過した後、形質導入された細胞をルミネッセンスアッセイによってルシフェラーゼについて評価した。
ＡＡＶベクター調製
ＡＡＶシス、ＡＡＶトランス、およびアデノウイルスヘルパープラスミドの大規模ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションを、ＨＥＫ２９３細胞のコンフルエントに近い単層を有する１０層ハイパーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行った。プラスミドを２：１：１の比（２６０μｇのアデノウイルスヘルパープラスミド／１３０μｇのシスプラスミド／１３０μｇのトランスプラスミド）でトランスフェクトした。Ａｎｃベクターの生産のためのトランスフェクションには、ＡＡＶシスプラスミドと同等量のｐＡＡＰ２を補充した。ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）／ＤＮＡ比は１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。トランスフェクションおよび下流の精製プロセスは、以前に記載されたように行った（Lock et al, 2010, Hum. Gene Ther., 21 : 1259-71）。ＤＮＡｓｅＩ耐性ベクターゲノムコピーを用いて、導入遺伝子カセットのプロモーター、導入遺伝子またはポリアデニル化シグナルコード領域を検出するプライマーおよびプローブを使用して、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ増幅（Applied Biosystems 7500, Life Technologies）によってＡＡＶ調製物を滴定した。大規模調製物の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって評価した。
ＡＡＶシス、ＡＡＶトランス、およびアデノウイルスヘルパープラスミドの大規模ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションを、ＨＥＫ２９３細胞のコンフルエントに近い単層を有する１０層ハイパーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行った。プラスミドを２：１：１の比（２６０μｇのアデノウイルスヘルパープラスミド／１３０μｇのシスプラスミド／１３０μｇのトランスプラスミド）でトランスフェクトした。Ａｎｃベクターの生産のためのトランスフェクションには、ＡＡＶシスプラスミドと同等量のｐＡＡＰ２を補充した。ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）／ＤＮＡ比は１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。トランスフェクションおよび下流の精製プロセスは、以前に記載されたように行った（Lock et al, 2010, Hum. Gene Ther., 21 : 1259-71）。ＤＮＡｓｅＩ耐性ベクターゲノムコピーを用いて、導入遺伝子カセットのプロモーター、導入遺伝子またはポリアデニル化シグナルコード領域を検出するプライマーおよびプローブを使用して、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ増幅（Applied Biosystems 7500, Life Technologies）によってＡＡＶ調製物を滴定した。大規模調製物の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって評価した。
構造的および生物物理学的ベクターの特徴付け
Ａｎｃ８０Ｌ６５粒子形態を、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターの精製調製物５μＬをｆｏｒｍｖａｒ被覆された４００メッシュの銅グリッド上に装填し、酢酸ウラニルで染色して、透過型電子顕微鏡で評価した。分析用超遠心分離によって空／完全粒子比を決定した。１０～３０μｇ／ｍＬのグリセロールを含まないＡｎｃ８０Ｌ６５サンプル５００μＬの含有量は、ＭＩＴ生物物理施設で入手可能なＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析用超遠心分離機を使用して分析した。実験は、８ホール（５０Ｔｉ）ローターを用いて２０℃、１５，０００ｒｐｍで行った。沈降プロファイルは、屈折率光学測定によって定期的な時点で得られた。ソフトウェアＳＥＤＦＩＴ（Schuck et al., 2002, Biophys. J., 82: 1096-111）を用いてＬａｍｍ方程式を解き、沈降係数分布分析を行って、ＡＡＶ試料に含まれる異なる種を同定した。ＵＶ蛍光分光法および示差走査蛍光（ＤＳＦ）によってＡｎｃ８０Ｌ０６５の熱安定性を評価した。各血清型のトリプトファン蛍光（Ausar et al., 2006, J. Biol. Chem., 281 : 19478-88）に対して、４．５μＬのアリコート６個を２００μＬのエッペンドルフチューブで調製し、３０℃、４５℃、６０℃、７５℃、９０℃または９９℃で５分間インキュベートし、スピンダウンし、室温で５分間冷却し、二連にして（それぞれ２μＬ）Ｔａｋｅ ３ＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｖｏｌｕｍｅ Ｐｌａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）上に装填した。Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＩ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）を用いて、試料を２９３ｎｍで照射し、発光スペクトルを１ｎｍの解像度で３２３～４００ｎｍで取得した。移動平均フィルター（スパン：１５）を用いて、サンプルおよびブランク発光スペクトルをさらに平滑化した。バックグラウンドを差し引いた後、最大発光波長を各血清型および各温度条件について決定した。その後、これらの波長値を温度の関数としてプロットして、異なるＡＡＶ血清型の熱安定性プロファイルを導出した。示差走査蛍光（Rayaprolu et al., 2013, J. Virol., 87: 13150-60）について、各ＡＡＶ２５μＬは、５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Life Technologies）で補充され、９６ウェルＰＣＲプレート（Denville Scientific Inc）に装填され、２０００ｒｐｍで２分間遠心沈殿させ、Ｒｅａｐｌｅｘ ２Ｓ ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）（励起：４５０ｎｍ；発光：５５０ｎｍ）を用いて、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素の蛍光をモニターしながら温度勾配（３０～９９℃、０．１℃／６ｓ）に曝露させた。各アッセイにおいて、共に５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジで補充された２５μＬのＦＦＢ（２１－０３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）および２５μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ陰性対照および陽性対照として用いた。２５μＬのＡＡＶベクターの蛍光はまた、蛍光バックグラウンド除去のための色素の非存在下でモニターした。蛍光強度は０～１００％でさらに標準化し、温度の関数としてプロットした。
Ａｎｃ８０Ｌ６５粒子形態を、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターの精製調製物５μＬをｆｏｒｍｖａｒ被覆された４００メッシュの銅グリッド上に装填し、酢酸ウラニルで染色して、透過型電子顕微鏡で評価した。分析用超遠心分離によって空／完全粒子比を決定した。１０～３０μｇ／ｍＬのグリセロールを含まないＡｎｃ８０Ｌ６５サンプル５００μＬの含有量は、ＭＩＴ生物物理施設で入手可能なＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析用超遠心分離機を使用して分析した。実験は、８ホール（５０Ｔｉ）ローターを用いて２０℃、１５，０００ｒｐｍで行った。沈降プロファイルは、屈折率光学測定によって定期的な時点で得られた。ソフトウェアＳＥＤＦＩＴ（Schuck et al., 2002, Biophys. J., 82: 1096-111）を用いてＬａｍｍ方程式を解き、沈降係数分布分析を行って、ＡＡＶ試料に含まれる異なる種を同定した。ＵＶ蛍光分光法および示差走査蛍光（ＤＳＦ）によってＡｎｃ８０Ｌ０６５の熱安定性を評価した。各血清型のトリプトファン蛍光（Ausar et al., 2006, J. Biol. Chem., 281 : 19478-88）に対して、４．５μＬのアリコート６個を２００μＬのエッペンドルフチューブで調製し、３０℃、４５℃、６０℃、７５℃、９０℃または９９℃で５分間インキュベートし、スピンダウンし、室温で５分間冷却し、二連にして（それぞれ２μＬ）Ｔａｋｅ ３ＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｖｏｌｕｍｅ Ｐｌａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）上に装填した。Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＩ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）を用いて、試料を２９３ｎｍで照射し、発光スペクトルを１ｎｍの解像度で３２３～４００ｎｍで取得した。移動平均フィルター（スパン：１５）を用いて、サンプルおよびブランク発光スペクトルをさらに平滑化した。バックグラウンドを差し引いた後、最大発光波長を各血清型および各温度条件について決定した。その後、これらの波長値を温度の関数としてプロットして、異なるＡＡＶ血清型の熱安定性プロファイルを導出した。示差走査蛍光（Rayaprolu et al., 2013, J. Virol., 87: 13150-60）について、各ＡＡＶ２５μＬは、５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Life Technologies）で補充され、９６ウェルＰＣＲプレート（Denville Scientific Inc）に装填され、２０００ｒｐｍで２分間遠心沈殿させ、Ｒｅａｐｌｅｘ ２Ｓ ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）（励起：４５０ｎｍ；発光：５５０ｎｍ）を用いて、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素の蛍光をモニターしながら温度勾配（３０～９９℃、０．１℃／６ｓ）に曝露させた。各アッセイにおいて、共に５×ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジで補充された２５μＬのＦＦＢ（２１－０３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）および２５μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ陰性対照および陽性対照として用いた。２５μＬのＡＡＶベクターの蛍光はまた、蛍光バックグラウンド除去のための色素の非存在下でモニターした。蛍光強度は０～１００％でさらに標準化し、温度の関数としてプロットした。
マウス実験
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）からＣ５７ＢＬ／６雄マウス（６～８週齢）を購入し、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＥＲＩ）動物施設に保管した。全ての動物手順は、ＳＥＲＩの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認されたプロトコールに従って行われた。肝臓標的化遺伝子移入研究について、１００μｌの単回腹腔内注射または１５０μｌ中の単一の後眼眼窩静脈叢静脈注射を受けた。筋肉標的化ｅＧＦＰ実験について、５０μｌを右後腓腹筋に注射した。ＧｏｌｄｅｎＲｏｄ動物ランセット（ＭＥＤＩｐｏｉｎｔ, Ｉｎｃ.）を顎下顎のマウス出血に使用した。ブラウンキャップチューブ（マイクロチューブ１．１ｍｌ Ｚ－Ｇｅｌ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を血清収集に使用した。ベクターの体内分布研究は、２８ｄｐｉのベクター投与で屠殺にしたマウスからの肝臓、心臓、腎臓、肺および脾臓を含む組織に対して行われた。肝臓におけるｅＧＦＰ発現を視覚化するために、組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定し、リン酸緩衝食塩水ＰＢＳで３０分間洗浄し、１０％、２０％および３０％スクロース勾配で逐次インキュベートし、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）において凍結した。ｌａｃＺのマウス肝臓発現をβ－Ｇａｌ染色キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。４％：パラホルムアルデヒド固定肝組織を１０μｍで切片化した。組織切片をＰＢＳで洗浄して残留固定液を除去し、市販の染色溶液（４００ｍＭフェリシアン化カリウム、４００ｍＭフェロシアン化カリウム、２００ｍＭ塩化マグネシウム、Ｘ－ｇａｌ ９５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）を用いて０．５～２時間、３７℃で染色した。凍結切片を１０μｍで調製した。筋肉におけるｅＧＦＰ発現を視覚化するために、組織を１０％のトラガカントガム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｇ１１２８）を保持するコルクディスク上に載せ、液体窒素を用いて－１５０℃に冷却したイソペンタン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ２７、０３４－２）を用いて瞬時凍結した。筋肉の凍結切片を１０μｍで調製した。網膜下注射は２μｌの容量で行い、２×１０９ＧＣの動物あたりの絶対用量を用いた。各ベクターは、分析した血清型あたり合計４つの眼に注射した。注射後４週間で動物を安楽死させ、組織学的分析のために眼を回収した。除核した眼を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、氷上で１時間固定し、次にＯＣＴに包埋し、凍結し、その後凍結切片にした。網膜切片をＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で１０分間染色し、共焦点画像化のためにスライドに載せた。
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）からＣ５７ＢＬ／６雄マウス（６～８週齢）を購入し、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＥＲＩ）動物施設に保管した。全ての動物手順は、ＳＥＲＩの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認されたプロトコールに従って行われた。肝臓標的化遺伝子移入研究について、１００μｌの単回腹腔内注射または１５０μｌ中の単一の後眼眼窩静脈叢静脈注射を受けた。筋肉標的化ｅＧＦＰ実験について、５０μｌを右後腓腹筋に注射した。ＧｏｌｄｅｎＲｏｄ動物ランセット（ＭＥＤＩｐｏｉｎｔ, Ｉｎｃ.）を顎下顎のマウス出血に使用した。ブラウンキャップチューブ（マイクロチューブ１．１ｍｌ Ｚ－Ｇｅｌ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を血清収集に使用した。ベクターの体内分布研究は、２８ｄｐｉのベクター投与で屠殺にしたマウスからの肝臓、心臓、腎臓、肺および脾臓を含む組織に対して行われた。肝臓におけるｅＧＦＰ発現を視覚化するために、組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定し、リン酸緩衝食塩水ＰＢＳで３０分間洗浄し、１０％、２０％および３０％スクロース勾配で逐次インキュベートし、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）において凍結した。ｌａｃＺのマウス肝臓発現をβ－Ｇａｌ染色キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。４％：パラホルムアルデヒド固定肝組織を１０μｍで切片化した。組織切片をＰＢＳで洗浄して残留固定液を除去し、市販の染色溶液（４００ｍＭフェリシアン化カリウム、４００ｍＭフェロシアン化カリウム、２００ｍＭ塩化マグネシウム、Ｘ－ｇａｌ ９５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）を用いて０．５～２時間、３７℃で染色した。凍結切片を１０μｍで調製した。筋肉におけるｅＧＦＰ発現を視覚化するために、組織を１０％のトラガカントガム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｇ１１２８）を保持するコルクディスク上に載せ、液体窒素を用いて－１５０℃に冷却したイソペンタン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ２７、０３４－２）を用いて瞬時凍結した。筋肉の凍結切片を１０μｍで調製した。網膜下注射は２μｌの容量で行い、２×１０９ＧＣの動物あたりの絶対用量を用いた。各ベクターは、分析した血清型あたり合計４つの眼に注射した。注射後４週間で動物を安楽死させ、組織学的分析のために眼を回収した。除核した眼を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、氷上で１時間固定し、次にＯＣＴに包埋し、凍結し、その後凍結切片にした。網膜切片をＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で１０分間染色し、共焦点画像化のためにスライドに載せた。
非ヒト霊長類モデル
アカゲザルを用いた実験は、ニューイングランド霊長類研究センター（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）で行われた。全ての実験手順は、ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｂｊｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｒｅａ（ＨＭＡ） Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ、ハーバード大学医学大学院の動物実験委員会（ｔｈｅ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）委員会によって承認された。動物をデキサメタゾンと組み合わせてケタミンまたはテラゾールで鎮静させた。分泌型ｒｈＣＧを発現するウイルスベクターを１ｍｌ／分の速度で２０ｍｌ容量で静脈内投与した。注射から回復した後、動物を臨床的に一般的な健康状態についてモニターし、２カ月間追跡した。この間に、定期的な間隔で静脈切開を行い、ＡＡＶに対する免疫応答および毒性を評価した。７０日後、サルを安楽死させ、肝臓サンプルを採取した。
アカゲザルを用いた実験は、ニューイングランド霊長類研究センター（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）で行われた。全ての実験手順は、ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｂｊｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｒｅａ（ＨＭＡ） Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ、ハーバード大学医学大学院の動物実験委員会（ｔｈｅ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）委員会によって承認された。動物をデキサメタゾンと組み合わせてケタミンまたはテラゾールで鎮静させた。分泌型ｒｈＣＧを発現するウイルスベクターを１ｍｌ／分の速度で２０ｍｌ容量で静脈内投与した。注射から回復した後、動物を臨床的に一般的な健康状態についてモニターし、２カ月間追跡した。この間に、定期的な間隔で静脈切開を行い、ＡＡＶに対する免疫応答および毒性を評価した。７０日後、サルを安楽死させ、肝臓サンプルを採取した。
ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡ１ＡＴ）の定量化
血清試料中のｈＡ１ＡＴの発現レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。プレートを１０００ｎｇ／ウェルの一次コーティングウサギ抗Ａ１ＡＴ抗体（Ｓｉｇｍａ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、２時間ブロックした。血清サンプルを５倍に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＡ１ＡＴ抗体（Ａｂｃａｍ）を２時間インキュベートした。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質を添加した。１時間以内に分光光度計プレートリーダーを用いてＯＤ４０５ｎｍ値を測定した。
血清試料中のｈＡ１ＡＴの発現レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。プレートを１０００ｎｇ／ウェルの一次コーティングウサギ抗Ａ１ＡＴ抗体（Ｓｉｇｍａ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、２時間ブロックした。血清サンプルを５倍に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＡ１ＡＴ抗体（Ａｂｃａｍ）を２時間インキュベートした。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質を添加した。１時間以内に分光光度計プレートリーダーを用いてＯＤ４０５ｎｍ値を測定した。
組織生体分布
スナップ凍結組織をプロテイナーゼＫで消化し、指示通りにＢｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。単離したｇＤＮＡを、ＢｉｏＴｅｋプレート読み取り分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ． Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて定量した。二倍体細胞におけるウイルスゲノム（ｖｇ）分布を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲシステムおよび先に記載した導入遺伝子特異的プライマー／プローブ（Wang et al., 2010, Mol. Ther., 18: 118-25）を用いてＱＰＣＲにより検出および定量した。
スナップ凍結組織をプロテイナーゼＫで消化し、指示通りにＢｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。単離したｇＤＮＡを、ＢｉｏＴｅｋプレート読み取り分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ． Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて定量した。二倍体細胞におけるウイルスゲノム（ｖｇ）分布を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲシステムおよび先に記載した導入遺伝子特異的プライマー／プローブ（Wang et al., 2010, Mol. Ther., 18: 118-25）を用いてＱＰＣＲにより検出および定量した。
ｍＲＮＡ発現
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ（１μｇ）をＤＮａｓｅ処理し、Ｑｉａｇｅｎ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムｍＲＮＡ発現は、特定のプライマー／プローブ反応混合物；ＧＡＰＤＨ（Ｒｈ０２６２１７４５＿ｇｌ）、アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（Ｒｈ０２８２１９８３＿ｇｌ）と共に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲプライマーミックス試薬を用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて検出および定量した。ＴａｑＭａｎカスタムプライマー／プローブの示唆された反応条件を適用した。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ（１μｇ）をＤＮａｓｅ処理し、Ｑｉａｇｅｎ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムｍＲＮＡ発現は、特定のプライマー／プローブ反応混合物；ＧＡＰＤＨ（Ｒｈ０２６２１７４５＿ｇｌ）、アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（Ｒｈ０２８２１９８３＿ｇｌ）と共に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲプライマーミックス試薬を用いたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて検出および定量した。ＴａｑＭａｎカスタムプライマー／プローブの示唆された反応条件を適用した。
中和抗体アッセイ
ＮＡＢは、以下の改変を伴って以前に記載されたように（Calcedo et al, 2009, J. Infect. Dis., 199:38 1 -90）、インビトロで評価した。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０およびｒｈ３２．３３（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔｏ ＣａｌｃｅｄｏおよびＪａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，ＵＰｅｎｎからの親切な贈呈）（Gao et al, 2004, J. Virol, 78:6381-88）で予備免疫化されたウサギの血清を１：４０から１：２０，９７１，５２０まで連続希釈し、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ２．ＳＶＰＡトランスジェニック構築物を保有する、一致する血清型またはＡｎｃ８０Ｌ６５のいずれかの１０９個のＧＣ粒子と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、２４時間前にヒトアデノウイルス５（ｈＡｄ５）のＭＯＩ（感染多重度）＝２０で感染させた、９６ウェルプレート上のＨＥＫ－２９３細胞に混合物を添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、Ｄ－ルシフェリン含有緩衝液を添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて発光を測定した。血清を含まずにインキュベートしたＡＡＶに感染した対照細胞に対して、発光を標準化した。発光が対照ウェルと比較して＜５０％である希釈で中和力価を決定した。
ＮＡＢは、以下の改変を伴って以前に記載されたように（Calcedo et al, 2009, J. Infect. Dis., 199:38 1 -90）、インビトロで評価した。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０およびｒｈ３２．３３（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔｏ ＣａｌｃｅｄｏおよびＪａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，ＵＰｅｎｎからの親切な贈呈）（Gao et al, 2004, J. Virol, 78:6381-88）で予備免疫化されたウサギの血清を１：４０から１：２０，９７１，５２０まで連続希釈し、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ２．ＳＶＰＡトランスジェニック構築物を保有する、一致する血清型またはＡｎｃ８０Ｌ６５のいずれかの１０９個のＧＣ粒子と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、２４時間前にヒトアデノウイルス５（ｈＡｄ５）のＭＯＩ（感染多重度）＝２０で感染させた、９６ウェルプレート上のＨＥＫ－２９３細胞に混合物を添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、Ｄ－ルシフェリン含有緩衝液を添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて発光を測定した。血清を含まずにインキュベートしたＡＡＶに感染した対照細胞に対して、発光を標準化した。発光が対照ウェルと比較して＜５０％である希釈で中和力価を決定した。
ＡＡＶキャプシドタンパク質のインシリコ祖先配列再構築
プロウイルスＤＮＡまたは考古学的サンプル由来の無傷の祖先ウイルス配列を単離することを試みる代わりに、ＡＡＶキャップの推定上の祖先アミノ酸配列を推測するために、現代のＡＡＶ配列データを系統解析および最大尤度ＡＳＲにより統合した。以前のバイオマイニング努力からの合計７５個の配列ＡＡＶ血清型単離物および変異体（Gao et al., 2003, PNAS USA, 100:6081-6; Gao et al., 2004, J. Virol., 78:6381-8; Gao et al., 2005, Current Gene Ther., 5:285-97）からは、ＡＡＶ５を外れ値として、ＰＨＹＭＬ（Guindon et al., 2010, System . Biol, 59:307-21）を用いて生成された頑健なＡＡＶキャップ系統発生が得られた。この分析には、（ａ）霊長類集団において天然に存在し、（ｂ）以前は効率的にアセンブルして感染することが実証されており、および（ｃ）その自然の経歴において組換え事象により生じたことが知られていない全長ＡＡＶキャプシドだけが含まれた。これは、伝統的な系統発生解析およびＡＳＲは、水平的進化事象を説明していないためである。図１８の樹状図は、Ａｎｃ８０と命名された単一節と並行した、ＡＡＶ４および５の血清型の早期分化を伴うＡＡＶの進化的経路をモデル化する。知られている現代のＡＡＶのほとんどがこのＡｎｃ８０から進化した。これらの血清型には、現在、遺伝子治療試験における臨床開発中のＡＡＶ１、２、８および９が含まれる。この系統樹の節はＡｎｃと命名され、順番に番号が付けられた。ＡＡＶに対するＡＳＲの本明細書に記載されるアプローチを検証するために、Ａｎｃ８０を、遺伝子治療ベクターとしての可能な使用のために組換えウイルスに発生させるための節として選択した。
プロウイルスＤＮＡまたは考古学的サンプル由来の無傷の祖先ウイルス配列を単離することを試みる代わりに、ＡＡＶキャップの推定上の祖先アミノ酸配列を推測するために、現代のＡＡＶ配列データを系統解析および最大尤度ＡＳＲにより統合した。以前のバイオマイニング努力からの合計７５個の配列ＡＡＶ血清型単離物および変異体（Gao et al., 2003, PNAS USA, 100:6081-6; Gao et al., 2004, J. Virol., 78:6381-8; Gao et al., 2005, Current Gene Ther., 5:285-97）からは、ＡＡＶ５を外れ値として、ＰＨＹＭＬ（Guindon et al., 2010, System . Biol, 59:307-21）を用いて生成された頑健なＡＡＶキャップ系統発生が得られた。この分析には、（ａ）霊長類集団において天然に存在し、（ｂ）以前は効率的にアセンブルして感染することが実証されており、および（ｃ）その自然の経歴において組換え事象により生じたことが知られていない全長ＡＡＶキャプシドだけが含まれた。これは、伝統的な系統発生解析およびＡＳＲは、水平的進化事象を説明していないためである。図１８の樹状図は、Ａｎｃ８０と命名された単一節と並行した、ＡＡＶ４および５の血清型の早期分化を伴うＡＡＶの進化的経路をモデル化する。知られている現代のＡＡＶのほとんどがこのＡｎｃ８０から進化した。これらの血清型には、現在、遺伝子治療試験における臨床開発中のＡＡＶ１、２、８および９が含まれる。この系統樹の節はＡｎｃと命名され、順番に番号が付けられた。ＡＡＶに対するＡＳＲの本明細書に記載されるアプローチを検証するために、Ａｎｃ８０を、遺伝子治療ベクターとしての可能な使用のために組換えウイルスに発生させるための節として選択した。
この節のこの再構築は、この進化中間体からの自然発生したＡＡＶ臨床的に関連する子孫の豊富さによって非常に知らされていたため、Ａｎｃ８０が部分的に選択された。さらに、Ａｎｃ８０は、Ａｎｃ８０の種分化に先立って生じた公知のヘルパー依存性霊長類ＡＡＶを有するディペンドパルボビリダエ（Dependoparvoviridae）系統発生に組み込まれており（図１８）、祖先再構築粒子がこのファミリー内で共有される基本特性を保持する可能性が高くなる。最大尤度法を使用して、特定の位置の各残基の計算された事後確率に基づいて、Ａｎｃ８０についてタンパク質配列予測を導出した。各位置において適切なアミノ酸を選択する際の不確実性を説明するために、ｐ≧０．３の個々のアミノ酸事後確率を有する位置についての全ての可能な配列置換を生成することが目的であった。このライブラリーＡｎｃ８０Ｌｉｂの表示は、図１９Ａに、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８参照キャプシド配列との部分－構造アラインメントで示されている。実際には、これは図１８に示されるような確率的な配列空間をもたらした；７３６個のＡｎｃ８０キャプシドのアミノ酸位置のうちの１１個を除く全てがＡＳＲに固有の残基を占める一方で、１１個の位置について２つのアミノ酸オプションが提供され、結果として２１１＝２０４８個の置換を含む配列空間が得られた。
既存のＡＡＶおよびそれらのＸ線結晶学データと共にＡｎｃ８０Ｌｉｂの構造および配列アラインメントは、現在知られている循環ＡＡＶからの顕著な相違を強調する。ＢＬＡＳＴ検索によって決定された最も近い相同体は、ｒｈ．１０、霊長類ディペンドパルボビリダエ（Dependoparvoviridae）のクレードＥ内のアカゲザル単離物であり、これは最小８．０％でＡｎｃ８０Ｌｉｂと異なり、５９個の多様なアミノ酸位置を占める（図１９Ｂ）。ＡＡＶ８およびＡＡＶ２は、それぞれ９．５％および１２．０％相違し、これらの７０～８７個の可変部位は、ＶＰ１、２の固有のドメインを含むＶＰ１タンパク質全体に広がっている（図１９Ａ、１９Ｂ）。多様性は、ＡＡＶ２および８モノマー構造をオーバーレイしたＡｎｃ８０Ｌｉｂクローンの構造モデリングに基づくだけでなく、配列に関しても超可変領域ドメインＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩにおいて最も高い（図１９Ａ、１９Ｃ）。図１９ＤのＡＡＶ２およびＡＡＶ８の三量体Ｘ線結晶構造モデルへの可変Ａｎｃ８０残基のマッピングは、ビリオンの外面上の３倍対称軸の周りの突起のピークおよびフランク上で生じるほとんどの変化を強調する。しかしながら、粒子の内部表面上およびＸ線では解析されない構造であるＣａｐの領域上にある少数の変異に加えて、かなりの数の可変残基も、３倍軸の外側の表面に露出したドメイン上に認められた。
Ａｎｃ８０合成および基本的特徴
続いて、Ａｎｃ８０Ｌｉｂタンパク質配列を逆翻訳し、プールされたライブラリーフォーマットの遺伝子合成によって作製した。キャプシド遺伝子を、ＡＡＶ２ ＲｅｐをｐＡｎｃ８０ＬｉｂにコードするＡＡＶパッケージングプラスミドにクローニングし、続いてそのライブラリーをクローン的にデコンボリューションした。個々のクローン（ｐＡｎｃ８０ＬＸと称し、Ｘは連続番号である）は、最小限多様なライブラリー集団において潜在的に干渉する競合相互作用を回避するために、単離して評価された。個々のＡｎｃ８０クローンの一部は、完全性および複雑性要件を確認するためにサンガー配列決定された。クローンＡｎｃ８０プラスミドは、ΔＦ６アデノウイルスヘルパープラスミド、ＡＡＶ２由来のＡＡＰ（ＡＡＰ２）の発現構築物、およびルシフェラーゼをコードするＩＴＲ隣接発現構築物と共に同時トランスフェクトされた。合計７７６個のライブラリークローンを産生させ、組み合わせた粒子アセンブリおよび形質移入効率を評価することを目的とした半ハイスループットアッセイにおいて、ＨＥＫ２９３細胞上の等容量のプロデューサー細胞溶解物に接種した。Ａｎｃ８０クローンの約５０％が、この初歩的スクリーニングアッセイにおいてバックグラウンドよりも検出可能なシグナルをもたらした。最も高いルシフェラーゼシグナルを有するいくつかのリード候補が、ＤＮａｓｅ耐性ゲノム粒子（ＧＣ）の配列決定および滴定、ならびにＨＥＫ２９３細胞上の感染力に進行した。これらの結果に基づいて、評価された第６５番目のＡｎｃ８０ＬｉｂクローンであるＡｎｃ８０Ｌ６５をさらなる特徴付けのために選択した。細胞溶解物からのＡｎｃ８０Ｌ６５ベクター収率は、ＡＡＶ２収率の８２～１６７％であるが、高収率ＡＡＶ８（３～５％相対的ＡＡＶ８収率）と比較して低下した。ＨＥＫ２９３のインビトロでの感染力はＡＡＶ２より劣るが、しかしながら、細胞あたりの粒子に基づきＡＡＶ８より優れている。
続いて、Ａｎｃ８０Ｌｉｂタンパク質配列を逆翻訳し、プールされたライブラリーフォーマットの遺伝子合成によって作製した。キャプシド遺伝子を、ＡＡＶ２ ＲｅｐをｐＡｎｃ８０ＬｉｂにコードするＡＡＶパッケージングプラスミドにクローニングし、続いてそのライブラリーをクローン的にデコンボリューションした。個々のクローン（ｐＡｎｃ８０ＬＸと称し、Ｘは連続番号である）は、最小限多様なライブラリー集団において潜在的に干渉する競合相互作用を回避するために、単離して評価された。個々のＡｎｃ８０クローンの一部は、完全性および複雑性要件を確認するためにサンガー配列決定された。クローンＡｎｃ８０プラスミドは、ΔＦ６アデノウイルスヘルパープラスミド、ＡＡＶ２由来のＡＡＰ（ＡＡＰ２）の発現構築物、およびルシフェラーゼをコードするＩＴＲ隣接発現構築物と共に同時トランスフェクトされた。合計７７６個のライブラリークローンを産生させ、組み合わせた粒子アセンブリおよび形質移入効率を評価することを目的とした半ハイスループットアッセイにおいて、ＨＥＫ２９３細胞上の等容量のプロデューサー細胞溶解物に接種した。Ａｎｃ８０クローンの約５０％が、この初歩的スクリーニングアッセイにおいてバックグラウンドよりも検出可能なシグナルをもたらした。最も高いルシフェラーゼシグナルを有するいくつかのリード候補が、ＤＮａｓｅ耐性ゲノム粒子（ＧＣ）の配列決定および滴定、ならびにＨＥＫ２９３細胞上の感染力に進行した。これらの結果に基づいて、評価された第６５番目のＡｎｃ８０ＬｉｂクローンであるＡｎｃ８０Ｌ６５をさらなる特徴付けのために選択した。細胞溶解物からのＡｎｃ８０Ｌ６５ベクター収率は、ＡＡＶ２収率の８２～１６７％であるが、高収率ＡＡＶ８（３～５％相対的ＡＡＶ８収率）と比較して低下した。ＨＥＫ２９３のインビトロでの感染力はＡＡＶ２より劣るが、しかしながら、細胞あたりの粒子に基づきＡＡＶ８より優れている。
Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクター調製物は、従来のプロトコールに従ったスケールでイオジキサノール勾配上で生成および精製し、種々の生化学的、生物物理学的および構造的分析に供した。Ａｎｃ８０Ｌ６５の精製された調製物内の粒子を電子顕微鏡（ＥＭ）による陰性染色下で視覚化した（図２０Ａ）。Ａｎｃ８０Ｌ６５ビリオンは、他のＡＡＶカプソマーと異なり、約２０～２５ｎｍの直径を有する比較的均一な六角形の粒子となっている。変性粒子は、ＳＤＳ電気泳動下で、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８粒子からのＶＰ１－３タンパク質に対応する約１：１：１０の比で、６０、７２および９０ｋＤａの３つのバンドに分離した（図２０Ｂ）。分析的超遠心分離（ＡＵＧ）により、ＡＡＶ８（８５．９Ｓ）からわずかに増加した８８．９ＳのＡｎｃ８０Ｌ６５を含むゲノムまたは完全なＡｎｃ８０Ｌ６５の沈降係数を決定することができた（図２０Ｃ）。この分析は、ベクターゲノムが欠如していると推定される、空のまたはより低い密度のアセンブルされた粒子の相対存在量ならびに全体的な純度のさらなる決定を可能にした。１つの懸念は、祖先キャプシド配列の不正確なモデリングが、ゲノムをパッケージングする能力が不十分である構造をもたらし得、Ａｎｃ８０Ｌ６５調製物における空対完全比が偏る結果となることであった。結果は、ＡＡＶ８による観察と一致して、調製物中の約８５％の完全粒子に対して約１６％が空粒子であることを示した（図２０Ｃ）。さらに、祖先キャプシド組成物の次善のモデル化により粒子の安定性が低下する可能性があると仮定し、粒子を熱安定性アッセイに供すると、その指示された予測に対して、Ａｎｃ８０Ｌ６５は、その推定されるＡＡＶ２およびＡＡＶ８よりも１５～３０℃熱安定性であることが決定された（図２０Ｄ）。
マウスモデルにおけるＡｎｃ８０Ｌ６５のインビボ遺伝子移入および形質導入
次に、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける３つの臨床的に関連する標的組織および投与経路（ＲＯＡ）から、送達され、発現されるＡｎｃ８０Ｌ６５パッケージされた導入遺伝子の能力を評価した：（ａ）全身注射後の肝臓、（ｂ）直接筋肉内注射後の骨格筋、および（ｃ）網膜外側標的化のための網膜下注射。Ａｎｃ８０Ｌ６５の大規模調製物は、レポーター遺伝子を有するＡＡＶ２およびＡＡＶ８対照と一緒に産生させ、成体雄性Ｃ５７Ｂ１／６マウスの肝臓、筋肉および網膜指向性遺伝子移入のために等用量で注射した。図２１に示される発現は、３つの標的組織の全てについて定性的に（ｅＧＦＰおよび／またはＬａｃＺ）モニターされ、様々な時点で分泌されたｈＡ１ＡＴ（肝臓）の血清ＥＬＩＳＡ測定によって定量的にモニターした。肝臓への遺伝子移入は、２つの投与経路および導入遺伝子を介して堅牢であることが観察された（図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ）。ＡＡＶ８と同様に、肝細胞は、ＡＡＶ２について許容的に記載される制限（Nakai et al., 2005, J. Virol., 79:214-24; Nakai et al., 2002, J. Virol., 76: 1 1343-9）を超えるＬａｃＺおよびＧＦＰ染色によって観察されるように効率的に標的化した。定量的に、Ａｎｃ８０は、細胞内レポーターおよび分泌型血清タンパク質導入遺伝子産物によるＡＡＶ８への形質導入の同様の効率を実証した。用量範囲決定研究は、１０１０ＧＣ／マウスを上回る用量での遺伝子移入の線形性を実証したが、ｈＡ１ＡＴについてはある閾値より下では線形性が維持されない（およびｅＧＦＰによってはあまり明らかではない）（図２１Ｂ、２１Ｃ）。生体分布試験は、対照としてのＡＡＶ８と共に、Ａｎｃ８０Ｌ６５の肝臓、心臓、脾臓、腎臓および肺におけるベクターゲノムの組織分布を評価するために、５×１０１１ＧＣ／マウスの高用量で注入の７日後および２８日後に行った（表３）。結果は、試験した組織におけるＡｎｃ８０のＡＡＶ８への遺伝子移入の同様の範囲を示し、脾臓、心臓および肺におけるＡｎｃ８０Ｌ６５について中程度の増加である。直接骨格筋肉内注射により、Ａｎｃ８０は、注入部位の近位および繊維を縦方向に伸長する筋繊維を効率的に標的化した（図２１Ａおよび図２４）。網膜下注射後の網膜形質導入は、前述したようにＡＡＶ２およびＡＡＶ８と同様に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を標的とするのに有効である。ＡＡＶ２について記載されているように、より難しい細胞標的である光受容体標的化は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５を用いて観察された。ＡＡＶ８とＡｎｃ８０Ｌ６５の両方が光受容体細胞の大部分を標的としたが、Ａｎｃ８０Ｌ６５による形質導入は一貫して細胞あたりより高い発現レベルをもたらす。内網膜の限られた数の細胞はまた、Ａｎｃ８０Ｌ６５形質導入によってＧＦＰ陽性であることが観察された（図２１Ａ）。
次に、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける３つの臨床的に関連する標的組織および投与経路（ＲＯＡ）から、送達され、発現されるＡｎｃ８０Ｌ６５パッケージされた導入遺伝子の能力を評価した：（ａ）全身注射後の肝臓、（ｂ）直接筋肉内注射後の骨格筋、および（ｃ）網膜外側標的化のための網膜下注射。Ａｎｃ８０Ｌ６５の大規模調製物は、レポーター遺伝子を有するＡＡＶ２およびＡＡＶ８対照と一緒に産生させ、成体雄性Ｃ５７Ｂ１／６マウスの肝臓、筋肉および網膜指向性遺伝子移入のために等用量で注射した。図２１に示される発現は、３つの標的組織の全てについて定性的に（ｅＧＦＰおよび／またはＬａｃＺ）モニターされ、様々な時点で分泌されたｈＡ１ＡＴ（肝臓）の血清ＥＬＩＳＡ測定によって定量的にモニターした。肝臓への遺伝子移入は、２つの投与経路および導入遺伝子を介して堅牢であることが観察された（図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ）。ＡＡＶ８と同様に、肝細胞は、ＡＡＶ２について許容的に記載される制限（Nakai et al., 2005, J. Virol., 79:214-24; Nakai et al., 2002, J. Virol., 76: 1 1343-9）を超えるＬａｃＺおよびＧＦＰ染色によって観察されるように効率的に標的化した。定量的に、Ａｎｃ８０は、細胞内レポーターおよび分泌型血清タンパク質導入遺伝子産物によるＡＡＶ８への形質導入の同様の効率を実証した。用量範囲決定研究は、１０１０ＧＣ／マウスを上回る用量での遺伝子移入の線形性を実証したが、ｈＡ１ＡＴについてはある閾値より下では線形性が維持されない（およびｅＧＦＰによってはあまり明らかではない）（図２１Ｂ、２１Ｃ）。生体分布試験は、対照としてのＡＡＶ８と共に、Ａｎｃ８０Ｌ６５の肝臓、心臓、脾臓、腎臓および肺におけるベクターゲノムの組織分布を評価するために、５×１０１１ＧＣ／マウスの高用量で注入の７日後および２８日後に行った（表３）。結果は、試験した組織におけるＡｎｃ８０のＡＡＶ８への遺伝子移入の同様の範囲を示し、脾臓、心臓および肺におけるＡｎｃ８０Ｌ６５について中程度の増加である。直接骨格筋肉内注射により、Ａｎｃ８０は、注入部位の近位および繊維を縦方向に伸長する筋繊維を効率的に標的化した（図２１Ａおよび図２４）。網膜下注射後の網膜形質導入は、前述したようにＡＡＶ２およびＡＡＶ８と同様に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を標的とするのに有効である。ＡＡＶ２について記載されているように、より難しい細胞標的である光受容体標的化は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５を用いて観察された。ＡＡＶ８とＡｎｃ８０Ｌ６５の両方が光受容体細胞の大部分を標的としたが、Ａｎｃ８０Ｌ６５による形質導入は一貫して細胞あたりより高い発現レベルをもたらす。内網膜の限られた数の細胞はまた、Ａｎｃ８０Ｌ６５形質導入によってＧＦＰ陽性であることが観察された（図２１Ａ）。
非ヒト霊長類肝臓におけるＡｎｃ８０Ｌ６５遺伝子移入および発現
マウスにおけるＡｎｃ８０Ｌ６５の強力な肝向性を考慮すると、大型動物モデルにおけるＡｎｃ８０Ｌ６５の遺伝子移入を評価することが目的であった。ＡＡＶと無関係の先行研究に登録された６匹の雌アカゲザルに、伏在静脈からＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５のいずれかを臨床的に関連する用量１０１２ＧＣ／ｋｇで注射した（表４）。ｒｈＣＧレポーターを使用して、絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのアカゲザルｃＤＮＡを発現させた。この絨毛性ゴナドトロピンは、非自己導入遺伝子免疫応答を回避するために動物を寛容化する導入遺伝子産物である。この実験に登録された動物は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５へのＮＡＢについて予めスクリーニングされた。注射の数週間前のＮＡＢ血清レベルは、この研究に登録するのに１／４力価以下であった。遺伝子移入は、注射後の７０～７１日間に全肝臓ＤＮＡ（尾状葉）のｖｇについてＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって評価された（図２１Ｄ）。驚くべきことに、対照ＡＡＶ８を注射した３匹の動物のうち２匹は、おそらく以前の研究で報告された標準的なＮＡＢアッセイによっては検出されなかった注射時の低レベルＮＡＢのために、圧倒的な遺伝子移入（＜０．１ｖｇ／ｄｇ）を示した。おそらくＡＡＶ８に対するＮＡＢがないかまたは最小のＮＡＢを有する１匹のＡＡＶ８動物は、期待される０．８１ｖｇ／ｄｇの範囲内の肝臓に対する遺伝子移入レベルを実証した。Ａｎｃ８０Ｌ６５遺伝子移入は、明らかにＮＡＢによって阻害されず（Ａｎｃ８０Ｌ６５ ＮＡＢは注射前に検出しなかった）、３匹の動物は０．７３～３．５６ｖｇ／ｄｇの範囲の肝臓導入遺伝子のコピー数を生じた。肝臓発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲによってモニターした（図２１Ｅ）。Ａｎｃ８０Ｌ６５は、ＡＡＶ８よりも優れた発現をもたらし、全ての肝臓葉において全ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量の１３～２６％のｒｈＣＧ転写産物レベルを達成した。
マウスにおけるＡｎｃ８０Ｌ６５の強力な肝向性を考慮すると、大型動物モデルにおけるＡｎｃ８０Ｌ６５の遺伝子移入を評価することが目的であった。ＡＡＶと無関係の先行研究に登録された６匹の雌アカゲザルに、伏在静脈からＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５のいずれかを臨床的に関連する用量１０１２ＧＣ／ｋｇで注射した（表４）。ｒｈＣＧレポーターを使用して、絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのアカゲザルｃＤＮＡを発現させた。この絨毛性ゴナドトロピンは、非自己導入遺伝子免疫応答を回避するために動物を寛容化する導入遺伝子産物である。この実験に登録された動物は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０Ｌ６５へのＮＡＢについて予めスクリーニングされた。注射の数週間前のＮＡＢ血清レベルは、この研究に登録するのに１／４力価以下であった。遺伝子移入は、注射後の７０～７１日間に全肝臓ＤＮＡ（尾状葉）のｖｇについてＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって評価された（図２１Ｄ）。驚くべきことに、対照ＡＡＶ８を注射した３匹の動物のうち２匹は、おそらく以前の研究で報告された標準的なＮＡＢアッセイによっては検出されなかった注射時の低レベルＮＡＢのために、圧倒的な遺伝子移入（＜０．１ｖｇ／ｄｇ）を示した。おそらくＡＡＶ８に対するＮＡＢがないかまたは最小のＮＡＢを有する１匹のＡＡＶ８動物は、期待される０．８１ｖｇ／ｄｇの範囲内の肝臓に対する遺伝子移入レベルを実証した。Ａｎｃ８０Ｌ６５遺伝子移入は、明らかにＮＡＢによって阻害されず（Ａｎｃ８０Ｌ６５ ＮＡＢは注射前に検出しなかった）、３匹の動物は０．７３～３．５６ｖｇ／ｄｇの範囲の肝臓導入遺伝子のコピー数を生じた。肝臓発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲによってモニターした（図２１Ｅ）。Ａｎｃ８０Ｌ６５は、ＡＡＶ８よりも優れた発現をもたらし、全ての肝臓葉において全ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量の１３～２６％のｒｈＣＧ転写産物レベルを達成した。
Ａｎｃ８０Ｌ６５の安全性、免疫学および毒性
治療的適用のための効率的な遺伝子送達ベクターシステムを使用することの検討は、臨床使用に関してその安全性の広範な評価を必要とする。さらに、ディペンドパルボウイルスの祖先状態に近似し得る新規な薬剤の使用は、それらの懸念をさらに高め得る。ここでは、非公式な臨床前の状況において、Ａｎｃ８０Ｌ６５を安全性の観点から制限する可能性があるいくつかの重要な側面を検討した。動物の発現研究（図２１）は、研究の生存段階の間、および標的組織特異的毒性について可能な限り、毒性の明白な徴候についてモニターした。ベクター注入と関連した顕著な逆行は見られなかった。簡単には、腹腔内（最大用量試験［ｍｄｔ］：３．９×１０１０ＧＣ／マウス）、眼窩後静脈注射（ｍｄｔ：５×１０１１ＧＣ／マウス）、網膜下（ｍｄｔ：２×１０９ＧＣ／眼）、硝子体内（ｍｄｔ：２×１０９ＧＣ／眼）、および直接筋肉内（１０１０ＧＣ／マウス）によるベクター投与は明白な毒性を示さなかった。より直接的な評価は、以下の対照と一緒に、５×１０１１ＧＣ／マウス（約２×１０１３ＧＣ／ｋｇ）のＡｎｃ８０Ｌ６５．ＴＢＧ．ｅＧＦＰの高用量静脈内注射で行われた：（ａ）同じ導入遺伝子カセットを有するＡＡＶ８、および（ｂ）等容量の生理食塩水注射。注射前、注射の２時間後、１日後、３日後、７日後、１４日後および２８日後にマウスを静脈切開し、血液を細胞血液計数（ＣＢＣ）および血清化学（Ｃｈｅｍ）について分析した（表５および６）。これはＡｎｃ８０Ｌ６５の対照範囲内または同等であり、したがって重大な懸念は生じなかった。２時間、２４時間、３日および７日の時点からの血清は、多重２３サイトカイン分析によってベクター抗原に対する自然免疫応答の尺度としてサイトカインについてさらに評価した（表７）。Ａｎｃ８０Ｌ６５のサイトカインは、生理食塩水およびＡＡＶ８対照血清に対するものと全体的に一致しており、主要なサイトカインの上昇または低下は観察されなかったが、しかしながら、いくつかの場合において、ＡＡＶ８よりもＡｎｃ８０Ｌ６５についてより明らかな形で生理食塩水対照値によって設定された範囲のやや外にあった。図２１Ｄおよび２１Ｅに記載されたアカゲザルの研究からの血液について同様の分析を行った。マウス研究と同様に、得られたＣＢＣおよびＣｈｅｍ値から、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５試験品に関する毒性の徴候は同定されなかった（表８および９）。
治療的適用のための効率的な遺伝子送達ベクターシステムを使用することの検討は、臨床使用に関してその安全性の広範な評価を必要とする。さらに、ディペンドパルボウイルスの祖先状態に近似し得る新規な薬剤の使用は、それらの懸念をさらに高め得る。ここでは、非公式な臨床前の状況において、Ａｎｃ８０Ｌ６５を安全性の観点から制限する可能性があるいくつかの重要な側面を検討した。動物の発現研究（図２１）は、研究の生存段階の間、および標的組織特異的毒性について可能な限り、毒性の明白な徴候についてモニターした。ベクター注入と関連した顕著な逆行は見られなかった。簡単には、腹腔内（最大用量試験［ｍｄｔ］：３．９×１０１０ＧＣ／マウス）、眼窩後静脈注射（ｍｄｔ：５×１０１１ＧＣ／マウス）、網膜下（ｍｄｔ：２×１０９ＧＣ／眼）、硝子体内（ｍｄｔ：２×１０９ＧＣ／眼）、および直接筋肉内（１０１０ＧＣ／マウス）によるベクター投与は明白な毒性を示さなかった。より直接的な評価は、以下の対照と一緒に、５×１０１１ＧＣ／マウス（約２×１０１３ＧＣ／ｋｇ）のＡｎｃ８０Ｌ６５．ＴＢＧ．ｅＧＦＰの高用量静脈内注射で行われた：（ａ）同じ導入遺伝子カセットを有するＡＡＶ８、および（ｂ）等容量の生理食塩水注射。注射前、注射の２時間後、１日後、３日後、７日後、１４日後および２８日後にマウスを静脈切開し、血液を細胞血液計数（ＣＢＣ）および血清化学（Ｃｈｅｍ）について分析した（表５および６）。これはＡｎｃ８０Ｌ６５の対照範囲内または同等であり、したがって重大な懸念は生じなかった。２時間、２４時間、３日および７日の時点からの血清は、多重２３サイトカイン分析によってベクター抗原に対する自然免疫応答の尺度としてサイトカインについてさらに評価した（表７）。Ａｎｃ８０Ｌ６５のサイトカインは、生理食塩水およびＡＡＶ８対照血清に対するものと全体的に一致しており、主要なサイトカインの上昇または低下は観察されなかったが、しかしながら、いくつかの場合において、ＡＡＶ８よりもＡｎｃ８０Ｌ６５についてより明らかな形で生理食塩水対照値によって設定された範囲のやや外にあった。図２１Ｄおよび２１Ｅに記載されたアカゲザルの研究からの血液について同様の分析を行った。マウス研究と同様に、得られたＣＢＣおよびＣｈｅｍ値から、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５試験品に関する毒性の徴候は同定されなかった（表８および９）。
ＡＡＶ血清型に対する既存の免疫は遺伝子移入を遮断することが知られており、一次感染に関与する天然に存在する野生型ウイルスと共有されるベクター抗原に対する記憶Ｔ細胞のリコールにより有害な状況が生じるリスクに患者を曝す可能性がある。ＡＡＶ血清型１、２、５、６．２、８、９およびｒｈ．３２．３３に対して産生された高力価ウサギ抗血清を使用したが、ｒｈ．１０はまた含まれ、これは、その配列がＡｎｃ８０Ｌ６５と最も相同であり、８．０％の残基が異なるためである。図２２Ａにおいて、血清は、Ａｎｃ８０Ｌ６５に対して生じた同種のベクターキャプシドに対するＡｎｃ８０Ｌ６５を中和する血清の能力について血清を試験した。結果は、ＡＡＶ５およびｒｈ．３２．３３、構造的に高い多様性のＡＡＶに対する交差反応性を示さなかったが、一方、ＡＡＶ２、６．２および８は、Ａｎｃ８０Ｌ６５の子孫であると推定され、相同性の抗血清力価よりも１６倍またはそれより低いレベルであるにもかかわらず、低レベルの交差反応性を実証した。Ａｎｃ８０系統のメンバーの中で、ＡＡＶ９およびｒｈ．１０の感度の限界を超える交差反応は観察されなかった。次に、筋肉内経路を介してＡＡＶ８の動物を前免疫し、免疫化の２５日後にＡＡＶ８と比較して静脈注射後のＡｎｃ８０Ｌ６５の中和を評価することにより、中和に関してインビボモデルにおいてこれらの結果を検証することが目的であった（図２２Ｂ）。中和は、ＡＡＶ８前免疫動物におけるＡＡＶ８について完了した。Ａｎｃ８０Ｌ６５は、５匹のうち２匹の動物において中和されたが、５匹のうち３匹の動物においては、これらの動物におけるＡＡＶ８ ＮＡＢの実証にもかかわらず、形質導入の６０～１１７％を示した。これらの結果は、ウサギおよびマウスにおけるＡＡＶ８とのＡｎｃ８０Ｌ６５の部分的交差反応性を実証する。
ＡＡＶの系統分析および再構築
ＡＳＲに基づくＡｎｃ８０Ｌ６５の合成が成功し、遺伝子療法のための生産性が高く、安定した感染力剤としてのその証拠によって強化されたが、ＡＡＶの系統をさらに再構築することによって、アプローチおよびモデリング方法論のさらなる検証を提供することが目的であった。この追加セットの試薬を生成することの野望は、このウイルスファミリー内の構造－機能関係の実験的評価を可能にし、将来のＡＡＶの合理的設計アプローチに有益な重要なエピスタシスカップリングを強調する、Ａｎｃ８０および現存のＡＡＶの構造中間体を提供することであった。ＡＡＶの合計８つの追加の進化中間体をＡＳＲによって再構成し、実験室で合成した（図１８）：Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０およびＡｎｃ１１３は、ＡＡＶ７、８および／または９に向かう分岐において分離され、一方、Ａｎｃ１２６およびＡｎｃ１２７は、ＡＡＶ１、２および／または３の自然の経歴中に位置付けられる。これらの各々について、位置あたりの事後確率が最も高いアミノ酸を選択することによって配列を決定した。最初に、ＧＣウイルスベクター収率は、ベクター成分についてのＨＥＫ２９３標準三重トランスフェクション、およびベクターゲノムについてのＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲを用いたアデノウイルスヘルプにおいて決定した。図２３Ａに示される結果は、ＡＡＶ８などの血清型のより高い産生収率に一致して、ＡＡＶ７－９系統における推定上の祖先としてのＡｎｃ－８０からの生産性の増加を実証する。ＡＡＶ１－３分枝は、収率の増加を示さず、Ａｎｃ１２６については非常に乏しい粒子収率が観察された。Ａｎｃ８０と同様に、統計的空間を活用することでＡｎｃ１２６収率を改善し得ることが可能であるが、しかしながら、ＡＡＶ系統発生のこの分岐のアンダーサンプリングのためにＡｎｃ１２６ ＡＳＲについては情報が少ない可能性も同等にある。等しい粒子用量での産生粒子の感染力は、ＧＦＰおよびルシフェラーゼによるＨＥＫ２９３においてインビトロでさらに試験した。しかしながら、新しく合成された全てのＡｎｃベクターは、様々な程度で感染力を示した（図２３Ｂ）。ＡＡＶ７－９系統において、感染力価は全体的に低下し、Ａｎｃ８０のものよりもＡＡＶ８表現型により類似していた。等量で試験することができるＡｎｃ８０からＡＡＶ２系統の唯一の中間体であるＡｎｃ１２７は、Ａｎｃ８０とＡＡＶ２の両方と比較して形質導入効率が低下していることを実証した。この系列の両方の分岐において選択された進化中間体の熱安定性プロファイルをさらに試験した（図２３Ｃ）。興味深いことに、Ａｎｃ８１およびＡｎｃ８２は、Ａｎｃ８０Ｌ６５と比較して熱安定性アッセイでは高いが、中程度に低下した融解温度を示し、これは、おそらくこの分岐における進化年齢と共に熱安定性が徐々に減少することを示唆している。対照的に、Ａｎｃ１２７は、既に非常に熱安定性の高いＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターからのさらなる増加を実証した。
ＡＳＲに基づくＡｎｃ８０Ｌ６５の合成が成功し、遺伝子療法のための生産性が高く、安定した感染力剤としてのその証拠によって強化されたが、ＡＡＶの系統をさらに再構築することによって、アプローチおよびモデリング方法論のさらなる検証を提供することが目的であった。この追加セットの試薬を生成することの野望は、このウイルスファミリー内の構造－機能関係の実験的評価を可能にし、将来のＡＡＶの合理的設計アプローチに有益な重要なエピスタシスカップリングを強調する、Ａｎｃ８０および現存のＡＡＶの構造中間体を提供することであった。ＡＡＶの合計８つの追加の進化中間体をＡＳＲによって再構成し、実験室で合成した（図１８）：Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０およびＡｎｃ１１３は、ＡＡＶ７、８および／または９に向かう分岐において分離され、一方、Ａｎｃ１２６およびＡｎｃ１２７は、ＡＡＶ１、２および／または３の自然の経歴中に位置付けられる。これらの各々について、位置あたりの事後確率が最も高いアミノ酸を選択することによって配列を決定した。最初に、ＧＣウイルスベクター収率は、ベクター成分についてのＨＥＫ２９３標準三重トランスフェクション、およびベクターゲノムについてのＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲを用いたアデノウイルスヘルプにおいて決定した。図２３Ａに示される結果は、ＡＡＶ８などの血清型のより高い産生収率に一致して、ＡＡＶ７－９系統における推定上の祖先としてのＡｎｃ－８０からの生産性の増加を実証する。ＡＡＶ１－３分枝は、収率の増加を示さず、Ａｎｃ１２６については非常に乏しい粒子収率が観察された。Ａｎｃ８０と同様に、統計的空間を活用することでＡｎｃ１２６収率を改善し得ることが可能であるが、しかしながら、ＡＡＶ系統発生のこの分岐のアンダーサンプリングのためにＡｎｃ１２６ ＡＳＲについては情報が少ない可能性も同等にある。等しい粒子用量での産生粒子の感染力は、ＧＦＰおよびルシフェラーゼによるＨＥＫ２９３においてインビトロでさらに試験した。しかしながら、新しく合成された全てのＡｎｃベクターは、様々な程度で感染力を示した（図２３Ｂ）。ＡＡＶ７－９系統において、感染力価は全体的に低下し、Ａｎｃ８０のものよりもＡＡＶ８表現型により類似していた。等量で試験することができるＡｎｃ８０からＡＡＶ２系統の唯一の中間体であるＡｎｃ１２７は、Ａｎｃ８０とＡＡＶ２の両方と比較して形質導入効率が低下していることを実証した。この系列の両方の分岐において選択された進化中間体の熱安定性プロファイルをさらに試験した（図２３Ｃ）。興味深いことに、Ａｎｃ８１およびＡｎｃ８２は、Ａｎｃ８０Ｌ６５と比較して熱安定性アッセイでは高いが、中程度に低下した融解温度を示し、これは、おそらくこの分岐における進化年齢と共に熱安定性が徐々に減少することを示唆している。対照的に、Ａｎｃ１２７は、既に非常に熱安定性の高いＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターからのさらなる増加を実証した。
最後に、既知のエピトープをＡＡＶ２に破壊するＡＳＲの能力が探究した。ほんの僅かなＢ細胞またはＴ細胞エピトープだけがこれまでにＡＡＶ２上にマッピングされ、その全ては、ＡＡＶ２系統に相当するＡｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７およびＡＡＶ２上にマッピングされた。これらの推定上の進化中間体間の順次変異の導入は、図２２Ｃにおいて、突然変異と２／４ヒトＴ細胞エピトープと２／２マウスＢ細胞エピトープの間の重複を強調する。これらのデータは、ＡＳＲがＡＡＶキャプシド上の抗原性領域を排除または調節する方法として使用される可能性を強調し、免疫がＡＡＶの自然の経歴における主要な選択的圧力であったことを示唆し得る。
Ａｎｃ１１０のインビボ機能性
Ｃ５７Ｂ１／６マウスのＡＡＶ９と比較して、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２およびＡｎｃ１１０によるルシフェラーゼの肝臓形質導入を評価するための実験を行った。図２７の結果は、指示されたベクターの静脈注射後、Ａｎｃ１１０が、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の導入遺伝子発現に基づいて、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＡＡＶ９と同等レベルの肝臓標的化を示したことを実証する。特に、ＡＡＶ９は、現在臨床研究中である。
Ｃ５７Ｂ１／６マウスのＡＡＶ９と比較して、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２およびＡｎｃ１１０によるルシフェラーゼの肝臓形質導入を評価するための実験を行った。図２７の結果は、指示されたベクターの静脈注射後、Ａｎｃ１１０が、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の導入遺伝子発現に基づいて、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＡＡＶ９と同等レベルの肝臓標的化を示したことを実証する。特に、ＡＡＶ９は、現在臨床研究中である。
他の態様
対象の方法および組成物は、多数の異なる態様と併せて本明細書に記載されるが、様々な態様の前述の記載は、説明することを意図しており、対象の方法および組成物の範囲を限定しないことを理解するべきである。他の態様、利点および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
対象の方法および組成物は、多数の異なる態様と併せて本明細書に記載されるが、様々な態様の前述の記載は、説明することを意図しており、対象の方法および組成物の範囲を限定しないことを理解するべきである。他の態様、利点および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
開示された方法および組成物に使用できるか、それと組み合わせて使用できるか、その調製に使用できるか、またはその生成物である方法および組成物が開示される。これらの物質および他の物質は、本明細書に開示され、これらの方法および組成物の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されていると理解される。すなわち、様々な個々のおよび集合的な組合せならびにこれらの組成物の並べ替えについての具体的な言及は明示的に記載されていない場合もあるが、それぞれは本明細書において具体的に意図され、記載される。例えば、対象の特定の組成物または特定の方法が開示され、検討され、多数の組成物または方法が検討される場合、組成物および方法のそれぞれおよび全ての組合せおよび並び替えは、具体的な記載に反しない限り、具体的に意図される。同様に、これらのあらゆるサブセットまたは組合せもまた、特に意図され、開示される。
Claims (14)
- 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
- 前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
- 前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
- 精製されている、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
- 配列番号４３に示される核酸配列によってコードされる、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
- 配列番号４３に示される核酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む精製されたウイルス粒子。
- 導入遺伝子をさらに含む、請求項９に記載の精製されたウイルス粒子。
- 導入遺伝子を用いて遺伝子移入および／またはワクチン接種する方法において使用するための、請求項１０に記載のウイルス粒子を含む組成物であって、前記方法が、遺伝子移入またはワクチン接種を必要とする対象に前記組成物を投与することを含み、前記ウイルス粒子はＡＡＶ９ウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、組成物。
- 前記ウイルス粒子が、ＡＡＶ９ウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、請求項１１に記載の組成物。
- 対象にワクチン接種する方法において使用するための、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドに作動可能に連結した標的抗原を含む組成物であって、前記方法が、ワクチン接種を必要とする対象に前記組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドとほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、組成物。
- 前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ９キャプシドポリペプチドと同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、請求項１３に記載の組成物。
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