JP2005512533A - アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）血清型８の配列 - Google Patents

Abstract

血清型８アデノ随伴ウイルスの配列およびこれらの配列を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。またｒＡＡＶ粒子の生産におけるそのような宿主細胞およびベクターの使用法も記載する。治療用および免疫原性遺伝子のｒＡＡＶ８媒介型送達も提供する。

Description

パルボウイルス科の員であるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）から６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを持つ小さな、包膜をもたない正二十面ウイルスである。ＡＡＶはこのウイルスが精製されたアデノウイルスストック中の混入物として発見されたのでディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に分類される。ＡＡＶの生活環は、感染後にＡＡＶゲノムが宿主の染色体に部位特異的に組み込まれる潜伏期、およびアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスの感染後に、組み込まれたゲノムが引き続きレスキューされ、複製され、そして感染性ウイルスにパッケージングされる感染期を含む。非病原性であり、非分割細胞を含む感染の広い宿主範囲、および潜在的な部位特異的染色体組込みにより、ＡＡＶは遺伝子転移の魅力的な道具である。

最近の研究では、ＡＡＶベクターが遺伝子送達の好適な媒介物となり得ることが示唆されている。今日まで、ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から６種の血清型のＡＡＶが単離され、そして十分に特性決定された。それらの中で、ヒト血清型２は遺伝子転移ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり；これは種々の標的組織および動物モデルにおいて、効率的な遺伝子転移実験に広く使用されてきた。ＡＡＶ２に基づくベクターを幾つかのヒトの疾患モデルへ実験的に応用する臨床的試験が進行中であり、そして嚢胞性繊維症および血友病Ｂのような疾患を含む。

望まれるものは遺伝子送達用のＡＡＶに基づく構築物である。

発明の要約
１つの観点では、本発明は新規ＡＡＶ配列、これらの配列を含む組成物およびそれらの使用を提供する。有利にはこれらの組成物は治療または予防目的にｒＡＡＶの再投与を要する組成物での使用に特に良く適している。

本発明のこれらおよび他の観点は、以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかになるだろう。
発明の詳細な説明
本発明は、新規ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ８の核酸配列およびアミノ酸を提供する。またこれらＡＡＶ配列のフラグメントも提供する。これら各フラグメントは種々のベクター系および宿主細胞で直ちに利用することができる。中でも望ましいＡＡＶ８フラグメントはｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３および超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらタンパク質をコードする配列である。これらのフラグメントは種々のベクター系および宿主細胞で直ちに利用することができる。そのようなフラグメントは単独で、他のＡＡＶ８配列もしくはフラグメントと組み合わせて、または他のＡＶＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列に由来する要素と組み合わせて使用することができる。１つの特に望ましい態様では、ベクターは本発明のＡＡＶ８ｃａｐおよび／またはｒｅｐ配列を含む。

ＡＡＶ８配列およびそのフラグメントはｒＡＡＶの生産に有用であり、そしてアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターまたはワクチンベクターとしても有用である。本発明はさらに核酸分子、遺伝子送達ベクターおよび本発明のＡＡＶ８配列を含む宿主細胞を提供する。

適当なフラグメントは本明細書に提供する情報を使用して決定することができる。アライメントはインターネット上のウェブサーバーを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」のように様々に公開または市販されて利用可能なマルチプルシークエンスアライメントプログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して行う。あるいはベクター ＮＴＩユーティリティ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ）も使用する。ヌクレオチド配列の同一性の測定するために使用することができる、当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムがあり、それらには上記のプログラムに含まれるものを含む。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＦａｓｔａ、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムを使用して比較することができる。Ｆａｓｔａはクエリとサーチ配列との間で最高の重複領域のアライメントおよび配列同一性の割合を提供する。例えば核酸配列間の配列同一性の割合は、引用により本明細書に編入するＧＣＧバージョン６．１に提供されているように、そのデフォルトパラメーター（６のワードサイズ、およびスコアリングマトリックスについてはＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦａｓｔａを使用して決定することができる。同様なプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」プログラムがアミノ酸アライメントを行うために利用可能である。一般にこれらのプログラムはデフォルト設定で使用するが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変えることができる。あるいは当業者は参照にしたアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたはアライメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。

核酸またはそのフラグメントを指す時、用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、適切なヌクレオチド挿入または欠損が別の核酸（またはその相補鎖）と最適に並べられた時に、並べられた配列の少なくとも約９５〜９９％にヌクレオチド配列の同一性があることを示す。好ましくは相同性は完全長の配列、またはそのオープンリーディングフレイム、または少なくとも１５個のヌクレオチド長である他の適当なフラグメントである。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。

アミノ酸またはそのフラグメントを指す時、用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、適切なアミノ酸挿入または欠損が別のアミノ酸（またはその相補鎖）と最適に並べられた時に、並べられた配列の少なくとも約９５〜９９％にアミノ酸配列の同一性があることを示す。好ましくは相同性は完全長の配列、またはそのタンパク質、例えばｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または少なくとも８個のアミノ酸、またはより望ましくは少なくとも１５個のアミノ酸長であるそのフラグメントにわたる。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。

用語「高度に保存された」とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性、そしてより好ましくは９７％より高い同一性を意味する。同一性は当業者に知られているアルゴリズムおよびコンピュータープログラムにより当業者が容易に決定できる。

核酸配列の内容において「同一性の割合」または「同一の」という用語は、最大の対応について並べた時、２つの配列中で同じ残基を指す。配列同一性の比較の長さは、完全長のゲノム、完全長の遺伝子コード配列にわたることができ、または少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしより小さいフラグメント間、例えば少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチド間の同一性も望ましくなり得る。同様に「配列同一性の割合」は完全長のタンパク質またはそのフラグメントにわたるアミノ酸配列について容易に決定することができる。適当にはフラグメントは少なくとも約８個のアミノ酸長であり、そして最高約７００個のアミノ酸であることができる。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。

本明細書に記載するように、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が他のＡＡＶ血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの効力を減少させる応用に特に良く適している。本発明のｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ再投与および反復遺伝子治療に特に有利である。

本発明のこれらのおよび他の態様および利点は、これからさらに詳細に記載する。本明細書および特許請求の範囲通して使用する用語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、他の成分、要素、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）、工程等を含むことができる。逆に用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」およびその変形は、他の成分、要素、完全体、工程等を含まない。
Ｉ．ＡＡＶ血清型８の配列
Ａ．核酸配列
本発明のＡＡＶ８の核酸配列は、４３９６ヌクレオチドからなる図１［配列番号１］のＤＮＡ配列を含む。本発明のＡＡＶ８の核酸配列はさらに図１［配列番号１］に相補的である鎖、ならびに図１［配列番号１］およびその相補鎖に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含する。また本発明の核酸配列に含まれるのは、図１［配列番号１］およびその相補鎖の天然の変異体および工作した修飾である。そのような修飾には例えば当該技術分野で知られている標識、メチル化および１以上の自然に存在するヌクレオチドと縮重ヌクレオチドとの置換を含む。

さらに本発明に含まれるのは、図１［配列番号１］に約９０％より高く、より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％同一または相同的である核酸配列である。

また本発明に含まれるのは、図１［配列番号１］のフラグメント、その相補鎖、それに相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡである。適当なフラグメントは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、そして機能的フラグメント、すなわち生物学的に興味深いフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは選択的スプライスバリアント：ｖｐ１［図１、配列番号１のｎｔ２１２１〜４３３５］；ｖｐ２［図１、配列番号１のｎｔ２５３２〜４３３５］；およびｖｐ３［図１、配列番号１のｎｔ２７３０〜４３３５］であるＡＡＶ８キャプシドの３つの可変タンパク質（ｖｐ）をコードする配列を含む。図１［配列番号１］の他の適当なフラグメントには、本明細書に記載するＡＡＶ８キャプシドタンパク質の出発コドンを含むフラグメント、およびｖｐ１キャプシドタンパク質の超可変領域をコードするフラグメントを含む。

さらに別のフラグメントには、ｒｅｐ７８［図１、配列番号１のｎｔ２２７に位置する開始コドン］、ｒｅｐ６８［図１、配列番号１のｎｔ２２７に位置する開始コドン］、ｒｅｐ５２［図１、配列番号１のｎｔ９０５に位置する開始コドン］およびｒｅｐ４０［図１、配列番号１のｎｔ９０５に位置する開始コドン］を含むｒｅｐタンパク質をコードするものを含む。他の興味深いフラグメントには、本明細書に記載する方法により同定することができるＡＡＶ８逆方向末端反復、ＡＡＶ Ｐ１９配列、ＡＡＶ８ Ｐ４０配列、ｒｅｐ結合部位およびターミナル リゾルート サイト（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｅ ｓｉｔｅ：ＴＲＳ）を含むことができる。さらに他の適当なフラグメントが当業者には直ちに明らかとなるだろう。

図面および配列表に提供する核酸配列を含むことに加えて、本発明は本発明のＡＡＶ血清型のアミノ酸配列、タンパク質およびペプチドを発現するように設計された核酸分子および配列を含む。すなわち本発明は以下の新規ＡＡＶアミノ酸配列およびこれらの配列および／またはその独自なフラグメントを使用して生成された人工ＡＡＶ血清型をコードする核酸配列を含む。

本明細書で使用する人工ＡＡＶ血清型には限定するわけではないが、自然には存在しないキャプシドタンパク質を持つＡＡＶを含む。そのような人工的キャプシドは本発明の新規ＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を、別のＡＡＶ血清型（既知または新規）から、同じＡＡＶ血清型の非連続部分から、非ＡＡＶウイルス供給源から、または非ウイルス供給源から得ることができるヘテロロガスな配列と組み合わせて使用して、任意の適切な技術により生成することができる。人工ＡＡＶ血清型には限定するわけではないが、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシドまたは「ヒト化」ＡＡＶキャプシドでよい。
Ｂ．ＡＡＶ８アミノ酸配列、タンパク質およびペプチド
本発明はさらに本発明のＡＡＶ８核酸によりコードされるタンパク質およびそのフラグメント、および他の方法により生成されるＡＡＶ８アミノ酸を提供する。本発明はさらに合成、組換えまたは当業者に既知の他の技術を使用して生成される本発明の新規ＡＡＶ血清型の配列を使用して生成されるＡＡＶ血清型を包含する。本発明は本発明の新規なＡＡＶ核酸配列から発現される新規ＡＡＶアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質に限定されず、そして例えば化学合成により、他の合成技法により、または他の方法によることを含む当該技術分野で既知な他の方法により生成されるアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質を包含する。例えば任意の配列が種々の技術を使用して容易に生成される。

適切な生産技法は当業者には周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー出版（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）を参照にされたい。あるいはペプチドは周知な固相ペプチド合成法により合成することもできる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６２）；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、固相ペプチド合成（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、サンフランシスコ、１９６９）第２７〜６２頁）。これらのおよび他の適当な生産法は当業者の知識内であり、そして本発明を限定しない。

特に望ましいタンパク質には上で確認したヌクレオチド配列によりコードされるＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。ＡＡＶキャプシドは選択的スプライス変異体である３つのタンパク質、ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３を含んでなる。図２に提供される完全長の配列はｖｐ１の配列である。ＡＡＶ８キャプシドタンパク質にはｖｐ１［配列番号２のａａ１〜７３７］、ｖｐ２［配列番号２のａａ１３８〜７３７］、およびｖｐ３［配列番号２のａａ２０３〜７３７］およびそれらの機能的フラグメントを含む。キャプシドタンパク質の他の望ましいフラグメントは、超可変領域（ＨＰＶ）間に位置する定常および可変領域を含む。キャプシドタンパク質の他の望ましいフラグメントにはＨＰＶ自体を含む。

ＡＡＶ２における配列多様性の領域を決定するために開発されたアルゴリズムでは、１２の超可変領域（ＨＶＲ）を生じ、その５個が重複するか、または４個の以前に記載された可変領域の一部である［Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７３：１３０９−１９（１９９９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７２：３０９−３１９］。このアルゴリズムおよび／または本明細書に記載するアライメント技術を使用して、新規ＡＡＶ血清型のＨＶＲを決定する。例えばＡＡＶ２ ｖｐ１［配列番号４］の番号に関して、ＨＶＲは以下のように位置する：ＨＶＲ１、ａａ１４６〜１５２；ＨＶＲ２ ａａ１８２〜１８６；ＨＶＲ３、ａａ２６２〜２６４；ＨＶＲ４、ａａ３８１〜３８３；ＨＶＲ５、ａａ４５０〜４７４；ＨＶＲ６、ａａ４９０〜４９５；ＨＶＲ７、ａａ５００〜５０４；ＨＶＲ８、ａａ５１４〜５２２；ＨＶＲ９、ａａ５３４〜５５５；ＨＶＲ１０、ａａ５８１〜５９４；ＨＶＲ１１、ａａ６５８〜６６７；およびＨＶＲ１２、ａａ７０５〜７１９。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘプログラムをデフォルト設定で使用して行う本明細書に提供されるアライメントを使用して、または他の市販されているか、もしくは公に利用可能なアライメントプログラムをデフォルト設定で使用して、当業者は本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定することができる。

ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のさらに他の望ましいフラグメントには、配列番号２のアミノ酸１〜１８４、配列番号２のアミノ酸１９９〜２５９；アミノ酸２７４〜４４６；アミノ酸６０３〜６５９；アミノ酸６７０〜７０６；アミノ酸７２４〜７３６；ａａ１８５〜１９８；ａａ２６０〜２７３；ａａ４４７〜４７７；ａａ４９５〜６０２；ａａ６６０〜６６９；およびａａ７０７〜７２３を含む。さらにＡＡＶキャプシドの他の適当なフラグメントの例には、ＡＡＶ２［配列番号４］の番号付けで、ａａ２４〜４２、ａａ２５〜２８；ａａ８１〜８５；ａａ１３３〜１６５；ａａ１３４〜１６５；ａａ１３７〜１４３；ａａ１５４〜１５６；ａａ１９４〜２０８；ａａ２６１〜２７４；ａａ２６２〜２７４；ａａ１７１〜１７３；ａａ４１３〜４１７；ａａ４４９〜４７８；ａａ４９４〜５２５；ａａ５３４〜５７１；ａａ５８１〜６０１；ａａ６６０〜６７１；ａａ７０９〜７２３を含む。さらに他の望ましいフラグメントには例えばＡＡＶ７中の配列番号２のアミノ酸１〜１８４、アミノ酸１９９〜２５９；アミノ酸２７４〜４４６；アミノ酸６０３〜６５９；アミノ酸６７０〜７０６；アミノ酸７２４〜７３６；ａａ１８５〜１９８；ａａ２６０〜２７３；ａａ４４７〜４７７；ａａ４９５〜６０２；ａａ６６０〜６６９；およびａａ７０７〜７２３を含む。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘプログラムをデフォルト設定で使用して行う本明細書に提供されるアライメントを使用して、または他の市販されているか、もしくは公に利用可能なアライメントプログラムをデフォルト設定で使用して、当業者は本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定することができる。

さらに他の望ましいＡＡＶ８タンパク質には、ｒｅｐ６８／７８およびｒｅｐ４０／５２［配列番号３のａａ１〜６２５内に位置する］を含むｒｅｐタンパク質を含む。ｒｅｐタンパク質の適当なフラグメントには配列番号３のａａ１〜１０２；ａａ１０３〜１４０；ａａ１４１〜１７３；ａａ１７４〜２２６；ａａ２２７〜２７５；ａａ２７６〜３７４；ａａ３７５〜３８３；ａａ３８４〜４４６；ａａ４４７〜５４２；ａａ５４３〜５５５；ａａ５５６〜６２５を含むことができる。

適当にはフラグメントは少なくとも８アミノ酸長である。しかし他の望ましい長さのフラグメントを容易に利用することができる。そのようなフラグメントは組換えで、または他の適当な手段、例えば化学合成により生成することができる。

本発明はさらに本明細書に提供する配列情報を使用して同定される他のＡＡＶ８配列を提供する。例えば本明細書に提供する上記ＡＡＶ８配列、感染性ＡＡＶ８はゲノムウォーキング技術（Ｓｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：１０８７−１０８８，Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６９７２−６９８５，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、カリフォルニア州）を使用して単離することができる。ゲノムウォーキングは、本発明の方法に従い同定される新規配列に隣接する配列の同定および単離に特によく適している。この技術は本明細書に提供する新規ＡＡＶキャプシドおよびｒｅｐ配列に基づき、新規ＡＡＶ８血清型の逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を単離するためにも有用である。

本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組換え生産、化学合成または他の合成手段を含む任意の適当な手段により生産することができる。そのような生産法は当業者の知識の範囲内であり、そして本発明を限定しない。
ＩＶ．ＡＡＶ８キャプシドを持つｒＡＡＶの生産
本発明は新規な野生型ＡＡＶ８を包含し、その配列はこれらウイルスが天然に付随するＤＮＡおよび／または細胞物質を含まない。別の観点では、本発明は標的細胞にヘテロロガスな遺伝子または他の核酸配列を送達するのに有用な分子の生産に、本発明の新規ＡＡＶ配列（そのフラグメントを含む）を利用する分子を提供する。

別の観点では本発明は標的細胞にヘテロロガスな遺伝子または他の核酸配列を送達するのに有用なウイルスベクターの生産に、本発明の新規ＡＡＶ８配列（そのフラグメントを含む）を利用する分子を提供する。

ＡＡＶ８配列を含む本発明の分子は、宿主細胞に送達され得る任意の遺伝的要素（ベクター）、例えばその上に持つ配列を転移する裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、非ウイルス性の送達媒体（例えば脂質に基づく担体）中のタンパク質、ウイルス等を含む。選択したベクターはトランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合法、高速ＤＮＡ−コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む任意の適当な方法により送達することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用する方法は核酸操作の技術を持つ者に知られており、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を含む。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照にされたい。

１つの態様では、本発明のベクターは最低限ＡＡＶ８キャプシドまたはそのフラグメントをコードする配列を含む。別の態様では、本発明のベクターは最低限ＡＡＶ８ｒｅｐタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列を含む。場合によりそのようなベクターはＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐタンパク質の両方を含むことができる。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの両方が提供されるベクターでは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ配列が両方ともＡＡＶ８起源であることができる。あるいは本発明はｒｅｐ配列がｃａｐ配列を提供している血清型とは異なるＡＡＶの血清型に由来するベクターを提供する。１つの態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は別の供給源（例えば別のベクター、または宿主細胞およびベクター）から発現される。別の態様では、これらｒｅｐ配列は異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列とフレイム内で融合して、キメラＡＡＶベクターを形成する。場合により本発明のベクターはさらにＡＡＶ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ３’ＩＴＲに挟まれた選択した導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子を含む。

このように１つの態様では、本明細書に記載するベクターは単一のＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ８）に由来することができる完全なＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列を含む。そのようなキャプシドは配列番号２のアミノ酸１〜７３８を含んでなることができる。あるいはこれらのベクターはヘテロロガスなＡＡＶまたは非ＡＡＶキャプシドタンパク質（またはそれらのフラグメント）に融合したＡＡＶ８キャプシドの１以上のフラグメントを含む人工キャプシドをコードする配列を含む。これらの人工キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８キャプシドの非連続部分から、または他のＡＡＶ血清型のキャプシドから選択される。例えばｒＡＡＶはｖｐ２および／もしくはｖｐ３から、またはｖｐ１から選択される１以上のＡＡＶ８キャプシド領域を含んでなるキャプシドタンパク質、またはＡＡＶ８、配列番号２のアミノ酸１〜１８４、アミノ酸１９９〜２５９；アミノ酸２７４〜４４６；アミノ酸６０３〜６５９；アミノ酸６７０〜７０６；アミノ酸７２４〜７３８から選択されるそれらのフラグメントを有することができる。別の例では、ｖｐ３タンパク質の開始コドンをＧＴＧに改変することが望ましいかもしれない。あるいはｒＡＡＶは、本明細書で同定される１以上のＡＡＶ血清型８のキャプシドタンパク質超可変領域、または限定するわけではないがＡＡＶ８キャプシドのａａ１８５〜１９８；ａａ２６０〜２７３；ａａ４４７〜４７７；ａａ４９５〜６０２；ａａ６６０〜６６９；およびａａ７０７〜７２３を含む他のフラグメントを含んでもよい。配列番号２を参照にされたい。これらの修飾は発現、収量を上げ、かつ／または選択した発現系における精製を向上させ、あるいは別の所望する目的（例えばトロピズムを変えるか、または中和抗体エピトープを改変する）とすることができる。

本明細書に記載するベクター、例えばプラスミドは様々な目的に有用であるが、特にＡＡＶ配列またはそのフラグメントを含んでなるキャプシドを含有するｒＡＡＶの生産での使用に良く適している。ｒＡＡＶを含むこれらのベクター、それらの要素、構築および使用を本明細書に詳細に記載する。

１つの観点では、本発明はＡＡＶ血清型８キャプシドまたはその部分を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成法を提供する。そのような方法には本明細書で定義するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；最低限ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）および導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子；およびミニ遺伝子をＡＡＶ８キャプシドタンパク質にパッケージングすることを可能とする十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。

ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶキャプシドへパッケージングするために、宿主細胞で培養されることが必要な要素は、宿主細胞にトランスで提供され得る。あるいは必要な要素の１以上（例えばミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）は、当業者に知られている方法を使用して１以上の必要な要素を含むように工作した安定な宿主細胞により提供され得る。最も適当には、そのような安定な宿主細胞は誘導性プロモーターの制御下に必要な要素（１つまたは複数）を含む。しかし必要な要素（１つまたは複数）は構成的プロモーターの制御下でもよい。適当な誘導性および構成的プロモーターの例は本明細書において導入遺伝子を用いた使用に適する調節要素の考察で提供する。さらに別の選択では、選択した安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下に選択した成分（１つまたは複数）を、そして１以上の誘導性プロモーターの制御下に他の選択した成分（１つまたは複数）を含むことができる。例えば、２９３細胞（これはＥ１ヘルパー機能を構成的プロモーターの制御下に含む）に由来するが、ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を誘導性プロモーターの制御下に含む安定な宿主細胞を作成することができる。さらに別の安定な宿主細胞を当業者は作成することができる。

本発明のｒＡＡＶを生産するために必要なミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、その上に持つ配列を移す任意の遺伝的要素の形態でパッケージング宿主細胞に送達され得る。選択した遺伝的要素は本明細書に記載する方法を含む任意の適当な方法により送達され得る。本発明の任意の態様を構成するために使用する方法は、核酸操作における当業者には知られており、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を含む。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照にされたい。同様にｒＡＡＶビリオンの作成法も周知であり、そして適当な方法の選択が本発明を限定することはない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照にされたい。

特に言及しない限り、本明細書に記載するＡＡＶ ＩＴＲｓおよび他の選択したＡＡＶ成分は限定するわけではないがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９および本発明の新規血清型ＡＡＶ８を含む任意のＡＡＶ血清型の中から容易に選択することができる。これらのＩＴＲｓまたは他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶ血清型から当業者が利用可能な技術を使用して容易に単離され得る。そのようなＡＡＶは学術的、市販の、または公的な供給源（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニア州）から単離または得ることができる。あるいはＡＡＶ配列は、技術文献またはＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄ等のようなデーターベースから利用できるような公開された配列を参照にすることにより、合成または適当な手段を通して得ることができる。
Ａ．ミニ遺伝子
ミニ遺伝子は最低限、導入遺伝子およびその調節配列、および５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を含んでなる。１つの望ましい態様では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲｓを使用する。しかし他の適当な血清型に由来するＩＴＲも選択することができる。このミニ遺伝子はキャプシドタンパク質にパッケージングされ、そして選択した宿主細胞に送達される。
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、問題のポリペプチド、タンパク質または他の産物をコードする導入遺伝子を挟むベクター配列にヘテロロガスな核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳および／または発現を可能とする様式で調節成分に操作可能に連結される。

導入遺伝子配列の組成は、生成するベクターに課される使用に依存するだろう。例えば導入遺伝子配列の１つの種類はレポーター配列を含み、これは発現により検出可能なシグナルを生産する。そのようなレポーター配列には限定するわけではないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ赤血球凝集タンパク質、および当該技術分野で周知の他のもの（これらに対する高親和性抗体が存在するか、あるいは通例の手段により生成することができる）、ならびに中でもとりわけ赤血球凝集素またはＭｙｃに由来する抗原のタグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。

これらのコード配列はそれらの発現を駆動する調節要素と会合した時、酵素、放射線、比色、蛍光または他の分光的アッセイ、蛍光活性化細胞ソーティングアッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む通例の手段により検出可能なシグナルを提供する。例えばマーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを持つベクターの存在は、ベータガラクトシダーゼ活性に関するアッセイにより検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを持つベクターはルミノメーター中での色または光の生産により視覚的に測定することができる。

しかし望ましくは、導入遺伝子はタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素または触媒ＲＮＡのような生物学および医学で有用な産物をコードする非−マーカー配列である。望ましいＲＮＡ分子にはｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の１例は、処置する動物中で標的核酸配列の発現を無効にする配列である。

導入遺伝子は、正常な遺伝子が正常レベルよりも低く発現される欠損、または機能的な遺伝子産物が発現されない欠損を含み得る遺伝子欠損を矯正するか、または軽減するために使用することができる。好適な種類の導入遺伝子配列は、宿主細胞で発現する治療用タンパク質またはペプチドをコードする。本発明はさらに、例えば多サブユニットタンパク質により引き起こされる遺伝子欠失を矯正するか、または改善するために多数の導入遺伝子を使用することを含む。特定の状況ではタンパク質の各サブユニットをコードするために、または異なるペプチドまたはタンパク質をコードするために種々の導入遺伝子を使用することができる。これはタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい時、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子またはジストロフィンタンパク質について望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を生産するためには、細胞を異なる各サブユニットを含む組換えウイルスに感染させる。あるいはタンパク質の種々のサブユニットが同じ導入遺伝子によりコードされてもよい。この場合、１つの導入遺伝子が各サブユニットをコードするＤＮＡを含み、各サブユニットのＤＮＡは内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）により分けられている。これは各サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが小さい時、例えばサブユニットをコードするＤＮＡおよびＩＲＥＳの全サイズが５キロベース未満である時に望ましい。ＩＲＥＳに対する代わりとして、ＤＮＡは２Ａペプチド（これは翻訳後反応（ｅｖｅｎｔ）で自己開裂する）をコードする配列により分けられてもよい。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８（Ｐｔ１）：１３−２１（Ｊａｎ１９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４−８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）；Ｋｌｕｍｐ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１−８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照にされたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳよりも有意に小さく、スペースが限定因子となる時の使用によく適している。しかし選択した導入遺伝子は任意の生物学的に活性な産物または他の産物、例えば研究に望ましい産物もコードすることができる。

適切な導入遺伝子は当業者により容易に選択され得る。導入遺伝子の選択が本発明を限定するとは考えられない。
２．調節要素
ミニ遺伝子に関して上記で確認した主要な要素に加えて、ベクターは本発明により生産されたプラスミドベクターでトランスフェクトした、またはウイルスに感染した細胞での転写、翻訳および／または発現を可能とする様式で導入遺伝子に操作可能に連結された、通常の必要な制御要素も含む。本明細書で使用するように「操作可能に連結した」配列には、問題の遺伝子に連続する発現制御配列、およびトランスで、つまり一定の距離を離れて作用して問題の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。

発現制御配列には適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニレーション（ポリＡ）シグナルのような効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわちＫｏｚａｋ共通配列）；タンパク質の安定性を強化する配列；および所望により、コードされた産物の分泌を強化する配列を含む。天然の、構成的な、誘導性のおよび／または組織特異的なプロモーターを含む莫大な数の発現制御配列が当該技術分野では知られており、そして利用することができる。

構成的プロモーターの例には限定するわけではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを含む）［例えばＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照にされたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を含む。誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能とし、そして外から供給される化合物、温度のような環境的因子、または特別な生理学的状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在により、あるいは複製している細胞のみで調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、限定するわけではないがインビトロゲン、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびアリアド（Ａｒｉａｄ）を含む様々な商業的供給源から入手することができる。多くの他の系が記載され、そして当業者により容易に選択され得る。外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターおよびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際公開第９８／１００８８号パンフレット］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン−抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン−誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、またＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）を参照にされたい］、ＲＵ４８６−誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）］およびラパマイシン−誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を含む。この内容において有用となり得る誘導性プロモーターの他の例には、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製している細胞のみにより調節されるプロモーターを含む。

別の態様では、導入遺伝子に天然のプロモーターを使用する。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模するべきであることが望まれる時に好適となり得る。天然のプロモーターは導入遺伝子の発現が一時的にもしくは発育的に、または組織特異的様式で、あるいは特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない時に使用することができる。さらなる態様では、エンハンサーエレメント、ポリアデニレーション部位またはＫｏｚａｋ共通配列のような他の天然の発現制御要素を使用して、天然の発現を模することもできる。

導入遺伝子の別の態様には、組織−特異的プロモーターに操作可能に連結された導入遺伝子を含む。例えば骨格筋中での発現が望まれる場合、筋肉中で活性なプロモーターを使用するべきである。これらには骨格筋β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターよりも高い活性を持つ合成の筋肉プロモーターを含む（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９）を参照にされたい）。組織−特異的であるプロモーターの例は、中でも肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４（１９９６））、骨のオステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロプロテイン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６）），リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプター鎖）、ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターのような神経性（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽−鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン−特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））について知られている。

場合により治療的に有用な導入遺伝子を持つプラスミドは、中でもジェネティシン、ハイグロマイシンまたはプリマイシン耐性をコードする配列を含むことができる選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子を含んでもよい。そのような選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子（好ましくは本発明の方法によりレスキューされるウイルスゲノムの外側に位置する）を使用して、アンピシリン耐性のような細菌細胞中でのプラスミドの存在のシグナルを出すことができる。プラスミドの他の成分には、複製起点を含むことができる。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は通例であり、そして多くのそのような配列を利用することができる［たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、およびそこに引用されている参考文献を参照にされたい］。

導入遺伝子、プロモーター／エンハンサーおよび５’および３’ＩＴＲｓの組み合わせは、本明細書で簡便性のために「ミニ遺伝子」と呼ぶ。本発明の教示によれば、そのようなミニ遺伝子の設計は通例の技術により作成することができる。
３．ミニ遺伝子のパーケッジンング宿主細胞への送達
ミニ遺伝子は宿主細胞へ送達される任意の適当なベクター、例えばプラスミド上で運ぶことができる。本発明に有用なプラスミドは、それらが複製、そして場合により原核細胞、哺乳動物細胞または両方への組み込みに適当となるように工作することができる。これらのプラスミド（または５’ＡＡＶ ＩＴＲ−ヘテロロガス分子−３’ＩＴＲを持つ他のベクター）は、真核および／または原核細胞中でのミニ遺伝子の複製およびこれらの系に関する選択マーカーを可能とする配列を含む。選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子は、中でもジェネティシン、ハイグロマイシンまたはプリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を含むことができる。プラスミドはアンピシリン耐性のような細菌細胞中でのベクターの存在の信号を出すために使用できる特定の選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子を含むこともできる。プラスミドの他の成分には複製起点およびエプスタイン・バーウイルス核抗原を使用するアンプリコン系のようなアンプリコンを含むことができる。このアンプリコン系または他の類似のアンプリコン成分は細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能とする。好ましくはミニ遺伝子を持つ分子は細胞にトランスフェクトされ、ここで一時的に存在することができる。あるいはミニ遺伝子（５’ＡＡＶ ＩＴＲ−ヘテロロガス分子−３’ＩＴＲを持つ）は、染色体にまたはエピソームのいずれかとして宿主細胞のゲノムに安定に組込まれることができる。特定の態様では、ミニ遺伝子は場合により頭−対−頭、頭−対−尾または尾−対−尾のコンカテマーの多コピーで存在することができる。適当なトランスフェクション技術が知られており、そしてミニ遺伝子を宿主細胞に送達するために容易に利用することができる。

一般にミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する時、ベクターは約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、約１０〜約５０μｇのＤＮＡから約１×１０^４細胞〜約１×１０^１３細胞、または約１０^５細胞の量で送達される。しかし宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対的量は、選択するベクター、送達法および選択する宿主細胞のような因子を考慮して調整することができる。
Ｂ．ＲｅｐおよびＣａｐ配列
ミニ遺伝子に加えて、宿主細胞は宿主細胞中でＡＡＶ８キャプシドタンパク質（またはＡＡＶ８キャプシドのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質）の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子中に見いだされるＡＡＶ ＩＴＲｓの血清型と同じ血清型または交差−相補血清型のｒｅｐ配列を含む。ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ配列は上記のようにＡＡＶの供給源から独立して得ることができ、そして上記のように当該技術分野で知られている任意の既知の様式で宿主細胞に導入することができる。さらにＡＡＶ８キャプシド中のＡＡＶベクターをシュードタイプ化する時、必須の各ｒｅｐタンパク質をコードする配列はＡＡＶ８により供給されてもよく、またはｒｅｐタンパク質をコードする配列は異なるＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９）により供給されてもよい。例えばｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２に由来することができ、一方ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ８に由来することができる。

１つの態様では、宿主細胞は上記のような適当なプロモーターの制御下にキャプシドタンパク質を安定に含む。最も望ましくは、この態様ではキャプシドタンパク質が誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様ではキャプシドタンパク質は宿主細胞にトランスで供給される。宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質は宿主細胞で選択したキャプシドタンパク質の発現を支配するために必要な配列を含むプラスミドを介して送達することができる。最も望ましくは宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質を持つプラスミドはｒＡＡＶをパーケッジンングするために必要な他の配列、例えばｒｅｐ配列も持つ。

別の態様では、宿主細胞は上記のような適当なプロモーターの制御下にｒｅｐ配列を安定に含む。最も望ましくはこの態様では、必須なｒｅｐタンパク質が誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様では、ｒｅｐタンパク質は宿主細胞にトランスで供給される。宿主細胞にトランスで送達される時、ｒｅｐタンパク質は宿主細胞で選択したｒｅｐタンパク質の発現を支配するために必要な配列を含むプラスミドを介して送達される。最も望ましくは宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質を持つプラスミドはｒＡＡＶをパーケッジンングするために必要な他の配列、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列も持つ。

このように１つの態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は１つの核酸分子で宿主細胞にトランスフェクトされ、そしてエピソープとして細胞中で安定に存在することができる。別の態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞の染色体に安定に組込まれる。別の態様は宿主細胞で一時的に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えばそのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は５’から３’へ、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に介在する任意のスペーサー、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子配列およびＡＡＶｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。

場合によりｒｅｐおよび／ｃａｐ配列は宿主細胞に導入される他のＤＮＡ配列を含むベクターで供給してもよい。例えばベクターはミニ遺伝子を含んでなるｒＡＡＶ構築物を含むことができる。ベクターはヘルパー機能をコードする１以上の遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６、およびＶＡＩ ＲＮＡの遺伝子を含んでなることができる。

好ましくはこの構築物に使用するプロモーターは、当業者に知られているか、または上記で検討した任意の構成的、誘導性または天然のプロモーターでよい。１つの態様ではＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列が使用される。任意のこれら配列を提供するためのＡＡＶの選択が本発明を限定することはない。

別の好適な態様では、ｒｅｐのプロモーターは導入遺伝子の調節要素との関連で上に検討したような誘導性プロモーターである。ｒｅｐ発現の１つの好適なプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを構成的または誘導的に発現するいずれかの細胞にトランスフェクトまたは形質転換される。例えば１９９８年３月１２日に公開された国際公開第９８／１００８８号パンフレットを参照にされたい。

スペーサーはベクターの設計における任意の要素である。スペーサーはプロモーターとｒｅｐ遺伝子のＡＴＧ開始部位との間に介在するＤＮＡ配列である。スペーサーは任意の所望する設計を有することができる；すなわちスペーサーはヌクレオチドのランダムな配列でよく、あるいはスペーサーはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードすることができる。スペーサーは典型的には開始／終止およびポリＡ部位を包含する遺伝子を含むことができる。スペーサーは原核または真核生物に由来する非コードＤＮＡ配列、反復非コード配列、転写制御を含まないコード配列または転写制御を含むコード配列であることができる。２つの例示的なスペーサー配列源はファージラダー配列または酵母ラダー配列であり、これらは例えば中でもギブコ（Ｇｉｂｃｏ）またはインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。スペーサーはｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物の発現を正常レベルにしたまま、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を下げるために十分な任意のサイズでよい。したがってスペーサーの長さは約１０ｂｐ〜約１０．０ｋｂｐの範囲、好ましくは約１００ｂｐ〜約８．０ｋｂｐの範囲となり得る。組換えの可能性を減少させるために、スペーサーは好ましくは２ｋｂｐ長よりも短く；しかし発明を限定するものではない。

ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１つまたは複数）は宿主細胞に一時的に存在できるが（すなわちトランスフェクションを介して）、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の１つまたは両方およびそれらの発現を制御するプロモーター（１つまたは複数）が、宿主細胞中で例えばエピソームとして、または宿主細胞の染色体に組み込まれることにより安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構成するために使用する方法は、上記に引用した中に記載されるような通例の遺伝子工学または組換え工学技術である。この明細書では本明細書で提供する情報を使用して特別な構築物の具体例を提供するが、当業者は他の適当な構築物をスペーサー、Ｐ５プロモーターおよび少なくとも１つの翻訳開始および終止シグナル、および任意のポリアデニレーション部位の付加を含む他の要素の選択を使用して選択し、そして設計することができる。

本発明の別の態様では、ｒｅｐまたはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供され得る。
Ｃ．ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞も、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能を必要とする。場合によりこれらの機能は、ヘルペスウイルスにより供給される。最も望ましくは必要なヘルパー機能はそれぞれ、上記のおよび／またはバージニア州（米国）マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）を含む様々な供給源から入手可能であるようなヒトまたは非ヒト霊長類のアデノウイルス源から提供される。現在好適な１つの態様では、宿主細胞はＥ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物および／またはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物で供給されるか、かつ／またはそれらを含む。宿主細胞はＶＡＩ ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子も含むことができるが、これらの遺伝子は必要ではない。好適な態様では、宿主細胞に他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能は存在しない。

「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」とは、Ｅ１ａまたは任意の機能的Ｅ１ａタンパク質をコードする任意のアデノウイルス配列を意味する。Ｅ２ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡおよびＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡも同様に定義する。またアデノウイルス遺伝子またはそれらの機能的部分の任意の対立遺伝子または他の修飾も含む。そのような修飾は幾つかの様式でアデノウイルス機能を強化するための通例の遺伝子工学または突然変異誘発技術により意図的に、ならびに自然に存在するそれらの対立遺伝子変異体により導入され得る。これらのアデノウイルス遺伝子機能を達成するためのそのような修飾およびＤＮＡの操作法は、当業者には知られている。

アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／またはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびに任意の他の所望するヘルパー機能は、細胞でそれらの発現を可能とする任意の手段を使用して提供することができる。これら産物をコードする各配列は別のベクター上に存在するか、または１以上の遺伝子が同じベクター上に存在してもよい。ベクターはプラスミド、コスミドおよびウイルスを含む当該技術分野で既知の、または上に開示した任意のベクターでよい。ベクターの宿主細胞への導入は、中でもトランスフェクション、感染、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ−コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む当該技術分野で既知の手段により、または上に開示したように達成することができる。１以上のアデノウイルス遺伝子を、エピソームとして安定に発現する宿主細胞のゲノムに安定に組込むか、または一時的に発現させることができる。遺伝子産物はエピソーム上で、または安定に組み込まれてすべてが一時的に発現されるか、あるいは遺伝子産物の幾つかが安定に発現されると同時に、他の産物は一時的に発現される。さらに各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択することができる。プロモーターは、例えば生物または細胞の特異的な生理学的状態（すなわち分化状態により、または複製中であるか、または静止細胞）、あるいは例えば外から加えられた因子により調節され得る。
Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞系
宿主細胞自体は原核（例えば細菌）細胞、および昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞を含む任意の生物から選択することができる。特に望ましい宿主細胞は限定するわけではないがＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、およびヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来する初代繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を含む任意の哺乳動物種から選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定せず；哺乳動物細胞の種類、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞等も本発明を限定しない。使用する細胞の要件は、細胞がＥ１、Ｅ２ａおよび／またはＥ４ＯＲＦ６以外のアデノウイルス遺伝子を持たず；細胞はｒＡＡＶの生産中に混入ウイルスの相同的組換えを生じる可能性がある他の任意の他のウイルス遺伝子を含まず；そして細胞はＤＮＡの感染またはトランスフェクション、およびトランスフェクトしたＤＮＡの発現を行うことができる。好適な態様では、宿主細胞は細胞に安定にトランスフェクトされたｒｅｐおよびｃａｐを有するものである。

本発明に有用な１つの宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換され、そしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡおよび上記のミニ遺伝子を持つ構築物でトランスフェクトされた宿主細胞である。Ｂ−５０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３）または米国特許第５，６５８，７８５号明細書に記載された細胞のような安定なｒｅｐおよび／またはｃａｐ発現細胞系も同様に使用することができる。別の望ましい宿主細胞はＥ４ＯＲＦ６を発現するために十分な最少のアデノウイルスＤＮＡを含む。さらに別の細胞系は、本発明のＡＡＶ８ｒｅｐおよび／またはＡＡＶ８ｃａｐ配列を使用して構築することができる。

本発明に従い宿主細胞の調製には選択したＤＮＡ配列の集合のような技術を含む。この集合は、通常の技術を利用して行うことができる。そのような技術には周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（同上）に記載されているｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法および所望のヌクレオチド配列を提供する他の適当な方法と組み合わせたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用を含む。

分子（プラスミドまたはウイルスとして）の宿主細胞への導入も、当業者に既知の技術を使用して、そして本明細書を通して検討するように行うことができる。好適な態様では、標準的なトランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ_４トランスフェクションまたは電気穿孔、および／またはハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによるヒト胚性腎細胞系ＨＥＫ２９３（トランスに作用するＥ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含むヒト腎臓細胞系）のような細胞系への感染を使用する。

当業者により作成されるＡＡＶ８に基づくベクターは、ＡＡ８に対する中和抗体がヒトの群で見いだされていないので、選択した宿主細胞および遺伝子治療患者への遺伝子送達に有益である。当業者は当業者に知られている様々な技術を使用して、本明細書で提供されるＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含む他のｒＡＡＶウイルスベクターを容易に調製することができる。同様にＡＡＶ８配列および他の血清型のＡＡＶキャプシドを含むさらに他のｒＡＡＶウイルスベクターを調製することもできる。

当業者は本発明のＡＡＶ８配列を、インビトロ、エクスビボまたはインビボ遺伝子送達のためのこれらおよび他のウイルスベクター系での使用に容易に適合させることができると容易に理解するだろう。同様に当業者は種々のｒＡＡＶおよび非ｒＡＡＶベクター系で使用するために、本発明のＡＡＶ８ゲノムの他のフラグメントを容易に選択することができる。そのようなベクター系は、中でも例えばレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を含む。これらベクター系の選択は本発明を限定しない。

このように本発明はさらに、本発明の新規ＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を使用して生成したベクターを提供する。そのようなベクターは治療用分子の送達およびワクチン処方における使用を含む様々な目的に有用である。治療用分子の送達に特に望ましいのは、本発明の新規ＡＡＶのキャプシドを含有する組換えＡＡＶである。本発明の新規ＡＡＶ配列を含むこれらまたは他のベクター構築物をワクチン処方に、例えばサイトカインとの同時送達に、または免疫原自体の送達に使用することができる。
Ｖ．組換えウイルスおよびその使用
本明細書に記載する技術を使用して、当業者は本発明の血清型８のキャプシドを有するか、またはＡＡＶ８の１以上のフラグメントを含むキャプシドを有するｒＡＡＶを生成することができる。１つの態様では、単一の血清型、例えばＡＡＶ８［配列番号２］に由来する完全長のキャプシドを利用することができる。別の態様では、別の選択したＡＡＶ血清型に由来するか、またはＡＡＶ８のヘテロロガスな部分に由来する配列に枠内で融合したＡＡＶ８の１以上のフラグメントを含む完全長のキャプシドを生成することができる。例えばｒＡＡＶはＡＡＶ８の１以上の新規な超可変領域配列を含むことができる。あるいは本発明の独自なＡＡＶ８配列を、他のウイルスまたは非ウイルス配列を含む構築物に使用することができる。場合により組換えウイルスは１以上のＡＡＶ８ｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ８ｒｅｐ配列を持つことができる。
Ａ．ウイルスの送達
別の観点では、本発明は導入遺伝子を宿主に送達するための方法を提供し、この方法には選択した宿主細胞を本発明のＡＡＶ８配列（またはその機能的フラグメント）を用いて生成した組換えウイルスベクターでトランスフェクトまたは感染させることが含まれる。送達法は当業者には周知であり、そして本発明を限定しない。

１つの望ましい態様では、本発明はＡＡＶ８が媒介する導入遺伝子の宿主への送達法を提供する。この方法には選択した導入遺伝子およびＡＡＶ８キャプシドタンパク質の発現を支配する配列の制御下に選択した導入遺伝子を含む組換えウイルスベクターで、選択した宿主細胞をトランスフェクトまたは感染させることが含まれる。

場合により選択したＡＡＶ血清型に対する抗体の存在について、宿主からのサンプルを最初にアッセイすることができる。中和抗体を検出するための様々なアッセイ形式が当業者には周知である。そのようなアッセイの選択は本発明を限定しない。例えばＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３（３）：３０６−３１２（１９９７年３月）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９；４７７−４８５（１９９８年３月１日）。このアッセイの結果を使用して、例えばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の不存在により、特定の血清型のキャプシドタンパク質を含むどのＡＡＶベクターが送達に好適であるかを決定することができる。

この方法の１つの観点では、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質を持つベクターの送達が、異なる血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を持つベクターを介する遺伝子の送達の前もしくは後に行われる。すなわちｒＡＡＶベクターを介する遺伝子送達は、選択した宿主細胞に反復して遺伝子を送達するために使用することができる。望ましくは続いて投与するｒＡＡＶベクターは最初のｒＡＡＶベクターと同じ導入遺伝子を運ぶが、続いて投与されるベクターは最初のベクターとは異なる血清型のキャプシドタンパク質を含む。例えばもし最初のベクターがＡＡＶ８キャプシドタンパク質を有するならば、続いて投与されるベクターは他の血清型の中から選択されるキャプシドタンパク質を有することができる。

上記の組換えベクターは公開された方法に従い宿主細胞に送達することができる。好ましくは生理学的に適合性のある担体中に懸濁されたｒＡＡＶを、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与することができる。適当な担体は転移するウイルスが向けられる兆候の観点から当業者により容易に選択され得る。例えば１つの適当な担体には種々の緩衝化溶液を用いて配合される塩水（例えばリン酸緩衝化生理食塩水）を含む。他の例示担体には滅菌塩水、ラクトース、シュクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油および水を含む。担体の選択は本発明を限定しない。

場合により本発明の組成物はｒＡＡＶおよび担体（１つまたは複数）に加えて、保存剤または化学的安定化剤のような他の通例の製薬学的成分を含むことができる。適当な例示的保存剤にはクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。適当な化学的安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンを含む。

ベクターは細胞をトランスフェクトし、そして医学的分野における当業者により決定され得る不適当な副作用を与えずに、または医学的に許容され得る生理学的効果で治療的利益を提供するために十分なレベルの遺伝子転移および発現を提供するために十分な量で投与される。通例の、そして製薬学的に許容され得る投与経路には限定するわけではないが、所望する器官（例えば肝臓または肺）への直接送達、経口、吸入、鼻内、気管内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路を含む。投与経路は所望により組み合わせることができる。

ウイルスベクターの投薬用量は、処置する状態、患者の年齢、体重および健康のような因子に主に依存し、そして患者間で変動し得る。例えばウイルスベクターの治療に有効なヒトへの投薬用量は、一般に約１×１０^９〜約１×１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含む約１ｍｌ〜約１００ｍｌ溶液の範囲内である。好適なヒトへの投薬用量は約１×１０^１３〜１×１０^１６ＡＡＶゲノムとなり得る。投薬用量は副作用に対して治療的利益のバランスを取るように調整され、そしてそのような投薬用量は組換えベクターを使用する治療的応用に依存して変動することができる。導入遺伝子の発現レベルは投薬頻度を決定するために監視することができ、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含むＡＡＶベクターをもたらす。場合により治療目的に記載されたものに類似する投薬計画を、本発明の組成物を使用して免疫感作するために利用することができる。

本発明のＡＡＶ８を含むベクターにより送達するための治療用産物および免疫原性産物の例を以下に提供する。これらのベクターは本明細書に記載するように、種々の治療用またはワクチン接種計画に使用することができる。さらにこれらのベクターは１以上の他のベクターまたは有効成分と組み合わせて、望ましい治療用かつ／またはワクチン接種計画で送達され得る。
Ｂ．治療用の導入遺伝子
導入遺伝子によりコードされる有用な治療用産物には、限定するわけではないがインスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを含むトランスフォーミング増殖因子αスーパーファミリーの任意のもの、あるいは任意の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のＢＭＰｓ１〜１５、増殖因子のヒレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ 分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの任意のもの、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ノルチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、アグリン、セマフォリン／コラポスリンファミリーの任意のもの、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン類（ｅｐｈｒｉｎｓ）、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼを含むホルモンおよび増殖および分化因子を含む。

他の有用な導入遺伝子産物には、限定するわけではないがトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−１８、単球誘引タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドのようなサイトカインおよびリンホカインを含む免疫系を調節するタンパク質を含む。免疫系により生産される遺伝子産物も、本発明に有用である。これらには限定するわけではないが免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を含む。有用な遺伝子産物には補体調節タンパク質、膜コファクタータンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質を含む。

さらに他の有用な遺伝子産物には、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の任意のレセプターを含む。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レセプター、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）レセプターおよびスカベンジャーレセプターを含むコレステロール調節に関するレセプターを包含する。また本発明は、グルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプター、ビタミンＤレセプターおよび他の核レセプターを含むステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーの員のような遺伝子産物も包含する。加えて有用な遺伝子産物には、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳ−ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ−結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、および翼型ヘリックス（ｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘ）タンパク質のフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）ファミリーのような転写因子を含む。

他の有用な遺伝子産物には、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ、デヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グリコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性繊維症膜貫通調節（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列を含む。さらに他の有用な遺伝子産物には、酵素の欠損活性から生じる様々な状態に有用な酵素代替療法に有用となり得るような酵素を含む。例えばマンノース−６−ホスフェートを含む酵素は、リソソーム蓄積症（例えば適当な遺伝子にはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを含む）の治療に利用することができる。

他の有用な遺伝子産物には、挿入、削除またはアミノ酸置換を含む自然には存在しないアミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドのような自然には存在しないポリペプチドを含む。例えば単鎖の工作された免疫グロブリンは特定の免疫抑制患者に有用となり得る。他の種類の自然には存在しない遺伝子配列には、標的の過剰発現を低下させるために使用することができるアンチセンス分子およびリボザイムのような触媒核酸を含む。

遺伝子発現の減少および／または調節は、癌および乾癬のような過増殖細胞の特徴である過増殖状態を処置するために特に望ましい。標的とするポリペプチドには、正常細胞に比べて過増殖細胞で排他的に、または高レベルで生産されるポリペプチドを含む。標的抗原には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎおよびトランスロケーション遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦのような癌遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。標的抗原として癌遺伝子産物に加えて、抗癌治療および防御的処方のための標的ポリペプチドには、Ｂ細胞リンパ腫により作られた抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞レセプターの可変領域を含み、これらは態様によっては自己免疫疾患の標的抗原としても使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを含む腫瘍細胞中で高レべルで見いだされるポリペプチドのような標的ポリペプチドとして使用することができる。

他の適切な治療用ポリペプチドおよびタンパク質には、細胞レセプターおよび“自己”に向かう抗体を生産する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対して広範な防御免疫応答を与えることによる自己免疫疾患および障害を患っている個体を処置するために有用となり得るものを含む。Ｔ細胞性自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む。これらの各疾患は、内因性の抗原に結合し、そして自己免疫疾患に関係する炎症カスケードを開始するＴ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）を特徴とする。
Ｃ．免疫原性導入遺伝子
あるいはまたは加えて、本発明のベクターは本発明のＡＡＶ配列および選択した免疫原に対して免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子を含むことができる。例えば免疫原は種々のウイルス科から選択することができる。免疫応答が望まれる望ましいウイルス科の例は、望ましくは一般的な風邪の原因の約５０％を占めるライノウイルス属；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスのようなヒト腸内ウイルスを含む腸内ウイルス属；および主に非−ヒト動物において足および口の疾患の原因であるアフトウイルス属を含むピコルナウイルス科を含む。ピコルナウイルス科内のウイルスで、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを含む。別のウイルス科には、流行性胃腸炎の重要な病原体であるウイルスのノーウォーク群を包含するカルシウイルス科を含む。ヒトおよび非−ヒト動物に免疫応答を誘導するための標的抗原として使用するために望ましいさらに別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロス川ウイルスおよびベネゼエラ、東部および西部ウマ脳髄膜炎を含むアルファウイルス属、および風疹ウイルスを含むルビウイルスを含むトガウイルス科である。フラビウイルス科にはデング、黄熱、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介性脳炎ウイルスを含む。他の標的抗原は、感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数の非−ヒトウイルス、および普通の風邪および／または非−Ａ、ＢまたはＣ型肝炎の原因となり得るヒト呼吸コロナウイルスを含むＣ型肝炎またはコロナウイルス科から生成することができる。コロナウイルス科内で、標的抗原にはＥ１（Ｍまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたは赤血球凝集素−エルテロース（ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）、糖タンパク質（すべてのコロナウイルスに存在するわけではない）、またはＮ（ヌクレオキャプシド）を含む。さらに別の抗原は、ベシキュロウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）および一般的な狂犬病ウイルス（例えば狂犬病）を含むラブドウイルス科を標的とすることができる。ラブドウイルス科内で適当な抗原は、Ｇタンパク質またはＮタンパク質に由来することができる。マールブルグおよびエボラウイルスのような出血性の発熱ウイルスを含むフィロウイルス科も抗原の適当な供給源となり得る。パラミクソウイルス科には、１型パラインフルエンザウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、ウシ３型パラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、２型パラインフルエンザウイルス、４型パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジステンバーを含むモルビリウイルス、および呼吸合胞体ウイルスを含むニューモウイルスを含む。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルスの科に分類され、そして抗原の適切な供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科には、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラ クロス（Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ））、フレボウイルス属（リフト渓谷熱）、ハンタウイルス属（プレマーラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビヒツジ病）および種々の割り当てられていないブンガウイルス属（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）を含む。アレナウイルス科は、ＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科には、レオウイルス属、ロタウイルス属（これは小児の急性胃腸炎の原因である）、オルビウイルス属およびカルチウイルス属（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、レボンボ（Ｌｅｂｏｍｂｏ）（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）を含む。レトロウイルス科には、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶ１およびＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（これはＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプーマウイルスを含む）のようなヒトおよび獣医学上の疾患を包含するオンコリウイルス（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）の亜科を含む。パポバウイルス科にはポリオーマウイルス（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）の亜科およびパピローマウイルス（癌または乳頭腫の悪性の進行に関連する）の亜科を含む。アデノウイルス科には呼吸疾患および／または腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。パルボウイルス科のネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコパンロイコペニアウイルス（ｐａｎｌｅｕｃｏｐｅｎｉａｖｉｒｕｓ）、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルス。ヘルペスウイルス科には、シンプレックスウイルス属（ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセーロウイルス属（ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を含むアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス属（ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））を含むベータヘルペスウイルス亜科、およびリンホクリプトウイルス属（ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、伝染性鼻気管支炎、マルク病ウイルスおよびラジノウイルス属（ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）を含むガンマヘルペスウイルス亜科を含む。ポックスウイルス科にはオルソポックスウイルス（バリオーラ（Ｖａｒｉｏｌａ）（痘瘡）およびワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含する脊椎動物ポックスウイルス亜科、およびエントモポックスウイルスの亜科を含む。ヘパドナウイルス科には、Ｂ型肝炎ウイルスを含む。適当な抗原源となり得る１つの分類されていないウイルスは、デルタ肝炎ウイルスである。さらに抗原の供給源である別のウイルスはニパン（Ｎｉｐａｎ）ウイルスである。さらに別のウイルス源には、鳥類感染性嚢疾患ウイルスおよびブタ呼吸および生殖症候群ウイルスを含む。アルファウルイス科にはウマ関節炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスを含む。

本発明はヒトまたは非ヒト動物を、ヒトおよび非ヒト動物に感染する細菌、菌類、寄生微生物もしくは多細胞寄生生物を含む他の病原体に対して免疫感作するために有用な免疫原、あるいは癌細胞または腫瘍細胞に由来する免疫原も包含する。細菌病原体の例には、病原性グラム陽性球菌を含み、それらには肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）；ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）（およびそれらにより生産されるトキシン、例えばエンテロトキシンＢ）；および連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）を含む。病原性グラム陰性球菌には髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）；淋菌（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む。病原性腸内グラム陰性桿菌には、腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびイケネーラ属（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ属（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲーラ属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィラス属（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセーラ属（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；Ｈ．デュクレイ（ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ種（ｂｒｕｃｅｌｌａ）（ブルセラ症）；野兎病菌（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；ペスト菌（ペスト）および他のエルシニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ属）；ストレプトバシラス モニリホルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリウム属（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）を含む；グラム陽性桿菌にはリステアリモノシトゲネシス（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径肉芽腫）；およびバルトネラ症を含む。病原性の嫌気性細菌により引き起こされる疾患には、破傷風；ボツリヌス中毒（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびそのトキシン）；ガス壊疽菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのイプシロン トキシン；他のクロストリジウム属（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）；結核；ハンセン病；および他のマイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含む。病原性スピロヘーター疾患には梅毒；トリポネーマ症；フランベジア、ピンタおよび性行為外の梅毒；およびレプトスピラ症を含む。より高等な病原性細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染には、馬鼻疽（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）；放線菌症；ノルカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクス症；パラコクシジオイドミコーシス症、ペトリリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコシース；および皮膚糸状菌症を含む。リケッチア感染にはチフス熱、ロッキー山熱病、Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）：およびリケッチア痘を含む。マイコプラズマおよびクラミジア感染の例には：マイコプラズマ肺炎；リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染を含む。病原性真核生物には、病原性原生成物および蠕虫を含み、そしてそれらにより引き起こされる感染には；アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスティスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラズマ ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア鞭毛虫症；旋毛虫症；フィラリア症；住虫吸虫症；線虫；吸虫綱に属する吸虫類または吸虫類；および多節条虫亜綱（条虫）感染を含む。

多くのこれら生物および／またはそれらにより生産されたトキシンが疾病管理センター［（ＣＤＣ）、米国の保健福祉省］により、生物学的攻撃に使用するための可能性を有する病原体として同定された。例えばこれら生物剤の幾つかには、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（悪疫）、大痘瘡（痘瘡）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、およびウイルス性出血熱［フィロウイルス属（例えばエボラ、マールブルグ］、およびアレナウイルス属［例えばラッサ、マチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ］）これらすべては現在、カテゴリーＡ剤に属する；Ｑ熱リケッチア菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（ブルセラ症）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（類鼻疽）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびそのトキシン（リシン トキシン）、ガス壊疽（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのトキシン（イプシロントキシン）、ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびそのトキシン（エンテロトキシンＢ）、クラミジア シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性に関する脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム パルバム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、チフス熱（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ ｐｏｗａｚｅｋｉｉ））およびウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネゼエラ ウマ 脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；このすべてが現在、カテゴリーＢ剤に属する；および現在、カテゴリーＣ剤に分類されるニパン（Ｎｉｐａｎ）ウイルスおよびハンタウイルスを含む。さらにそのように分類されるか、または異なって分類される他の生物を、将来、そのような目的に同定し、かつ／または使用することができる。本明細書に記載するウイルスベクターおよび他の構築物は、これらの生物、ウイルス、それらのトキシンまたは副産物に由来する抗原を送達するために有用であり、これによりこれらの生物剤で感染または他の副作用が防止され、かつ／または処置されると容易に理解される。

Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与は、ＣＴＬｓを含む免疫応答を誘導してこれらＴ細胞を排除する。慢性関節リウマチ（ＲＡ）では、疾患に関与するＴＣＲｓの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲｓにはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶ−１７を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。多発性硬化症（ＭＳ）では、疾患に関与するＴＣＲｓの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲｓにはＶ−７およびＶ−１０を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。硬皮症では、この疾患に関与するＴＣＲｓの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲｓにはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶ−１６、Ｖ−３Ｃ、Ｖ−７、Ｖ−１４、Ｖ−１５、Ｖ−１６、Ｖ−２８およびＶ−１２を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸分子の送達は、硬皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。

このように本発明のｒＡＡＶ８に由来する組換えウイルスベクターは、選択した導入遺伝子を、生物が１以上のＡＡＶ血清型の中和抗体を有する選択した宿主細胞にインビボまたはエクスビボで送達することができる効率的な遺伝子転移媒体を提供する。１つの態様では、ｒＡＡＶおよび細胞はエクスビボで混合され；感染した細胞は常法を使用して培養され；そして形質導入された細胞が患者に再注入される。

これらの組成物は治療目的および防御免疫を誘導することを含む免疫感作のための遺伝子送達に特によく適している。さらに本発明の組成物はインビトロで所望する遺伝子産物の生産にも使用することができる。インビトロ生産については、所望の産物（例えばタンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含むｒＡＡＶで宿主細胞をトランスフェクトし、そして発現を可能とする条件下で細胞のカルチャーを培養した後に所望のカルチャーから得ることができる。次いで発現した産物を所望により精製し、そして単離する。トランスフェクション、細胞培養、精製および単離に関する適当な技法は、当業者には知られている。

以下の実施例は本発明の幾つかの観点および態様を具体的に説明する。

ＡＡＶ２ ＩＴＲｓを備えた組換えＡＡＶ８ウイルスゲノムの生産
ＡＡＶ２ｒｅｐを新規ＡＡＶ血清型のｃａｐ配列と融合することによりキメラパッケージング構築物を作成する。これらキメラパッケージング構築物は、最初にＡｄ５ヘルパープラスミドを使用して２９３細胞での３回のトランスフェクションにより、ＡＡＶ２ ＩＴＲｓを持つ組換えＡＡＶゲノムのシュードタイプ化に使用する。これらのシュードタイプ化ベクターはこれら新規血清型の完全かつ感染性ウイルスが単離される前に、形質導入に基づく血清型の実験における性能を評価し、そしてＮＨＰおよび齧歯類を含む種々の動物モデルを対象として新規ＡＡＶ血清型の遺伝子転移効率を評価するために使用する。
Ａ．ｐＡＡＶ２ＧＦＰ
ＡＡＶ２プラスミドは、構成的プロモーターの制御下で発現するＡＡＶ２ ＩＴＲｓおよび緑色蛍光タンパク質を含む。このプラスミドは以下の要素を含む：ＡＡＶ２ＩＴＲｓ、ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰコード配列。
Ｂ．トランスプラスミドのクローニング
組換えシュードタイプ化ＡＡＶ８ベクター生産用のキメラトランス−プラスミドを構築するために、ｐ５Ｅ１８プラスミド（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４−４００３）をＸｈｏＩで部分消化して、プラスミドを３１６９ｂｐのみの位置のＸｈｏＩ部位で線状とした。次いでＸｈｏＩ切断末端をフィルインし、そして戻し連結した。この修飾されたｐ５Ｅ１８プラスミドをＸｂａＩおよびＸｈｏＩで完全に消化するまで制限処理してＡＡＶ２ｃａｐ遺伝子配列を除去し、そしてｐＣＲＡＡＶ８６−５＋１５−４プラスミドから単離したＡＡＶ８ｃａｐ遺伝子を含む２２６７ｂｐのＳｐｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントに置き換えた。

生成したプラスミドはＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターの制御下にＲｅｐ７８／６８のＡＡＶ２ｒｅｐ配列を、そしてＡＡＶ２ Ｐ１９プロモーターの制御下にＲｅｐ５２／４０のＡＡＶ２ ｒｅｐ配列を含む。ＡＡＶ９キャプシド配列はＡＡＶ２ Ｐ４０プロモーターの制御下にあり、これはＲｅｐ配列内に位置する。このプラスミドはさらにｒｅｐ ＯＲＦのスペーサー５’を含む。

あるいはＡＡＶ８ｒｅｐ配列および天然のＡＡＶ８プロモーター配列を利用する類似のプラスミドを構築することができる。次いでこのプラスミドは本明細書に記載するようにｒＡＡＶ８の生産に使用する。
Ｃ．シュードタイプ化ｒＡＡＶの生産
ｒＡＡＶ粒子（ＡＡＶ８キャプシド中のＡＡＶ２ベクター）は、アデノウイルスを含まない方法を使用して生成する。簡単に説明すると、シスプラスミド（ＡＡＶ２ ＩＴＲｓを含むｐＡＡＶ２．１ ｌａｃＺプラスミド）、およびトランスプラスミドｐＣＲＡＡＶ８６−５＋１５−４（ＡＡＶ２ｒｅｐおよびＡＡＶ８ｃａｐを含む）およびヘルパープラスミドをそれぞれ同時に２９３細胞に１：１：２の比率でリン酸カルシウム沈殿によりコトランスフェクトした。

ｐＡｄヘルパープラスミドの構築については、ｐＢＧ１０プラスミドをマイクロビックス（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）（カナダ）から購入した。Ｌ２およびＬ３を含むＲｓｒＩＩフラグメントをｐＢＨＧ１０から削除し、第１ヘルパープラスミドであるｐＡｄΔＦ１３を生じた。プラスミドＡｄＦ１は、ｐＢＨＧ１０から単離したＰｍｅＩ／Ｓｇｆｌ削除を含むＡｓｐ７００／ＳａｌＩフラグメントを、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングすることにより構築した。ＭＬＰ、Ｌ２、Ｌ２およびＬ３をｐＡｄΔＦ１中で削除した。さらに２．３ｋｂのＮｒｕＩフラグメント、そして続いて０．５ｋｂのＲｓｒＩＩ／ＮｒｕＩフラグメントの削除によりそれぞれヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ５およびｐＡｄΔＦ６を生成した。ｐΔＦ６と名付けられたヘルパープラスミドは、Ｅ１−発現ヘルパー細胞によっては提供されないＥ２ａおよびＥ４ ＯＲＦ６の本質的ヘルパー機能を提供するが、アデノウイルスキャプシドタンパク質および機能的Ｅ１領域が削除されている。

典型的には５０μｇのＤＮＡ（シス：トランス：ヘルパー）を、１５０ｍｍの組織培養皿上にトランスフェクトした。２９３細胞をトランスフェクションから７２時間後に回収し、超音波処理し、そして０．５％デオキシコール酸ナトリウムで処理した（３７℃で１０分）。細胞ライゼートを２回のＣｓＣｌ勾配に供した。ｒＡＡＶベクターを含むピーク画分を集め、プールし、そしてＰＢＳに対して透析した。

ＡＡＶ８キャプシドを含むベクターの評価
ＡＡＶ１（２／１）、ＡＡＶ５（２／５）およびＡＡＶ２（２／２）に基づくベクターは、本質的には実施例１のＡＡＶ８について記載したように開発した。ＡＡＶベクターのゲノムコピー（ＧＣ）力価は、ＴａｑＭａｎ分析によりすでに記載したように［Ｇａｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ１１，２０７９−９１］、ＳＶ４０ポリＡ領域を標的とするプローブおよびプライマーを使用して決定した。組換えビリオンはヘパリンクロマトグラフィーにより精製したＡＡＶ２／２を除き、すべての場合でＣｓＣｌ_２沈降により回収した。

ベクターは多数のインビトロおよびインビボ実験のために各血清型について構築した。８種の導入遺伝子カセットをベクターに挿入し、そして組換えビリオンを各血清型について生成した。ゲノムコピーに基づくウイルスの回収を表１にまとめる。ベクターの収量は各血清型について高く、血清型で一貫した差異はなかった。表に示すデータは、５０プレート（１５０ｍｍ）のトランスフェクションの複数生産ロットの標準偏差を含む平均ゲノムコピー収量（ｘ１０^１３）である。

シュードタイプ化ベクターの血清学的分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに異なる血清型のＡＡＶＣＢＡ１ＡＴベクターのベクターを筋肉内注射し（５ｘ１０^１１ＧＣ）、そして血清サンプルを３４日後に集めた。ＡＶＶの各血清型に対する血清の中和および交差中和活性を試験するために、血清は形質導入に基づく中和抗体アッセイで分析した［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，８９３４−４３］。より具体的には、中和抗体の存在は異なる血清型のレポーターウイルス（ＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰ）による８４−３１細胞の形質導入を阻害する血清の能力を評価することにより決定した。具体的には各血清型のレポーターウイルスＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰ［表示細胞の９０％の形質導入を導く感染多重度（ＭＯＩ）］を、異なる血清型のＡＡＶを受けた動物、またはナイーブなマウスに由来する熱不活化血清とプレインキューベーションした。３７℃で１時間インキューベーションした後、ウイルスを９６ウェルプレートの８４−３１細胞に、ウイルスの血清型に依存して４８〜７２時間、加えた。ＧＦＰの発現はＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｉｎ（モレキュラーダイナミックス：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により測定し、そしてＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより定量した。中和抗体力価は５０％未満まで形質導入を阻害した最高の血清希釈として報告した。

ＧＦＰ発現ベクターの利用性は、許容細胞系（すなわちＡｄ５からＥ４を安定に発現する２９３細胞）での形質導入の阻害に基づく中和抗体のアッセイの開発を簡略化した。選択したＡＡＶ血清型に対する血清は、組換えウイルスの筋肉内注射により生成した。抗血清の１：２０および１：８０希釈によるＡＡＶ形質導入の中和を評価した（表２）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８に対する抗血清は、抗血清が生成された血清型の形質導入を中和したが（ＡＡＶ１およびＡＡＶ２よりも少ない程度のＡＡＶ５およびＡＡＶ８）、他の血清型に対しては中和しなかった（すなわち交差中和の証拠はなく、ＡＡＶ８が真に独自な血清型であることを示唆する）。

５２名の正常個体に由来するヒト血清を、選択した血清型に対する中和についてスクリーニングした。ＡＡＶ２／８を中和する血清サンプルは見いだされなかったが、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／１ベクターはそれぞれ血清の２０％および１０％が中和された。６０，０００個体サンプルのコレクションを表すヒトのプールＩｑＧは、ＡＡＶ２／８を中和しなかったが、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／１ベクターはそれぞれ１／１２８０および１／６４０に等しい血清の力価で中和した。

種々の血清型のＡＡＶベクターのインビボ評価
この実験では、７種の組換えＡＡＶゲノムであるＡＡＶ２ＣＢｈＡ１ＡＴ、ＡＡＶ２ＡｌｂｈＡ１ＡＴ、ＡＡＶ２ＣＭＶｒｈＣＧ、ＡＡＶ２ＴＢＧｒｈＣＧ、ＡＡＶ２ＴＢＧｃＦＩＸ、ＡＡＶ２ＣＭＶＬａｃＺおよびＡＡＶ２ＴＢＧＬａｃＺを、種々の血清型のキャプシドタンパク質でパッケージングした。すべての７種の構築物において、ミニ遺伝子カセットをＡＡＶ２ ＩＴＲｓで挟んだ。ヒトα−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）［Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，３９９４−４００３］、アカゲザルのコリオゴナドトロピンホルモン（ＣＧ）のβ−サブユニット［Ｚｏｌｔｉｃｋ，Ｐ．Ｗ．＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ２，６５７−９］、イヌ第ＩＸ因子［Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１１５６３−６］、および細菌のβ−ガラクトシダーゼ（すなわちＬａｃＺ）遺伝子のｃＤＮＡをレポーター遺伝子として使用した。肝臓に向けた遺伝子転移には、マウスのアルブミン遺伝子プロモーター（Ａｌｂ）［Ｘｉａｏ，Ｗ．（１９９９）、同上］またはヒトの甲状腺ホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーター（ＴＢＧ）［Ｗａｎｇ，（１９９７）同上］を使用して肝臓に特異的なレポーター遺伝子の発現を駆動した。筋肉に向けられた遺伝子転移実験では、サイトメガロウイルス初期プロモーター（ＣＭＶ）またはＣＭＶエンハンサー（ＣＢ）を持つニワトリβ−アクチンプロモーターをレポーターの発現を支配するために採用した。

筋肉に向けられた遺伝子転移には、ベクターを４〜６週齢のＮＣＲヌードまたはＣ５７ＢＬ／６マウス（タコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）の右脛側前方に、動物あたり１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量で注射した。肝臓に向けられた遺伝子転移実験では、ベクターを７〜９週齢のＮＣＲヌードまたはＣ５７ＢＬ／６マウス（タコニック、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）の門脈内に、また動物あたり１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量で注入した。血清サンプルはベクター投与から異なる時点で眼窩内から集めた。筋肉および肝臓組織は、低温切開およびＸｇａｌ組織化学染色用にｌａｃＺベクターを受容した動物から異なる時点で回収した。再投与実験については、Ｃ５６ＢＬ／６マウスは最初にＡＡＶ２／１、２／２、２／５、２／７および２／８ＣＢＡ１ＡＴベクターを筋肉内に受け、そしてＡ１ＡＴ遺伝子発現を７週間追跡した。次いで動物はＡＡＶ２／８ＴＢＧｃＦＩＸを門脈内で処置し、そしてｃＦＩＸ遺伝子発現について実験した。

ＥＬＩＳＡに基づくアッセイはすでに記載したように［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，８９３４−４３；Ｚｏｌｔｉｃｋ，Ｐ．Ｗ．＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２，６５７−９；Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１１５６３−６］、ｈＡ１ＡＴ、ｒｈＣＧおよびｃＦＩＸタンパク質の血清レベルを定量するために行った。この実験は、ＤＮＡ抽出およびベクター調製［Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３．６９７−７０７］の滴定と同じ組のプライマーおよびプローブを使用して、ＴａｑＭａｎによる標的組織中に存在するベクターのゲノムコピーの定量的分析のために、筋肉および肝臓組織を回収するために動物が屠殺された時に完了した。

新たな血清型に基づくベクターの性能は、筋肉および肝臓に向けられた遺伝子転移のマウスモデルで評価し、そして既知の血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５に基づくベクターと比較した。分泌型タンパク質（Ａ１ＡＴおよびＣＧ−表３）を発現するベクターを使用して、血清のＥＬＩＳＡ分析を介して種々の血清型間の相対的な形質導入効率を定量した。標的器官内の形質導入の細胞分布は、ｌａｃＺ発現ベクターおよびＸｇａｌ組織化学を使用して評価した。

骨格筋中のＡＡＶベクターの性能は、脛側前方筋に直接注射した後に分析した。ベクターは、導入遺伝子の発現を駆動するＣＭＶの前初期遺伝子またはＣＭＶ強化β−アクチンプロモーターを持つ同じＡＡＶ２に基づくゲノムを含んだ。事前の実験では、免疫コンピテントＣ５７ＢＬ／６マウスがＡＡＶベクターから発現された時、ヒトＡ１ＡＴタンパク質に対して限られた液性応答を誘導することが示された［Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，３９９４−４００３］。

各株では、ＡＡＶ２／１ベクターが最高レベルのＡ１ＡＴを生産し、そしてＡＡＶ２／２ベクターは最低であり、ＡＡＶ２／８ベクターは中間レべルの発現を示した。ｎｕ／ｎｕＮＣＲマウスの注射から２８日で、ＣＧのピークレベルはＡＡＶ２／７から最高レベル、そしてＡＡＶ２／２からは最低を示し、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／１はその間であった。ＡＡＶ２／１ ｌａｃＺベクターの注射はすべての筋肉繊維において注射部位に遺伝子発現をもたらし、実質的により少ないｌａｃＺ陽性繊維がＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８ベクターで観察された。

同様のマウスモデルを使用して肝臓に向けられた遺伝子転移を評価した。ゲノムコピーに基づきベクターの同一用量をマウスの門脈静脈に注入し、これを続いて導入遺伝子の発現について分析した。各ベクターは導入遺伝子の発現を駆動するために、以前に記載された肝臓に特異的なプロモーター（すなわちアルブミンまたは甲状腺ホルモン結合グロブリン）を使用して、ＡＡＶ２に基づくゲノムを含んだ。より詳細にはＣＭＶＣＧおよびＴＢＧＣＧミニ遺伝子カセットを、それぞれ筋肉および肝臓に向けられた遺伝子転移に使用した。ｒｈＣＧのレベルは相対的単位（ｒＵｓ×１０^３）として定めた。データはベクター投与から２８日に集めた血清サンプルをアッセイすることから得た（１群あたり４匹）。表４に示すように、キャプシドタンパク質がｎｕ／ｎｕおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのＡ１ＡＴベクターおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのＣＧベクターの形質導入効率に及ぼす影響は一致し、すなわちＡＡＶ２／８が肝臓に向けられた遺伝子転移用のシュードタイプに最も効率的である。

すべての場合でＡＡＶ２／８ベクターは、ＡＡＶ２／２ベクターで得られるよりも１６〜１１０大きい範囲の最高レベルの導入遺伝子発現を生じた：ＡＡＶ２／５からの発現は中間であった。対応するｌａｃＺベクターを受容した動物のＸ−Ｇａｌ染色した肝臓切片の分析では、形質導入した細胞の数と導入遺伝子発現の全体的レベルとの間の相関が明らかとなった。Ａ１ＡＴベクターを受容したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から抽出したＤＮＡｓは、リアルタイムＰＣＲ技法を使用してベクターＤＮＡの量について分析した。

注射から５６日後の肝臓に見いだされるベクターＤＮＡの量は、導入遺伝子発現のレベルと相関した（表４）。この実験について、ベクターゲノムのＳＶ４０ポリＡ領域を標的とする１組のプローブおよびプライマーをＴａｑＭａｎ ＰＣＲに使用した。示した値は３匹の別個の動物の平均であり、標準偏差を含む。動物はＤＮＡ抽出用の肝臓組織を回収するために５６日で屠殺した。これらの実験は、形質導入された肝細胞の数の上昇から、ＡＡＶ８が肝臓に向けられた遺伝子転移用の最も効率的なベクターであること示す。

上記の血清学的データは、ＡＡＶ２／８ベクターが他の血清型で免疫感作された後にインビボで当然、中和されないことを示唆する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、それらが異なる血清型のＡ１ＡＴベクターの筋肉内注射を受けてから５６日後、イヌの第ＩＸ因子を発現するＡＡＶ２／８ベクター（１０^１１ゲノムコピー）の門脈内注射を受けた。高レべルの第ＩＸ因子の発現は、投薬を受けていない（ｎａｉｖｅ）動物へのＡＡＶ２／８の注入から１４日後に得（１７±２μｇ／ｍｌ、Ｎ＝４）、これはＡＡＶ２／１（３１±２３μｇ／ｍｌ、Ｎ＝４）およびＡＡＶ２／２（１６μｇ／ｍｌ、Ｎ＝２）で免疫感作した動物で観察されたものと有意に異ならなかった。これは検出可能な第ＩＸ因子が観察されなかったＡＡＶ２／８第ＩＸ因子ベクターを注入したＡＡＶ２／８免疫感作動物で観察された結果と好対照をなす（＜０．１μｇ／ｍｌ、Ｎ＝４）。

ｃａｐ遺伝子の保存領域に対するオリゴヌクレオチドは、独自のＡＡＶｓを表すアカゲザル由来の配列を増幅した。同一のｃａｐサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列が、少なくとも２つの集団に由来するアカゲザルの多組織に見いだされた。１つの供給源から完全長のｒｅｐおよびｃａｐオープンリーディングフレイムを単離し、そして配列決定した。ＡＡＶ８キャプシドを持つベクターはＩＴＲｓおよびＡＡＶ２に由来するｒｅｐを使用して作成されたので、ベクターとして新規ＡＡＶｓのｃａｐオープンリーディングフレイムだけがそれらの能力を評価するために必要であった。これはまた実際のベクターゲノムが種々のベクター血清型間で同一であるので、異なるベクターの比較を簡単にした。実際に、この取り組みを使用して生成された組換えベクターの収量は、血清型間で異ならなかった。

ＡＡＶ８に基づくベクターは免疫学的に異なるようである（すなわちそれらは他の血清型に対して生じた抗体により中和されない）。さらにヒトに由来する血清はＡＡＶ８ベクターによる形質導入を中和せず、これは中和されつつある既存の免疫を有する有意な比率のヒト個体群のために現在開発中のヒトに由来するＡＡＶｓよりも実質的に有利である［Ｃｈｉｒｍｕｌｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６，１５７４−８３］。

新規ベクターのトロピズムは、インビボの応用に好ましい。重要なことは、現在まで安定に形質導入された肝細胞の数という意味で比較的失望してきた肝臓への遺伝子転移の効率という意味で、ＡＡＶ２／８が他の血清型よりも実質な利点を提供するということである。ＡＡＶ２／８は他のベクターに比べて遺伝子転移効率において１０〜１００倍の改善を一貫して達成した。ＡＡＶ２／８の改善された効率の基礎は不明であるが、おそらく肝細胞の基底外側上でより活性な種々のレセプターを介した取り込みによるのかもしれない。この改善された効率は、尿の循環障害および家族性高コレステロール血症のような形質導入された細胞の数が重要となる肝臓に向けられた遺伝子転移の開発に極めて有用となるだろう。

このようにＡＡＶ８に対する既存の免疫の欠如およびベクターの肝臓に対する好ましいトロピズムは、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質を持つベクターがヒトの遺伝子治療および他のインビボの応用にベクターとして使用するのに適していることを示す。

組織トロピズム実験
新規ＡＡＶ構築物の高処理量機能的スクリーニングスキームの設計では、非組織特異的な、そして高度に活性なプロモーターであるＣＢプロモーター（ＣＭＶ強化型ニワトリβ−アクチンプロモーター）が、容易に検出可能で、しかも定量可能なレポーター遺伝子であるヒトα−アンチ−トリプシン遺伝子を駆動するために選択された。特定のＡＡＶ構築物を組織トロピズムをスクリーニングするために、各新規ＡＡＶクローン用に唯一のベクターが、３つの異なる組織、肝臓、肺および筋肉を標的とする遺伝子転移実験のために作られることが必要である。以下の表は組織トロピズム実験において新規ＡＡＶベクターから生成されたデータをまとめる（ＡＡＶＣＢＡ１ＡＴ）。表５は実験の１４日目に得られたデータを報告する（血清１ｍＬあたりのＡ１ＡＴのμｇ数）。

新規ＡＡＶｓのキャプシドでシュードタイプ化された肺特異的発現用のＣＣ１０ｈＡ１ＡＴミニ遺伝子を持つＡＡＶベクターは、以下の表に提供するように気管内注射を介して等容量（各５０μｌの希釈なしの元の調製物）で免疫不全動物（ＮＣＲヌード）に与えた。ベクターも表６に示すように等ゲノムコピー（１×１０^１１ＧＣ）で免疫コンピテント動物（Ｃ５７ＢＬ／６）に投与した。（動物あたり１×１０^１１ＧＣ、Ｃ５７ＢＬ／６、１４日、検出限界＞０．０３３μｇ／ｍｌ）。示すようにＡＡＶ８が最高の肝臓形質導入物（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）である。

高コレステロール血症のモデル
本発明のＡＡＶ２／８構築物によるｒＡＡＶ媒介型導入遺伝子発現の影響をさらに評価するために、さらなる実験を行った。
Ａ．ベクターの構築
ＡＡＶ８キャプシドタンパク質でパッケージングされたＡＡＶベクターは、シュードタイプ化法［Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ２００１；７５：６１９９−６２０３］を使用して構築した。ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む組換えＡＡＶゲノムは、シス−プラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミドおよびキメラパッケージング構築物、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子を持つ新規ＡＡＶ血清型のキャプシドの融合物を用いた２９３細胞の３回のトランスフェクションによりパッケージングした。キメラパッケージングプラスミドはすでに記載したように構築した［Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，同上］。組換えベクターは標準的なＣｓＣｌ_２沈降法により精製した。収量を検討するためのＴａｑＭａｎ（アプライドバイオシステムズ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）分析は、ベクターのＳＶ４０ポリ（Ａ）領域を標的とするプローブおよびプライマーを使用して行った［Ｇａｏ ＧＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００ Ｏｃｔ １０：１１（１５）：２０７９−９１］。生成したベクターはヒト甲状腺ホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーター（ＴＢＧ）の制御下で導入遺伝子を発現する。
Ｂ．動物
Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＬＤＬレセプター欠損マウスをジャクソンラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（バーハーバー、メリーランド州、米国）から購入し、そして育種集団として維持した。マウスには水を自由に与え、そしてベクター注射の３週間前から始めた高脂肪の西洋食（高％のコレステロール）を与えた。７日に０日と同様に後眼窩出血を介して血液を得、そして脂質プロフィールを評価した。マウスは無作為に７群に分割した。ベクターは前述したように門脈内注射を介して注射した（［Ｃｈｅｎ ＳＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０００；２（３），２５６−２６１］。簡単に説明すると、マウスはケタミンおよびキシラジンで麻酔をかけた。側腹切開を行い、そして門脈を露出した。３０ｇニードルを使用して、１００μｌのＰＢＳで希釈した適切な用量のベクターを門脈に直接注射した。注射部位に圧力をかけて止血を確実とした。皮膚の創傷を閉じ、そして滅菌布で覆い、そしてマウスは翌日から慎重にモニタリングされた。肝臓に向けられた遺伝子転移から１４日後に毎週の採血を開始して、血中の脂質を測定した。各群２匹の動物をベクター注射から６週および１２週後の時点で屠殺して、アテローム硬化症プラークのサイズならびにレセプター発現を調査した。残りのマウスはプラークの測定および導入遺伝子発現の決定に２０週で屠殺した。

Ｃ．血清リポタンパク質および肝機能分析
血液サンプルは６時間の絶食後、後眼窩叢（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ ｐｌｅｘｕｓ）から得た。血清は遠心により血漿から分離した。血漿リポタンパク質および血清中の肝臓トランスアミナーゼの量は、自動化臨床化学分析機（ＡＣＥ、スキャパレリ バイオシステムズ（Ｓｃｈｉａｐｐａｒｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、アルファ ヴァッセルマン）を使用して検出した。
Ｄ．導入遺伝子発現の検出
ＬＤＬレセプター発現は免疫−蛍光染色およびウエスタンブロッティングにより評価した。ウエスタンブロットには、凍結した肝臓組織を溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、プロティナーゼインヒビターコンプリート、ＥＤＴＡ無し、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、マンハイム、ドイツ）で均一化した。タンパク質濃度はＭｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォールド、イリノイ州）を使用して決定した。４０μｇのタンパク質を４〜１５％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌレディゲル（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、ヘラクレス、カリフォルニア州）に溶解し、そしてニトロセルース膜（インビトロゲン）に移した。抗−ｈＬＤＬレセプター抗体を生成するために、ウサギにＡｄｈＬＤＬｒ ｐｒｅｐ（１×１０^１３ｇｃ）を静脈内注射した。４週間後にウサギの血清を得、そしてウエスタンブロットに使用した。血清の１：１００希釈を１次抗体として使用して、続いてＨＲＰ−結合抗−ウサギＩｇＧおよびＥＣＬ化学発光検出（ＥＣＬウエスタンブロット検出キット、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントンハイツ、イリノイ州）を行った。
Ｄ．免疫細胞化学
凍結した肝臓切片中のＬＤＬレセプター発現を決定するために、免疫組織化学分析を行った。１０ｕｍの低温切片をアセトン中で５分間固定するか、または固定しなかった。ブロッキングは１０％のヤギ血清を用いて１時間のインキューベーション時間を介して得た。次いで切片を１時間、１次抗体と室温でインキューベーションした。ウサギポリクローナル抗体抗ヒトＬＤＬ（バイオメディカルテクノロジーズ社（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，）、ストートン、マサチューセッツ州）を製造元の使用説明に従い希釈して使用した。切片をＰＢＳで洗浄し、そして１：１００で希釈したフルオレセインヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）とインキューベーションした。検体は最終的に蛍光顕微鏡ニコン（Ｎｉｋｏｎ）Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ−ＦＸＡ下で調査した。すべての場合で、各インキューベーションに続いてＰＢＳで徹底的に洗浄した。陰性対照はＰＢＳとのプレインキューベーション、１次抗体の省略および１次抗体のアイソタイプが合った非免疫対照抗体による置換からなった。上に挙げた３種の対照は各実験について同日に行った。
Ｅ．遺伝子転移効率
肝臓組織はマウスを計画した時点で屠殺した後に得た。組織は液体窒素中でショック凍結し（ｓｈｏｃｋ ｆｒｏｚｅｎ）、そしてさらに処理するまで−８０℃で保存した。ＤＮＡは製造元のプロトコールに従いＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ）を使用して肝臓組織から抽出した。肝臓組織中のＡＡＶベクターのゲノムコピーは、上記のようにＳＶ４０ポリ（Ａ）テイルに対するプローブおよびプライマーを使用してＴａｑｍａｎ分析を使用して評価した。
Ｆ．アテローム硬化症プラークの測定
マウス大動脈中のアテローム硬化症のプラークを定量するために、マウスに麻酔をかけ（１０％ケタミンおよびキシラジン、ｉｐ）、開胸し、そして動脈系に左心室を通して氷冷リン酸緩衝化生理食塩水を潅流した。次いで大動脈を慎重に回収し、腹中線に沿って大動脈弓から大腿動脈にかけて切り開き、そしてホルマリンで固定した。脂質に富むアテローム硬化症のプラークがスーダンＩＶ（シグマ、ドイツ）で染色され、そして大動脈を黒いワックス面上にピンで平らにして止めた。 ソニー（Ｓｏｎｙ）ＤＸＣ−９６０ＭＤカラービデオカメラを用いて像を取った。プラークならびに完全な大動脈表面の面積をＰｈａｓｅ ３ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（メディア サイバーネティックス：Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して決定した。
Ｇ．Ｉ^１２５ＬＤＬのクリアランス
実験群あたり２匹の動物を試験した。Ｉ^１２５で標識したＬＤＬ（Ｄａｎ Ｒａｄｅｒ、アペン（Ｕｐｅｎｎ）の好意により提供された）のボーラスを３０秒間にわたり尾の静脈を通してゆっくりと注入した（１００μｌの滅菌ＰＢＳで希釈した１，０００，０００カウントの［Ｉ^１２５］ＬＤＬ／動物）。注射から３分、３０分、１．５時間、３時間、６時間の時点で、血液サンプルを後眼窩叢を介して得た。血漿を全血から分離し、そして１０μｌ血漿をガンマカウンターで計数した。最後にリポタンパク質クリアランスデータから分画異化率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｒａｔｅ）を算出した。
Ｈ．肝臓の脂質蓄積の評価
凍結した肝臓切片のオイルレッド（Ｏｉｌ Ｒｅｄ）染色を行って脂質の蓄積を測定した。凍結した肝臓切片は蒸留水で簡単にすすぎ、続いて無水プロピレングリコール中で２分間、インキューベーションした。次いで切片はオイルレッド溶液中（プロピレングリコール中０．５％）で１６時間染色し、続いてＭａｙｅｒのヘマトキシリン溶液で３０秒間カウンター染色し、そして暖めたグリセリンゼリー溶液に乗せた。

肝臓コレステロールおよびトリグリセリド含量の定量には、肝臓切片を均一化し、そしてクロロホルム／メタノール（２：１）中で一晩インキューベーションした。０．０５％Ｈ_２ＳＯ_４を加え、そして１０分間遠心した後、各サンプルの下層を集め、２つのアリコートに分け、そして窒素下で乾燥させた。コレステロールの測定には第１アリコートの乾燥脂質を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（クロロホルム中）に溶解した。いったん溶解したら、溶液を窒素下で乾燥させた。脂質をｄｄＨ_２Ｏ中に溶解し、そして３７℃で３０分間インキューベーションした後、総コレステロール濃度をトータルコレステロールキット（ワコー ダイアグノスティックス：Ｗａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して測定した。第２アリコートについては、乾燥脂質をアルコール性ＫＯＨに溶解し、そして６０℃で３０分間インキューベーションした。次いで１Ｍ ＭｇＣｌ_２を加え、続いて氷上で１０分間インキューベーションし、そして１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清は最後にトリグリセリドについて評価した（ワコー ダイアグノスティックス）。

ＡＡＶ２／８キャプシドにシュードタイプ化されたすべてのベクターは、対照に比べて総コレステロール、ＬＤＬおよびトリグリセリドを下げた。これらの試験ベクターは用量依存的様式で高コレステロール血症の表現型も矯正した。ＡＡＶ２／８マウスにおけるプラーク面積の減少が最初の試験（２カ月）で処置したマウスに観察され、そしてこの効果は実験期間にわたり（６カ月）持続することが観察された。

機能的第ＩＸ因子の発現および血友病の矯正
Ａ．ノック−アウトマウス
機能的なイヌの第ＩＸ因子（ＦＩＸ）発現を、血友病Ｂのマウスで評価した。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８のキャプシドを持つベクターを構築して、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ−肝臓特異的プロモーター［ＬＳＰ］−イヌＦＩＸ−ウッドチャック肝炎後−調節要素（ＷＰＲＥ）−ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを送達した。ベクターは適切なキャプシドを使用して、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２：１５４−１５８に記載されているように構築した。

ノック−アウトマウスはＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１１５６３−１１５６６に記載されているように生成した。このモデルはヒトの血友病Ｂの表現型を緻密に模する。

異なる血清型のベクターを、成体の血友病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓に単回の門脈内注射として１×１０^１０ＧＣ／マウスの用量で５種類の血清型について送達し、そして第２ＡＡＶ８ベクターも１×１０^１０ＧＣ／マウスで送達した。対照群は１×１０^１１ＧＣのＡＡＶ２／８ＴＢＧＬａｃＺ３を注射した。各群は５〜１０匹のオスおよびメスのマウスを含む。マウスはベクター投与後に週２回（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）、採血した。
１．ＥＬＩＳＡ
マウス血漿中のイヌのＦＩＸ濃度は、本質的にはＡｘｅｌｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５１７３−５１７７に記載されている方法を変更して行うイヌの第ＩＸ因子に特異的なＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。第１抗体としてヒツジ抗−イヌ第ＩＸ因子（エンザイム リサーチ ラボラトリーズ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、そして第２抗体としてウサギ抗−イヌ第ＩＸ因子（エンザイム リサーチ ラボラトリーズ）を使用した。注射から２週間後に始まる血漿レベルのｃＦＩＸの上昇がすべての試験ベクターで検出された。この上昇したレベルは実験期間を通して、すなわち１２週まで治療的レベルで持続した。治療的レベルは正常レベルの５％、すなわち約２５０ｎｇ／ｍＬになると考えられる。

最高レベルの発現はＡＡＶ２／８（１０^１１で）について観察され、超生理学的（ｓｕｐｅｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）レベルのｃＦＩＸレベル（正常レベルより１０倍高い）で持続した。ＡＡＶ２／８（１０^１１）の発現レベルはＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８（１０^１０）について観察されるレベルよりも約１０倍高かった。最低レベルは、それでも治療範囲よりは上であるが、ＡＡＶ２／５で観察された。
２．インビトロ活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ
ＦＩＸノック−アウトマウスの血漿中の機能的第ＩＸ因子活性をインビトロ活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイにより決定し−マウスの血液サンプルは１／１０容量のクエン酸バッファー中に後−眼叢から集めた。ＡＰＴＴアッセイはＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，により１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１５６３−１１５６６に記載されているように行った。

ベクターを注射したすべてのマウス血漿サンプルについてａＰＴＴによる凝固時間は、注射から２週間後に測定した時、正常範囲内であり（約６０秒）、そして実験期間を通して（１２週間）正常範囲内か、正常範囲よりも短い凝固時間を維持した。

持続した最低の凝固時間はＡＡＶ２／８（１０^１１）を受けたマウスで観察された。１２週まで、ＡＡＶ２／２もＡＡＶ２／８に類似する凝固時間を誘導した。しかしこの低下した凝固時間は１２週までＡＡＶ２／２では観察されず、一方、ＡＡＶ２／８については低下した凝固時間（２５〜４０秒の範囲）が２週目の始めから観察された。

処置したマウスの何匹かから回収した肝臓組織の免疫−組織化学染色を現在行っている。約７０〜８０％の肝細胞が、ＡＡＶ２／８．ｃＦＩＸベクターを注射したマウスにおいてイヌＦＩＸについて陽性に染色された。
Ｂ．血友病Ｂの犬
モデル実験に基づき、Ｆ．ＩＸ遺伝子の触媒ドメインに点突然変異を有する犬はタンパク質が不安定になり、血友病Ｂに罹患すると思われる［Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００９５−１００９９）。そのような犬の集団がチャペルヒルのノースカロライナ大学で２０年間以上維持されてきた。これらの犬の恒常性パラメーターは十分に説明され、そして血漿Ｆ．ＩＸ抗原の不存在、正常な犬では６〜８分である６０分を越える全血凝固時間、および正常な犬では１３〜２８秒である５０〜８０秒の長期化した活性化部分トロンボプラスチン時間を含む。これらの犬は再発する自然な出血を経験する。典型的には重大な出血の病歴が１０ｍｌ／ｋｇの正常なイヌ血漿の単回静脈内注入により成功裏に管理され；場合によっては出血を制御するには繰り返し注入することが必要である。

４匹の犬は以下の計画に従いＡＡＶ．ｃＦＩＸを門脈内に注射された。第１の犬は３．７×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量でＡＡＶ２／２．ｃＦＩＸの単回注射を受け、そして重篤な脊髄出血（ｓｐｉｎａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）により６６５日に屠殺された。第２の犬はＡＡＶ２／２．ｃＦＩＸ（２．８×１０^１１ＧＣ／ｋｇ）の第１注射、続いてＡＡＶ２／５．ｃＦＩＸ（２．３×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の第２注射を１１８０日に受けた。第３の犬はＡＡＶ２／２．ｃＦＩＸを４．６×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量で単回受けた。第４の犬はＡＡＶ２／２．ｃＦＩＸ（２．８×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）の注射、そして９９５日にＡＡＶ２／８．ｃＦＩＸ（５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）の注射を受けた。

血友病の犬の腹を全身麻酔の下で無菌的および外科的に開き、そしてベクターの単回注入を門脈に投与した。動物は正常なイヌの血漿を静脈内投与することにより手術期の出血を防いだ。犬を鎮静させ、全身麻酔を誘導するために挿管し、そして腹を剃り、手術の準備をした。開腹後、脾臓を手術の場に取り出した。脾臓静脈を配置し、そして縫合糸は静脈中の小さい遠位切開の近位にゆるやかに配置した。導入は迅速に静脈に挿入し、次いで縫合糸をゆるめ、そして５Ｆカニューレを門脈の分岐点近くの静脈内位置に糸でつながれた門脈付近の静脈内位置に通した。止血を固定し、そしてカテーテルバルーンを膨らませた後、ＰＢＳで希釈した約５．０ｍｌのベクターを５分間の間隔で門脈に注入した。ベクター注入に続いて５．０ｍｌの塩水を注入した。次いでバルーンを窄ませ、カニューレを取り出し、そして静脈止血を固定した。次いで脾臓を再配置し、出血皿を焼灼し、そして手術の創傷を閉じた。動物は外科的手順によく耐えながら抜管された。血液サンプルは記載した用に分析した。［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２：１５４−１５８］
結果を以下の表にまとめる。犬Ｃ５１、メスは、最初の注射時に１３．６ｋｇ、そして６．５カ月齢であった。犬Ｃ５２、オスは、最初の注射時に１７．６ｋｇ、そして６．５カ月齢であった；そして２回目の注射時に１７．２ｋｇ、４５．２カ月齢であった。犬Ｃ５５、オスは、最初の注射時に１９．０ｋｇ、そして１２．０カ月齢であった。犬Ｄ３９、メスは、最初の注射時に５．０ｋｇ、そして２．８カ月齢であり；２回目の注射時に２２．６ｋｇ、そして３５．４カ月齢であった。表では、ＧＣはＡＡＶベクターのゲノムコピーを指す。ＷＢＣＴは注射前に＞６０分（Ｃ５２＝４２分を除く）であった。Ｃ５１のベースラインａＰＴＴ＝９８．４秒、Ｃ５２＝９７．７秒；Ｃ５５＝１４５．１秒；Ｄ３９＝９７．８秒。処置後の出血は、血漿注入の処置を必要としたＡＡＶベクター処置後の血友病Ｂの犬における自発的な出血病状の発現であった。

１．全血凝固時間（ＷＢＣＴ）
ＡＡＶ２／２ベクター注射後のＷＢＣＴは幾分、変動性であり、約６．５分から３０分の範囲であった。正常な犬に関するＷＢＣＴは６〜１２分である。ＷＢＣＴにおける急激な鋭い低下がＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／５ベクターを注射すると即座に観察された。この鋭い低下はＡＡＶ２を注射したＣ５５（ｄ２＝９分）、およびＣ５１およびＣ５２でも観察され、ＷＢＣＴについては初期のデータ時点はチェックしなかった。鋭い低下は手術前後の犬の血漿注入によると考えられる。ＷＢＣＴは低レベルのＦＩＸに大変感受性のアッセイであり、ＦＩＸの実際のレベルにはそれほど感受性ではない（ａＰＴＴがより関連する）。
２．ａＰＴＴアッセイ
ベクターを注射したすべての犬の血漿サンプルについて、ａＰＴＴによる凝固時間は、最初の約７００日間にわたり可変性であったが、その時点で凝固時間は正常範囲のレベルであった（４０〜６０秒、正常な犬：２４〜３２秒）。正常範囲への鋭い低下は、各２回目の注射（ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／５）後に観察された。凝固時間は正常範囲内で持続しなかったが、凝固時間は２回目の注射前に観察されたレベル未満に低下した。

ａＰＴＴについて、正常な犬は２４〜３２秒であり、そして血友病Ｂの犬は８０〜１０６秒である。低用量のＡＡＶ２．ｃＦＩＸベクターを受けたＣ５１およびＣ５２については、処置後の平均ａＰＴＴが７７．５および８１．５秒に留まり、処置なしの血友病Ｂの犬と有意に異ならなかった。より高用量のＡＡＶ２はＤ３９およびＣ５５について、平均ａＰＴＴをそれぞれ５９．１および４６．４秒に改善した。ＡＡＶ２／５の処置後、Ｃ５２に関する平均ａＰＴＴは８１．５秒から４１．９秒に有意に改善された。そしてＡＡＶ２／８処置後のＤ３９については、平均ａＰＴＴが５９．１秒から改善する。

３．イヌの第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡ
ｃＦＩＸレベルはたとえ治療レベル未満でも、第１組の注射後に検出可能であった。ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／５での注射後、ｃＦＩＸのレベルは治療範囲にスパイクされて上がり、ついで治療範囲内のレベルで平らになった（正常は血漿中５μｇ／ｍｌであり、治療レベルは正常レベルの５％、これは２５０ｎｇ／ｍｌである）。

最初の３週間のＷＢＣＴ、ａＰＴＴおよびｃＦＩＸ抗原は手術前後の犬の血漿注入により影響を受ける。最初の３週間については、凝固時間の低下またはｃＦＩＸ抗原レベルの上昇がベクターまたは血漿注入によるのかを結論するのは難しい。しかし２／５および２／８ベクターの注射後のｃＦＩＸ抗原の急激かつ劇的な上昇に注目することは興味深い。すべての犬が手術のために等量の正常な犬の血清の注入を受容しているので、これはＡＡＶ２／５および２／８を注射した犬に独特であり、そして正常の犬の血漿の注入というよりはむしろＡＡＶ２／５および２／８ベクターに起因する可能性がある。ＡＡＶ２／８注射から３日後、Ｄ３９の血漿中のｃＦＩＸレベルは９．５μｇ／ｍｌに達し、そして６日には正常レベル（５μｇ／ｍｌ）の２倍多い１０．４μｇ／ｍｌのピークとなった。ｃＦＩＸレベルは次第に８１７ｎｇ／ｍｌ（Ｃ５２、ＡＡＶ２／５）、および６５７ｎｇ／ｍｌ（Ｄ３９、ＡＡＶ２／８）の平均に低下した。Ｃ５２では、ＡＡＶ２／５ベクターの注射から３日後、ｃＦＩＸレベルは２．６μｇ／ｍｌに達し、そして７日に４．６μｇ／ｍｌのピークに達した。Ｄ３９にＡＡＶ２／８を投与した同じ用量でＡＡＶ２ベクターを受けたＣ５５では、ピークは３日目のわずか２．２μｇ／ｍｌであり、次第に低下し、そしてｃＦＩＸの正常レベルの５％で維持された。

Ｃ５５（ＡＡＶ２、４．６×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）およびＤ３９が２回目の注射（ＡＡＶ２／８、５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で受容したベクターの用量は大変近かった。しかしＡＡＶ２／８ベクターによりＤ３９で上昇したｃＦＩＸ発現レベルは（平均６５７−３４＝６２３ｎｇ／ｍｌ、正常レベルの１２．５％）、Ｃ５５のレベルよりも２．５倍高かった（平均２５９ｎｇ／ｍｌ、正常レベルの５％）。これは類似用量のベクターを門脈内に注射した犬では、ＡＡＶ２／８がＡＡＶ２よりも２．５倍有力であることを示唆している。同じ犬であるＤ３９において、２倍高い用量のＡＡＶ２／８の２回目の注射により、ｃＦＩＸレベルは０．７％から１３．１％へと１回目の注射より１８．７倍高く劇的に上昇した。そしてＣ５２では、２．３×１０^１３ＧＣ／ｍｌのＡＡＶ２／５ベクターの２回目の注射により、平均８１７ｎｇ／ｍｌ（正常レベルの１６．３％）の血漿中のｃＦＩＸがもたらされた。これはＡＡＶ２／８によりＤ３９で上昇したｃＦＩＸレベル（６２３ｎｇ／ｍｌ、正常レベルの１２．５％）よりもわずかに高いだけであった（１．３倍）。しかしＣ５２に注射したＡＡＶ２／５の用量は、Ｄ３９に注射したＡＡＶ２／８の用量よりも４．６倍高かった。これは犬においてもＡＡＶ２／８ベクターがＡＡＶ２／５ベクターより有力であることを示唆している。

ＡＡＶ２ベクターの最初の注射は、犬における２回目の注射後にＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８ベクターによる成功裏の形質導入を遮断しなかった。異なる血清型のＡＡＶベクターを使用した再投与は、事前にＡＡＶ２に暴露されたか、またはＡＡＶ２ベクターで処置された動物またはヒトを処置する取り組みとして使用することができる。

肝臓の酵素障害のマウスモデル
本明細書に記載したように生成したＡＡＶ２／８ベクターを、ＯＴＣ疾患に関して認められた動物モデルにおいて［Ｘ．Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１（４）：５２７−５３４（１９９７）；Ｘ．Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（７）：３６３９−３６４６（Ｆｅｂ．１９９６）］ 、肝臓の酵素の遺伝子オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）を転移する効率について実験した。この実験結果は（データは示さず）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子を持つ本発明のＡＡＶ２／８ベクターがＯＴＣ欠損を矯正したことを示した。

本明細書に引用したすべての刊行物は、参考により本明細書に編入する。本発明は特に好適な態様について記載してきたが、本発明の精神から逸脱することなく修飾を行うことができると考える。

図１Ａから１Ｃは、ＡＡＶ８のｒｅｐおよびｃａｐ領域の核酸配列である［配列番号１］。 図２Ａから２Ｃは、ＡＡＶ８キャプシドｖｐ１タンパク質のアミノ酸配列であり［配列番号２］、公開された配列のＡＡＶ２［配列番号４］、ＡＡＶ１［配列番号５］およびＡＡＶ３［配列番号６］、および新たに同定されたＡＡＶ血清型ＡＡＶ７［配列番号８］およびＡＡＶ９［配列番号７］のｖｐ１とのアライメントを提供する。このアライメントはＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して行い、ＡＡＶ２の番号を参照に使用した。アライメントの下の配列の下線および太字は、カセットの同一性を示す。アライメント中の点線はＡＡＶ２ ＶＰ１と比べてアライメント中のその位置にアミノ酸が無いことを示す。 図３Ａから３ＣはＡＡＶ８ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列である［配列番号３］。

【配列表】

Claims (17)

1. ＡＡＶ８のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸１〜７３７を有するＡＡＶキャプシドを含んでなる単離されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
2. 上記ウイルスが配列番号１の核酸配列を有する、請求項２に記載の単離されたＡＡＶ。
3. 上記ＡＡＶがさらにＡＡＶ逆方向末端反復および宿主細胞で発現を支配する調節配列に操作可能に連結されたヘテロロガスな遺伝子を有するミニ遺伝子を含んでなる、請求項１に記載の単離されたＡＡＶ。
4. （ａ）ｖｐ１キャプシドタンパク質、アミノ酸（ａａ）１〜７３７；
   ｖｐ２キャプシドタンパク質、ａａ１３８〜７３７；
   ｖｐ３キャプシドタンパク質、ａａ２０３〜７３７；
   ａａ１４６〜１５２；ａａ１８２〜１８７；ａａ２６２〜２６４；ａａ２６３〜２６６；ａａ２６３〜２６６；ａａ３８１〜３８３；３８３〜３８５；ａａ４５０〜４７４；ａａ４５１〜４７５；ａａ４９０〜４９５；ａａ４９１〜４９６；ａａ５００〜５０４；ａａ５０１〜５０５；ａａ５１４〜５２２；ａａ５３３〜５５４；ａａ５３４〜５５５；ａａ５８１〜５９４；ａａ５８３〜５９６；ａａ６５８〜６６７；ａａ６６０〜６６９；およびａａ７０５〜７１９；ａａ７０７〜７２３；
   ａａ２４〜４２；ａａ２５〜２８；ａａ８１〜８５；ａａ１３３〜１６５；ａａ１３４〜１６５；ａａ１３７〜１４３；ａａ１５４〜１５６；ａａ１９４〜２０８；ａａ２６１〜２７４；ａａ２６２〜２７４；ａａ１７１〜１７３；ａａ１８５〜１９８；ａａ４１３〜４１７；ａａ４４９〜４７８；ａａ４９４〜５２５；ａａ５３４〜５７１；ａａ５８１〜６０１；ａａ６６０〜６７１；ａａ７０９〜７２３；および
   ａａ１〜１８４；ａａ１９９〜２５９；ａａ２７４〜４４６；ａａ６０３〜６５９；ａａ６７０〜７０６；ａａ７２４〜７３６；ａａ１８５〜１９８；ａａ２６０〜２７３；ａａ４４７〜４７７；ａａ４９５〜６０２；ａａ６０３〜６５９；ａａ６６０〜６６９；およびａａ７０７〜７２３、ここでアミノ酸番号はＡＡＶ２キャプシド、配列番号４のアミノ酸番号およびＡＡＶ８のキャプシド、配列番号２中の対応する領域の番号である、
   からなる群から選択される超可変領域（ＨＶＲ）１から１２またはそれらのより小さいフラグメントを包含するフラグメント、
   からなる群から選択されるＡＡＶ８キャプシドタンパク質またはそのフラグメント
   ならびに
   （ｂ）配列番号３のａａ１〜６２５；ａａ１〜１０２；ａａ１０３〜１４０；ａａ１４１〜１７３；ａａ１７４〜２２６；ａａ２２７〜２７５；ａａ２７６〜３７４；ａａ３７５〜３８３；ａａ３８４〜４４６；ａａ４４７〜５４２；ａａ５４３〜５５５；およびａａ５５６〜６２５
   からなる群から選択されるＡＡＶ８ｒｅｐタンパク質またはそのフラグメント、
   からなる群から選択されるＡＡＶ８タンパク質またはそのフラグメントを含んでなるタンパク質。
5. 請求項４ａに記載する１以上のＡＡＶ８キャプシドタンパク質フラグメントを含んでなる人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
6. 請求項５に記載の人工キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
7. 請求項４に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる分子。
8. 上記核酸配列が：
   ｖｐ１、ｎｔ２１２１〜４３３５；
   ｖｐ２、ｎｔ２５３２〜４３３５；および
   ｖｐ３、ｎｔ２７３０〜４３３５、ここでヌクレオチド番号はＡＡＶ８、配列番号１の番号である、
   からなる群から選択される請求項７に記載の分子。
9. 上記分子がＡＡＶキャプシドタンパク質および機能的ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ配列を含んでなる、請求項７または８に記載の分子。
10. 上記核酸配列が：配列番号１の核酸９０５〜２１０４；配列番号１の核酸２３７〜２１０４；配列番号１の核酸９０５〜２１０４；および配列番号１の核酸２３７〜２１０４；からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項７ないし９のいずれかに記載の分子。
11. 上記分子がＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６からなる群から選択される血清型に由来するｃａｐタンパク質または機能的ＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含んでなる請求項９に記載の分子。
12. 上記分子がプラスミドである請求項７ないし１１のいずれかに記載の分子。
13. ＡＡＶ血清型キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成する方法であって：（ａ）ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする分子；（ｂ）機能的ｒｅｐ遺伝子；（ｃ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）および導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子；および（ｄ）ミニ遺伝子のＡＡＶキャプシドタンパク質へのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養する工程を含んでなり、該宿主細胞が請求項７ないし１２のいずれかに記載の分子を含んでなる上記方法。
14. 請求項１ないし３または請求項６のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項７ないし１２のいずれかに記載の分子でトランスフェクトした宿主細胞。
15. 請求項１ないし３または請求項６のいずれかに記載のＡＡＶおよび生理学的に適合性のある担体を含んでなる組成物。
16. 導入遺伝子を細胞に送達する方法であって、細胞を請求項１ないし３または請求項６のいずれかに記載のＡＡＶと接触させる工程を含んでなり、該ｒＡＡＶが導入遺伝子を含んでなる上記方法。
17. 導入遺伝子を細胞に送達する薬剤の調製における、請求項１ないし３または請求項６のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項７ないし１１のいずれかに記載の分子の使用。

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