JP6741590B2 - コレステロールレベルを低下させるためのｌｄｌｒ変異体および組成物中でのそれらの使用 - Google Patents

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連邦に支援される研究若しくは開発に関する声明
本研究は、国立保健研究所心・肺・血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｈｅａｒｔ．Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの助成金Ｐ０１−ＨＬ０５９４０７−１５により部分的に支援された。米国政府は本発明においてある種の権利を有しうる。

家族性高コレステロール血症（ＦＨ）は、低密度リポタンパク質の受容体（ＬＤＬＲ）；その成熟形態で８３９アミノ酸を含有する一本鎖糖タンパク質の非存在を特徴とする常染色体性共優性障害である。非特許文献１。１つの異常な対立遺伝子、ヘテロ接合性ＨＦ（ｈｅＦＨ）を伴う患者は血漿ＬＤＬの中程度の上昇を有しかつ未熟な冠動脈疾患（ＣＡＤ）に苦しめられる一方、ホモ接合性ＦＨ患者（ｈｏＦＨ）は、生命を脅かす心血管系疾患（ＣＶＤ）の早期発症をしばしばもたらす高い血清コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ＞２４ｍｍｏｌ／Ｌ）を有する。非特許文献２。過剰な血清コレステロールを低下させるための現在の治療の選択肢は、ＬＤＬアフェレーシス［非特許文献３］およびコレステロール降下薬での処置を包含する。非特許文献４。同所肝移植は長期是正につながり得る［非特許文献５］とは言え、それは実質的な処置関連の罹病および死亡を伴う。

アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を使用する肝に向けられる遺伝子治療は数種の代謝障害を安定に是正することが前臨床モデルで示されており、そして血友病ＡおよびＢ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症（ＯＴＣ）ならびにα１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠乏症の処置のため臨床試験で現在追求されている。非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９］。最近、ＦＨのヒト化マウスモデルにおける血清コレステロールレベルの是正におけるＡＡＶに媒介される遺伝子治療の有効性が示された。非特許文献１０。これらのマウスにおいて、ヒトＬＤＬＲを発現するＡＡＶ８（ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ）の全身投与が第７日までに正常レベルへのコレステロールの低下につながり、それは１年にわたり持続しかつ既存のアテローム硬化症の退縮につながった。しかしながら、ＡＡＶ８．ＬＤＬＲ形質導入は用量依存性であり、また、統計学的に有意の是正は１．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ若しくはそれ以上のベクター用量でのみ達成された。臨床的遺伝子治療のため、ベクター用量を最小限にすることは、ベクター注入容量、毒性、免疫反応ならびに製造および商品の費用の制約を包含する多くの理由上きわめて重要である。

肝ＬＤＬＲ発現は細胞内の複数の経路により調節される。すなわち、ＬＤＬＲ転写はステロール反応エレメント結合タンパク質（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＲＥＢＰ）により調節され、また、ＨＭＧｃｏＡ還元酵素阻害剤（スタチン）は肝細胞内のコレステロール合成を阻害することによりＳＲＥＢＰを活性化する［非特許文献１１］。

プロタンパク質転換酵素スブチリシン ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）が関わるＬＤＬＲ調節の第二の経路が、ヒト遺伝子の高ＬＤＬ−Ｃレベルを引き起こした機能獲得型変異［
非特許文献１２］、および低ＬＤＬ−Ｃレベルを引き起こした機能喪失型変異［非特許文献１３］に基づいて発見された。ＰＣＳＫ９機能の喪失は心血管系疾患の８８％低下を伴い、そしてＰＣＳＫ９の阻害に基づく新たな分類のコレステロール降下薬の開発につながった［非特許文献１４；非特許文献１５］。ＦＨを伴う患者はＰＣＳＫ９の有意により高い血漿レベルを有する［非特許文献１６］。

ＬＤＬＲ調節の第三の経路は、ＩＤＯＬ（ＬＤＬＲの誘導可能な分解物質（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒａｄｅｒ ｏｆ ＬＤＬＲ））によるＬＤＬＲの分解を示したＺｅｌｃｈｅｒら、［非特許文献１７］により発見された。Ｅ３ユビキチンリガーゼＩＤＯＬは肝Ｘ受容体（ＬＸＲ）の活性化後に誘導され、そしてその後、受容体のユビキチン化および分解の媒介においてＬＤＬＲの細胞質側末端と相互作用した。さらに、低ＬＤＬ−Ｃを伴う被験体のスクリーニングは、ＬＤＬＲの分解を予防したＩＤＯＬ中の機能喪失型変異を特定した［非特許文献１８］。

被験体、とりわけ家族性高コレステロール血症を有するものにおいてコレステロールを効果的に低下させるのに有用な組成物が必要とされる。

Ｈｕｓｓａｉｎ ＭＭら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ．１９９９；１９：１４１−１７２ Ｍａｒａｉｓ ＡＤ、Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｒｅｖ．２００４；２５：４９−６８ ＭｃＧｏｗａｎ ＭＰ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ．２０１３；７：Ｓ２１−２６ Ｈｏｖｉｎｇｈ ＧＫら、Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０１３；３４：９６２−９７１ Ｒａａｌ ＦＪ、２０１２；２２３：２６２−２６８ Ｗａｎｇ Ｌら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１２；１０５：２０３−２１１ Ｂｒａｎｔｌｙ ＭＬら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９；１０６：１６３６３−１６３６８ Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１；３６５：２３５７−２３６５ Ｗａｒｄ ＮＪら、Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７：７９８−８０７ Ｋａｓｓｉｍ ＳＨら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０；５：ｅ１３４２４ Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ＲＳ、Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０００；１３９：５７７−５８３ Ａｂｉｆａｄｅｌ Ｍら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００３；３４：１５４−１５６ Ｃｏｈｅｎ Ｊら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００５；３７：１６１−１６５３ Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｋら、Ｌａｎｃｅｔ．２０１４；３８３：６０−６８ Ｇｉｕｇｌｉａｎｏ ＲＰら、Ｌａｎｃｅｔ．２０１２；３８０：２００７−２０１７ Ｒａａｌ Ｆら、Ｊ Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ．２０１３；２：ｅ００００２８ Ｚｅｌｃｈｅｒ Ｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９；３２５：１００−１０４ Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ Ｖら、Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０１３；３４：１２９２−１２９７

ＰＣＳＫ９および／若しくはＩＤＯＬ抵抗性により従来技術の「野生型」ＬＤＬＲに比較して増大された有効性を有する、新規の操作されたヒト低密度リポタンパク質受容体（ｈＬＤＬＲ）変異体が提供される。ｈＬＤＬＲのこれら操作された変異体は、適して、天然のｈＬＤＬＲに比較してＰＣＳＫ９および／若しくはＩＤＯＬに対する低下された親和性、増大された全身半減期を特徴とし、そしてコレステロールを低下させるのに有用である。これら変異体は、多数の経路を介して、およびとりわけ組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのような組換えベクターにより媒介されるｉｎ ｖｉｖｏ発現により、それの必要な被験体に送達し得る。

いくつかの態様において、改変されたｈＬＤＬｒ遺伝子を含んでなる合成若しくは組換えベクターが提供される。いくつかの態様において、改変されたｈＬＤＬＲ遺伝子は発現後にコレステロールを低下させる改変されたｈＬＤＬＲをコードする。いくつかの態様において、改変されたｈＬＤＬＲは、野生型ｈＬＤＬＲ ＩＤＯＬ経路を妨害する１個若しくはそれ以上のアミノ酸置換、および／またはＰＣＳＫ９経路を妨害することによりｈＬＤＬＲの分解に抵抗性である１個若しくはそれ以上のアミノ酸置換を含んでなる。

ある態様において、該合成若しくは組換えベクターは、アミノ酸位置Ｎ２９５、Ｈ３０６、Ｖ３０７、Ｎ３０９、Ｄ３１０、Ｌ３１８、Ｌ７９６、Ｋ８０９および／若しくはＣ８１８に１アミノ酸置換を含んでなる改変されたｈＬＤＬＲをコードする。これらアミノ酸位置は配列番号１（シグナルペプチドを伴わないＬＤＬＲ）の番号付けに基づく。特定の一態様において、１個若しくはそれ以上のアミノ酸置換はＮ２９５Ｄ、Ｈ３０６Ｄ、Ｖ３０７Ｄ、Ｎ３０９Ａ、Ｄ３１０Ｎ、Ｌ３１８Ｈおよび／若しくはＬ３１８Ｄであり、それらは野生型ｈＬＤＬＲ ＩＤＯＬ経路を妨害するアミノ酸置換の例である。別の特定の態様において、１個若しくはそれ以上のアミノ酸置換はＬ７６９Ｒ、Ｋ８０９Ｒおよび／若しくはＣ８１８Ａであり、これらはＰＣＳＫ９経路を妨害することによりｈＬＤＬＲの分解に抵抗性であるアミノ酸置換の例である。別の特定の態様において、組換えベクターは、アミノ酸置換Ｌ７６９６Ｒ、Ｋ８０９Ｒおよび／若しくはＣ８１８Ａ（配列番号１に基づく番号付け）の１個若しくはそれ以上と組合せのアミノ酸置換Ｎ２９５Ｄ、Ｈ３０６Ｄ、Ｖ３０７Ｄ、Ｎ３０９Ａ、Ｄ３１０Ｎ、Ｌ３１８Ｈおよび／若しくはＬ３１８Ｄの１個若しくはそれ以上を含んでなる改変されたｈＬＤＬＲをコードする。

いくつかの態様において、本明細書に提供される組換えベクターは、改変されたｈＬＤＬＲを含んでなる発現カセットを有する。いくつかの態様において、該発現カセットは、肝細胞中での改変されたｈＬＤＬＲの発現を特異的に指図するプロモーターを含んでなる。

いくつかの態様において、組換えベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶはＡＡＶ８、ｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９若しくはｒｈ１０から選択されるキャプシドを有する。特定の一態様において、改変されたｈＬＤＬＲ遺伝子を含んでなる発現カセットを有するｒＡＡＶベクターが提供され、ここで前記ｈＬＤＬＲ遺伝子はＬ３１８Ｄアミノ酸置換を含んでなる改変されたｈＬＤＬＲをコードする。特定の一態様において、改変されたｈＬＤＬＲはさらにＫ８０９Ｒおよび／若しくはＣ８１８Ａアミノ酸置換を含んでなる。特定の一態様において、ｒＡＡＶベクターは、肝細胞中での改変されたｈＬＤＬｒの発現を特異的に指図するプロモーターを含
んでなる発現カセットを含んでなる。

ある態様において、ｈＬＤＬＲ遺伝子は３個の置換：Ｌ３１８Ｄ／Ｋ８０９Ｒ／Ｃ８１８Ａ（配列番号１に基づく番号付け）を有する改変されたｈＬＤＬｒをコードする。置換の他の組合せを選択しうる。

いくつかの態様において、製薬学的に許容できる担体および本明細書に記述されるところの組換えベクターを含んでなる製薬学的組成物が提供される。発現カセットを有する本明細書に記述される組換えベクターをそれの必要な被験体に投与することによる循環コレステロールレベルの低下方法もまた提供され、ここで前記発現カセットは、被験体における改変されたｈＬＤＬｒの発現を指図する調節制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）をさらに含んでなる。

なお別の態様において、Ｎ２９５、Ｈ３０６、Ｖ３０７、Ｎ３０９、Ｄ３１０、Ｌ３１８、Ｌ７６９６、Ｋ８０９および／若しくはＣ８１８から選択される１個若しくはそれ以上のアミノ酸位置（配列番号１に基づく位置番号）でｈＬＤＬＲを改変することを含んでなる、ｈＬＤＬＲの循環半減期の増大方法が提供される。特定の一態様において、ｈＬＤＬＲは、Ｎ２９５Ｄ、Ｈ３０６Ｄ、Ｖ３０７Ｄ、Ｎ３０９Ａ、Ｄ３１０Ｎ、Ｌ３１８Ｈおよび／若しくはＬ３１８Ｄから選択される１個若しくはそれ以上のアミノ酸置換を含んでなるように改変される。別の特定の態様において、ｈＬＤＬＲは、Ｋ７６９Ｒ、Ｋ８０９Ｒおよび／若しくはＣ８１８Ａアミノ酸置換を含んでなるようにさらに改変される。

上述される組換えベクターは家族性高コレステロール血症を処置するためのレジメンで使用し得る。

本発明の他の局面および利点は本発明の以下の詳細な記述から容易に明らかであろう。

図１Ａおよび１Ｂは、ｈＰＣＳＫ９調節を免れるＬＤＬＲ変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の結果を提供する。野生型ｈＬＤＬＲ若しくはＬＤＬＲ変異体の１種を発現するプラスミドをｈＰＣＳＫ９と一緒にＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間（ｈｒ）後に、細胞をＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ］で２ｈｒパルスし、そしてその後蛍光ＬＤＬ陽性細胞についてフローサイトメトリーにより評価した。図１Ａは、ｈＬＤＬＲ若しくはｈＰＣＳＫ９と一緒のｈＬＤＬＲでコトランスフェクトされた場合のＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬ陽性細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。該実験は、無関係なプラスミド（偽似）で細胞をトランスフェクトすることにより対照した。図１Ｂは、ｈＬＤＬＲのみトランスフェクトされた細胞に関するｈＬＤＬＲおよびｈＰＣＳＫ９でコトランスフェクトされた細胞中のＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬ陽性細胞の倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を示す棒グラフである。図１Ｃは、ｍＬＤＬＲを発現するマウスモデルでのｉｎ ｖｉｖｏ結果を示す棒グラフである。該結果はｈＰＣＳＫ９とｍＬＤＬＲの間のある程度の相互作用を示す。 図２Ａ−２Ｃは、ｈＰＣＳＫ９のｉｎ ｖｉｖｏ過剰発現が野生型ｈＬＤＬＲを投与された動物における血清コレステロールの増大に至ることを示す研究からの結果を提供する。ＬＤＬＲ^-/-、ＡＰＯＢＥＣ−１^-/-二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウス（ｎ＝４／群）に、５×１０¹⁰ＧＣの用量のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ若しくは５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ９．ｈＰＣＳＫ９ベクターと一緒のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲを静脈内投与した。ベクター投与前および３０日後の動物からの血清を、総血清コレステロールおよびＨＤＬコレステロールについて分析した。非ＨＤＬコレステロールレベルは総コレステロールからＨＤＬ成分を差し引くことにより決定した。図２Ａは、ｈＰＣＳＫ９とともに若しくは伴わずにｈＬＤＬＲを受領した動物におけるベースラインレベルに関する第３０日の非ＨＤＬ血清コレステロールの変化パーセントを示す棒グラフである。図２Ｂは、ｈＬＤＬＲ若しくはｈＬＤＬＲおよびｈＰＣＳＫ９を受領したマウスからの血清中のｈＰＣＳＫ９発現の時間経過を示す線グラフである。ｈＰＣＳＫ９発現はサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して評価した。ヒトにおける報告される参照平均ｈＰＣＳＫ９レベルもまた該グラフ上に示す。図２Ｃは、ｈＬＤＬＲ若しくはｈＰＣＳＫ９を伴うｈＬＤＬＲで処置されるマウスにおけるｈＬＤＬＲ発現のイムノブロットである。群あたり２匹の代表動物からの総肝ライセートを４−１２％勾配ＳＤＳゲル上で電気泳動し、そしてポリクローナル抗ｈＬＤＬＲヤギポリクローナル抗体でプロービングした。マウスチューブリン発現を負荷対照として使用した。全部の値は平均±ＳＥＭとして表す。^***ｐ＜０．００１。 図３Ａおよび３Ｂは、ｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄで形質導入されたマウスがｈＰＣＳＫ９に媒介される調節に抵抗性であることを具体的に説明する。ＤＫＯマウス（ｎ＝４／群）を５×１０¹⁰ＧＣのＡＡ９．ｈＰＣＳＫ９と一緒に５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ若しくはｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄで共形質導入した。ベクター投与前および３０日後の動物からの血清を総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールについて評価した。図３Ａは、ｈＰＣＳＫ９と一緒にｈＬＤＬＲ若しくはｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄを共投与されたＤＫＯマウスにおけるベクター投与前に関する第３０日の非ＨＤＬ血清コレステロールレベルの変化パーセントを示す棒グラフである。図３Ｂは、４−１２％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で電気泳動されかつｈＬＤＬＲ発現についてプロービングされた群あたり２動物からの総肝ライセートを示す。マウスチューブリン発現を負荷対照として使用した。全部の値は平均±ＳＥＭとして表す。^***ｐ＜０．００１。ｎｓ ｐ＞０．０５。 図４Ａ−４Ｄは、ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａがｉｎ ｖｉｖｏのｈＩＤＯＬに媒介される調節を免れることを具体的に説明する。ＨＥＫ２９３細胞を、ｈＩＤＯＬと一緒にｈＬＤＬＲ若しくはｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａいずれかを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトした。２４ｈｒ後に細胞をＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬで２ｈｒパルスし、そしてその後フローサイトメーターを使用して蛍光ＬＤＬ取り込みについて評価した。図４Ａは、ｈＩＤＯＬと一緒にｈＬＤＬＲ若しくはｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８ＡでトランスフェクトされたＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬ陽性細胞パーセントを示す棒グラフである。図４Ｂは、１×１０¹¹ＧＣのＡＡＶ９ｈＰＣＳＫ９ベクターを全身投与されたＬＤＬＲ^+/-、Ａｐｏｂｅｃ^-/-、Ｔｇ−ｈＡｐｏＢ１００（ＬＡＨＢ）ヘテロ接合性ＦＨ（ｈｅＦＨ）マウス（ｎ＝４）からのデータを示す線グラフである。ベクター投与後の非ＨＤＬコレステロールレベルの時間経過。図４Ｃは、ＡＡＶ９．ｈＩＤＯＬ ５×１０¹⁰ＧＣと一緒に３×１０⁹ＧＣのＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ若しくはＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａを全身投与されたホモ接合性ＦＨ（ｈｏＦＨ）ＤＫＯマウス（ｎ＝４＼群）を示す棒グラフである。ベクター投与前および３０日後の動物からの血清を総血清コレステロールについて評価した。投与前のベースラインレベルに関する３０日の血清非ＨＤＬレベルの変化パーセント。全部の値は平均±ＳＥＭとして表す。^***ｐ＜０．０００１。^*ｐ＜０．０５。ｎｓ ｐ＞０．０５。図４Ｄは、４−１２％ＳＤＳゲル上で電気泳動されかつ抗ｈＬＤＬＲ抗体を使用してプロービングされた、トランスフェクトされた細胞（図４Ａ）の全細胞ライセートを提供する。チューブリン負荷対照と一緒のＬＤＬＲの成熟（Ｍ）およびプロセシングされた（Ｐ）形態のＬＤＬＲの場所を示す。 図５Ａ−５Ｂは、３アミノ酸置換をコードするＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄ＼Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａ変異体がＰＣＳＫ９およびＩＤＯＬ双方に媒介される調節を免れることを具体的に説明する。図５Ａは、ＤＫＯマウス（ｎ＝４）に３×１０⁹ＧＣのｈＬＤＬＲ若しくはｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄ＼Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａを静脈内投与した研究での結果を具体的に説明する。マウスの追加の群はＡＡＶ９．ｈＩＤＯＬの同時投与もまた受領した。総血清コレステロールレベルをベクター投与前および３０日後に評価した。ベースラインに関する非ＨＤＬコレステロールの減少パーセント。群あたり２匹の代表動物からの総肝ライセートを、負荷対照としてのチューブリンと一緒にＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で電気泳動しかつ抗ｈＬＤＬＲ抗体を使用してプロービングした。図５Ｂは、ＡＡＶ９．ｈＰＣＳＫ９（５×１０¹⁰ＧＣ）と一緒のＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ（５×１０¹⁰ＧＣ）若しくはｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄ＼Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａの共投与後の結果を具体的に説明する。ベースラインに関する第３０日の非ＨＤＬコレステロールの減少パーセントを、肝でのｈＬＤＬＲ発現のイムノブロットと一緒に示す。ｎ ^***ｐ＜０．００１。 ＤＫＯマウスでＰＣＳＫ９調節を免れる変異体のｈＬＤＬＲ活性を具体的に説明する棒グラフである。ＤＫＯマウス（ｎ＝４／群）に、３×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ若しくは９種のｈＰＣＳＫ９エスケープ変異体の１種を発現するＡＡＶ８ベクターを注入した。動物からの血清をベクター投与前および３０日後に分析し、そしてベースラインと比較した第３０日の日（ｄａｙ ３０ ｄａｙ）の非ＨＤＬコレステロールの低下パーセントをＳＤと一緒に示す。 ＡＡＶ．ｈＬＤＬＲがより高用量で投与される場合にｈＩＤＯＬに媒介される阻害を克服することを具体的に説明する棒グラフである。ＤＫＯマウス（ｎ＝４／群）に５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ若しくはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａを投与した。マウスの追加の群は５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ９．ＴＢＧ．ｈＩＤＯＬのと一緒にｈＬＤＬＲを受領した。ベースラインと比較した第３０日の非ＨＤＬコレステロールレベルのパーセントをＳＤと一緒に示す。 ＬＤＬＲ−／−、ＡｐｏＢｅｃ−／−二重ノックアウト１マウスモデルでＰＣＳＫ９調節を免れる変異体のｈＬＤＬＲ活性を具体的に説明する棒グラフである。ＤＫＯマウス（ｎ＝５／群）に、５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ９．ＴＢＧ．ｈＰＣＳＫ９ベクターと一緒に、５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ若しくは９種のｈＰＣＳＫ９エスケープ変異体の１種を発現するＡＡＶ８ベクターを注入した（尾静脈）。動物からの血清をベクター投与前および３０日後に分析した。ベースラインと比較した第３０日の日（ｄａｙ ３０ ｄａｙ）の非ＨＤＬコレステロールの低下パーセントをＳＤと一緒に示す。対照マウスはＰＣＳＫ９の共投与を伴わずＬＤＬＲベクターのみを受領した（各対の左への棒）。

［発明の詳細な記述］
本明細書に記述される新規の操作されたヒト低密度リポタンパク質受容体（ｈＬＤＬＲ）変異体は、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）による分解を実質的に回避しかつ／若しくはＬＤＬＲの誘導可能な分解物質（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒａｄｅｒ ｏｆ ＬＤＬＲ）（ＩＤＯＬ）による分解を実質的に回避するそれらの能力に少なくとも部分的により、天然のｈＬＤＬＲと比較して増大された半減期およびコレステロールレベルの低下における増大された有効性を特徴とする。

多数の経路を介する、およびとりわけｒＡＡＶベクターのような組換えベクターにより媒介されるｉｎ ｖｉｖｏ発現による、それの必要な被験体へのこれら変異体の送達が記述される。それの必要な被験体におけるコレステロールレベルを低下させる、家族性高コレステロール血症を処置する、アテローム硬化症を処置する、未熟な冠動脈疾患のリスクを低下させる、および／若しくは心血管系疾患の早期発症を減少させるためのレジメンでのこれら変異体の使用方法もまた提供される。有利には、本明細書で提供される組成物は、これらの処置およびレジメンで複数の経路を同時に標的とするのに有用である。

本明細書で使用されるところの家族性高コレステロール血症（ＦＨ）という用語は脂質
代謝の遺伝性障害を指す。本明細書で別の方法で明記されない限り、ホモ接合性ＦＨ（ｈｏＦＨ）被験体およびヘテロ接合性ＦＨ（ｈｅＦＨ）被験体双方がＦＨという用語内に包括される。

本明細書で使用されるところの「コレステロールレベルを低下させる（こと）」という用語は、血清コレステロールレベルを減少させることおよび／若しくは（例えば血漿中の）低密度リポタンパク質レベルを減少させることを包括しうる。アテローム硬化症を処置することは、プラークの数および／若しくは量を減少させることならびに／または動脈硬化プラークのさらなる蓄積を予防することを包含しうる。

成熟「野生型」ｈＬＤＬＲ（アイソフォーム１）のアミノ酸配列が便宜上配列番号１として本明細書で再現され、そして本明細書に提供されるアミノ酸変異の番号付けのための参照を提供する。本明細書に提供される配列の番号付けは成熟ｈＬＤＬＲタンパク質（８３９アミノ酸の一本鎖糖タンパク質）を指す一方、野生型ｈＬＤＬＲリーダー配列（配列番号２のアミノ酸１−２１）を使用しうるか若しくは異種リーダー配列を本明細書に記述される構築物での使用のため選択しうることが理解されることができる。加えて、若しくは場合によっては、その配列が例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０１１３０から入手可能である他のｈＬＤＬＲアイソフォーム２、３、４、５および６の１種若しくはそれ以上、ならびに本明細書に記述されるアミノ酸置換を、これらのアイソフォーム中に組み込みうる（これらアイソフォームの配列が便宜上再現されている配列番号３−７もまた参照されたい）。以下の記述において、置換は（１文字記号により特定される第一のアミノ酸）−残基位置番号−（１文字記号により特定される第二のアミノ酸）としてもまた書くことができ、それにより第一のアミノ酸は置換されるアミノ酸でありかつ第二のアミノ酸はアイソフォーム１に準拠する指定される位置の置換するアミノ酸であり；しかしながら、慣習的アライメント段階により、アイソフォーム１の番号付けに関して本明細書で特定される該対応するアミノ酸残基は、本明細書で特定される他のアイソフォーム若しくはｈＬＤＬＲタンパク質中に配置され得る。

上述される「アミノ酸置換」という用語およびその同義語は、１アミノ酸の別の置換するアミノ酸での置換によるあるアミノ酸配列の改変を包括することを意図している。置換は保存的置換でありうる。それはまた非保存的置換でもありうる。２アミノ酸を指すことにおける保存的という用語は、該アミノ酸が当業者により認識される共通の特性を共有することを意味することを意図している。例えば、疎水性の非酸性側鎖を有するアミノ酸、疎水性の酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性の非酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性の酸性側鎖を有するアミノ酸、および親水性の塩基性側鎖を有するアミノ酸。共通の特性は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、脂肪族の疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族の疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性の中性側鎖をもつアミノ酸、荷電している側鎖をもつアミノ酸、荷電している酸性側鎖をもつアミノ酸、および荷電している塩基性側鎖をもつアミノ酸でもまたありうる。天然に存在するおよび天然に存在しないの双方のアミノ酸は当該技術分野で既知であり、そして態様において置換するアミノ酸として使用されうる。アミノ酸の置換方法は当業者に公知であり、そして、限定されるものでないがアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の突然変異を挙げることができる。本明細書の「１若しくはそれ以上」への言及は、例えば１、２、３、４、５、６若しくはそれ以上の個別の態様を包括することを意図している。

本明細書に記述されるところの、本明細書で提供されるｈＬＤＬＲ変異体は、野生型ＬＤＬＲに特徴的なＰＣＳＫ９分解を低下させるよう操作されている。一態様において、変異体は、天然のロイシン（Ｌｅｕ）が改変されている位置３１８のアミノ酸置換を有するヒトＬＤＬＲである。一例において、Ｌ３１８はヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）に改変される。しかしながら他の置換（例えばＬ３１８Ｄ）をこの位置で作成しうる。あるいは、若し
くは加えて、ＰＣＳＫ９分解に抵抗性の他のｈＬＤＬＲ変異体を本明細書で同定されるもののなかから選択しうる。これらは例えばＮ２９５、Ｈ３０６、Ｖ３０７、Ｎ３０９および／若しくはＤ３１０（配列番号１に基づく位置番号）の置換を包含しうる。ＰＣＳＫ９分解に対する抵抗性の決定および／若しくは野生型ｈＬＤＬＲと比較した増大された循環半減期の測定方法は当該技術分野で既知であり、そして最低１種のこれらアッセイを下の実施例で具体的に説明する。

加えて、本明細書に記述されるＰＣＳＫ９抵抗性ＬＤＬＲ変異体は、ＩＤＯＬによる分解に対する抵抗性を包含するようさらに操作しうる。この特徴を付与するための適する置換は位置Ｋ７９６（配列表中でＫ６と略称される）、Ｋ８０９およびＣ８１８での置換を包含する。本明細書に具体的に説明される置換はＫ８０９ＲおよびＣ８１８Ａである。しかしながら他のＩＤＯＬ抵抗性置換を選択しうる。ＩＤＯＬ分解に対する抵抗性の決定および／若しくは野生型ｈＬＤＬＲと比較した増大された循環半減期の測定方法は当該技術分野で既知であり、そして最低１種のこれらアッセイを下の実施例に具体的に説明する。

上の変異体の１種若しくはそれ以上を組み込むｈＬＤＬＲアイソフォーム１のアミノ酸配列に対する他の改変が本発明内に包括される。例えば、アイソフォーム２（配列番号３）、アイソフォーム３（配列番号４）、アイソフォーム４（配列番号５）、アイソフォーム５（配列番号６）およびアイソフォーム７（配列番号７）のいずれかのアミノ酸配列に対する対応する改変を利用しうる。これらアイソフォームは本明細書の配列表に再現される。別の例において、本明細書に記述されるｈＬＤＬＲ変異体はｈＬＤＬＲリーダー配列を含有するよう操作しうる。あるいは、異種リーダー配列をｈＬＤＬＲ変異体のＮ末端に操作しうる。あるいは、本明細書に記述されるｈＬＤＬＲ変異体の治療的機能の１種若しくはそれ以上を保持しならびにＰＣＳＫ９抵抗性および／若しくはＩＤＯＬ抵抗性を特徴とする、本明細書に提供されるｈＬＤＬＲ変異体（リーダー配列を除外する）に対する約５％までの変異（該変異体配列に対する約９５％同一性ないし約９９．９％同一性、若しくは約９７％ないし約９８％同一性）を包含しうるなお他の変異を選択しうる。

本記述の実施例の節において、多数の構築物が最初のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングにおいてＰＣＳＫ９調節を免れた一方で、該研究はＬ３１８Ｄアミノ酸置換に焦点を当てた。本明細書に提供される変異体のなかで、Ｌ３１８Ｄ改変はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方でＰＣＳＫ９からの保護を付与することが示されている。本明細書に提供される実施例において、Ｌ３１８Ｄ（配列番号１に基づく位置番号、配列番号２６のリーダー配列を伴う具体的に説明する構築物）が、ＰＣＳＫ９を過剰発現するマウスにおいて肝発現後に保護を付与し、そして血清コレステロールの有意の減少に至り；一方、野生型ＬＤＬＲはより少なく効率的でありかつＰＣＳＫ９によりより容易に分解された。

下の実施例に具体的に説明されるとおり、Ｋ８０９Ｒ／Ｃ８１８Ａ ｈＬＤＬＲ二重変異体（配列番号１に基づく位置番号、配列番号３６のリーダー配列を伴う具体的に説明する構築物］は、ｈＩＤＯＬを発現するマウスにおいて肝発現後に保護を付与しかつ血清コレステロールの有意の減少に至り；一方、野生型ＬＤＬＲはより少なく効率的でありかつＩＤＯＬによりより容易に分解された。これらのデータは、従って、ＬＤＬＲ中のアミノ酸改変はｉｎ ｖｉｖｏのＩＤＯＬに媒介される抑制もまた克服し得ることを確立する。ＬＤＬＲ分解に至る因子は、阻害剤を除去するための基質の欠如により内因性受容体発現を欠く被験体でより高いことが期待される。ＦＨ被験体に存在することが知られている負の細胞調節経路の克服におけるＬＤＬＲ変異体の有用性が本明細書に示される。ここに提示される知見は、ＦＨのための遺伝子治療製品で有用である高レベルの阻害因子を発現するヒト化されたマウスモデルでのコレステロールの低下における、ＡＡＶにコードされる「機能獲得型」導入遺伝子の成功裏の使用を初めて示す。

本明細書に提供されるｈＬＤＬＲタンパク質変異体に加え、これらｈＬＤＬＲタンパク質変異体をコードする核酸配列が提供される。これらの変異体のコーディング配列は、野生型核酸配列の部位特異的突然変異誘発を使用して生成しうる。別法として若しくは加えて、ウェブに基づく若しくは商業的に利用可能なコンピュータプログラム、ならびにサービスに基づく会社（ｓｅｒｖｉｃｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐａｎｉｅｓ）を使用して、アミノ酸配列をＲＮＡおよび／若しくはｃＤＮＡ双方を包含する核酸コーディング配列に戻し翻訳しうる。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／；Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ−／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。一態様において、該ＲＮＡおよび／若しくはｃＤＮＡコーディング配列を、ヒト細胞中での最適な発現のため設計する。

コドン最適化されたコーディング領域は多様な異なる方法により設計し得る。この最適化は、オンラインで利用可能である方法、公開された方法、若しくはコドン最適化サービスを提供する会社を使用して実施しうる。１つのコドン最適化方法は、例えば米国特許出願第６１／８１７，１１０号明細書（本明細書に引用することにより組み込まれる）に記述されている。簡潔には、該産物をコードする核酸配列を同義のコドン配列で改変する。適しては該産物の読み取り枠（ＯＲＦ）の完全長を改変する。しかしながら、いくつかの態様において、ＯＲＦの１フラグメントのみを変えることができる。これらの方法の１つを使用することにより、該頻度をいずれの所定のポリペプチド配列にも適用し得、そして該ポリペプチドをコードするコドン最適化されたコーディング領域の核酸フラグメントを製造し得る。

核酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」若しくは「同一のパーセント」という用語は、対応のため整列される場合に同一である２配列中の塩基を指す。配列同一性比較の長さはゲノムの完全長、遺伝子コーディング配列の完全長、若しくは最低約５００ないし５０００ヌクレオチドのフラグメント、または所望のとおりにわたることができる。しかしながら、例えば最低約９ヌクレオチド、通常は最低約２０ないし２４ヌクレオチド、最低約２８ないし３２ヌクレオチド、最低約３６ヌクレオチド若しくはそれ以上のより小さいフラグメント間の同一性もまた望ましいことができる。複数配列アライメントプログラムが核酸配列についてもまた利用可能である。こうしたプログラムの例は、インターネット上のウェブサーバーを通じてアクセス可能である「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」および「ＭＥＭＥ」を包含する。こうしたプログラムの他の供給源は当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。上述されたプログラムに含有されるものを包含する、ヌクレオチド配列同一性を評価するのに使用し得る当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＧＣＧバージョン６．１中のプログラムＦａｓｔａ^TMを使用して比較し得る。Ｆａｓｔａ^TMはクエリおよび検索配列の間の最良の重複の領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧバージョン６．１（引用することにより本明細書に組み込まれる）に提供されるところのそのデフォルトのパラメータ（６のワードサイズおよびスコアリングマトリックスについてのＮＯＰＡＭファクター）を用いるＦａｓｔａ^TMを使用して決定し得る。

アミノ酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」若しくは「同一のパーセント」という用語は、対応のため整列される場合に同一である２配列中の残基を指す。同一性パーセントは、あるタンパク質の完全長にわたるアミノ酸配列、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸若しくはそれら
のペプチドフラグメント、または対応する核酸配列コーディングシークエンサー（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）について容易に決定しうる。適するアミノ酸フラグメントは長さが最低約８アミノ酸であることができ、そして約７００アミノ酸まででありうる。一般に、２種の異なる配列間の「同一性」、「相同性」若しくは「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」若しくは「類似性」は「整列される」配列に関して決定される。「整列される」配列若しくは「アライメント」は、参照配列と比較して欠けている若しくは付加的な塩基若しくはアミノ酸に対する是正をしばしば含有する複数の核酸配列若しくはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アライメントは多様な公的若しくは商業的に利用可能な多配列アライメントプログラムのいずれかを使用して実施する。配列アライメントプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムがアミノ酸配列に利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるとおり変更し得る。あるいは、当業者は、少なくとも、参照されるアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性若しくはアライメントの水準を提供する別のアルゴリズム若しくはコンピュータプログラムを利用し得る。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”、２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。

一態様において、本明細書に記述されるｈＬＤＬＲ変異体をコードする核酸配列（例えばＬＤＬＲバリアント遺伝子）は、例えば、パッケージング宿主細胞中でＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスベクターを運搬するナノ粒子を生成するためおよび／または被験体中の宿主細胞への送達のためその上に運搬されているｈＬＤＬＲ配列を宿主細胞に移入するいずれかの適する遺伝要素、例えば裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、エピソームなど中に操作される。一態様において、遺伝要素はプラスミドである。選択される遺伝要素は、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいずれかの適する方法により送達しうる。こうした構築物を作成するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、ＧｒｅｅｎとＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２０１２）を参照されたい。

本明細書で使用されるところの「発現カセット」は、ｈＬＤＬＲ変異体コーディング配列、プロモーターを含んでなりかつそのための他の制御配列を包含しうる核酸分子を指し、このカセットは遺伝要素中に操作されることができかつ／若しくはウイルスベクターのキャプシド（例えばウイルス粒子）中にパッケージングされうる。典型的に、ウイルスベクターを生成するためのこうした発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルおよび本明細書に記述されるもののような他の発現制御配列により隣接されている本明細書に記述されるｈＬＤＬＲ配列を含有する。

該発現カセットは典型的に発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含有する。本明細書に記述される具体的に説明するプラスミドおよびベクターは肝特異的プロモーターチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）を使用する。あるいは他の肝特異的プロモーターを使用しうる［例えば、肝特異的遺伝子プロモーターデータベース（Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ）、コールドスプリングハーバー、ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ、α１アンチト
リプシン（Ａ１ＡＴ）；ヒトアルブミン Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４ ３２（１９９７）、ｈｕｍＡｌｂ；およびＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１００２ ９（１９９６）を参照されたい］。ＴＴＲミニマルエンハンサー／プロモーター、αアンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（イントロンレスｓｃＡＡＶを必要とする）。より少なく望ましいとは言え、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば第ＷＯ ２０１１／１２６８０８号明細書および第ＷＯ ２０１３／０４９４３号明細書を参照されたい］、若しくは生理学的合図に応答性のプロモーターのような他のプロモーターを、本明細書に記述されるベクターで使用し利用しうる。

プロモーターに加え、発現カセットおよび／若しくはベクターは、他の適切な転写開始、終止、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を含有しうる。適するポリＡ配列の例は、例えばＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）およびＴＫポリＡを包含する。適するエンハンサーの例は、とりわけ、例えばαフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲミニマルプロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）を包含する。

これら制御配列はｈＬＤＬＲ遺伝子配列に「作動可能に連結されて」いる。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結されている」という用語は、目的の遺伝子と隣接している発現制御配列および目的の遺伝子を制御するためにトランスで若しくは離れて作用する発現制御配列の双方を指す。

発現カセットは、ウイルスベクターの製造のため使用されるプラスミド上で操作されうる。ＡＡＶウイルス粒子中に発現カセットをパッケージングするのに必要とされる最小配列はＡＡＶ ５’および３’ＩＴＲであり、それらはキャプシドと同一のＡＡＶ起源のもの若しくは異なるＡＡＶ起源のもの（ＡＡＶシュードタイプを製造するために）でありうる。一態様において、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列若しくはその欠失されたバージョン（ΔＩＴＲ）を、便宜上および規制当局による承認を促進するために使用する。しかしながら他のＡＡＶ供給源からのＩＴＲを選択しうる。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２からでありかつＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源からである場合、生じるベクターはシュードタイピングされたと称することができる。典型的に、ＡＡＶベクターのための発現カセットは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＬＤＬＲコーディング配列およびいずれかの制御配列ならびにＡＡＶ ３’ＩＴＲを含んでなる。しかしながらこれらのエレメントの他の構成が適することができる。Ｄ配列および末端解離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が欠失されている、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮されたバージョンが記述されている。他の態様において、完全長のＡＡＶ ５’および３’ＩＴＲを使用する。

「ｓｃ」という略称は自己相補型を指す。「自己相補型ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列により運搬されるコーディング領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するよう設計されている発現カセットを有するプラスミド若しくはベクターを指す。感染に際して、第二の鎖の細胞に媒介される合成を待機するよりことむしろ、ｓｃＡＡＶの２個の相補的半分が会合して、即座の複製および転写の準備ができている１個の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成することができる。例えばＤ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙら、“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ”、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、（Ａｕｇｕｓｔ ２００１）、Ｖｏｌ ８、Ｎｕｍｂｅｒ １６、１２４８−１２５４ページを参照されたい。自己相補型ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書；および同第７，４５６，６８３号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、その中に標的細胞への送達のための核酸配列をパッケージングされるＡＡＶタンパク質キャプシドを有するＡＡＶ ＤＮアーゼ抵抗性粒子である。ＡＡＶキャプシドは、６０個のキャプシドタンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成され、それらは選択されたＡＡＶに依存しておよそ１：１：１０ないし１：１：２０の比で正十二面体の対称に配置される。例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８を包含するＡＡＶ血清型を、ＡＡＶウイルスベクターのキャプシド（ＤＮアーゼ抵抗性ウイルス粒子）の供給源として選択しうる［例えば米国特許出願公開第２００７−００３６７６０−Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００９−０１９７３３８−Ａ１号明細書；第ＥＰ １３１０５７１号明細書を参照されたい］。第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号明細書および米国特許第７２８２１９９号明細書（ＡＡＶ８）、第ＷＯ ２００５／０３３３２１号明細書および第ＵＳ ７，９０６，１１１号明細書（ＡＡＶ９）、ならびに第ＷＯ ２００６／１１０６８９号明細書もまた参照されたい］、ならびにｒｈ１０［第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書］、またはなお発見されるはずである若しくはそれに基づく組換えＡＡＶをＡＡＶキャプシドの供給源として使用しうる。これら文書はＡＡＶを生成するために選択することができる他のＡＡＶもまた記述し、そして引用することにより組み込まれる。いくつかの態様において、ウイルスベクターでの使用のためのＡＡＶ ｃａｐを、前述のＡＡＶ Ｃａｐの１種若しくはそのコーディング核酸の突然変異誘発により（すなわち挿入、欠失若しくは置換により）生成し得る。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドは前述のＡＡＶキャプシドタンパク質の２種若しくは３種若しくは４種若しくはそれ以上からのドメインを含んでなるキメラである。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドは、２若しくは３種の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶからのＶｐｌ、Ｖｐ２およびＶｐ３単量体のモザイクである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物は前述のＣａｐの１種以上を含んでなる。

ビリオン中に発現カセットをパッケージングするため、ＩＴＲは遺伝子と同一の構築物中にシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。一態様において、複製（ｒｅｐ）および／若しくはキャプシド（ｃａｐ）のためのコーディング配列がＡＡＶゲノムから除去され、そしてＡＡＶベクターを生成するためにトランスで若しくはパッケージング細胞株により供給される。例えば、上述されたとおり、シュードタイピングされたＡＡＶはＡＡＶキャプシドの供給源と異なる供給源からのＩＴＲを含有しうる。加えて、若しくは、あるいは、キメラＡＡＶキャプシドを利用しうる。なお他のＡＡＶ成分を選択しうる。こうしたＡＡＶ配列の供給源は本明細書に記述されており、そして学究的、商業的若しくは公的供給源（例えばｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ヴァージニア州マナサス）から単離する若しくは得ることもまたできる。あるいは、ＡＡＶ配列は、合成、または例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などのような文献若しくはデータベース中で入手可能であるような公表された配列への参照による他の適する手段により、得ることができる。

被験体への送達に適するＡＡＶウイルスベクターの生成および単離方法は当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書；第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書；第ＷＯ ２００５／０３３３２１
号明細書、第ＷＯ ２００６／１１０６８９号明細書；および第ＵＳ ７５８８７７２ Ｂ２号明細書を参照されたい］。ある１系において、産生体細胞株を、ＩＴＲならびにｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物（１種若しくは複数）により隣接されている導入遺伝子をコードする構築物で一過性にトランスフェクトする。ある第二の系において、ｒｅｐおよびｃａｐを安定に供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子をコードする構築物で一過性にトランスフェクトする。これらの系のそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンが、ヘルパーアデノウイルス若しくはヘルペスウイルスへの感染に応答して産生され、汚染するウイルスからのｒＡＡＶの分離を必要とする。より最近、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としない系が開発された。すなわち、必要とされるヘルパー機能（すなわちアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４若しくはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた該系によりトランスで供給される。これらのより新しい系において、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物への細胞の一過性トランスフェクションにより供給し得るか、若しくは、細胞を、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含有するように操作することができ、その発現を転写若しくは翻訳後レベルで制御し得る。なお別の系において、ＩＴＲおよびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子により隣接されている導入遺伝子を、バキュロウイルスに基づくベクターへの感染により昆虫細胞中に導入する。これら産生系に関する総説については、全般として、例えばＺｈａｎｇら、２００９、“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２−９２９（そのそれぞれの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらおよび他のＡＡＶ産生系の作成および使用方法は、以下の米国特許（そのそれぞれの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）：第５，１３９，９４１号明細書；第５，７４１，６８３号明細書；第６，０５７，１５２号明細書；第６，２０４，０５９号明細書；第６，２６８，２１３号明細書；第６，４９１，９０７号明細書；第６，６６０，５１４号明細書；第６，９５１，７５３号明細書；第７，０９４，６０４号明細書；第７，１７２，８９３号明細書；第７，２０１，８９８号明細書；第７，２２９，８２３号明細書；および第７，４３９，０６５号明細書にもまた記述されている。全般として、例えば、ＧｒｉｅｇｅｒとＳａｍｕｌｓｋｉ、２００５、“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ： Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５；Ｂｕｎｉｎｇら、２００８、“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３；および下に引用される参考文献（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、ＧｒｅｅｎとＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は公知であり、そして適する方法の選択は本発明に対する制限でない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０−５３２および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。

場合によっては、本明細書に記述されるｈＬＤＬＲ遺伝子はｒＡＡＶ以外のウイルスベクターを介して送達しうる。こうした他のウイルスベクターは、遺伝子治療が用いられ得るに適するいかなるウイルスも包含しうる（限定されるものでないがアデノウイルス；ヘ
ルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルスなどを包含し得る）。適しては、これら他のベクターの１種が生成される場合、それは複製欠損ウイルスベクターとして製造される。

「複製欠損ウイルス」若しくは「ウイルスベクター」は、目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスキャプシド若しくはエンベロープにパッケージングされている合成すなわち人工ウイルス粒子を指し、そこでウイルスキャプシド若しくはエンベロープ内にまたパッケージングされているいかなるウイルスゲノム配列も複製欠損であり；すなわち、それらは子孫ビリオンを生成し得ないがしかし標的細胞を感染させる能力を保持する。一態様において、ウイルスベクターのゲノムは複製するために必要とされる酵素をコードする遺伝子を包含しない（該ゲノムは「臆病」であるように操作し得る、すなわち該人工ゲノムの増幅およびパッケージングのために必要とされるシグナルにより隣接されている目的の導入遺伝子のみを含有する）が、しかしこれら遺伝子は産生の間に供給されうる。従って、それは遺伝子治療での使用に安全と思われる。子孫ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下を除き発生し得ないからである。

本明細書に記述される製薬学的組成物は、いずれかの適する経路若しくは多様な経路の組合せによるそれの必要な被験体への送達のため設計される。肝への直接送達（場合によっては静脈内を介して、肝動脈を介して、若しくは移植により）、経口、吸入、鼻内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路。本明細書に記述されるウイルスベクターは単一組成物若しくは複数の組成物中で送達しうる。場合によっては、２種若しくはそれ以上の異なるＡＡＶまたは複数のウイルスを送達しうる［例えば第ＷＯ ２０１１／１２６８０８号明細書および第ＷＯ ２０１３／０４９４９３号明細書を参照されたい］。別の態様において、複数のウイルスが異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶおよびアデノウイルス）を含有しうる。

複製欠損ウイルスは、遺伝子移入および遺伝子治療の応用での使用のため生理学的に許容できる担体と配合し得る。ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化を製剤中に含有される用量の尺度として使用しうる。当該技術分野で既知のいかなる方法も、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するのに使用し得る。ＡＡＶ ＧＣ数のタイトレーションの一実施方法は後に続くとおりである。すなわち、精製されたＡＡＶベクター試料を最初にＤＮアーゼで処理して、被包化されていないＡＡＶゲノムＤＮＡ若しくは汚染するプラスミドＤＮＡを製造工程から排除する。ＤＮアーゼ抵抗性粒子をその後、キャプシドからゲノムを放出するため熱処理にかける。放出されるゲノムをその後、該ウイルスゲノムの特定領域（通常ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブ組を使用するリアルタイムＰＣＲにより定量化する。

また、複製欠損ウイルス組成物を、ヒト患者について約１．０×１０⁹ＧＣないし約１．０×１０¹⁵ＧＣ（体重が７０ｋｇの平均的被験体を処置するため）、および好ましくは１．０×１０¹²ＧＣないし１．０×１０¹⁴ＧＣの範囲にある複製欠損ウイルスの量を含有するように投薬量単位中に配合し得る。別の態様において該用量は約１．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ未満である。例えば、ＡＡＶウイルスの用量は約１×１０⁹ＧＣ、約５×１０⁹ＧＣ、約１×１０¹⁰ＧＣ、約５×１０¹⁰ＧＣ若しくは約１×１０¹¹ＧＣでありうる。別の例において、変異体を約０．００１ｍｇないし約１０ｍｇ／ｋｇの量で送達しうる。

上述された組換えベクターは公表された方法に従って宿主細胞に送達しうる。生理学的に適合性の担体に好ましくは懸濁されているｒＡＡＶをヒト若しくはヒト以外の哺乳動物被験体に投与しうる。適する担体は、移入ウイルスが向けられる適応症を鑑み当業者により容易に選択されうる。例えば、１つの適する担体は、多様な緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）とともに配合されうる食塩水を包含する。他の例示的担体は、滅菌生理食
塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油および水を包含する。担体の選択は本発明の制限でない。

場合によっては、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび／若しくは変異体ならびに担体（１種若しくは複数）に加え、保存剤若しくは化学的安定化剤のような他の慣習的製薬学的成分を含有しうる。適する例示的保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを包含する。適する化学的安定化剤はゼラチンおよびアルブミンを包含する。

本明細書に記述されるウイルスベクターおよび他の構築物は、それの必要な被験体にＬＤＬＲ変異体を送達するために、増大された半減期を有するＬＤＬＲ変異体を被験体に供給するために、および／または上昇されたコレステロールレベル、上昇された高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、上昇されたトリグリセリド、家族性高コレステロール血症、アテローム硬化症、冠動脈疾患、心血管系疾患および／若しくは別のリポタンパク質代謝性障害を処置するための医薬品を製造するために、使用しうる。

１コースの処置は、場合によっては、同一ウイルスベクター（例えばＡＡＶ８ベクター）若しくは異なるウイルスベクター（例えばＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を必要としうる。本明細書に記述されるウイルスベクターを使用するなお他の組合せを選択しうる。場合によっては、本明細書に記述される組成物は、他の抗脂質薬（例えばスタチン類、モノクローナル抗体など）またはタンパク質に基づく治療（例えば本明細書に記述されるところの１種若しくはそれ以上のＬＤＬＲ変異体を含有する組成物の送達を包含する）を必要とするレジメンで組合せうる。

「ある（ａ）」若しくは「ある（ａｎ）」という用語は１若しくはそれ以上を指すことが留意されるべきである。であるから、「ある（ａ）」（若しくは「ある（ａｎ）」）、「１若しくはそれ以上」および「最低１つ」という用語は本明細書で互換性に使用される。

「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでなる（こと）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は排他的によりはむしろ包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なる（こと）（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語およびその異形は包括的によりはむしろ排他的に解釈されるべきである。本明細中の多様な態様は「含んでなる（こと）」言語を使用して提示される一方、他の環境下で、関係する態様が「よりなる（こと）（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」若しくは「より本質的になる（こと）（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ
ｏｆ）」言語を使用して解釈および記述されることもまた意図している。

本明細書で使用されるところの「約」という用語は、別の方法で明記されない限り示される参照から１０％の変動を意味している。

本明細書で使用されるところの「調節」という用語若しくはその変形は、生物学的経路の１若しくはそれ以上の成分を阻害する組成物の能力を指す。

「被験体」は、哺乳動物例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、乳牛、ブタ、またはサル、チンパンジー、ヒヒ若しくはゴリラのようなヒト以外の霊長類である。

本明細書で使用されるところの「疾患」、「障害」および「状態」は、被験体における
異常な状態を示すために互換性に使用される。

本明細で別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は、当業者によりおよび公表される本文への参照により普遍的に理解されると同一の意味するところを有し、それらは本出願で使用される用語の多くへの一般的手引きを当業者に提供する。

以下の実施例は具体的に説明するのみでありかつ本発明を制限することを意図していない。

実施例−

ＬＤＬＲ機能獲得型変異を発現するＡＡＶベクターは家族性高コレステロール血症のマウスモデルで増大された有効性を示す
Ａ．実験動物
全部の動物研究はペンシルベニア大学で施設内審査委員会（ＩＲＢ）により承認された。ＬＤＬＲ^-/-、ＡＰＯＢＥＣ−１^-/-二重ノックアウトマウス（ＤＫＯ）およびＬＤＬＲ^-/-、ＡＰＯＢＥＣ−１^-/-ヒトＡｐｏＢ１００トランスジェニック（ＬＡＨＢ）をペンシルベニア大学で飼養した。これらのマウスはｈＰＣＳＫ９を過剰発現する。この動物モデルにおける内因性マウスＬＤＬＲ発現の非存在は、マウスＬＤＬＲからの妨害を伴わないｈＬＤＬＲ導入遺伝子発現の上昇を可能にする。ｈＰＣＳＫ９の過剰発現はｈＰＣＳＫ９を発現するＡＡＶベクター（ＡＡＶ９．ＴＢＧ．ｈＰＣＳＫ９）を共投与することにより達成され、その製造法は本実施例のＣ部に記述される。

６−８週齢雄性マウスに、１００μＬの総容量中でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈されたベクターを静脈内（尾静脈）に注入した。血清を後眼窩出血によりベクター投与前および後に収集した。研究の終了時に全部の動物を殺し、そして肝をベクターゲノムおよび導入遺伝子発現の分析のため収集した。動物からの血清試料を、ＭＩＲＡ分析装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して総コレステロール（Ｔｃ）、ＬＤＬ、ＨＤＬおよび総トリグリセリド（Ｔｇ）について分析した。非ＨＤＬコレステロールはＴｃからＴｇを差し引くことにより得た。動物からの肝を収集しかつＲＩＰＡ緩衝液を使用して均質化した。２５μｇの総肝ライセートを４−１２％ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、そしてポリクローナル抗ｈＬＤＬＲ抗体でプロービングした。

Ｂ．ＬＤＬＲ変異体
突然変異誘発のため標的とされたアミノ酸残基（配列番号１に基づく位置番号）は後に続くとおりであった：

加えて、ＩＤＯＬに媒介される分解を予防するＬＤＬＲのＣ末端細胞質ドメイン中のアミノ酸置換Ｋ８０９ＲおよびＣ８１８Ａを選択した。

Ｃ．ベクター
肝特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターから野生型ｈＬＤＬＲ ｃＤＮＡを発現するＡＡＶ８ベクターは以前に記述されており、そしてペンシルベニア大学ベクター中核施設（ｔｈｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から得た。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞をＡｄヘルパープラスミドと一緒にＡＡＶシスおよびトランスプラスミドを使用して三重トランスフェクトした。ＡＡＶ粒子を培養上清から精製し、そしてプライマーを使用してｂＧＨポリアデニル化配列に対し定量化した。ベクター調製物を、動物への注入前に制限消化によるＤＮＡ構造およびエンドトキシン汚染（＜２０ＥＵ／ｍＬ）について分析した。野生型ｈＬＤＬＲ ｃＤＮＡを部位特異的突然変異誘発のための鋳型として使用して、製造元の推奨に従ってＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＸＬキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してアミノ酸置換を導入した。

本明細書に記述されるところのＡＡＶベクターの製造のため使用されるプラスミドの配列を、付録として付けられる配列表に提供する。ＴＢＧプロモーターを有するプラスミド構築物を動物（マウス）研究で使用し；ＣＢプロモーターを伴うものをｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングのため使用した。

ｈＰＣＳＫ９およびｈＩＤＯＬをコードするｃＤＮＡ配列を購入し（Ｏｒｉｇｅｎｅ、メリーランド州）、クローン化し、そしてＴＢＧプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルの後ろでＡＡＶ９ベクターから発現させるためベクターに入れた（ｖｅｃｔｏｒｅｄ）。ＴＢＧプロモーターからまた発現されるヒトα１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）を発現するＡＡＶ９ベクターを、無関係の導入遺伝子を必要とした研究で対照として使用した。

Ｄ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＬＤＬＲアッセイ
６ウェルプレート中で増殖するＨＥＫ ２９３細胞を、ｈＰＣＳＫ９若しくはｈＩＤＯＬと一緒にｈＬＤＬＲを発現するプラスミドで一夜トランスフェクトした。全部のｃＤＮＡをサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）の後ろにクローン化してＨＥＫ２９３細胞中で発現を得た。対照細胞はｈＬＤＬＲおよび無関係の導入遺伝子（Ａ１ＡＴ）を発現するプラスミドでトランスフェクトした。１種のベクターの用量がより低く滴定された研究で、無関係のプラスミドを添加して、プラスミドの総量が１実験ウェルから別のものまで異ならなかったことを確認した。翌日、細胞を４μｇ／ｍＬの濃度のＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でパルスした。細胞を２ｈｒ後に取り出し、そしてフローサイトメーター（ＦＣ５００、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して蛍光ＬＤＬ取り込みについて評価した。

Ｅ．イムノブロッティングおよび酵素結合免疫測定法
ヒトＬＤＬＲを発現する細胞若しくはマウス肝から調製された５０μｇの全細胞ライセートを、ＰＶＤＦメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写する前に４−１２％勾配プレキャストミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。抗ｈＬＤＬＲヤギポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１／１０００希釈）、次いでアルカリホスファターゼに結合された二次抗ヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してメンブレンをプロービングした。マウス血清中のヒトＰＣＳＫ９発現レベルを、製造元の説明書に従いＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して分析した。

Ｆ．統計学的解析
全部の実験はテューキーの事後検定を使用して評価される平均コレステロールレベルのペアワイズ集団差を伴う一元配置分散分析モデルを使用して解析した。しかしながら、Ｃ
５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＣＳＫ９の影響を評価する実験については、線形混合効果モデルを使用して、同一マウスでの反復された測定間の相関を考慮に入れながらコレステロールレベルの集団差を評価した。同様に、ＡＡＶで形質導入されたｈＬＤＬＲでのＰＣＳＫ９の分析は共分散分析モデル化に頼り、後コレステロールレベル（ｐｏｓｔ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｅｖｅｌ）は前コレステロール（ｐｒｅ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）レベルおよび群で逆行した。統計学的有意性は全部の実験について０．０５水準で考慮した。

結果
Ｇ．ｈＬＤＬＲ中のアミノ酸置換はＰＣＳＫ９抵抗性を付与する
ＰＣＳＫ９への潜在的に低下された結合を伴う９種のＬＤＬＲ変異体（Ｎ２９５Ｄ、Ｄ２９９Ｎ、Ｈ３０６Ｇ、Ｖ３０７Ｄ、Ｎ３０９Ａ、Ｄ３１０Ｎ、Ｌ３１１Ｔ、Ｌ３１８ＤおよびＬ３１８Ｈ 表１を参照されたい、配列番号１の番号付けに基づく位置番号）を、ｈＰＣＳＫ９の存在若しくは非存在下の蛍光標識されたＬＤＬ（ＢＯＤＰＩＹ−ＬＤＬ^TM）の取り込みについてのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ＨＥＫ２９３細胞で最初にスクリーニングした。

ｈＬＤＬＲおよびｈＰＣＳＫ９の低レベルの内因性発現を有するＨＥＫ２９３細胞での研究を実施した。外因性ｈＰＣＳＫ９の供給源として、細胞をｈＬＤＬＲ構築物と一緒にｈＰＣＳＫ９を発現するプラスミドでコトランスフェクトした。偽似トランスフェクトされた細胞は、ＬＤＬＲタンパク質を検出することに失敗したイムノブロッティングに基づき低レベルのＬＤＬＲを発現し（データは示されない）；さらに、偽似トランスフェクトされた細胞はＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬの取り込みを示すことに失敗した（図１Ａ）。対照的に、ＨＥＫ２９３細胞中への野生型ｈＬＤＬＲの一過性トランスフェクションは、細胞の３０％におけるＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬの内部移行につながり、これはｈＰＣＳＫ９とコトランスフェクトされた場合に１８％に低下された（図１Ａ）。ｈＰＣＳＫ９と共発現される変異体構築物のなかで、Ｄ２９９ＮおよびＬ３１１Ｔアミノ酸置換のみが、ＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬ取り込みが野生型ＬＤＬＲと類似の程度まで低下されたことにおいて、ＰＣＳＫ９に媒介される分解に対する何らかの保護を提供することに失敗した。全部の他のアミノ酸置換はＰＣＳＫ９からの変動する程度の保護を提供したとは言え、いくつかの構築物は、野生型ｈＬＤＬＲと比較された場合にＰＣＳＫ９の非存在下でＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬ取り込みにおいてより少なく効率的であった。一例として、Ｌ３１８ＤおよびＬ３１８Ｈ置換は双方がｈＰＣＳＫ９分解に抵抗性であったとは言え、Ｌ３１８ＤのみがＰＣＳＫ９の非存在下で正常なＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬ取り込みを示した（図１Ｂ）。対照的に、Ｌ３１８Ｈ置換は低下された受容体活性につながり、そしてＢＯＤＩＰＹ^TM−ＬＤＬ取り込みはｈＰＣＳＫ９の非存在下で野生型ｈＬＤＬＲと比較した場合により低かった（３０％対６％；ｈＬＤＬＲ対ｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｈ）。この理由上、ｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄベクターをマウスにおけるさらなるｉｎ ｖｉｖｏ評価に選択した。

Ｈ．マウスにおけるｈＰＣＳＫ９の過剰発現はＡＡＶに発現されるｈＬＤＬＲを下方制御する
マウスにおけるｈＬＤＬＲの野生型およびＬ３１８Ｄの形態の活性を評価することは、外因性ｈＬＤＬＲタンパク質と内因性のマウスＰＣＳＫ９タンパク質の間の潜在的な減少された相互作用により複雑であった。ｈｏＦＨ表現型（生殖系列妨害によってＬＤＬＲおよびＡＰＯＢＥＣ−１を欠く）をもちかつｈＰＣＳＫ９を過剰発現する［肝特異的プロモーターＴＢＧを介してｈＰＣＳＫ９を発現するＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９．ｈＰＣＳＫ９）のｉ．ｖ．注入後］完全にヒト化されたマウスモデルを創成した（本実施例のＡ部に記述されるＬＤＬＲ−／−、ＡｐｏＢｅｃ−／−二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウス。ＡＡＶ９．ｈＰＣＳＫ９ベクターの発現を、最初に、増大する用量のｈＰＣＳＫ９を受領したＣ５７ＢＬ／６マウスで評価した。高用量ベクター（すなわち５×１０¹⁰ＧＣ）で血清
非ＨＤＬコレステロールはおよそ２．５倍増大し（ｐ＝０．００１５）、ｈＰＣＳＫ９とｍＬＤＬＲの間の何らかのレベルの相互作用を示す。図１Ｃを参照されたい。

導入遺伝子に派生されるｈＬＤＬＲに対するｈＰＣＳＫ９の影響を評価する前に、ｈｏＦＨ ＤＫＯマウスにＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ単独を注入した。これらの動物において、通常飼料（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）でのベースライン非ＨＤＬレベルは４１７±２３ｍｇ／ｄｌであり；これは５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲの投与後第７日までに減少した。非ＨＤＬレベルは安定化され、そして第３０日までにわずか３７±７ｍｇ／ｄｌであり、これはベースラインレベルの９％であった（ｐ＝０．０３７、図２Ａ）。次に、ｈＰＣＳＫ９を発現するＤＫＯマウスにおけるこのベクターの性能を、ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲと一緒に等用量（５×１０¹⁰ＧＣ）のＡＡＶ９．ｈＰＣＳＫ９を共投与すること（ｉ．ｖ．）により評価した。ベクター投与後、ｈＰＣＳＫ９の血清レベルは堅調に上昇し、そして第３０日までにピークレベル（７５００±３０００ｎｇ／ｍＬ）に達した（図２Ｂ）。付随して、ｈＰＣＳＫ９で共形質導入されたマウスにおける非ＨＤＬレベルは、ｈＬＤＬＲのみを受領した動物と比較した場合に有意により高かった（ｐ＝０．０００８）（図２Ａ）。ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲはｈＰＣＳＫ９の非存在下で非ＨＤＬを１０倍低下させ；しかしながら、この低下はｈＰＣＳＫ９の存在下でわずか２．５倍であった。総肝ライセートのイムノブロッティングは、ＰＣＳＫ９との共形質導入が肝での低下されたｈＬＤＬＲタンパク質をもたらしたことを確認し（図２Ｃ）；一方、ｈＬＤＬＲメッセンジャーＲＮＡのレベルは実験群間で不変のままであった（データは示されない）。これらの知見は、受容体分解を増大させる細胞内区画中のＬＤＬＲを結合かつ封鎖するＰＣＳＫ９の報告された作用様式［Ｗａｎｇら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、２０１２；５３：１９３２−１９４３］と一致する。ｈＬＤＬＲ発現の低下は無関係の導入遺伝子を発現するＡＡＶ９ベクターで共形質導入された動物で観察されなかった。

Ｉ．ＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄアミノ酸置換はヒトＰＣＳＫ９に媒介される分解に対する抵抗性を付与する
類似の戦略を使用して、ｈＰＣＳＫ９を過剰発現するＤＫＯマウスにおけるｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄの活性を評価し、そして該結果を野生型ｈＬＤＬＲで形質導入されたマウスと比較した。期待されたとおり、ｈＬＤＬＲでの形質導入は第３０日までに血清コレステロールの劇的な低下をもたらし（ベースラインの１０％）；一方、ｈＰＣＳＫ９との共形質導入は、ベースラインのわずか２３％の非ＨＤＬコレステロールレベルを伴う低下されたｈＬＤＬＲ活性をもたらした（ｐ＜０．０００１、図３Ａ）。対照的に、Ｌ３１８Ｄ置換は、ｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄ若しくはｈＰＣＳＫ９と一緒のｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄを受領した動物間の非ＨＤＬレベルの差違が統計学的に有意でなかった（１０％対１４％；ｐ＝０．１３３７）ことにおいて受容体分解を明らかに予防した。さらに、研究の終了時（第３０日）に収集された肝のイムノブロッティングは、ｈＬＤＬＲタンパク質レベルがｈＰＣＳＫ９と一緒に野生型ｈＬＤＬＲを受領した動物でのみ有意に減少したが、しかしｈＬＤＬＲ単独を受領したものでしなかったことを示した（図３Ｂ）。しかしながら、ｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄの肝レベルはｈＰＣＳＫ９との共発現により影響されず、そしてｈＰＣＳＫ９の非存在下に野生型ｈＬＤＬＲで観察されたと同一であった（図３Ｂ）。観察された差違がｍＲＮＡ発現の変化から生じなかったことを確認するため、ｈＬＤＬＲ転写物を定量的ＰＣＲアッセイを使用して肝で分析した。これらの研究は、ｈＬＤＬＲタンパク質の減少より実質的により少なかった、野生型ｈＬＤＬＲで処置されたマウスにおける控えめのみの減少を示した（図３Ｂ）。

Ｊ．ｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８ＡはｈＩＤＯＬ調節を免れる
ＬＤＬＲ発現は、ＩＤＯＬ；オキシステロールの細胞内濃度の増大後に肝Ｘ受容体（ＬＸＲ）により転写的に上方制御されるＥ３ユビキチンリガーゼによる調節もまた受ける。活性化されたＩＤＯＬは受容体分解につながるＬＤＬＲの細胞質側末端領域と相互作用す
る［Ｚｈａｎｇ Ｌら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０１２；３２：２５４１−２５４６］。Ｋ８０９ＲおよびＣ８１８Ａアミノ酸置換を含有するｈＬＤＬＲを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ−Ｋ８０８Ｒ＼Ｃ８１８Ａ）を構築した。この構築物を最初にｈＩＤＯＬの存在若しくは非存在下にＨＥＫ２９３細胞中で評価し；ヒトＩＤＯＬの供給源として、ｈＩＤＯＬを発現するプラスミドをｈＬＤＬＲと共発現させた。期待されたとおり、野生型ｈＬＤＬＲのトランスフェクションは細胞の２８％におけるＬＤＬ取り込みをもたらし；しかしながら、ｈＬＤＬＲと一緒のｈＩＤＯＬのコトランスフェクションはＬＤＬ陽性細胞をわずか２％に劇的に低下させた（図４Ａ）。Ｋ８０８Ｒ＼Ｃ８１８Ａアミノ酸置換は受容体活性に影響せず、また、ＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａ構築物はＩＤＯＬの非存在下でＬＤＬの内部移行において野生型ｈＬＤＬＲと同じくらい効率的であった（ＬＤＬＲ対ＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａ、２８％対２２％）。しかしながら、該２構築物間の差違はｈＩＤＯＬとコトランスフェクトした場合に出現したのであった。ｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａ構築物はｈＩＤＯＬの影響に対しより抵抗性であり、野生型ＬＤＬＲでの２％と対照的に蛍光ＬＤＬを取り込むおよそ１４％の細胞をもたらした。全細胞ライセートのイムノブロッティングは、ＬＤＬ取り込みの観察された差違が、ｈＩＤＯＬの存在下でｈＬＤＬＲタンパク質の低下されたレベルと相関しかつｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａとしなかったことをさらに確認した（図４Ａ）。

次に、ヒトＩＤＯＬを過剰発現するＤＫＯマウスにおけるｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａ構築物の活性を評価した。肝でヒトＩＤＯＬを過剰発現するマウスの表現型を、肝特異的プロモーターの制御下にヒトＩＤＯＬを発現するＡＡ９ベクターを投与することにより創成した。パイロット研究で、内因性ＬＤＬＲ発現の調節におけるヒトＩＤＯＬの有効性を、ＬＤＬＲ発現についてヘテロ接合性のＦＨマウス（ｈｅＦＨ）に５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ９．ｈＩＤＯＬを投与すること（ｉ．ｖ．）によりマウスで評価した。マウスのこの系統（ＬＡＨＢマウス）は、ＡＰＯＢＥＣ−１が欠損、マウスＬＤＬＲ^+/-についてヘテロ接合性、およびより高い血清コレステロールにつながるヒトＡｐｏＢ１００についてトランスジェニックである。ＡＡＶ９．ｈＩＤＯＬの投与後、非ＨＤＬレベルは第７日までに増大しかつ第３０日までに安定レベルに達した（ｐ＜０．０００１、図４Ｂ）。これらの結果は、ＡＡＶに発現されるｈＩＤＯＬがマウス肝において活性でありかつ内因性ｍＬＤＬＲの喪失を引き起こし得ることを確認した。次に、ベクターにコードされるｈＬＤＬＲに対するｈＩＤＯＬの過剰発現の影響がＤＫＯマウスで示された。パイロット研究において、低用量ｈＬＤＬＲベクター投与のみがヒトＩＤＯＬにより有意に影響され；これゆえに、マウスに３×１０⁹ＧＣのＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲおよび５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ９．ｈＩＤＯＬを共投与した。この低用量で、ｈＬＤＬＲおよびｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９＼Ｃ８１８Ａベクターは機能的に類似であり（ｐ＝０．９）、そしてｈＩＤＯＬの非存在下で血清コレステロールの控えめな低下（ベースラインの２０％）を誘発した（図４Ｃ）。しかしながら、ｈＩＤＯＬの共投与は野生型ｈＬＤＬＲの活性を除去し、そして是正は処置前のベースラインレベルで留まった非ＨＤＬコレステロールレベルで見られなかった（ｐ＝０．０２４８、図４Ｃ）。対照的に、ｈＩＤＯＬの存在若しくは非存在下でｈＬＤＬＲ−Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａを受領したマウスにおける非ＨＤＬコレステロールレベルは同様であり（ｐ＞０．０５）、ｈＩＤＯＬに対する改変された構築物のｉｎ ｖｉｖｏ抵抗性を示した（図４Ｃ）。

ｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄ＼Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８ＡはＰＣＳＫ９およびＩＤＯＬ双方による調節を回避する
Ｌ３１８Ｄ、Ｋ８０９ＲおよびＣ８１８Ａアミノ酸置換を単一ベクターにクローン化して、双方の経路による調節に抵抗性であるとみられる構築物を創成した。該ベクターを、ＩＤＯＬエスケープ突然変異を評価する場合に低用量（３×１０⁹ＧＣ）で；若しくはＰ
ＣＳＫ９エスケープ突然変異を評価する場合により高用量（５×１０¹⁰ＧＣ）でＤＫＯマウスに投与した。低用量で投与される場合、ｈＬＤＬＲ−Ｌ３１８Ｄ＼Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａは、血清コレステロールの控えめな減少のみがいずれのベクター投与後にも実現された（図５Ａ）ことにおいて野生型ｈＬＤＬＲと比較可能であった（ｐ＞０．０５）。しかしながら、ｈＩＤＯＬの存在下で投与される場合、該変異体ベクターのみが、血清コレステロールレベルが野生型ｈＬＤＬＲおよびｈＩＤＯＬで見られたものより有意により低い（ｐ＝０．０００２）ままであったことにおいて、ｈＩＤＯＬに対する何らかの抵抗性を示した。肝試料のイムノブロッティングは、該変異体ベクターがｈＩＤＯＬに媒介される分解に対しより抵抗性であったことを確認した（図５Ａ）。ベクターをｈＰＣＳＫ９と一緒により高用量で投与した同時の研究において、該変異体タンパク質は、ｈＰＣＳＫ９を過剰発現するマウスにおいて、対照野生型ＬＤＬＲより血清コレステロールの低下において有意により良好に遂行した（ｐ＝０．０００７、図５Ｂ）。肝のイムノブロット分析はｈＰＣＳＫ９の存在下で野生型ｈＬＤＬＲのほぼ完全な非存在を示し；対照的に、該変異体ベクターは保護されかつｈＰＣＳＫ９によりより少なく分解された。

家族性高コレステロール血症のマウスモデルにおけるｈＬＤＬＲ変異体の比較。

ＰＣＳＫ９調節を回避することが期待された単一アミノ酸置換を運搬するｈＬＤＬＲの一団を、ＬＤＬＲ−／−、ＡＰＯＢＥＣ−／−二重ノックアウトマウス（ＤＫＯ）に投与することによりスクリーニングした。動物に、３×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ若しくはｈＰＣＳＫ９調節を回避することが期待されたｈＬＤＬＲ変異体の１種を静脈内に（ｉ．ｖ．尾静脈）注入した。非ＨＤＬコレステロールの血清レベルの低下を多様な構築物からの受容体活性を比較するための代理物として使用した。血清をベクター投与前および３０日後に後眼窩出血により動物から収集し、そしてコレステロールレベルをＭＩＲＡ分析装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して分析した。非ＨＤＬコレステロールレベルを、総コレステロールからＨＤＬ成分を差し引くことにより決定した。図６はベクター投与後の動物におけるベースラインを上回る非ＨＤＬレベルの減少パーセントを示す。

本研究を、ベクターをより高用量で、すなわち変異体（Ｌ３１８Ｄ、Ｎ２９５Ｄ、Ｈ３０６Ｇ、Ｖ３０７Ｄ、Ｎ３０９Ａ、Ｄ３１０Ｎ、Ｌ３１１Ｔ、Ｌ３１８Ｈ）のそれぞれについて５×１０¹⁰ＧＣのＡＡＶ８．ＴＢＧＦ．ｈＬＤＬＲを投与したことを除き、同一条件下で反復した。５×１０¹⁰ＧＣの野生型ｈＬＤＬＲの投与は独力でベースラインの非ＨＤＬコレステロールレベルの９０％減少に至った（図８）。Ｄ２９９Ｎを除き、全部の他のｈＬＤＬＲ変異体は非ＨＤＬコレステロールの同様の低下もまた達成した。期待されたとおり、ｈＰＣＳＫ９の共投与はｈＬＤＬＲベクターの有効性を有意に低下させた。ｈＰＣＳＫ９の過剰発現は変異体Ｌ３１８Ｄ、Ｎ２９５Ｄ、Ｈ３０６Ｇ、Ｖ３０７ＤおよびＮ３０９Ａに対する最小限の影響のみ有した。さらに、第３０日の肝のイムノブロッティングは、Ｈ３０６Ｇを除きこれら変異体が分解から有意に保護された（示されない）ことを確認した。

高用量ＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ投与はｉｎ ｖｉｖｏのＩＤＯＬ阻害を回避する。

ＬＤＬＲ−／−、ＡＰＯＢＥＣ−／−二重ノックアウトマウス（ＤＫＯ）に、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ若しくはＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｋ８０９Ｒ＼Ｃ８１８Ａを５×１０¹⁰ＧＣの用量で注入した。加えて、数群のマウスにヒトＩＤＯＬを発現する等量のＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９．ＴＢＧ．ｈＩＤＯＬ）を共投与して、ｈＩＤＯＬの存在下でｈＬＤＬＲ活性を評価した。非ＨＤＬコレステロールレベルをベクター投与前および３０日後に分析した。ベクター投与後にベースラインと比較した第３０日の非ＨＤＬコレステロール
パーセントを図７に示す。

本明細で引用される全部の刊行物は、米国仮出願第６２／０２２，６２７号、２０１４年７月９日出願および同第６１／９８４，６２０号、２０１４年４月２５日出願がそうであるように、引用することにより本明細書に組み込まれる。同様に、本明細書で参照されかつ付属として付けられる配列表中に出現する配列番号は引用することにより組み込まれる。本発明は特定の態様に関して記述された一方、改変が本発明の技術思想から離れることなくなされ得ることが認識されるであろう。こうした改変は付属として付けられる請求の範囲の範囲内にあることを意図している。

以下の情報は数字見出し＜２２３＞にフリーテキストを含有する配列について提供される。

Claims (10)

1. 改変されたｈＬＤＬＲ遺伝子を含む発現カセットを有するｒＡＡＶベクターであって、
   前記ｈＬＤＬＲ遺伝子が、配列番号１の番号付けに基づく、Ｌ３１８Ｄアミノ酸置換、Ｋ８０９ＲおよびＣ８１８Ａアミノ酸置換とを含む改変されたｈＬＤＬＲをコードし、
   それにより、改変されたｈＬＤＬＲの前記置換が、野生型ｈＬＤＬＲ ＩＤＯＬ経路を妨害し、およびＰＣＳＫ９経路を妨害することによりｈＬＤＬＲの分解に抵抗性である、
   ベクター。
2. 前記ベクターが、ＡＡＶ８、ｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９またはｒｈ１０から選択されるキャプシドを含む、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
3. 前記発現カセットが、肝細胞中での改変されたｈＬＤＬＲの発現を特異的に指図するプロモーターを含む、請求項１または２に記載のｒＡＡＶベクター。
4. 製薬学的に許容できる担体と、請求項１−３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターとを含む、製薬学的組成物。
5. 請求項１−３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターを含む、それの必要な被験体における循環コレステロールレベルを低下させるための製薬学的組成物であって、
   前記発現カセットが、前記被験体での改変されたｈＬＤＬＲの発現を指図する調節制御配列をさらに含む、
   組成物。
6. 請求項１−３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターを含む、それの必要な被験体におけるｈＬＤＬＲの循環半減期を増大させるための製薬学的組成物であって、
   前記発現カセットが、前記被験体での改変されたｈＬＤＬＲの発現を指図する調節制御配列をさらに含む、
   組成物。
7. それの必要な被験体における循環コレステロールレベルを低下させるための請求項４に記載の組成物であって、
   前記発現カセットが、前記被験体での改変されたｈＬＤＬＲの発現を指図する調節制御配列をさらに含む、
   組成物。
8. それの必要な被験体におけるｈＬＤＬＲの循環半減期を増大させるための請求項４に記載の組成物であって、
   前記発現カセットが、前記被験体での改変されたｈＬＤＬＲの発現を指図する調節制御配列をさらに含む、
   組成物。
9. 家族性高コレステロール血症を処置するためのレジメンでの使用のための、請求項１−３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターを含む、製薬学的組成物。
10. 家族性高コレステロール血症を処置するためのレジメンでの使用のための、請求項６に記載の組成物。

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