KR20210106489A - 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 유전자 요법 - Google Patents

가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 유전자 요법 Download PDF

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Abstract

가족성 고콜레스테롤혈증이 있는 인간 환자를 치료하는 데 유용한 레지멘이 기재되어 있다. 이러한 레지멘은 코르티코스테로이드와 LDLR을 포함하는 복제 결핍 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 현탁액의 공통-투여를 포함한다.

Description

가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 유전자 요법
본 발명은 가족성 고콜레스테롤혈증(FH), 특히, 동형접합 FH(HoFH)를 치료하기 위한 유전자 요법에 관한 것이다.
가족성 고콜레스테롤혈증(FH)은 LDL 수용체(LDLR) 기능에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이에 의해 유발된 생명을 위협하는 장애이다(Goldstein 등, Familial hypercholesterolemia, in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, 등, Editors. 2001, McGraw-Hill Information Services Company: New York. p. 2863-2913 (2001)). 분자적으로 확인된 FH 환자의 90% 초과가 LDLR을 암호화하는 유전자(LDLR, MIM 606945)에 돌연변이를 보유하고 있는 것으로 추정된다. 나머지 환자는 3 가지 추가의 유전자: 아포지단백질(apo) B를 암호화하는 APOB(MIM 107730), 전단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9(PCSK9)를 암호화하는 PCSK9(MIM 607786), 및 LDLR 어댑터 단백질 1을 암호화하는 LDLRAP1(MIM 695747)에 돌연변이를 보유하고 있다. 후자는 열성 소질과 관련된 유일한 유전자 돌연변이이다. 동형접합은 일반적으로 동일한 유전자의 2 개의 대립유전자에서 돌연변이의 존재에 의해 부여되지만; 이중 이형접합(2 개의 이형접합 돌연변이, 2 개의 상이한 유전자에서 각각 1 개씩)이 있는 환자의 사례가 보고되었다. 이형접합 FH에 대해 500 명 중 1 명 내지 200 명 중 1 명의 유병률에 기초하여(Nordestgaard 등, Eur Heart J, 2013. 34(45): p. 3478-90a(2013), Sjouke 등, Eur Heart J,(2014)), 전 세계적으로 7,000 명 내지 43,000 명의 사람들이 동형접합 FH(HoFH)를 가지고 있는 것으로 추정된다.
돌연변이체 LDLR 대립유전자의 특성화는 결실, 삽입, 미스센스 돌연변이, 및 넌센스 돌연변이를 포함한 다양한 돌연변이를 나타내었다(Goldstein 등 2001). 1700 개 초과의 LDLR 돌연변이가 보고되었다. 이 유전자형의 이질성은 4 개의 일반적인 그룹으로 분류된 수용체의 생화학적 기능에서 가변적인 결과를 초래한다. 클래스 1 돌연변이는 검출가능한 단백질 없음과 관련되어 있으며 종종 유전자 결실에 의해 유발된다. 클래스 2 돌연변이는 단백질의 세포내 처리에서 이상을 초래한다. 클래스 3 돌연변이는 리간드 LDL의 결합에 특이적으로 영향을 미치고, 클래스 4 돌연변이는 코팅된 홈에서 클러스터가 되지 않는 수용체 단백질을 암호화한다. 환자의 배양된 섬유아세포를 사용하여 평가된 잔류 LDRL 활성에 기초하여, 돌연변이는 또한 수용체 음성(LDRL의 2% 미만의 잔류 활성) 또는 수용체-결함(2-25% 잔류 활성)으로 분류된다. 수용체-결함이 있는 환자는 평균적으로 LDL-C 수준이 낮고 악성 심혈관 과정이 적다.
손상된 LDL 수용체 기능의 결과로, HoFH 환자의 미치료된 총 혈장 콜레스테롤 수준은 전형적으로 500 mg/dl 초과이며, 조기 및 공격적인 죽상동맥경화증을 초래하여 종종 20 세 이전에 심혈관 질환(CVD) 및 30 세 이전에 사망으로 이어진다(Cuchel 등 Eur Heart J, 2014. 35(32): p. 2146-2157 (2014), Goldstein 등 2001). 따라서 이들 환자에 대한 공격적인 치료의 조기 개시가 필수적이다(Kolansky 등 2008). 이용가능한 옵션은 제한된다. 스타틴(Statin)은 약리학적 치료를 위한 제1 선으로 간주된다. 심지어 최대 용량에서도, LDL-C 혈장 수준의 10-25% 감소만이 대부분의 환자에서 관찰된다(Marais 등 Atherosclerosis, 2008. 197(1): p. 400-6 (2008); Raal 등 Atherosclerosis, 2000. 150(2): p. 421-8 (2000)). 콜레스테롤 흡수 억제제인 에제티미브(ezetimibe)를 스타틴 요법에 첨가하면 LDL-C 수준에서 추가 10-20% 감소를 초래할 수 있다(Gagne 등 Circulation, 2002. 105(21): p. 2469-2475 (2002)). 담즙산 격리제, 니아신, 피브레이트, 및 프로부콜을 포함한 다른 콜레스테롤 저하 약물의 사용은 스타틴 이전 시대에 성공적으로 사용되었고 HoFH에서 추가 LDL-C 감소를 달성하는 것으로 간주될 수 있지만; 이들의 사용은 내약성 및 약물 이용가능성에 의해 제한된다. 이 접근법은 CVD 및 모든 원인 사망률을 감소시키는 것으로 나타났다(Raal 등 Circulation, 2011. 124(20): p. 2202-7). 공격적인 다중-약물 요법 접근법의 이행에도 불구하고, HoFH 환자의 LDL-C 수준은 계속 상승되고 그들의 평균 기대수명은 대략 32 년으로 남아있다(Raal 등 2011). 여러 비-약리학적 옵션이 또한 수년에 걸쳐 테스트되었다. 문맥대정맥 문합술(Bilheimer Arteriosclerosis, 1989. 9(1 Suppl): p. I158-I163 (1989); Forman 등 Atherosclerosis, 1982. 41(2-3): p. 349-361 (1982)) 및 회장 우회술(Deckelbaum 등 N. Engl. J. Med. 1977;296:465-470 1977. 296(9): p. 465-470 (1977))과 같은 외과적 개입은 부분적 및 일시적 LDL-C 저하만을 초래하였고 이제 실행불가능한 접근법으로 간주된다. 정위 간 이식은 HoFH 환자에서 LDL-C 수준을 실질적으로 감소시키는 것으로 입증되었지만(Ibrahim 등 J Cardiovasc Transl Res, 2012. 5(3): p. 351-8(2012); Kucukkartallar 등 2 Pediatr Transplant, 2011. 15(3): p. 281-4(2011)), 이식 후 수술 합병증 및 사망률의 높은 위험, 공여자 부족, 및 면역억제 요법으로 평생 치료 필요를 포함한 단점 및 위험이 이러한 접근법의 사용을 제한한다(Malatack Pediatr Transplant, 2011. 15(2): p. 123-5 (2011); Starzl 등 Lancet, 1984. 1(8391): p. 1382-1383 (1984)). HoFH의 현재 표준 치료(standard of care)는 LDL-C를 50% 초과까지 일시적으로 감소시킬 수 있는 LDL-C의 혈장을 제거하는 물리적 방법인 지단백질 성분채집술을 포함한다(Thompson Atherosclerosis, 2003. 167(1): p. 1-13 (2003); Vella 등 Mayo Clin Proc, 2001. 76(10): p. 1039-46 (2001)). 치료 세션 후 혈장 내 LDL-C의 빠른 재축적(Eder and Rader Today's Therapeutic Trends, 1996. 14: p. 165-179 (1996))은 매주 또는 격주로 성분채집술을 필요로 한다. 이 절차가 죽상동맥경화증의 발병을 지연시킬 수 있지만(Thompson 등 Lancet, 1995. 345: p. 811-816; Vella 등 Mayo Clin Proc, 2001. 76(10): p. 1039-46 (2001)), 힘들고 비용이 많이 들며 용이하게 이용가능하지 않다. 또한, 일반적으로 내약성이 좋은 절차이지만, 빈번한 반복 및 정맥 접근이 필요하다는 점은 많은 HoFH 환자에게 도전이 될 수 있다.
최근에 3 가지 새로운 약물이 HoFH에 특이적인 부가적 요법으로 FDA의 승인을 받았다. 그들 중 2 개인 로미타피드(mipomersen) 및 미포머젠(mipomersen)은 상이한 분자 메커니즘을 통해 수행하지만 apoB-함유 지단백질의 어셈블리 및 분비를 억제한다(Cuchel 등 N Engl J Med, 2007. 356(2): p. 148-156 (2007);, Raal 등 Lancet, 2010. 375(9719): p. 998-1006 (2010)). 이 접근법은 로미타피드를 통해 평균 ~50%에 도달하고(Cuchel 등 2013) 미포머젠을 통해 ~25%에 도달하는(Rall 등 2010) LDL-C의 유의한 감소를 초래한다. 그러나 이들의 사용은 내약성 및 장기간 부착에 영향을 미칠 수 있고 간 지방 축적을 포함하는 일련의 부작용과 관련되어 있으며, 장기간 결과는 아직 완전히 밝혀지지 않았다.
세번째는 이형접합 FH 환자에서 명백히 유리한 안전성 프로필에 따라 LDL-C 수준을 저하시키는 데 효과적인 것으로 나타난 전단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9(PCSK9)에 대한 단클론 항체인 지질-저하 약물의 신규 클래스의 일부이다(Raal 등 Circulation, 2012. 126(20): p. 2408-17 (2012), Raal 등 The Lancet, 2015. 385(9965): p. 341-350 (2015); Stein 등 Circulation, 2013. 128(19): p. 2113-20 (2012)). HoFH를 PCSK9 억제제 에볼로쿠맙(evolocumab) 420 mg으로 12 주 동안 4 주마다 치료하면 위약과 비교하여 LDL-C에서 약 30% 감소를 제공하는 것으로 나타났다(Raal 등 2015). 그러나, PCSK9 억제제의 효능은 잔류 LDLR 활성에 따라 달라지며, 잔류 LDLR 활성이 없는 환자에서는 효과가 없다(Raal 등 2015, Stein 등 Circulation, 2013. 128(19): p. 2113-20 (2013)). PCSK9 억제제의 첨가는 FH에 대한 표준 치료가 될수 있고 HoFH 환자의 하위집합에서 고콜레스테롤혈증을 저하시키기 위해 추가로 추가 감소를 제공할 수 있지만, 이 병태의 임상적 관리에 극적인 영향을 미치지 않을 것이다.
따라서, HoFH에 대한 새로운 의학적 요법에 대한 미충족된 의학적 요구가 남아있다.
인간 저밀도 지단백질 수용체(hLDLR) 유전자를 HoFH로 진단된 환자(인간 대상체)의 간 세포에 전달하기 위한 복제 결핍 아데노 연관 바이러스(AAV)를 포함하는 레지멘이 제공된다. LDLR 유전자를 전달하는 데 사용되는 재조합 AAV 벡터(rAAV)("rAAV.hLDLR")는 간에 대한 향성을 가져야 하며(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV), hLDLR 이식유전자는 간-특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 이러한 rAAV.hLDLR 벡터는 간에서 LDLR 발현의 치료적 수준을 달성하기 위해 20 내지 30-분 기간에 걸쳐 정맥내(IV) 주입에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 레지멘은 약 2.5 x 1013 게놈 카피(GC)/kg의 rAAV.hLDLR 범위를 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 레지멘은 점점 줄어드는 용량의 스테로이드(예를 들어, 약 40 mg/일의 초기 용량을 갖는 프레드니손과 동등(또는 스테로이드 등가물)의 공동-투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료는 -1 일에 시작하여 투약 후 약 8 주까지 계속된다. 특정 구현예에서, 용량은 9 및 10 주 각각 동안 주 당 10 mg 용량 감소, 11, 12 및 13 주 각각 동안 주 당 5 mg 용량 감소로 점점 줄어든다. 특정 구현예에서, 스테로이드 레지멘은 또한 환자가 약 2.5 x 1013 GC/kg 내지 7.5 x 1012 게놈 카피의 용량, 또는 본원에 제공된 다른 용량을 받을 때 전달된다.
인간 저밀도 지단백질 수용체(hLDLR) 유전자를 HoFH로 진단된 환자(인간 대상체)의 간 세포에 전달하기 위한 복제 결핍 아데노 연관 바이러스(AAV)를 포함하는 레지멘이 제공된다. LDLR 유전자를 전달하는 데 사용되는 재조합 AAV 벡터(rAAV)("rAAV.hLDLR")는 간에 대한 향성을 가져야 하며(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV), hLDLR 이식유전자는 간-특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 이러한 rAAV.hLDLR 벡터는 간에서 LDLR 발현의 치료적 수준을 달성하기 위해 20 내지 30-분 기간에 걸쳐 정맥내(IV) 주입에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 레지멘은 약 2.5 x 1013 게놈 카피(GC)/kg의 rAAV.hLDLR 범위를 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 레지멘은 점점 줄어드는 용량의 스테로이드(예를 들어, 약 40 mg/일의 초기 용량을 갖는 프레드니손과 동등(또는 스테로이드 등가물))의 공동-투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 스테로이드를 사용한 예방적 공동-치료는 유전자 요법의 적어도 하루 전(-1 일), 또는 유전자 요법 전달 일(0 일)에 시작하고, 투약 후 약 8 주까지 계속된다. 특정 구현예에서, 예방적 공동-치료는 유전자 요법 전달의 적어도 하루 전 또는 당일에 시작하고 투약 후 약 13 주까지 점점 줄어드는 용량으로 계속된다. 임의적으로, 예방적 스테로이드 공동-요법은 벡터 투약 2 또는 3 일 전에 시작될 수 있다. 특정 구현예에서, 용량은 9 및 10 주 각각 동안 주 당 10 mg 용량 감소, 11, 12 및 13 주 각각 동안 주 당 5 mg 용량 감소로 점점 줄어든다. 특정 구현예에서, 예방적 스테로이드 레지멘은 또한 환자가 본원에 제공된 바와 같이 더 낮은 용량(예를 들어, 약 2.5 x 1012 GC/kg 내지 7.5 x 1012 GC/kg), 또는 더 높은 용량을 받을 때 전달된다.
치료 목표는 이 질환을 치료하고 현재 지질-저하 치료에 대한 반응을 개선하기 위한 실행가능한 접근법으로서 rAAV-기반 간-지정 유전자 요법을 통해 환자의 결함이 있는 LDLR을 기능적으로 대체하는 것이다. 본 발명은 부분적으로 효과적인 용량의 안전한 전달을 허용하는 치료적 조성물 및 방법; 및 인간 대상체에서 효과적인 투약을 위한 정제 생산 요건을 충족하는 개선된 제조 방법의 개발에 기초한다.
요법의 효능은 치료 후, 예를 들어, 환자에서 인간 LDLR 이식유전자 발현을 위한 대리 바이오마커로서 혈장 LDL-C 수준을 사용하여 투약 후 평가될 수 있다. 예를 들어, 유전자 요법 치료 후 환자의 혈장 LDL-C 수준의 감소는 기능적 LDLR의 성공적인 형질도입을 나타낼 것이다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 모니터링될 수 있는 다른 매개변수는 기준선과 비교하여 총 콜레스테롤(TC), 비-고밀도 지단백질 콜레스테롤(비-HDL-C), HDL-C, 공복 트리글리세리드(TG), 초저밀도 지단백질 콜레스테롤(VLDL-C), 지단백질(a)(Lp(a)), 아포지단백질 B(apoB), 및 아포지단백질 A-I(apoA-I)의 변화 측정, 뿐만 아니라 벡터 이전 및 벡터 투여 후 LDL 동역학 연구(대사 메커니즘 평가), 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 요법의 효능은 환자가 요구하는 성분채집술 빈도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, AAV8.hLDLR 치료 후, 환자는 성분채집술에 대한 그들의 요건이 25%, 50%, 또는 그 이상까지 감소될 수 있다. 예를 들어, AAV8.hLDLR 요법 전에 매주 성분채집술을 받는 환자는 격주 또는 매월 성분채집술만을 필요로 할 수 있으며; 다른 구현예에서, 성분채집술은 심지어 덜 빈번하게 요구될 수 있거나, 또는 필요성이 제거될 수 있다.
특정 구현예에서, 요법의 효능은 필요한 PCSK9 억제제의 용량 감소에 의해, 또는 AAV8.hLDLR 치료 후 환자에서 이러한 요법에 대한 필요성의 제거에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 요법의 효능은 필요한 스타틴 또는 답즙 격리제의 용량 감소에 의해 측정된다.
치료 후보인 환자는 바람직하게는 LDLR 유전자에 2 개의 돌연변이를 보유하는 HoFH로 진단된 성인(18 세 이상의 남성 또는 여성); 즉, HoFH와 일치하는 임상 제시 설정으로 두 대립유전자에서 분자적으로 정의된 LDLR 돌연변이를 갖는 환자이며, 미치료된 LDL-C 수준, 예를 들어, 300 mg/dl 초과의 LDL-C 수준, 치료된 LDL-C 수준, 예를 들어, 300 mg/dl 미만의 LDL-C 수준 및/또는 500 mg/dl 초과의 총 혈장 콜레스테롤 수준 및 조기 및 공격적인 죽상동맥경화증을 포함할 수 있다. 치료 후보는 스타틴, 에제티미브, 담즙산 격리제, PCSK9 억제제, 및 LDL과 같은 지질-저하 약물 및/또는 혈장 성분채집술로 치료를 받고 있는 HoFH 환자를 포함한다.
치료 전에, HoFH 환자는 hLDLR 유전자를 전달하는 데 사용되는 AAV 혈청형에 대한 중화 항체(NAb)에 대해 평가되어야 한다. 이러한 NAb는 형질도입 효율을 방해하고 치료 효능을 감소시킬 수 있다. 기준선 혈청 NAb 역가가 ≤1:10인 HoFH 환자는 rAAV.hLDLR 유전자 요법 프로토콜을 사용한 치료의 우수한 후보자이다. 그러나, 다른 기준선 수준을 가진 환자가 선택될 수 있다. 혈청 NAb 역가가 >1:5인 HoFH 환자의 치료는 rAAV.hLDLR 벡터 전달로의 치료 전 및/또는 도중에 면역억제제와의 일시적 공동-치료와 같은 조합 요법이 필요할 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 환자는 일시적 면역억제 요법으로 치료될 수 있는 상승된 간 효소에 대해 모니터링된다(예를 들어, 적어도 약 2x 기준선 수준의 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST) 또는 알라닌 트랜스아미나제(ALT)가 관찰된 경우). 이러한 공동-요법을 위한 면역억제제는 스테로이드, 항대사물, T-세포 억제제, 및 알킬화제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 인간 대상체의 AAV8.LDLR 치료를 위한 프로토콜(섹션 6, 실시예 1); 질환의 동물 모델에서 치료 효능을 입증하는 전임상 동물 데이터(섹션 7, 실시예 2); 치료용 AAV.hLDLR 조성물의 제조 및 제형(섹션 8.1 내지 8.3, 실시예 3); 및 AAV 벡터의 특성화 방법(섹션 8.4, 실시예 3)을 기재하는 예로서 예시된다.
3.1. 정의
본원에 사용된 바와 같이, "AAV8 캡시드"는 본원에 참조로 포함되고, 서열번호: 5에 재현된 GenBank 수탁:YP_077180의 암호화된 아미노산 서열을 갖는 AAV8 캡시드를 지칭한다.　 이 암호화된 서열의 일부 변이는 본 발명에 의해 포함되며, 이는 GenBank 수탁:YP_077180; 미국 특허 제7,282,199호, 제7,790,449호;　제8,319,480호;　제8,962,330호; US 제8,962,332호에서 참조 아미노산 서열에 대해 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다(즉, 참조 서열로부터 약 1% 미만의 변이). 또 다른 구현예에서, AAV8 캡시드는 WO2014/124282에 기재된 AAV8 변이체의 VP1 서열 또는 본원에 참조로 포함된 US 2013/0059732 A1 또는 US7588772 B2에 기재된 dj 서열을 가질 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 캡시드를 생성하는 방법, 이에 따른 코딩 서열, 및 rAAV 바이러스 벡터의 생산 방법이 기재되었다.　 예를 들어, Gao, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(10), 6081-6086(2003), US 2013/0045186A1, 및 WO 2014/124282 참조.　
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "NAb 역가"는 표적화된 에피토프(예를 들어, AAV)의 생리학적 효과를 중화하는 중화 항체(예를 들어, 항-AAV NAb)가 얼마나 많이 생산되었는지에 대한 측정치를 지칭한다. 항-AAV NAb 역가는 예를 들어, Calcedo, R., 등, Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381-390에 기재된 바와 같이 측정될 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
아미노산 서열의 맥락에서 용어 "퍼센트(%) 동일성", "서열 동일성", "퍼센트 서열 동일성", 또는 "동일한 퍼센트"는 대응을 위해 정렬될 때 동일한 2 개의 서열에서 잔기를 지칭한다. 퍼센트 동일성은 전장 단백질, 폴리펩티드, 약 32 개 아미노산, 약 330 개 아미노산, 이의 펩티드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 코딩 서열분석기에 걸쳐 아미노산 서열에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 적어도 약 8 개 아미노산 길이일 수 있고, 최대 약 700 개 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 2 개의 상이한 서열 사이의 "동일성", "상동성", 또는 "유사성"을 언급할 때, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은 다중 핵산 서열 또는 단백질(아미노산)을 지칭하며, 참조 서열과 비교하여 누락 또는 추가된 염기 또는 아미노산에 대한 보정을 종종 함유한다. 정렬은 다양한 공개적으로 또는 상업적으로 이용가능한 다중 서열 정렬 프로그램(Multiple Sequence Alignment Program) 중 임의의 것을 사용하여 수행된다. 서열 정렬 프로그램은 아미노산 서열의 경우, 예를 들어, "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", 및 "Match-Box" 프로그램이 이용가능하다. 일반적으로, 이들 프로그램 중 임의의 것은 디폴트 설정으로 사용되지만, 당업자는 필요에 따라 이러한 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 언급된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 것과 같은 적어도 동일성 또는 정렬 수준을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 활용할 수 있다. 예를 들어, J. D. Thomson 등, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999) 참조.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 관심 유전자와 인접하는 발현 제어 서열 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스에서 또는 떨어져서 작용하는 발현 제어 서열 둘 다를 지칭한다.
"복제-결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 외피에 패킹된 합성 또는 인공 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 바이러스 캡시드 또는 외피 내에 또한 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제-결핍이며; 즉, 자손 비리온을 생성할 수 없지만 표적 세포를 감염시키는 능력을 보유한다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않지만(인공 게놈의 증식 및 패키징에 필요한 신호가 측면에 있는 관심 이식유전자만을 함유하는 게놈은 "무기능"하도록 조작될 수 있음), 이들 유전자는 복제 동안 공급될 수 있다. 따라서, 자손 비리온에 의한 복제 및 감염은 복제에 필요한 바이러스 효소가 존재하는 경우를 제외하고 발생할 수 없으므로 유전자 요법에 사용하기에 안전한 것으로 간주된다.
단수형 용어는 하나 이상을 지칭한다는 점을 유의해야 한다. 이와 같이, 단수형 용어, "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
단어 "포함하다", "포함한다", 및 "포함하는"은 배타적이기 보다는 포괄적으로 해석되어야 한다. 단어 "이루어지다", "이루어진", 및 이의 변이는 포괄적이기 보다는 배타적으로 해석되어야 한다. 명세서의 다양한 구현예가 "포함하는" 언어를 사용하여 제시되지만, 다른 상황 하에, 관련된 구현예는 또한 "로 이루어진" 또는 "로 본질적으로 이루어진" 언어를 사용하여 해석되고 기재되도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 달리 명시되지 않는 한, 주어진 참조로부터 10%의 가변성을 의미한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 그리고 공개된 텍스트를 참조하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지며, 이는 당업자에게 본 출원에 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 가이드를 제공한다.
도 1a - 1h. 원숭이 간에서 EGFP 발현 수준에 대한 기존 AAV8 NAb의 영향. 상이한 유형 및 연령의 원숭이에게 말초 정맥을 통해 3x1012 GC/kg의 AAV8.TBG.EGFP를 주사하고 7 일 후 희생시키고 여러 방식으로 간세포 형질도입에 대해 분석하였다. 도 1a - 1e는 다양한 수준의 기존 중화 항체 대 AAV8(각각 <1:5, 1:5, 1:10 및 1:20)을 갖는 동물의 간에 대한 대표적인 절편을 나타내는 현미경 사진이다. 도 1f는 간세포의 형질도입율에 기초한 형질도입 효율의 정량적 형태계량학적 분석을 나타낸다. 도 1g는 상대적 EGFP 강도에 기초한 형질도입 효율의 정량적 형태계량학적 분석을 나타낸다. 도 1h는 ELISA에 의한 간 용해물에서의 EGFP 단백질의 정량화를 나타낸다. 성체 시노몰구스 원숭이(n = 8, 닫힌 원), 성체 레서스 원숭이(n = 8, 열린 삼각형), 어린 레서스 원숭이(n = 5, 열린 사각형).
도 2. DKO 마우스에서 mLDLR의 장기 발현. DKO 마우스에게 AAV8.TBG.mLDLR(n = 10) 또는 AAV8.TBG.nLacZ(n = 10)를 마우스 당 1011 GC(5x1012 GC/kg)로 투여하였다. 혈청 내 콜레스테롤 수준을 정기적으로 모니터링하였다. 두 그룹 간의 통계적으로 유의한 차이는 빠르면 7 일에 실현되었고(p <0.001) 실험 기간 내내 유지되었다. 마우스를 벡터 투여 후 180 일에 희생시켰다.
도 3a - 3l. AAV8.TBG.mLDLR 후 DKO 마우스에서 죽상동맥경화증의 퇴행. 도 3a는 En face Sudan IV 염색된 3 개의 패널 세트이다. 마우스 대동맥을 핀으로 고정시키고 Sudan IV로 염색하여 중성 지질을 염색하였다. AAV8.nLacZ를 마우스 당 1011 GC(5x1012 GC/kg)(중간)로, 벡터 투여 후 60 일(고지방 식단 시 120 일)에 AAV8.TBG.mLDLR를 마우스 당 1011 GC(5x1012 GC/kg)(오른쪽)로, 또는 기준선(고지방 식단 시 60 일)(왼쪽)에서 처리된 동물로부터의 대표적인 대동맥이 제시된다. 도 3b는 대동맥의 전체 길이를 따라 Oil Red O로 염색된 대동맥의 퍼센트를 정량화된 형태계량학적 분석 결과를 나타내는 막대 차트이다. 도 3c-3k는 이들 마우스로부터의 대동맥 뿌리가 Oil Red O로 염색되었음을 나타낸다. 도 3l은 기준선(n = 10), AAV.TBG.nLacZ(n = 9), 및 AAV8.TBG.mLDLR(n = 10)에서 총 대동맥 표면의 Sudan IV 염색률이 결정되었음을 나타내는 막대 차트이다. 정량화는 Oil Red O 병변에서 수행하였다. 죽상경화성 병변 영역 데이터를 일원 ANOVA에 적용하였다. 실험 그룹을 Dunnett 검정을 사용하여 기준선 그룹과 비교하였다. 반복-측정 ANOVA를 사용하여 유전자 전달 후 시간 경과에 따라 상이한 마우스 그룹 간의 콜레스테롤 수준을 비교하였다. 모든 비교에 대한 통계적 유의성은 P,0.05에서 할당되었다. 그래프는 평균 SD 값을 나타낸다. *p <0.05, **p <0.01, ‡ p <0.001.
도 4. 테스트 또는 대조군 물품이 주입된 DKO 마우스에서 콜레스테롤 수준. DKO 마우스에게 7.5x1011 GC/kg, 7.5x1012 GC/kg 또는 6.0x1013 GC/kg의 AAV8.TBG.mLDLR 또는 6.0x1013 GC/kg의 AAV8.TBG.hLDLR 또는 비히클 대조군(100 μl PBS)을 IV 주사하였다. 콜레스테롤 수준은 평균 ± SEM으로 표현된다. 각 그룹은 동일한 부검 시점에서의 PBS 대조군에 비해 혈청 콜레스테롤에서 통계적으로 유의한 감소를 입증하였다.
도 5a - 5b. 테스트 물품이 주입된 DKO 마우스에서 콜레스테롤 수준. 도 5a는 0 일, 7 일 및 30 일에 측정된 다양한 용량의 벡터로 처리된 마우스에서의 콜레스테롤 수준(mg/mL)을 나타낸다. 값은 평균 ± SEM으로 표현된다. P <0.05.
도 6a - 6c. 벡터 주입된 레서스 원숭이에서 말초 T 세포 반응. 제시된 데이터는 원숭이 19498(도 6a), 090-0287(도 6b), 및 090-0263(도 6c)에 대한 T 세포 반응 및 AST 수준의 시간 경과를 나타낸다. 각 연구 일에 대해, 자극 없음, 100 만개 PBMC 당 스팟-형성 단위(SFU)로 측정된 AAV8 및 hLDLR에 대한 T 세포 반응을 각 도면에서 왼쪽에서 오른쪽으로 플롯팅하였다. 원숭이 19498 및 090-0287은 hLDLR 이식유전자에 대해 양성 말초 T 세포 반응이 발달한 반면, 090-0263은 그렇지 않았다. *는 배경보다 유의하게 높았던 양성 캡시드 반응을 나타낸다.
도 7. AAV8.TBG.hLDLR 벡터의 개략도 표현.
도 8a - 8b. AAV 시스 플라스미드 작제물. a) 간 특이적 TBG 프로모터 및 AAV2 ITR 요소가 측면에 있는 키메라 인트론을 함유하는, 모체 시스 클로닝 플라스미드인 pENN.AAV.TBG.PI의 선형 표현. B) 인간 LDLR 시스 플라스미드인 pENN.AAV.TBG.PI.hLDLR.RBG.KanR의 선형 표현, 여기서 인간 LDLR cDNA가 인트론 및 poly A 신호 사이에 pENN.AAV.TBG.PI로 클로닝되었고 암피실린 내성 유전자가 카나마이신 내성 유전자로 대체되었다.
도 9a - 9b. AAV 트랜스 플라스미드. 도 9a는 암피실린 내성 유전자가 있는 AAV8 트랜스 패키징 플라스미드인 p5E18-VD2/8의 선형 표현이다. 도 9b는 카나마이신 내성 유전자가 있는 AAV8 트랜스 패키징 플라스미드인 pAAV2/8의 선형 표현이다.
도 10a - 10b. 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드. 도 10a는 중간체 pAdΔF1 및 pAdΔF5를 통해 모체 플라스미드인 pBHG10으로부터 ad-헬퍼 플라스미드인 pAdΔF6의 유도를 예시한다. 도 10b는 pAdΔF6(Kan)을 생성하기 위해 카나마이신 내성 유전자로 대체된 pAdΔF6에서 암피실린 내성 유전자의 선형 표현이다.
도 11a - 11b. AAV8.TBG.hLDLR 벡터 제조 과정을 나타내는 흐름도.
복제 결핍 rAAV는 HoFH로 진단된 환자(인간 대상체)의 간 세포에 hLDLR 유전자를 전달하는 데 사용된다. rAAV.hLDLR 벡터는 간에 대한 향성을 가져야하며(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV) hLDLR 이식유전자는 간-특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다.
이러한 rAAV.hLDLR 벡터는 간에서 LDLR 발현의 치료 수준을 달성하기 위해 약 20 내지 약 30 분 기간에 걸쳐 정맥내(IV) 주입에 의해 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 더 짧거나(예를 들어, 10 내지 20 분) 또는 더 긴(예를 들어, 30 분 초과 내지 60 분, 개입 시간, 예를 들어, 약 45 분, 또는 그 이상) 기간이 선택될 수 있다. rAAV.hLDLR의 치료적으로 효과적인 용량은 환자 체중 kg 당 적어도 약 2.5 x 1012 내지 7.5 x 1012 게놈 카피(GC) 범위이다. 바람직한 구현예에서, rAAV 현탁액은 HoFH의 이중 녹아웃(knockout) LDLR-/-Apobec-/- 마우스 모델(DKO 마우스)에 투여된 5 x 1011 GC/kg의 용량이 DKO 마우스에서 기준선 콜레스테롤 수준을 25% 내지 75%까지 감소시키도록 하는 효능을 갖는다. 치료 효능은 이식유전자 발현에 대한 대리로서 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준을 사용하여 평가될 수 있다. 1차 효능 평가는 치료 후 1 내지 3 개월(예를 들어, 12 주)에서 LDL-C 수준을 포함하며, 그 후 적어도 약 1 년(약 52 주) 동안 효과가 지속된다. 이식유전자 발현의 장기 안전성 및 지속성은 치료 후 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 요법의 효능은 환자가 요구하는 성분채집술 빈도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, AAV8.hLDLR 치료 후, 환자는 성분채집술에 대한 그의 요건이 25%, 50%, 또는 그 이상까지 감소될 수 있다. 예를 들어, AAV8.hLDLR 요법 전에 매주 성분채집술을 받는 환자는 단지 격주로 또는 매월 성분채집술을 필요로 할 수 있으며; 다른 구현예에서, 성분채집술은 훨씬 덜 빈번하게 필요할 수 있거나 또는 필요성이 제거될 수 있다.
특정 구현예에서, 요법의 효능은 필요한 PCSK9 억제제의 용량 감소에 의해, 또는 AAV8.hLDLR 치료 후 환자에서 이러한 요법에 대한 필요성의 제거에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 요법의 효능은 필요한 스타틴 또는 담즙 격리제의 용량 감소에 의해 측정된다.
치료 후보인 환자는 바람직하게는 LDLR 유전자에 2 개의 돌연변이를 보유하는 HoFH로 진단된 성인(18 세 이상의 남성 또는 여성); 즉, HoFH와 일치하는 임상 제시 설정으로 두 대립유전자에서 분자적으로 정의된 LDLR 돌연변이를 갖는 환자이며, 미치료된 LDL-C 수준, 예를 들어, 300 mg/dl 초과의 LDL-C 수준, 치료된 LDL-C 수준, 예를 들어, 300 mg/dl 미만의 LDL-C 수준 및/또는 500 mg/dl 초과의 총 혈장 콜레스테롤 수준, 및 조기 및 공격적인 죽상동맥경화증을 포함할 수 있다. 치료 후보는 스타틴, 에제티미브, 담즙산 격리제, PCSK9 억제제, 및 LDL과 같은 지질-저하 약물 및/또는 혈장 성분채집술로 치료를 받고 있는 HoFH 환자를 포함한다.
치료 전에, HoFH 환자는 hLDLR 유전자를 전달하는 데 사용되는 AAV 혈청형에 대한 중화 항체(NAb)에 대해 평가되어야 한다. 이러한 NAb는 형질도입 효율을 방해하고 치료 효능을 감소시킬 수 있다. 기준선 혈청 NAb 역가가 ≤ 1:10인 HoFH 환자는 rAAV.hLDLR 유전자 요법 프로토콜을 사용한 치료에 우수한 후보이다. 혈청 NAb 역가가 >1:5인 HoFH 환자의 치료는 rAAV.hLDLR로 치료 전/도중에 면역억제제와의 일시적 공동-치료와 같은 조합 요법을 필요로 할 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 환자는 일시적 면역억제 요법으로 치료될 수 있는 상승된 간 효소에 대해 모니터링된다(예를 들어, 적어도 약 2x 기준선 수준의 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST) 또는 알라닌 트랜스아미나제(ALT)가 관찰되는 경우).
특정 구현예에서, 이러한 요법은 동일한 날에 2 개 이상의 면역억제 약물, (예를 들어, 프레드넬리손, 미코페놀레이트 모페틸(MMF) 및/또는 시롤리무스(즉, 라파마이신))의 공동-투여를 수반할 수 있다. 이들 약물 중 하나 이상은 유전자 요법 투여 후에, 동일한 용량 또는 조정된 용량으로 계속될 수 있다. 이러한 요법은 필요에 따라 약 1 주(7 일), 약 60 일, 또는 그 이상 동안일 수 있다. 특정 구현예에서, 타크롤리무스가 없는 레지멘이 선택된다. 추가의 면역억제제 공동-요법이 사용된다. 이러한 공동-요법에 대한 면역억제제는 글루코코르티코이드, 스테로이드, 항대사물, T-세포 억제제, 마크롤라이드(예를 들어, 라파마이신 또는 라파로그), 및 알킬화제, 항대사물, 세포독성 항생제, 항체, 또는 이뮤노필린에 활성인 제제를 포함한 세포정지제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역 억제제는 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체- (CD25-) 또는 CD3-지정 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α(종양 괴사 인자-알파) 결합제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역억제 요법은 유전자 요법 투여 전 0, 1, 2, 7 일, 또는 그 이상 일, 또는 유전자 요법 투여 후 0, 1, 2, 3, 7 일, 또는 그 이상 일에 시작될 수 있다.
이러한 공동-요법을 위한 면역억제제는 글루코코르티코이드, 스테로이드, 항대사물, T-세포 억제제, 마크롤라이드(예를 들어, 라파마이신 또는 라파로그), 및 알킬화제, 항대사물, 세포독성 항생제, 항체, 또는 이뮤노필린에 활성인 제제를 포함한 세포정지제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역 억제제는 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체- (CD25-) 또는 CD3-지정 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α(종양 괴사 인자-알파) 결합제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역억제 요법은 유전자 요법 투여 전 0, 1, 2, 7 일, 또는 그 이상 일, 또는 유전자 요법 투여 후 0, 1, 2, 3, 7 일, 또는 그 이상 일에 시작될 수 있다. 이러한 요법은 동일한 날에 2 개 이상의 약물, (예를 들어, 프레드넬리손, 미코페놀레이트 모페틸(MMF) 및/또는 시롤리무스(즉, 라파마이신))의 공동-투여를 수반할 수 있다. 이들 약물 중 하나 이상은 유전자 요법 투여 후에, 동일한 용량 또는 조정된 용량으로 계속될 수 있다. 이러한 요법은 필요에 따라 약 1 주(7 일), 약 60 일, 또는 그 이상 동안일 수 있다. 특정 구현예에서, 타크롤리무스가 없는 레지멘이 선택된다.
5.1 유전자 요법 벡터
rAAV.hLDLR 벡터는 간에 대한 향성을 가져야하며(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV) hLDLR 이식유전자는 간-특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 벡터는 인간 대상체에 주입하기에 적합한 완충제/담체로 제형화된다. 완충제/담체는 rAAV가 주입 튜빙에 달라붙는 것을 방지하지만 생체내에서 rAAV 결합 활성을 방해하지 않는 구성요소를 포함하여야 한다.
5.1.1. rAAV.hLDLR 벡터
간 향성이 있는 다수의 rAAV 벡터 중 임의의 것이 사용될 수 있다. rAAV의 캡시드에 대한 공급원으로서 선택될 수 있는 AAV의 예는 예를 들어, rh10, AAVrh64R1, AAVrh64R2, rh8을 포함한다[예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 제2007-0036760-A1호; 미국 공개 특허 출원 번호 제2009-0197338-A1호; EP 1310571 참조]. 또한, WO 2003/042397(AAV7 및 다른 유인원 AAV), 미국 특허 제7790449호 및 미국 특허 제7282199호(AAV8), WO 2005/033321 및 US 7,906,111(AAV9), WO 2006/110689 및 WO 2003/042397(rh10), AAV3B; US 2010/0047174(AAV-DJ) 참조.
hLDLR 이식유전자는 본원에 참조로 포함된 첨부된 서열 목록에 제공된 서열번호:1, 서열번호: 2, 및/또는 서열번호: 4에 의해 제공되는 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 서열번호:1과 관련하여, 이들 서열은 약 염기쌍 188 내지 약 염기쌍 250에 위치한 신호 서열을 포함하고 변이체 1에 대한 성숙 단백질은 약 염기쌍 251 내지 약 염기쌍 2770에 걸쳐 있다. 서열번호: 1은 또한 hLDLR의 알려진 대체 스플라이스 변이체에 부재하는 것 중 적어도 하나인 엑손을 식별한다. 추가적으로, 또는 임의적으로, 다른 hLDLR 이소형 중 하나 이상을 암호화하는 서열이 선택될 수 있다. 예를 들어, uniprot.org/uniprot/P01130에서 이용가능한 서열인 예를 들어, 이소형 2, 3, 4, 5 및 6 참조. 예를 들어, 통상적인 변이체는 서열번호: 1의 엑손 4(bp (255)..(377) 또는 엑손 12(bp (1546)..(1773))가 부족하다). 임의적으로, 이식유전자는 이종 신호 서열을 갖는 성숙 단백질에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 서열번호: 2는 인간 LDLR에 대한 cDNA 및 번역된 단백질(서열번호: 3)을 제공한다. 서열번호: 4는 인간 LDLR에 대한 조작된 cDNA를 제공한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 웹-기반 또는 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램, 뿐만 아니라 서비스 기반 회사는 아미노산 서열을 RNA 및/또는 cDNA를 모두 포함하는 핵산 코딩 서열로 역 번역하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, EMBOSS의 backtranseq, ebi.ac.uk/Tools/st/; Gene Infinity(geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html); ExPasy(expasy.org/tools/) 참조.
하기 실시예에 기재된 구체적 구현예에서, 유전자 요법 벡터는 rAAV8.TBG.hLDLR로 지칭되는 간-특이적 프로모터(티록신-결합 글로불린, TBG)의 제어 하에 hLDLR 이식유전자를 발현하는 AAV8 벡터이다(실시예 6 참조). 외부 AAV 벡터 구성요소는 1:1:18의 비율로 3 개의 AAV 바이러스 단백질인 VP1, VP2, 및 VP3의 60 개 카피로 이루어진 혈청형 8, T = 1 정이십면체 캡시드이다. 캡시드는 단일 가닥 DNA rAAV 벡터 게놈을 함유한다.
rAAV8.TBG.hLDLR 게놈은 2 개의 AAV 도립된 말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 hLDLR 이식유전자를 포함한다. hLDLR 이식유전자는 인핸서, 프로모터, 인트론, hLDLR 코딩 서열 및 폴리아데닐화(polyA) 신호를 포함한다. ITR은 벡터 생산 동안 게놈의 복제 및 패키징을 담당하는 유전적 요소이며 rAAV를 생성하는 데 필요한 유일한 바이러스 시스 요소이다. hLDLR 코딩 서열의 발현은 간세포-특이적 TBG 프로모터로부터 유도된다. 알파 1 마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서 요소의 2 개의 카피는 프로모터 활성을 자극하기 위해 TBG 프로모터에 선행한다. 키메라 인트론은 발현을 추가로 향상시키기 위해 존재하고 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화(polyA) 신호는 hLDLR mRNA 전사체의 종결을 매개하도록 포함된다.
본원에 기재된 예시적인 플라스미드 및 벡터는 간-특이적 프로모터 티록신 결합 글로불린(TBG)을 사용한다. 대안적으로, 다른 간-특이적 프로모터가 사용될 수 있다[예를 들어, The Liver Specific Gene Promoter Database, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPD, alpha 1 anti-trypsin (A1AT); human albumin Miyatake 등, J. Virol., 71:5124 32 (1997), humAlb; and hepatitis B virus core promoter, Sandig 등, Gene Ther., 3:1002 9 (1996)참조]. TTR 최소 인핸서/프로모터, 알파-항트립신 프로모터, LSP(845 nt)25(인트론이 적은 scAAV 필요). 덜 바람직하지만, 바이러스 프로모터, 구성적 프로모터, 조절가능한 프로모터와 같은 다른 프로모터[예를 들어, WO 2011/126808 및 WO 2013/04943 참조], 또는 생리학적 단서에 반응하는 프로모터가 본원에 기재된 벡터에서 활용될 수 있다.
프로모터 이외에, 발현 카세트 및/또는 벡터는 다른 적적한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 암호화된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 함유할 수 있다. 적합한 polyA 서열의 예는 예를 들어, SV40, 소 성장 호르몬(bGH), 및 TK polyA를 포함한다. 적합한 인핸서의 예는 다른 것들 중에서 예를 들어, 알파 태아단백질 인핸서, TTR 최소 프로모터/인핸서, LSP(TH-결합 글로불린 프로모터/알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서를 포함한다.
이들 제어 서열은 hLDLR 유전자 서열에 "작동가능하게 연결"된다.
발현 카세트는 바이러스 벡터의 생산을 위해 사용되는 플라스미드 상에서 조작될 수 있다. 발현 카세트를 AAV 바이러스 입자로 패키징하는 데 필요한 최소 서열은 AAV 5' 및 3' ITR이며, 이는 캡시드와 동일한 AAV 기원의 것일 수 있거나, 또는 상이한 AAV 기원의 것(AAV 위형(pseudotyped)을 생산하기 위함)일 수 있다. 일 구현예에서, AAV2로부터의 ITR 서열, 또는 이의 결실된 버전(ΔITR)은 편의를 위해 그리고 규제 승인을 가속화하기 위해 사용된다. 그러나, 다른 AAV 공급원으로부터의 ITR이 선택될 수 있다. ITR의 공급원이 AAV2로부터 유래되고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 공급원으로부터 유래되는 경우, 생성된 벡터는 위형으로 명명될 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터에 대한 발현 카세트는 AAV 5' ITR, hLDLR 코딩 서열 및 임의의 조절 서열, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 이들 요소의 다른 구성이 적합할 수 있다. ΔITR로 명명되는 5' ITR의 단축된 버전은 D-서열 및 말단 분해 부위(trs)는 결실된 것으로 기재되었다. 다른 구현예에서, 전장 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다.
약어 "sc"는 자기-상보성을 지칭한다. "자기-상보성 AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반된 코딩 영역이 분자내 이중-가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 발현 카세트를 갖는 플라스미드 또는 벡터를 지칭한다. 감염 시, 두번째 가닥의 세포 매개 합성을 기다리기 보다는, scAAV의 2 개의 상보적 절반이 회합하여 즉시 복제 및 전사할 준비가 된 1 개의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 단위를 형성할 것이다. 예를 들어, D M McCarty 등, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254 참조. 자기-상보성 AAV는 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,596,535호; 제7,125,717호 및 제7,456,683호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
5.1.2. rAAV.hLDLR 제형
rAAV.hLDLR 제형은 완충 염수, 계면활성제, 및 생리학적으로 호환가능한 염 또는 약 100 mM 염화나트륨(NaCl) 내지 약 250 mM 염화나트륨과 동등한 이온 강도로 조정된 염의 혼합물, 또는 동등한 이온 농도로 조정된 생리학적으로 호환가능한 염을 함유하는 수용액에 현탁된 유효량의 rAAV.hLDLR 벡터를 함유하는 현탁액이다. 일 구현예에서, 제형은 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 M. Lock 등, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14에 기재된 바와 같은 최적화된 qPCR(oqPCR) 또는 디지털 액적 PCR(ddPCR)에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어, 약 1.5 x 1011 GC/kg 내지 약 6 x 1013 GC/kg, 또는 약 1 x 1012 내지 약 1.25 x 1013 GC/kg을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 현탁액은 NaCl 및 KCl 둘 다 함유할 수 있다. pH는 6.5 내지 8, 또는 7 내지 7.5 범위 내일 수 있다. 적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합은 폴록사머(Poloxamer), 즉, 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2 개의 친수성 쇄가 측면에 있는 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 삼중블록 공중합체, SOLUTOL HS 15(Macrogol-15 Hydroxystearate), LABRASOL(폴리옥시 카프릴산 글리세리드), 폴리옥시 10 올레일 에테르, TWEEN(폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌 글리콜 중에서 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 제형은 폴록사머를 함유한다. 이들 공중합체는 통상적으로 문자 "P"(폴록사머의 경우) 다음에 3 자리 숫자로 명명되며: 첫번째 2 자리 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적인 분자 질량을 제공하고, 마지막 자리 숫자 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 제공한다. 일 구현예에서 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005 % 내지 약 0.001%의 양으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, rAAV.hLDLR 제형은 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 M. Lock 등, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14에 기재된 바와 같은 oqPCR 또는 디지털 액적 PCR(ddPCR)에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 1x1013 게놈 카피(GC)/mL, 또는 그 이상을 함유하는 현탁액이다. 일 구현예에서, 벡터는 180 mM 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨, 0.001% 폴록사머 188, pH 7.3을 함유하는 수용액에 현탁된다. 제형은 인간 대상체에서 사용하기에 적합하고 정맥내로 투여된다. 일 구현예에서, 제형은 20 분(±5 분)에 걸쳐 주입에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 그러나, 이 시간은 필요에 따라 또는 원하는 경우 조정될 수 있다.
빈 캡시드가 환자에게 투여된 AAV. hLDLR의 용량으로부터 제거됨을 보장하기 위해, 빈 캡시드는 예를 들어, 섹션 8.3.2.5에서 본원에 상세히 논의된 바와 같은 염화세슘 구배 초원심분리를 사용하여 벡터 정제 과정 동안 벡터 입자로부터 분리된다. 일 구현예에서, 패키징된 게놈을 함유하는 벡터 입자는 2016년 12월 9일 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US16/65976, 2016년 4월 13일 출원된 미국 특허 출원 번호 제62/322,093호, 및 2015년 12월 11일 출원된 미국 특허 출원 번호 제62/266,341호에 기재되고 발명의 명칭이 "AAV8에 대한 확장가능한 정제 방법"인 과정을 사용하여 빈 캡시드로부터 정제되며, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함된다. 간단히 말해서, rAAV 생산 세포 배양물의 정화되고 농축된 상청액으로부터 게놈-함유 rAAV 벡터 입자를 선택적으로 포획하고 단리하는 2-단계 정제 계획이 기재되어 있다. 과정은 rAAV 중간체가 실질적으로 없는 rAAV 벡터 입자를 제공하기 위해 고염 농도에서 수행된 친화성 포획 방법 이어서 높은 pH에서 수행된 음이온 교환 수지 방법을 활용한다. 특정 구현예에서, 방법은 게놈-결핍(빈) AAV8 캡시드 중간체로부터 약리학적으로 활성인 게놈 서열을 포함하는 DNA를 함유하는 재조합 AAV8 바이러스 입자를 분리한다. 방법은 (a) 입자 및 중간체가 생성된 AAV 생산자 세포 배양물로부터 비-AAV 물질을 제거하기 위해 정제된 재조합 AAV8 바이러스 입자 및 빈 AAV8 캡시드 중간체; 및 20 mM Bis-Tris 프로판(BTP)을 포함하는 완충액 A 및 약 10.2의 pH를 포함하는 로딩 현탁액을 형성하는 단계; (b) (a)의 현탁액을 현탁액 및/또는 용액의 유동을 위한 유입구 및 용기로부터 용리액의 유동을 허용하는 유출구를 갖는 용기 내에 있는 강한 음이온 교환 수진 상에 로딩하는 단계; (c) 로딩된 음이온 교환 수지를 10mM NaCl 및 20mM BTP를 포함하고 pH가 약 10.2인 완충액 1% B로 세척하는 단계; (d) 로딩되고 세척된 음이온 교환 수지에 증가하는 염 농도 구배를 적용하며, 여기서 염 구배는 종점, 또는 등가물을 포함하여 10 mM 내지 약 190 mM NaCl 범위인, 단계; 및 (e) 중간체로부터 정제된 rAAV 입자를 용리액으로부터 수집하는 단계를 수반한다.
일 구현예에서, 사용되는 pH는 10 내지 10.4(약 10.2)이고 rAAV 입자는 AAV8 중간체로부터 적어도 약 50% 내지 약 90% 정제되거나, 또는 pH 10.2이고 AAV8 중간체로부터 약 90% 내지 약 99% 정제된다. 일 구현예에서, 이는 게놈 카피에 의해 결정된다. rAAV8 입자(패키징된 게놈)의 스톡 또는 제제는 스톡 내 rAAV8 입자가 스톡 내 rAAV8의 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 99%이고 "빈 캡시드"가 스톡 또는 제제 내 rAAV8의 약 1% 미만, 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만일 때 AAV 빈 캡시드(및 다른 중간체)가 "실질적으로 없다".
일 구현예에서, 제형은 l 이하, 바람직하게는 0.75 미만, 보다 바람직하게는, 0.5, 바람직하게는 0.3 미만의 "빈" 대 "가득찬"의 비율을 갖는 rAAV 스톡을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, rAAV 입자의 평균 수율은 적어도 약 70%이다. 이는 칼럼 위에 로딩된 혼합물에서의 역가(게놈 카피) 및 최종 용리액에 존재하는 양을 결정함으로써 계산될 수 있다. 또한, 이들은 본원에 기재된 것들 또는 당업계에 기재된 것들과 같이 q-PCR 분석 및/또는 SDS-PAGE 기술에 기초하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 빈 입자 함량 및 가득찬 입자 함량을 계산하기 위해, 선택된 샘플(예를 들어, 요오딕사놀 구배-정제된 제제 여기서 GC의 # = 입자의 #)에 대한 VP3 밴드 부피를 로딩된 GC 입자에 대해 플롯팅한다. 생성된 선형 방정식(y = mx+c)을 사용하여 테스트 물품 피크의 밴드 부피 내 입자의 수를 계산한다. 그런 다음 로딩된 20 μL 당 입자(pt)의 수에 50을 곱하여 입자(pt) /mL를 제공한다.　 Pt/mL를 GC/mL로 나누어 입자 대 게놈 카피의 비율(pt/GC)을 제공한다.　 Pt/mL-GC/mL는 빈 pt/mL를 제공한다.　 빈 pt/mL를 pt/mL로 나누고 100을 곱하여 빈 입자의 백분율을 제공한다.
일반적으로, 빈 캡시드 및 패키징된 게놈을 갖는 AAV 벡터 입자를 검정하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Grimm 등, Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer 등, Molec. Ther. (2003) 7:122-12 참조. 변성된 캡시드를 테스트 하기 위해, 방법은 처리된 AAV 스톡을 3 개의 캡시드 단백질을 분리할 수 있는 임의의 겔, 예를 들어, 완충액 중 3-8% Tris-아세테이트를 함유하는 구배 겔로 이루어진 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용한 다음 샘플 물질이 분리될 때까지 겔을 실행하고, 겔을 나일론 또는 니트로셀룰로스 막, 바람직하게는 나일론 위에 블롯팅하는 단계를 포함한다. 그런 다음 항-AAV 캡시드 항체는 변성된 캡시드 단백질에 결합하는 1차 항체, 바람직하게는 항-AAV 캡시드 단클론 항체, 가장 바람직하게는 B1 항-AAV-2 단클론 항체로서 사용된다(Wobus 등, J. Virol.(2000) 74:9281-9293). 그런 다음 1차 항체에 결합하고 1차 항체와의 결합을 검출하기 위한 수단을 함유하는 2차 항체, 보다 바람직하게는 공유 결합된 검출 분자를 함유하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 공유 연결된 양 항-마우스 IgG 항체가 사용된다. 결합을 검출하는 방법, 바람직하게는 방사성 동위원소 방출, 전자기 복사, 또는 비색 변화를 검출할 수 있는 검출 방법, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트를 사용하여 1차 및 2차 항체 사이의 결합을 반-정량적으로 결정한다. 예를 들어, SDS-PAGE의 경우, 칼럼 분획으로부터 샘플을 취하고 환원제(예를 들어, DTT)를 함유하는 SDS-PAGE 로딩 완충액에서 가열할 수 있고, 캡시드 단백질을 사전-주조 구배 폴리아크릴아미드 겔(예를 들어, Novex) 상에서 분해하였다. 은 염색은 제조업체의 지침에 따라 SilverXpress(Invitrogen, 캘리포니아주 소재)를 사용하여 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 칼럼 분획 내 AAV 벡터 게놈(vg)의 농도는 정량적 실시간 PCR(Q-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 샘플을 희석하고 DNase I(또는 또 다른 적합한 뉴클레아제)로 분해하여 외인성 DNA를 제거한다. 뉴클레아제의 비활성화 후, 샘플을 추가로 희석하고 프라이머 및 프라이머 사이의 DNA 서열에 특이적인 TaqMan™ 플루오로제닉 프로브를 사용하여 증폭시킨다. 정의된 형광 수준에 도달하는 데 필요한 주기의 수(임계 주기, Ct)는 Applied Biosystems Prism 7700 서열 검출 시스템 상에서 각 샘플에 대해 측정된다. AAV 벡터에 함유된 것과 동일한 서열을 함유하는 플라스미드 DNA를 이용하여 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성한다. 샘플로부터 수득된 주기 임계(Ct) 값을 사용하여 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값에 정규화함으로써 벡터 게놈 역가를 결정한다. 디지털 PCR에 기초한 종점 검정이 또한 사용될 수 있다.
일 측면에서, 광범위 스펙트럼 세린 프토테아제, 예를 들어, 프로테이나제 K(예컨대 Qiagen으로부터 상업적으로 입수가능함)를 활용하는 최적화된 q-PCR 방법이 본원에 제공된다. 보다 특히, 최적화된 qPCR 게놈 역가 검정은 DNase I 분해 후, 샘플이 프로테이나제 K 완충액으로 희석되고 프로테이나제 K로 처리된 후 열 불활성화 처리된다는 점을 제외하고 표준 검정과 유사하다.　 적합하게 샘플은 샘플 크기와 동일한 양의 프로테이나제 K 완충액으로 희석된다.　 프로테이나제 K 완충액은 2-배 이상으로 농축될 수 있다. 전형적으로, 프로테이나제 K 처리는 약 0.2 mg/mL이지만, 0.1 mg/mL에서 약 1 mg/mL까지 달라질 수 있다.　 처리 단계는 일반적으로 약 55℃에서 약 15 분 동안 수행되지만, 더 긴 기간(예를 들어, 약 20 분 내지 약 30 분)에 걸쳐 더 낮은 온도(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 50℃), 또는 더 짧은 기간(예를 들어, 약 5 내지 10 분) 동안 더 높은 온도(예를 들어, 최대 약 60℃)에서 수행될 수 있다. 유사하게, 열 불활성화는 일반적으로 약 95℃에서 약 15 분 동안이지만, 온도는 더 낮아지고(예를 들어, 약 70 내지 약 90℃) 시간은 연장될 수 있다(예를 들어, 약 20 분 내지 약 30 분).　 그런 다음 샘플을 희석하고(예를 들어, 1000 배) 표준 검정에 기재된 바와 같이 TaqMan 분석에 적용한다.　
추가적으로, 또는 대안적으로, 액적 디지털 PCR(ddPCR)이 사용될 수 있다. 예를 들어, ddPCR이 의한 단일 가닥 및 자기-상보성 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하는 방법이 기재되었다. 예를 들어, M. Lock 등, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14 참조.
5.1.3 제조
rAAV.hLDLR 벡터는 도 11에 나타낸 흐름도에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다. 간단히 말해서, 세포(예를 들어 HEK 293 세포)를 적합한 세포 배양 시스템에서 번식시키고 벡터 생성을 위해 형질감염시킨다. 그런 다음 rAAV.hLDLR 벡터를 수확하고 농축하고 정제하여 벌크 벡터를 제조한 다음 다운스트림 과정에서 채우고 완료할 수 있다.
본원에 기재된 유전자 요법 벡터를 제조하는 방법은 유전자 요법 벡터의 생산, 벡터의 생성, 및 벡터의 정제를 위해 사용되는 플라스미드 DNA의 생성과 같은 당업계에 잘 알려진 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 벡터이며 생성된 플라스미드는 AAV 게놈 및 관심 유전자를 암호화하는 AAV 시스-플라스미드, AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 트랜스-플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드이다. 벡터 생성 과정은 세포 배양의 개시, 세포 계대, 세포 시딩, 플라스미드 DNA로 세포의 형질감염, 형질감염 후 무혈청 배지로 배지 교환, 및 벡터-함유 세포 및 배양 배지의 수확과 같은 방법 단계를 포함할 수 있다. 수확된 벡터-함유 세포 및 배양 배지는 본원에서 조질 세포 수확물로 지칭된다.
그후에 조질 세포 수확물은 벡터 수확물의 농축, 벡터 수확물의 투석여과, 벡터 수확물의 미세유동화, 벡터 수확물의 뉴클레아제 분해, 미세유동화 중간체의 여과, 크로마토그래피에 의한 정제, 초원심분리에 의한 정제, 접선 유동 여과에 의한 완충액 교환, 및 벌크 벡터를 제조하기 위한 제형 및 여과와 같은 방법 단계에 적용될 수 있다.
특정 구현예에서, 도 11의 방법과 유사한 방법이 다른 AAV 생산자 세포와 함께 사용될 수 있다. rAAV 벡터를 생산하기 위해 형질감염, 안정된 세포주 생산, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드 및 배큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생산 시스템을 포함한 수많은 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, G Ye, 등, Hu Gene Ther Clin Dev, 25: 212-217 (Dec 2014); RM Kotin, Hu Mol Genet, 2011, Vol. 20, Rev Issue 1, R2-R6; M. Mietzsch, 등, Hum Gene Therapy, 25: 212-222 (Mar 2014); T Virag 등, Hu Gene Therapy, 20: 807-817 (August 2009); N. Clement 등, Hum Gene Therapy, 20: 796-806 (Aug 2009); DL Thomas 등, Hum Gene Ther, 20: 861-870 (Aug 2009) 참조. rAAV 바이러스 입자의 생산을 위한 rAAV 생산 배양물은 모두 다음을 필요로 한다; 1) 예를 들어, HeLa, A549, 또는 293 세포와 같은 인간-유래 세포주, 또는 배큘로바이러스 생산 시스템의 경우 SF-9와 같은 곤충-유래 세포주를 포함한 적합한 숙주 세포; 2) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예컨대 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 배큘로바이러스, 또는 트랜스 또는 시스에서 헬퍼 기능을 제공하는 핵산 작제물에 의해 제공되는 적합한 헬퍼 바이러스 기능; 3) 기능적 AAV rep 유전자, 기능적 cap 유전자 및 유전자 산물; 4) AAV ITR 서열이 측면에 있는 이식유전자(예컨대 치료용 이식유전자); 및 5) rAAV 생산을 지원하는 적합한 배지 및 배지 구성요소.
AAV의 생산에 사용하기 위한 다양한 적합한 세포 및 세포주가 기재되었다. 세포 자체는 원핵(예를 들어, 박테리아) 세포, 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유류 세포를 포함한 진핵 세포를 포함하는 임의의 생물학적 유기체로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 숙주 세포는 A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, HEK 293 세포(기능적 아데노바이러스 E1을 발현함), Saos, C2C12, L 세포, HT1080, HepG2 및 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 및 햄스터를 포함한 포유동물로부터 유래된 1차 섬유아세포, 간세포 및 근아세포 세포와 같은 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 포유류 종 중에서 선택된다. 특정 구현예에서, 세포는 현탁액-적응된 세포이다. 세포를 제공하는 포유류 종의 선택은 본 발명의 제한이 아니며; 포유류 세포의 유형, 즉, 섬유아세포, 간세포, 종양 세포 등도 아니다.
구체적 구현예에서, 유전자 요법 벡터를 제조하는 데 사용되는 방법은 하기 섹션 8에서 실시예 3에 기재되어 있다.
5.2 환자 집단
치료 후보인 환자는 바람직하게는 LDLR 유전자에 2 개의 돌연변이를 보유하는 HoFH로 진단된 성인(18 세 이상의 남성 또는 여성); 즉, HoFH와 일치하는 임상 제시 설정으로 두 대립유전자에서 분자적으로 정의된 LDLR 돌연변이를 갖는 환자이며, 미치료된 LDL-C 수준, 예를 들어, 300 mg/dl 초과의 LDL-C 수준, 치료된 LDL-C 수준, 예를 들어, 300 mg/dl 미만의 LDL-C 수준 및/또는 500 mg/dl 초과의 총 혈장 콜레스테롤 수준 및 조기 및 공격적인 죽상동맥경화증을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 18 세 미만의 환자가 치료될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료되는 환자는 18 세 이상의 남성이다. 일부 구현예에서, 치료되는 환자는 18 세 이상의 여성이다. 치료 후보는 스타틴, 에제티미브, 담즙산 격리제, PCSK9 억제제, 및 LDL과 같은 지질-저하 약물 및/또는 혈장 성분채집술로 치료를 받고 있는 HoFH 환자를 포함한다.
치료 전에, HoFH 환자는 hLDLR 유전자를 전달하는 데 사용되는 AAV 혈청형에 대한 NAb에 대해 평가되어야 한다. 이러한 NAb는 형질도입 효율을 방해하고 치료 효능을 감소시킬 수 있다. 기준선 혈청 NAb 역가가 ≤ 1:10인 HoFH 환자는 rAAV.hLDLR 유전자 요법 프로토콜을 사용한 치료에 우수한 후보이다. 그러나, 더 높은 비율을 갖는 환자가 특정 상황 하에 선택될 수 있다. 혈청 NAb 역가가 >1:5인 HoFH 환자의 치료는 면역억제제와의 일시적 공동-치료와 같은 조합 요법을 필요로 할 수 있지만, 이러한 요법은 낮은 비율을 갖는 환자에 대해서 선택될 수 있다. 이러한 공동-요법을 위한 면역억제제는 스테로이드, 항대사물, T-세포 억제제, 및 알킬화제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이러한 일시적 치료는 약 60 mg에서 시작하여, 하루에 10 mg/씩 감소하는(7 일째에 용량 없음) 양으로, 감소하는 용량으로 7 일 동안 하루에 1 회 투여된 스테로이드(예를 들어, 프레드니솔)를 포함할 수 있다. 다른 용량 및 약물이 선택될 수 있다.
대상체는 임상 의사의 재량에 따라 유전자 요법 치료 전 및 동시에 표준 치료(들)(예를 들어, LDL 성분채집술 및/또는 혈장 교환, 및 다른 지질 저하 치료)를 계속하도록 허용될 수 있다. 대안으로, 의사는 유전자 요법 치료를 투여하기 전에 표준 요법을 중단하고, 임의적으로, 유전자 요법의 투여 후 공동-요법으로 표준 치료를 재개하는 것을 선호할 수 있다. 유전자 요법 레지멘의 바람직한 평가변수는 기준선에서 유전자 요법 치료의 투여 후 최대 12 주까지 LDL 아포지단백질 B(apoB)의 분획별 대사율(FCR)에서 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 감소 및 변화이다. 다른 바람직한 평가변수는 예를 들어, 총 콜레스테롤(TC), 비-고밀도 지단백질 콜레스테롤(비-HDL-C), 공복 트리글리세리드(TG)의 감소, 및 HDL-C의 변화(예를 들어, 증가된 수준이 바람직함), 초저밀도 지단백질 콜레스테롤(VLDL-C), 지단백질(a)(Lp(a)), 아포지단백질 B(apoB), 및/또는 아포지단백질 A-I(apoA-I) 중 하나 이상에서 감소를 포함한다.
일 구현예에서, 환자는 AAV8.hLDLR 단독으로 치료하고/하거나 연구 지속기간에 걸쳐 보조 치료의 사용과 조합하여 치료한 후 원하는 LDL-C 역치(예를 들어, LDL-C <200, <130, 또는 <100, mg/dl)를 달성한다.
특정 구현예에서, 환자는 LDL의 빈도 및/또는 혈장 성분채집술을 포함한 지질 저하 요법에 대한 필요성이 감소될 것이다.
또한 다른 구현예에서, 기준선과 비교하여 평가가능한 황색종(황색종s)의 수, 크기 또는 정도가 감소될 것이다.
그럼에도, 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 환자는 임상 의사의 재량에 따라 치료로부터 제외될 수 있다:
ㆍ NYHA 분류에 의해 기준선 방문 12 주 이내에 입원 이력이 있는 기능적 클래스 III 또는 기능적 클래스 IV로 정의된 심부전.
ㆍ 심근 경색(MI), 입원으로 이어지는 불안정한 협심증, 관상 동맥 우회로 이식술(CABG), 경피적 관상동맥 중재술(PCI), 비제어성 심장 부정맥, 경동맥 수술 및 스텐팅, 뇌졸중, 일시적 허혈성 발작, 경동맥 혈관성형술, 혈관내 수술 또는 외과적 개입에 대한 기준선 방문 12 주 이내의 이력.
ㆍ 다음과 같이 정의된 비제어성 고혈압: 수축기 혈압 >180 mmHg, 이완기 혈압 > 95 mmHg.
ㆍ 문서화된 조직학적 평가 또는 비-침습 영상 또는 검사에 기초한 간경변 또는 만성 간 질환 이력.
ㆍ 다음 간 질환 중 임의의 것에 대한 문서화된 진단: 비알코올성 지방간염(생검으로 입증); 알코올성 간 질환; 자가면역 간염; 간암; 원발성 쓸개관 간경변; 원발성 경화성 쓸개관염; 윌슨병; 혈색소침착증; α1 항-트립신 결핍증.
ㆍ 스크리닝 시 비정상적인 LFT(환자가 길버트 증후군으로 인한 비접합 고빌리루빈혈증이 없는 한 AST 또는 ALT >2x 정상 상한치(ULN) 및/또는 >1.5x ULN의 총 빌리루빈).
ㆍ B HepB SAg, 또는 Hep B Core Ab, 및/또는 바이러스 DNA에 대해 양성으로 정의된 B형 간염, 또는 HCV Ab 및 바이러스 RNA에 대해 양성으로 정의된 만성 활성 C형 간염.
ㆍ 52 주 이내에 알코올 남용 이력.
ㆍ 잠재적으로 간 독성이 있는 것으로 알려진 특정한 금지 약물, 특히 미세수포성 또는 거대공포성 지방증을 유도할 수 있는 약물. 이들은 아큐탄, 아미오다론, HAART 약물, 과도한 아세트아미노펜 사용(2g/일 > 3 x q 주), 이소니아지드, 메토트렉세이트, 테트라사이클린, 타목시펜, 발프로에이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
ㆍ 활성 결핵, 전신성 진균 질환, 또는 다른 만성 감염.
ㆍ 양성 HIV 검사 결과를 포함한 면역결핍 질환 이력.
ㆍ 추정된 GRF < 30 mL/분으로 정의된 만성 신부전.
ㆍ 적절하게 치료된 기저 세포 피부암, 편평 세포 피부암, 또는 동일반응계 자궁경부암을 제외하고, 지난 5년 이내의 암 이력.
ㆍ 이전 장기 이식.
ㆍ 기준선 및/또는 치료 결정 전 3 개월 미만에 발생하는 임의의 주요 수술 절차.
기준선 혈청 AAV8 NAb 역가 > 1:5, > 1:10. 다른 구현예에서, 임상 의사는 이들 신체적 특징(의료 이력) 중 하나 이상의 존재가 본원에 제공된 바와 같은 치료를 배제하지 않아야 함을 결정할 수 있다.
5.3. 투약 및 투여 경로
환자는 예를 들어, 약 20 내지 약 30 분에 걸쳐 예를 들어, 말초 정맥을 통해 주입에 의해 투여된 단일 용량의 rAAV.hLDLR을 받는다. 환자에게 투여되는 rAAV.hLDLR의 용량은 2.5 x 1013 GC/kg이다(oqPCR 또는 ddPCR에 의해 측정됨).
특정 구현예에서, 스테로이드와의 예방적 면역조절 공동-치료는 유전자 요법의 적어도 하루 전(-1 일), 또는 유전자 요법 전달 일(0 일)에 시작하고, 투약 후 약 8 주까지 계속된다. 특정 구현예에서, 예방적 공동-치료는 유전자 요법 전달의 적어도 하루 전 또는 당일에 시작하고 투약 후 약 13 주까지 점점 줄어드는 용량으로 계속된다. 임의적으로, 예방적 스테로이드 공동-요법은 벡터 투약 2 또는 3 일 전에 시작할 수 있다. 특정 구현예에서, 용량은 9 및 10 주 각각 동안 주 당 10 mg 용량 감소, 11, 12 및 13 주 각각 동안 주 당 5 mg 용량 감소로 점점 줄어든다. 특정 구현예에서, 예방적 스테로이드 레지멘은 또한 환자가 본원에 제공된 바와 같이 더 낮은 용량(예를 들어, 약 2.5 x 1012 GC/kg 내지 7.5 x 1012 GC/kg), 또는 더 높은 용량을 받을 때 전달된다. 특정 구현예에서, 또 다른 코르티코스테로이드가 프레드니손을 대체할 수 있다. 이러한 경우, 코르티코스테로이드 용량 등가물이 제공된다. 예를 들어, 40 mg 프레드니손에 대한 적합한 대안은 예를 들어, 베타메타손(약 6 mg), 코르티손(약 200 mg), 덱사메타손(약 6 mg), 하이드로코르티손(160 mg), 메틸프레드니솔론(약 32 mg), 프레드니솔론(약 40 mg), 또는 트리암시놀론(약 32 mg)을 포함할 수 있다. 다른 면역조절제 및 용량 등가물이 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 용량은 투약 하루 전(-1 일)에 시작한다. 시작 용량은 1 일 1 회 프레드니손 40 mg이며 점차 감소는 9 주에 시작하여 13 주 끝까지 계속된다. 첫번째 용량은 -1 일에 연구 벡터로 예정된 투약의 적어도 8 시간 전에 주어져야 한다.
연구 주별 프레드니손 용량
Figure pct00001
특정 구현예에서, 환자는 프레드니손 또는 용량 등가 코르티코스테로이드와의 공동-요법에서 적어도 2.5 x 1012 GC/kg 또는 7.5 x 1012 GC/kg, 또는 적어도 5 x 1011 GC/kg 내지 약 7.5 x 1012 GC/kg(oqPCR 또는 ddPCR에 의해 측정됨)을 포함하는 공동-요법을 받는다. 그러나, 다른 용량이 선택될 수 있다.
임의적으로, 추가의 면역조절제가 이 레지멘에서 활용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 추가의 면역조절제는 투약 후 도입된다.
바람직한 구현예에서, 사용되는 rAAV 현탁액은 HoFH의 이중 녹아웃 LDLR-/-Apobec-/- 마우스 모델(DKO 마우스)에 투여된 5 x 1011 GC/kg의 용량이 DKO 마우스에서 기준선 콜레스테롤 수준을 25% 내지 75%까지 감소시키도록 하는 효능을 갖는다.
일부 구현예에서, 환자에게 투여되는 rAAV.hLDLR의 용량은 2.5 x 1012 GC/kg 내지 7.5 x 1012 GC/kg 범위이다. 바람직하게는, 사용되는 rAAV 현탁액은 HoFH의 이중 녹아웃 LDLR-/-Apobec-/- 마우스 모델(DKO 마우스)에 투여된 5 x 1011 GC/kg의 용량이 DKO 마우스에서 기준선 콜레스테롤 수준을 25% 내지 75%까지 감소시키도록 하는 효능을 갖는다. 구체적 구현예에서, 환자에게 투여되는 rAAV.hLDLR의 용량은 적어도 5 x 1011 GC/kg 2.5 x 1012 GC/kg, 3.0 x 1012 GC/kg, 3.5 x 1012 GC/kg, 4.0 x 1012 GC/kg, 4.5 x 1012 GC/kg, 5.0 x 1012 GC/kg, 5.5 x 1012 GC/kg, 6.0 x 1012 GC/kg, 6.5 x 1012 GC/kg, 7.0 x 1012 GC/kg, 또는 7.5 x 1012 GC/kg이다.
일부 구현예에서, rAAV.hLDLR은 HoFH의 치료를 위해 하나 이상의 요법과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV.hLDLR은 스타틴, 에제티미브, 에제디아(ezedia), 담즙산 격리제, LDL 성분채집술, 혈장 성분채집술, 혈장 교환, 로미타피드, 미포머젠, 및/또는 PCSK9 억제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 HoFH를 치료하는 데 사용되는 표준 지질-저하 요법과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV.hLDLR은 니아신과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV.hLDLR은 피브레이트와 조합하여 투여된다.
5.4. 임상 목적 측정
투여 후 유전자 요법 벡터의 안전성은 벡터 투여 후 최대 약 52 주까지 다중 시점에 평가된 이상 반응(adverse event)의 수, 신체 검사에 기입된 변화, 및/또는 임상 실험실 매개변수에 의해 평가될 수 있다. 생리학적 효과가 더 일찍 예를 들어, 약 1 일 내지 1 주에 관찰될 수 있지만, 일 구현예에서, 정상 상태 수준 발현 수준은 약 12 주까지 도달된다.
rAAV.hLDLR 투여로 달성된 LDL-C 감소는 기준선과 비교하여 약 12 주, 또는 다른 원하는 시점에서 LDL-C의 정의된 변화율로 평가될 수 있다.
다른 지질 매개변수가 또한 기준선 값, 구체적으로 총 콜레스테롤(TC), 비-고밀도 지단백질 콜레스테롤(비-HDL-C), HDL-C, 공복 트리글리세리드(TG), 초저밀도 지단백질 콜레스테롤(VLDL-C), 지단백질(a)(Lp(a)), 아포지단백질 B(apoB), 및 아포지단백질 A-I(apoA-I)의 변화율과 비교하여 약 12 주, 또는 다른 원하는 시점에 평가될 수 있다. LDL-C가 감소되는 대사 메커니즘은 rAAV.hLDLR 투여 전 및 다시 투여 후 12 주에 LDL 동역학 연구를 수행함으로써 평가될 수 있다. 평가할 1차 매개변수는 LDL apoB의 분획별 대사율(FCR)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 rAAV.hLDLR 벡터는 환자가 이러한 임상 평가변수 중 적어도 하나를 달성하기 위해 충분한 LDLR 수준을 발현할 때 환자 결함이 있는 LDLR을 활성 LDLR로 "기능적으로 대체"하거나 또는 "기능적으로 보충"한다. 비-FH 환자에서 정상 야생형 임상 평가변수 수준의 최소 약 10% 내지 100% 미만을 달성하는 hLDLR의 발현 수준은 기능적 대체를 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 발현은 투약 후 빠르면 약 8 시간 내지 약 24 시간에 관찰될 수 있다. 상기 기재된 원하는 임상 효과 중 하나 이상은 투약 후 수 일 내지 수 주 내에 관찰될 수 있다.
장기(최대 260 주) 안전성 및 효능은 rAAV.hLDLR 투여 후 평가될 수 있다.
하기 섹션 6.4.1 내지 6.7에 기재된 표준 임상 실험실 평가 및 다른 임상 검정을 사용하여 이상 반응, 지질 매개변수의 변화율을 평가하는 효능 평가변수, 약역학 평가, 지단백질 동역학, ApoB-100 농도, 뿐만 아니라 rAAV.hLDLR 벡터에 대한 면역 반응을 모니터링할 수 있다.
하기 실시예는 단지 예시이며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
6. 실시예 1: 인간 대상체를 치료하기 위한 프로토콜
이 실시예는 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 유전자에서의 돌연변이로 인해 유전적으로 확인된 동형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(HoFH) 환자를 위한 유전자 요법 치료에 관한 것이다. 이 실시예에서, hLDLR을 발현하는 복제 결핍 아데노-연관 바이러스 벡터 8(AAV8)인 유전자 요법 벡터 AAV8.TBG.hLDLR을 HoFH 환자에게 투여한다. 치료 효능은 이식유전자 발현에 대한 대리로서 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준을 사용하여 평가될 수 있다. 1차 효능 평가는 치료 후 약 12 주에 LDL-C 수준을 포함하며, 그후에 적어도 52 주 동안 효과가 지속된다. 장기 안전성 및 이식유전자 발현의 지속성은 간 생검 샘플에서 치료 후 측정될 수 있다.
6.1. 유전자 요법 벡터
유전자 요법 벡터는 간-특이적 프로모터(티록신-결합 글로불린, TBG)의 제어 하에 이식유전자 인간 저밀도 지단백질 수용체(hLDLR)를 발현하는 AAV8 벡터이며 이 실시예에서 AAV8.TBG.hLDLR로 지칭된다(도 7 참조). AAV8.TBG.hLDLR 벡터는 AAV 벡터 활성 성분 및 제형 완충액으로 이루어진다. 외부 AAV 벡터 구성요소는 1:1:18의 비율로 3 개의 AAV 바이러스 단백질 VP1, VP2, 및 VP3의 60 개 카피로 이루어진 혈청형 8, T = 1 정이십면체 캡시드이다. 캡시드는 단일 가닥 DNA 재조합 AAV(rAAV) 벡터 게놈을 함유한다. 게놈은 2 개의 AAV 도립된 말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 hLDLR 이식유전자를 함유한다. 인핸서, 프로모터, 인트론, hLDLR 코딩 서열 및 폴리아데닐화(polyA) 신호는 hLDLR 이식유전자를 포함한다. ITR은 벡터 생산 동안 게놈의 복제 및 패키징을 담당하는 유전적 요소이며 rAAV를 생성하는 데 필요한 유일한 바이러스 시스 요소이다. hLDLR 코딩 서열의 발현은 간세포-특이적 TBG 프로모터로부터 유도된다. 알파 1 마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서 요소의 2 개의 카피는 프로모터 활성을 자극하기 위해 TBG 프로모터에 선행한다. 키메라 인트론은 발현을 추가로 향상시키기 위해 존재하고 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화(polyA) 신호는 hLDLR mRNA 전사체의 종결을 매개하기 위해 포함된다. 이 벡터를 생산하는 데 사용된 pAAV.TBG.PI.hLDLRco.RGB의 서열은 서열번호: 6에 제공된다.
시험용 제제의 제형은 180 mM 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨, 0.001% 폴록사머 188, pH 7.3을 함유하는 수용액 중 적어도 1x1013 게놈 카피(GC)/mL이며 20 분(±5 분)에 걸쳐 주입에 의해 말초 정맥을 통해 투여된다.
6.2. 환자 집단
치료된 환자는 LDLR 유전자에 2 개의 돌연변이를 보유하는 동형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(HoFH)이 있는 성인이다. 환자는 18 세 이상의 남성 또는 여성일 수 있다. 환자는 HoFH와 일치하는 임상 제시 설정으로 두 대립유전자에서 분자적으로 정의된 LDLR 돌연변이를 가지며, 미치료된 LDL-C 수준, 예를 들어, 300 mg/dl 초과의 LDL-C 수준, 치료된 LDL-C 수준, 예를 들어, 300 mg/dl 미만의 LDL-C 수준 및/또는 500 mg/dl 초과의 총 혈장 콜레스테롤 수준 및 조기 및 공격적인 죽상동맥경화증을 포함할 수 있다. 치료된 환자는 스타틴, 에제티미브, 담즙산 격리제, PCSK9 억제제와 같은 지질-저하 약물, 및 LDL 성분채집술 및/또는 혈장 성분채집술로 동시에 치료를 받을 수 있다.
치료되는 환자는 기준선 혈청 AAV8 중화 항체(NAb) 역가가 ≤ 1:10일 수 있다. 환자가 기준선 혈청 AAV8 중화 항체(NAb) 역가가 ≤ 1:10이 아닌 경우, 환자는 형질도입 기간 동안 일시적으로 면역억제제로 공동-치료될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 더 높거나(예를 들어, ≤ 1:5 내지 ≤1:15, 또는 ≤1:20) 또 더 낮은(예를 들어, ≤ 1:2 내지 ≤1:5) AAV8 중화 항체 역가를 가질 수 있다. 공동-요법을 위한 면역억제제는 스테로이드, 항대사물, T-세포 억제제, 및 알킬화제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
대상체는 임상 의사의 재량에 따라 유전자 요법 치료 전 및 동시에 표준 치료(들)(예를 들어, LDL 성분채집술 및/또는 혈장 교환, 및 다른 지질 저하 치료)를 계속하도록 허용될 수 있다. 대안으로, 의사는 유전자 요법 치료를 투여하기 전에 표준 치료를 중단하고, 임의적으로, 유전자 요법의 투여 후에 공동-요법으로서 표준 치료를 재개하는 것을 선호할 수 있다. 유전자 요법 레지멘의 바람직한 평가변수는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 감소 및 유전자 요법 치료의 투여 후 기준선에서 최대 약 12 주까지 LDL 아포지단백질 B(apoB)의 분획별 대사율(FCR)의 변화이다.
또한 다른 구현예에서, 바람직한 평가변수는 LDL 성분채집술에 대한 필요성의 감소를 포함하고/하거나 혈장 성분채집술이 바람직한 평가변수이다. 용어 "LDL 성분채집술"은 LDL이 투석과 유사한 과정을 사용하여 혈류로부터 제거되는 과정인 저밀도 지단백질(LDL) 성분채집술을 지칭하는 데 사용된다. LDL 성분채집술은 환자의 혈액으로부터 LDL 콜레스테롤을 제거하는 절차이다. LDL-성분채집술 절차 동안, 혈액 세포가 혈장으로부터 분리된다. 특수 필터를 사용하여 LDL 콜레스테롤을 혈장으로부터 제거하고, 여과된 혈액을 환자에게 돌려 보낸다. 단일 LDL 성분채집술 치료는 혈액으로부터 유해한 LDL 콜레스테롤의 60-70%를 제거할 수 있다. 현재 미국 식품의약국에 의해 승인된 두 가지 기계가 있다. Liposorber는 덱스트란으로 덮인 필터를 사용하며, 이는 LDL에 부착하여 혈행에서 제거한다. 다른 기계는 HELP라 불리며 LDL을 제거하기 위해 헤파린을 사용한다. 이러한 기계 중 어떤 것도 HDL(좋은) 콜레스테롤의 양에 유의한 변화를 유발하지 않는다. 이들은 현재 LDL 콜레스테롤이 2000 ng/mdl 이상이며 관상 동맥 질환 이력이 있는 환자 및 LDL 콜레스테롤 수준이 300 mg/dl 이상이며 관상 동맥 질환이 없는 환자에게 승인되고 있다. 예를 들어, 미국 성분채집술 학회(American Society for Apheresis), www.apheresis.com, 및 http://c.ymcdn.com/sites/www.apheresis.org/resource/resmgr/-fact_sheets_file/ldl_apheresis.pdf 참조. 또한, 국제 성분채집술 협회(World Apheresis Association)[http://worldapheresis.org/] 및 국립 지질 협회(National Lipid Association)(USA)[https://www.lipid.org/] 참조. 특정 구현예에서, LDL에 대해 비선택적인 혈장 성분채집술(혈장반출법)은 유전자 요법 치료 전에 사용될 수 있고 이러한 치료에 대한 필요성은 LDL 성분채집술에 대해 본원에 기재된 바와 같이 감소될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 성분채집술의 "감소"는 환자가 성분채집술을 받아야 할 필요가 있는 개월 및/또는 년의 횟수 감소를 지칭한다. 이러한 감소는 rAAV8-hLDLR 요법 전에 사용된 성분채집술의 수준과 비교하여 요법 후 성분채집술 치료가 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%(예를 들어, 필요성 제거) 적을 수 있다. 예를 들어, rAAV8.hLDLR로 매주 성분채집술 전처리를 받은 선택된 환자는 단지 2 주마다, 매월, 또는 치료 후 덜 빈번하게 성분채집술을 필요로 할 수 있다. 또 다른 예에서, rAAV8.hLDLR로 월 2 회 성분채집술 전처리를 받은 선택된 환자는 단지 매월, 격월, 분기, 또는 치료 후 덜 빈번하게 성분채집술을 필요로 할 수 있다. 여전히 다른
특정 구현예에서, 바람직한 평가변수는 환자를 치료하는 데 사용되는 PCSK9 억제제의 용량 감소를 포함하는 것이 바람직한 평가변수이다. 본원에 사용된 바와 같이, 성분채집술의 "감소"는 환자가 성분채집술을 받아야 할 필요가 있는 개월 및/또는 년의 횟수 감소를 지칭한다. 이러한 감소는 rAAV8-hLDLR 요법 전에 사용된 PCSK9 억제제 수준과 비교하여 요법 후 필요한 PCSK9 억제제가 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%(예를 들어, 필요성 제거) 적을 수 있다. 예를 들어, HoFH 환자를 PCSK9 억제제 사전-rAAV8.hLDLR 요법(예를 들어, 300 mg - 500 mg 용량 투약)으로 한 달에 1 회 주입으로 치료하면 PCSK9 억제제를 사용한 치료를 HeFH 환자와 일치하는 치료 수준까지 감소시키는 능력을 초래할 수 있다. 이는 환자가 덜 방해가 되는 요법(예를 들어, 고용량 주입에 대한 필요성 제거)을 받을 수 있도록 할 수 있다. 예를 들어, 주입 당 420 mg을 매월 주입하기 보다는, 환자는 한 달에 1 회 또는 2 주마다(HeFH 용량), 또는 덜 빈번하게 주사기 또는 자동주사기를 사용한 낮은 용량(예를 들어, 100 - 140 ng/mL)의 투여를 선택할 수 있다.
6.3. 투약 및 투여 경로
환자는 주입에 의해 말초 정맥을 통해 투여된 단일 용량의 AAV8.TBG.hLDLR을 받는다. 환자에게 투여되는 AAV8.TBG.hLDLR의 용량은 약 2.5x1012 GC/kg 또는 7.5x1012 GC/kg이다. 빈 캡시드가 환자에게 투여된 AAV8.TBG.hLDLR의 용량으로부터 제거됨을 보장하기 위해, 빈 캡시드를 섹션 8.3.2.5에 논의된 바와 같이 벡터 정제 과정 동안 염화세슘 구배 초원심분리 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 벡터 입자로부터 분리한다.
6.4. 임상 목적 측정
ㆍ AAV8.TBG.hLDLR 투여로 달성된 LDL-C 감소는 기준선과 비교하여 약 12 주에 LDL-C의 정의된 변화율로 평가될 수 있다.
ㆍ 다른 지질 매개변수는 기준선 값, 구체적으로 총 콜레스테롤(TC), 비-고밀도 지단백질 콜레스테롤(비-HDL-C), HDL-C, 공복 트리글리세리드(TG), 초저밀도 지단백질 콜레스테롤(VLDL-C), 지단백질(a)(Lp(a)), 아포지단백질 B(apoB), 및 아포지단백질 A-I(apoA-I)의 변화율과 비교하여 약 12 주에 평가될 수 있다.
ㆍ LDL-C가 감소되는 대사 메커니즘은 벡터 투여 전 및 다시 투여 후 약 12 주에 LDL 동역학 연구를 수행함으로써 평가될 수 있다. 평가될 1차 매개변수는 LDL apoB의 분획별 대사율(FCR)이다.
ㆍ 장기(최대 52 주 또는 최대 260 주) 안전성 및 효능은 AAV8.TBG.hLDLR 투여 후 평가될 수 있다
6.4.1. 수행될 수 있는 표준 임상 실험실 평가:
다음 임상 프로필을 치료 전 및 후에 테스트할 수 있다:
ㆍ 생화학적 프로필: 나트륨, 칼륨, 염화물, 이산화탄소, 글루코스, 혈액 요소 질소, 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 크레아티닌, 크레아티닌 포스포키나제, 칼슘, 총 단백질, 알부민, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 알칼린 포스파타제, 총 빌리루빈, GGT.
ㆍ CBC: 백혈구(WBC) 수, 헤모글로빈, 적혈구용적률(hematocrit), 혈소판 수, 적혈구 분포 폭, 평균 혈구 용적, 평균 혈구 헤모글로빈, 및 평균 혈구 헤모글로빈 농도.
ㆍ 응고: PT, INR, PTT(스크리닝 및 기준선에서, 및 필요에 따라.
ㆍ 소변검사: 소변 색, 탁도, pH, 글루코스, 빌리루빈, 케톤, 혈액, 단백질, WBC.
6.4.2. 관심 이상 반응
다음 임상 검정을 사용하여 독성을 모니터링할 수 있다:
ㆍ 간 손상
o 빌리루빈 또는 간 효소(AST, ALT, AlkPhos)에 대한 CTCAE v4.0 등급 3 이상의 실험실 결과.
o 빌리루빈 및 AlkPhos CTCAE v4.0 등급 2(빌리루빈 >1.5xULN; AlkPhos >2.5xULN).
ㆍ 간세포독성(즉, "Hy의 법칙"에 대한 기준 충족)
o AST 또는 ALT의 경우 ≥ 3 x ULN(정상 상한치), 및
o 상승된 알칼린 포스파타제 없이 > 2 x ULN 혈청 총 빌리루빈, 및
o 증가된 총 빌리루빈과 조합된 증가된 트랜스아미나제 수준을 설명하는 다른 이유를 찾을 수 없다.
추가로, 추정된 T-세포 매개 면역 트랜스아미니티스(transaminitis)(>2x 기준선 AND 1xULN)에 대한 코르티코스테로이드 요법을 촉발시킬 수 있는 ALT 또는 AST 상승이 표시되고 보고될 것이다.
6.5. 효능 평가변수
AAV8.TBG.hLDLR의 투여 후 약 12 주에 지질 매개변수의 변화율 평가를 평가하고 기준선과 비교할 수 있다. 이는 다음을 포함한다:
ㆍ 직접 측정된 LDL-C의 변화율(1차 효능 평가변수).
ㆍ 총 콜레스테롤, VLDL-C, HDL-C, 계산된 비-HDL-콜레스테롤의 변화율, 트리글리세리드, apoA-I, apoB, 및 Lp(a)의 변화.
기준선 LDL-C 값을 AAV8.TBG.hLDLR의 투여 전에 2 개의 별도의 경우에 공복 상태 하에 수득된 LDL-C 수준의 평균으로 계산하여 실험실 및 생물학적 가변성을 제어하고 신뢰가능한 효능 평가를 보장할 수 있다.
6.5.1. 약역학/ 효능 평가
다음 효능 실험실 테스트를 공복 상태 하에 평가할 수 있다:
ㆍ 직접 측정된 LDL-C
ㆍ 지질 패널: 총 콜레스테롤, LDL-C, 비-HDL-C, HDL-C, TG, Lp(a)
ㆍ 아포지단백질: apoB 및 apoA-I.
추가로, 임의의 LDL apoB 동역학을 치료 전 및 치료 후 12 주에 결정할 수 있다. 지질 저하 효능을 벡터 투여 후 약 12, 24 및 52 주에 기준선으로부터의 변화율로 평가할 수 있다. 기준선 LDL-C 값은 투여 전 2 개의 별도의 경우에 공복 상태 하에 수득된 LDL-C 수준을 평균화함으로써 계산한다. 벡터 투여 후 12 주에 LDL-C에서 기준선으로부터의 변화율은 유전자 전달 효능의 주요 척도이다.
ㆍ 기준선에서 벡터 투여 후 12 주까지 LDL-apoB 분획별 대사율의 변화. 추가의 apoB 동역학 매개변수가 또한 고려될 것이다.
ㆍ AAV8.hLDLR의 투여 후 12 주, 24 주, 52 주 및 매년 최대 260 주에 절대 LDL-C 수준.
ㆍ AAV8. hLDLR의 투여 후 24 주, 52 주 및 매년 최대 260 주에 기준선으로부터 LDL-C 및 다른 지질 매개변수의 변화율
ㆍ AAV8.hLDLR의 투여 후 12 주, 24 주, 52 주에 200 mg/dl 미만의 절대 LDL-C 수준을 달성하는 대상체의 백분율.
ㆍ AAV8.hLDLR의 투여 후, 12 주, 24 주, 36 주, 52 주에 이전의 복용을 재개하지 않거나 또는 임의의 새로운 지질 저하 치료를 시작하지 않은 대상체의 수.
ㆍ 스크리닝 전에 지질 성분채집술을 받은 대상체의 경우, 연구 동안 언제든지 성분채집술 치료의 빈도 변화를 경험한 대상체의 수.
ㆍ PCSK9 억제제를 받은 대상체의 경우, AAV8.hLDLR의 투여 전에 PCSK9 억제제로 달성된 LDL-C와 비교하여 AAV8. hLDLR의 투여 후 달성된 LDL-C.
ㆍ 기준선에서 황색종을 설명하기 쉬운 대상체의 경우, AAV8.hLDLR의 투여 후 12 주 및 24 주에 임상 제시의 수, 크기 또는 정도의 개선이 문서화된 대상체의 수.
6.6. 지단백질 동역학
지단백질 동역학 연구는 LDL-C가 감소되는 대사 메커니즘을 평가하기 위해 벡터 투여 전 및 다시 투여 후 12 주 후에 수행될 수 있다. 평가할 1차 매개변수는 LDL-apoB의 분획별 대사율(FCR)이다. apoB의 내인성 표지화는 중수소화 류신의 정맥내 주입 후, 48 시간에 걸친 혈액 샘플링에 의해 달성된다.
6.6.1. ApoB-100 단리
VLDL, IDL 및 LDL은 D3-류신 주입 후 채취된 시한 샘플의 순차적 초원심분리에 의해 단리된다. Apo B-100은 Tris-글리신 완충 시스템을 사용하여 분취용 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)에 의해 이러한 지단백질로부터 단리된다. 개별 apoB 종 내의 ApoB 농도는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정된다. 총 apoB 농도는 자동 면역탁도 검정을 사용하여 결정된다.
6.6.2. 동위원소 농축 결정
ApoB-100 밴드를 폴리아크릴아미드 겔로부터 절제한다. 절제된 밴드를 12N HCl에서 100℃에서 24 시간 동안 가수분해한다. 아미노산을 기체 크로마토그래프/질량 분광계를 사용하여 분석하기 전에 N-이소부틸 에스테르 및 N-헵타플루오로부티르아미드 유도체로 전환한다. 동위원소 농축(백분율)을 관찰된 이온 전류 비로부터 계산한다. 이 형식의 데이터는 방사성추적자 실험에서 특이적 방사능과 유사하다. 각 대상체는 이 절차 동안 apoB-100 대사와 관련하여 정상 상태에서 유지되는 것으로 추정된다.
6.7. AAV8 평가에 대한 약동학 및 면역 반응
다음 테스트를 사용하여 약동학, AAV 벡터에 대한 사전 면역 및 AAV 벡터에 대한 면역 반응을 평가할 수 있다:
ㆍ 면역 반응 모니터링: AAV8 NAb 역가; AAV8 벡터에 대한 T-세포 반응; hLDLR에 대한 T-세포 반응.
ㆍ 벡터 농도: PCR에 의해 벡터 게놈으로 측정된 혈장 내 AAV8 농도.
ㆍ 인간 백혈구 항원 타이핑(HLA 유형): HLA 유형은 클래스 I 및 HLA DRB1/DRB345의 경우 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 클래스 II의 경우 DQB1 및 DPB1의 고해상도 평가에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 데옥시리보핵산(DNA)에서 평가된다. 이 정보는 AAV8 캡시드 또는 LDLR 이식유전자에 대한 잠재적인 T 세포 면역 반응과 특이적 HLA 대립유전자의 상관관계를 허용하여, T 세포 반응의 강도 및 시한의 개별 가변성을 설명하는 데 도움이 된다.
6.8 황색종 평가
신체 검사는 임의의 황색종의 식별, 검사 및 설명을 포함한다. 황색종 위치 및 유형, 즉, 피부, 눈꺼풀(눈), 결절, 및/또는 힘줄의 기록이 결정된다. 가능한 경우, 미터 자 또는 캘리퍼를 사용하여 신체 검사 동안 황색종의 크기(최대 및 최소 정도)를 기록한다. 가능한 경우, 가장 광범위하고 용이하게 식별가능한 황색종의 디지털 사진은 병변 옆에 테이프 자(밀리미터로 측정)가 배치되어 만들어진다.
7. 실시예 2: 전임상 데이터
HoHF 및 기존 체액 면역의 동물 모델에 대한 AAV8.TBG.hLDLR의 효과를 연구하기 위해 비임상 연구를 수행하였다. 콜레스테롤 감소를 측정하는 소형 및 대형 동물 모델에서 다중 단일 용량 약리학 연구를 수행하였다. 추가로, LDLR 및 Apobec1이 둘 다 결핍되어 있고, 사료 식이에서도 apoB-100-함유 LDL의 상승으로 인해 심각한 고콜레스테롤혈증이 발생하고, 광범위한 죽상동맥경화증이 발생하는 이중 녹아웃 LDLR-/- Apobec1-/- 마우스 모델(DKO)에서 죽상동맥경화증의 퇴행을 측정하였다. 이들 데이터를 사용하여 최소 유효 용량을 결정하고 인간 연구를 위한 용량 선택을 적절하게 정당화하였다. 인간 연구를 위한 적절한 용량을 추가로 특성화하고 잠재적인 안전성 신호를 식별하기 위해, 비-인간 영장류(NHP) 및 HoFH 마우스 모델에서 독성학 연구를 수행하였다.
7.1 기존 체액 면역: 간에 AAV-매개 유전자가 전달되는 효과
이 연구의 목표는 레서스 및 시노몰구스 원숭이에서 AAV8 캡슐화된 벡터를 사용하여 AAV에 대한 기존 체액 면역이 간 지정 유전자 전달에 미치는 영향을 평가하는 것이었다. 21 마리의 레서스 및 시노몰구스 원숭이를 AAV8에 대한 기존 면역 수준에 대해 사전 스크리닝된 대규모 동물 집단으로부터 선택하였다. 동물은 넓은 연령 분포를 나타내었고 모두 수컷이었다. 이러한 연구는 중화 항체(NAb)를 낮은 수준에서 검출불가능한 수준으로 갖지만 AAV8 NAb 역가가 최대 1:160인 더 제한된 수를 포함하는 동물에 초점을 맞추었다. 동물에게 말초 정맥 주입을 통해 간-특이적 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터로부터 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하는 AAV8 벡터 3x1012 GC/kg을 주입하였다. 동물을 7 일 후에 부검하였고 EGFP 발현 및 AAV8 벡터 게놈의 간 표적화에 대해 조직을 평가하였다(도 1). NHP 혈청에서 AAV8에 대한 기존 NAb를 시험관내 형질도입 억제 검정을 사용할 뿐만 아니라 수동 전달 실험의 맥락에서 평가하였으며, 여기서 NHP로부터의 혈청을 벡터 투여 전 및 동시에 마우스에 주입하여 생체내에서 간 지정 유전자 전달에 대한 기존 AAV8 NAb의 영향을 평가하였다(Wang 등, 2010 Molecular Therapy 18(1): 126-134).
AAV8에 대한 기존 NAb를 검출불가능한 수준에서 낮은 수준으로 갖는 동물은 형광 현미경(도 1) 및 ELISA에 의한 EGFP 검출, 뿐만 아니라 간에서 벡터 DNA 정량화에 의해 입증된 바와 같이, 간에서 높은 수준의 형질도입을 나타내었다. HoFH의 효능 면에서 형질도입의 가장 유용한 척도는 형질도입된 간세포의 퍼센트이며, 이는 기존 NAb의 부재 하에 17%(4.4% 내지 40% 범위)였다. 이는 동일한 용량의 벡터에서 마우스에서 관찰된 효율에 가장 가깝다. 간 세포의 형질도입에 유의하게 영향을 미치는 기존 NAb의 T 역치 역가는 ≤ 1:5였다(즉, 1:10 이상의 역가는 형질도입을 실질적으로 감소시킴). 간 형질도입의 항체-매개 억제는 간에서 감소된 AAV 게놈과 직접적으로 상관관계가 있다. 인간 혈청을 AAV8에 대한 기존 NAb의 증거에 대해 스크리닝하였고 결과는 성인의 약 15%가 ≤ 1:5를 초과하는 AAV8에 대한 NAb를 가짐을 시사한다. 또한, 이는 높은 수준의 NAb가 벡터의 생체분포 변화와 연관되어, NAb가 비장 형질도입을 증가시키지 않고 벡터 게놈의 비장으로의 침착을 증가시키면서 간 유전자 전달을 감소시키도록 한다는 것을 나타내었다.
7.2 HoFH 마우스 모델에서 혈청 콜레스테롤에 대한 AAV8.TBG.mLDLR의 효과
DKO 마우스(6 내지 12 주령 수컷)에게 AAV8.TBG.mLDLR을 IV 주사하고 대사 보정 및 기존 죽상동맥경화증 병변의 반전을 추적하였다. 동물을 또한 혈청 트랜스아미나제의 총 임상 독성 및 이상에 대해 평가하였다. LDLR의 마우스 버전을 DKO 마우스에 벡터 투여를 위해 활용하였다.
마우스 당 1011 GC(5x1012 GC/kg)를 받은 마우스는 180 일 동안 안정된 고콜레스테롤혈증의 거의 완전한 정규화를 나타내었다(도 2). 설치류에서 최고 용량으로 벡터 주입 후 최대 6 개월 동안 ALT 수준의 상승 또는 비정상적인 간 생화학은 관찰되지 않았다(Kassim 등, 2010, PLoS One 5(10): e13424).
7.3 HoFH 마우스 모델의 죽상경화성 병변에서 고지방 식이에 대한 AAV8.TBG.mLDLR의 효과
LDLR의 AAV8-매개 전달이 총 콜레스테롤의 유의한 저하를 유도하였음을 고려할 때, mLDLR의 AAV8-매개 발현을 개념 입증 연구에서 설명하여 죽상경화성 병변에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하였다(Kassim 등, 2010, PLoS One 5(10): e13424). 3 그룹의 수컷 DKO 마우스에게 고지방 식이를 공급하여 죽상동맥경화증의 진행을 촉진하였다. 2 개월 후, 1 그룹의 마우스는 5x1012 GC/kg의 대조군 AAV8.TBG.nLacZ 벡터를 단일 IV 주사로 받았고, 1 그룹은 5x1012 GC/kg의 AAV8.TBG.mLDLR 벡터를 단일 IV 주사로 받았으며, 세번째 비-개입 그룹은 죽상동맥경화증 병변 정량화를 위해 부검하였다. 벡터를 받은 마우스는 추가 60 일 동안 고지방 식이를 유지하였고 이후에 부검하였다.
AAV8.TBG.mLDLR 벡터를 받은 동물은 기준선에서 1555 ± 343 mg/dl에서 처리 후 7 일에 266 ± 78 mg/dl 및 60 일에 67 ± 13 mg/dl까지 총 콜레스테롤의 급격한 하락을 달성하였다. 대조적으로, AAV8.TBG.nLacZ 처리된 마우스의 혈장 콜레스테롤 수준은 기준선에서 1566 ± 276 mg/dl에서 벡터 후 60 일에 측정하였을 때 1527 ± 67 mg/dl까지 사실상 계속 변하지 않았다. 모든 동물은 고지방 식이로 2 개월 후 혈청 트랜스아미나제의 약간 증가로 발전하였으며, 이는 AAV8.TBG.nLacZ 벡터 처리 후 계속 상승되었지만 AAV8.TBG.mLDLR 벡터 처리 후 정상 수준으로 3 배 감소하였다.
기존 죽상경화성 병변의 진화는 2 가지 독립적인 방법으로 평가되었다. 첫번째 방법에서 대동맥을 궁에서 장골 분지까지 개방하고 Oil Red O로 염색하였으며(도 3a); 형태계량학적 분석으로 대동맥의 전체 길이를 따라 Oil Red O로 염색된 대동맥의 퍼센트를 정량화하였다(도 3b). Oil Red O는 동결된 절편에서 중성 트리글리세리드 및 지질의 염색을 위해 사용되는 용성색소(지용성 염료) 디아조 염료이다. 이 염료로 대동맥을 염색하면 지질이 가득한 플라크를 시각화할 수 있다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 2 개월의 고지방 식이는 벡터 시점에서 기저 질환을 반영하는 대동맥의 2-%를 덮는 광범위한 죽상동맥경화증을 초래하며; 이는 AAV8.TBG.nLacZ 벡터 처리 후 추가 2 개월에 걸쳐 33%로 증가하여, 죽상동맥경화증에서 65% 추가 진행을 나타낸다. 대조적으로, AAV8.TBG.mLDLR 벡터 처리는 기준선에서 죽상동맥경화증으로 덮힌 20%의 대동맥에서 벡터 투여 60 일 후 죽상동맥경화증으로 덮힌 단지 2.6%의 대동맥까지, 죽상동맥경화증의 퇴행을 2 개월에 걸쳐 87%까지 야기하였다.
두번째 방법에서, 총 병변 영역을 대동맥 뿌리에서 정량화하였다(도 3c-f). 이 분석은 AAV8.TBG.nLacZ 주사된 마우스가 기준선 마우스에 비해 2 개월에 걸쳐 44% 진행을 나타낸 반면, AAV8.TBG.mLDLR 주사된 마우스가 기준선 마우스와 비교하여 병변에서 64% 퇴행을 나타내는 동일한 전반적인 경향을 입증하였다. 요약하면, AAV8.TBG.mLDLR의 주사를 통한 LDLR의 발현은 대동맥 내의 2 개의 상이한 부위에서 2 개의 독립적인 정량화 방법에 의해 평가된 바와 같이 2 개월에 걸쳐 콜레스테롤의 현저한 감소 및 죽상동맥경화증의 실질적인 퇴행을 유도하였다.
7.4 HoFH 마우스 모델에서 최소 유효 용량 평가
HoFH 집단에서 표현형 및 유전자형 사이의 상관관계의 광범위한 연구는 단지 25-30%의 LDL 및 총 콜레스테롤의 차이가 임상 결과의 실질적인 차이를 의미함을 입증하였다(Bertolini 등 2013, Atherosclerosis 227(2): 342-348; Kolansky 등 2008, Am J Cardiol 102(11): 1438-1443; Moorjani 등 1993, The Lancet 341(8856): 1303-1306). 더욱이, 30% 미만의 LDL-C 감소와 연관된 지질-저하 치료는 HoFH 환자의 심혈관 사건 지연 및 생존 연장을 의미한다(Raal 등 2011, Circulation 124(20): 2202-2207). 최근에, FDA는 1차 평가변수가 기준선으로부터 20 내지 25%의 LDL-C 감소인 HoFH의 치료를 위한 약물 미포머젠을 승인하였다(Raal 등 2010, Lancet 375(9719): 998-1006).
이러한 배경에 대하여, 하기 논의된 유전자 요법 마우스 연구에서 최소 유효 용량(MED)은 기준선보다 적어도 30% 낮은 혈청 내 총 콜레스테롤을 통계적으로 유의하고 안정한 감소를 야기하는 벡터의 최저 용량으로 정의되었다. MED는 다수의 상이한 연구에서 평가되었으며 각 실험에 대한 간략한 설명이 하기 제공된다.
7.4.1. DKO 마우스에서 AAV8.TBG.mLDLR의 POC 용량-범위 연구
DKO 마우스에서 AAV8.TBG.mLDLR 및 AAV8.TBG.hLDLR의 개념 입증 용량-범위 연구를 수행하여 추가 연구를 위한 적합한 용량을 식별하였다. 이러한 연구에서, DKO 수컷 마우스에게 1.5 내지 500x1011 GC/kg 범위의 상이한 용량의 AAV8.TBG.mLDLR을 IV 주사하고 혈장 콜레스테롤 감소를 추적하였다(Kassim 등, 2010, PLoS One 5(10): e13424). 이러한 연구 실험에 사용된 GC 용량(1.5 내지 500 x 1011)은 정량적 PCR(qPCR) 역가에 기초하였다. 최대 30%의 혈장 콜레스테롤의 통계적으로 유의한 감소가 21 일에 1.5x1011 GC/kg의 AAV8.TBG.mLDLR 용량에서 관찰되었으며, 더 많은 용량의 벡터에 비례하여 더 큰 감소가 달성되었다(Kassim 등, 2010, PLoS One 5(10): e13424). 대사 보정 후 수확된 간 조직의 분석은 벡터의 용량에 비례하는 마우스 LDLR 이식유전자 및 단백질의 수준을 입증하였다. 따라서, 용량-반응 상관관계를 관찰하였다.
7.4.2. DKO 및 LAHB 마우스에서 AAV8.TBG.hLDLR의 용량-범위 연구
DKO 마우스에서 유사한 개념 입증 연구를 마우스 LDLR 유전자보다는 인간 LDL 수용체(hLDLR) 유전자를 함유하는 벡터로 수행하였다. hLDLR 벡터를 사용한 결과는 벡터의 용량이 간에서 이식유전자의 발현 및 벡터 게놈의 침착에 비례하였다는 점에서 mLDLR을 사용하여 관찰된 결과와 매우 유사하였다(Kassim 등 2013, Hum Gene Ther 24(1): 19-26). 주요 차이는 효능에 있었으며, 인간 LDLR 벡터는 이 모델에서 덜 강력하였다. 적어도 30%에 가까운 콜레스테롤 감소가 5x1012 GC/kg 및 5x1011 GC/kg(qPCR 역가에 기초한 용량)에서 달성되었지만 통계적 유의성은 더 높은 용량에서만 달성되었다.
관찰된 감소된 효능은 마우스 ApoB에 대한 인간 LDLR의 감소된 친화성에 기인하였다. 이 문제를 우회하기 위해, 인간 ApoB100을 발현하는 LAHB 마우스 모델을 사용하여 연구를 반복하였으며, 따라서, 인간 연구와 관련하여 인간 LDLR과 인간 apoB100의 상호작용을 보다 확실하게 모델링하였다. 두 균주(DKO vs. LAHB)의 수컷 마우스는 AAV8.TBG.hLDLR의 3 가지 벡터 용량(qPCR 역가에 기초한 0.5x1011 GC/kg, 1.5x1011 GC/kg, 및 5.0x1011 GC/kg) 중 하나를 꼬리 정맥 주사로 받았다. 각 코호트로부터의 동물에서 0 일(벡터 투여 전), 7 일, 및 21 일에 채혈하고 혈청 콜레스테롤 수준 평가를 수행하였다. 인간 LDLR은 DKO 마우스의 mLDLR에 비해 LAHB 마우스에서 훨씬 더 효과적이었다: 혈청 콜레스테롤의 30% 감소가 1.5x1011 GC/kg의 용량에서 달성되었으며, 이는 DKO 동물에서 마우스 LDLR 작제물의 이전 연구로 달성된 효능과 동일하였다(Kassim 등 2013, Hum Gene Ther 24(1): 19-26).
7.4.3. HoFH 마우스 모델에서 AAV8.TBG.mLDLR 및 AAV8.TBG.hLDLR의 비-임상 약리학/독성학 연구
6-22 주령의 수컷 및 암컷 DKO 마우스(n = 280, 수컷 140 마리 및 암컷 140 마리)에게 3 가지 벡터 용량의 AAV8.TBG.mLDLR(7.5x1011 GC/kg, 7.5x1012 GC/kg, 6.0x1013 GC/kg) 중 하나 또는 의도된 유전자 요법 벡터 AAV8.TBG.hLDLR(6.0x1013 GC/kg)의 하나의 용량을 꼬리 정맥 주사하였다. 섹션 8.4.1에서 본원에 기재된 oqPCR 적정 방법을 사용하여 체중 킬로그램 당 게놈 카피(GC)에 기초하여 동물에게 투여하였다. 동물의 추가 코호트는 PBS를 비히클 대조군으로 받았다. 각 코호트로부터의 동물을 3 일, 14 일, 90 일, 및 180 일에 희생시키고 혈청 콜레스테롤 수준을 평가하기 위해 혈액을 수집하였다(도 4).
모든 처리된 마우스 그룹에서 모든 부검 시점에 콜레스테롤의 빠르고 유의한 감소를 관찰하였다. 이 감소는 초기 시점에 저용량 벡터가 수컷보다 암컷에서 적은 것으로 보였지만, 이 차이는 시간 경과에 따라 감소하였고 결국 성별 간에 검출가능한 차이는 없었다. 각 그룹은 동일한 부검 시점에 PBS 대조군에 비해 적어도 30%의 혈청 콜레스테롤의 통계적으로 유의한 감소를 입증하였다. 따라서, 이 연구에 기초한 MED의 결정은 ≤7.5x1011 GC/kg이다.
7.4.4. 동형접합 가족성 고콜레스테롤혈증의 마우스 모델에서 AAV8.TBG.hLDLR의 효능 연구
12-16 주령의 수컷 DKO 마우스(n=40)에게 AAV8.TBG.hLDLR의 4 개의 용량(1.5x1011 GC/kg, 5.0x1011 GC/kg, 1.5x1012 GC/kg, 5.0x1012 GC/kg)(oqPCR 적정 방법에 기초한 용량) 중 하나를 IV 투여하였다. 동물에서 0 일(벡터 투여 전), 7 일, 및 30 일에 채혈하고 혈청 콜레스테롤을 평가하였다(도 5). 콜레스테롤의 빠르고 유의한 감소를 ≥5.0x1011 GC/kg로 처리된 마우스 그룹에서 7 및 30 일에 관찰하였다. 이 연구에 기초한 MED의 결정은 1.5x1011 GC/kg 내지 5.0x1011 GC/kg이다.
7.5. LDLR+/- 레서스 원숭이에서 고지방 식이에 대한 AAV8.TBG.rhLDLR의 효과
FH 원숭이에서 AAV8-LDLR 유전자 전달을 평가하도록 설계된 연구를 수행하였다. 1013 GC/kg의 AAV8.TBG.rhAFP(대조군 벡터; qPCR 적정 방법에 기초한 용량)를 지방 공급 또는 사료 공급 야생형 레서스 원숭이에게 투여한 후, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 값의 상승이 보이지 않았다. 이는 AAV8 캡시드 자체가 염증 또는 해로운 간 과정을 촉발하는 데 이겨하지 않음을 시사한다.
7.6. HoFH 마우스 모델에서 AAV8.TBG.hLDLR의 파일럿 생체분포 연구
HoFH에 대한 유전자 요법의 안전성 및 약역학 특성을 평가하기 위해, DKO 마우스에서 파일럿 생체분포(BD) 연구를 수행하였다. 이러한 연구는 5x1012 GC/kg(qPCR 적정 방법에 기초한 용량)의 AAV8.TBG.hLDLR 벡터가 다음 2 가지 경로 중 하나를 통해 전신으로 투여된 5 마리 암컷 DKO 마우스에서 벡터 분포 및 지속성을 조사하였다: 1) 꼬리 정맥으로 IV 주사 또는 2) 포털 내 주사. 2 개의 상이한 시점(3 일 및 28 일)에서, 조직 패널을 수확하고 총 세포 DNA를 수확된 조직으로부터 추출하였다. 이러한 파일럿 연구에서, IV 및 포털 내 경로 모두 비슷한 BD 프로필을 초래하였으며, 이는 말초 정맥을 통해 환자 및 동물에게 유전자 요법 벡터를 주입하는 근거를 뒷받침한다.
7.7. 독성학
HoFH에 대한 유전자 요법의 잠재적인 독성을 평가하기 위해, DKO 마우스(HoFH 마우스 모델), 및 야생형 및 LDLR+/- 레서스 원숭이에서 약리학/독성학 연구를 수행하였다. 연구는 사료 공급 야생형 및 LDLR+/- 레서스 원숭이에 대한 벡터 관련 독성에서 LDLR 이식유전자 발현의 역할 조사, HoFH 마우스 모델에서 AAV8.TBG.mLDLR 및 AAV8.TBG.hLDLR의 약리학/독성학 연구, 및 HoFH 마우스 모델에서 AAV8.TGB.hLDLR의 비-임상 생체분포의 조사를 포함한다. 이러한 연구는 하기에 상세하게 기재되어 있다.
7.8. 사료 공급 야생형 및 LDLR+/- 레서스 원숭이에서 벡터 관련 독성에 대한 LDLR 이식유전자 발현의 역할을 조사하는 비-임상 연구
4 마리 야생형 및 4 마리 LDLR+/- 레서스 원숭이에게 1.25x1013 GC/kg의 AAV8.TBG.hLDLR(oqPCR 적정 방법에 기초한 용량)을 IV 투여하고, 비 인간 영장류(NHP)를 벡터 투여 후 최대 1 년 동안 모니터링하였다. 4 마리 동물(야생형 2 마리 및 LDLR+/- 2 마리)을 벡터 투여 후 28 일에 부검하여 급성 벡터-관련 독성 및 벡터 분포를 평가하고 4 마리 동물(야생형 2 마리 및 LDLR+/- 2 마리)을 벡터 투여 후 364/365 일에 부검하여 장기 벡터-관련 병리 및 벡터 분포를 평가하였다. 야생형 및 LDLR+/- 원숭이의 각 코호트는 수컷 2 마리 및 암컷 2 마리를 가졌다.
동물은 장기 또는 단기 임상 후유증 없이 벡터 주입을 잘 견뎠다. 생체분포 연구는 간의 높은 수준 및 안정된 표적화가 훨씬 적지만, 여전히 검출가능한 간외 분포를 입증하였으며, 이는 시간 경과에 따라 감소하였다. 이러한 데이터는 효능에 대한 표적 기관인 간이 또한 잠재적인 독성의 가장 가능성 높은 공급원임을 시사하였다. 벡터 투여 후 28 및 364/365 일에 수행된 부검에서 수확된 조직의 상세한 검토는 간에서 일부 최소 내지 경미한 발견 및 LDLR+/- 원숭이에서 죽상동맥경화증의 일부 증거를 입증하였다. 간 병리의 속성 및 유사한 병리가 미처료된 야생형 동물 2 마리 중 1 마리에서 관찰되었다는 사실은 병리학자에게 테스트 물품과 관련이 없음을 시사하였다.
1 마리 동물은 벡터 투여 전에 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 지속적인 상승이 있었으며, 58 내지 169 U/L 범위의 수준에서 벡터 후여 후 계속되었다. 나머지 동물은 트랜스아미나제의 상승이 없거나 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 ALT가 단지 일시적이고 낮은 수준으로 증가하여, 103 U/L를 초과하지 않았음을 입증하였다. 가장 일관된 이상은 벡터 주입 후 발견되었으며, 이는 테스트 물품과 관련이 있음을 시사한다. 인간 LDLR 또는 AAV8 캡시드에 대한 T 세포의 활성화는 AST/ALT 증가와의 상관관계에 대해 평가되었다. 도 6은 관련 발견이 입증된 선택된 3 마리 동물에서 AAV 캡시드 ELISPOT 데이터 및 혈청 AST 수준을 제시한다. 1 마리의 동물만이 103 U/L로 AST의 증가가 캡시드에 대한 T 세포의 출현에 상응하는 상관관계를 나타내었으며(도 6, 동물 090-0263); AST가 즉시 정상 범위로 돌아오는 동안 캡시드 T 세포 반응이 지속되었다.
캡시드 및 이식유전자-특이적 T 세포의 존재에 대한 조직-유래 T 세포의 분석은 간 유래 T 세포가 나중 시점까지 두 유전자형(야생형 및 LDLR+/-)의 캡시드에 반응하게 되지만 인간 LDLR에 대한 T 세포가 나중 시점에 LDLR+/- 동물에서 검출되었음을 나타내었다. 이는 PBMC가 표적 조직에서 T 세포 구획을 반영하지 않음을 시사한다. 28 및 364/365 일에 수확된 간 조직을 RT-PCR에 의한 이식유전자의 발현에 대해 분석하였고 임상 병리의 이상 또는 T 세포의 출현에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다.
야생형 동물도 LDLR+/- 동물도 사료 식이에서 고콜레스테롤혈증이 발생하지 않았다. 1.25x1013 GC/kg(oqPCR에 기초)의 용량에서 용량 제한 독성(DLT)이 관찰되지 않았으며, 이는 최대 허용 용량(MTD)이 이 용량과 동일하거나 또는 더 클 것임을 암시한다. 트랜스아미나제의 상승과 관련된 테스트 물품을 관찰하였으며, 이는 적고 일시적이지만 그럼에도 존재한다. 따라서, 최대무독성용량(NOAEL)은 본원의 실시예 1에서 평가된 단일 고용량보다 적다.
7.9. HoFH 마우스 모델에서 AAV8.TBG.mLDLR 및 AAV8.TBG.hLDLR의 비-임상 약리학/독성학 연구
이 연구를 DKO 마우스에서 수행하였는데 이 균주를 사용하면 1) 독성과 동시에 개념 입증 효능의 평가, 및 2) LDLR의 결함과 관련된 임의의 병리 설정 및 관련된 이상지질혈증 및 지방증과 같은 후유증에서 벡터 관련 독성의 평가가 가능하기 때문이다.
연구는 실시예 1에 제시된 바와 같이 HoFH가 있는 인간 대상체에게 투여하기 위한 최고 용량보다 8-배 더 높은 최고 용량에서 AAV8.TBG.hLDLR을 테스트하도록 설계되었다. 뮤린 LDLR을 발현하는 벡터의 버전을 이 고용량, 뿐만 아니라 2 개의 낮은 용량에서 테스트하여, 콜레스테롤 감소 뿐만 아니라 독성 매개변수에 대한 용량 효과 평가를 제공하였다. 용량 반응 실험은 인간 LDLR 벡터를 사용하여 인간에서 관찰될 독성 및 효능을 더 반영하도록 뮤린 LDLR을 발현하는 벡터를 사용하여 수행하였다.
이 연구에서, 6-22 주령의 수컷 및 암컷 DKO 마우스에게 AAV8.TBG.mLDLR의 용량(7.5x1011 GC/kg, 7.5x1012 GC/kg 및 6.0x1013 GC/kg) 중 하나 또는 6.0x1013 GC/kg의 벡터(AAV8.TBG.hLDLR)(oqPCR 적정 방법에 기초한 용량)를 투여하였다. 동물을 벡터 투여 후 3 일, 14 일, 90 일, 및 180 일에 부검하였으며; 이러한 시간은 급성 및 만성 독성 뿐만 아니라 테스트 물품의 벡터 발현 프로필을 포착하기 위해 선택하였다. 혈청 콜레스테롤 수준을 측정하여 이식유전자 발현의 효능을 모니터링하였다. 동물을 포괄적인 임상 병리, 벡터에 대한 면역 반응(사이토카인, AAV8 캡시드에 대한 NAb, 캡시드 및 이식유전자 둘 다에 대한 T 세포 반응)에 대해 평가하였고, 부검 시 포괄적인 조직병리학적 검사를 위해 조직을 수확하였다.
이 연구로부터의 주요 독성 발견은 다음과 같다:
ㆍ 처리된 그룹에서 임상 후유증이 관찰되지 않았다
ㆍ 임상 병리:
o 트랜스아미나제: 이상은 1-4x ULN 범위인 간 기능 테스트 AST 및 ALT의 평가로 제한되었으며 주로 모든 용량의 뮤린 LDLR 벡터의 90 일에 발견되었다. 일부 수컷 동물에서 <2x ULN의 ALT를 제외하고, 고용량 인간 LDLR 벡터가 투여된 그룹에서 트랜스아미나제의 상승은 없었다. 마우스 벡터와 관련된 이상은 경미하고 용량 의존적이지 않았고, 따라서, 벡터와 관련이 있는 것으로 여겨졌다. 본질적으로 고용량 인간 벡터와 관련된 발견은 없었다. 이러한 발결에 기초한 치료 관련 독성의 증거는 없었으며, 이는 이러한 기준에 기초한 최대무독성용량(NOAEL)이 6.0x1013 GC/kg임을 의미한다.
ㆍ 병리: 총 병리 발견은 없었다. 조직병리는 다음과 같이 간에서 최소 또는 경미한 발견으로 제한되었다:
o PBS가 투여된 동물은 평가된 모든 기준에 따라 최소 및/또는 경미한 이상의 증거를 가졌다. 치료 관련 병리를 평가하는 데 있어서 본 발명자들은 PBS 주사된 동물에서 발견된 것보다 경미한 것으로 분류된 임의의 발견에 초점을 맞추었다.
o 마우스 및 인간 LDLR 벡터가 투여된 고용량 암컷 마우스에서 경미한 담관 과형성 및 동모양 세포 과형성이 관찰되었다. 이는 고용량에서만 관찰된 벡터 관련 효과를 나타낼 수 있다.
o 소엽중심성 비대는 수컷에서만 경미하고 벡터 관련되지 않았다고 주장하는 고용량의 벡터에서 그렇지 않았다.
o 최소 괴사는 고용량 인간 LDLR 벡터에서 180 일에 7 마리 수컷 중 1 마리 및 7 마리 암컷 중 3 마리에서 발견되었다.
o 고용량의 벡터에서 경미한 담관 및 동모양 과형성의 발견, 및 고용량 인간 LDLR 벡터에서 최소 괴사의 일부 예에 기초하여, 이러한 기준에 기초한 NOAEL은 7.5x1012 GC/kg 내지 6.0x1013 GC/kg이다.
ㆍ 다른 발견: 동물은 고용량의 인간 LDLR 벡터의 투여 후 캡시드 및 LDLR에 대한 IFN-γ ELISPOT에 기초하여 AAV8에 대한 NAb의 증가 및 매우 낮은 T 세포 반응의 증거를 발달시켰다. 벡터 후 3 및 14 일의 혈청 분석에 기초하여 급성 염증 반응의 증거는 거의 없었으며; 약간의 사이토카인은 적당하고 일시적 상승을 나타내었지만 IL6 증가는 없었다.
한 가지 주목할만한 발견은 독성이 인간 LDLR 벡터로 처리된 것보다 마우스 LDLR 벡터로 처리된 DKO 마우스에서 더 나쁘지 않았다는 것이며, 이는 인간 LDLR이 마우스 이식유전자보다 T 세포 면에서 더 면역원성인 경우일 수 있었다. ELISPOT 연구는 인간 이식유전자를 발현하는 고용량 벡터가 투여된 마우스에서 LDLR-특이적 T 세포의 일부 활성화를 나타내었지만,이들은 독성 데이터를 뒷받침하는 제한된 수의 동물에서 낮았으며, 숙주 반응의 이러한 메커니즘은 안정성 우려에 기여할 가능성이 없음을 시사하였다.
결론적으로, 용량 제한 독성이 없었으며, 이는 최대로 허용된 용량이 테스트된 최고 용량인 6.0x1013 GC/kg보다 더 높았음을 의미한다. 최고 용량의 간 병리에서 경미하고 가역적인 발결에 기초하여, NOAEL은 대략 6.0x1013 GC/kg(이때 간에서 경미한 가역적 병리 관찰됨) 내지 7.5x1012 GC/kg(이때 벡터 관련 발결의 명확한 징후 없음)까지 내려갔다.
7.10. HoFH 마우스 모델에서 AAV8.TGB.hLDLR의 비-임상 생체분포
6-22 주령의 수컷 및 암컷 DKO 마우스에게 실시예 1f에서 인간 대상체를 치료하기 위한 최고 용량인 7.5x1012 GC/kg(oqPCR 적정 방법에 의해 측정된 용량)의 AAV8.TBG.hLDLR을 IV 투여하였다. 동물은 벡터 투여 후 3 일, 14 일, 90 일, 및 180 일에 생체분포 평가를 위해 부검하였다. 혈액 이외에도, 20 개의 기관을 수확하였다. 기관 내 벡터 게놈의 분포는 수확된 총 게놈 DNA의 정량적 민감성 PCR 분석에 의해 평가하였다. PCR 검정 반응의 적절성을 평가하기 위해, 각 조직의 하나의 샘플은 알려진 양의 벡터 서열을 포함하여 대조군 DNA의 스파이크를 포함하였다.
간에서 벡터 GC 수는 다른 기관/조직에서보다 간에서 실질적으로 더 높았으며, 이는 AAV8 캡시드의 높은 간친화성 특성과 일치한다. 예를 들어, 간에서 벡터 게놈 카피는 90 일에 임의의 다른 조직에서 발견된 것보다 적어도 100배 더 컸다. 처음 3 가지 시점에서 수컷 또는 암컷 마우스 사이에 유의한 차이는 없었다. GC 수는 90 일까지 간에서 시간 경과에 따라 감소한 다음 안정화되었다. 유사한 감소 경향이 모든 조직에서 관찰되었지만 벡터 카피 수의 감소는 더 높은 세포 전환율을 갖는 조직에서 더 빨랐다. 낮지만 검출가능한 수준의 벡터 게놈 카피가 성 및 뇌 둘 다의 생식선에 존재하였다.
DKO 마우스에서 AAV8.TBG.hLDLR의 생체분포는 AAV8을 사용하여 공개된 결과와 일치하였다. 간은 IV 주입 후 유전자 전달의 표적 1차 표적이며 간에서의 게놈 카피는 시간 경과에 따라 유의하게 감소하지 않는다. 다른 기관은 벡터 전달을 위해 표적화되지만, 이러한 비-간 조직에서 유전자 전달 수준은 실질적으로 더 낮고 시간 경과에 따라 감소한다. 따라서, 본원에 제시된 데이터는 평가될 1차 기관 시스템이 간임을 시사한다.
7.11. 비-임상 안전성 연구 결론
레서스 원숭이 및 DKO 마우스 연구는 고용량 벡터가 NHP에서, 및 경미한 담관 및 동모양 비대의 일시적인 출현에 의해 마우스에서 트랜스아미나제의 일시적 상승에 의해 명백한 낮은 수준, 일시적, 및 무증상 간 병리와 관련됨을 확인하였다. 벡터로 인해 느껴질 다른 독성은 관찰되지 않았다.
원숭이에서 1.25x1013 GC/kg 및 DKO 마우스에서 6x1013 GC/kg의 높은 용량에서 DLT가 관찰되지 않았다. NOAEL의 결정은 주로 원숭이의 트랜스아미나제에서의 상승 및 DKO 마우스의 조직병리에 반영된 바와 같은 간 독성에 초점을 맞춘다. 이는 원숭이에서 1.25x1013 GC/kg 미만의 NOAEL 및 DKO 마우스에서 6x1013 GC/kg 미만이지만 7.5x1012 GC/kg 초과를 의미하였다. 용량은 oqPCR 적정 방법에 기초하였다.
7.12. 인간 치료를 지원하는 비-임상 데이터의 전반적인 평가
임상 연구를 위한 용량 선택 및 설계를 알려주는 약리학 및 독성학 연구에서 나온 주요 결과는 다음과 같다:
ㆍ 최소 유효 용량(MED): MED는 혈청 콜레스테롤에서 30% 감소를 초래하는 GC/kg 용량으로 비임상 연구에서 정의되었다. 2 개의 IND-가능 비임상 연구는 MED가 1.5 내지 5.0x1011 GC/kg이 되도록 확립하였다. 마우스 약리학/독성학 연구는 PBS 대조군에 비해 적어도 30%의 혈청 콜레스테롤의 통계적으로 유의한 감소를 입증하여, MED ≤ 7.5x1011 GC/kg를 추정하였다. 관찰된 용량-반응 관계는 MED를 oqPCR에 의해 측정된 바와 같이 1.5 내지 5.0x1011 GC/kg이 되도록 결정할 수 있었다.
ㆍ 최대 허용 용량(MTD): MTD는 용량 제한 독성(DLT)을 초래하지 않는 GC/kg 용량으로 비임상 연구에서 정의되었다. DLT는 oqPCR에 의해 결정된 바와 같이 DKO 마우스에서 6.0x1013 GC/kg 및 원숭이에서 1.25x1013 GC/kg인 테스트된 최고 용량으로 독성학 연구에서 관찰되지 않았다. 본 발명의 결과는 실제 MTD가 이들 용량보다 더 높음을 시사하였다.
6.0 Х 1013 GC/kg의 용량으로 AAV8.TBG.hLDLR이 주어진 마우스에서, 처리 3, 14, 90 또는 180 일 후에 부작용이 보이지 않았다. AAV8.TBG.hLDLR이 주어진 원숭이 및 마우스에서, 때때로 트랜스아미나제의 증가가 원숭이 및 마우스 둘 다에서 보고되었다. 마우스에서, AAV8.TBG.hLDLR 처리된 마우스에서 간에서의 최소 괴사는 180 일째에만 관찰되었다. 그러나, 이는 90 일째에 관찰되지 않았거나 또는 뮤린 이식유전자 산물이 주어진 임의의 동물에서 인간 이식유전자 산물에 대한 면역 반응과 관련되었을 수 있음을 시사할 가능성이 있다. AAV8.TBG.hLDLR이 주어진 마우스 또는 원숭이에서 명백한 부작용이 관찰되지 않았지만, ALT 및 AST에서의 최소 상승은 AAV가 간 효과를 도출하는 잠재력을 설명하는 임상 데이터에 따른다.
ㆍ 최대무독성용량(No Observed Adverse Event Level, NOAEL): 이는 DKO 마우스에서 7.5x1012 GC/kg인 것으로 결정되었다. 이는 인간 LDLR(hLDLR) 이식유전자의 더 높은 용량에서 관찰된 주로 간에서의 최소 내지 경미한 조직병리학적 발결(담관 및 동모양 과형헝, 최소 괴사)에 기초하였다. 원숭이에서 단지 하나의 용량만이 테스트되었지만; 1.25x1013 GC/kg에서 독성은 AST 및 ALT의 일시적이고 낮은 수준 증가를 포함하여 경미하였으며, 이는 실제 NOAEL이 테스트된 용량보다 낮은 용량에서 달성됨을 시사한다.
이들 데이터에 기초하여, 3 가지 단일 용량 코호트를 제안하였다: 2.5Х1012 GC/kg, 7.5Х1012 GC/kg, 및 2.5Х1013 GC/kg(oqPCR 방법에 기초한 용량). 이들 용량은 용량-반응을 알아낼 수 있고 비-임상 테스팅에 의해 뒷받침된 용량 범위를 나타내는 반-로그 단계별 증가를 나타낸다. 임상 프로토콜에서 예방적 코르티코스테로이드의 도입은 면역 매개 간세포 손상을 약화시키거나 또는 방지함으로써 생성물 투여의 안정성을 개선시킬 것으로 예상된다. T
8. 실시예 3: AAV8.TBG.hLDLR의 제조
AAV8.TBG.hLDLR 벡터는 AAV 벡터 활성 성분 및 제형 완충액으로 이루어진다. 외부 AAV 벡터 구성요소는 1:1:18의 비율로 3 개의 AAV 바이러스 단백질 VP1, VP2, 및 VP3의 60 개 카피로 이루어진 혈청형 8, T = 1 정이십면체 캡시드이다. 캡시드는 단일 가닥 DNA 재조합 AAV(rAAV) 벡터 게놈을 함유한다(도 7). 게놈은 2 개의 AAV 도립된 말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 인간 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 이식유전자를 함유한다. 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 LDLR 코딩 서열 및 폴리아데닐화(polyA) 신호는 인간 LDLR 이식유전자를 포함한다. ITR은 벡터 생산 동안 게놈의 복제 및 패키징을 담당하는 유전적 요소이며 rAAV를 생성하는 데 필요한 유일한 바이러스 시스 요소이다. 인간 LDLR 코딩 서열의 발현은 간세포-특이적 티록신-결합 글로불린(TBG) 프로모터로부터 유도된다. 알파 1 마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서 요소의 2 개의 카피는 프로모터 활성을 자극하기 위해 TBG 프로모터에 선행한다. 키메라 인트론은 발현을 추가로 향상시키기 위해 존재하며 토끼 베타 글로빈 polyA 신호는 인간 LDLR mRNA 전사체의 종결을 매개하기 위해 포함된다. 벡터는 제형 완충액 중 AAV8.TBG.hLDLR 벡터의 현탁액으로 공급된다. 제형 완충액은 180 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨, 0.001% 폴록사머 188, pH 7.3이다.
벡터 제조 및 벡터의 특성화에 대한 상세한 내용은 하기 섹션에 기재되어 있다.
8.1. AAV8.TBG.hLDLR의 생산에 사용되는 플라스미드
AAV8.TBG.hLDLR의 생산을 위해 사용되는 플라스미드는 다음과 같다:
8.1.1 시스 플라스미드(벡터 게놈 발현 작제물):
인간 LDLR 발현 카세트를 함유하는 pENN.AAV.TBG.hLDLR.RBG.KanR(도 8). 이 플라스미드는 rAAV 벡터 게놈을 암호화한다. 발현 카세트에 대한 polyA 신호는 토끼 β 글로빈 유전자로부터 유래된다. 알파 1 마이크로글로불린 /비쿠닌 인핸서 요소의 2 개의 카피는 TBG 프로모터에 선행한다.
AAV8.TBG.hLDLR의 생산을 위해 사용되는 시스 플라스미드를 생성하기 위해, 인간 LDLR cDNA를 AAV2 ITR-함유 작제물인 pENN.AAV.TBG.PI에 클로닝하여 pENN.AAV.TBG.hLDLR.RBG를 생성하였다. pENN.AAV.TBG.PI의 플라스미드 백본은 원래 pKSS-기반 플라스미드인 pZac2.1로부터 유래하였다. pENN.AAV.TBG.hLDLR.RBG의 암피실린 내성 유전자를 절제하고 카나마이신 유전자로 대체하여 pENN.AAV.TBG.hLDLR.RBG.KanR을 생성하였다. 인간 LDLR cDNA의 발현은 키메라 인트론이 있는 TBG 프로모터(Promega Corporation, 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 유도된다. 발현 카세트에 대한 polyA 신호는 토끼 β 글로빈 유전자로부터 유래된다. 알파 1 마이크로글로불린 /비쿠닌 인핸서 요소의 2 개의 카피는 TBG 프로모터에 선행한다.
서열 요소의 설명
1. 도립된 말단 반복부(ITR): AAV ITR(GenBank # NC001401)은 양쪽 단부가 동일하지만, 반대 방향에서 발견되는 서열이다. AAV2 ITR 서열은 AAV 및 아데노바이러스(ad) 헬퍼 기능이 트랜스에서 제공될 때 벡터 DNA 복제 기점 및 벡터 게놈에 대한 패키징 신호 둘 다로 기능한다. 이와 같이, ITR 서열은 벡터 게놈 복제 및 패키징에 필요한 유일한 시스 작용 서열을 나타낸다.
2. 인간 알파 1 마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서(2 개 카피; 0.1Kb) ; Genbank # X67082) 이 간 특이적 인핸서 요소는 간-특이성을 부여하고 TBG 프로모터로부터 발현을 향상시키는 역할을 한다.
3. 인간 티록신-결합 글로불린(TBG) 프로모터(0.46Kb; Gen bank # L13470) 이 간세포-특이적 프로모터는 인간 LDLR 코딩 서열의 발현을 구동시킨다
4. 인간 LDLR cDNA(2.58Kb; Genbank # NM000527, 완전 CDS). 인간 LDLR cDNA는 SDS-PAGE에 의해 예측된 분자량이 95 kD이고 겉보기 분자량이 130 kD인 860 개의 아미노산의 저밀도 지단백 수용체를 암호화한다.
5. 키메라 인트론(0.13Kb; Genbank # U47121; Promega Corporation, 위스콘신주 매디슨 소재) 키메라 인트론은 인간 β-글로빈 유전자의 첫번째 인트론 및 분지로부터의 5'-공여자 부위 및 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 리더 및 몸체 사이에 위치한 인트론으로부터의 3'-수용자 부위로 이루어진다. 발현 카세트에서 인트론의 존재는 핵에서 세포질까지 mRNA의 수송을 용이하게 하여, 발현을 위한 mRNA의 안정된 수준의 축적을 향상시키는 것으로 나타났다. 이는 유전자 발현의 증가된 수준을 매개하는 것으로 의도된 유전자 벡터의 통상적인 특징이다.
6. 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호: (0.13Kb; GenBank # V00882.1) 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호는 항체 mRNA의 효율적인 폴리아데닐화를 위한 시스 서열을 제공한다. 이 요소는 전사 종결을 위한 신호, 초기 전사체의 3' 단부에서 특이적 절단 사건 이어서 긴 폴리아데닐 꼬리의 첨가로서 기능한다.
8.1.2 트랜스 플라스미드(패키징 작제물): AAV2 rep 유전자 및 AAV8 cap 유전자를 함유하는 pAAV2/8(Kan)(도 9).
AAV8 트랜스 플라스미드 pAAV2/8(Kan)은 AAV2 레플리카제(rep) 유전자 및 비리온 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화하는 AAV8 캡시드(cap) 유전자를 발현한다. AAV8 캡시드 유전자 서열은 원래 레서스 원숭이의 심장 DNA로부터 단리되었다(GenBank 수탁 AF513852). 키메라 패키징 작제물을 생성하기 위해, AAV2 rep 및 cap 유전자를 함유하는 플라스미드 p5E18을 XbaI 및 XhoI로 분해하여 AAV2 cap 유전자를 제거하였다. 그런 다음 AAV2 cap 유전자를 AAV8 cap 유전자의 2.27Kb SpeI/XhoI PCR 단편으로 대체하여 플라스미드 p5E18VD2/8을 생성하였다(도 9a). 정상적으로 rep 발현을 구동하는 AAV p5 프로모터는 이 작제물에서 rep 유전자의 5' 단부에서 cap 유전자의 3' 단부까지 재배치된다. 이 배열은 벡터 수율을 증가시키기 위해 rep의 발현을 하향 조절하는 역할을 한다. p5E18에서 플라스미드 백본은 pBluescript KS로부터 우래된다. 최종 단계로, 암피실린 내성 유전자를 카나마이신 내성 유전자로 대체하여 pAAV2/8(Kan)을 생성하였다(도 9b). 전체 pAAV2/8(Kan) 트랜스 플라스미드는 직접 서열분석에 의해 검증되었다.
8.1.3 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드: pAdΔF6(Kan)
플라스미드 pAdΔF6(Kan)은 15.7Kb 크기이며 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈 영역, 즉 E2A, E4, 및 VA RNA를 함유한다. pAdΔF6(Kan)은 임의의 추가의 아데노바이러스 복제 또는 구조 유전자를 암호화하지 않고 복제에 필요한 아데노바이러스 ITR과 같은 시스 요소를 함유하지 않으며, 따라서, 감염성 아데노바이러스가 생성될 것으로 기대되지 않는다. 아데노바이러스 E1 필수 유전자 기능은 rAAV 벡터가 생산되는 HEK293 세포에 의해 공급된다. pAdΔF6(Kan)은 Ad5의 E1, E3 결실된 분자 클론(pBHG10, pBR322 기반 플라스미드)으로부터 유래되었다. 결실을 Ad5 DNA에 도입하여 불필요한 아데노바이러스 코딩 영역을 제거하고 생성된 ad-헬퍼 플라스미드에서 아데노바이러스 DNA의 양을 32Kb에서 12Kb까지 감소시켰다. 마지막으로, 암피실린 내성 유전자를 카나마이신 내성 유전자로 대체하여 pAdΔF6(Kan)을 생성하였다(도 10). DNA 플라스미드 서열분석은 독일 소재의 Qiagen Sequencing Services에 의해 수행하였으며, pAdDeltaF6(Kan)에 대한 참조 서열 및 다음 아데노바이러스 요소 사이의 100% 상동성을 입증하였다: p1707FH-Q: E4 ORF6 3.69-2.81Kb; E2A DNA 결합 단백질 11.8-10.2Kb; VA RNA 영역 12.4-13.4Kb.
상기 기재된 시스, 트랜스 및 ad-헬퍼 플라스미드 각각은 카나마이신-내성 카세트를 함유하며, 따라서, β-락탐 항생제는 이들의 생산에 사용되지 않는다.
8.1.4 플라스미드 제조
벡터 생산을 위해 사용되는 모든 플라스미드는 Puresyn Inc.(펜실베니아주 말번 소재)에 의해 생산되었다. 과정에 사용되는 모든 성장 배지는 무동물성이다. 발효 플라스크, 용기, 막, 수지, 칼럼, 튜빙, 및 플라스미드와 접촉하게 되는 임의의 구성요소를 포함한 과정에 사용되는 모든 구성요소는 단일 플라스미드 전용이며 BSE 무함유 인증을 받았다. 공유된 구성요소가 없으며 적절한 경우 일회용품이 사용된다.
8.2. 세포 은행
AAV8.TBG.hLDLR 벡터는 완전히 특성화된 마스터 세포 은행으로부터 유도된 HEK293 제조용 세포 은행으로부터 생산되었다. 두 세포 은행의 제조 및 테스트 세부 사항은 하기에 나타나 있다.
8.2.1 HEK293 마스터 세포 은행
HEK293 마스터 세포 은행(MCB)은 1차 인간 배아 신장 세포(HEK) 293의 유도체이다. HEK293 세포주는 공유된 인간 아데노바이러스 유형 5(Ad5) DNA에 의해 형질전환된 영구적 세포주이다(Graham 등, 1977, Journal of General Virology 36(1): 59-72). HEK293 MCB는 미생물 및 바이러스 오염에 대해 광범위하게 테스트되었다. HEK293 MCB는 현재 액체 질소에 저장되어 있다. 인간, 유인원, 소, 및 돼지 기원의 특이적 병원체의 부재를 입증하기 위해 HEK293 MCB에서 추가 테스트를 수행하였다. HEK293 MCB의 인간 기원은 동위효소 분석에 의해 입증되었다.
세포 현탁액의 피하 주사 후 누드(nu/nu) 무흉선 마우스에서 종양 형성을 평가함으로써 HEK293 MCB에서 종양형성 테스트를 또한 수행하였다. 이 연구에서, 10 마리의 양성 대조군 마우스 중 10 마리의 주사 부위에서 섬유육종이 진단되었고 10 마리의 테스트 물품 마우스 중 10 마리의 주사 부위에서 암종이 진단되었다. 임의의 음성 대조군 마우스에서 신생물은 진단되지 않았다. 또한 HEK293 MCB L/N 3006-105679를 돼지 써코바이러스(PCV) 유형 1 및 2의 존재에 대해 테스트하였다. MCB는 PCV 유형 1 및 2에 대해 음성으로 밝혀졌다.
8.2.2 HEK293 제조용 세포 은행
HEK293 제조용 세포 은행(WCB)은 유럽 약전 논문에 따라 적합성 인증을 받은 뉴질랜드 공급 소 태아 혈청, FBS(Hyclone PN SH30406.02)를 사용하여 제조되었다. HEK293 WCB를 MCB의 1 개 바이알(1mL)을 시드 물질로 사용하여 확립하였다. 특성화 테스트를 수행하였고 테스트 결과는 표 4.1에 열거되어 있다.
표 4.1 HEK293 WCB의 특성화.
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8.3. 벡터 제조
벡터 제조 과정의 일반적인 설명이 하기에 주어지며 또한 도 11의 흐름도에 반영되어 있다.
8.3.1 벡터 생성 과정(업스트림 과정)
8.3.1.1 T-플라스크(75cm 2 )로 HEK293 WCB 세포 배양 개시
1mL에 107 개 세포를 함유하는 WCB로부터 HEK293 세포의 1 개 바이알을 37℃에서 해동시키고 10% 소 태아 혈청(DMEM HG/10% FBS)이 보충된 DMEM 고글루코스를 함유하는 75 cm2 조직 배양 플라스크에 시딩한다. 그런 다음 세포를 37℃ /5% CO2 인큐베이터에 두고, 세포 성장을 평가하기 위해 매일 직접 육안 및 현미경 검사로 ~70% 합류까지 성장시킨다. 이들 세포를 계대 1로 지정하고 하기 기재된 바와 같이 최대 ~10 주 동안 벡터 생합성을 위한 세포 시드 트레인을 생성하기 위해 계대한다. 계대 수를 각 계대에서 기록하고 세포를 계대 20 후에 중단시킨다. 벡터 생합성을 위해 추가 세포가 필요한 경우, 새로운 HEK293 세포 시드 트레인을 HEK293 WCB의 또 다른 바이알로부터 개시한다.
8.3.1.2 ~2 개 T-플라스크(225 cm 2 )로 세포 계대
T75 플라스크에서 성장하는 HEK293 세포가 ~70% 합류일 때, 세포를 재조합 트립신(TrypLE)을 사용하여 플라스크의 표면으로부터 떼어내고 DMEM HG/10% FBS를 함유하는 2 개의 T225 플라스크에 시딩한다. 세포를 인큐베이터에 두고 ~70% 합류까지 성장시킨다. 세포를 육안 검사 및 현미경을 사용하여 세포 성장, 오염 부재, 및 일관성에 대해 모니터링한다.
8.3.1.3 ~10 개 T-플라스크(225 cm 2 )로 세포 계대
2 개의 T225 플라스크에서 성장하는 HEK293 세포가 ~70% 합류일 때, 세포를 재조합 트립신(TrypLE)을 사용하여 떼어내고, DMEM HG/10% FBS를 함유하는 10 개의 225cm2 T-플라스크에 플라스크 당 ~3x106 개 세포의 밀도로 시딩한다. 세포를 37℃/5% CO2 인큐베이터에 두고 ~70% 합류까지 성장시킨다. 세포를 직접 육안 검사 및 현미경을 사용하여 세포 성장, 오염 부재, 및 일관성에 대해 모니터링한다. 세포 시드 트레인을 유지하고 후속 벡터 배치의 제조를 뒷받침하는 확장을 위한 세포를 제공하기 위해 세포를 T225 플라스크에서 연속 계대에 의해 유지한다.
8.3.1.4 ~10 개 롤러 병으로 세포 계대
10 개의 T225 플라스크에서 성장하는 HEK293 세포가 ~70% 합류일 때, 세포를 재조합 트립신(TrypLE)을 사용하여 떼어내고, 계수하고 DMEM HG/10% FBS를 함유하는 850cm2 롤러 병(RB)에 시딩한다. 그런 다음 RB를 RB 인큐베이터에 두고 세포를 ~70% 합류까지 성장시킨다. RB를 직접 육안 검사 및 현미경을 사용하여 세포 성장, 오염 부재, 및 일관성에 대해 모니터링한다.
8.3.1.5 ~100 개 롤러 병으로 세포 계대
이전 과정 단계에서 기재된 바와 같이 제조된 RB에서 성장하는 HEK293 세포가 ~70% 합류일 때, 이들을 재조합 트립신(TrypLE)을 사용하여 떼어내고, 계수하고 DMEM/10% FBS를 함유하는 100 개의 RB에 시딩한다. 그런 다음 RB를 RB 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 두고 ~70% 합류까지 성장시킨다. 세포를 직접 육안 검사 및 현미경을 사용하여 세포 성장, 오염 부재, 및 일관성에 대해 모니터링한다.
8.3.1.6 플라스미드 DNA를 사용한 세포 형질감염
100 개의 RB에서 성장하는 HEK293 세포가 ~70% 합류일 때, 세포를 다음 3 개의 플라스미드 각각으로 형질감염시킨다: AAV 혈청형-특이적 패키징(트랜스) 플라스미드, ad-헬퍼 플라스미드, 및 AAV 도립된 말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 인간 LDLR 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하는 벡터 시스 플라스미드. 인산칼슘 방법을 사용하여 형질감염을 수행한다(플라스미드에 대한 상세한 내용은 섹션 4.1.1 참조). RB를 RB 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 밤새 둔다.
8.3.1.7. 무혈청 배지로 배지 교환
형질감염 후 100 개의 RB를 밤새 배양한 후, 형질감염 시약을 함유하는 DMEM/10% FBS 배양 배재를 흡인에 의해 각 RB로부터 제거하고 DMEM-HG(FBS 없음)로 교체한다. RB를 RB 인큐베이터에 다시 두고 수확할 때까지 37℃, 5% CO2에서 배양한다.
8.3.1.8. 벡터 수확
RB를 인큐베이터에서 제거하고 형질감염의 증거(세포 형태학에서 형질감염-유도된 변화, 세포 단층 떼어내기) 및 임의의 오염 증거를 검사한다. 각 RB를 교반하여 세포를 RB 표면에서 떼어낸 다음, 생물공정 용기(BPC)에 연결된 멸균 일회용 깔때기로 따라내어 수확한다. BPC에서 조합된 수확 물질을 '생성물 중간체: 조질 세포 수확물'로 표지하고 샘플을 (1) 공정중 바이오버든(bioburden) 테스트 및 (2) 바이오버든, 마이코플라즈마, 및 우발성 제제 생성물 방출 테스트를 위해 취한다. 조질 세포 수확물(CH)로 표지된 생성물 중간체 배치를 추가 처리까지 2-8℃에서 저장한다.
8.3.2 벡터 정제 과정(다운스트림 과정)
통상적인 '플랫폼' 정제 과정이 모든 AAV 혈청형에 대해 사용되지만(즉 동일한 시리즈 및 단계 순서로 혼입), 각 혈청형은 크로마토그래피 단계에 대한 고유한 조건을 필요로 하며, 요건은 또한 크로마토그래피 수지에 적용된 정화된 세포 용해물을 제조하는 데 사용되는 단계의 일부 상세한 사항(완충액 농도 및 pH)에 영향을 미친다.
8.3.2.1 AAV8 벡터 수확물 농축 및 TFF에 의한 투석여과
조질 CH를 함유하는 PBC는 포스페이트 완충 염수로 평형화된 중공 섬유(100k MW 컷오프) TFF 장치의 살균된 저장소의 유입구에 연결된다. 조질 CH를 연동 펌프를 사용하여 TFF 장치에 적용하고 1-2 L로 농축한다. 벡터를 유지(보유)하는 동안 작은 분자량 모이어티 및 완충액은 TFF 필터 기공을 통해 통과하고 버려진다. 그런 다음 수확물을 AAV8 투석여과 완충액을 사용하여 투석여과한다. 투석여과 후, 농축된 벡터를 5L BPC에 회수한다. 물질을 '생성물 중간체: 수확 후 TFF'로 표지하고, 공정중 바이오버든 테스트를 위해 샘플을 취한다. 농축된 수확물을 즉시 추가 처리하거나 또는 추가 처리까지 2-8C에서 저장한다.
8.3.2.2 수확물의 미세유동화 및 뉴클레아제 분해
농축되고 투석여과된 수확물을 미세유동화기를 사용하여 개방된 온전한 HEK293 세포를 파괴하는 전단에 적용한다. 미세유동화기는 각 사용 후 최소 1 시간 동안 1N NaOH로 살균하고, 다음 실행까지 20% 에틸 알코올에 저장하고, 각 사용 전에 WFI로 헹군다. BPC에 함유된 조질 벡터는 미세유동화기의 살균된 유입 포트에 부착되고, 멸균된 빈 BPC는 유출 포트에 부착된다. 미세유동화기에 의해 생성된 공기압을 사용하여, 벡터-함유 세포를 미세유동화기 상호작용 챔버(나선형 300μm 직경 경로)를 통해 통과시켜 세포를 용해하고 벡터를 방출한다. 미세유동화 과정을 반복하여 세포의 완전한 용해 및 벡터의 높은 회수를 보장한다. 미세유동화기를 통해 생성물 중간체의 반복 계대 후, 유동경로를 ~500mL의 AAV8 벤조나제(Benzonase) 완충액으로 헹군다. 미세유동화 벡터를 함유하는 5L BPC를 미세유동화기의 유출 포트에서 떼어낸다. 물질을 '생성물 중간체: 최종 미세유동화'로 표지하고, 공정중 바이오버든 테스트를 위해 샘플을 취한다. 미세유동화 생성물 중간체를 즉시 추가로 처리하거나 또는 추가 가공까지 2-8℃에서 저장한다. 100 U/mL Benzonase®을 첨가하여 AAV8 입자에서 핵산 불순물을 제거한다. BPC의 내용물을 혼합하고 실온에서 적어도 1 시간 동안 배양한다. 뉴클레아제 분해된 생성물 중간체를 추가로 처리한다.
8.3.2.3 미세유동화 중간체의 여과
미세유동화 및 분해된 생성물 중간체를 함유하는 BPC를 3μm에서 시작하여 0.45μm까지 내려가는 구배 기공 크기의 카트리지 필터에 연결한다. 필터를 AAV 벤조나제 완충액으로 조절한다. 연동 펌프를 사용하여, 미세유동화 생성물 중간체를 카트리지 필터를 통해 통과시키고 필터 유출 포트에 연결된 BPC에 수집한다. 멸균된 AAV8 벤조나제 완충액을 필터 카트리지를 통해 펌핑하여 필터를 헹군다. 그런 다음 여과된 생성물 중간체를 AAV8 벤조나제 완충액으로 조절된 0.2μm 최종 기공 크기 캡슐 필터에 연결한다. 연동 펌프를 사용하여, 여과된 중간체를 카트리지 필터를 통해 통과시키고 필터 유출 포트에 연결된 BPC에 수집한다. 멸균된 AAV8 벤조나제 완충액의 부피를 필터 카트리지를 통해 펌핑하여 필터를 헹군다. 물질을 '생성물 중간체: MF 후 0.2μm 여과됨'으로 표지하고, 공정중 바이오버든 테스트를 위해 샘플을 취한다. 물질을 추가 처리까지 2-8℃에서 밤새 저장한다. 정화된 세포 용해물을 크로마토그래피 칼럼에 적용하기 전에 크로마토그래피 당일에 추가 여과 단계를 수행할 수 있다.
8.3.2.4 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 정제
0.2 μm 여과된 생성물 중간체를 희석 완충액 AAV8을 첨가하여 NaCl 농도에 대해 조정한다. 다음으로 벡터를 함유하는 세포 용해물을 이온 교환 수지를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. GE Healthcare AKTA Pilot 크로마토그래피 시스템은 대략 1L 수지층 부피를 함유하는 BPG 칼럼을 갖추고 있다. 칼럼을 연속 유동 조건을 사용하여 패킹하고 확립된 비대칭 사양을 충족한다. 시스템을 확립된 절차에 따라 살균하고 다음 실행까지 20% 에틸 알코올에서 저장한다. 사용 직전에, 시스템을 멸균된 AAV8 세척 완충액으로 평형화한다. 무균 기술 및 멸균된 물질 및 구성요소를 사용하여, 정화된 세포 용해물을 함유하는 BPC를 살균된 샘플 유입 포트에 연결하고, 하기 나열된 생물공정 완충액을 함유하는 BPC를 AKTA Pilot 상의 살균된 유입 포트에 연결한다. 크로마토그래피 절차 동안 모든 연결을 무균으로 수행한다. 정화된 세포 용해물을 칼럼에 적용하고 AAV8 세척 완충액을 사용하여 헹군다. 이러한 조건 하에, 벡터는 칼럼에 결합되고, 불순물은 수지로부터 헹군다. AAV8 입자를 AAV8 용리 완충액을 적용하여 칼럼으로부터 용리하고 멸균된 플라스틱 병에 수집한다. 물질을 '생성물 중간체로 표지하고 공정중 바이오버든 테스트를 위해 샘플을 취한다. 물질을 즉시 추가 처리한다.
8.3.2.5 CsCl 구배 초원심분리에 의한 정제
상기 기재된 바와 같은 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된 AAV8 입자는 빈 캡시드 및 다른 생성물 관련 불순물을 함유한다. 빈 캡시드를 염화세슘 구배 초원심분리에 의해 벡터 입자로부터 분리한다. 무균 기술을 사용하여, 염화세슘을 벡터 '생성물 중간체'에 첨가하여 1.35 g/mL의 밀도에 상응하는 최종 농도로 부드럽게 혼합한다. 용액을 0.2μm 필터를 통해 여과하고, 초원심분리 튜브에 분배하고, 15℃에서 대략 24 시간 동안 Ti50 로터에서 초원심분리한다. 원심분리 후, 튜브를 로터에서 제거하고, Septihol로 닦고, BSC로 가져온다. 각 튜브를 스탠드에 고정하고 집중 조명을 적용하여 밴드 시각화를 보조한다. 2 개의 주 밴드가 전형적으로 관찰되며, 상부 밴드는 빈 캡시드에 상응하고, 하부 밴드는 벡터 입자에 상응한다. 하부 밴드를 멸균 주사기에 부착된 멸균 바늘을 사용하여 각 튜브로부터 회수한다. 각 튜브로부터 회수된 벡터를 조합하고, 공정중 바이오버든, 내독소, 및 벡터 역가를 위해 샘플을 취한다. 풀링된 물질을 '생성물 중간체: CsCl 구배 후'로 표지된 멸균된 50mL 폴리프로필렌 원추형 튜브에 분배하고, 다음 처리 단계까지 -80℃에서 즉시 저장한다.
8.3.2.6 접선 유동 여과에 의한 완충액 교환
풀링을 위한 테스트 및 방출 후, CsCl 밴딩 처리 단계를 통해 정제된 벡터 배치를 조합하고 TFF에 의한 투석여과에 적용하여 벌크 벡터를 생산한다. 개별 배치로부터 수득된 샘플의 역가에 기초하여, 멸균 투석여과 완충액의 계산된 부피를 사용하여 풀링된 벡터의 부피를 조정한다. 이용가능한 부피에 따라, 풀링된 농도 조정된 벡터의 분취액을 일회용 TFF 장치를 사용하여 TFF에 적용한다. 장치는 사용 전에 살균한 다음 투석여과 완충액으로 평형화한다. 투석여과 과정이 완료되면, 벡터를 TFF 장치로부터 멸균된 병에 회수한다. 물질을 "사전-0.2 μm 여과 벌크"라고 표지한다. 물질을 즉시 추가 처리한다.
8.3.2.7 벌크 벡터를 제조하기 위한 제형 및 0.2μm 여과
개별 TFF 유닛에 의해 제조된 배치를 함께 풀링하고 500mL 멸균된 병에서 부드럽게 빙빙 돌려 혼합한다. 그런 다음 풀링된 물질을 0.22μm 필터를 통해 통과시켜 벌크 벡터를 제조한다. 풀링된 물질을 벌크 벡터 및 예정된 QC 테스팅에 대해 샘플링한 다음, '벌크 벡터'로 표지된 멸균된 50mL 폴리프로필렌 튜브에 분취하고, 다음 단계까지 -80℃에서 저장한다.
8.4. 벡터 테스트
혈청형 동일성, 빈 입자 함량 및 이식유전자 산물 동일성을 포함한 특성화 검정을 수행한다. 모든 검정의 설명은 하기에 나타낸다.
8.4.1 게놈 카피(GC) 역가
최적화된 정량적 PCR(oqPCR) 검정을 사용하여 동족 플라스미드 표준과의 비교에 의해 게놈 카피 역가를 결정한다. oqPCR 검정은 DNase I 및 프로테이나제 K를 사용한 순차적 분해를 활용한 후, qPCR 분석하여 캡슐화된 게놈 카피를 측정한다. DNA 검출은 RBG polyA 영역을 표적으로 하는 서열 특이적 프라이머를 이와 동일한 영역을 혼성화하는 형광으로 태그된 프로브와 조합하여 사용하여 완수한다. 플라스미드 DNA 표준 곡선과의 비교는 임의의 PCR 후 샘플을 조작할 필요 없이 역가를 결정할 수 있다. 다수의 표준, 검증 샘플 및 대조군(배경 및 DNA 오염용)을 검정에 도입하였다. 이 검정은 민감도, 검출 한계, 검증 범위 및 검정내 및 검정간 정밀도를 포함한 검정 매개변수를 확립하고 정의함으로써 검증하였다. 내부 AAV8 참조 로트를 확립하고 사용하여 검증 연구를 수행하였다.
8.4.2 효능 검정
생체내 효능 검정을 설계하여 HoFH의 이중 녹아웃(DKO) LDLR-/- Apobec-/- 마우스 모델의 혈청에서 총 콜레스테롤 수준의 인간 LDLR 벡터-매개 감소를 검출하였다. 생체내 효능 검정의 개발에 대한 기초는 섹션 4.3.5.11에 기재되어 있다. AAV8.TBG.hLDLR 벡터의 효능을 결정하기 위해, 6-20 주령 DKO 마우스에게 마우스 당 PBS에 희석된 벡터 5x1011GC/kg을 IV(꼬리 정맥을 통해) 주사한다. 동물을 안와후 출혈에 의해 채혈하고 혈청 총 콜레스테롤 수준을 Antech GLP에 의해 벡터 투여 전 및 후(14 및 30 일)에 평가한다. 벡터-투여된 동물의 총 콜레스테롤 수준은 이 용량에서 벡터 투여에 대한 이전 경험에 기초하여 14 일까지 기준선의 25% - 75%까지 감소할 것으로 예상된다. 마우스 당 5x1011GC/kg 용량은 안정성 테스트 과정에 걸쳐 벡터 효능에서의 변화를 평가할 수 있는 총 콜레스테롤 감소의 예상 범위에 기초한 임상 검정을 위해 선택되었다.
8.4.3 벡터 캡시드 동일성: VP3의 AAV 캡시드 질량 분광법
벡터의 AAV2/8 혈청형의 확인은 질량 분광법(MS)에 의한 VP3 캡시드 단백질의 펩티드 분석에 기초한 검정에 의해 달성된다. 방법은 SDS-PAGE 겔로부터 절제된 VP3 단백질 밴드의 다중-효소 분해(트립신, 키모트립신 및 엔도프로테이나제 Glu-C) 후 캡시드 단백질을 서열분석하기 위한 Q-Exactive Orbitrap 질량 분광계에서 UPLC-MS/MS에 대한 특성화를 수반한다. 특정 오염 단백질을 식별하고 질량 스펙트럼에서 펩티드 서열을 유도할 수 있는 탠덤 질량 스펙트럼(MS) 방법이 개발되었다.
8.4.4 빈 입자 대 가득찬 입자 비율
분석용 초원심분리기에서 측정된 바와 같은 분석용 초원심분리(AUC) 침강 속도를 사용한 벡터 입자 프로필은 거대분자 구조 이질성, 차이 확인 및 회합 또는 응집 상태에 관한 정보를 수득하기 위한 훌륭한 방법이다. 샘플을 세포에 로딩하고 Beckman Coulter Proteomelab XL-I 분석용 초원심분리기에서 12000 RPM으로 침강시켰다. 굴절률 스캔을 3.3 시간 동안 2 분마다 기록하였다. 데이터를 c(s) 모델(Sedfit 프로그램)에 의해 분석하고 정규화된 c(s) 값에 대해 플롯된 침강 계수를 계산하였다. 단량체 벡터를 나타내는 주 피크가 관찰되어야 한다. 주 단랑체 피크보다 느리게 이동하는 피크의 모양은 빈/잘못 어셈블리된 입자를 나타낸다. 빈 입자 피크의 침강 계수는 빈 AAV8 입자 제제를 사용하여 확립된다. 주 단량체 피크 및 선행 피크의 직접 정량화는 빈 입자 대 가득찬 입자 비율을 결정할 수 있다.
8.4.5 감염성 역가
감염성 단위(IU) 검정을 사용하여 RC32 세포(rep2를 발현하는 HeLa 세포)에서 벡터의 생산적 흡수 및 복제를 결정한다. 간단히 말해서, 96 웰 플레이트에서 RC32 세포를 벡터의 연속 희석 및 rAAV의 각 희석에서 12 개 복제물과 함께 Ad5의 균일한 희석에 의해 공동-형질감염시킨다. 감염 72 시간 후 세포를 용해하고, qPCR을 수행하여 유입에 걸쳐 rAAV 벡터 증폭을 검출한다. 종점 희석 TCID50 계산(Spearman-Karber)을 수행하여 IU/ml로 표현된 복제 역가를 결정한다. "감염성" 값은 세포와 접촉하게 되는 입자, 수용체 결합, 내재화, 핵으로의 수송 및 게놈 복제에 따라 달라지므로, 검정 기하학 및 사용된 세포주에서 적절한 수용체 및 결합 후 경로의 존재에 영향을 받는다. AAV 벡터 유입에 중요한 수용체 및 결합 후 경로는 일반적으로 내재화된 세포주에서 유지되고 따라서 감염성 검정 역가는 존재하는 "감염성" 입자의 수의 절대 척도가 아니다. 그러나, 캡슐화된 GC 대 "감염 단위"의 비율(GC/IU 비로 기재됨)은 로트간 생성물 일관성의 척도로 사용될 수 있다. 이 시험관내 생물검정의 가변성은 시험관내에서 AAV8 벡터의 낮은 감염성으로 인해 높을 가능성(30-60% CV)이 있다.
8.4.6 이식유전자 발현 검정
이식유전자 발현은 1x1010 GC(5x1011 GC/kg)의 AAV8.TBG.hLDLR 벡터를 받은 LDLR-/- Apobec-/- 마우스로부터 수확된 간에서 평가한다. 30 일 전에 벡터가 투여된 동물을 안락사시키고, 간을 수확하고 RIPA 완충액에서 균질화한다. 25-100 ug의 총 간 균질물을 4-12% 변성 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동하고 인간 LDLR에 대한 항체를 사용하여 프로브하여 이식유전자 발현을 결정한다. 벡터를 받지 않거나 또는 관련없는 벡터를 받은 동물은 검정에 대한 대조군으로 사용한다. 벡터로 처리된 동물은 번역 후 변형으로 인해 90- 160 kDa 중 어디서든 이동하는 밴드를 나타낼 것으로 예상된다. 상대적 발현 수준은 밴드의 통합 강도를 정량화함으로써 결정된다.
(서열 목록 프리 텍스트)
하기 정보는 숫자 식별기호 <223> 하에 프리 텍스트를 함유하는 서열에 대해 제공된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
본 명세서에 인용된 모든 간행물은 2018년 12월 20일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/782,627호와 같이 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 유사하게, 본원에 참조되고 2019년 12월 10일 생성된 "16-7717C2PCT_20191210_SequenceListing_ST25"로 표지된 첨부된 서열 목록에 나타내고 64,936 바이트 크기인 서열번호가 참조로 포함된다. 본 발명은 특정 구현예를 참조하여 기재되었지만, 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> GENE THERAPY FOR TREATING FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA <130> UPN-16-7717C2PCT <150> US 62/782,627 <151> 2018-12-20 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5292 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(254) <223> exon <220> <221> misc_feature <222> (188)..(2770) <223> LDLR isoform 1 encoded by full-length CDS, 188-2770; other variants encoded by alternative splice variants missing an exon; most common variant missing fourth exon or twelfth exon <220> <221> misc_signal <222> (188)..(250) <220> <221> misc_feature <222> (251)..(2767) <223> Mature protein of isoform 1 <220> <221> misc_feature <222> (255)..(377) <223> exon <220> <221> misc_feature <222> (378)..(500) <223> exon <220> <221> misc_feature <222> (501)..(881) <223> exon <220> <221> misc_feature <222> (882)..(1004) <223> exon <220> <221> misc_feature <222> (1005)..(1127) <223> exon <220> <221> misc_feature <222> 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Asn Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met 690 695 700 ctg ctg gcc aga gat atg cgg tct tgt ctg aca gaa gcc gaa gcc gct 3122 Leu Leu Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala 705 710 715 gtg gct aca cag gag aca agc acc gtg cgg ctg aag gtg tct agc aca 3170 Val Ala Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr 720 725 730 gcc gtg aga acc cag cac aca acc acc aga ccc gtg cca gat acc agc 3218 Ala Val Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser 735 740 745 750 aga ctg cca gga gct aca cca gga ctg acc acc gtg gag atc gtg acc 3266 Arg Leu Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr 755 760 765 atg agc cac cag gct ctg gga gac gtg gca gga aga gga aac gag aag 3314 Met Ser His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys 770 775 780 aag cct agc agc gtg aga gcc ctg tct atc gtg ctg ccc atc gtg ctg 3362 Lys Pro Ser Ser Val Arg Ala Leu Ser Ile Val Leu Pro Ile Val Leu 785 790 795 ctg gtg ttc ctc tgt ctg ggc gtg ttc ctc ctc tgg aag 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Asp Leu Lys Ile Gly Tyr 325 330 335 Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys 340 345 350 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys 355 360 365 Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln 370 375 380 Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr 385 390 395 400 Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg 405 410 415 Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu 420 425 430 Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln 435 440 445 Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser 450 455 460 Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala 465 470 475 480 Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly 485 490 495 Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe 500 505 510 Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His 515 520 525 Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys 530 535 540 Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile 545 550 555 560 Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr 565 570 575 Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly 580 585 590 Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro 595 600 605 Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile 610 615 620 Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn 625 630 635 640 Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His 645 650 655 Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu 660 665 670 Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn 675 680 685 Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu 690 695 700 Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala 705 710 715 720 Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val 725 730 735 Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu 740 745 750 Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser 755 760 765 His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro 770 775 780 Ser Ser Val Arg Ala Leu Ser Ile Val Leu Pro Ile Val Leu Leu Val 785 790 795 800 Phe Leu Cys Leu Gly Val Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys 805 810 815 Asn Ile Asn Ser Ile Asn Phe Asp Asn Pro Val Tyr Gln Lys Thr Thr 820 825 830 Glu Asp Glu Val His Ile Cys His Asn Gln Asp Gly Tyr Ser Tyr Pro 835 840 845 Ser Arg Gln Met Val Ser Leu Glu Asp Asp Val Ala 850 855 860

Claims (58)

  1. AAV8 캡시드에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV) 바이러스 입자를 포함하는 현탁액을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)의 치료에 사용하기 위한 레지멘으로서, 상기 벡터 게놈은 AAV 도립된 말단 반복부(ITR) 및 간 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 저밀도 지단백질(LDL) 수용체(hLDLR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 현탁액은 환자 체중 킬로그램(kg) 당 rAAV 바이러스 입자의 약 2.5 x 1013 게놈 카피의 용량으로 환자에게 투여되고, 상기 게놈 카피는 최적화된 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(oqPCR) 또는 디지털 액적 폴리머라제 연쇄 반응(ddPCR)에 의해 결정되는 것인, 레지멘.
  2. 제1항에 있어서, 스테로이드로 환자를 치료하는 것을 추가로 포함하는, 레지멘.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 현탁액이 포스페이트 완충 염수를 포함하는 제형 완충액을 추가로 포함하는 수용액인, 레지멘.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 적어도 1 x 1013 GC/ml의 농도 또는 역가로 rAAV 바이러스 입자를 포함하는, 레지멘.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자가 빈 캡시드의 적어도 약 95%가 없는, 레지멘.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 종점 및 이들 사이의 임의의 비율을 포함하여 0:4 내지 1:4의 빈 캡시드 대 가득찬 입자의 비를 갖는, 레지멘.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자의 5 x 1011 GC/kg의 용량이 동형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(HoFH)의 이중 녹아웃(DKO) LDLR-/-Apobec-/- 마우스 모델에서 기준선 콜레스테롤 수준을 25% 내지 75%까지 감소시키는, 레지멘.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가 티록신-결합 글로불린(TBG) 프로모터인, 레지멘.
  9. 제8항에 있어서, 상기 TBG 프로모터가 인간 TBG 프로모터인, 레지멘.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hLDLR 핵산 서열이 서열번호: 2 또는 4의 서열, 또는 서열번호: 6의 뉴클레오티드(nt) 969 내지 nt 3551을 포함하는, 레지멘.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 인트론, 인핸서 및 polyA 신호 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 레지멘.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인핸서가 알파 1 마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서(알파 mic/bik) 인핸서인, 레지멘.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 polyA 신호가 토끼 베타 글로빈 polyA인, 레지멘.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 서열번호: 6의 뉴클레오티드(nt) 1 내지 nt 3947의 서열을 포함하는, 레지멘.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 계면활성제를 추가로 포함하는, 레지멘.
  16. 제15항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴록사머인, 레지멘.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 계면활성제가 현탁액의 약 0.0005 % 내지 약 0.001%의 농도로 존재하는, 레지멘.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 6.5 내지 8 또는 7 내지 7.5 범위의 pH를 갖는, 레지멘.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 pH 7.3에서 180mM NaCl, 10mM Na 포스페이트, 및 0.001% 폴록사머 188을 포함하는 제형 완충액을 추가로 포함하는, 레지멘.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 말초 정맥 주입을 통해 환자에게 투여되는, 레지멘.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 동형접합 FH(HoFH)로 진단된 인간 환자인, 레지멘.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 스테로이드로 치료되는, 레지멘.
  23. 제22항에 있어서, 상기 환자가 약 14 주 동안 스테로이드 공동-요법으로 치료되는, 레지멘.
  24. 제22항에 있어서, 상기 스테로이드가 rAAV 현탁액의 투여 하루 전(즉, -1 일) 내지 rAAV의 투약 후 약 8 주 동안 약 40 mg/일 프레드니손의 초기 용량과 동등한 점점 줄어드는 용량으로 환자에게 투여되는, 레지멘.
  25. 제24항에 있어서, 상기 환자가 9 및 10 주 각각 동안 주 당 10 mg 용량 감소, 및 11, 12 및 13 주 각각 동안 주 당 5 mg 용량 감소로 스테로이드를 추가로 투여받아, 스테로이드가 14 주 후에 중단되며, 임의적으로, 환자가 약 2.5 x 1013 GC/kg 내지 7.5 x 1012 게놈 카피의 용량, 또는 본원에 제공된 다른 용량을 받을 때 스테로이드 레지멘이 또한 전달되도록 하는, 레지멘.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테로이드가 프레드니손인, 레지멘.
  27. AAV8 캡시드에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV) 바이러스 입자를 포함하는, 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)의 치료에 사용하기 위한 현탁액으로서, 상기 벡터 게놈은 AAV 도립된 말단 반복부(ITR) 및 간 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 저밀도 지단백질(LDL) 수용체(hLDLR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 현탁액이 환자 체중 킬로그램(kg) 당 rAAV 바이러스 입자의 약 2.5 x 1013 게놈 카피(GC)의 용량으로 환자에게 투여하기에 적합하고, 상기 게놈 카피가 최적화된 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(oqPCR) 또는 디지털 액적 폴리머라제 연쇄 반응(ddPCR)에 의해 결정되는, 현탁액.
  28. FH 환자를 치료하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 레지멘 또는 제27항의 현탁액의 용도.
  29. FH의 치료를 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 레지멘 또는 제27항의 현탁액의 용도.
  30. FH를 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 레지멘 또는 제27항의 현탁액.
  31. 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV) 바이러스 입자를 포함하는 현탁액을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 rAAV 바이러스 입자는 AAV8 캡시드에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은 AAV 도립된 말단 반복부(ITR) 및 간 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 저밀도 지단백질(LDL) 수용체(hLDLR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 환자는 환자 체중 킬로그램(kg) 당 rAAV 바이러스 입자의 약 2.5 x 1013 게놈 카피를 투여받고, 상기 게놈 카피 수 또는 역가는 최적화된 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(oqPCR) 또는 디지털 액적 폴리머라제 연쇄 반응(ddPCR)에 의해 결정되는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 현탁액이 rAAV 바이러스 입자 및 제형 완충액을 포함하는 수용액인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제형 완충액이 포스페이트 완충 염수 및 계면활성제를 포함하는, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 적어도 1 x 1013 GC/ml의 rAAV 게놈 카피(GC) 역가를 갖는, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 빈 캡시드의 적어도 약 95%가 없는, 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 종점 및 이들 사이의 임의의 비율을 포함하여 0:4 내지 1:4의 빈 캡시드 대 가득찬 rAAV 바이러스 입자의 비를 갖는, 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 바이러스 입자의 5 x 1011 GC/kg의 용량이 동형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(HoFH)의 이중 녹아웃(DKO) LDLR-/-Apobec-/- 마우스 모델에서 기준선 콜레스테롤 수준을 25% 내지 75%까지 감소시키는, 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 스테로이드를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 적어도 1 x 1013 GC/ml의 농도 또는 역가로 rAAV 바이러스 입자를 포함하는, 방법.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 특이적 프로모터가 티록신-결합 글로불린(TBG) 프로모터인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 TBG 프로모터가 인간 TBG 프로모터인, 방법.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hLDLR 핵산 서열이 서열번호: 2 또는 4의 서열, 또는 서열번호: 6의 뉴클레오티드(nt) 969 내지 nt 3551을 포함하는, 방법.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 인트론, 인핸서 및 polyA 신호 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서가 알파 1 마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서(알파 mic/bik) 인핸서인, 방법.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 polyA 신호가 토끼 베타 글로빈 polyA인, 방법.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 서열번호: 6의 뉴클레오티드(nt) 1 내지 nt 3947의 서열을 포함하는, 방법.
  47. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액 또는 제형 완충액이 계면활성제를 추가로 포함하는,방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴록사머인, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 계면활성제가 조성물의 약 0.0005 % 내지 약 0.001%의 농도로 존재하는, 방법.
  50. 제31항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 6.5 내지 8 또는 7 내지 7.5 범위의 pH를 갖는, 방법.
  51. 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 pH 7.3에서 180mM NaCl, 10mM Na 포스페이트, 및 0.001% 폴록사머 188을 포함하는 제형 완충액을 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 말초 정맥 주입을 통해 환자에게 투여되는, 방법.
  53. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 동형접합 FH(HoFH)로 진단된 인간 환자인, 방법.
  54. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 면역억제제로 공동-치료되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 환자가 약 14 주 동안 스테로이드 공동-요법으로 치료되는, 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 면역억제제가 rAAV 현탁액의 투여 하루 전(즉, -1 일) 내지 rAAV로 투약 후 약 8 주 동안 약 40 mg/일 프레드니손의 초기 용량과 동등한 점점 줄어드는 용량으로 환자에게 투여되는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 환자가 9 및 10 주 각각 동안 주 당 10 mg 용량 감소, 및 11, 12 및 13 주 각각 동안 주 당 5 mg 용량 감소에 의해 면역억제제를 추가로 투여받아, 면역억제제가 14 주 후에 중단되도록 하는, 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제가 스테로이드 프레드니손인, 방법.
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