CN115109788A - Aav介导的人脂蛋白脂酶肝脏异位表达载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及优化的人脂蛋白脂酶基因表达框以及包含所述优化的人脂蛋白脂酶基因表达框的病毒载体，例如，重组腺相关病毒载体。本发明还涉及所述病毒载体作为基因药物，通过静脉注射，在肝脏特异性表达人脂蛋白脂酶(例如，LPL‑S447X)来预防和/或治疗严重高甘油三酯血症或由其引起的疾病如急性胰腺炎。

Description

AAV介导的人脂蛋白脂酶肝脏异位表达载体及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及一种携带优化的人脂蛋白脂酶基因表达框的重组腺相关病毒载体。通过静脉注射本发明的重组腺相关病毒载体，能够获得脂蛋白脂酶的肝脏特异性表达，由此预防和/或治疗严重高甘油三酯血症或由其引起的疾病如急性胰腺炎。

背景技术

脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是水解血浆甘油三酯(triglyceride，TG)的关键酶,该酶功能障碍可使血浆乳糜微粒、极低密度脂蛋白等富含甘油三酯的脂蛋白(triglyceride-rich lipoprotei，TRL)增高，临床表现为乳糜微粒/及低密度脂蛋白血症,血浆甘油三酯升高。

与LPL密切相关的是糖基磷脂酰肌醇锚定的高密度脂蛋白结合蛋白1(glycosylphosphatidylinositol anchored high density lipoprotein bindingprotein 1，GPIHBP1)。GPIHBP1位于肌肉和脂肪组织的血管内皮细胞上，能够从血管内皮的基底间隙与来自肌肉细胞和脂肪细胞的LPL结合，并将其转运至毛细血管腔面，在血管腔内为LPL提供附着位点，使得LPL能够水解血浆中TRL上的甘油三酯。GPIHBP1与LPL的结合还能够使LPL保持结构稳定和较高的催化活性。GPIHBP1缺陷会使得LPL无法转运至毛细血管腔发挥水解TRL上TG的作用，造成严重的高甘油三酯血症(Stephen G Young等人，CellMetab.2019；30(1):51-65)。

现有技术中报导了通过肌肉注射重组AAV1病毒载体(所述AAV1是肌肉靶向性高的腺相关病毒载体)介导的人LPL-S447X表达能够有效治疗LPL基因缺陷小鼠，具有良好的安全性，可长期(约1年)降低血浆甘油三酯，呈剂量依赖性(Ross CJ等人，Hum GeneTher.2012；15(9):906-919)。Carpentier等人发现肌肉注射AAV1-LPL-S447X可降低LPL基因缺陷患者餐后乳糜微粒水平(Carpentier AC等人，J Clin Endocrinol Metab.97(5):1635-1644)。Stroes等人向LPL基因缺陷患者腿部肌肉注射两种剂量的携带人LPL-S447X基因的腺相关病毒载体(1×10¹¹vg/kg和3×10¹¹vg/kg)，12周后检测甘油三酯水平,结果表明，与治疗前相比较，甘油三酯水平分别降低27％、41％，26-36周后,在患者肌肉匀浆中检测到有活性的LPL蛋白，无任何不良反应出现(Stroes ES等人，Arterioscler Thromb VascBiol.2018.28(12):2303-2304)。Gaudet等对14例LPL基因缺陷型HTG-AP患者通过肌肉注射施用AAV1-LPL-S447X进行基因治疗，患者血浆甘油三酯在12周下降到40％，经过2年临床观察无高甘油三酯血症性胰腺炎(hypertriglyceridemic acute pancreatitis,HTG-AP)复发和严重不良反应(Glancy D等人，Gene Ther.2013.20(4):361-369)。鉴于前期临床研究结果证实了该基因治疗方法的安全性和有效性，2012年，欧洲药品局(EMA)批准了西方国家第一个基因治疗药物Alipogene Tiparvovec(商品名：Glybera)，该药的适应症为：严格限制脂肪饮食后仍然发生严重或反复HTG-AP的LPL基因缺陷患者。

Glybera是通过肌肉局部注射AAV1-LPL-S447X病毒载体来表达LPL。虽然AAV1病毒载体在注射部位浓度很高，但不能有效扩散至肌肉中血管内皮细胞的血管腔面，需要在患者大腿股四头肌注射二百多个点，不仅需要的AAV1病毒载体的量非常大，而且造成了患者不便依从；此外，肌肉转导AAV1-LPL-S447X对降低体内甘油三酯作用有限：LPL只是在肌肉注射局部表达，因此尽管在肌肉的注射位置处LPL活性足够高，但LPL表达仅限于肌肉的局部注射部位，在分解血浆甘油三酯的血管内皮细胞表面的功能部位很少，其降低血浆甘油三酯的疗效有限，长期观察发现难以将血浆甘油三酯降至11.3mmol/L以下。因此Glybera在上市4年后并没有真正用于治疗临床病人，而是在4年后由生产厂家宣布退出了市场。

所以本领域仍需要预防和/或治疗高甘油三酯血症的备选基因疗法，并且通过多方优化，将这种备选基因疗法达到单次或多次注射后，能够长期表达功能性LPL、且表达的功能性LPL可有效扩散至患者的能够有效分解血浆甘油三酯的组织或器官。

发明概述

本发明提供了一种携带LPL基因表达框的AAV病毒载体。所述AAV病毒载体仅保留了野生型AAV病毒基因组中包装病毒所需要的两个ITR序列或其变体，不含有野生型AAV病毒基因组中的蛋白编码基因，这使得所述AAV病毒载体在施用于患者后的免疫原性低；此外，AAV病毒载体通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带外源基因读框的持续稳定表达，避免了导入生物体的外源基因随机整合而带来的安全性问题。

本发明的AAV病毒载体在单次静脉注射后，对肝脏具有较高的转导效率，保证了LPL基因表达框能够在肝脏内高效地表达LPL蛋白，由此，提供了一种新的预防和/或治疗严重高TG血症的基因药物。

在第一方面，本发明提供了一种优化的人脂蛋白脂酶基因表达框，其包含：

(1)如SEQ ID NO:5所示的启动子序列或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列；

(2)插入有SEQ ID NO:2所示的内含子序列或者插入有与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的内含子序列的编码功能性脂蛋白脂酶(例如，LPL-S447X)的核苷酸序列，例如，

(i)如SEQ ID NO:3所示的优化的编码LPL-S447X的核苷酸序列；

(ii)与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的LPL-S447X，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(iv)与(i)或(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少70％同一性的序列；和

(3)至少一个(例如，2－8个)SEQ ID NO:6所示的人miR-142-3p靶序列，例如，具有4个串联的人miR-142-3p靶序列，例如，SEQ ID NO:7所示的人miR-142-3p靶序列。

在一个实施方案中，本发明的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框还包含：

(4)如SEQ ID NO:10所示的或者与其具有至少约90％同一性的BGH polyA序列；和/或

(5)如SEQ ID NO:11所示的或者与其具有至少约90％同一性的TBG增强子序列。

在一个具体实施方案中，本发明的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框具有如SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少约90％同一性的序列。

本发明的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框的表达产物为功能性脂蛋白脂酶(例如，LPL-S447X)，具有LPL活性；此外，所述表达框还能够抑制生物体的免疫反应。

在第二方面，本发明提供了一种病毒载体，其包含本发明的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框。

在第三方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗严重高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎的基因药物，其中所述基因药物是包含本发明的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框的病毒载体。通过静脉注射本发明的所述基因药物，能够在肝脏特异性表达功能性人脂蛋白脂酶(例如，LPL-S447X)，发挥预防和/或治疗严重高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎的目的。在一些实施方案中，所述严重高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎是LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷和/或高脂饮食诱发的。

在一些实施方案中，本发明的病毒载体是重组腺相关病毒载体，包括但不限于选自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10或它们的组合的血清型的重组腺相关病毒载体，优选地为重组AAV5、AAV3B、AAV8、AAV9载体。

在一些实施方案中，本发明的病毒载体的基因组可以自我互补形成双链DNA分子。

在第四方面，本发明提供了本发明的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框和本发明的病毒载体的用途，用于制备预防和/或治疗高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎的基因药物，例如，用于制备预防和/或治疗LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷和/或高脂饮食诱发的高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎的基因药物。

在一些实施方案中，本发明的基因预防和/或治疗药物的给药方式为单次或多次静脉注射，优选地为单次静脉注射。

在一些实施方案中，本发明的基因药物的一次给药可持续降低体内的血浆甘油三脂浓度，由此预防和/或治疗高甘油三酯血症，特别地，预防和/或治疗严重的高甘油三酯血症，例如，由LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷和/或高脂饮食诱发的高甘油三酯血症，以及由高甘油三酯引起的疾病如急性胰腺炎。

发明的技术效果

本发明的病毒载体通过静脉注射方式给药，优选地，通过一次性静脉注射方式给药，减少了反复施用药物所带给患者的痛苦；在肝脏异位表达功能性LPL不会产生明显毒性作用，却可对循环血液中富含甘油三酯脂蛋白的降解发挥明显效应，由此大大提高了预防和/或治疗效果。当病毒载体的基因组是可以自我互补形成双链DNA分子的双链AAV载体时，较单链AAV载体表达功能性LPL所需的时间更少，可以在体内更快地发挥作用。

进一步地，当病毒载体是AAV5、AAV3B、AAV8或AAV9病毒载体时，可以实现对肝脏细胞的高效感染(提高表达水平)，提高了药物有效性。而且，AAV5、AAV3B、AAV8或AAV9病毒载体的产量高，利于降低生产成本，预期上市后有更好的性价比优势。

本发明的病毒载体扩大了基因药物使用的范围和适应症，从LPL基因缺陷引起的严重高甘油三酯血症，扩大至GPIHBP1基因缺陷引起的严重高甘油三酯血症、以及由高脂饮食导致的高甘油三酯血症、或由高甘油三酯血症引起的疾病如急性胰腺炎。

因此，本发明通过对病毒载体结构的优化，从多个不同的层次共同实现了功能性LPL基因在肝脏的高效、特异性表达，同时降低了有可能引起的免疫反应，提高了病毒载体作为基因药物的有效性和安全性。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1A：例示了pscAAV-LP15-EGFP-kan-4×142T载体的结构示意图。左侧ITR为AAV病毒的约145bp的反向末端重复序列；右侧ITR为删除了AAV病毒的D序列和trs序列的ITR(有时也标记为ΔITR)；LP15启动子：由人AMBP(X67082.1)的增强子序列、人ALB(M12523.1)的增强子序列和长度为128bp的启动子序列以及小鼠微小病毒(MVM)内含子(大小为67bp)拼接而成；EGFP：增强型绿色荧光蛋白：4×142-3pT：4个串联的人miR-142-3p靶序列：BGHpolyA：牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号：TBG增强子：甲状腺素结合球蛋白增强子；Kan：卡那霉素抗性基因。

图1B：例示了pscAAV-LP15-optLPL-S447X-kan-4×142T载体的结构示意图，图中的optLPL-S447X是插入有SEQ ID NO:2所示的内含子序列的经优化的编码LPL-S447X的核苷酸序列。

图1C：例示了pscAAV-LP15-LPL-S447X-kan-4×142T载体的结构示意图，图中的LPL-S447X是未插入SEQ ID NO:2所示的内含子序列的编码LPL-S447X的核苷酸序列。

图2：显示了图1A(对照)、图1B、图1C的载体分别导入肝细胞Huh7后，LPL-S447X基因的相对mRNA转录水平。以GAPDH作为内参，通过实时定量RT-qPCR，用ΔΔCt法计算mRNA相对表达水平。误差棒表示标准差。

图3：显示了Lpl^-/-小鼠注射scAAV5-EGFP或scAAV5-optLPL(以下也分别简称为AAV5-EGFP、AAV5-optLPL)前，注射后第7，14，28，56天，血浆甘油三酯(TG)浓度。Lpl^-/-小鼠注射AAV5-optLPL的高中低3个剂量组(高剂量，1E13个载体基因组(vg)/kg；中间剂量，1E12vg/kg；低剂量，1E11vg/kg)和注射AAV5-EGFP(1E13vg/kg)前后不同时间点(0，7，14，28，56天)采血，检测血浆中的TG浓度。

图4：显示了Lpl^-/-小鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL前，注射后第7，14，28，56天，血浆总胆固醇(TC)浓度。Lpl^-/-小鼠注射AAV5-optLPL的高中低3个剂量组(高剂量，1E13vg/kg；中间剂量，1E12vg/kg；低剂量，1E11vg/kg)和注射AAV5-EGFP(1E13vg/kg)前后不同时间点(0，7，14，28，56天)采血，检测血浆中的TC浓度。

图5：显示了Lpl^-/-小鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL后第14天血浆LPL活性。Lpl^-/-小鼠注射AAV5-optLPL的高中低3个剂量组(高剂量，1E13vg/kg；中间剂量，1E12vg/kg；低剂量，1E11vg/kg)和注射AAV5-EGFP(1E13vg/kg)后第14天，静脉注射肝素，取肝素后血浆，检测血浆LPL活性。

图6：显示了Lpl^-/-小鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL后第56天取肝脏，并检测肝脏optLPL mRNA水平。Lpl^-/-小鼠注射AAV5-optLPL的高中低3个剂量组(高剂量，1E13vg/kg；中间剂量，1E12vg/kg；低剂量，1E11vg/kg)和注射AAV5-EGFP(1E13vg/kg)后第56天，PBS灌流后，取肝组织，提取RNA，通过qPCR检测肝脏中optLPL的mRNA。

图7A：显示了Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒后的血浆TG随时间的变化。图中，“n.s.”表示无显著性差异。

图7B：显示了Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒后的血浆胆固醇随时间的变化。

图7C：显示了Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒2个月后，小鼠外周血血浆外观与野生型C57小鼠血浆无差别。图中WT-PBS表示对野生型C57小鼠施用PBS组；GP-KO PBS表示对Gpihbp1^-/-小鼠施用PBS组；GP-KO+AAV5-optLPL表示对Gpihbp1^-/-小鼠施用scAAV5-optLPL-S447X组。

图7D：显示了Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒2个月后的血浆LPL浓度。

图7E：显示了Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒2个月后的血浆LPL活性。

图8A：显示了对Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒或PBS 2个月后，再施用极低剂量雨蛙素(5μg/kg/h*10次)时，胰腺组织的HE染色结果。图中，Cae表示雨蛙素。

图8B：显示了对Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒或PBS 2个月后，再施用极低剂量雨蛙素(5μg/kg/h*10次)时，血浆的淀粉酶水平。图中，GP表示Gpihbp1^-/-小鼠。

图8C：显示了对Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒或PBS 2个月后，再施用常规剂量雨蛙素(50μg/kg/h*10次)时，胰腺组织的HE染色结果。

图8D：显示了对Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒或PBS 2个月后，再施用常规剂量雨蛙素(50μg/kg/h*10次)后第0、6、12、24小时，血浆淀粉酶活性的变化。图中，WT表示野生型C57小鼠；Cae表示雨蛙素；GP表示Gpihbp1^-/-小鼠，AAV5-optLPL表示静脉注射1×10¹³vg/kgscAAV5-optLPL-S447X。

图8E：显示了对Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒或PBS 2个月后，再施用常规剂量雨蛙素(50μg/kg/h*10次)后第0、6、12、24小时，血浆脂肪酶活性的变化。图中各缩写的含义同图8D。

图8F：显示了对Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒或PBS 2个月后，再施用常规剂量雨蛙素(50μg/kg/h*10次)后第0、6、12、24小时，血浆TG浓度的变化。图中各缩写的含义同图8D。

图8G：显示了对Gpihbp1^-/-小鼠静脉注射重组病毒或PBS 2个月后，再施用常规剂量雨蛙素(50μg/kg/h*10次)后第0、6、12、24小时，血浆胆固醇浓度的变化。图中各缩写的含义同图8D。

图9A：显示了对新生Gpihbp1^-/-大鼠出生后7天经眶静脉注射AAV5-optLPL病毒导致了Gpihbp1^-/-大鼠的28天生存率显著提高。

图9B：显示了对新生Gpihbp1^-/-大鼠出生后7天经眶静脉注射AAV5-optLPL病毒导致了Gpihbp1^-/-大鼠的血浆TG显著下降。

图9C：显示了对Gpihbp1^-/-大鼠出生后8周经尾静脉二次注射AAV8-optLPL病毒导致了血浆TG的进一步下降。

图9D：显示了对新生Gpihbp1^-/-大鼠出生后7天经眶静脉注射AAV5-optLPL病毒导致了Gpihbp1^-/-大鼠的血浆胆固醇显著下降。

图9E：显示了对Gpihbp1^-/-大鼠出生后8周经尾静脉二次注射AAV8-optLPL病毒导致了血浆胆固醇的进一步下降。

图9F：显示了第一针AAV病毒载体静脉注射后9周，来自野生型SD大鼠、PBS组Gpihbp1^-/-大鼠、AAV-optLPL治疗组Gpihbp1^-/-大鼠的血浆外观。图9F小管1、2、3是来自野生型SD大鼠的血浆；小管4、5、6是来自Gpihbp1^-/-大鼠+PBS的血浆；小管7、8、9是来自Gpihbp1^-/-大鼠+1×10¹¹vg/kgscAAV8-optLPL-S447X的血浆；小管10、11、12是来自Gpihbp1^-/-大鼠+1×10¹³vg/kgscAAV8-optLPL-S447X的血浆。

图9G：显示了第一针AAV病毒载体静脉注射后9周，来自野生型SD大鼠、PBS组Gpihbp1^-/-大鼠、AAV-optLPL治疗组Gpihbp1^-/-大鼠的血浆LPL浓度。在AAV-optLPL治疗组Gpihbp1^-/-大鼠中，LPL浓度呈AAV8-optLPL病毒的剂量依赖性升高。

图9H：显示了第一针AAV病毒载体静脉注射后9周，来自野生型SD大鼠、PBS组Gpihbp1^-/-大鼠、AAV-optLPL治疗组Gpihbp1^-/-大鼠的血浆LPL活性。在AAV8-optLPL治疗组Gpihbp1^-/-大鼠中，LPL活性呈AAV8-optLPL病毒的剂量依赖性升高。

图10A：显示了高脂饲料(HFD)喂饲后14天，Gpihbp1^-/-大鼠胰腺外观呈现明显包裹性坏死。

图10B：显示了用高脂饲料(HFD)喂饲的14天期间，Gpihbp1^-/-大鼠血浆甘油三脂水平的变化。

图10C：显示了用高脂饲料(HFD)喂饲的14天期间，Gpihbp1^-/-大鼠血浆胆固醇水平的变化。

图10D：显示了高脂饲料(HFD)喂饲后14天，HE染色观察注射重组AAV病毒载体对Gpihbp1^-/-大鼠的胰腺组织损伤程度的影响。

图10E：显示了高脂饲料(HFD)喂饲后14天，HE染色观察注射重组AAV病毒载体对Gpihbp1^-/-大鼠的肺组织损伤程度的影响。

图11：显示了WT仓鼠高脂饲料喂饲前后，以及注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL后的血浆TG浓度。在喂饲高脂饲料前，喂饲高脂饲料后第28天，以及注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL(1E12vg/kg)后第7，14，28天(实验开始的第35，42，56天)，过夜禁食12小时，取血，检测血浆TG浓度。

图12：显示了WT仓鼠高脂饲料喂饲前后，以及注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL后血浆TC浓度。在喂饲高脂饲料前，喂饲高脂饲料后第28天，以及注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL(1E12vg/kg)后第7，14，28天(实验开始的第35，42，56天)，过夜禁食12小时，取血，检测血浆TC浓度。

图13：显示了WT仓鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL后第14天口服脂质负荷试验。WT仓鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL(1E12vg/kg)后第14天，过夜禁食12小时，取零点血，橄榄油灌胃后，检测1，2，4，8小时的血浆TG浓度。

图14：显示了WT仓鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL后第28天血浆LPL活性。WT仓鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL(1E12vg/kg)后第28天，静脉注射肝素，取肝素后血浆，用试剂盒检测血浆LPL活性。

图15：显示了WT仓鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL第30天取材后，肝脏optLPLmRNA检测。WT仓鼠注射AAV5-EGFP或AAV5-optLPL(1E12vg/kg)后第30天(实验开始后第58天)取材，PBS灌流后，取肝组织，提RNA，通过qPCR检测肝脏中optLPL的mRNA。

发明详述

本发明公开了一种预防和/或治疗严重高甘油三酯血症的基因药物，涉及该基因药物的设计、小量制备及功能验证。

除非下文中另外定义，否则本说明书中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

I.定义

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。

术语“脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)”是一种对脂蛋白甘油三酯进行脂解的脂肪酶。在肠道中，膳食脂肪被吸收、包装成富含甘油三酯的脂蛋白颗粒，并通过生物体的循环系统输送至合适的外周组织，这对于维持生物体的代谢稳态是必不可少的，这些过程的缺陷或失调会导致代谢疾病，例如，糖尿病、肥胖症和高脂血症。脂蛋白甘油三酯的脂解需要LPL。当所述脂解发生在毛细血管内皮细胞的腔表面(luminal surface)时，LPL的脂解作用部分地受到蛋白质GPIHBP1的调节。GPIHBP1是毛细血管内皮细胞的一种GPI锚定蛋白，负责将LPL跨过内皮细胞转运至毛细血管腔。没有这种转运，LPL会错误地定位在内皮下胞间间隙(interstitial space)，无法到达富含甘油三酯的脂蛋白处，从而导致严重的高甘油三酯血症。

人类LPL基因位于第8号染色体p22上，约30kb，由10个外显子和9个内含子组成，编码包含27个氨基酸信号肽在内的475个氨基酸蛋白。LPL基因主要在心脏、骨骼肌和脂肪组织中表达。编码LPL的信使RNA长约3560bp，其信号肽由27个氨基酸组成。人的成熟LPL由448个氨基酸残基组成。

如本文中所用，术语“功能性LPL”是指具有全长野生型(天然)人LPL(如NCBIprotein数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)登录号NP_000228.1所示)的氨基酸序列的酶、其变体(例如，具有保守氨基酸置换的变体)、其片段，所述变体或片段提供至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、或大约相同、或大于100％的全长野生型(天然)人LPL的生物活性水平。

LPL变体的示例包括但不限于LPL-S447X，其是通过去掉野生型(天然)人LPL的C端最后两个氨基酸而获得。

如本文中所用，术语“保守氨基酸置换”或“保守氨基酸取代”是指将氨基酸改变、置换或取代成具有相似生物化学性质(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸，这是本领域技术人员已知的。

存在多种通过常规方法来测量LPL表达和活性水平的测定法。参见，例如本说明书实施例3。

LPL功能障碍会导致血浆甘油三酯升高。与LPL功能密切相关的GPIHBP1的缺陷也会使得LPL无法转运至毛细血管腔发挥水解TRL上TG的作用，造成严重的高甘油三酯血症。急性胰腺炎(acute pancreatits,AP)是一种常见的急腹症，死亡率极高，其中，脂蛋白脂酶功能障碍和/或GPIHBP1缺陷对高乳糜微粒血症、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia，HTG)及随之发生的急性胰腺炎的影响最为显著。

“信号序列”是连接至蛋白质的N-端部分的氨基酸的序列，其促进蛋白质分泌至细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。

术语“N端”指N端的最末氨基酸，术语“C端”指C端的最末氨基酸。

术语“有效连接”意指指定的各组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

术语“调控序列”或“表达控制序列”是指这样的核酸序列，其诱导、抑制或以其它方式控制与之有效连接的编码核酸序列的蛋白质转录。调控序列可以是例如起始序列、增强子序列、内含子序列和启动子序列等。

描述核酸或蛋白质时所用的术语“外源的”是指核酸或蛋白质不是天然存在于其存在的染色体或宿主细胞的位置。外源核酸序列也指衍生自并插入相同宿主细胞或受试者但以非天然状态存在的序列，例如，不同的拷贝数，或受不同调控元件的控制。

如本文中所用，术语“腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)”因在腺病毒制品中发现而得名。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA。

AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、或辅助因素提供辅助功能蛋白才能复制。

最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”(inverted terminal repeat,ITR)，呈回文-发卡结构。基因组中有两个大开放阅读框(ORF)，分别编码rep和cap基因。已将AAV2的全长基因组克隆至大肠杆菌质粒中(Samulski RJ等人，Proc Natl Acad Sci USA.1982；79:2077-2081.Laughlin CA等人，Gene.1983；23:65-73)。

ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site，RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用。

AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区。

rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs和GAGY重复基序特异性结合，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序和/或GAGY重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，启动分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40具有ATP依赖的DNA解旋酶活性，但没有结合DNA的功能。

cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

如本文中所用，术语“AAV载体”是人们随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，将野生型AAV病毒改造成的一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带待转运的外源基因表达框。AAV病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过其他外源质粒反式提供，由此降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。进一步地，AAV病毒本身不具有致病性，这使得AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体所携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率(Wang Z等人，Gene Ther.2003；10(26):2105-2111；McCarty DM等人，GeneTher.2003；10(26):2112-2118)。包装得到的病毒成为scAAV(self-complementary AAV)病毒，即所谓的双链AAV病毒。它不同于双侧ITR均未突变的ssAAV(single-stranded AAV)，即传统的AAV病毒。

scAAV病毒载体的包装容量更小，仅为ssAAV病毒载体包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。

AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z等人，Mol Ther.2006；14(3):316-327)。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导入至大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能(Samaranch L等人，Hum Gene Ther.2012；23(4):382-389)。

此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸、碱和高温体现出较强的耐受性(GruntmanAM等人，Hum Gene Ther Methods.2015；26(2):71-76)，容易开发出稳定性较高的生物制品。

现有技术中对AAV载体具有相对成熟的包装系统，这便于规模化生产AAV载体。

目前常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒作为辅助病毒的系统、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV1)作为辅助病毒的包装系统、以及基于杆状病毒的包装系统。每种包装系统都各具特点，本领域技术人员可以根据需要做出合适的选择。

三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。

Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统(Yuan Z等人，Hum GeneTher.2011；22(5):613-624)，该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。

HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略(伍志坚，吴小兵等，科学通报，1999，44(5)：506-509；Conway JE等人，Gene Ther.1999，6：986-993)。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略(Wustner JT等人，MolTher.2002，6(4)：510-518)。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列(Inverted terminal repeat，ITR)/外源基因表达框，然后用这两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒(Booth MJ等人，Gene Ther.2004；11:829-837)。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统(Thomas DL等人，Gene Ther.2009；20:861-870)，使更大规模的AAV病毒生产成为可能。

Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构基因、非结构基因和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两个或一个杆状病毒(Chen H.，Mol Ther.2008，16(5)：924-930；Galibert L.等人，JInvertebr Pathol.2011；107Suppl:S80-93)以及一个杆状病毒组合一株诱导细胞株策略(Mietzsch M等人，Hum Gene Ther.2014；25:212-222，Mietzsch M等人，Hum GeneTher.2015；26(10):688-697)。

由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2016年8月，世界上批准的基于AAV载体的基因治疗临床试验方案有173项(http://www.abedia.com/wiley/vectors.php)。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物(

S.，Mol Ther.2012；20(10):1831-1832)；血友病B(Kay MA等人，Nat Genet.2000；24(3):257-261)和先天性黑蒙症(RPE65基因突变引起)(Jacobson SG等人，Arch Ophthalmol.2012；130(1):9-24)的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。

术语“载体基因组(vg)”是指包装在rAAV衣壳内形成rAAV载体的核酸序列。在一个实施方案中，载体基因组至少包含5’至3’的AAV2 5’ITR、编码功能性LPL的核酸序列和AAV23’ITR。也可以选择来自除AAV2以外的不同来源AAV的ITR。此外，载体基因组可以包含指导功能性LPL表达的调控序列。

如本文中所用，术语“miRNA(microRNA)”是指广泛存在于人类和动物体内的长度为18至25个核苷酸(nucleotide，nt)的单链非编码RNA。

1993年miRNA首先在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现。秀丽隐杆线虫中lin-4基因能够下调lin-14基因的表达，但lin-4基因的编码产物不是蛋白质，而是一种小RNA分子，这表明自身编码的小RNA分子能够调节基因的表达。随后，多种类似的小RNA分子在不同的物种和细胞中相继发现，miRNA开始成为该类小RNA的统称。

miRNA调节人类大约60％基因的表达(Friedman RC等人，Genome Res.2009；19:92-105)，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。

miRNA基因通常位于基因组的外显子、内含子和基因间区中(Olena AF等人，JCell Physiol.2010；222:540-545；Kim VN等人，Trends Genet.2006；22:165-173)。在细胞内，miRNA的产生过程如下所述。首先，在细胞核中，miRNA基因由RNA聚合酶II或III启动转录产生初始产物pri-microRNA；pri-microRNA自我折叠部分序列形成茎环结构。随后，由核糖核酸酶III Drosha和DGCR8分子组成的加工复合体作用于pri-microRNA，切去多余序列，留下60nt左右的茎环结构，即前体miRNA分子pre-microRNA。然后，在转运蛋白Exportin-5的协助下，pre-microRNA从细胞核进入细胞质中，经Dicer酶加工去掉其茎环结构中的环形部分，变为双链RNA分子。最后，双链RNA分子被AGO2等蛋白因子结合，其中一条链发生降解，另一条链和蛋白因子形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)。RISC识别mRNA中的靶序列，通过降解mRNA分子、促进mRNA分子3’端去腺苷化和抑制翻译来降低mRNA的表达水平，在转录后水平调节基因的表达(Fabian MR等人，Annu RevBiochem.2010；79:351-379)。因此，利用细胞内高表达的miRNA，在外源基因的3’UTR(untranslated region)插入该miRNA的靶序列，能够有效地抑制外源基因在导入细胞中的表达。

miR-142-3p是一种miRNA，其在造血干细胞系来源细胞中高表达。

免疫细胞均分化来源于造血干细胞系，因此利用miRNA抑制基因表达的原理(KimVN.Nat Rev Mol Cell Biol.2005；6(5):376-385)，携带miR-142-3p靶序列的基因表达会在免疫细胞中受到明显抑制，从而降低机体产生针对基因表达产物免疫反应的概率(Dismuke DJ等人，Curr Gene Ther.2013；13(6):434-452)。

术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。

用于本文时，“预防”包括对疾病或特定疾病的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有高甘油三脂家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，术语“预防”是指在高甘油三脂血症发生前，特别是在具有LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷的受试者中于高甘油三脂血症发生前的药物施用。

II.表达框

在一个方面，本发明提供了一种功能性人脂蛋白脂酶基因表达框，其包含编码功能性LPL的核苷酸序列和指导其表达的调控序列。

在一个实施方案中，表达框包含如本文所述的编码功能性LPL的核苷酸序列和指导其表达的调控序列。在一个实施方案中，编码功能性LPL的核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、90％的同一性，例如，具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。又在一个实施方案中，编码功能性LPL的核苷酸序列是插入有SEQ ID NO:2所示的内含子序列或者插入有与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性(例如，具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的内含子序列的编码功能性LPL(例如，LPL-S447X)的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码功能性LPL的核苷酸序列选自

(i)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的编码功能性LPL的核苷酸序列；

(ii)与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的功能性LPL，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(iv)与(i)或(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少70％、80％、90％同一性(例如，具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列。

在一个实施方案中，指导功能性LPL表达的调控序列包含肝特异性启动子，例如，白蛋白启动子、乙肝病毒核心启动子、α甲胎蛋白(AFP)启动子、CMV启动子等。优选地，调控序列包含如SEQ ID NO:5所示的LP15启动子序列或者与其具有至少约90％同一性(例如，具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的启动子序列。与使用CMV启动子相比较，使用所述LP15启动子能够避免CMV启动子进入体内表达易被甲基化沉默，提高功能性LPL的表达水平，更好地实现肝脏靶器官的特异性表达。

在一个实施方案中，调控序列进一步包含可降低功能性LPL在免疫相关细胞(如抗原呈递细胞)中的表达，减弱功能性LPL表达带来的免疫反应的序列，由此显著降低针对外源性LPL蛋白发生免疫反应的概率，所述序列为例如一个或多个(例如，1－8个、2－7个、3个、4个、5个或6个)串联的与miR-142-3p互补的靶序列，由此，本发明的表达框转录得到编码功能性LPL(例如，LPL-S447X)的mRNA的非翻译区(例如，5’端非翻译区和/或3’端非翻译区中含有人miR-142-3p靶序列，能够有效地抑制功能性LPL(例如，LPL-S447X)在免疫相关细胞(如抗原呈递细胞)中的表达，抑制免疫反应。

在一个实施方案中，调控序列包含一个或多个表达增强子，例如，TBG增强子、CMV增强子等。在一个具体实施方案中，调控序列包含如SEQ ID NO:11所示的或者与其具有至少约90％同一性(例如，与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的TBG增强子序列。

在一个实施方案中，调控序列进一步包含聚腺苷酸化信号(polyA)，例如，人生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列、SV40 polyA、BGH polyA。在一个具体实施方案中，调控序列包含如SEQ ID NO:10所示的或者与其具有至少约90％同一性(例如，与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的BGH polyA序列。

III.病毒载体

又在一个方面，本发明提供了一种病毒载体，其为人造的重组病毒颗粒，其中，包含编码功能性LPL的表达框的复制缺陷型病毒基因组序列被包装在病毒衣壳或包膜中，从而所述重组病毒颗粒不能产生子代病毒体，但保留了感染靶细胞的能力。

在一个实施方案中，病毒载体的基因组序列不包含编码病毒复制所需的酶的基因，因此，认为在基因疗法中使用病毒载体是安全的，因为在不存在病毒复制所需的酶的情况下，子代病毒体的复制和感染是不会发生的。

本发明的重组病毒载体可以是重组的腺相关病毒(AAV)、腺病毒、博卡病毒(Bocavirus)、AAV/博卡病毒杂交体、单纯疱疹病毒或慢病毒。

生产重组病毒载体(例如，重组AAV载体)的包装细胞系可以是原核细胞或真核细胞(例如，人类细胞、昆虫细胞或酵母细胞)，其含有通过任何方式(例如电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染、转染和原生质体融合)引入细胞中的外源DNA。包装细胞系细胞包括但不限于大肠杆菌细胞、酵母细胞、人类细胞、非人类细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、昆虫细胞、HEK293细胞、肝细胞、肾细胞、神经胶质细胞或干细胞。

如本文所用，术语“靶细胞”是指其中期望表达功能性LPL的靶细胞。靶细胞的示例包括但不限于肝细胞、肌细胞。在一些实施方案中，将载体体内递送至靶细胞。

在一个优选的实施方案中，病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组。rAAV载体用于治疗LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷和/或高脂饮食诱发的高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎。载体基因组包含AAV 5’反向末端重复序列(ITR)或AAV 5’ΔITR、编码功能性LPL的核酸序列、指导LPL在靶细胞中表达的调控序列、以及AAV 3’ITR或AAV 3’ΔITR。所述ΔITR是删除了D序列和末端解链位点trs的ITR。ITR是在载体生产期间负责基因组的复制和包装的遗传元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。可以选择来自不同来源AAV的ITR。在一个实施方案中，ITR来自与病毒颗粒的衣壳不同的AAV。

除非另有说明，否则本文描述的AAV衣壳、ITR和其它AAV组分可以容易地从任何AAV中选择，包括但不限于通常被鉴定为AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10或它们的组合的血清型的AAV。在一个实施方案中，AAV衣壳是AAV5衣壳或其变体。在一个实施方案中，AAV衣壳是AAV3B衣壳或其变体。在一个实施方案中，AAV衣壳是AAV8衣壳或其变体。在一个实施方案中，AAV衣壳是AAV9衣壳或其变体。在某些实施方案中，衣壳蛋白由rAAV载体名称中术语“AAV”之后的数字或数字和字母的组合来指定。

在一个实施方案中，提供一种这样的rAAV，其包含AAV血清型5(AAV5)衣壳；和包含SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少约90％同一性的序列的载体基因组。

在一个实施方案中，提供一种这样的rAAV，其包含AAV血清型3B(AAV3B)衣壳；和包含SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少约90％同一性的序列的载体基因组。

在一个实施方案中，提供一种这样的rAAV，其包含AAV血清型8(AAV8)衣壳；和包含SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少约90％同一性的序列的载体基因组。

在一个实施方案中，提供一种这样的rAAV，其包含AAV血清型9(AAV9)衣壳；和包含SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少约90％同一性的序列的载体基因组。

如本文中所用的，AAV“变体”是指衍生自已知的AAV序列的任何AAV序列，包括具有保守氨基酸置换的那些AAV序列，以及与AAV的氨基酸或核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更大的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，AAV衣壳包括可以包含与任何描述或已知的AAV衣壳序列相比高达约10％的变异的变体。即，AAV衣壳与本文提供的和/或本领域已知的AAV衣壳具有约90％的同一性至约99.9％的同一性，约95％至约99％的同一性或约97％至约98％的同一性。在一个实施方案中，AAV衣壳与AAV衣壳变体具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。当确定AAV衣壳的百分同一性时，可以对任何变体蛋白(例如vp1、vp2或vp3)进行比较。

IV.病毒载体的制备方法

本发明的重组腺相关病毒(AAV)载体可以使用已知的技术产生。此类方法涉及培养包装细胞，其包含编码AAV衣壳的核酸序列；功能性rep基因；如本文描述的表达框，其侧接有AAV反向末端重复序列(ITR)或ΔITR；和足够的辅助功能，以允许将表达框包装到AAV衣壳蛋白中。

本文还提供了包装细胞，其包含编码AAV衣壳的核酸序列；功能性rep基因；如本文描述的表达框，其侧接有AAV反向末端重复序列(ITR)或ΔITR；和足够的辅助功能，以允许将表达框包装到AAV衣壳蛋白中。在一个实施方案中，宿主细胞是HEK 293细胞。

可以利用本领域已知的产生rAAV的其它方法。合适的方法可以包括但不限于杆状病毒表达系统或通过酵母生产。

V.病毒载体的用途

本发明的病毒载体作为一种基因药物，能够通过静脉注射，在肝脏异位地、特异性表达预防和/或治疗严重高甘油三酯血症的功能性LPL。

通过静脉注射本发明的病毒载体，在成年患者的机体本身不表达LPL基因的肝脏中异位表达功能性LPL，且所表达的功能性LPL不依赖于GPIHBP1即可实现对血浆中TG的水解，使较高的甘油三酯水平趋于正常。

本发明的病毒载体可以用于预防和/或治疗高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎。在一些实施方案中，本发明的病毒载体可以用于预防和/或治疗LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷和/或高脂饮食诱发的高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎。

实施例

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

实施例1.AAV质粒载体的构建

在本实施例中构建了包含目的基因和目的基因表达调控元件、以及ITR序列的AAV质粒载体。

首先构建了pUC57-optLPL-S447X载体。

具体而言，登录NCBI protein数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)，搜索得到人LPL蛋白质氨基酸序列(NP_000228.1)(448aa)，去掉C端最后两个氨基酸即为LPL-S447X的氨基酸序列(446aa)，将LPL-S447X对应的编码序列进行人源密码子优化，并增加一个终止密码子，获得编码功能性LPL的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

将人14号染色体中免疫球蛋白重链表达基因的如SEQ ID NO:2所示的内含子(长度为82bp)插入SEQ ID NO:1所示的LPL-S447X编码序列。该内含子序列将LPL-S447X编码序列分为两部分(分别称为：LPL-S447X CDS part1和LPL-S447X CDS part2)，插入该内含子序列后，获得了LPL-S447X CDS part1-内含子-LPL-S447X CDS part2序列，如SEQ ID NO:3所示，文中也称为“optLPL-S447X”或“优化的LPL-S447X”或简称为“optLPL”。

作为对照，也合成了未插入内含子的LPL-S447X编码序列(即，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列)，下文中也称为“未插入内含子的LPL-S447X”。

将未插入内含子的LPL-S447X编码序列(SEQ ID NO:1)和optLPL-S447X的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)均送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并分别克隆入pUC57simple载体(南京金斯瑞生物科技有限公司)，得到pUC57-LPL-S447X质粒载体和pUC57-optLPL-S447X质粒载体。

另外，构建了图1A所示的pscAAV-LP15-EGFP-kan-4×142T质粒载体(下文中也将该载体简称为pscAAV-LP15-EGFP载体)，其序列如SEQ ID NO:4所示，包含：

i)LP15启动子，所述LP15启动子的序列如SEQ ID NO:5所示，由人AMBP(X67082.1)的增强子序列、人ALB(M12523.1)的增强子序列和长度为128bp的启动子序列以及小鼠微小病毒(MVM)内含子(大小为67bp)拼接而成；

ii)4个串联的人miR-142-3p靶序列，也缩写为“4×142-3pT”。4×142-3pT的序列如SEQ ID NO:7所示；

iii)牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号，也缩写为BGH polyA；

iv)人甲状腺素结合球蛋白(thyroxine-binding globulin，TBG)基因增强子序列；

v)EGFP，所述EGFP是表达增强型绿色荧光蛋白的核苷酸序列。

然后，用KpnI和EcoRI双酶切消化pUC57-optLPL-S447X载体，产生2.7kb和1507bp两个片段，回收长度为1507bp的片段，为optLPL-S447X编码序列。用KpnI和EcoRI双酶切消化构建的图1A所示的pscAAV-LP15-EGFP-kan-4×142T载体，得到5403bp和748bp两个片段，回收长度为5403bp的片段。连接所获得的长度为1507bp的片段和长度为5403bp的片段，得到图1B所示的pscAAV-LP15-optLPL-S447X-kan-4×142T载体，经SmaI酶切(产生3149bp/1356bp/1275bp片段)鉴定该载体，下文中也将该载体简称为pscAAV-LP15-optLPL-S447X载体。

类似地，用KpnI和EcoRI双酶切消化pUC57-LPL-S447X载体，产生2.7kb和1425bp两个片段，回收长度为1425bp的片段。另外，用KpnI和EcoRI双酶切消化图1A所示的pscAAV-LP15-EGFP-kan-4×142T载体，得到5403bp和748bp两个片段，回收长度为5403bp的片段。连接所获得的长度为1425bp的片段和长度为5403bp的片段，得到图1C所示的载体，经SmaI酶切(产生5636bp/2487bp/2476bp/144bp/133bp片段)鉴定该载体，下文中也将该载体简称为pscAAV-LP15-LPL-S447X载体。

将肝细胞Huh7(获自ATCC)均匀接种在24孔板中，1×10⁵个细胞/孔，37℃CO₂培养箱中温育过夜使细胞贴壁。使用脂质体转染法分别将pscAAV-LP15-optLPL-S447X质粒和pscAAV-LP15-LPL-S447X质粒转染入Huh7细胞中，作为对照，同样地将pscAAV-LP15-EGFP质粒转染入Huh7细胞中，转染条件均为1μl Lipofectamine 2000:2μg质粒DNA，转染后6h换液，放入细胞培养箱中继续培养48h后收获细胞，提取细胞总RNA，通过RT-qPCR分别检测LPL-S447X mRNA和optLPL-S447X mRNA的转录。具体过程如下：

在LPL-S447X基因上设计两条引物LPL-F和LPL-R：

LPL-F：5’-TCAACCACAGCTCCAAGACC-3’(SEQ ID NO:8)

LPL-R：5’-GTATAGCCGGCGGACACTG-3’(SEQ ID NO:9)

以LPL-F和LPL-R为引物特异性地扩增LPL-S447X基因长度为173bp片段，采用SYBRGreen染料结合法，应用SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂(Takara，大连，中国)，使用荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500fast，ABI)检测。操作过程参见SYBR Premix ExTaq II(Tli RNaseH Plus)试剂说明书。

检测结果如图2所示，显示了插入SEQ ID NO:2所示的内含子后，optLPL-S447XmRNA的转录效率显著提高，是未插入内含子的LPL-S447X mRNA的近10倍。

实施例2.重组AAV病毒的制备和检定

在本实施例中采用三质粒共转染HEK293包装系统包装重组AAV病毒，得到了scAAV5-LP15-opt LPL-S447X重组病毒。

首先，构建了pAAV-R2C5质粒。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies，目录号#240071)中的pAAV-RC质粒为基本骨架，采用标准的分子克隆方法，用合成的AAV5基因组(GenBank ID：NC_006152.1)中的衣壳蛋白编码序列(也称为Cap5)(基因组中第2207至4381位序列)替换pAAV-RC质粒中HindIII至PmeI限制性酶切位点之间的序列(即，替换pAAV-RC质粒的第2013至4220位序列)，获得了pAAV-R2C5质粒。所述pAAV-R2C5质粒包含完整的AAV5的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV5病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV5衣壳蛋白。

然后，取实施例1构建的AAV载体质粒(pscAAV-LP15-optLPL-S447X载体)、辅助质粒(pHelper)(来自AAV Helper Free System，Agilent Technologies)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒pAAV-R2C5，将这三种质粒按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法共转染HEK293细胞，转染48小时后，收获细胞和培养上清液，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒，得到scAAV5-LP15-optLPL-S447X重组病毒。由于使用的质粒pAAV-R2C5表达了AAV5衣壳蛋白，由此，获得的是AAV5重组病毒。

采用定量PCR方法测定通过上述制备方法得到的AAV5重组病毒的基因组滴度。具体过程如下：

在LP15启动子中设计两条引物LP15-F和LP15-R：

LP15-F：5’-AAGTGGCCCTTGGCAGCATCT-3’(SEQ ID NO:13)

LP15-R：5’-GGACAAACGGAGGGAAATTAGCACT-3’(SEQ ID NO:14)

以LP15-F和LP15-R为引物特异性地扩增LP15启动子长度为229bp片段，采用SYBRGreen染料结合法，以1μg/μl的pscAAV-LP15-optLPL-S447X质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂(Takara，大连，中国)，使用荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500fast，ABI)检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBRPremix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献(Ulrich-Peter R.等人，J Virol Methods.2002；106:81-88)，获得的AAV5重组病毒滴度约为6E+12vg/ml。

类似地，通过三质粒法，使用实施例1构建的AAV载体质粒pscAAV-LP15-EGFP、辅助质粒(pHelper)(来自AAV Helper Free System，Agilent Technologies)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒pAAV-R2C5，制备了scAAV5-LP15-EGFP重组病毒，并检测了病毒滴度。

实施例3.静脉注射重组AAV病毒治疗LPL基因缺陷小鼠的高甘油三酯血症

从空军军医大学引进条件性LPL基因敲除小鼠。采用20只成年Lpl^-/-小鼠，年龄为8-12周，体重在18-25g。购买后在实验室动物房适应一周，然后称重，用玻璃毛细管进行内眦静脉采血，肝素抗凝，4℃，4000rpm，离心10分钟，分离血浆。使用甘油三酯和胆固醇检测试剂盒(购自：中生北控生物科技股份有限公司)检测甘油三脂(TG)和总胆固醇(TC)。

根据检测的甘油三脂(TG)和总胆固醇(TC)结果将Lpl^-/-小鼠分为4组，每组5只小鼠。施用设置为：一次静脉注射scAAV5-LP15-optLPL-S447X病毒(简称AAV5-optLPL病毒)的高中低3个剂量组(高剂量1E+13vg/kg；中间剂量1E+12vg/kg；低剂量1E+11vg/kg)和一次静脉注射scAAV5-LP15-EGFP病毒(1E+13vg/kg)(简称AAV5-EGFP)的对照组。

根据待静脉注射的重组AAV病毒剂量和实施例2检测的AAV病毒滴度，计算出所需的对每组小鼠注射的重组AAV病毒液的体积，然后用无菌PBS定容至100μL，将各组小鼠分别通过尾静脉注射给予相应的重组AAV病毒。

在重组AAV病毒静脉注射后的第7、14、28、56天，分别在将动物过夜禁食12小时后，内眦静脉采血，测定血浆TG、TC。结果显示，静脉注射scAAV5-LP15-optLPL-S447X病毒后，血浆中的TG和TC均显著性降低，特别是TG的下降幅度更加明显(图3，图4)。

另外，在静脉注射重组AAV病毒后第14天，按照100U/kg的剂量通过尾静脉注射肝素，注射10分钟后取血，离心分离得到血浆，用该肝素后血浆作为酶源，使用LPL试剂盒(Abcam)，测量LPL活性。结果表明：静脉注射AAV5-optLPL病毒的三个组的血浆均具有LPL活性，且该LPL活性随着注射的病毒载体剂量的加大而增加，而AAV5-EGFP病毒组没有检测到血浆LPL活性(图5)。

在重组AAV病毒静脉注射后第56天，处死小鼠，取肝脏，检测外源性LPL基因的mRNA表达水平。在施与scAAV5-optLPL-S447X病毒的小鼠组中检测到了optLPL-S447X mRNA,并且optLPL-S447X mRNA水平呈剂量依赖性增加(图6)。

实施例4Gpihbp1^-/-小鼠尾静脉注射AAV5-optLPL治疗高甘油三酯血症

Gpihbp1^-/-小鼠购自Jackson Laboratory，饲养于东部战区总医院比较医学科动物房。12周龄成年Gpihbp1^-/-小鼠随机分为AAV治疗组和PBS对照组两组，每组15只。AAV治疗组给予尾静脉注射AAV5-optLPL重组病毒，注射剂量为1×10¹³vg/kg。PBS对照组给予注射同等体积PBS。在注射后不同的时间点(0天、7天、14天、28天和2月)内眦静脉取血检测血浆甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHO)含量变化，注射治疗后2月，取肝素后血浆检测循环LPL浓度及活性。

从图7A和图7B的结果可知，Gpihbp1^-/-小鼠AAV治疗组和PBS对照组相比，治疗前0天基线血浆甘油三酯和总胆固醇水平无显著差别，均呈现重度高甘油三酯血症。经尾静脉注射AAV5-optLPL重组病毒后7天，治疗组Gpihbp1^-/-小鼠血浆甘油三脂水平即明显降低，接近正常值水平。降脂效果维持至治疗后2个月，长期有效，离心后的小鼠外周血血浆外观与野生型C57小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)血浆无差别(图7C)。

治疗两个月后，AAV治疗组Gpihbp1^-/-小鼠肝素后血浆LPL浓度相较于PBS对照组Gpihbp1^-/-小鼠升高接近10倍(图7D)，血浆LPL活性升高约2倍(图7E)。

实施例5.Gpihbp1^-/-小鼠尾静脉注射AAV5-optLPL减轻施用雨蛙素诱导的高甘油三酯血症急性胰腺炎的易感性与严重程度

对实施例4的Gpihbp1^-/-小鼠尾静脉注射AAV5-optLPL治疗2月后，进一步对所述Gpihbp1^-/-小鼠评估了施用雨蛙素后的影响。

施用雨蛙素诱导建立高甘油三酯血症急性胰腺炎(HTG-AP)模型的实验方案：在实施例4中对Gpihbp1^-/-小鼠尾静脉注射AAV5-optLPL治疗2月后，将注射AAV治疗组再随机分为极低剂量雨蛙素(Cae:5μg/kg/h*10针)组(n＝6)，常规剂量雨蛙素(Cae:50μg/kg/h*10针)组(n＝6)和未造模(腹腔注射同等体积PBS)组(n＝3)，其中所述10针是10次腹腔注射，每小时注射一次。PBS对照组同样随机分为极低剂量雨蛙素(Cae:5μg/kg/h*10针)组(n＝6)，常规剂量雨蛙素(Cae:50μg/kg/h*10针)组(n＝6)和未造模(腹腔注射同等体积PBS)组(n＝3)。造模后6、12、24h，取材小鼠外周血，进行血浆生化淀粉酶检测；留取胰腺组织，显微拍摄胰腺组织切片的苏木精和伊红(HE)染色照片，结果如下。

当对野生型C57小鼠施用极低剂量雨蛙素(5μg/kg/h*10次)时，不会诱发急性胰腺炎。对于Gpihbp1^-/-小鼠未治疗的PBS对照组由于重度高脂血症，当给予极低剂量雨蛙素(5μg/kg/h*10次)时，从图8A、图8B的结果可知，增加了AP的易感性，胰腺病理呈现轻度水肿、炎症细胞浸润的胰腺炎症表现，同时血浆生化淀粉酶水平增高；而经尾静脉注射AAV5-optLPL治疗后的Gpihbp1^-/-小鼠，血脂水平接近正常，AP易感性降低，胰腺病理无炎症表现，血浆生化淀粉酶水平轻度升高。

另外，从图8C－图8G的结果可知，给予常规剂量雨蛙素(50μg/kg/h*10次)诱导AP模型，未治疗的PBS对照组Gpihbp1^-/-小鼠呈现重度HTG-AP表现，胰腺组织水肿、大量炎症细胞浸润并伴有胰腺组坏死，血浆淀粉酶、脂肪酶水平增高。而经尾静脉注射AAV5-optLPL降脂治疗后的Gpihbp1^-/-小鼠，血脂水平接近正常，HTG-AP严重程度显著降低，胰腺病理仅表现为轻度水肿，血浆生化淀粉酶、脂肪酶水平相较于对照组显著下降。

实施例4和实施例5的结果表明，Gpihbp1^-/-小鼠经尾静脉注射AAV5-optLPL病毒后，能够有效地表达产生LPL蛋白，增加循环LPL浓度和活性，由此，降低Gpihbp1^-/-小鼠血浆中甘油三酯的含量，消除因血液中甘油三酯过高带来的高甘油三酯血症，减轻高甘油三酯血症性急性胰腺炎的易感性及严重程度，从而达到治疗高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的目的。

实施例6.Gpihbp1^-/-大鼠静脉注射AAV-optLPL治疗高甘油三酯血症，降低乳鼠死亡率，减轻HFD喂饲诱导的HTG-AP

Gpihbp1^-/-大鼠动物模型是通过TALEN基因编辑技术，在GPIHBP1基因外显子2上设计靶点，敲除102bp片段构建而成，由北京大学医学部刘国庆教授团队和东部战区总医院重症胰腺炎中心李维勤主任团队提供。经鉴定具有重度高脂血症表型，并从哺乳期血脂水平急剧增高达10000mg/dl以上，自发HTG-AP，28天存活率仅为60％。使用野生型SD大鼠(购自南京青龙山动物繁殖场)用作对照。

存活的成年Gpihbp1^-/-大鼠随着鼠龄增加，血脂水平逐渐增加，胰腺炎症病理逐渐加重。给予高脂饲料(HFD)喂饲后急性暴发HTG-AP，胰腺包裹性坏死，HFD喂饲后28天死亡率达42.3％。

为挽救Gpihbp1^-/-大鼠哺乳期高死亡率，给予新生乳鼠出生后7天经眶静脉注射AAV5-optLPL病毒降脂治疗，剂量1×10¹³vg/kg，对照组Gpihbp1^-/-乳鼠注射同等体积PBS，观察28天，记录生存曲线。在注射后不同的时间点(7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天)内眦静脉取血检测血浆甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHO)含量变化。哺乳期经AAV5-optLPL病毒降脂治疗的Gpihbp1^-/-大鼠随着鼠龄增长，体重增加，体内病毒载体量相对不足，血脂水平逐渐复升，于8周龄成年时对所述大鼠经尾静脉二次注射AAV8-optLPL病毒，分为高剂量组(1×10¹³vg/kg)和低剂量组(1×10¹¹vg/kg)。所述二次注射的AAV8-optLPL病毒是如下制备的：

首先，构建了pAAV-R2C8质粒。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies，目录号#240071)中的pAAV-RC质粒为基本骨架，采用标准的分子克隆方法，用合成的AAV8基因组(GenBank ID：NC_006261.1)中的衣壳蛋白编码序列(也称为Cap8)(基因组中第2121至4337位序列)替换pAAV-RC质粒中HindIII至PmeI限制性酶切位点之间的序列(即，替换pAAV-RC质粒的第2013至4220位序列)，获得了pAAV-R2C8质粒。所述pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV8病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV8衣壳蛋白。

然后，取实施例1构建的AAV载体质粒(pscAAV-LP15-optLPL-S447X载体)、辅助质粒(pHelper)(来自AAV Helper Free System，Agilent Technologies)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒pAAV-R2C8，将这三种质粒按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法共转染HEK293细胞，转染48小时后，收获细胞和培养上清液，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV8病毒，得到scAAV8-LP15-optLPL-S447X重组病毒(也简称为“AAV8-optLPL病毒”)。由于使用的质粒pAAV-R2C8表达了AAV8衣壳蛋白，由此，获得的是AAV8重组病毒。与实施例2同样地通过定量PCR方法测定通过上述制备方法得到的AAV8重组病毒的基因组滴度。

对Gpihbp1^-/-大鼠经尾静脉二次注射AAV8-optLPL病毒治疗后2周，喂饲高脂饲料(Research Diet 12492)14天建立自发HTG-AP模型。喂饲HFD期间的不同时间点(1天、3天、7天、14天)内眦静脉取血检测血浆甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHO)含量变化。喂饲HFD14天后取材外周血、胰腺组织和肺组织。

从图9A-9E的结果可知，和未治疗Gpihbp1^-/-哺乳期乳鼠相比，新生Gpihbp1^-/-乳鼠出生后7天经眶静脉注射AAV5-optLPL病毒降脂治疗后，显著提高Gpihbp1^-/-大鼠28天生存率至80％，血浆生化甘油三酯和总胆固醇水平显著下降，TG水平维持在800-1000mg/dl。8周成年后，经尾静脉二次注射AAV8-optLPL病毒，血脂水平进一步下降至正常水平，并且与注射的AAV8-optLPL病毒载体呈剂量依赖效应。

第一针AAV病毒载体静脉注射后9周(第二针AAV病毒载体静脉注射后2周)去肝素后血浆检测循环中LPL浓度和活性，相较于未治疗Gpihbp1^-/-大鼠，AAV-optLPL治疗后Gpihbp1^-/-大鼠LPL浓度升高10倍(图9G)和LPL活性升高2-3倍(图9H)。离心后血浆外观脂血明显减轻，接近正常大鼠血浆(图9F)。

喂饲HFD饲料后，未治疗Gpihbp1^-/-大鼠血脂水平急剧升高，最高值达18000mg/dl(图10B)。喂饲HFD饲料后14天胰腺外观呈现明显包裹性坏死(图10A)，胰腺组织HE染色见大片状胰腺组织坏死，大量炎症细胞浸润，呈现纤维化表现，自发HTG-AP严重(图10D)，同时全身炎症反应，肺组织病理表现为急性肺损伤(图10E)，多脏器功能障碍。

对AAV5-optLPL和AAV8-optLPL治疗后的Gpihbp1^-/-大鼠喂饲HFD，血脂水平3天应激性升高后，迅速下降，低剂量AAV8-optLPL治疗组血浆甘油三脂水平3天升高至大于5000mg/dl，随后逐渐降至约2000mg/dl(图10B)；血浆胆固醇水平起初略有升高，随后逐渐降低(图10C)；胰腺组织病理HE表现炎症细胞浸润，轻度胰腺坏死形成，显著减轻了HTG-AP的严重程度。高剂量AAV8-optLPL治疗组血浆甘油三脂水平轻度升高至1000mg/dl；血浆胆固醇水平维持在较低水平；胰腺组织外观基本正常，病理HE表现无炎症细胞浸润，无胰腺坏死形成，预防了HTG-AP的发生(图10D)。

以上结果表明，Gpihbp1^-/-大鼠经静脉注射AAV-optLPL病毒治疗后，能够有效地表达产生LPL蛋白，降低大鼠血浆中甘油三酯的含量，降低Gpihbp1^-/-大鼠哺乳期因重度高脂血症诱发HTG-AP导致的高死亡率，同时预防和减轻HFD喂饲诱导的HTG-AP发病，从而达到治疗高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的目的。

实施例7.静脉注射重组AAV病毒治疗高脂饲料喂饲诱发的仓鼠高脂血症模型

从伊维沃生物科技公司购买12只雄性WT仓鼠，年龄在2-3月龄。仓鼠适应性饲养一周后称重。过夜禁食后，用玻璃毛细管进行内眦静脉采血，肝素抗凝，4度，4000rpm，离心10分钟，分离得到血浆。使用甘油三酯和胆固醇检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)检测甘油三脂(TG)和总胆固醇(TC)。

从北京博泰宏达生物科技公司订制胆固醇含量为0.5％且猪油含量为20％的高脂饲料。在仓鼠适应性饲养一周后开始喂饲该高脂饲料(实验的第0天)。在喂饲该高脂饲料4周(实验的第28天)时，过夜禁食12小时后取血，测量血浆TG、TC,根据血脂结果将仓鼠分为两组(以两组之间血浆TG、TC无明显差异为原则)，每组6只。一组小鼠给予颈静脉注射scAAV5-EGFP(简称AAV5-EGFP)，另一组小鼠给予一次颈静脉注射scAAV5-optLPL-S447X(简称AAV5-optLPL)。按照1E+12vg/kg的注射剂量，根据相应的AAV滴度，计算出注射容积，用无菌PBS定容至300μL后给予注射。在注射后第7、14、28天，过夜禁食取血，离心得到血浆，使用试剂盒检测血浆TG，TC。

结果显示，喂饲高脂饲料4周后，仓鼠血浆TG明显升高，TC也有轻微升高。在注射重组AAV病毒后第14天，发现与注射AAV5-EGFP组相比，AAV5-optLPL组血浆TG明显降低。在第28天，AAV5-optLPL组的血浆TG仍然较低(图11，12)。

给药后第14天进行口服脂质负荷试验，即，过夜禁食后，取血(记录为0点血)，然后按照10mL/kg的剂量给予仓鼠橄榄油灌胃，灌胃后第1、2、4、8小时取血，测量血浆TG，结果显示注射AAV5-optLPL组的仓鼠餐后TG的清除明显加快(图13)。

给药后第28天取完测血脂用的禁食血后，给动物喂饲高脂饲料，4小时后再按照500U/kg的剂量腹腔注射肝素，注射20分钟后取血，离心分离得到血浆，用肝素后血浆作为酶源，使用LPL试剂盒(Abcam)，测量LPL活性。结果显示AAV5-optLPL组的LPL活性明显高于AAV5-EGFP组(图14)。

在给药后第30天(即，实验的第58天)取材，检测肝脏外源性LPL基因的mRNA表达水平，在AAV5-optLPL组检测到了外源性LPL基因的mRNA表达(图15)。

以上描述了本发明的示例性实施方案。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实施本申请的发明。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明的技术。

序列表

<110> 北京锦篮基因科技有限公司

<120> AAV介导的人脂蛋白脂酶肝脏异位表达载体及其用途

<130>

<160> 14

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码LPL-S447X的核苷酸序列

<400> 1

atggagtcca aggccctgct ggtgctgaca ctggccgtgt ggctgcagtc tctgaccgca 60

agcaggggag gagtggcagc agcagaccag cggagagact tcatcgatat cgagtccaag 120

tttgcactga ggaccccaga ggacacagca gaggatacct gccacctgat ccctggcgtg 180

gccgagtctg tggccacatg tcacttcaac cacagctcca agaccttcat ggtcatccac 240

ggctggaccg tgacaggcat gtacgagagc tgggtgccta agctggtggc cgccctgtat 300

aagagggagc cagactctaa cgtgatcgtg gtggattggc tgagcagggc acaggagcac 360

tacccagtgt ccgccggcta taccaagctg gtgggacagg acgtggcacg gttcatcaat 420

tggatggagg aggagtttaa ctaccccctg gataatgtgc acctgctggg atattctctg 480

ggagcacacg cagcaggaat cgcaggaagc ctgacaaaca agaaagtgaa taggatcacc 540

ggactggatc cagcaggacc taatttcgag tacgcagagg cacctagcag gctgtcccca 600

gacgatgccg acttcgtgga tgtgctgcac acctttacaa ggggatcccc aggccgctct 660

atcggaatcc agaagcccgt gggccacgtg gacatctatc ccaacggcgg cacctttcag 720

cctggctgca atatcggcga ggccatcaga gtgatcgccg agagaggcct gggcgacgtg 780

gatcagctgg tgaagtgtag ccacgagcgg tccatccacc tgttcatcga ttccctgctg 840

aacgaggaga atccctctaa ggcctacaga tgctctagca aggaggcctt tgagaagggc 900

ctgtgcctgt cctgtaggaa gaaccgctgt aacaatctgg gctacgagat caataaggtg 960

cgggccaaga gatcctctaa gatgtatctg aagacacgga gccagatgcc ttacaaggtg 1020

ttccactatc aggtgaagat ccacttttct ggcaccgaga gcgagaccca cacaaaccag 1080

gccttcgaga tcagcctgta cggcacagtg gccgagtccg agaacatccc attcaccctg 1140

cccgaggtgt ctaccaataa gacatacagc tttctgatct atacagaggt ggacatcggc 1200

gagctgctga tgctgaagct gaagtggaag tctgacagct atttctcctg gtctgattgg 1260

tggagctccc ctggctttgc catccagaag atccgggtga aggccggcga gacccagaag 1320

aaagtgatct tctgctccag agagaaggtg tctcacctgc agaagggcaa ggccccagcc 1380

gtgtttgtga agtgtcacga taagagcctg aataagaagt gataa 1425

<210> 2

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人14号染色体中免疫球蛋白重链表达基因的内含子

<400> 2

gtgagtatct cagggatcca gacatgggga tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca 60

ctgtgggtct ctctgttcac ag 82

<210> 3

<211> 1507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 插入有SEQ ID NO:2所示的内含子的编码LPL-S447X的核苷酸序列

<400> 3

atggagtcca aggccctgct ggtgctgaca ctggccgtgt ggctgcagtc tctgaccgca 60

agcaggggag gagtggcagc agcagaccag cggagagact tcatcgatat cgagtccaag 120

tttgcactga ggaccccaga ggacacagca gaggatacct gccacctgat ccctggcgtg 180

gccgagtctg tggccacatg tcacttcaac cacagctcca agaccttcat ggtcatccac 240

ggctggaccg tgacaggtga gtatctcagg gatccagaca tggggatatg ggaggtgcct 300

ctgatcccag ggctcactgt gggtctctct gttcacaggc atgtacgaga gctgggtgcc 360

taagctggtg gccgccctgt ataagaggga gccagactct aacgtgatcg tggtggattg 420

gctgagcagg gcacaggagc actacccagt gtccgccggc tataccaagc tggtgggaca 480

ggacgtggca cggttcatca attggatgga ggaggagttt aactaccccc tggataatgt 540

gcacctgctg ggatattctc tgggagcaca cgcagcagga atcgcaggaa gcctgacaaa 600

caagaaagtg aataggatca ccggactgga tccagcagga cctaatttcg agtacgcaga 660

ggcacctagc aggctgtccc cagacgatgc cgacttcgtg gatgtgctgc acacctttac 720

aaggggatcc ccaggccgct ctatcggaat ccagaagccc gtgggccacg tggacatcta 780

tcccaacggc ggcacctttc agcctggctg caatatcggc gaggccatca gagtgatcgc 840

cgagagaggc ctgggcgacg tggatcagct ggtgaagtgt agccacgagc ggtccatcca 900

cctgttcatc gattccctgc tgaacgagga gaatccctct aaggcctaca gatgctctag 960

caaggaggcc tttgagaagg gcctgtgcct gtcctgtagg aagaaccgct gtaacaatct 1020

gggctacgag atcaataagg tgcgggccaa gagatcctct aagatgtatc tgaagacacg 1080

gagccagatg ccttacaagg tgttccacta tcaggtgaag atccactttt ctggcaccga 1140

gagcgagacc cacacaaacc aggccttcga gatcagcctg tacggcacag tggccgagtc 1200

cgagaacatc ccattcaccc tgcccgaggt gtctaccaat aagacataca gctttctgat 1260

ctatacagag gtggacatcg gcgagctgct gatgctgaag ctgaagtgga agtctgacag 1320

ctatttctcc tggtctgatt ggtggagctc ccctggcttt gccatccaga agatccgggt 1380

gaaggccggc gagacccaga agaaagtgat cttctgctcc agagagaagg tgtctcacct 1440

gcagaagggc aaggccccag ccgtgtttgt gaagtgtcac gataagagcc tgaataagaa 1500

gtgataa 1507

<210> 4

<211> 6151

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pscAAV-LP15-EGFP-kan-4×142T质粒载体的核苷酸序列

<400> 4

aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt 60

ctagcttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 120

tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg 180

gagtggccaa ctccatcact aggggttcct ctcgaggtta atttttaaaa agcaagtggc 240

ccttggcagc atctgtttgc tctggttaat aatctcagga gcacaaacat tcccaggaga 300

agaaatcaac atcctggact tatcctctgg gcctaagtat ttagtttggt tagtaattac 360

taaacactga gaacgccaat gaaatacaaa gatgagtcta gttaataatc tacaattatt 420

ggttaaagaa gtatattagt gctaatttcc ctccgtttgt cctagctttt ctcttctgtc 480

aaccccacac gcctttggca ggtaagttgg cgccgtttaa gggatggttg gttggtgggg 540

tattaatgtt taattacctt ttttacaggg taccgccacc atggtgagca agggcgagga 600

gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 660

gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt 720

catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 780

cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 840

cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaagggcg acggcaacta 900

caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 960

gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa 1020

cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 1080

gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 1140

ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc 1200

cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1260

cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa agtggccgcg actctagagg 1320

gaattctcca taaagtagga aacactacga tctccataaa gtaggaaaca ctacagtatc 1380

tccataaagt aggaaacact acgctatcca taaagtagga aacactacag atctgcctcg 1440

actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 1500

ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 1560

ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 1620

tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatgggtct ggcagccaaa 1680

gcaatcactc aaaggatccc cgccccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 1740

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 1800

gagcgcgcag agagggacag atccccagga agctcctctg tgtcctcata aaccctaacc 1860

tcctctactt gagaggacat tccaatcata ggctgcccat ccaccctctg tgtcctcctg 1920

ttaattaggt cacttaacaa aaaggaaatt gggtaggggt ttttcacaga ccgctttcta 1980

agggtaattt taaaatatct gggaagtccc ttccactgct gtgttccaga agtgttggta 2040

aacagcccac aaatgtcaac agcagaaaca tacaagctgt cagctttgca caaggttgta 2100

acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcggc tttgttgaat aaatcgaact 2160

tttgctgagt tgaaggatca gatcacgcat cttcccgaca acgcagaccg ttccgtggca 2220

aagcaaaagt tcaaaatcac caactggtcc acctacaaca aagctctcat caaccgtggc 2280

tccctcactt tctggctgga tgatggggcg attcaggcct ggtatgagtc agcaacacct 2340

tcttcacgag gcagacctca gcgccccccc cccccggagt caggcaacta tggatgaacg 2400

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 2460

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 2520

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 2580

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 2640

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 2700

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 2760

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 2820

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 2880

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 2940

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3000

acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3060

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3120

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 3180

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 3240

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 3300

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 3360

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga aattctatga tttctctcat tacttcctca 3420

catgttggag gcattttctc tccctctgca cttaatagcc tatcttgctt taatttcttc 3480

ccactcttgg aggctaggtt tggtttggtg ggctacactc cgctatcgct acgtgactgg 3540

gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 3600

ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 3660

ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt 3720

ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 3780

gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 3840

ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 3900

cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 3960

gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 4020

ggcttttgca aaaagctttc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4080

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc gggggggggg ggcgctgagg 4140

tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag 4200

ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat 4260

tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc 4320

cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca agtcagcgta 4380

atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc 4440

aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt 4500

ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat 4560

cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa 4620

ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa 4680

agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa 4740

tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg 4800

cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact 4860

gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct 4920

gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc 4980

ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta 5040

acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc 5100

ccatacaatc gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac 5160

ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc tcgaacaaga cgtttcccgt 5220

tgaatatggc tcataacacc ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt 5280

catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttacgt caaagggcga 5340

acgagttggt tcagctgctg cctgaggctg gacgacctcg cggagttcta ccggcagtgc 5400

aaatccgtcg gcatccagga aaccagcagc ggctatccgc gcatccatgc ccccgaactg 5460

caggagtggg gaggcacgat ggccgctttg gtccggatct ttgtgaagga accttacttc 5520

tgtggtgtga cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa ggtaaatata 5580

aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt attttagatt 5640

ccaacctatg gaactgatga atgggagcag tggtggaatg cctttaatga ggaaaacctg 5700

ttttgctcag aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc tcaacattct 5760

actcctccaa aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc agaattgcta 5820

agttttttga gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc tatttacacc 5880

acaaaggaaa aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattc tgtaaccttt 5940

ataagtaggc ataacagtta taatcataac atactgtttt ttcttactcc acacaggcat 6000

agagtgtctg ctattaataa ctatgctcaa aaattgtgta cctttagctt tttaatttgt 6060

aaaggggtta ataaggaata tttgatgtat agtgccttga ctagagatca taatcagcca 6120

taccacattt gtagaggttt tacttgcttt a 6151

<210> 5

<211> 352

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LP15启动子序列

<400> 5

gttaattttt aaaaagcaag tggcccttgg cagcatctgt ttgctctggt taataatctc 60

aggagcacaa acattcccag gagaagaaat caacatcctg gacttatcct ctgggcctaa 120

gtatttagtt tggttagtaa ttactaaaca ctgagaacgc caatgaaata caaagatgag 180

tctagttaat aatctacaat tattggttaa agaagtatat tagtgctaat ttccctccgt 240

ttgtcctagc ttttctcttc tgtcaacccc acacgccttt ggcaggtaag ttggcgccgt 300

ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta ccttttttac ag 352

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人miR-142-3p靶序列

<400> 6

tccataaagt aggaaacact ac 22

<210> 7

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4个串联的人miR-142-3p靶序列

<400> 7

tccataaagt aggaaacact acgatctcca taaagtagga aacactacag tatctccata 60

aagtaggaaa cactacgcta tccataaagt aggaaacact ac 102

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增LPL-S447X基因的正向引物

<400> 8

tcaaccacag ctccaagacc 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增LPL-S447X基因的反向引物

<400> 9

gtatagccgg cggacactg 19

<210> 10

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BGH polyA序列

<400> 10

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 230

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBG增强子序列

<400> 11

gggtctggca gccaaagcaa tcactcaaa 29

<210> 12

<211> 2267

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人脂蛋白脂酶基因表达框

<400> 12

gttaattttt aaaaagcaag tggcccttgg cagcatctgt ttgctctggt taataatctc 60

aggagcacaa acattcccag gagaagaaat caacatcctg gacttatcct ctgggcctaa 120

gtatttagtt tggttagtaa ttactaaaca ctgagaacgc caatgaaata caaagatgag 180

tctagttaat aatctacaat tattggttaa agaagtatat tagtgctaat ttccctccgt 240

ttgtcctagc ttttctcttc tgtcaacccc acacgccttt ggcaggtaag ttggcgccgt 300

ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta ccttttttac agggtaccgc 360

caccatggag tccaaggccc tgctggtgct gacactggcc gtgtggctgc agtctctgac 420

cgcaagcagg ggaggagtgg cagcagcaga ccagcggaga gacttcatcg atatcgagtc 480

caagtttgca ctgaggaccc cagaggacac agcagaggat acctgccacc tgatccctgg 540

cgtggccgag tctgtggcca catgtcactt caaccacagc tccaagacct tcatggtcat 600

ccacggctgg accgtgacag gtgagtatct cagggatcca gacatgggga tatgggaggt 660

gcctctgatc ccagggctca ctgtgggtct ctctgttcac aggcatgtac gagagctggg 720

tgcctaagct ggtggccgcc ctgtataaga gggagccaga ctctaacgtg atcgtggtgg 780

attggctgag cagggcacag gagcactacc cagtgtccgc cggctatacc aagctggtgg 840

gacaggacgt ggcacggttc atcaattgga tggaggagga gtttaactac cccctggata 900

atgtgcacct gctgggatat tctctgggag cacacgcagc aggaatcgca ggaagcctga 960

caaacaagaa agtgaatagg atcaccggac tggatccagc aggacctaat ttcgagtacg 1020

cagaggcacc tagcaggctg tccccagacg atgccgactt cgtggatgtg ctgcacacct 1080

ttacaagggg atccccaggc cgctctatcg gaatccagaa gcccgtgggc cacgtggaca 1140

tctatcccaa cggcggcacc tttcagcctg gctgcaatat cggcgaggcc atcagagtga 1200

tcgccgagag aggcctgggc gacgtggatc agctggtgaa gtgtagccac gagcggtcca 1260

tccacctgtt catcgattcc ctgctgaacg aggagaatcc ctctaaggcc tacagatgct 1320

ctagcaagga ggcctttgag aagggcctgt gcctgtcctg taggaagaac cgctgtaaca 1380

atctgggcta cgagatcaat aaggtgcggg ccaagagatc ctctaagatg tatctgaaga 1440

cacggagcca gatgccttac aaggtgttcc actatcaggt gaagatccac ttttctggca 1500

ccgagagcga gacccacaca aaccaggcct tcgagatcag cctgtacggc acagtggccg 1560

agtccgagaa catcccattc accctgcccg aggtgtctac caataagaca tacagctttc 1620

tgatctatac agaggtggac atcggcgagc tgctgatgct gaagctgaag tggaagtctg 1680

acagctattt ctcctggtct gattggtgga gctcccctgg ctttgccatc cagaagatcc 1740

gggtgaaggc cggcgagacc cagaagaaag tgatcttctg ctccagagag aaggtgtctc 1800

acctgcagaa gggcaaggcc ccagccgtgt ttgtgaagtg tcacgataag agcctgaata 1860

agaagtgata ataaagtggc cgcgactcta gagggaattc tccataaagt aggaaacact 1920

acgatctcca taaagtagga aacactacag tatctccata aagtaggaaa cactacgcta 1980

tccataaagt aggaaacact acagatctgc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc 2040

tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 2100

ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 2160

gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 2220

ggatgcggtg ggctctatgg gtctggcagc caaagcaatc actcaaa 2267

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LP15启动子中的正向引物LP15-F

<400> 13

aagtggccct tggcagcatc t 21

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LP15启动子中的反向引物LP15-R

<400> 14

ggacaaacgg agggaaatta gcact 25

Claims (10)

1.一种优化的人脂蛋白脂酶基因表达框，其包含：

(1)如SEQ ID NO:5所示的启动子序列或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列；

(2)插入有SEQ ID NO:2所示的内含子序列或者插入有与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的内含子序列的编码功能性脂蛋白脂酶(例如，LPL-S447X)的核苷酸序列，例如，

(i)如SEQ ID NO:3所示的优化的编码LPL-S447X的核苷酸序列；

(ii)与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的LPL-S447X，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(iv)与(i)或(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少70％同一性的序列；和

(3)至少一个(例如，2－8个)SEQ ID NO:6所示的人miR-142-3p靶序列，例如，具有4个串联的人miR-142-3p靶序列，例如，SEQ ID NO:7所示的人miR-142-3p靶序列。

2.根据权利要求1所述的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框，其还包含：

(4)如SEQ ID NO:10所示的或者与其具有至少约90％同一性的BGH polyA序列；和/或

(5)如SEQ ID NO:11所示的或者与其具有至少约90％同一性的TBG增强子序列。

3.根据权利要求2所述的基因表达框，其碱基全序列如SEQ ID NO:12所示或与SEQ IDNO:12具有至少约90％同一性，特征在于，表达框表达产物为LPL-S447X。

4.一种病毒载体，其特征在于，包含权利要求1－3中任一项所述的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框。

5.一种用于预防和/或治疗严重高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎的基因药物，特征在于，

(1)该基因药物是一种病毒载体；

(2)该病毒载体包含权利要求1－3中任一项所述的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框；和

(3)将该基因药物静脉注射，通过肝脏特异性表达人脂蛋白脂酶(例如，LPL-S447X)来达到预防和/或治疗严重高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎的目的，

例如，所述严重高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎是LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷和/或高脂饮食诱发的。

6.根据权利要求4所述的病毒载体或根据权利要求5所述的基因药物，其特征在于，

(1)所述病毒载体是重组腺相关病毒载体；和/或

(2)所述病毒载体的基因组可自我互补形成双链DNA分子。

7.根据权利要求6所述的病毒载体或基因药物，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体是选自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10或它们的组合的血清型的重组腺相关病毒载体，优选的血清型为AAV5、AAV3B、AAV8、AAV9。

8.根据权利要求1－3中任一项所述的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框和根据权利要求4、6和7中任一项所述的病毒载体的用途，用于制备预防和/或治疗高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎的基因药物，例如，用于制备预防和/或治疗LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷和/或高脂饮食诱发的高甘油三酯血症或其引起的疾病如急性胰腺炎的基因药物。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述基因药物的给药方式为静脉注射，所述高甘油三酯血症是LPL基因缺陷和/或GPIHBP1基因缺陷和/或高脂饮食引起的高甘油三酯血症。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的用途，其特征在于，所述基因药物的一次给药可持续降低体内的血浆TG浓度，由此预防和/或治疗高甘油三酯血症，特别地，预防和/或治疗严重的高甘油三酯血症。

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