CN111084888B - 一种用于治疗严重高甘油三酯血症的基因药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组腺相关病毒介导的用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物。重组腺相关病毒载体携带包含人miR‑142‑3p靶序列的ApoC2基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达载脂蛋白C2，显著降低血液中甘油三酯的含量并使其恢复正常，有效延长仓鼠生存期。结果提示，该重组腺相关病毒载体基因药物可用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎。

Description

一种用于治疗严重高甘油三酯血症的基因药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带人miR-142-3p靶序列的ApoC2基因表达框，为用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物。

背景技术

高甘油三酯血症（hypertriglyceridemia，HTG）是一种异族性甘油三酯蛋白合成或降解障碍，临床表现为“血稠”，即血液中脂质含量过高导致的血液黏稠，在血管壁上沉积，渐渐形成小斑块，即动脉粥样硬化。根据病因可将高甘油三酯血症分为原发性与继发性，原发性高甘油三酯血症包括家族性高甘油三酯血症、家族性混合型血脂异常、家族性异常β-脂蛋白血症等；继发性高甘油三酯血症的病因主要包括代谢性疾病、某些疾病状态、激素和药物等。

高甘油三酯血症是我国急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）的第二大病因，称之为高甘油三酯血症性急性胰腺炎（hypertriglyceridemia acute pancreatitis，HTG-AP）。近几年，高甘油三酯血症性急性胰腺炎的发病率逐年上升，其以显著的血甘油三酯（TG）值升高，代谢紊乱和多脏器功能障碍为主要特征。该病的致病因素复杂，确切的发病机制尚不清楚，可能与TG水平升高，分解产生游离脂肪酸（FFA）增多导致对胰腺本身的毒性和化学刺激作用、胰腺微循环障碍、基因突变和氧化应激等有关。早期降低血TG是该病治疗的核心，血浆置换和血液滤过、结合中医中药治疗是目前常用的治疗方法（付静. 天津药学.2017; 29(2): 57-60）。

对于继发性高甘油三酯血症（糖尿病、甲减、药物、高脂饮食等）诱发的HTG-AP患者，针对原发病进行治疗控制甘油三酯是减少HTG-AP复发的关键，同时运动、饮食干预、减重、降脂药物等方法均有控制甘油三酯的确切效果（Valdivielso P, et al. EuropeanJournal of Internal Medicine. 2014; 25: 689-694.）。然而，对于基因缺陷型HTG-AP患者，使用贝特类药物、烟酸类药物及Ω-脂肪酸均无法有效降低血浆甘油三酯水平，且无法降低 HTG-AP的发病率（Blackett P, et al. Journal of Clinical Lipidology. 2013;7: 132-139. Stefanutti C, Julius U. Atheroscler Suppl. 2015; 18: 85-94.）。目前已明确LPL、LMF1、ApoC2、GPIHBP1、ApoA5 等基因缺陷患者均可致重度原发性高甘油三酯血症及HTG-AP 反复发病（Coca-Prieto I, et al. Bmc Gastroenterology. 2009; 9: 46.Gotoda T, et al. Journal of Atherosclerosis & Thrombosis. 2012; 19: 1.），因此基因疗法具有很好的应用前景。对于LPL基因缺陷的HTG患者，Stroes等（Stores ES, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008; 28(12): 2303-2304.）通过运用含有LPL基因的病毒载体治疗，可减轻其餐后乳糜微粒血症，从而降低胰腺炎的发病率。Gaudet等（Gaudet D, et al. Gene Ther. 2013; 20(4): 361-369.）对14例LPL基因缺陷型HTG-AP患者应用AAV1-LPLS447X进行基因治疗（肌肉注射），患者血浆甘油三酯在12周下降到40%，经过2年临床观察无HTG-AP复发和严重不良反应。

饮食中的甘油三酯（TG）以乳糜微粒（CM）的形式与肝脏合成的TG形成极低密度脂蛋白（VLDL）而在血液中运输。它们被周围组织毛细血管内皮的脂蛋白脂酶（LPL）所水解。LPL分布在脂肪组织、心肌和骨骼肌等组织，并在这些组织的实质细胞内合成，然后从细胞内分泌出来，转移到毛细血管内皮朝向管腔的表面上。这个酶的任何缺陷，都能使富含TG的脂蛋白（CM、VLDL）的代谢和清除发生异常，继而导致高甘油三酯血症，而LPL的活性受载脂蛋白C的调节。脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白或脱脂蛋自（apoprotein或简写为apo-），它们是由60~250个氨基酸残基组成的多肽。目前已经发现的有8种载脂蛋白，主要有ApoA、ApoB、ApoC、ApoD以及含精氨酸和谷氨酸的载脂蛋白（ARP或称ApoE）五类。其中ApoA和ApoC又分若干亚类ApoA-I、ApoA-II；ApoC-I、ApoC-II和ApoC-III（朱赓伯. 苏州医学院学报. 1983; 1: 38-40）。

人载脂蛋白C II（ApoC II/ApoC2）是由79个氨基酸组成的蛋白质，主要在肝脏和小肠中合成，分泌入血后参与组成乳糜微粒、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白（HDL）。ApoCII基因定位于19q13. 2，与ApoE、ApoC II、ApoC IV形成一载脂蛋白基因簇（ApoE/C I/CIV/C II）。ApoC II与ApoE、ApoC I基因的结构非常相似，均由3个内含子、4个外显子组成。内含子的分布位置几乎相同：第一个内含子截断5’非翻译区，第二个内含子截断信号肽的编码区、靠近信号肽的切割部位，第三个内含子截断编码成熟蛋白质的区域。

ApoC2为LPL的辅助因子，它可激活多种来源的LPL。其激活机制可能是：LPL通常存在于外周循环与肝素样分子结合，并附着于血管内皮上。当LPL接触乳糜微粒（CM）或极低密度脂蛋白（VLDL）时，LPL便同脂蛋白颗粒表面的磷脂发生作用进而结合于脂蛋白颗粒上。ApoC2羧基端44-79位氨基酸残基能与LPL羧基端389-448位氨基酸残基特异性交联，使LPL充分发挥脂解活性；进一步的研究发现ApoC2第55-78位氨基酸残基是维持其对LPL激活作用的最短必需肽段，第44-50位氨基酸残基为α螺旋结构与脂质结合区。ApoC2与LPL发生作用，改变LPL的空间结构，进而催化水解甘油三酯（高纯. 国外医学临床生物化学与检验学分册. 2000; 21(6): 285-286.）。对于ApoC2基因缺失的原发性HTG，目前尚没有特异性的治疗方法，可以输入ApoC2、新鲜血浆、ApoC2模拟肽治疗，但需要反复给药，因此理论上基因治疗才是可以彻底治愈该类HTG患者的最佳疗法。

然而，目前还没有ApoC2的小鼠敲除模型，只有ApoC2的突变体模型，ApoC2高表达但分布在HDL上，而不在VLDL和乳糜微粒上，且只有中度HTG（500mg/dL），与人类的严重HTG完全不同，且不会发生或加重AP。仓鼠ApoC2敲除后和人类表型相似，甘油三酯特别高，且与LPL基因敲除救治后的HTG模型不同在于，其出生后的死亡是通过静脉注射血浆救活的，离乳后体内没有ApoC2的残余，成年和新生期的ApoC2敲除仓鼠都是理想的动物模型，因为人类的治疗可以从新生儿开始，也可以从成人开始。

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.Hoggan MD, et al. Proc NatlSci USA. 1966; 55: 1467-1474.）。AAV是微小病毒科（Parvovirus）成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA（Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.），其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒（Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.），或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将以附加体的形式潜伏到染色体中（Chiorini JA, et al. Curr Top MicrobiolImmunol. 1996; 218:25-33.），而不产生子代病毒。

最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）（Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.）。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”（inverted terminal repeat，ITR），呈回文-发卡结构（Lusby E, et al. JVirol. 1980; 34: 402-409.）。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中（Samulski RJ, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.）。

ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用（Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948.）。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site，RBS）和末端解链位点trs（terminal resolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口（Linden RM, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.）。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用（Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.）。

AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区（Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.）。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolution site）和GAGY重复基序（repeat motif）特异性结合（Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.），启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGY重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和都存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织（Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.）。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导至大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能（Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.）。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性（Gruntman AM, et al. Hum GeneTher Methods. 2015; 26(2): 71-76.），容易开发出稳定性较高的生物制品。

AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type 1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（Yuan Z, et al. Hum Gene Ther. 2011; 22(5):613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，等. 科学通报.1999, 44(5): 506-509。Conway JE, et al. Gene Ther. 1999; 6:986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（Wustner JT, et al. MolTher. 2002; 6(4):510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Inverted terminal repeat，ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（Booth MJ, et al. Gene Ther,2004,11:829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（Thomas DL, et al. Gene Ther. 2009; 20:861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（ChenH. Mol Ther.2008;16(5):924-930. Galibert L,et al.J Invertebr Pathol. 2011;107 Suppl:S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（Mietzsch M, et al. HumGene Ther. 2014;25:212-222. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015;26(10):688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。

由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2016年8月，世界上批准的基于AAV载体的基因治疗临床试验方案有173项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.）；血友病B（Kay MA, et al. Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.）和先天性黑曚症（RPE65基因突变引起）（Jacobson SG, et al. Arch Ophthalmol. 2012; 130(1): 9-24.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会造福广大患者。

本发明中，我们选择AAV载体来携带载脂蛋白C2基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射具有较高的转导效率（Wang Z, et al.Nat Biotechnol. 2005; 23: 321-328. Bish LT, et al. Hum Gene Ther. 2008; 19:1359-1368. Zincarelli C, et al. Mol Ther. 2008; 16: 1073-1080. Prasad KM, et al. Gene Ther. 2011; 18: 43-52. Rebuffat A, et al. Hum Gene Ther. 2010; 21(4): 463-477.），保证载脂蛋白C2基因表达框能够在体内高效地表达载脂蛋白C2。

为了降低机体产生针对载脂蛋白C2免疫反应的概率，延长载脂蛋白C2基因持续稳定表达的时间。我们人为设计了肝脏特异性高效表达的LP15启动子，让导入的载脂蛋白C2基因在肝脏特异性高表达，减少病毒载体感染其它组织器官所可能引起的免疫反应。进一步，我们在载脂蛋白C2基因表达框的3’UTR区克隆入4个miR-142-3p靶序列。由于miR-142-3p在造血干细胞系来源细胞中高表达（Chen CZ, et al. Science. 2004; 303(5654):83-86.），免疫细胞均分化来源于造血干细胞系，因此利用miRNA抑制基因表达的原理（KimVN. Nat Rev Mol Cell Biol.2005;6(5):376-385.），携带miR-142-3p靶序列的基因表达会在免疫细胞中受到明显抑制，从而降低机体产生针对基因表达产物免疫反应的概率（Dismuke DJ, et al. Curr Gene Ther. 2013; 13(6): 434-452.）。

miRNAs（microRNAs）是广泛存在于人类和动物体内的长度为18至25个核苷酸（nucleotide，nt）的单链非编码RNA（Bartel DP. Cell. 2004; 116: 281-297. Kim VN.Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 376-385.）。1993年miRNA首先在秀丽线虫（C.elegans）中发现（Lee RC, et al. Cell. 1993; 75: 843-854. Wightman B, et al.Cell. 1993; 75: 855-862.）。C.elegans中lin-4基因能够下调lin-14基因的表达，但lin-4基因的编码产物不是蛋白质，而是一种小RNA分子，表明自身编码小RNA分子能够调节基因的表达。随后，多种类似的小RNA分子在不同的物种和细胞中相继发现（Lagos-Quintana M,et al. Science. 2001; 294: 853-858. Lau NC, et al. Science. 2001; 294: 858-862. Lee RC, et al. Science. 2001;294: 862-864.），miRNA开始成为该类小RNA 的统称。miRNA调节人类大约60%基因的表达（Lewis BP, et al. Cell. 2005;120: 15-20.Friedman RC, et al. Genome Res. 2009; 19: 92-105.），在多种生理和病理过程中发挥重要作用（Careton M, et al. Cell Cycle. 2007; 6: 2127-2132. Ambros V. Cell.2003; 113:673-676. Schichel R, et al. Oncogene. 2008; 27: 5959-5974.）。

miRNA基因通常位于基因组的外显子、内含子和基因间区中（Olena AF, et al. JCell Physiol. 2010; 222: 540-545. Kim VN, et al. Trends Genet. 2006; 22: 165-173.）。在细胞内，miRNA的产生过程如下述（Winter J, et al. Nat Cell Biol. 2009;11:228-234.）。首先在细胞核中，miRNA基因由RNA聚合酶II或III启动转录产生初始产物pri-microRNA；pri-microRNA自我折叠部分序列形成茎环结构。随后，由核糖核酸酶III Drosha和DGCR8分子组成的加工复合体作用pri-microRNA，切去多余序列，留下60nt左右的茎环结构，即前体miRNA分子pre-microRNA（Lee Y, et al. Nature. 2003;425: 415-419. DenliAM, et al. Nature. 2004;432: 231-235. Gregory RI, et al. Nature. 2004; 432:235-240. Han J, et al. Genes Dev. 2004; 18: 3016-3027. Landthaler M, et al.Curr Biol. 2004;14: 2162-2167.）。然后在转运蛋白Exportin-5的协助下，pre-microRNA从细胞核进入细胞质中（Lund E, et al. Science. 2003; 303: 95-98. Yi R, et al.Genes Dev. 2003;17: 3011-3016. Bohnsack MT, et al. RNA. 2004; 10: 185-191.），经Dicer酶加工去掉其茎环结构中的环形部分，变为双链RNA分子（Jiang F, et al. GenesDev. 2005; 19: 1674-1679. Saito K, et al. PLoS Biol. 2005; 3: e235.）。最后，双链RNA分子被AGO2等蛋白因子结合，其中一条链发生降解，另一条链和蛋白因子形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）。RISC识别mRNA中靶序列，通过降解mRNA分子、促进mRNA分子3’端去腺苷化和抑制翻译来降低mRNA的表达水平，在转录后水平调节基因的表达（Storz G, et al. Curr Opin Microbiol.2004; 7: 140-144. FabianMR, et al. Annu Rev Biochem. 2010; 79: 351-379. Valencia-Sanchez MA, et al.Genes Dev. 2006; 20: 515-524.）。因此利用细胞内高表达的miRNA，在外源基因的3’UTR（untranslated region）插入该miRNA的靶序列，能够有效地抑制外源基因在导入细胞中的表达。

为此，我们在本发明中设计了一种用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物scAAV8-LP15-ApoC2。首先我们选择肝脏特异性高效表达启动子LP15调控ApoC2基因的表达，既保证了表达效率，又降低了在其它器官的非特异表达；其次对ApoC2编码区序列进行优化，在优化序列中引入短小内含子，提高基因的转录效率；然后在3’UTR区引入4个miR-142-3p完全互补的靶序列，降低ApoC2基因在抗原呈递细胞中的表达，减弱ApoC2过量表达可能带来的免疫反应；再次在表达框的3’端插入短小的肝脏特异性增强子，增强基因的转录水平；最后选择安全、不致病的重组双链AAV8载体（Dismuke DJ, et al.Curr Gene Ther. 2013; 13(6): 434-452.）携带载脂蛋白C2基因表达框，增强病毒对肝脏组织的特异性感染及在肝脏中的表达效率。进一步提高了药物开发成功的可能性。

根据以上设计思路，我们制备得到scAAV8-LP15-ApoC2病毒。将该病毒注射至ApoC2敲除仓鼠模型体内，评价所设计scAAV8-LP15-ApoC2的有效性。结果显示，scAAV8-LP15-ApoC2能够在ApoC2敲除仓鼠模型体内表达载脂蛋白C2，显著降低ApoC2敲除仓鼠模型体内的甘油三酯含量，在新生仓鼠和成年仓鼠中均能有效缓解和治疗因血液中甘油三酯浓度过高带来的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎等症状。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于AAV载体的新型的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因治疗药物。该药物由AAV载体携带含有人miR-142-3p靶序列的ApoC2基因表达框。首先选取了肝脏特异性高效表达启动子LP15调控ApoC2基因的表达，既保证了表达效率，又降低了在其它器官的非特异表达；其次对ApoC2编码区序列进行优化，在优化序列中引入短小内含子，提高基因的转录效率；然后在3’UTR区引入4个miR-142-3p完全互补的靶序列，降低ApoC2基因在抗原呈递细胞中的表达，减弱ApoC2过量表达可能带来的免疫反应；再次在表达框的3’端插入短小的肝脏特异性增强子，增强基因的转录水平；最后选择安全、不致病的重组双链AAV8载体携带ApoC2基因表达框，增强病毒对肝脏组织的特异性感染及在肝脏中的表达效率。基于上述设计，预期该药物通过静脉注射后能够在ApoC2敲除仓鼠模型体内高效表达载脂蛋白C2，显著降低血液中甘油三酯的浓度，治疗因ApoC2基因突变所致血液中甘油三酯浓度过高带来的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎等症状。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物，其特征在于，包括：

（1）该基因药物由病毒载体携带；

（2）该基因药物携带载脂蛋白C2的基因表达框。

本发明提供的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因治疗药物，其特征在于，该药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过静脉注射能高效地把药物效应元件导入体内，实现药物效应元件表达产物治疗作用蛋白——载脂蛋白C2的高效表达。为了实现载脂蛋白C2的高效表达，根据不同血清型AAV的转导特点，不同的给药方式选择相应的血清型AAV，静脉注射主要选择AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8和AAV9等，其中优选的血清型为AAV8。

本发明提供的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因治疗药物，其特征在于，使用的AAV载体为ssAAV载体和scAAV载体。优先选择为scAAV载体，scAAV载体能够自身互补形成双链，避免了ssAAV进入细胞后需要通过DNA修复、复制等合成互补链才能转录表达携带外源基因的过程，因此scAAV载体转导效率更高，表达更为迅速。

本发明提供的治疗高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因治疗药物，其特征还在于，含人脂蛋白酯酶的辅助因子载脂蛋白C2。我们将人体的载脂蛋白C2基因的核苷酸序列进行优化，在优化序列中引入短小内含子，提高基因的转录效率，将内含子与优化的载脂蛋白C2基因序列融合得到的序列命名为cApoC2序列（SEQ ID No.2）。后进一步设计了载脂蛋白C2的基因表达框，基于设计的载脂蛋白C2基因表达框能够实现载脂蛋白C2的高效表达。选择肝脏特异性高效表达启动子LP15（SEQ ID No.1）调控ApoC2基因的转录，LP15启动子由人AMBP（X67082.1）基因长度为118bp的增强子序列、人ALB（M12523.1）基因大小为40bp的增强子序列和长度为128bp的启动子序列以及小鼠微小病毒（MVM）内含子（大小为67bp）拼接而成，使载脂蛋白C2基因能够在多种细胞中高效转录。并在3’UTR区引入4个miR-142-3p完全互补的靶序列（SEQ ID No.3），降低ApoC2基因在抗原呈递细胞中的表达，减弱ApoC2过量表达带来的免疫反应。在表达框的3’端插入短小的肝脏特异性增强子，增强基因的转录水平（SEQ ID No.5）。

本发明提供的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎基因治疗药物，其特征在于，将该药物经静脉注射至ApoC2敲除仓鼠模型体内后，能在仓鼠体内高效稳定持续地表达载脂蛋白C2，表达产生的载脂蛋白C2作为辅助因子会将血液中的甘油三酯进行分解，显著降低血液中甘油三酯的含量，消除因血液中甘油三酯过高带来的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎等不良影响，从而达到治疗高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的目的。

本发明提供的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因治疗药物，其特征还在于，经静脉注射一次给药就能够长期持续地降低患者体内甘油三酯的含量，消除因甘油三酯过高带来的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎等不良影响，从而达到长时间的治疗效果。

本发明还提供了一种载脂蛋白C2的基因表达框，其特征在于，包括：

（1）如SEQ ID No.1所示的启动子序列；和/或

（2）如SEQ ID No.2所示的优化的载脂蛋白C2编码区的核苷酸序列；和/或

（3）如SEQ ID No.3所示的人miR-142-3p的靶序列；和/或

（4）如SEQ ID No.4所示的BGH polyA序列；和/或

（5）如SEQ ID No.5所示的TGB enhancer增强子序列。

本发明所提供的脂蛋白C2基因表达框，其碱基全序列如SEQ ID No.6所示，其特征还在于，表达框表达产物为载脂蛋白C2，可降低血液中甘油三酯水平。

本发明所提供的脂蛋白C2基因表达框，其碱基全序列如SEQ ID No.6所示，其特征还在于，表达框转录得到编码载脂蛋白C2的mRNA的3’UTR（3’ untranslated region，3’端非翻译区）中含有人miR-142-3p靶序列，能够有效地抑制载脂蛋白C2在抗原呈递细胞中的表达，抑制免疫反应。

本发明还提供了病毒载体，其特征在于，包括：

（1）该病毒载体包括但不限于腺相关病毒载体；和/或

（2）腺相关病毒载体携带基因组为单链DNA分子，或可自我互补形成双链DNA分子；和/或

（3）重组腺相关病毒载体血清型包括AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10，其中优选的血清型为AAV8。

本发明所提供的病毒载体，其特征还在于，携带本发明所提供的载脂蛋白C2的基因表达框。

本发明还提供了一种基因药物组合物，包括所述病毒载体和所述载脂蛋白C2的基因表达框。

本发明还提供了所述组合物的制备方法：

步骤1：将载脂蛋白C2基因表达框的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载体；

步骤2：将所述表达载体运用不同的病毒包装生产工艺进行包装，收集纯化表达产物，即得。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法，将LP15启动子、优化的ApoC2序列、4个与miR-142-3p完全互补的靶序列、BGH polyA序列和TGB enhancer增强子序列的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒包装的生产工艺，包括但不限于三质粒共转染系统、HSV1为辅助病毒的包装系统和基于杆状病毒的Bac-to-AAV包装系统。

本发明还提供了一种基因治疗方式，其特征在于，给药方式为静脉注射。

本发明还提供了所述基因药物、载脂蛋白C2基因表达框、病毒载体、基因药物组合物和基因治疗方式在制备治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎中的应用。

本发明的实验证明，所设计的基因治疗药物scAAV8-LP15-ApoC2在新生仓鼠体内能够有效治疗高甘油三酯血症。将出生后3天的ApoC2敲除新生仓鼠经眶静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒，注射剂量为2×10¹¹vg/只，在注射后不同的时间点（7天、14天、28天和56天）进行检测。发现经眶静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒的ApoC2敲除新生仓鼠不仅全部存活，而且血脂水平在第14天已经完全恢复正常（图3），体内TG和TC的含量在第14天也完全恢复到正常仓鼠水平（图4），且均能有效检测到ApoC2蛋白的表达（图5）。

本发明的实验证明，所设计的基因治疗药物scAAV8-LP15-ApoC2在成年仓鼠体内也能够有效治疗高甘油三酯血症。将ApoC2敲除成年仓鼠经尾静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒，注射剂量为2×10¹²vg/只，在注射后不同的时间点（7天、14天、28天、42天和56天）进行检测。发现ApoC2敲除成年仓鼠在经尾静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒后，血脂水平不断下降，在第28天已经完全恢复正常（图6），体内TG和TC的含量也迅速下降，并分别在第28天、第14天完全恢复到正常水平（图7），且均能有效检测到ApoC2蛋白的表达（图8）。

本发明的实验还证明，已治疗组ApoC2敲除新生仓鼠在成年后经尾静脉再次注射重组病毒，也能治疗高甘油三酯血症。将已治疗组的ApoC2敲除新生仓鼠，在成年后以4×10¹²vg/只的高剂量和2×10¹²vg/只的低剂量经尾静脉再次注射scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒，在注射后不同的时间点（7天、14天、28天、42天、56天和84天）进行检测。发现无论是4×10¹²vg/只的高剂量组还是2×10¹²vg/只的低剂量组，经尾静脉再次注射scAAV8-LP15-ApoC2后，仓鼠体内的血脂水平均开始迅速下降，并在第28天已经完全恢复正常（图9），体内TG和TC的含量也迅速下降，并分别在第28天、第14天完全恢复到正常水平（图10），且均能有效检测到ApoC2蛋白的表达（图11）。

本发明用到的重要原始实验材料如下所示：

pAAV-R2C8质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV8基因组（GenBank ID：AF513852）中外壳蛋白编码序列Cap8（基因组中第2121至4337位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI酶切位点之间序列，获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV8外壳蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 pscAAV8-LP15-EGFP载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。LP15 promoter，由人AMBP（X67082.1）的增强子序列、人ALB（M12523.1）的增强子序列和长度为128bp的启动子序列以及小鼠微小病毒（MVM）内含子（大小为67bp）拼接而成。EGFP，增强型绿色荧光蛋白。4×142-3pT，4个人miR-142-3p靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。TGB enhancer，增强子。XhoI、KpnI、EcoRI、XbaI、BglII、BamHI和ClaI均为限制性酶切位点。

图2 pscAAV8-LP15-ApoC2载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。LP15 promoter，由人AMBP（X67082.1）的增强子序列、人ALB（M12523.1）的增强子序列和长度为128bp的启动子序列以及小鼠微小病毒（MVM）内含子（大小为67bp）拼接而成。ApoC2，脂蛋白酯酶的辅助因子。4×142-3pT，4个人miR-142-3p靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。TGB enhancer，增强子。XhoI、KpnI、EcoRI、SacI、BglII、BsaI和ClaI均为限制性酶切位点。

图3 ApoC2^-/-新生仓鼠经眶静脉注射重组病毒后的血脂改变。重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经眶静脉注射ApoC2^-/-新生仓鼠模型。注射后不同的时间点（7天、14天、28天和56天）采血，观察血脂变化。

图4 ApoC2^-/-新生仓鼠经眶静脉注射重组病毒后的TG和TC改变。重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经眶静脉注射ApoC2^-/-新生仓鼠模型。注射后不同的时间点（7天、14天、28天和56天）采血，检测血液中TG和TC的含量变化。

图5 ApoC2^-/-新生仓鼠经眶静脉注射重组病毒后的ApoC2蛋白表达情况。重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经眶静脉注射ApoC2^-/-新生仓鼠模型。注射后不同的时间点（7天、14天和28天）采血，检测血液中ApoC2蛋白表达情况。

图6 ApoC2^-/-成年仓鼠经尾静脉注射重组病毒后的血脂改变。重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2以2×10¹²vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射ApoC2^-/-成年仓鼠模型。注射后不同的时间点（7天、14天、28天和56天）采血，观察血脂变化。

图7 ApoC2^-/-成年仓鼠经尾静脉注射重组病毒后的TG和TC改变。重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2以2×10¹²vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射ApoC2^-/-成年仓鼠模型。注射后不同的时间点（7天、14天、28天、42天和56天）采血，检测血液中TG和TC的含量变化。

图8 ApoC2^-/-成年仓鼠经尾静脉注射重组病毒后的ApoC2蛋白表达情况。重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2以2×10¹²vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射ApoC2^-/-成年仓鼠模型。注射后不同的时间点（7天、14天和28天）采血，检测血液中ApoC2蛋白表达情况。

图9 已治疗组ApoC2^-/-新生仓鼠成年后经尾静脉再次注射重组病毒后的血脂改变。已治疗组的ApoC2^-/-新生仓鼠，在成年后以4×10¹²vg/只的高剂量和2×10¹²vg/只的低剂量经尾静脉注射重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2。注射后不同的时间点（7天、14天、28天和56天）采血，观察血脂变化。

图10 已治疗组ApoC2^-/-新生仓鼠成年后经尾静脉再次注射重组病毒后的TG和TC改变。已治疗组的ApoC2^-/-新生仓鼠，在成年后以4×10¹²vg/只的高剂量和2×10¹²vg/只的低剂量经尾静脉注射重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2。注射后不同的时间点（7天、14天、28天、42天、56天和84天）采血，检测血液中TG和TC的含量变化。

图11 已治疗组ApoC2^-/-新生仓鼠成年后经尾静脉再次注射重组病毒后的ApoC2蛋白表达情况。已治疗组的ApoC2^-/-新生仓鼠，在成年后以4×10¹²vg/只的高剂量和2×10¹²vg/只的低剂量经尾静脉注射重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2。注射后不同的时间点（7天、14天）采血，检测血液中ApoC2蛋白表达情况。

具体实施方式

本发明公开了一种高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 质粒载体构建

为了构建获得包装重组AAV病毒需要的pscAAV8-LP15-ApoC2质粒，我们首先以公司保存的pscAAV8-LP15-EGFP载体[该载体其中一侧的ITR序列为缺失了AAV2的ITR中trs(terminal resolution site)和D序列的突变序列，命名为ΔITR，如SEQ ID No.7所示]为基础，选择肝脏特异性高效表达启动子调控ApoC2基因的表达，对ApoC2编码区序列进行优化，在优化序列中引入短小内含子，提高基因的转录效率。在3’UTR区引入4个miR-142-3p完全互补的靶序列，降低ApoC2基因在抗原呈递细胞中的表达，减弱ApoC2过量表达带来的免疫反应。在表达框的3’端插入短小的肝脏特异性增强子，增强基因的转录水平，将人工合成的ApoC2序列克隆入pscAAV8-LP15-EGFP载体的KpnI和EcoRI双酶切位点之间，得到pscAAV8-LP15-ApoC2载体。

（1）pUC57-ApoC2载体构建

登录NCBI protein数据库，搜索得到人ApoC2蛋白质及其核苷酸序列。将该核苷酸序列进行优化，在优化序列中引入短小内含子得到cApoC2序列（SEQ ID No.2），将优化的cApoC2序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆入pUC57 simple载体，得到pUC57-ApoC2。

（2）pscAAV8-LP15-ApoC2载体构建

KpnI和EcoRI双酶切消化pUC57-cApoC2载体，产生2.7kb和400bp两个片段，回收长度为400bp片段。KpnI和EcoRI双酶切消化pscAAV8-LP15-EGFP载体，得到5403bp和748bp两个片段，回收长度为5403bp片段。两片段连接后，SmaI酶切鉴定（3149bp/1356bp/1275bp），得到pscAAV8-LP15-ApoC2载体。

实施例2 重组AAV病毒制备及检定

采用三种不同的包装系统分别包装得到scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒。

包装系统1 三质粒共转染HEK293包装系统

参照文献（Xiao X, et al. J Virol. 1998;72(3):2224-2232.），应用三质粒包装系统包装重组AAV病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pscAAV8-LP15-ApoC2）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-R2C8）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒。

包装系统2 rHSV1-rep2cap8感染AAV细胞株系统

参照文献（伍志坚, 吴小兵, 侯云德. 具有AAV载体包装功能的重组HSV的产生[J]. 科学通报, 1999, 44(5):506. 伍志坚, 吴小兵, 曹晖, et al. 一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统[J]. 中国科学C辑, 2001, 31(5).）和中国专利（CN98101753.3、CN98120033.8、CN99119038.6和CN99119039.4），将携带rep2cap8的1型重组单纯疱疹病毒rHSV1-rep2cap8（公司制备保存）以5到10的MOI（感染复数）感染BHK21-LP15-ApoC2细胞株（AAV细胞株）。感染后，收获细胞和培养上清。参照文献（吴小兵, 董小岩, 伍志坚, et al.一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法[J]. 科学通报, 2000, 45(19):2071.）和中国专利（CN99123723.4）的方法分离纯化得到scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒。BHK21-LP15-ApoC2细胞株为携带scAAV8-LP15-ApoC2病毒基因组的BHK21细胞株，含有包装制备得到scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒的全部顺式作用元件。rHSV1-rep2cap8含有rep2cap8表达框序列，能够表达产生包装scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒需要的Rep78、Rep68、Rpe52、Rep40等4种Rep蛋白以及AAV8的VP1、VP2和VP3等3种结构蛋白。

包装系统3 Bac-to-AAV系统

将LP15-ApoC2表达框信息发送给美国Virovek公司，委托其应用Bac-to-AAV系统包装制备scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒。包装过程参考文献（Chen H . Intron Splicing—mediated Expression of AAV Rep and Cap Genes and Production of AAV Vectors inInsect Cells[J]. Molecular Therapy the Journal of the American Society ofGene Therapy, 2008, 16(5):924.）和专利（US8945918、CN101522903B）。包装得到病毒应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。

采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。具体过程如下：

在LP15启动子中设计两条引物LP15-F和LP15-R：

LP15-F：5’-AAGTGGCCCTTGGCAGCATCT-3’ （SEQ ID NO.8）

LP15-R：5’-GGACAAACGGAGGGAAATTAGCACT-3’ （SEQ ID NO.9）

以LP15-F和LP15-R为引物特异性地扩增LP15启动子长度为229bp片段，采用SYBRGreen染料结合法，以1μg/μl的pscAAV8-LP15-ApoC2质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR PremixEx Taq II（Tli RNaseH Plus）试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Ulrich-Peter R,et al. J Virol Methods. 2002; 106: 81-88.）

实施例3 ApoC2^-/-仓鼠模型的建立

ApoC2敲除仓鼠模型由北京大学医学部刘国庆老师提供，专利名称：构建ApoC2基因敲除仓鼠的试剂盒和方法，专利申请号：201811179674.7。

实施例4 ApoC2^-/-新生仓鼠经眶静脉注射重组病毒治疗高甘油三酯血症

从实施例3中获得的ApoC2^-/-仓鼠模型中选择8只新生仓鼠，分为2组。其中1组仓鼠6只，出生后3天经眶静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒，注射剂量为2×10¹¹vg/只。其中1组仓鼠2只，在出生后经血清救治至21天，离乳后停止血清救治作为注射scAAV8-LP15-ApoC2的对照。另有野生型对照仓鼠2只，作为静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2和血清救治的对照。

在注射后不同的时间点（7天、14天、28天和56天）监测仓鼠血清中的血脂变化、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量变化以及ApoC2蛋白的表达情况。检测结果如图3~图5所示。

从图3的结果可知，和野生型对照组相比，ApoC2^-/-新生仓鼠在经血清救治时，体内血脂水平正常，21天离乳停止血清救治后，血脂含量非常高，即出现严重的高甘油三酯血症。经眶静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒的ApoC2^-/-新生仓鼠不仅全部存活，而且甘油三酯在第14天已经完全恢复正常，随着时间推移及新生仓鼠肝脏的生长，甘油三酯水平略有升高，但仍在有效治疗范围之内，与不治疗的ApoC2^-/-新生仓鼠具有显著差异，且在28天后基本维持稳定。未经治疗的ApoC2^-/-新生仓鼠在出生一周左右全部死亡。

从图4的结果可知，和野生型对照组相比，经scAAV8-LP15-ApoC2治疗14天，ApoC2^-/-新生仓鼠体内的TG和TC已完全恢复到正常仓鼠水平；28天和56天，TG含量略有升高，但未经治疗的ApoC2^-/-新生仓鼠的TG含量是治疗组的100多倍，因此仍具有十分显著的治疗效果，而TC则一直稳定在正常仓鼠水平。

从图5的结果可知，以人血浆为阳性对照，注射scAAV8-LP15-ApoC2的6只ApoC2^-/-新生仓鼠在7天、14天、28天均能有效表达ApoC2蛋白，未经注射的ApoC2^-/-新生仓鼠及野生型对照未检测到ApoC2蛋白的明显表达。

结果提示，scAAV8-LP15-ApoC2治疗病毒经眶静脉注射ApoC2^-/-新生仓鼠模型后，能够有效地表达产生ApoC2蛋白，降低仓鼠血清中甘油三酯的含量，消除因血液中甘油三酯过高带来的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎等不良影响，从而达到治疗高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的目的。

实施例5 ApoC2^-/-成年仓鼠经尾静脉注射重组病毒治疗高甘油三酯血症

从实施例3中获得的ApoC2^-/-仓鼠模型中选择6只成年仓鼠，经尾静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2重组病毒，注射剂量为2×10¹²vg/只。另有5只ApoC2^+/-杂合子仓鼠，表型与野生型相同，作为静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2的ApoC2^-/-仓鼠对照。

在注射后不同的时间点（7天、14天、28天、42天和56天）监测仓鼠血清中的血脂变化、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量变化以及ApoC2蛋白的表达情况。检测结果如图6~图8所示。

从图6的结果可知，尾静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2后，ApoC2^-/-成年仓鼠的血脂水平开始下降，从第7天到14天迅速下降，并在28天已完全恢复到正常水平。

从图7的结果可知，和ApoC2^+/-杂合子仓鼠相比，ApoC2^-/-成年仓鼠经scAAV8-LP15-ApoC2治疗后，TG水平迅速下降，并在28天已完全恢复到正常水平，TC含量也迅速下降，并在14天即完全恢复到正常水平。

从图8的结果可知，以人血浆为阳性对照，注射scAAV8-LP15-ApoC2的ApoC2^-/-成年仓鼠在7天、14天、28天均能有效表达ApoC2蛋白，未经注射的ApoC2^-/-成年仓鼠及野生型对照未检测到ApoC2蛋白的明显表达。

结果提示，scAAV8-LP15-ApoC2治疗病毒经尾静脉注射ApoC2^-/-成年仓鼠模型后，能够有效地表达产生ApoC2蛋白，降低仓鼠血清中甘油三酯的含量，消除因血液中甘油三酯过高带来的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎等不良影响，从而达到治疗高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的目的。

实施例6 已治疗组ApoC2^-/-新生仓鼠在成年后经尾静脉再次注射重组病毒治疗高甘油三酯血症

经AAV治疗后，由于体内会产生针对AAV及治疗基因的抗体，因此二次注射治疗往往无效。在实施例4中，由于所治疗的是ApoC2^-/-新生仓鼠，而新生仓鼠的免疫系统尚未发育完全，因此体内未必能产生出针对AAV及治疗基因的抗体。我们将已治疗组的ApoC2^-/-新生仓鼠，在成年后以4×10¹²vg/只的高剂量和2×10¹²vg/只的低剂量经尾静脉再次注射重组AAV病毒scAAV8-LP15-ApoC2。另有2只未经治疗的ApoC2^-/-纯合子仓鼠和2只ApoC2^+/-杂合子仓鼠，作为静脉注射scAAV8-LP15-ApoC2的ApoC2^-/-仓鼠对照。

在注射后不同的时间点（7天、14天、28天、42天、56天和84天）监测仓鼠血清中的血脂变化、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量变化以及ApoC2蛋白的表达情况。检测结果如图9~图11所示。

从图9的结果可知，无论是4×10¹²vg/只的高剂量组还是2×10¹²vg/只的低剂量组仓鼠，经尾静脉再次注射scAAV8-LP15-ApoC2后，血脂水平均开始迅速下降，并在28天已完全恢复到正常水平，其中高剂量组比低剂量组在7至14天血脂下降得更快一些。

从图10的结果可知，无论是4×10¹²vg/只的高剂量组还是2×10¹²vg/只的低剂量组仓鼠，经尾静脉再次注射scAAV8-LP15-ApoC2后，体内TG和TC水平均开始迅速下降，并且TG在28天已完全恢复到正常水平，而TC在14天即完全恢复到正常水平。

从图11的结果可知，以人血浆为阳性对照，无论是4×10¹²vg/只的高剂量组还是2×10¹²vg/只的低剂量组仓鼠，经尾静脉再次注射scAAV8-LP15-ApoC2后，在7天、14天均能有效表达ApoC2蛋白，未经注射的ApoC2^-/-成年仓鼠及野生型对照未检测到ApoC2蛋白的明显表达。

结果提示，已治疗组ApoC2^-/-新生仓鼠，成年后经尾静脉再次注射重组病毒也能够有效地表达产生ApoC2蛋白，降低仓鼠血清中甘油三酯的含量，消除因血液中甘油三酯过高带来的高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎等不良影响，从而达到治疗高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的目的。

序列表

<110> 北京五加和分子医学研究所有限公司

<120> 一种用于治疗严重高甘油三酯血症的基因药物

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 352

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gttaattttt aaaaagcaag tggcccttgg cagcatctgt ttgctctggt taataatctc 60

aggagcacaa acattcccag gagaagaaat caacatcctg gacttatcct ctgggcctaa 120

gtatttagtt tggttagtaa ttactaaaca ctgagaacgc caatgaaata caaagatgag 180

tctagttaat aatctacaat tattggttaa agaagtatat tagtgctaat ttccctccgt 240

ttgtcctagc ttttctcttc tgtcaacccc acacgccttt ggcaggtaag ttggcgccgt 300

ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta ccttttttac ag 352

<210> 2

<211> 391

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

atgggcacca ggctgctgcc agccctgttc ctggtgctgc tggtgctggg ctttgaggtg 60

cagggcacac agcagcccca gcaggacgag atgccctctc ctaccttcct gacacaggtg 120

agtatctcag ggatccagac atggggatat gggaggtgcc tctgatccca gggctcactg 180

tgggtctctc tgttcacagg tgaaggagtc cctgagctcc tactgggagt ctgccaagac 240

cgccgcccag aacctgtacg agaagacata tctgccagca gtggacgaga agctgcggga 300

cctgtactct aagagcaccg ccgccatgag cacctataca ggcatcttta cagatcaggt 360

gctgtccgtg ctgaagggcg aggagtgata a 391

<210> 3

<211> 102

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

tccataaagt aggaaacact acgatctcca taaagtagga aacactacag tatctccata 60

aagtaggaaa cactacgcta tccataaagt aggaaacact ac 102

<210> 4

<211> 230

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 230

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

gggtctggca gccaaagcaa tcactcaaa 29

<210> 6

<211> 1128

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

gttaattttt aaaaagcaag tggcccttgg cagcatctgt ttgctctggt taataatctc 60

aggagcacaa acattcccag gagaagaaat caacatcctg gacttatcct ctgggcctaa 120

gtatttagtt tggttagtaa ttactaaaca ctgagaacgc caatgaaata caaagatgag 180

tctagttaat aatctacaat tattggttaa agaagtatat tagtgctaat ttccctccgt 240

ttgtcctagc ttttctcttc tgtcaacccc acacgccttt ggcaggtaag ttggcgccgt 300

ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta ccttttttac agggtaccgc 360

caccatgggc accaggctgc tgccagccct gttcctggtg ctgctggtgc tgggctttga 420

ggtgcagggc acacagcagc cccagcagga cgagatgccc tctcctacct tcctgacaca 480

ggtgagtatc tcagggatcc agacatgggg atatgggagg tgcctctgat cccagggctc 540

actgtgggtc tctctgttca caggtgaagg agtccctgag ctcctactgg gagtctgcca 600

agaccgccgc ccagaacctg tacgagaaga catatctgcc agcagtggac gagaagctgc 660

gggacctgta ctctaagagc accgccgcca tgagcaccta tacaggcatc tttacagatc 720

aggtgctgtc cgtgctgaag ggcgaggagt gataagaatt ctccataaag taggaaacac 780

tacgatctcc ataaagtagg aaacactaca gtatctccat aaagtaggaa acactacgct 840

atccataaag taggaaacac tacagatctg cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 900

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 960

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 1020

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 1080

gggatgcggt gggctctatg ggtctggcag ccaaagcaat cactcaaa 1128

<210> 7

<211> 121

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggacagatcc 120

c 121

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

aagtggccct tggcagcatc t 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

ggacaaacgg agggaaatta gcact 25

Claims (11)

1.一种载脂蛋白C2的基因表达框，其特征在于，包含：

（1）SEQ ID No.1所示的启动子序列；

（2）SEQ ID No.2所示的优化的载脂蛋白C2编码区的核苷酸序列；

（3）SEQ ID No.3所示的人miR-142-3p的靶序列。

2.根据权利要求1所述的载脂蛋白C2的基因表达框，其特征在于，进一步包含SEQ IDNo.4所示的BGH polyA序列和/或SEQ ID No.5所示的TGB enhancer增强子序列。

3.根据权利要求2所述的载脂蛋白C2的基因表达框，其特征在于，碱基全序列如SEQ IDNo .6所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的载脂蛋白C2的基因表达框，其特征在于，表达框表达产物为载脂蛋白C2，可降低血液中甘油三酯水平和抑制免疫反应。

5.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，携带如权利要求1-4中任一项所述的载脂蛋白C2的基因表达框。

6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体携带基因组为单链DNA分子，或可自我互补形成双链DNA分子。

7.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体血清型为AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 AAV9或AAVrh.10。

8.根据权利要求7所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体血清型为AAV8。

9.一种基因药物，其特征在于，包含：权利要求1-4任一项所述的载脂蛋白C2的基因表达框，或权利要求5-8任一项所述的重组腺相关病毒载体。

10.根据权利要求1-4任一项所述的载脂蛋白C2的基因表达框或权利要求5-8任一项所述的重组腺相关病毒载体的用途，用于制备治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述基因药物的给药方式为静脉注射。

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