CN108103103B - 一种高脂血症的基因治疗药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组腺相关病毒介导的高脂血症治疗药物。重组腺相关病毒载体携带包含人miR‑142‑3p靶序列的oFat‑1(optimized Fat‑1,简称oFat‑1)基因表达框。体内实验表明,该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内,持续稳定地表达Fat‑1蛋白,提高体内ω‑3多不饱和脂肪酸含量,降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白含量。结果提示,该重组腺相关病毒载体有希望开发成为一种新的高脂血症治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带oFat-1基因表达框的高脂血症基因治疗药物。
背景技术
高脂血症是由体内脂质代谢紊乱导致血脂水平增高而引起的一种病症,即血液中一种或多种脂质成分异常增高并由此引发一系列临床病理表现的病症。通常情况下,血清总胆固醇检测>5.72 mmol/L,三酰甘油检测>2.3 mmol/L,就可以被诊断为高脂血症。
我国的血脂异常患病率高达18.6%,大约2亿人,对人们的健康造成了极大的危害。这是因为高脂血症是许多疾病的主要危险因素。首先高脂血症是形成冠心病的主要危险因素之一。高脂血症对身体的直接损害是加速全身动脉粥样硬化,因为全身的重要器官都要依靠动脉供血、供氧,一旦动脉被粥样斑块堵塞,就会导致严重的后果。大量研究资料表明,高脂血症与脑卒中、心肌梗死、心脏猝死、糖尿病、高血压、脂肪肝等的发病有着密切关系,是形成冠心病的主要危险因素之一。此外,高脂血症还可诱发胆结石、胰腺炎,加重肝炎,导致男性性功能障碍、老年痴呆症等疾病。最新研究提示高脂血症可能与癌症的发病有关。
其次,高脂血症还是引起的心脑血管疾病的重要原因之一。近年来,随着人们生活习惯特别是饮食习惯的改变等多种因素的影响,高脂血症引起的心脑血管疾病的发病率呈现出明显增高的趋势。高脂血症引起的心脑血管疾病危害大,病情进展凶险,其死亡率约占人类总死亡率的半数左右。据现代医学疾病监控的数据显示,全世界每天因高脂血症引发的心脑血管疾病死亡人数近4 000人之多。
高脂血症严重地危机人们的健康和生命。虽然目前市面已有多种可用的高脂血症治疗药物,但都存在各自的弊端,仍然不能有效地惠及广大患者。他汀类药因其疗效确切,是目前主要的高脂血症临床用药。它通过抑制胆固醇合成限速酶羟甲戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A, HMG-CoA)还原酶活性,降低血液中的胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯含量,并提高血液中的高密度脂蛋白含量,从而到达治疗高脂血症的目的。遗憾的是,对重症高脂血症病人,简单地提高他汀类药物的使用量,对LDL的降低作用有限,但却大大增加了肌痛肌炎等不良反应,患者依从性明显降低。而且有的高脂血症患者为他汀类药物不耐受者。针对这些不足,也研发出了或正在其他一些高脂血症治疗药物,如贝特类药物、烟酸及其衍生物、中药降脂药、PCSK9抑制剂(如PCSK9抗体、反义核苷酸等),但要么疗效相比于他汀类药物未见明显优势,要么使用成本极高,让很多的高脂血症望而却步。因此有必要研究新的更加高效的高脂血症治疗药物。
Harris对70多个临床实验进行汇总分析证实:富含ω-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的鱼油可以有效降低甘油三酯(triglyceride,TG)水平且疗效持久(Harris WS. Lipids 1999;34 Suppl:S257-S258)。严重高脂血症患者每天服用鱼油4g可以使TG的含量下降25-30%,长期服用小剂量2g/d即有显著降低,餐后TG水平尤其敏感。Bunea R等研究发现高脂血症病人服用鱼油后能够显著降低体内的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)含量,同时提高高密度脂蛋白(HDL)含量,治疗作用明显(Bunea R, et al. Altern Med Rev. 2004; 9(4):420-428.)。在欧洲,鱼油已经被批准用于高脂血症的治疗。这些结果都说明了ω-3PUFA在高脂血症中的治疗作用。后续的研究表明,通过服用鱼油提高体内的ω-3PUFA含量,降低ω-6PUFA/ω-3PUFA的比值,能够改变体内的脂代谢过程中的某些关键环节。如减少肝脏TG的合成和极低密度脂蛋白(VLDL)的分泌关系等。
遗憾的是,人类自身不能够合成ω-3PUFA,需要从食物中吸收或人为补充ω-3PUFA,才能使体内的ω-6PUFA/ω-3PUFA保持在一个合理的水平。但大部分的饮食结构决定了每天摄入的PUFA多为ω-6PUFA。就算人为服用ω-3PUFA能够降低ω-6PUFA/ω-3PUFA,但体内的ω-6PUFA的绝对含量也相对较高。因此如果能够通过某种物质直接将体内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA,从而使ω-6PUFA的绝对含量和ω-6PUFA/ω-3PUFA比值均降低,无疑将具有更好的治疗效果。已有研究表明通过转基因方式将秀丽线虫中的ω-6 PUFA转化为ω-3 PUFA的n-3 PUFA脱氢酶(Fat-1)基因人源化(mFat-1)后,导入小鼠,制备得到Fat-1基因转基因小鼠,结果转基因小鼠体内的ω-3 PUFA含量显著提高,ω-6PUFA含量明显降低,ω-6PUFA/ω-3 PUFA比值降低(Kim EH, et al. Biochem Pharmacol. 2012;84(10):1359-1365.)。该结果从原理上证明了Fat-1能够将哺乳动物体内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA。那么是否能够将Fat-1基因直接导入人体内,把ω-6PUFA转化为ω-3PUFA,显著降低ω-6PUFA/ω-3PUFA比值,从而达到治疗高脂血症的目的,开发出一种新的高脂血症治疗药物,仍然有许多困难需要克服。其中,最主要的障碍是,mFat-1基因本身不在人体内表达,作为一种异源蛋白,人体可能会产生针对表达Fat-1蛋白的免疫反应,直接对导入mFat-1基因并表达Fat-1蛋白的细胞进行免疫攻击。
为了突破这一障碍,我们在本发明中设计了一种用于高脂血症的基因治疗药物rAAV-CAM-oFat-1-142T。为了提高Fat-1基因的表达效率,我们对Fat-1基因进行了序列优化合成,得到oFat-1基因。采用人为设计的高效表达启动子CAM调控oFat-1基因表达,并在基因的3’UTR(untranslated region)区加入miR-142-3p靶序列,最大限度地抑制oFat-1基因在免疫相关细胞(如抗原呈递细胞)中表达,显著降低针对oFat-1蛋白免疫反应的产生概率[29]。选择更加安全的重组AAV载体[30]携带oFat-1基因表达框。进一步提高了药物开发成功的可能性。
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)因在腺病毒制品中发现而得名(Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.Hoggan MD, et al. Proc NatlSci USA. 1966; 55: 1467-1474.)。AAV是微小病毒科 (Parvovirus)成员,包含多种血清型,其基因组为单链DNA(Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.),其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒,需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.),或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时,AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(Chiorini JA, et al. Curr Top MicrobiolImmunol. 1996; 218:25-33.),而不产生子代病毒。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)(Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.)。AAV2基因组长约4.7kb,基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”( inverted terminal repeat, ITR),呈回文-发卡结构(Lusby E, et al. JVirol. 1980; 34: 402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框(ORF),分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(Samulski RJ, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.)。
ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件,在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948. )。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site,RBS)和末端解链位点trs(terminal resolutionsite),能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(Linden RM, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.)。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构,在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用(Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.)。
AAV2基因组其余部分可分为2个功能区,rep基因区和cap基因区(Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.)。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs(terminal resolution site)和GAGY重复基序(repeat motif)特异性结合(Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.),启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心,因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同,但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子,分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能,而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中,VP3分子量最小,但数量最多,在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的;VP2协助VP3进入细胞核;VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解,AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具,即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框,病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供,降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之,AAV病毒本身不具有致病性,使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs(terminal resolution site)序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补,形成双链,显著提高AAV载体的体内外转导效率(Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.)。包装得到的病毒成为scAAV(self-complementary AAV)病毒,即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV(single-stranded AAV),即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小,仅为ssAAV包装容量的一半,约为2.2kb-2.5kb,但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多,不同的血清型具有不同的组织感染嗜性,因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.)。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障,将外源基因导致大脑神经元中,为靶向大脑的基因转导提供了可能(Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.)。此外,AAV载体的理化性质稳定,对酸碱和高温体现出较强的耐受性(Gruntman AM, et al. Hum GeneTher Methods. 2015; 26(2): 71-76.),容易开发出稳定性较高的生物制品。
AAV载体还具有相对成熟的包装系统,便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus type 1,HSV1)为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中,三质粒转染包装系统因无需辅助病毒,安全性高,是应用最为广泛的AAV载体包装系统,也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是,高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统(Yuan Z, et al. Hum Gene Ther, 2011,22(5):613-624.),该系统生产效率高,但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在,影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略(伍志坚,吴小兵等。科学通报,1999,44(5):506-509。Conway JE, et al. Gene Ther, 1999,6:986-993.)。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略(Wustner JT, et al. Mol Ther, 2002,6(4):510-518.)。在此基础上,Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列(Inverted terminal repeat,ITR)/外源基因表达框,然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞,包装产生AAV病毒(Booth MJ,et al. Gene Ther,2004,11:829-837.)。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统(Thomas DL, et al.Gene Ther,2009,20:861-870.),使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外,Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框,构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性,随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数,逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒(Chen H. MolTher.2008;16(5):924-930. Galibert L,et al.J Invertebr Pathol, 2011,107 Suppl:S80-93.)以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略(Mietzsch M, et al. Hum GeneTher. 2014;25:212-222. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015;26(10):688-697.)。每种包装系统都各具特点,可根据需要做出合适的选择。
由于上述特点,AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗,特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2016年8月,世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有173项(http://www.abedia.com/wiley/vectors.php)。更为重要的是,基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市,成为西方世界批准的第一个基因治疗药物(Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.);血友病B(Kay MA, et al. Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.)和先天性黑蒙症(RPE65基因突变引起)(Jacobson SG, et al. Arch Ophthalmol. 2012; 130(1): 9-24.)的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果,预期在不久的将来会上市销售,造福广大患者。
本发明中,我们选择AAV载体来携带oFat-1基因表达框,主要是基于AAV载体的以下特点。其一,AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列,不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因(Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).),免疫原性低。其二,AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达(Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.),避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三,AAV载体通过静脉注射、肌肉注射都具有较高的转导效率(Wang Z, et al. Nat Biotechnol. 2005;23:321-328. Bish LT, et al. Hum Gene Ther. 2008;19:1359-1368.Zincarelli C, et al. Mol Ther. 2008;16:1073-1080.Prasad KM, et al.Gene Ther. 2011;18:43-52.Rebuffat A, et al. Hum Gene Ther.2010;21(4):463-477.),保证oFat-1基因表达框能够在体内高效地表达Fat-1蛋白。
为了降低机体产生针对oFat-1蛋白免疫反应的概率,延长oFat-1基因持续稳定表达的时间。我们人为设计了高效表达的CAM启动子,让导入的oFat-1基因在体内高效表达。进一步,我们在oFat-1基因表达框的3’UTR区克隆入4个miR-142-3p靶序列。由于miR-142-3p在造血干细胞系来源细胞中高表达(Chen CZ, et al. Science.2004; 303(5654): 83-86.),免疫细胞均分化来源于造血干细胞系,因此利用miRNA抑制基因表达的原理(Kim VN.Nat Rev Mol Cell Biol.2005;6(5):376-385.),携带miR-142-3p靶序列的基因表达会在免疫细胞中受到明显抑制,从而降低机体产生针对基因表达产物免疫反应的概率(DismukeDJ, et al. Curr Gene Ther. 2013; 13(6): 434-452.)。
miRNAs(microRNAs)是广泛存在于人类和动物体内的长度为18至25个核苷酸(nucleotide,nt)的单链非编码RNA(Bartel DP. Cell. 2004; 116: 281-297. Kim VN.Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 376-385.)。1993年miRNA首先在秀丽线虫(C.elegans)中发现(Lee RC, et al. Cell. 1993; 75: 843-854. Wightman B, et al.Cell. 1993; 75: 855-862.)。C.elegans中lin-4基因能够下调lin-14基因的表达,但lin-4基因的编码产物不是蛋白质,而是一种小RNA分子,表明自身编码小RNA分子能够调节基因的表达。随后,多种类似的小RNA分子在不同的物种和细胞中相继发现(Lagos-Quintana M,et al. Science. 2001; 294: 853-858. Lau NC, et al. Science. 2001; 294: 858-862. Lee RC, et al. Science. 2001;294: 862-864.),miRNA开始成为该类小RNA 的统称。miRNA调节人类大约60%基因的表达(Lewis BP, et al. Cell. 2005;120: 15-20.Friedman RC, et al. Genome Res. 2009; 19: 92-105.),在多种生理和病理过程中发挥重要作用(Careton M, et al. Cell Cycle. 2007; 6: 2127-2132. Ambros V. Cell.2003; 113:673-676. Schichel R, et al. Oncogene. 2008; 27: 5959-5974.)。
miRNA基因通常位于基因组的外显子、内含子和基因间区中(Olena AF, et al. JCell Physiol. 2010; 222: 540-545. Kim VN, et al. Trends Genet. 2006; 22: 165-173.)。在细胞内,miRNA的产生过程如下述(Winter J, et al. Nat Cell Biol. 2009;11:228-234.)。首先在细胞核中,miRNA基因由RNA聚合酶II或III启动转录产生初始产物pri-microRNA;pri-microRNA自我折叠部分序列形成茎环结构。随后,由核糖核酸酶III Drosha和DGCR8分子组成的加工复合体作用pri-microRNA,切去多余序列,留下60nt左右的茎环结构,即前体miRNA分子pre-microRNA(Lee Y, et al. Nature. 2003;425: 415-419. DenliAM, et al. Nature. 2004;432: 231-235. Gregory RI, et al. Nature. 2004; 432:235-240. Han J, et al. Genes Dev. 2004; 18: 3016-3027. Landthaler M, et al.Curr Biol. 2004;14: 2162-2167.)。然后在转运蛋白Exportin-5的协助下,pre-microRNA从细胞核进入细胞质中(Lund E, et al. Science. 2003; 303: 95-98. Yi R, et al.Genes Dev. 2003;17: 3011-3016. Bohnsack MT, et al. RNA. 2004; 10: 185-191.),经Dicer酶加工去掉其茎环结构中的环形部分,变为双链RNA分子( Jiang F, et al.Genes Dev. 2005;, 19: 1674-1679. Saito K, et al. PLoS Biol. 2005; 3: e235.)。最后,双链RNA分子被AGO2等蛋白因子结合,其中一条链发生降解,另一条链和蛋白因子形成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)。RISC识别mRNA中靶序列,通过降解mRNA分子、促进mRNA分子3’端去腺苷化和抑制翻译来降低mRNA的表达水平,在转录后水平调节基因的表达(Storz G, et al. Curr Opin Microbiol.2004; 7: 140-144.Fabian MR, et al. Annu Rev Biochem. 2010; 79: 351-379. Valencia-Sanchez MA,et al. Genes Dev. 2006; 20: 515-524.)。因此利用细胞内高表达的miRNA,在外源基因的3’UTR(untranslated region)插入该miRNA的靶序列,能够有效地抑制外源基因在导入细胞中的表达。
根据以上设计思路,我们制备得到rAAV-CAM-oFat-1-142T病毒,并设计制备得到无miR-142-3p靶序列的rAAV-CAM-oFat-1对照病毒。将这些病毒分别等剂量注射至高脂血症大鼠模型体内,评价设计rAAV-CAM-oFat-1-142T有效性。结果显示,相比对照病毒,rAAV-CAM-oFat-1-142T和rAAV-CAM-oFat-1都能够在高脂血症大鼠模型体内表达oFat-1蛋白,显著提高高脂血症大鼠模型体内的ω-3PUFA含量,降低模型体内的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白含量,有效缓解高脂血症症状,显示出巨大的高脂血症的治疗潜力。而且相比于rAAV-CAM-oFat-1病毒,rAAV-CAM-oFat-1-142T病毒在模型体内的稳定持续表达时间更长,一次注射就能够长时间地降低模型体内的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白含量,有效缓解高脂血症及其带来的相关症状,为高脂血症患者提供了新的治疗选择。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种基于AAV载体的新型的高脂血症基因治疗药物。该药物由AAV载体携带oFat-1基因表达框。oFat-1基因由秀丽线虫Fat-1基因人源化而来。根据在基因表达框中,人为设计的CAM启动子调控oFat-1基因的高效表达,oFat-1基因表达框的3’UTR包含4个串联的完全互补的miR-142-3p靶序列。基于上述设计,预期该药物通过静脉注射或者肌肉注射后能够在高脂血症大鼠体内高效表达Fat-1蛋白,显著提高血液中的ω-3PUFA含量,降低模型体内的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白含量,有效缓解高脂血症症状,从而达到治疗高脂血症的目的。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种治疗高脂血症的基因治疗药物,其特征在于,该药物基于重组AAV载体,利用AAV载体通过静脉注射或者肌肉注射能高效地把药物效应元件导入体内,实现药物效应元件表达产物治疗作用蛋白Fat-1的高效表达。为了实现Fat-1蛋白的高效表达,根据不同血清型AAV的转导特点,不同的给药方式选择相应的血清型AAV,如静脉注射主要选择AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8和AAV9等,肌肉注射则主要选择AAV1、AAV8和AAV9等。
本发明提供的高脂血症基因治疗药物,其特征在于,使用的AAV载体为ssAAV载体和scAAV载体。优先选择为scAAV载体,scAAV载体能够自身互补形成双链,避免了ssAAV进入细胞后需要通过DNA修复、复制等合成互补链才能转录表达携带外源基因的过程,因此scAAV载体转导效率更高,表达更为迅速。
本发明提供的治疗高脂血症的基因治疗药物,其特征还在于,基于设计的Fat-1基因表达框能够实现Fat-1蛋白的高效表达。为此,首先根据密码子偏爱性、GC含量、CpG二聚体含量、mRNA二级结构、消除隐蔽剪接位点、消除让转录提前终止的polyA加尾信号、消除内部chi位点和核糖体结合位点、CpG岛、消除ARE序列等RNA不稳定基序和RNA重复序列(正向重复、反向重复和二重复等)等原则优化合成Fat-1蛋白的编码区序列,得到oFat-1序列。接下来,在优化后的oFat-1序列的翻译起始密码子前添加Kozak序列5’-GCCACC-3’,提高蛋白翻译时的准确起始效率。采用人为设计的CAM启动子调控oFat-1基因转录,CAM启动子由人CMV病毒的增强子序列、鸡β-actin蛋白的基础启动子和MVM内含子组成,使oFat-1基因能够在多种细胞中高效转录。最后,在oFat-1基因的3’UTR区插入4个串联的完全互补的miR-142-3p靶序列,抑制Fat-1蛋白在抗原呈递细胞中表达,降低针对Fat-1蛋白产生免疫反应的概率,使Fat-1蛋白在体内持续稳定高效表达。本发明提供的T1D疾病基因治疗药物,其特征在于,将该药物经静脉注射注射至高脂血症大鼠体内后,能在大鼠体内高效稳定持续地表达Fat-1蛋白,表达产生的Fat-1蛋白将细胞内的ω-6PUFA催化转化ω-3PUFA,提高血液中的ω-3PUFA和ω-6PUFA的比值,降低模型体内的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白含量,有效缓解高脂血症症状,从而达到治疗高脂血症的目的。
本发明提供的高脂血症基因治疗药物,其特征在于,该药物经肌肉注射至高脂血症体内后呈现出同静脉注射相似的治疗效果。但需要采用不同于静脉注射方式的血清型AAV来携带oFat-1基因表达框,且需要改变药物的注射剂量。
本发明提供的高血脂基因治疗药物,其特征还在于,一次给药就能够长期持续地降低高脂血症患者体内的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白含量,从而达到长时间的治疗效果。
本发明用到的重要原始实验材料如下所示。
pHelper质粒,来源于AAV Helper Free System(Agilent Technologies,美国),由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。
pAAV-R2C1质粒,由本公司构建保存。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies,美国)中的pAAV-RC质粒为基本骨架,用AAV1基因组(GenBank ID:NC_002077)中外壳蛋白编码序列Cap1(基因组中第2223至4433位序列)替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列,即得pAAV-R2C1质粒。简要的构建过程为,根据前述思路获得pAAV-R2C1质粒序列信息,人工合成pAAV-R2C1质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列,采用标准的分子克隆方法,用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C1质粒。pAAV-R2C1质粒包含完整的AAV1的cap基因和AAV2的rep基因,在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV1外壳蛋白。
pAAV-R2C8质粒,由本公司构建保存。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies,美国)中的pAAV-RC质粒为基本骨架,用AAV8基因组(GenBank ID:AF513852)中外壳蛋白编码序列Cap8(基因组中第2121至4337位序列)替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列,即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为,根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息,人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列,采用标准的分子克隆方法,用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因,在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV8外壳蛋白。
pAAV-R2C9质粒,由本公司构建保存。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies,美国)中的pAAV-RC质粒为基本骨架,用AAV9外壳蛋白编码序列(GenBankID:AY530579)替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列,即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为,根据前述思路获得pAAV-R2C9质粒序列信息,人工合成pAAV-R2C9质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列,采用标准的分子克隆方法,用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因,在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV9外壳蛋白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1 pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo。ITR,inverted terminal repeat,长度为145bp的反向末端重复序列。CMVpromoter,人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA,牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp,氨苄青霉素抗性基因读框。Neo,新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图2 pscAAV-CAM载体结构示意图。ITR,inverted terminal repeat,长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter,人为设计合成的启动子,由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒(minute parvovirus of mice,MVM)内含子组成。BGH polyA,牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp,氨苄青霉素抗性基因读框。Neo,新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图3 pscAAV-CAM-OFat-1载体结构示意图。ITR,inverted terminal repeat,长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter,人为设计合成的启动子,由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒(minute parvovirus of mice,MVM)内含子组成。OFat-1,优化合成的秀丽线虫fat-1基因。BGH polyA,牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp,氨苄青霉素抗性基因读框。Neo,新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图4 pscAAV-CAM-OFat-1-142T载体结构示意图。ITR,inverted terminalrepeat,长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter,人为设计合成的启动子,由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒(minute parvovirus ofmice,MVM)内含子组成。OFat-1,优化合成的秀丽线虫fat-1基因。4×miR-142-3pT,4个串联的完全互补的人miR-142-3p靶序列。BGH polyA,牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp,氨苄青霉素抗性基因读框。Neo,新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图5 静脉注射重组病毒后4种组织Fat-1蛋白表达检测结果。 4种不同的重组AAV病毒(scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T)以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射病毒4周后,处死大鼠,分离肝脏、骨骼肌、心肌和肺等组织,提取各个组织细胞总蛋白,利用western blot方法检测细胞总蛋白中Fat-1蛋白含量。泳道1,肝脏;泳道2,心肌;泳道3,骨骼肌;泳道4,肺。结果显示注射病毒4周后,在四种组织中均检测到Fat-1蛋白的表达。
图6静脉注射scAAV9-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒4周后不同组织PUFA含量测定结果。
图7静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒4周后不同组织PUFA含量测定结果。
图8静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后高脂血症模型大鼠TC检测结果scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测总胆固醇( TC)。
图9静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后高脂血症模型大鼠TG检测结果 scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测甘油三酯( TG)。
图10静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后高脂血症模型大鼠HDL检测结果 scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测高密度脂蛋白( HDL)。
图11静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后高脂血症模型大鼠LDL检测结果 scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经尾静脉注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测低密度脂蛋白( LDL)。
图12肌肉注射重组病毒后4种组织Fat-1蛋白表达检测结果。 4种不同的重组AAV病毒(scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T)以4×1011vg/只的剂量经骨骼肌注射高脂血症模型大鼠。注射病毒4周后,处死大鼠,分离肝脏、骨骼肌、心肌和肺等组织,提取各个组织细胞总蛋白,利用western blot方法检测细胞总蛋白中Fat-1蛋白含量。泳道1,肝脏;泳道2,心肌;泳道3,骨骼肌;泳道4,肺。结果显示注射病毒4周后,在四种组织中均检测到Fat-1蛋白的表达。
图13肌肉注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV1-CAM-OFat-1-142T病毒4周后不同组织PUFA含量测定结果。
图14静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒4周后不同组织PUFA含量测定结果。
图15肌肉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后高脂血症模型大鼠TC检测结果 scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以4×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经骨骼肌注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测总胆固醇( TC)。
图16肌肉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后高脂血症模型大鼠TG检测结果 scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以4×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经骨骼肌注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测甘油三酯( TG)。
图17肌肉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后高脂血症模型大鼠HDL检测结果 scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以4×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经骨骼肌注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测高密度脂蛋白( HDL)。
图18肌肉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后高脂血症模型大鼠LDL检测结果 scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以2×1011vg/只(viral genome,vg)的剂量经骨骼肌注射高脂血症模型大鼠。注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w),大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测低密度脂蛋白( LDL)。
具体实施方式
本发明公开了一种高脂血症的基因治疗药物,包含药物的设计、小量制备及功能验证,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。其中,如无特殊说明,实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1 质粒载体构建
为了构建获得包装重组AAV病毒需要的pscAAV-CAM-OFat-1和pscAAV-CAM-OFat-1-142T质粒,我们首先以公司保存的pAAV2neo为基础,用自主设计得到的CAM启动子(SEQID No.1)替换pAAV2neo载体中的CMV启动子,用人工合成的缺失AAV2的ITR中trs(terminalresolution site)和D序列的突变ITR序列(命名为ΔITR)(SEQ ID No.2)替换pAAV2neo载体中的一侧ITR序列,得到pscAAV-CAM载体。接下来,将人工合成的OFat-1(SEQ ID No.3)和OFat-1-142T(SEQ ID No.4)序列分别克隆入pscAAV-CAM载体的KpnI和EcoRI以及KpnI和BglII酶切位点之间,得到pscAAV-CAM-OFat-1和pscAAV-CAM-OFat-1-142T载体。
(1)pscAAV-CAM载体构建
将人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列和小鼠细小病毒内含子序列拼接,得到CAM启动子序列,序列信息见SEQ ID No.1。在CAM启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成,合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57 simple载体(金斯瑞生物科技,南京),得到pUC57-CAM。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAM载体和pAAV2neo载体,回收CAM片段和切去CMV启动子的pAAV2neo载体片段(约6.3kb),两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物,大连),筛选、鉴定后得到含有CAM启动子的AAV质粒载体pAAV2neo-CAM。以AAV2基因组(GenBank No. AF043303)中的左侧ITR序列为基础,根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列( Wang Z, et al. Gene Ther. 2003;10:2105-2111.),得到ΔITR序列。为了便于克隆操作,将pAAV2neo载体中1392-1668bp之间序列(靠近BGH polyA的ITR和ApaI酶切位点之间序列)同ΔITR序列融合,得到融合序列。在融合序列两端分别添加BamHI和ApaI酶切位点后,由金斯瑞生物科技有限公司合成,克隆入pUC57 simple载体,获得pUC57-ΔITR。BamHI和ApaI分别双酶切消化pUC57-ΔITR载体和pAAV2neo-CAM载体,回收含有ΔITR片段和切去ITR序列的pAAV2neo-CAM载体片段。两片段连接后,转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物,大连),筛选、鉴定获得pscAAV-CAM载体(附图2)。
(2)pscAAV-CAM-OFat-1载体构建
根据线虫fat-1基因的cDNA序列(Spychalla JP, et al. Proc Natl Acad SciUSA.1997;94(4):1142-1147.),由金斯瑞生物科技有限公司根据人密码子偏爱性等原则优化合成得到OFat-1基因。将优化合成的OFat-1基因克隆入pUC57 simple载体,得到pUC57-OFat-1载体。KpnI和EcoRI分别双酶切消化pUC57-OFat-1载体和pscAAV-CAM载体,回收OFat-1片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段,两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物,大连),筛选、鉴定得到pscAAV-CAM-OFat-1载体。
(3)pscAAV-CAM-OFat-1-142T载体构建
将4个串联重复的人miR-142-3p的完全互补的靶序列同优化得到的OFat-1基因序列拼接,得到OFat-1-142T序列。由金斯瑞生物科技有限公司合成OFat-1-142T序列。将合成的OFat-1-142T序列克隆入pUC57 simple载体,得到pUC57-OFat-1-142T载体。KpnI和BglII分别双酶切消化pUC57-OFat-1-142T载体和pscAAV-CAM载体,回收OFat-1-142T片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段,两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物,大连),筛选、鉴定得到pscAAV-CAM-OFat-1-142T载体。
实施例2 重组AAV病毒制备及检定
参照文献(Xiao X, et al. J Virol. 1998;72(3):2224-2232.),应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒。简要地,AAV载体质粒(pscAAV-CAM-OFat-1或pscAAV-CAM-OFat-1-142T)、辅助质粒(pHelper)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-R2C1、pAAV-R2C8或pAAV-R2C9)按照1:1:1的摩尔比混匀后,采用磷酸钙方法转染HEK293细胞,转染48h后,收获细胞和培养上清,应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1-142T等6种重组病毒。
采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。具体过程如下:
在CAM启动子中设计两条引物CAM-Q-F和CAM-Q-R:
CAM-Q-F:5’-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3’ (SEQ ID NO.5)
CAM-Q-R:5’-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3’ (SEQ ID NO.6)
以CAM-Q-F和CAM-Q-R为引物特异性地扩增CAM启动子长度为175bp片段,采用SYBRGreen染料结合法,以1μg/μl的pscAAV-CAM-OFat-1质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品,应用SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂(Takara,大连,中国),使用荧光定量PCR仪(型号:ABI 7500 fast,ABI)检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR PremixEx Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献(Ulrich-Peter R,et al. J Virol Methods. 2002; 106: 81-88.)。
实施例3 大鼠高脂血症模型的建立
参考文献(赵金明,等. 中医药理与临床. 2012;28(1):177-180.),构建大鼠高脂血症模型。首先配制高脂乳剂,将30g自制的猪油在50°C的水浴中融化,搅拌中依次加入5g胆固醇、5g蛋黄粉、1g猪胆酸钠、0.5g丙硫氧嘧啶、5g葡萄糖和2g吐温-80,乳化均匀后,用蒸馏水定容至200mL,得到诱导大鼠高脂血症模型需要的高脂乳剂。从北京华阜康生物科技股份有限公司购买120只SPF级Wistar大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机选择雌雄各10只作为对照组,其余100只为实验组。高脂乳剂以50°C水浴融化并搅拌均匀,实验组每天按照20ml/kg的剂量灌胃给予高脂乳剂,每天灌胃服用一次,空白对照组灌胃给予含有等量吐温-80 的同体积蒸馏水。连续灌服乳剂二周后,大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC) 、甘油三脂 (TG) 、高密度脂蛋白 (HDL) 、低密度脂蛋白(LDL) 血脂四项指标; 继续灌服乳剂二周后(共四周),大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测TC、TG、HDL、LDL血脂四项指标。一旦实验组中大鼠的TC、TG和LDL测定值相比空白对照组检测结果平均值的差异具有统计学意义(P<0.05),即判定高脂血症大鼠模型造模成功。按照此标准,灌服乳剂2周后,实验组100只大鼠有63只可判定为高脂血症模型;灌服乳剂4周后,实验组有92只大鼠可判定为高脂血症模型。选择92只高脂血症模型大鼠作为后续研究的备选实验动物。
实施例4 静脉注射给药治疗高脂血症
从实施例3建模得到的92只高脂血症大鼠模型中随机选择40只大鼠,其余52只用于后续研究。将40只大鼠,随机分为5组,每组8只大鼠。5组大鼠中,其中4组大鼠分别经尾静脉注射scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T重组病毒,注射剂量为2×1011vg/只,剩余1组大鼠注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS),作为注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T的对照以及注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T的对照。注射完后,继续采用实施例3中高脂乳剂对实验组和对照组进行灌服,灌服剂量和频率同实施例3一致。
注射病毒4w后,从每种注射病毒组中随机选择3只大鼠,处死,分离肝脏、心脏、骨骼肌和肺等组织。取等质量的不同组织,采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白(ApplygenTechnologies Inc., P1250),western blot法检测组织总蛋白中Fat-1蛋白表达水平。测定浓度后每个样品上样20µg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,转移至PVDF膜后封闭,经抗Fat-1蛋白小鼠单抗(Abcam,ab20163,使用时1:1000稀释)4ºC孵育过夜后,彻底洗涤,用荧光标记的二抗在室温孵育1小时,然后利用Odyssey 红外成像系统对相应条带进行检测。结果如附图5所示。从图5的结果可知,注射病毒后,在大鼠的肝脏、心脏、骨骼肌和肺组织中均能够检测到Fat-1蛋白的表达,注射AAV9病毒组和注射携带相同基因表达框的AAV8病毒组的表达水平间未见明显差,且携带miR-142-3p靶序列与否也未对Fat-1蛋白的表达水平造成影响,但肝脏、心脏、骨骼肌中的Fat-1表达水平均明显高于肺组织,4组注射病毒大鼠均呈现出相似的性质。结果表明4种病毒经尾静脉注射大鼠体内后均能够有效地表达产生Fat-1蛋白。
为了进一步验证表达产生的Fat-1蛋白是否能够有效地将大鼠体内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA,我们用气相色谱法测定了处死的注射病毒组大鼠和未注射病毒对照组大鼠的不同组织中的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。
首先我们测定了静脉注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAA9-CAM-OFat-1-142T病毒高脂血症模型大鼠中不同组织的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。结果如图6所示。从图6的结果可知,相比于未注射病毒的对照组,注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组大鼠在4种组织中的ω-6PUFA含量均降低,而ω-3PUFA含量则升高,导致大鼠各个组织内的ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低,而且注射scAAV9-CAM-OFat-1病毒组和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组之间未见明显差异。结果表明注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒表达产生的Fat-1蛋白能够催化ω-6PUFA转化为ω-3PUFA,具有正常的生理功能。
接下来,我们测定了静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAA8-CAM-OFat-1-142T病毒高脂血症模型大鼠中不同组织的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。结果如图7所示。从图7的结果可知,相比于未注射病毒的对照组,注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组大鼠也在4种组织中的ω-6PUFA含量均降低,而ω-3PUFA含量则升高,导致大鼠各个组织内的ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低,而且注射scAAV8-CAM-OFat-1病毒组和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组之间未见明显差异。结果表明注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒表达产生的Fat-1蛋白能够催化ω-6PUFA转化为ω-3PUFA,同样具有正常的生理功能。
同时在注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w)监测大鼠体内的TC、TG、LDL和HDL浓度变化。在每次检测过程中,大鼠禁食不禁水16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)血脂四项指标。结果如图8至图11所示。其中图8展示的为TC测定结果;图9展示的为TG监测结果;图10展示的为HDL检测结果;图11展示的为LDL检测结果。
从图8的结果可知,相比于未注射病毒的对照组高脂血症模型大鼠,所有的注射病毒组大鼠的TC下降,注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组高脂血症模型大鼠的TC含量呈现出先快后慢的下降趋势,直到同正常大鼠体内的TC水平无明显差异。相反注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1病毒组高脂血症模型大鼠的TC水平则先下降后升高,虽然仍低于未注射病毒对照组大鼠。结果提示4种病毒经尾静脉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低TC含量,但注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长,效果更加明显。
从图9的结果可以看到,相比于未注射病毒的对照组高脂血症模型大鼠,所有的注射病毒组大鼠的TG下降,注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组高脂血症模型大鼠的TG含量呈现出先快后慢的下降趋势,直到同正常大鼠体内的TG水平无明显差异。相反注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1病毒组高脂血症模型大鼠的TG水平则先下降后升高,虽然仍低于未注射病毒对照组大鼠。结果提示4种病毒经尾静脉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低TG含量,但注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长,效果更加明显。
从图10的结果可知,相比于未注射病毒的对照组高脂血症模型大鼠,所有的注射病毒组大鼠的HDL含量升高,注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组高脂血症模型大鼠的HDL含量呈现出先快后慢的升高趋势,直到高于正常大鼠体内的HDL水平。相反注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1病毒组高脂血症模型大鼠的HDL水平则先升高后下降,虽然仍高于未注射病毒对照组大鼠。结果提示4种病毒经尾静脉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地提高HDL含量,但注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长,效果更加明显。
从图11的结果可知,相比于未注射病毒的对照组高脂血症模型大鼠,所有的注射病毒组大鼠的LDL下降,注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组高脂血症模型大鼠的LDL含量呈现出先快后慢的下降趋势,直到低于正常大鼠体内的LDL水平。相反注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1病毒组高脂血症模型大鼠的LDL水平则先下降后升高,直到接近未注射病毒对照组大鼠的LDL水平。结果提示4种病毒经尾静脉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低LDL含量,但注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长,效果更加明显。
总之,4种病毒静脉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低模型大鼠体内的TC、TG和LDL水平,提高HDL水平,表现出显著的降血脂作用,对高脂血症具有较强的治疗作用。而且携带miR-142-3p靶序列病毒体现出持续地降低模型大鼠体内的TC、TG和LDL的作用,降低幅度更大,说明其治疗作用持续时间长和作用效果更好,完全有可能一次给药就能达到终身治疗的作用,是一种理想的高脂血症治疗候选药物。
实施例5肌肉注射给药治疗高脂血症
在证明静脉注射给药有效的前提下,我们进一步探索了肌肉注射给药对高脂血症的治疗效果。为了保证药物的效果,我们选择对肌肉转导效率较高的AAV1和AAV8来携带OFat-1表达框,制备得到scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1-142T等4种病毒。将4种病毒分别通过肌肉注射至高脂血症模型大鼠体内,检测Fat-1蛋白表达情况、测定ω-6PUFA和ω-6PUFA含量、监测体内TC、TG、HDL和LDL含量,评价其开发成为高脂血症治疗药物的潜力。
从实施例3建模得到的剩余52只高脂血症大鼠模型中随机选择40只大鼠。将40只大鼠,随机分为5组,每组8只大鼠。5组大鼠中,其中4组大鼠分别经骨骼肌注射scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T重组病毒,注射剂量为4×1011vg/只,剩余1组大鼠注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS),作为注射scAAV1-CAM-OFat-1或scAAV1-CAM-OFat-1-142T的对照以及注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T的对照。注射完后,继续采用实施例3中高脂乳剂对实验组和对照组进行灌服,灌服剂量和频率同实施例3一致。
注射病毒4w后,从每种注射病毒组中随机选择3只大鼠,处死,分离肝脏、心脏、骨骼肌和肺等组织。取等质量的不同组织,采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白(ApplygenTechnologies Inc., P1250),western blot法检测组织总蛋白中Fat-1蛋白表达水平。测定浓度后每个样品上样20µg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,转移至PVDF膜后封闭,经抗Fat-1蛋白小鼠单抗(Abcam,ab20163,使用时1:1000稀释)4ºC孵育过夜后,彻底洗涤,用荧光标记的二抗在室温孵育1小时,然后利用Odyssey 红外成像系统对相应条带进行检测。结果如附图12所示。从图12的结果可知,注射病毒后,在大鼠的肝脏、心脏、骨骼肌和肺组织中均能够检测到Fat-1蛋白的表达,注射AAV1病毒组和注射携带相同基因表达框的AAV8病毒组的表达水平间未见明显差,且携带miR-142-3p靶序列与否也未对Fat-1蛋白的表达水平造成影响,但骨骼肌中的Fat-1表达水平均明显高于肝脏、心脏和肺组织,4组注射病毒大鼠均呈现出相似的性质。结果表明4种病毒经尾静脉注射大鼠体内后均能够有效地表达产生Fat-1蛋白。
为了进一步验证表达产生的Fat-1蛋白是否能够有效地将大鼠体内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA,我们用气相色谱法测定了处死的注射病毒组大鼠和未注射病毒对照组大鼠的不同组织中的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。
首先我们测定了肌肉注射scAAV1-CAM-OFat-1或scAA1-CAM-OFat-1-142T病毒高脂血症模型大鼠中不同组织的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。结果如图13所示。从图13的结果可知,相比于未注射病毒的对照组,注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组大鼠在4种组织中的ω-6PUFA含量均降低,而ω-3PUFA含量则升高,导致大鼠各个组织内的ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低,而且注射scAAV9-CAM-OFat-1病毒组和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组之间未见明显差异。结果表明注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒表达产生的Fat-1蛋白能够催化ω-6PUFA转化为ω-3PUFA,具有正常的生理功能。
接下来,我们测定了肌肉注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAA8-CAM-OFat-1-142T病毒高脂血症模型大鼠中不同组织的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。结果如图14所示。从图14的结果可知,相比于未注射病毒的对照组,注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组大鼠也在4种组织中的ω-6PUFA含量均降低,而ω-3PUFA含量则升高,导致大鼠各个组织内的ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低,而且注射scAAV8-CAM-OFat-1病毒组和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组之间未见明显差异。结果表明注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒表达产生的Fat-1蛋白能够催化ω-6PUFA转化为ω-3PUFA,同样具有正常的生理功能。
同时在注射后不同的时间点(0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w)监测大鼠体内的TC、TG、LDL和HDL浓度变化。在每次检测过程中,大鼠禁食不禁水 16h,玻璃毛细管大鼠眼底静脉丛采血,分离血清,全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC) 、甘油三脂 (TG) 、高密度脂蛋白 (HDL) 、低密度脂蛋白(LDL) 血脂四项指标。结果如图15至图18所示。其中图15展示的为TC测定结果;图16展示的为TG监测结果;图17展示的为HDL检测结果;图18展示的为LDL检测结果。
从图15的结果可知,相比于未注射病毒的对照组高脂血症模型大鼠,所有的注射病毒组大鼠的TC下降,注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组高脂血症模型大鼠的TC含量呈现出先快后慢的下降趋势,直到同正常大鼠体内的TC水平无明显差异。相反注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1病毒组高脂血症模型大鼠的TC水平则先下降后升高,虽然仍低于未注射病毒对照组大鼠。结果提示4种病毒经肌肉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低TC含量,但注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长,效果更加明显。
从图16的结果可以看到,相比于未注射病毒的对照组高脂血症模型大鼠,所有的注射病毒组大鼠的TG下降,注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组高脂血症模型大鼠的TG含量呈现出先快后慢的下降趋势,直到同正常大鼠体内的TG水平无明显差异。相反注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1病毒组高脂血症模型大鼠的TG水平则先下降后升高,虽然仍低于未注射病毒对照组大鼠。结果提示4种病毒经肌肉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低TG含量,但注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长,效果更加明显。
从图17的结果可知,相比于未注射病毒的对照组高脂血症模型大鼠,所有的注射病毒组大鼠的HDL含量升高,注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组高脂血症模型大鼠的HDL含量呈现出先快后慢的升高趋势,直到高于正常大鼠体内的HDL水平。相反注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1病毒组高脂血症模型大鼠的HDL水平则先升高后下降,虽然仍高于未注射病毒对照组大鼠。结果提示4种病毒经肌肉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地提高HDL含量,但注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长,效果更加明显。
从图18的结果可知,相比于未注射病毒的对照组高脂血症模型大鼠,所有的注射病毒组大鼠的LDL下降,注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组高脂血症模型大鼠的LDL含量呈现出先快后慢的下降趋势,直到低于正常大鼠体内的LDL水平。相反注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1病毒组高脂血症模型大鼠的LDL水平则先下降后升高,直到接近未注射病毒对照组大鼠的LDL水平。结果提示4种病毒经肌肉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低LDL含量,但注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长,效果更加明显。
总之,4种病毒肌肉注射高脂血症模型大鼠后,均能够有效地降低模型大鼠体内的TC、TG和LDL水平,提高HDL水平,表现出显著的降血脂作用,对高脂血症具有较强的治疗作用。而且携带miR-142-3p靶序列病毒体现出持续地降低模型大鼠体内的TC、TG和LDL的作用,降低幅度更大,说明其治疗作用持续时间长和作用效果更好,完全有可能一次给药就能达到终身治疗的作用,是一种理想的高脂血症治疗候选药物。
相比于静脉注射给药,我们对高脂血症模型大鼠经肌肉注射加倍剂量的重组病毒,但对模型大鼠的TC、TG和LDL的降低作用还相对偏低,这可能与肌肉注射感染的组织更少,对骨骼肌以外的组织转导效率较弱相关。但肌肉注射仍然能够将高脂血症大鼠模型中的TG、TC和LDL控制到较低的水平,表现出明显的治疗作用,提示肌肉注射也可以作用一种候选的给药方式,用于高脂血症疾病的治疗。
SEQ ID
No.1
5'-ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGACGCGTGTAAGTTGGCGCCGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTTTTTTACAG-3'
NO.2
5'-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCC-3'
No.3
5'-GCCACCATGGTGGCCCACAGCTCCGAGGGACTGTCCGCCACCGCACCTGTGACAGGAGGCGACGTGCTGGTGGATGCAAGGGCATCTCTGGAGGAGAAGGAGGCACCAAGAGATGTGAACGCCAATACCAAGCAGGCCACCACAGAGGAGCCTCGGATCCAGCTGCCAACAGTGGACGCCTTCCGGAGAGCAATCCCAGCACACTGTTTTGAGCGGGATCTGGTGAAGAGCATCAGATACCTGGTGCAGGACTTCGCCGCCCTGACCATCCTGTATTTTGCCCTGCCTGCCTTCGAGTACTTTGGCCTGTTCGGCTATCTGGTGTGGAATATCTTCATGGGCGTGTTCGGCTTTGCCCTGTTTGTGGTGGGCCACGATTGCCTGCACGGCTCCTTCTCTGACAACCAGAATCTGAACGACTTCATCGGCCACATCGCCTTTTCTCCACTGTTCAGCCCATACTTTCCCTGGCAGAAGTCTCACAAGCTGCACCACGCCTTCACCAATCACATCGACAAGGATCACGGCCACGTGTGGATCCAGGACAAGGATTGGGAGGCCATGCCCTCTTGGAAGAGATGGTTCAACCCCATCCCTTTTAGCGGCTGGCTGAAGTGGTTCCCCGTGTACACACTGTTCGGCTTTTGTGATGGCTCCCACTTCTGGCCTTATTCTAGCCTGTTCGTGCGGAACAGCGAGCGCGTGCAGTGCGTGATCTCTGGCATCTGCTGTTGCGTGTGCGCCTACATCGCCCTGACCATCGCCGGCAGCTATTCCAACTGGTTCTGGTACTATTGGGTGCCTCTGAGCTTCTTTGGCCTGATGCTGGTCATCGTGACATACCTGCAGCACGTGGACGATGTGGCCGAGGTGTATGAGGCCGACGAGTGGTCCTTTGTGAGGGGCCAGACCCAGACAATCGACCGCTACTATGGCCTGGGCCTGGATACCACAATGCACCACATCACCGACGGCCACGTGGCCCACCACTTCTTTAACAAGATCCCACACTACCACCTGATCGAGGCCACCGAGGGCGTGAAGAAGGTGCTGGAGCCCCTGAGCGATACACAGTACGGCTATAAGTCCCAAGTGAATTATGACTTCTTTGCCAGGTTTCTGTGGTTCAACTACAAGCTGGACTATCTGGTGCACAAGACAGCCGGCATCATGCAGTTCCGCACCACACTGGAGGAGAAGGCCAAGGCCAAGTGATAA-3'
No.4
5'-GCCACCATGGTGGCCCACAGCTCCGAGGGACTGTCCGCCACCGCACCTGTGACAGGAGGCGACGTGCTGGTGGATGCAAGGGCATCTCTGGAGGAGAAGGAGGCACCAAGAGATGTGAACGCCAATACCAAGCAGGCCACCACAGAGGAGCCTCGGATCCAGCTGCCAACAGTGGACGCCTTCCGGAGAGCAATCCCAGCACACTGTTTTGAGCGGGATCTGGTGAAGAGCATCAGATACCTGGTGCAGGACTTCGCCGCCCTGACCATCCTGTATTTTGCCCTGCCTGCCTTCGAGTACTTTGGCCTGTTCGGCTATCTGGTGTGGAATATCTTCATGGGCGTGTTCGGCTTTGCCCTGTTTGTGGTGGGCCACGATTGCCTGCACGGCTCCTTCTCTGACAACCAGAATCTGAACGACTTCATCGGCCACATCGCCTTTTCTCCACTGTTCAGCCCATACTTTCCCTGGCAGAAGTCTCACAAGCTGCACCACGCCTTCACCAATCACATCGACAAGGATCACGGCCACGTGTGGATCCAGGACAAGGATTGGGAGGCCATGCCCTCTTGGAAGAGATGGTTCAACCCCATCCCTTTTAGCGGCTGGCTGAAGTGGTTCCCCGTGTACACACTGTTCGGCTTTTGTGATGGCTCCCACTTCTGGCCTTATTCTAGCCTGTTCGTGCGGAACAGCGAGCGCGTGCAGTGCGTGATCTCTGGCATCTGCTGTTGCGTGTGCGCCTACATCGCCCTGACCATCGCCGGCAGCTATTCCAACTGGTTCTGGTACTATTGGGTGCCTCTGAGCTTCTTTGGCCTGATGCTGGTCATCGTGACATACCTGCAGCACGTGGACGATGTGGCCGAGGTGTATGAGGCCGACGAGTGGTCCTTTGTGAGGGGCCAGACCCAGACAATCGACCGCTACTATGGCCTGGGCCTGGATACCACAATGCACCACATCACCGACGGCCACGTGGCCCACCACTTCTTTAACAAGATCCCACACTACCACCTGATCGAGGCCACCGAGGGCGTGAAGAAGGTGCTGGAGCCCCTGAGCGATACACAGTACGGCTATAAGTCCCAAGTGAATTATGACTTCTTTGCCAGGTTTCTGTGGTTCAACTACAAGCTGGACTATCTGGTGCACAAGACAGCCGGCATCATGCAGTTCCGCACCACACTGGAGGAGAAGGCCAAGGCCAAGTGATAAGAATTCTCCATAAAGTAGGAAACACTACGATCTCCATAAAGTAGGAAACACTACAGTATCTCCATAAAGTAGGAAACACTACGCTATCCATAAAGTAGGAAACACTAC-3'
No.5
5'-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3'
No.6
5'-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3'
Claims (7)
1.一种秀丽线虫ω-3不饱和脂肪酸转化酶基因表达框,其特征在于,
(Ⅰ)包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列;或者包含SEQ ID No.1和SEQID No.4所示的核苷酸序列;
(Ⅱ)表达框表达产物能够以细胞内的ω-6多不饱和脂肪酸为底物,催化转化为ω-3多不饱和脂肪酸。
2.一种重组腺相关病毒载体,其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框。
3.权利要求2所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于,包括:
(I)携带基因组可自我互补形成双链DNA分子;和/或
(II)重组腺相关病毒载体血清型包括AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10。
4.权利要求3所述的重组腺相关病毒载体,其中所述的重组腺相关病毒载体血清型为AAV1、AAV8或AAV9。
5.一种基因治疗药物,其特征在于,包括权利要求1所述的基因表达框或权利要求2-4中任一项所述的重组腺相关病毒载体。
6.权利要求5所述的基因治疗药物,其特征在于,给药方式为静脉注射和/或肌肉注射。
7.权利要求5所述的基因治疗药物,其特征在于,一次给药可持续降低体内的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白含量,从而达到治疗高脂血症的目的。
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