CN108103058A - 一种i型糖尿病的基因治疗药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组腺相关病毒介导的I型糖尿病基因治疗药物。重组腺相关病毒载体携带包含人miR‑142‑3p靶序列的oFat‑1（optimized Fat‑1，简称oFat‑1）基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达Fat‑1蛋白，提高体内ω‑3多不饱和脂肪酸含量，增加体内胰岛素含量，维持血糖稳定。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为一种新的I型糖尿病治疗药物。

Description

一种I型糖尿病的基因治疗药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带oFat-1基因表达框的1型糖尿病基因治疗药物。
背景技术
1型糖尿病（Type 1 diabetes，T1D）是一种多基因的器官特异性自身免疫疾病。疾病发生过程中，机体内特定亚群的T淋巴细胞会攻击自身的胰岛β细胞[1-2]，造成β细胞数量减少，胰岛素分泌不足，体内血糖升高。目前，T1D主要通过每天注射胰岛素进行治疗。然而，注射的胰岛素中不包含C肽。C肽本为胰岛素原加工得到胰岛素时产生的副产物，但却对人体内的微脉管系统[3]、神经元[4]和肾脏[5]具有重要的保护作用。因此，虽然通过注射胰岛素能够有效地控制糖尿病人的血糖浓度，但患者还是不同程度地出现肾脏疾病、神经疾病和心血管疾病等一种或多种其他并发症[6-7]。
解决这一问题的关键是降低或抑制自身免疫系统对β细胞的攻击作用，保持β细胞数量的稳定；或者通过异体移植胰岛[8]和干细胞来源的β细胞[9]，人为增加体内的β细胞数量。针对自身免疫系统的药物研发主要为CD3抗体[10]、65kD谷氨酸脱氢酶抗体（GAD65-Ig）[11]和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体（CTLA-4-Ig）[12]等。CD3抗体和GAD65-Ig对早期I型糖尿病人的I期和II期临床试验结果令人兴奋，遗憾的是在III期临床时都未达到主要的疗效终点[10,11,13]。相似地，虽然2年内不间断地静脉注射CTLA-4-Ig，但C肽的浓度仅能在9个月内保持稳定[12]。异体移植胰岛则受制于供体短缺、移植后胰岛易出现纤维化和使用免疫抑制剂带来的副作用等因素的影响，也不可能成为主流的I型糖尿病治疗方式[8,14]。而且单纯地通过免疫抑制和胰岛移植都不能完全消除自身免疫反应对β细胞的攻击作用。因此，为了彻底治愈T1D疾病，有必要基于新的策略来开发药物。
回顾T1D发病机制发现，遗传和环境因素都可引起T1D。在某些特定条件下，例如病毒感染、营养失衡等会导致CD4+ T细胞功能异常[15]，让自动激活的CD8+ T细胞浸入胰岛，杀死β细胞。从而引起β细胞功能异常和数量减少，体内胰岛素分泌量降低，导致T1D出现[1,15]。现有的研究结果表明多种免疫细胞的改变在T1D疾病发生过程中发挥重要作用。其中主要的Th1、Th2、Th17和Tregs细胞都有较为详细的作用阐述[16]。Th1细胞会激活细胞免疫和依赖于吞噬细胞的炎症反应，而Th2细胞则能够引起较强的体液免疫和不依赖于吞噬细胞的炎症反应[17-18]。Th1细胞主导的免疫反应会引起特定器官的自身免疫异常病变[19]。Th1和Th17细胞主要分泌产生IFN-γ和IL-17等炎症因子[20]。这些炎症因子单独或者协同作用，推进T1D疾病的进程。相反，Th2细胞和Tregs细胞则通过分泌IL-4和IL-10等细胞因子，拮抗自身免疫的发生[21]。因此，打破Th细胞的调节异常对阻止自身免疫进程及炎症反应攻击十分重要。
充足的证据表明从婴幼儿开始在食物中添加鱼油有利于延缓自身免疫和降低T1D的发病率。长期的年轻人群糖尿病自身免疫研究结果显示1周岁开始服用ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）能够显著降T1D家族中小孩的胰岛被自身免疫系统攻击的风险[22]。一项针对挪威人的病例对照研究也得到类似的结果。在该研究中，从1周岁时开始给T1D高风险小孩服用鱼肝油，患病风险显著降低[23]。最近针对遗传性T1D高风险幼儿的多中心、随机、双盲临床试验表明，不管是在妊娠末期还是出生后5个月开始补充DHA，均能显著降低炎症反应的发生[24]。更为重要的是，已有研究表明通过转基因或者基因治疗方式将秀丽线虫中的ω-6 PUFA转化为ω-3 PUFA的n-3 PUFA脱氢酶（Fat-1）基因人源化（mFat-1）后，导入小鼠体内，可提高小鼠体内的ω-3 PUFA含量，改变β细胞的免疫微环境，阻止自身免疫系统对β细胞的攻击作用，促进β细胞再生，恢复NOD小鼠体内的胰岛素水平[25-26]。该结果从原理上证明了mFat-1作为治疗基因用于开发T1D基因治疗药物的可能性。但是，如果直接采用前述报道的方法来设计、开发T1D的基因治疗药物仍然会因为风险巨大而困难重重。前述研究中采用了慢病毒载体来携带mFat-1基因表达框。慢病毒载体本身较强的免疫原性[27]、基因组整合可能带来的安全性问题[28]都会影响基因治疗药物的开发进程。而且mFat-1基因本身不在人体内表达，作为一种异源蛋白，人体可能会产生针对表达Fat-1蛋白的免疫反应，直接对导入mFat-1基因并表达Fat-1蛋白的细胞进行免疫攻击。
为此，我们在本发明中设计了一种新的T1D基因治疗药物rAAV-CAM-oFat-1-142T。为了提高Fat-1基因的表达效率，我们重新对Fat-1基因进行了序列优化合成，得到oFat-1基因。采用人为设计的高效表达启动子CAM调控oFat-1基因表达，并在基因的3’UTR区加入miR-142-3p靶序列，最大限度地抑制oFat-1基因在免疫相关细胞（如抗原呈递细胞）中表达，显著降低产生针对Fat-1蛋白免疫反应的概率[29]。选择更加安全的重组AAV载体[30]携带oFat-1基因表达框。进一步提高了药物开发成功的可能性。
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名[31-32]。AAV是微小病毒科 (Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA[33]，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒[34]，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态[35]，而不产生子代病毒。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）[36]。AAV2基因组长约4.7kb,基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”（ inverted terminal repeat, ITR），呈回文-发卡结构[37]。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中[38-39]。
ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用[40]。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site，RBS）和末端解链位点trs（terminal resolution site），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口[41]。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用[42]。
AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区[43]。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolutionsite）和GAGY重复基序（repeat motif）特异性结合[44]，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率[45-46]。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织[47]。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导致大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能[48]。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性[49]，容易开发出稳定性较高的生物制品。
AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type 1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统[50]，该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略[51-52]。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略[53]。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Invertedterminal repeat，ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒[54]。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统[55]，使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒[56-57]以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略[58-59]。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。
由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2016年8月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有173项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物[60]；血友病B[61]和先天性黑蒙症（RPE65基因突变引起）[62]的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。
本发明中，我们选择AAV载体来携带oFat-1基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因[63]，免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达[64]，避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射、肌肉注射都具有较高的转导效率[65-69]，保证oFat-1基因表达框能够在体内高效地表达Fat-1蛋白。
为了降低机体产生针对oFat-1蛋白免疫反应的概率，延长oFat-1基因持续稳定表达的时间。我们人为设计了高效表达的CAM启动子，让导入的oFat-1基因在体内高效表达。进一步，我们在oFat-1基因表达框的3’UTR区克隆入4个miR-142-3p靶序列。由于miR-142-3p在造血干细胞系来源细胞中高表达[70]，免疫细胞均分化来源于造血干细胞系，因此利用miRNA抑制基因表达的原理[71]，携带miR-142-3p靶序列的基因表达会在免疫细胞中受到明显抑制，从而降低机体产生针对基因表达产物免疫反应的概率[72]。
miRNAs（microRNAs）是广泛存在于人类和动物体内的长度为18至25个核苷酸（nucleotide，nt）的单链非编码RNA[71,73]。1993年miRNA首先在秀丽线虫（C.elegans）中发现[74-75]。C.elegans中lin-4基因能够下调lin-14基因的表达，但lin-4基因的编码产物不是蛋白质，而是一种小RNA分子，表明自身编码小RNA分子能够调节基因的表达。随后，多种类似的小RNA分子在不同的物种和细胞中相继发现[76-78]，miRNA开始成为该类小RNA 的统称。miRNA调节人类大约60%基因的表达[79-80]，在多种生理和病理过程中发挥重要作用[81-83]。
miRNA基因通常位于基因组的外显子、内含子和基因间区中[84-85]。在细胞内，miRNA的产生过程如下述[86]。首先在细胞核中，miRNA基因由RNA聚合酶II或III启动转录产生初始产物pri-microRNA；pri-microRNA自我折叠部分序列形成茎环结构。随后，由核糖核酸酶III Drosha和DGCR8分子组成的加工复合体作用pri-microRNA，切去多余序列，留下60nt左右的茎环结构，即前体miRNA分子pre-microRNA[87-91]。然后在转运蛋白Exportin-5的协助下，pre-microRNA从细胞核进入细胞质中[92-94]，经Dicer酶加工去掉其茎环结构中的环形部分，变为双链RNA分子[95-96]。最后，双链RNA分子被AGO2等蛋白因子结合，其中一条链发生降解，另一条链和蛋白因子形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencingcomplex，RISC）。RISC识别mRNA中靶序列，通过降解mRNA分子、促进mRNA分子3’端去腺苷化和抑制翻译来降低mRNA的表达水平，在转录后水平调节基因的表达[97-99]。因此利用细胞内高表达的miRNA，在外源基因的3’UTR(untranslated region)插入该miRNA的靶序列，能够有效地抑制外源基因在导入细胞中的表达。
相比于慢病毒载体，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因[31]，免疫原性低。而且AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达[32]。同时AAV载体通过静脉注射、肌肉注射都具有较高的转导效率[33-37]，保证oFat-1基因表达框能够在体内高效地表达Fat-1蛋白。
根据以上设计思路，我们制备得到rAAV-CAM-oFat-1-142T病毒，并设计制备得到无miR-142-3p靶序列的rAAV-CAM-oFat-1和表达绿色荧蛋白的rAAV-CAM-EGFP等对照病毒。将这些病毒分别等剂量注射至NOD小鼠体内，评价设计rAAV-CAM-oFat-1-142T有效性。结果显示，相比对照病毒，rAAV-CAM-oFat-1-142T能够在NOD体内持续稳定地长时间表达oFat-1蛋白，显著提高NOD小鼠内的ω-3PUFA含量，改变免疫环境，阻止β细胞因免疫攻击而死亡，提高NOD小鼠体内的胰岛素浓度，维持血糖稳定，显示出巨大的治愈T1D疾病的潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于AAV载体的新型的T1D基因治疗药物。该药物由AAV载体携带oFat-1基因表达框。oFat-1基因由秀丽线虫Fat-1基因人源化而来。根据在基因表达框中，人为设计的CAM启动子调控oFat-1基因的高效表达，oFat-1基因的3’UTR包含4个串联的完全互补的miR-142-3p靶序列。基于上述设计，预期该药物通过静脉注射或者肌肉注射后能够在体内高效表达Fat-1蛋白，显著提高血液中的ω-3PUFA含量，改变免疫环境，抑制自身免疫对胰岛β细胞的攻击作用，保护并再生胰岛β细胞，恢复血液中胰岛素含量，维持血糖稳定，从而达到治疗T1D的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种治疗T1D疾病的基因治疗药物，其特征在于，该药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过静脉注射或者肌肉注射能高效地把药物效应元件导入体内，实现药物效应元件表达产物治疗作用蛋白Fat-1的高效表达。为了实现Fat-1蛋白的高效表达，根据不同血清型AAV的转导特点，不同的给药方式选择相应的血清型AAV，如静脉注射主要选择AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8和AAV9等，肌肉注射则主要选择AAV1、AAV8和AAV9等。
本发明提供的T1D疾病基因治疗药物，其特征在于，使用的AAV载体为ssAAV载体和scAAV载体。优先选择为scAAV载体，scAAV载体能够自身互补形成双链，避免了ssAAV进入细胞后需要通过DNA修复、复制等合成互补链才能转录表达携带外源基因的过程，因此scAAV载体转导效率更高，表达更为迅速。
本发明提供的治疗T1D疾病的基因治疗药物，其特征还在于，基于设计的Fat-1基因表达框能够实现Fat-1蛋白的高效表达。为此，首先根据密码子偏爱性、GC含量、CpG二聚体含量、mRNA二级结构、消除隐蔽剪接位点、让转录提前终止的polyA加尾信号、消除内部chi位点和核糖体结合位点、CpG岛、消除ARE序列等RNA不稳定基序和RNA重复序列（正向重复、反向重复和二重复等）等原则优化合成Fat-1蛋白的编码区序列，得到oFat-1序列。接下来，在优化后的oFat-1序列的翻译起始密码子前添加Kozak序列5’-GCCACC-3’，提高蛋白翻译时的准确起始效率。采用人为设计的CAM启动子调控oFat-1基因转录，CAM启动子由人CMV病毒的增强子序列、鸡β-actin蛋白的基础启动子和MVM内含子组成，使oFat-1基因能够在多种细胞中高效转录。最后，在oFat-1基因的3’UTR区插入4个串联的完全互补的miR-142-3p靶序列，抑制Fat-1蛋白在抗原呈递细胞中表达，降低针对Fat-1蛋白产生免疫反应的概率，使Fat-1蛋白在体内持续稳定高效表达。本发明提供的T1D疾病基因治疗药物，其特征在于，将该药物经静脉注射注射至NOD小鼠体内后，能在小鼠体内高效稳定持续地表达Fat-1蛋白，表达产生的Fat-1蛋白将细胞内的ω-6PUFA催化转化ω-3PUFA，提高血液中的ω-3PUFA和ω-6PUFA的比值，改变NOD小鼠体内的免疫环境，使NOD小鼠胰岛β细胞免于自身免疫攻击并再生，增加胰岛素分泌量，提升并恢复NOD小鼠血液中胰岛素含量至正常水平，维持血糖稳定，从而达到治疗目的。
本发明提供的T1D疾病基因治疗药物，其特征在于，该药物经肌肉注射至NOD小鼠体内后呈现出同静脉注射相似的治疗效果。但需要采用不同于静脉注射方式的血清型AAV来携带oFat-1基因表达框，且需要改变药物的注射剂量。
本发明提供的T1D疾病基因治疗药物，其特征还在于，一次给药就能够长期持续地保护胰岛β细胞免于自身免疫攻击并再生，增加胰岛素分泌量，提升并恢复血液中胰岛素含量至正常水平，维持血糖稳定，从而达到长时间的治疗效果。
本发明用到的重要原始实验材料如下所示。
pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。
pAAV-R2C1质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV1基因组（GenBank ID：NC_002077）中外壳蛋白编码序列Cap1（基因组中第2223至4433位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C1质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C1质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C1质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C1质粒。pAAV-R2C1质粒包含完整的AAV1的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV1外壳蛋白。
pAAV-R2C8质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV8基因组（GenBank ID：AF513852）中外壳蛋白编码序列Cap8（基因组中第2121至4337位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV8外壳蛋白。
pAAV-R2C9质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列（GenBankID：AY530579）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C9质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C9质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV9外壳蛋白。
NOD//LtJ小鼠：非肥胖糖尿病模型小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。12周龄时，大约有80%的小鼠可出现明显的1型糖尿病症状。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1 pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo[100]。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图2 pscAAV-CAM载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒（minute parvovirus of mice，MVM）内含子组成。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图3 pscAAV-CAM-OFat-1载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒（minute parvovirus of mice，MVM）内含子组成。OFat-1，优化合成的秀丽线虫fat-1基因。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图4 pscAAV-CAM-OFat-1-142T载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒（minute parvovirus ofmice，MVM）内含子组成。OFat-1，优化合成的秀丽线虫fat-1基因。4×miR-142-3pT，4个串联的完全互补的人miR-142-3p靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图5 静脉注射重组病毒后4种组织Fat-1蛋白表达检测结果。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T）以2×1010vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射确诊为糖尿病的12周龄NOD（non-obese diabetic）小鼠。注射病毒4周后，处死小鼠，分离肝脏、骨骼肌、心肌和肺等组织，提取各个组织细胞总蛋白，利用western blot方法检测细胞总蛋白中Fat-1蛋白含量。泳道1，肝脏；泳道2，心肌；泳道3，骨骼肌；泳道4，肺。结果显示注射病毒4周后，在四种组织中均检测到Fat-1蛋白的表达。
图6静脉注射scAAV9-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒4周后不同组织PUFA含量测定结果。
图7静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒4周后不同组织PUFA含量测定结果。
图8静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组病毒后小鼠血糖检测结果。scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以2×1010vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射确诊为糖尿病的12周龄NOD（non-obesediabetic）小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），小鼠进食2h后尾静脉采血，采用血糖仪（Accu-Chek，Roche）测定非空腹血糖浓度。
图9注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒4周后NOD小鼠血清中胰岛素含量测定结果。注射病毒4周后，以野生型正常的非糖尿病小鼠为阳性对照，不注射病毒的NOD糖尿病小鼠为阴性对照，尾静脉采血，分离血清，采用Rat/Mouse Insulin ELISA Kit（Millipore，美国）测定血清中胰岛素含量。结果显示，相比未注射病毒的NOD糖尿病小鼠，注射病毒NOD小鼠血液中胰岛素含量明显升高，接近野生型正常的非糖尿病小鼠的水平。
图10注射scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒28周后NOD小鼠血清中胰岛素含量测定结果。注射病毒28周后，以野生型正常的非糖尿病小鼠为阳性对照，不注射病毒的NOD糖尿病小鼠为阴性对照，尾静脉采血，分离血清，采用Rat/Mouse Insulin ELISA Kit（Millipore，美国）测定血清中胰岛素含量。结果显示，相比未注射病毒的NOD糖尿病小鼠，注射病毒NOD小鼠血液中胰岛素含量均明显升高，但注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组升高幅度更大，接近野生型正常的非糖尿病小鼠的水平。
图11肌肉注射重组病毒后4种组织Fat-1蛋白表达检测结果。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T）以4×1010vg/只（viral genome，vg）的剂量经骨骼肌注射确诊为糖尿病的12周龄NOD（non-obese diabetic）小鼠。注射病毒4周后，处死小鼠，分离肝脏、骨骼肌、心肌和肺等组织，提取各个组织细胞总蛋白，利用western blot方法检测细胞总蛋白中Fat-1蛋白含量。泳道1，肝脏；泳道2，心肌；泳道3，骨骼肌；泳道4，肺。结果显示注射病毒4周后，在四种组织中均检测到Fat-1蛋白的表达。
图12肌肉注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV1-CAM-OFat-1-142T病毒4周后不同组织PUFA含量测定结果。
图13肌肉注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒4周后不同组织PUFA含量测定结果。
图14肌肉注射scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T重组病毒后小鼠血糖检测结果。scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T重组AAV病毒以4×1010vg/只（viral genome，vg）的剂量经骨骼肌注射确诊为糖尿病的12周龄NOD（non-obesediabetic）小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），小鼠进食2h后尾静脉采血，采用血糖仪（Accu-Chek，Roche）测定非空腹血糖浓度。
图15注射scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒4周后NOD小鼠血清中胰岛素含量测定结果。肌肉注射病毒4周后，以野生型正常的非糖尿病小鼠为阳性对照，不注射病毒的NOD糖尿病小鼠为阴性对照，尾静脉采血，分离血清，采用Rat/Mouse Insulin ELISA Kit（Millipore，美国）测定血清中胰岛素含量。结果显示，相比未注射病毒的NOD糖尿病小鼠，注射病毒NOD小鼠血液中胰岛素含量明显升高，接近野生型正常的非糖尿病小鼠的水平。
图16肌肉注射scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒28周后NOD小鼠血清中胰岛素含量测定结果。肌肉注射病毒28周后，以野生型正常的非糖尿病小鼠为阳性对照，不注射病毒的NOD糖尿病小鼠为阴性对照，尾静脉采血，分离血清，采用Rat/Mouse Insulin ELISA Kit（Millipore，美国）测定血清中胰岛素含量。结果显示，相比未注射病毒的NOD糖尿病小鼠，注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒NOD小鼠血液中胰岛素含量明显升高，接近野生型正常的非糖尿病小鼠的水平，而注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1病毒NOD小鼠血液中胰岛素含量却未见升高，仅略高于未注射病毒的NOD糖尿病小鼠。
具体实施方式
本发明公开了一种I型糖尿病的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 质粒载体构建
为了构建获得包装重组AAV病毒需要的pscAAV-CAM-OFat-1和pscAAV-CAM-OFat-1-142T质粒，我们首先以公司保存的pAAV2neo为基础，用自主设计得到的CAM启动子(SEQ IDNo.1)替换pAAV2neo载体中的CMV启动子，用人工合成的缺失AAV2的ITR中trs(terminalresolution site)和D序列的突变ITR序列（命名为ΔITR）(SEQ ID No.2)替换pAAV2neo载体中的一侧ITR序列，得到pscAAV-CAM载体。接下来，将人工合成的OFat-1(SEQ ID No.3)和OFat-1-142T(SEQ ID No.4)序列分别克隆入pscAAV-CAM载体的KpnI和EcoRI以及KpnI和BglII酶切位点之间，得到pscAAV-CAM-OFat-1和pscAAV-CAM-OFat-1-142T载体。
（1）pscAAV-CAM载体构建
将人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列和小鼠细小病毒内含子序列拼接，得到CAM启动子序列，序列信息见SEQ ID No.1。在CAM启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-CAM。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAM载体和pAAV2neo载体，回收CAM片段和切去CMV启动子的pAAV2neo载体片段（约6.3kb），两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有CAM启动子的AAV质粒载体pAAV2neo-CAM。
以AAV2基因组（GenBank No. AF043303）中的左侧ITR序列为基础，根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列[45]，得到ΔITR序列(SEQ ID No.2)。为了便于克隆操作，将pAAV2neo载体中1392-1668bp之间序列（靠近BGH polyA的ITR和ApaI酶切位点之间序列）同ΔITR序列融合，得到融合序列。在融合序列两端分别添加BamHI和ApaI酶切位点后，由金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57 simple载体，获得pUC57-ΔITR。BamHI和ApaI分别双酶切消化pUC57-ΔITR载体和pAAV2neo-CAM载体，回收含有ΔITR片段和切去ITR序列的pAAV2neo-CAM载体片段。两片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定获得pscAAV-CAM载体（附图2）。
（2）pscAAV-CAM-OFat-1载体构建
根据线虫fat-1基因的cDNA序列[101]，由金斯瑞生物科技有限公司根据人密码子偏爱性等原则优化合成得到OFat-1基因。将优化合成的OFat-1基因克隆入pUC57 simple载体，得到pUC57-OFat-1载体。KpnI和EcoRI分别双酶切消化pUC57-OFat-1载体和pscAAV-CAM载体，回收OFat-1片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段，两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定得到pscAAV-CAM-OFat-1载体。
（3）pscAAV-CAM-OFat-1-142T载体构建
将4个串联重复的人miR-142-3p的完全互补的靶序列同优化得到的OFat-1基因序列拼接，得到OFat-1-142T序列。由金斯瑞生物科技有限公司合成OFat-1-142T序列。将合成的OFat-1-142T序列克隆入pUC57 simple载体，得到pUC57-OFat-1-142T载体。KpnI和BglII分别双酶切消化pUC57-OFat-1-142T载体和pscAAV-CAM载体，回收OFat-1-142T片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段，两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定得到pscAAV-CAM-OFat-1-142T载体。
实施例2 重组AAV病毒制备及检定
参照文献[102]，应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pscAAV-CAM-OFat-1或pscAAV-CAM-OFat-1-142T）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-R2C1、pAAV-R2C8或pAAV-R2C9）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1、scAAV8-CAM-OFat-1-142T、scAAV9-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1-142T等6种重组病毒。
采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。具体过程如下：
在CAM启动子中设计两条引物CAM-Q-F和CAM-Q-R：
CAM-Q-F：5’-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3’ (SEQ ID NO.5)
CAM-Q-R：5’-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3’ (SEQ ID NO.6)
以CAM-Q-F和CAM-Q-R为引物特异性地扩增CAM启动子长度为175bp片段，采用SYBRGreen染料结合法，以1μg/μl的pscAAV-CAM-OFat-1质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR PremixEx Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献[103]。
实施例3 静脉注射给药治疗1型糖尿病
从北京华阜康生物科技有限公司购买70只8周龄的雌性NOD/LtJ（后面简写为NOD）小鼠，在SPF级条件下培养至12周，尾静脉采血，采用血糖仪（Accu-Chek，Roche）测定每只小鼠的非空腹血糖浓度，视非空腹血糖浓度高于13mM的小鼠为1型糖尿病小鼠，共得到51只小鼠。取其中40只小鼠，随机分为5组，每组8只小鼠。5组小鼠中，其中4组小鼠分别经尾静脉注射scAAV9-CAM-OFat-1、scAAV9-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T重组病毒，注射剂量为2×1010vg/只，剩余1组小鼠作为注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T的对照以及注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T的对照。
注射病毒4w后，从每种注射病毒组中随机选择3只小鼠，处死，分离肝脏、心脏、骨骼肌和肺等组织。取等质量的不同组织，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白（ApplygenTechnologies Inc., P1250），western blot法检测组织总蛋白中Fat-1蛋白表达水平。测定浓度后每个样品上样20µg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜后封闭，经抗Fat-1蛋白小鼠单抗（Abcam，ab20163，使用时1:1000稀释）4ºC孵育过夜后，彻底洗涤，用荧光标记的二抗在室温孵育1小时，然后利用Odyssey 红外成像系统对相应条带进行检测。结果如附图5所示。从图5的结果可知，注射病毒后，在小鼠的肝脏、心脏、骨骼肌和肺组织中均能够检测到Fat-1蛋白的表达，注射AAV9病毒组和注射携带相同基因表达框的AAV8病毒组的表达水平间未见明显差，且携带miR-142-3p靶序列与否也未对Fat-1蛋白的表达水平造成影响，但肝脏、心脏、骨骼肌中的Fat-1表达水平均明显高于肺组织，4组注射病毒小鼠均呈现出相似的性质。结果表明4种病毒经尾静脉注射小鼠体内后均能够有效地表达产生Fat-1蛋白。
为了进一步验证表达产生的Fat-1蛋白是否能够有效地将小鼠体内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，我们用气相色谱法测定了处死的注射病毒组小鼠和未注射病毒对照组小鼠的不同组织中的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。
首先我们测定了静脉注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAA9-CAM-OFat-1-142T病毒NOD小鼠中不同组织的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。结果如图6所示。从图6的结果可知，相比于未注射病毒的对照组，注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组小鼠在4种组织中的ω-6PUFA含量均降低，而ω-3PUFA含量则升高，导致小鼠各个组织内的ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低，而且注射scAAV9-CAM-OFat-1病毒组和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组之间未见明显差异。结果表明注射scAAV9-CAM-OFat-1或scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒表达产生的Fat-1蛋白能够催化ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，具有正常的生理功能。
接下来，我们测定了静脉注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAA8-CAM-OFat-1-142T病毒NOD小鼠中不同组织的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。结果如图7所示。从图7的结果可知，相比于未注射病毒的对照组，注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组小鼠也在4种组织中的ω-6PUFA含量均降低，而ω-3PUFA含量则升高，导致小鼠各个组织内的ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低，而且注射scAAV8-CAM-OFat-1病毒组和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组之间未见明显差异。结果表明注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒表达产生的Fat-1蛋白能够催化ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，同样具有正常的生理功能。
同时在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠体内的血糖浓度变化。在每次检测过程中，小鼠进食2h后尾静脉采血，采用血糖仪（Accu-Chek，Roche）测定非空腹血糖浓度。结果如图8所示。从图8的结果可知，相比于未注射病毒的对照组NOD小鼠，所有的注射病毒组NOD小鼠的血糖下降，到4w时，注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组NOD小鼠的血糖浓度趋于稳定，且两分组之间未见明显差异。在注射病毒4w后，相反注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1病毒组NOD小鼠的血糖浓度则开始逐渐升高，虽然仍明显低于未注射病毒对照组小鼠。结果说明4种病毒经尾静脉注射NOD小鼠后，均能够有效地降低血糖浓度，但注射scAAV8-CAM-OFat-1-142T和scAAV9-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长，效果更加明显，更具有开发成为糖尿病基因治疗药物的潜力。该结果提示miR-142-3p可能能够显著降低体内产生针对Fat-1蛋白特异性抗体的概率，使Fat-1蛋白持续稳定表达，从而保证小鼠体内的胰岛素浓度维持较高的水平。
因此我们选择注射病毒后4w和28w两个时间点，以野生型正常的非糖尿病小鼠为阳性对照，不注射病毒的NOD糖尿病小鼠为阴性对照，尾静脉采血，分离血清，采用Rat/Mouse Insulin ELISA Kit（Millipore，美国）测定血清中胰岛素含量。注射病毒4w后的血清中胰岛素检测结果如图9所示；注射病毒28w后的检测结果如图10所示。对比分析图9和图10的结果可知，注射病毒4w后，4种病毒注射小鼠血清中的胰岛素含量均显著高于未注射病毒的NOD小鼠，接近野生型小鼠水平。然而，注射病毒28w，注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1病毒组NOD小鼠血清中的胰岛素含量明显低于注射4w后水平，而注射scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV9-CAM-OFat-1病毒组NOD小鼠血清中的胰岛素含量却同注射4w时差异不大。结果说明，在OFat-1表达框中添加miR-142-3p靶序列能够使小鼠体内胰岛素持续稳定在较高的水平。其可能的机制是miR-142-3p靶序列的加入有利于Fat-1蛋白的持续高效表达。
综上所述，通过高效转导小鼠的AAV8或者AAV9载体携带OFat-1基因表达框，同时在表达框中引入miR-142-3p靶序列，制备得到一种潜在的T1D治疗药物。将该药物静脉注射T1D模型NOD小鼠能够有效地降低模型小鼠体内的血糖浓度，提高模型小鼠体内的胰岛素浓度，为T1D的治疗提供了新的选择。
实施例4 肌肉注射给药治疗1型糖尿病
在证明静脉注射给药有效的前提下，我们进一步探索了肌肉注射给药对T1D疾病的治疗效果。为了保证药物的效果，我们选择对肌肉转导效率较高的AAV1和AAV8来携带OFat-1表达框，制备得到scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1-142T等4种病毒。将4种病毒分别通过肌肉注射至NOD小鼠体内，检测Fat-1蛋白表达情况、测定ω-6PUFA和ω-6PUFA含量、监测体内血糖变化和检测胰岛素含量，评价其开发成为T1D治疗药物的潜力。
从北京华阜康生物科技有限公司购买70只8周龄的雌性NOD小鼠，在SPF级条件下培养至12周，尾静脉采血，采用血糖仪（Accu-Chek，Roche）测定每只小鼠的非空腹血糖浓度，视非空腹血糖浓度高于13mM的小鼠为1型糖尿病小鼠，共得到49只小鼠。取其中40只小鼠，随机分为5组，每组8只小鼠。5组小鼠中，其中4组小鼠分别经骨骼肌注射scAAV1-CAM-OFat-1、scAAV1-CAM-OFat-1-142T、scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T重组病毒，注射剂量为4×1010vg/只，剩余1组小鼠作为注射scAAV1-CAM-OFat-1或scAAV1-CAM-OFat-1-142T的对照以及注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T的对照。
注射病毒4w后，从每种注射病毒组中随机选择3只小鼠，处死，分离肝脏、心脏、骨骼肌和肺等组织。取等质量的不同组织，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白（ApplygenTechnologies Inc., P1250），western blot法检测组织总蛋白中Fat-1蛋白表达水平。测定浓度后每个样品上样20µg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜后封闭，经抗Fat-1蛋白小鼠单抗（Abcam，ab20163，使用时1:1000稀释）4ºC孵育过夜后，彻底洗涤，用荧光标记的二抗在室温孵育1小时，然后利用Odyssey 红外成像系统对相应条带进行检测。结果如附图11所示。从图11的结果可知，注射病毒后，在小鼠的肝脏、心脏、骨骼肌和肺组织中均能够检测到Fat-1蛋白的表达，注射AAV1病毒组和注射携带相同基因表达框的AAV8病毒组的表达水平间未见明显差，且携带miR-142-3p靶序列与否也未对Fat-1蛋白的表达水平造成影响，但骨骼肌中的Fat-1表达水平均明显高于肝脏、心肌和肺等3种组织，4组注射病毒小鼠均呈现出相似的性质。结果表明4种病毒经尾静脉注射小鼠体内后均能够有效地表达产生Fat-1蛋白。
为了进一步验证表达产生的Fat-1蛋白是否能够有效地将小鼠体内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，我们用气相色谱法测定了处死的注射病毒组小鼠和未注射病毒对照组小鼠的不同组织中的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。
首先我们测定了肌肉注射scAAV1-CAM-OFat-1或scAA1-CAM-OFat-1-142T病毒NOD小鼠中不同组织的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。结果如图12所示。从图12的结果可知，相比于未注射病毒的对照组，注射scAAV1-CAM-OFat-1或scAAV1-CAM-OFat-1-142T病毒组小鼠在4种组织中的ω-6PUFA含量均降低，而ω-3PUFA含量则升高，导致小鼠各个组织内的ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低，而且注射scAAV1-CAM-OFat-1病毒组和scAAV1-CAM-OFat-1-142T病毒组之间未见明显差异。结果表明注射scAAV1-CAM-OFat-1或scAAV1-CAM-OFat-1-142T病毒表达产生的Fat-1蛋白能够催化ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，具有正常的生理功能。
接下来，我们测定了肌肉注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAA8-CAM-OFat-1-142T病毒NOD小鼠中不同组织的ω-6PUFA和ω-3PUFA含量。结果如图13所示。从图13的结果可知，相比于未注射病毒的对照组，注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组小鼠在4种组织中的ω-6PUFA含量均降低，而ω-3PUFA含量则升高，导致小鼠各个组织内的ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低，而且注射scAAV8-CAM-OFat-1病毒组和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组之间未见明显差异。结果表明注射scAAV8-CAM-OFat-1或scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒表达产生的Fat-1蛋白能够催化ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，具有正常的生理功能。
在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠体内的血糖浓度变化。在每次检测过程中，小鼠进食2h后尾静脉采血，采用血糖仪（Accu-Chek，Roche）测定非空腹血糖浓度。结果如图14所示。从图14的结果可知，相比于未注射病毒的对照组NOD小鼠，所有的注射病毒组NOD小鼠的血糖下降，到4w时，注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组NOD小鼠的血糖浓度趋于稳定，且两分组之间未见明显差异。在注射病毒4w后，相反注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1病毒组NOD小鼠的血糖浓度则开始逐渐升高，虽然仍明显低于未注射病毒对照组小鼠。结果说明4种病毒经尾静脉注射NOD小鼠后，均能够有效地降低血糖浓度，但注射scAAV1-CAM-OFat-1-142T和scAAV8-CAM-OFat-1-142T病毒组持续作用时间更长，效果更加明显，更具有开发成为糖尿病基因治疗药物的潜力。同时该结果提示miR-142-3p可能能够显著降低体内产生针对Fat-1蛋白特异性抗体的概率，使Fat-1蛋白持续稳定表达，从而保证小鼠体内的胰岛素浓度维持较高的水平。
因此我们选择注射病毒后4w和28w两个时间点，以野生型正常的非糖尿病小鼠为阳性对照，不注射病毒的NOD糖尿病小鼠为阴性对照，尾静脉采血，分离血清，采用Rat/Mouse Insulin ELISA Kit（Millipore，美国）测定血清中胰岛素含量。注射病毒4w后的血清中胰岛素检测结果如图15所示；注射病毒28w后的检测结果如图16所示。对比分析图15和图16的结果可知，注射病毒4w后，4种病毒注射小鼠血清中的胰岛素含量均显著高于未注射病毒的NOD小鼠，接近野生型小鼠水平。然而，注射病毒28w，注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1病毒组NOD小鼠血清中的胰岛素含量明显低于注射4w后水平，而注射scAAV1-CAM-OFat-1和scAAV8-CAM-OFat-1病毒组NOD小鼠血清中的胰岛素含量却同注射4w时差异不大。结果说明，在OFat-1表达框中添加miR-142-3p靶序列能够使小鼠体内胰岛素持续稳定在较高的水平。其可能的机制是miR-142-3p靶序列的加入有利于Fat-1蛋白的持续高效表达。
相比于静脉注射给药，肌肉注射对NOD小鼠的血糖降低作用相对偏低，但仍然能够将NOD小鼠体内的血糖浓度控制在10mM以下，且提高NOD小鼠体内的胰岛素表达水平，对T1D依旧显示出较好的治疗作用，提示肌肉注射也可以作用一种候选的给药方式，用于T1D疾病的治疗。
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SEQ ID
No.1
5'-ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGACGCGTGTAAGTTGGCGCCGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTTTTTTACAG-3'
NO.2
5'-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCC-3'
No.3
5'-GCCACCATGGTGGCCCACAGCTCCGAGGGACTGTCCGCCACCGCACCTGTGACAGGAGGCGACGTGCTGGTGGATGCAAGGGCATCTCTGGAGGAGAAGGAGGCACCAAGAGATGTGAACGCCAATACCAAGCAGGCCACCACAGAGGAGCCTCGGATCCAGCTGCCAACAGTGGACGCCTTCCGGAGAGCAATCCCAGCACACTGTTTTGAGCGGGATCTGGTGAAGAGCATCAGATACCTGGTGCAGGACTTCGCCGCCCTGACCATCCTGTATTTTGCCCTGCCTGCCTTCGAGTACTTTGGCCTGTTCGGCTATCTGGTGTGGAATATCTTCATGGGCGTGTTCGGCTTTGCCCTGTTTGTGGTGGGCCACGATTGCCTGCACGGCTCCTTCTCTGACAACCAGAATCTGAACGACTTCATCGGCCACATCGCCTTTTCTCCACTGTTCAGCCCATACTTTCCCTGGCAGAAGTCTCACAAGCTGCACCACGCCTTCACCAATCACATCGACAAGGATCACGGCCACGTGTGGATCCAGGACAAGGATTGGGAGGCCATGCCCTCTTGGAAGAGATGGTTCAACCCCATCCCTTTTAGCGGCTGGCTGAAGTGGTTCCCCGTGTACACACTGTTCGGCTTTTGTGATGGCTCCCACTTCTGGCCTTATTCTAGCCTGTTCGTGCGGAACAGCGAGCGCGTGCAGTGCGTGATCTCTGGCATCTGCTGTTGCGTGTGCGCCTACATCGCCCTGACCATCGCCGGCAGCTATTCCAACTGGTTCTGGTACTATTGGGTGCCTCTGAGCTTCTTTGGCCTGATGCTGGTCATCGTGACATACCTGCAGCACGTGGACGATGTGGCCGAGGTGTATGAGGCCGACGAGTGGTCCTTTGTGAGGGGCCAGACCCAGACAATCGACCGCTACTATGGCCTGGGCCTGGATACCACAATGCACCACATCACCGACGGCCACGTGGCCCACCACTTCTTTAACAAGATCCCACACTACCACCTGATCGAGGCCACCGAGGGCGTGAAGAAGGTGCTGGAGCCCCTGAGCGATACACAGTACGGCTATAAGTCCCAAGTGAATTATGACTTCTTTGCCAGGTTTCTGTGGTTCAACTACAAGCTGGACTATCTGGTGCACAAGACAGCCGGCATCATGCAGTTCCGCACCACACTGGAGGAGAAGGCCAAGGCCAAGTGATAA-3'
No.4
5'-GCCACCATGGTGGCCCACAGCTCCGAGGGACTGTCCGCCACCGCACCTGTGACAGGAGGCGACGTGCTGGTGGATGCAAGGGCATCTCTGGAGGAGAAGGAGGCACCAAGAGATGTGAACGCCAATACCAAGCAGGCCACCACAGAGGAGCCTCGGATCCAGCTGCCAACAGTGGACGCCTTCCGGAGAGCAATCCCAGCACACTGTTTTGAGCGGGATCTGGTGAAGAGCATCAGATACCTGGTGCAGGACTTCGCCGCCCTGACCATCCTGTATTTTGCCCTGCCTGCCTTCGAGTACTTTGGCCTGTTCGGCTATCTGGTGTGGAATATCTTCATGGGCGTGTTCGGCTTTGCCCTGTTTGTGGTGGGCCACGATTGCCTGCACGGCTCCTTCTCTGACAACCAGAATCTGAACGACTTCATCGGCCACATCGCCTTTTCTCCACTGTTCAGCCCATACTTTCCCTGGCAGAAGTCTCACAAGCTGCACCACGCCTTCACCAATCACATCGACAAGGATCACGGCCACGTGTGGATCCAGGACAAGGATTGGGAGGCCATGCCCTCTTGGAAGAGATGGTTCAACCCCATCCCTTTTAGCGGCTGGCTGAAGTGGTTCCCCGTGTACACACTGTTCGGCTTTTGTGATGGCTCCCACTTCTGGCCTTATTCTAGCCTGTTCGTGCGGAACAGCGAGCGCGTGCAGTGCGTGATCTCTGGCATCTGCTGTTGCGTGTGCGCCTACATCGCCCTGACCATCGCCGGCAGCTATTCCAACTGGTTCTGGTACTATTGGGTGCCTCTGAGCTTCTTTGGCCTGATGCTGGTCATCGTGACATACCTGCAGCACGTGGACGATGTGGCCGAGGTGTATGAGGCCGACGAGTGGTCCTTTGTGAGGGGCCAGACCCAGACAATCGACCGCTACTATGGCCTGGGCCTGGATACCACAATGCACCACATCACCGACGGCCACGTGGCCCACCACTTCTTTAACAAGATCCCACACTACCACCTGATCGAGGCCACCGAGGGCGTGAAGAAGGTGCTGGAGCCCCTGAGCGATACACAGTACGGCTATAAGTCCCAAGTGAATTATGACTTCTTTGCCAGGTTTCTGTGGTTCAACTACAAGCTGGACTATCTGGTGCACAAGACAGCCGGCATCATGCAGTTCCGCACCACACTGGAGGAGAAGGCCAAGGCCAAGTGATAAGAATTCTCCATAAAGTAGGAAACACTACGATCTCCATAAAGTAGGAAACACTACAGTATCTCCATAAAGTAGGAAACACTACGCTATCCATAAAGTAGGAAACACTAC-3'
No.5
5'-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3'
No.6
5'-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3'

Claims (7)

1.一种秀丽线虫ω-3多不饱和脂肪酸转化酶基因表达框，其特征在于，
（Ⅰ）包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
（Ⅱ）表达框表达产物能够以细胞内的ω-6多不饱和脂肪酸为底物，催化转化为ω-3多不饱和脂肪酸。
2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框。
3.权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括：
（1）携带基因组可自我互补形成双链DNA分子；和/或
（2）重组腺相关病毒载体血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10，其中优选的血清型为AAV1、AAV8和AAV9。
4.一种基因治疗方式，其特征在于，包括权利要求1所述的基因表达框和权利要求2、3所述的重组腺相关病毒载体。
5.权利要求4所述的基因治疗方式，其特征在于，给药方式为静脉注射和/或肌肉注射。
6.权利要求4所述的基因治疗方式，其特征在于，一次给药可持续降低体内的血糖浓度，提高体内的胰岛素浓度，从而达到治疗糖尿病的目的。
7.权利要求6所述的糖尿病，优选为1型糖尿病。
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