CN106459984A - 昆虫细胞中产生的进一步改善的aav载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在昆虫细胞中产生腺相关病毒载体。因此所述昆虫细胞包含第一核苷酸序列，其编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中AAV VP1衣壳蛋白翻译的启动密码子为非‑ATG、次优的启动密码子，并且其中一或多个氨基酸残基的编码序列已被插入至所述次优翻译启动密码子与编码氨基酸残基(对应于野生型衣壳氨基酸序列的位置2处的氨基酸残基)的密码子之间，其中第一个氨基酸残基为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。所述昆虫细胞还包含第二核苷酸序列，其包含至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；第三核苷酸序列，其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep52或Rep40编码序列；和，第四核苷酸序列，其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep78或Rep68编码序列。本发明还涉及具有改变比例的病毒衣壳蛋白的腺相关病毒载体。
Description
发明领域
本发明涉及腺相关病毒在昆虫细胞中的生产以及涉及提供改善的感染性的腺相关病毒。
发明背景
腺相关病毒(AAV)可以认为是用于人类基因疗法的最有前景的病毒载体之一。AAV具有有效感染分裂和非分裂人细胞的能力，AAV病毒基因组整合至宿主细胞中单一染色体位点内，而最重要的是，尽管许多人中存在AAV，但是其却从未与任何疾病相关联。考虑到这些优点，在用于乙型血友病、恶性黑色素瘤、囊性纤维化和其它疾病的基因疗法临床试验中，正在对重组腺相关病毒(rAAV)进行评估。许多的临床试验以及近来在欧洲获得许可的第一个基因疗法药物Alipogene tiparvovec(，uniQure)，使AAV很有希望成为临床实践的主要落脚点。
一般而言，有两种主要类型的重组AAV生产体系。一方面在哺乳动物细胞类型(如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞)中有常规的生产体系，而另一方面，近来也已经开发了使用昆虫细胞的生产体系。
哺乳动物生产体系有若干缺陷，其中对于治疗用途最重要的一条是每个细胞所产生的rAAV颗粒数量有限(104颗粒的数量级(在Clark，2002，Kidney Int.61(Suppl.1)：9-15中有综述))。对于临床研究，可能需要超过1015的rAAV颗粒。为了产生此数量的rAAV颗粒，将会需要用大约1011培养的人类293细胞(5,000个175-cm2烧瓶的细胞的等价物)进行转染和培养，这意味着转染高达1011的293细胞。因此，使用哺乳动物细胞培养系统大规模生产rAAV来获得用于临床试验的材料，已被证明是有问题的，在商业规模进行生产甚至都可能是不可行的。另外也总是会有这样的风险，在哺乳动物细胞培养物中产生的用于临床用途的载体会受到哺乳动物宿主细胞中存在的不期望的材料(或许是致病性的)的污染。
为了克服哺乳动物生产体系的这些问题，已经开发了使用昆虫细胞的AAV生产体系(Urabe等人，2002，Hum.Gene Ther.13：1935-1943；US 20030148506和US 20040197895)。为了在昆虫细胞中产生AAV，必需要进行一些修改以便实现三种AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的正确的化学计量，其依赖于剪接受体位点的交替使用与用于VP2的ACG启动密码子(昆虫细胞未准确再生)的次优利用的组合。为了在昆虫细胞中模拟衣壳蛋白的正确化学计量，Urabe等人(2002，上文所述文献)使用了转录成单一多顺反子信使的构建物，其表达所有三种VP蛋白而无需剪接并且其中最上游的起始密码子被次优起始密码子ACG替换。
WO2007/046703公开了杆状病毒产生的rAAV载体感染性的进一步改善(基于在昆虫细胞中对AAV衣壳蛋白的化学计量的优化而产生)。
Kohlbrenner等人(2005，Mol.Ther.12：1217-25)报道了用于表达两种Rep蛋白的杆状病毒(如Urabe等人所使用的)，具有固有的不稳定性。通过将Urabe的原始载体中两个Rep基因的回文取向分开并设计了两个分别的杆状病毒载体用于表达Rep52和Rep78，Kohlbrenner等人(2005，上文所述文献)提高了载体的传代能力。然而，虽然在昆虫细胞中Rep78和Rep52从两个独立的杆状病毒-Rep构建物稳定表达至少5代，但是rAAV载体的产量与Urabe等人设计的原始杆状病毒-Rep构建物相比低5-10倍(2002，上文所述文献)。
WO2009/014445提供了在基于杆状病毒的rAAV载体生产期间改善稳定性的一种选择，其中是通过使用具有区别的密码子偏倚的重复编码序列。
Urabe等人(J.Virol.，2006，80(4)：1874-1885)报道了使用ACG作为VP1衣壳蛋白启动密码子的杆状病毒系统中产生的AAV5颗粒具有不佳的感染性，并且与从ACG启动密码子表达的具有VP1的AAV2相反，在AAV5VP1编码序列中将+4位置突变为G-残基并未改善感染性。Urabe等人通过构建了嵌合AAV2/5 VP1蛋白来解决此问题，其中AAV5 VP1至少49个氨基酸的N末端部分被替换为AAV2 VP1的相应部分以便改善病毒粒的感染性。因而现有技术中仍然需要从ACG启动密码子表达的保留感染性而未进行大规模的修改的AAV5 VP1。
然而，本发明人已经发现杆状病毒系统中产生的AAV载体，特别是AAV5载体(如已经根据Urabe(Urabe等人，2002，Hum.Gene Ther.13：1935-1943)、WO2007/046703或WO2009/014445而进行过修改的而非嵌合的AA5载体)，在小鼠中的体外和体内研究中，与例如常规的哺乳动物293细胞中产生的相应AAV载体相比，显示出降低的感染性。因而，依然需要基于杆状病毒的用于产生具有改善的感染性的rAAV载体的体系。
发明描述
发明概述
第一方面，本发明涉及核酸分子，其具有包含开放读框的核苷酸序列，其中所述读框以5′至3′的次序包含以下或者由以下组成：
(i)第一密码子，其是选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子；
(ii)第二密码子，其编码选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基；
(iii)任选存在的，跟随所述第二密码子之后的编码额外氨基酸残基的一或多个密码子；和，
(iv)编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的序列，其中该序列仅仅缺少VP1翻译启动密码子。
在优选的实施方案中，所述AAV衣壳蛋白是AAV血清型5、AAV血清型8、或AAV血清型9衣壳蛋白，更优选所述AAV衣壳蛋白具有选自SEQ ID NO：22、28、30、71和73的氨基酸序列。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，在进一步优选的实施方案中所述第二密码子编码丙氨酸。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，在进一步优选的实施方案中所述第二密码子选自GCT、GCC、GCA、GCG和GGU，优选其中所述密码子为GCT。
第二方面，本发明涉及包含本发明核酸分子的核酸构建物，其中所述编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的读框的核苷酸序列可操作地连接至用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，在进一步优选的实施方案中所述读框的核苷酸序列可操作地连接至选自以下组的启动子：多角体启动子、p10启动子、4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子、ΔE1启动子、E1启动子。在本发明优选的实施方案中，所述构建物是昆虫相容性载体，优选杆状病毒载体。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，所述核酸分子包含选自以下组的开放读框：SEQ ID NO：51、69、42、47、48和50，优选SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：69，更优选SEQ IDNO：51。
第三方面，本发明涉及包含本发明核酸构建物的昆虫细胞。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，在进一步优选的实施方案中所述昆虫细胞还包含：(a)第二核苷酸序列，其包含至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；(b)第三核苷酸序列，其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep78或Rep68编码序列；(c)任选存在的，第四核苷酸序列，其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep52或Rep40编码序列。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，在进一步优选的实施方案中所述昆虫细胞包含：(a)本发明的第一核酸构建物，其中所述第一核酸构建物还包含上文所定义的第三和第四核苷酸序列；和(b)包含上文所定义的第二核苷酸序列的第二核酸构建物，其中所述第二核酸构建物优选是昆虫细胞-相容性载体，更优选杆状病毒载体。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，在进一步优选的实施方案中第二核苷酸序列还包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中表达)，并且其中所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列并入至昆虫细胞中产生的AAV血清型5的基因组中。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，在进一步优选的实施方案中第二核苷酸序列包含两个AAV ITR核苷酸序列，并且其中所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列位于该两个AAV ITR核苷酸序列之间。
作为选择又或者与任何前述实施方案组合，在进一步优选的实施方案中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列以及任选存在的第四核苷酸序列被稳定整合至昆虫细胞的基因组中。
第四方面，本发明涉及AAV病毒粒，在其基因组中包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列，其中该至少一个核苷酸序列优选不是天然AAV核苷酸序列，并且其中所述AAV VP1衣壳蛋白从N末端至C末端包含以下或者由以下组成：
(i)第一氨基酸残基，其由翻译启动密码子编码，优选是由选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子编码；
(ii)第二氨基酸残基，其选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；
(iii)任选存在的，跟随所述第二氨基酸残基的一或多个额外的氨基酸残基；和，
(iv)AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列，其中该序列仅缺乏由VP1翻译启动密码子所编码的氨基酸残基。
优选地，本发明的AAV病毒粒包含编码因子IX或因子VIII蛋白质的感兴趣的基因产物。
第五方面，本发明涉及用于在昆虫细胞中产生AAV的方法，其包括以下步骤：(a)在产生AAV的条件下培养本发明的昆虫细胞；和任选地(b)回收所述AAV。
定义
如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)原件以功能性关系的连接。当核酸被置于与另一核酸序列功能性关系时，其是“可操作地连接”的。例如，如果转录调节序列影响编码序列的转录，则其可操作地连接至该编码序列。可操作地连接意指连接的DNA序列通常是连续的，并且当需要接合两个蛋白质编码区时，是连续的并且符合读框的。
“表达控制序列”是指这样的核酸序列，其调节其可操作地连接的核苷酸序列的表达。当表达控制序列控制并调节核苷酸序列的转录和/或翻译时，则该表达控制序列是″可操作地连接″至所述核苷酸序列。因而，表达控制序列可包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白编码基因之前的起始密码子、内含子剪接信号、以及终止密码子。术语″表达控制序列″要包括(最少)其存在设计为要影响表达的序列，并且还可以包括额外的有利组分。例如，前导序列和融合配偶体序列是表达控制序列。该术语还可以包括对核酸序列进行的设计，从而将不期望的潜在启动密码子(读框内和读框外的)从该序列去除。其还可以包括对核酸序列进行的设计，从而将不期望的潜在剪接位点去除。其包括引导添加聚腺苷酸尾巴的序列或者聚腺苷酸化序列(pA)，也即，在mRNA的3′-末端的腺苷酸残基串，称之为聚腺苷酸序列的序列。其还可以设计为增强mRNA的稳定性。影响转录和翻译稳定性的表达控制序列(例如，启动子)、以及影响翻译的序列(例如，Kozak序列)，在昆虫细胞中是已知的。表达控制序列可以具有这样的性质，其调节其可操作连接的核苷酸序列，从而实现较低的表达水平或者较高的表达水平。
如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”是指这样的核酸片段，其作用于控制一或多个编码序列的转录，以及位于所述编码序列的转录起始位点转录方向的上游，并且在结构上通过DNA-依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列的存在来鉴别，包括但不限于转录因子结合位点、阻抑和激活蛋白结合位点、以及本领域技术人员已知的直接或间接作用于调节从启动子转录的量的任何其它序列。“组成性”启动子是在大部分生理和发育条件下于大部分组织中有活性的启动子。“可诱导”启动子是经生理学或者发育调节的启动子，例如通过应用化学诱导剂。“组织特异性”启动子是仅在特定类型的组织或细胞中有活性的启动子。
术语“实质上相同”、“实质相同性”或“基本上相似”或“基本相似性”意指两个肽序列或者两个核苷酸序列，当进行最佳比对时(如通过GAP或BESTFIT程序使用默认参数)，至少具有一定百分比的序列相同性(如本文别处所定义的)。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法来在两个序列的全长对其进行比对将匹配数最大化并将缺口最小化。通常，使用GAP默认参数，其中缺口创建罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白)而缺口扩展罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对于核苷酸所使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，而对于蛋白默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。当提到RNA序列与DNA序列基本上相似或者具有一定程度的序列相同性时，需要清楚的是认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。用于百分比序列相同性的序列比对和得分可以使用计算机程序来确定，如GCG Wisconsin软件包，版本10.3，可得自Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752 USA，或者开源软件用于Windows的Emboss(目前版本2.7.1-07)。或者可以通过针对数据库(如FASTA、BLAST等)进行搜索来确定百分比相似性或相同性。
本发明的编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列也可分别通过其在中等条件下(优选在严格杂交条件下)与SEQ ID NO.1核苷酸序列杂交的能力来进行定义。严格杂交条件在本文中定义为允许这样条件下的杂交：至少约25个、优选约50个核苷酸、75个或100个以及最优选约200个或更多个核苷酸的核算序列，在约65℃的温度于包含约1M盐的溶液(优选6xSSC或任何其它具有相当离子强度的溶液)中，以及在65℃于包含约0.1M或更少盐的溶液中(优选0.2x SSC或任何其它具有相当离子强度的溶液)洗涤。优选地，杂交过夜进行，也即至少进行10小时，且优选洗涤进行至少1小时(至少更换两次洗涤溶液)。这些条件通常使有约90％或更高序列相同性的序列特异性杂交。
中等条件在本文中定义为允许这样条件下的杂交：至少50个核苷酸、优选约200个或更多核苷酸的核酸序列，在大约45℃的温度于包含约1M盐的溶液(优选6x SSC或任何其它具有相当离子强度的溶液)中，以及在室温于包含约1M盐的溶液(优选6x SSC或任何其它具有相当离子强度的溶液)中洗涤。优选地，杂交过夜进行，也即至少进行10小时，且优选洗涤进行至少1小时(至少更换两次洗涤溶液)。这些条件通常使有约50％或更高序列相同性的序列特异性杂交。本领域技术人员将能够修改这些杂交条件，以特异性地鉴别相同性在50％至90％之间变化的序列。
发明详述
本发明涉及动物细小病毒的用途，特别是依赖病毒如感染性的人或猿AAV，以及其组分(例如，动物细小病毒基因组)，用作在哺乳动物细胞中引入和/或表达核酸的载体。具体而言，本发明涉及改善此类细小病毒载体在昆虫细胞中产生时的感染性。
细小病毒科(Parvoviridae)的病毒是小的DNA动物病毒。细小病毒科可以分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒(Parvovirinae)，以及感染昆虫的浓核病毒(Densovirinae)。细小病毒亚科的成员在本文中称作细小病毒并包括依赖病毒属(Dependovirus)。如可以从该属的名称所推断的，依赖病毒的成员的独特性在于它们通常需要与辅助病毒(如腺病毒或疱疹病毒)共感染以在细胞培养中产生有效感染。依赖病毒属包括AAV，其通常感染人类(例如，血清型1、2、3A、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)或灵长类(例如，血清型1和4)，以及感染其它温血动物的相关病毒(例如，牛、犬、马、和羊腺相关病毒)。关于细小病毒和细小病毒科成员的其它信息在Kenneth I.Berns的“Parvoviridae：The Viruses and Their Replication，”第69章，Fields Virology(3d Ed.1996)中有描述。为方便起见，本发明进一步在本文中针对AAV进行示例和说明。然而，应理解本发明不局限于AAV，而是可以等同地适用于其它细小病毒。
所有已知AAV血清型的基因组组织都很相似。AAV的基因组是线性的、单链DNA分子，其长度小于大约5,000个核苷酸(nt)。反向末端重复(ITR)位于非结构性的复制(Rep)蛋白以及结构性的(VP)蛋白独特的编码核苷酸序列旁侧。所述VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳。末端145个nt自我互补并组织起来从而可形成能量上稳定的分子内双链体(形成T型发夹)。这些发夹结构作用为病毒复制的原点，作为细胞DNA聚合酶复合物的引物。随着wtAAV在哺乳动物细胞中的感染，Rep基因(也即Rep78和Rep52)分别从P5启动子和P19启动子表达，并且这两种Rep蛋白都在病毒基因组的复制中具有功能。在Rep ORF中的剪接现象导致实际上表达四种Rep蛋白(也即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)。然而，已经显示出编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接的mRNA，在哺乳动物细胞中足以产生AAV载体。在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白也满足AAV载体生产的需求。三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3由单一的VP读框从p40启动子表达。哺乳动物细胞中的wtAAV感染，对产生衣壳蛋白而言需要依赖于将剪接受体位点的交替使用与用于VP2的ACG启动密码子的次优利用进行组合。然而这在昆虫细胞中没有准确再现，因而需要进一步的特征来获得AAV衣壳蛋白正确的化学计量。
在第一方面，本发明涉具有这样核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列包含编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的开放读框。优选地，编码衣壳蛋白的读框相对于编码AAV衣壳蛋白的野生型开放读框而言经过修改，至少经以下修改：(i)将ATG启动密码子替换为选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子；和(ii)插入一或多个氨基酸残基的密码子，所述密码子插入至次优翻译启动密码子与编码对应于衣壳蛋白氨基酸序列位置2的氨基酸残基的密码子之间，优选的是野生型衣壳蛋白氨基酸序列的位置2的氨基酸残基。应理解(野生型)衣壳蛋白氨基酸序列的位置2优选是指(野生型)AAV VP1衣壳蛋白氨基酸序列的位置2。优选地，所述次优翻译启动密码子在其3’-末端紧接有用于选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基的密码子。
或者，在此方面本发明涉及具有这样核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列包含开放读框，其中所述开放读框以5’至3’的顺序包含以下或由以下组成：
(i)第一密码子，其是选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子；
(ii)选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的第二密码子；
(iii)任选存在的，随着所述第二密码子的额外氨基酸残基的一或多个密码子；和，
(iv)编码AAV衣壳蛋白的序列，其中所述序列缺乏VP1翻译启动密码子，优选其中该序列仅仅缺少VP1翻译启动密码子，或者换句话说，其中所述序列所缺乏的不超过VP1翻译启动密码子。
因而，在(iv)中所述序列优选包含以下或由以下组成：编码AAV衣壳蛋白的开放读框的剩余部分，其中所述剩余部分从对应于编码衣壳蛋白的野生型开放读框的第二个氨基酸位置的位置起始。
具有包含编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的开放读框的核苷酸序列的核酸分子，在本文中理解为包含编码优选动物细小病毒所有三种VP1、VP2、和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列。
表述“用选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子起始”或者“第一密码子，其是选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子”在本文中理解为是指编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的开放读框的启动密码子(在编码VP1衣壳蛋白的氨基端位置)是选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子。
次优在本文中理解为意指在除其以外相同背景下与正常ATG密码子相比在翻译的起始方面效率较低。优选用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的启动密码子选自ACG、TTG、GTG、和CTG，更优选用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的启动密码子选自CTG和ACG，以及最优选用于AAVVP1衣壳蛋白翻译的启动密码子是CTG。所述动物细小病毒优选是依赖病毒，更优选人或猿腺相关病毒(AAV)。
在特别优选的实施方案中，VP1的次优启动密码子为CTG，一个额外的密码子被引入至紧邻该次优启动密码子的3′末端，该额外的密码子编码丙氨酸。优选所述衣壳蛋白是AAV5衣壳蛋白。这导致AAV5病毒粒效力的改善。术语“效力”在本文中用于指载体推动其遗传材料表达的能力。
所述开放读框还包含第二密码子，其编码选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基，优选编码丙氨酸。更优选地，所述第二密码子选自GCT、GCC、GCA、GCG和GGU，优选其中所述密码子为GCT。所述开放读框任选包含跟随第二密码子的编码另外的额外氨基酸残基的一或多个密码子，例如用于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个额外氨基酸，但优选少于60、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15或14个额外氨基酸残基的密码子。可以容易理解的是，用于编码额外氨基酸残基的密码子要与衣壳蛋白的开放读框符合读框。
在实施方案中，如果将开放读框与野生型衣壳蛋白相比，编码衣壳蛋白的开放读框还包含编码一或多个氨基酸残基的密码子，其插入至VP1的次优翻译启动密码子与编码相应野生型衣壳蛋白中紧邻启动密码子3′末端的氨基酸残基的密码子之间。例如，与相应野生型衣壳蛋白相比，所述开放读框包含编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个额外氨基酸残基的密码子。优选地，与相应野生型衣壳蛋白相比，所述开放读框包含编码少于60、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15或14个额外氨基酸残基的密码子。可以容易理解的是，编码所述额外氨基酸残基的密码子要与衣壳蛋白的开放读框符合读框。在编码额外氨基酸残基的这些密码子中(与相应野生型壳蛋白相比)，第一个密码子(也即紧邻次优翻译启动密码子3′末端的密码子)编码选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基。因而，如果在翻译启动密码子与编码对应于野生型序列的残基2的氨基酸残基的密码子之间只有一个额外密码子，该额外密码子编码选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基。如果在翻译启动密码子与编码对应于野生型序列的残基2的氨基酸残基的密码子之间有超过一个密码子，则紧随翻译启动密码子的密码子编码选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基。优选地，紧随次优翻译启动密码子(也即在其3′末端)的额外氨基酸残基是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸，更优选丙氨酸。换句话说，在本发明优选的实施方案中，紧随次优翻译启动密码子的密码子编码丙氨酸。
在本发明优选的实施方案中，紧随次优翻译启动密码子的密码子，也即第二密码子，选自GCT、GCC、GCA、GCG、GGU、GGC、GGA、GGG、GUU、GUC、GUA、GUG、GAU、GAC、GAA和GAG，优选选自GCT、GCC、GCA、GCG和GGU，更优选该密码子为GCT。
步骤(iv)中编码AAV衣壳蛋白的序列可以是自然中发现的衣壳序列，如例如AAV1-AAV13的衣壳序列，其核苷酸和氨基酸序列在SEQ ID NO：13-38和SEQ ID NO：70-73中示出。因而，步骤(iv)中编码AAV衣壳蛋白的序列可以例如是选自以下组的衣壳序列；AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVl2和AAV13。或者，所述序列是人工制造的，例如，所述序列可以是杂合形式或者可以经过密码子优化，如例如经AcmNPv或草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)密码子选择优化。例如，衣壳序列可以由AAV1得VP2和VP3序列构成，而VP1序列的剩余部分是AAV5的。优选的衣壳蛋白是AAV5，优选如SEQ ID NO：22中提供的，AAV8，优选如SEQ ID NO：28提供的，或AAV9，优选如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO71或SEQ ID NO：73提供的。因而，在优选的实施方案中，AAV衣壳蛋白是已根据本发明修改的AAV血清型5、AAV血清型8、或AAV血清型9衣壳蛋白。如果衣壳蛋白是AAV9，优选该衣壳蛋白具有这样的序列：如例如WO 03/052052中或WO 05/033321中公开的或者SEQ ID NO：29、30、70、71、72、73或74中提供的。更优选地，如果衣壳蛋白是AAV9，则该衣壳蛋白具有如SEQID NO：72和73中提供的序列。更优选地，AAV衣壳蛋白是已根据本发明进行了修改的AAV血清型5衣壳蛋白。应理解衣壳蛋白的确切分子量、以及翻译启动密码子的确切位置在不同的细小病毒会有不同。然而，技术人员将会指导如何鉴别来自AAV-5之外其它细小病毒的核苷酸序列中的相应位置。或者，编码AAV衣壳蛋白的序列是人工制备的序列，例如作为定向进化实验的结果。这可包括经DNA改组、易错PCR、生物信息学合理设计、位点饱和诱变来生成衣壳库。所得的衣壳基于现有的血清型，但却含有改善此类衣壳特征的各种氨基酸和核苷酸改变。所得的衣壳可以是现有血清型各个部分的组合，“改组的衣壳”或者含有全新的改变，也即一或多个氨基酸和核苷酸的添加、缺失或取代，成组的或者分布在基因或蛋白的整个长度上。参见例如Schaffer和Maheshri；Proceedings of the 26th AnnualInternational Conference of the IEEE EMBS San Francisco，CA，USA；9月1-5，2004，3520-3523页；Asuri等人(2012)Molecular Therapy 20(2)：329-3389；Lisowski等人(2014)Nature 506(7488)：382-386，援引加入本文。
在本发明优选的实施方案中，编码VP3衣壳蛋白的开放读框用非标准翻译启动密码子起始，所述非标准翻译启动密码子选自以下组：ACG、ATT、ATA、AGA、AGG、AAA、CTG、CTT、CTC、CTA、CGA、CGC、TTG、TAG和GTG。优选地，所述非标准翻译启动密码子选自GTG、CTG、ACG、TTG，更优选所述非标准翻译启动密码子为CTG。
本发明优选的用于表达AAV衣壳蛋白的核苷酸序列是包含表达控制序列的核苷酸序列，所述表达控制序列包含VP2起始子临近序列。VP2起始子临近序列在本文中理解为是指在VP2的非标准翻译起始起点之前的许多核苷酸。在优选的实施方案中，所述VP起始子临近序列是SEQ ID NO：3的九个核苷酸的序列或者基本上与SEQ ID NO：3同源的核苷酸序列，编码AAV VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的次优翻译启动密码子上游，优选紧邻次优翻译启动密码子上游，也即紧邻次优翻译启动密码子的5′末端。与SEQ IDNO：3的核苷酸序列有实质相同性并将有助于提高VP1表达的序列例如是，与SEQ ID NO：3的九个核苷酸的序列具有至少60％、70％、80％或90％相同性、优选100％相同性的序列。
本发明用于表达AAV衣壳蛋白的另外的优选核苷酸序列是包含表达控制序列的核苷酸序列，所述表达控制序列在编码AAV VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的启动密码子周围包含Kozak共有序列。所述Kozak共有序列在本文定义为GCCRCC(NNN)G(SEQ ID NO：4)，其中R是嘌呤(也即A或G)并且其中(NNN)代表上文定义的任何次优启动密码子。优选地，在本发明核苷酸序列中的Kozak共有序列中，R是G。本发明用于表达AAV衣壳蛋白的包含Kozak共有序列的核苷酸序列因而优选选自GCCACC(ACG)G(SEQID NO：5)、GCCGCC(ACG)G(SEQ ID NO：6)、GCCACC(TTG)G(SEQ IDNO：7)、GCCGCC(TTG)G(SEQ ID NO：8)、GCCACC(GTG)G(SEQ ID NO：9)、GCCGCC(GTG)G(SEQ ID NO：10)、GCCACC(CTG)G(SEQ ID NO：11)和GCCGCC(CTG)G(SEQ IDNO：12)，更优选包含Kozak共有序列的核苷酸序列选自GCCACC(CTG)G(SEQ ID NO：11)和GCCGCC(CTG)G(SEQ IDNO：12)，最优选地，包含Kozak共有序列的核苷酸序列是GCCGCC(CTG)G(SEQ ID NO：12)。本文中括号内的核苷酸表示VP1蛋白启动密码子的位置。
本发明用于表达AAV衣壳蛋白的核苷酸序列还优选包含编码AAVVP1衣壳蛋白的核苷酸序列的至少一个修改，其选自核苷酸位置12处的G、核苷酸位置21处的A、和核苷酸位置24处的C，其中所述核苷酸位置对应于野生型核苷酸序列的核苷酸位置，例如SEQ ID NO：21中所示的。“潜在的/可能的错误起始位点”或者“潜在的/可能的错误翻译启动密码子”在本文中理解为是指衣壳蛋白的编码序列中的符合读框的ATG密码子。消除其它血清型VP1翻译的可能的错误起始位点是本领域技术人员了解的，在昆虫细胞中可能识别的潜在剪接位点的消除也是如此。例如，修改位置12处的核苷酸对于重组AAV5是不需要的，因为核苷酸T不会引起错误的ATG密码子。例如，对AAV5核苷酸序列的进一步修改可以存在于SEQ ID NO：39中。通过应用各种已知的基因工程技术可以实现使野生型AAV序列在昆虫细胞中恰当表达的各种修改，如例如Sambrook和Russell(2001)″Molecular Cloning：A LaboratoryManual(3rd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York中描述的。VP编码区的各种另外的修改是本领域技术人员已知的，其可以提高VP和病毒粒产量或者具有其它期望的作用，如改变向性或者降低病毒粒的抗原性。这些修改在本发明的范围内。
在优选的实施方案中，本发明的核酸分子包含选自以下组的开放读框或者由其所组成：SEQ ID NO：51、69、41、42、43、44、45、46、47、48、50和52，更优选本发明的核酸分子包含选自以下组的开放读框或者由其所组成：SEQ ID NO：51、69、42、43、47、48和50，更优选其包含SEQ ID NO：69或51或者由其所组成，以及更优选其包含SEQ ID NO：51或者由其组成。
优选本发明编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接至用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列。因而，在第二方面，本发明涉及包含本发明核酸分子的核酸构建物，其中编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的开放读框的核苷酸序列可操作地连接至用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列。这些表达控制序列至少会包括在昆虫细胞中有活性的启动子。本领域技术人员已知的用于在昆虫宿主细胞中表达外源基因的技术可用于实施本发明。用于在昆虫细胞进行多肽的分子工程或者表达的方法在如下文献中有描述，例如，Summers和Smith.1986.A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect CultureProcedures，Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555，CollegeStation，Tex.；Luckow.1991.In Prokop等人，Cloning and Expression of HeterologousGenes in Insect Cells with Baculovirus Vectors′ Recombinant DNA Technologyand Applications，97-152；King，L.A.和R.D.Possee，1992，The baculovirus expressionsystem，Chapman and Hall，UnitedKingdom；O′Reilly，D.R.，L.K.Miller，V.A.Luckow，1992，BaculovirusExpression Vectors：A Laboratory Manual，New York；W.H.Freeman和Richardson，C.D.，1995，Baculovirus Expression Protocols，Methods inMolecularBiology，volume 39；US 4,745,051；US2003148506；以及WO 03/074714。用于对本发明编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列进行转录的特别适宜的启动，例如有多角体(polH)启动子，如SEQ ID NO：53中提供的polH启动子以及SEQ ID NO：54中提供的短polH启动子。然而，在昆虫细胞中有活性的启动子是本领域已知的，例如多角体蛋白(polH)启动子、p10启动子、p35启动子、4xHsp27 EcRE+最小Hsp70启动子、ΔE1启动子、E1启动子或IE-1启动子，以及上述文献中描述的其它启动子。
优选用于在昆虫细胞中表达AAV衣壳蛋白的核酸构建物是昆虫细胞-相容性载体。″昆虫细胞-相容性载体″或者″载体″理解为是指能够对昆虫或昆虫细胞产生有效转化或转染的核酸分子。示例性的生物学载体包括质粒、线性核酸分子、和重组病毒。可以使用任何载体只要其是昆虫细胞-相容性的。载体可以整合至昆虫细胞基因组之中，但是该载体在昆虫细胞中的存在需要是永久性的并且不包括附加型载体。所述载体可以通过任何已知措施进行引入，例如通过对细胞进行化学处理、电穿孔、或感染。在优选的实施方案中，所述载体是杆状病毒、病毒载体、或质粒。在更优选的实施方案中，所述载体是杆状病毒，也即所述构建物是杆状病毒载体。杆状病毒载体及其使用方法在上文引用的昆虫细胞分子工程的文献中有描述。
在优选的实施方案中，本发明核酸构建物中所包含的核酸分子，包含选自以下组的开放读框或者由其所组成：SEQ ID NO：51、69、42、43、47、48和50，更优选其包含SEQ IDNO：51或SEQ ID NO：69或由其组成，更优选其包含SEQ ID NO：51或由其组成。
在第三方面，本发明涉及昆虫细胞，其包含上文所定义的本发明的核酸构建物。任何允许AAV复制的并且可以保持在培养物中的昆虫细胞，都可以根据本发明进行使用。例如，所使用的细胞系可以来自草地贪夜蛾、果蝇细胞系、或者蚊子细胞系，例如，白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生的细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系是来自易受杆状病毒感染的昆虫物种的细胞，包括例如果蝇Schneider 2(S2)细胞、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5和来自Invitrogen的High Five。
本发明优选的昆虫细胞还包含：(a)第二核苷酸序列，其包含至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；(b)第三核苷酸序列，其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep52或Rep40编码序列；和(c)第四核苷酸序列，其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep78或Rep68编码序列。
在本发明的背景下″至少一个AAV ITR核苷酸序列″理解为是指回文序列，大部分包含互补的、对称安排的序列(也称作″A″、″B″和″C″区)。所述ITR作用为复制原点，在复制中具有″顺式″作用的位点，也即，作为反式作用复制蛋白(例如，Rep 78或Rep68)的识别位点，其识别回文序列以及回文序列内部的特异性序列。ITR序列对称性的一个例外是ITR的″D″区。其是独特的(在一个ITR内不具有互补)。单链DNA的切口在A和D区之间的接合处发生。这是新DNA合成起始的区域。D区一般位于回文序列的一侧并向核酸复制步骤提供指向性。在哺乳动物细胞中复制的AAV通常具有两个ITR序列。然而，可以改造ITR从而结合位点位于A区的两条链上并且D区对称地在回文序列的每一侧都有一个。在双链环状DNA模板上(例如，质粒)，Rep78-或Rep68-辅助的核酸复制则在两个方向都进行，并且单个ITR即可满足环状载体的AAV复制的需要。因而，在本发明的背景下，可以使用一个ITR核苷酸序列。然而，优选使用两个或者其它偶数数目的常规ITR。最优选使用两个ITR序列。考虑到病毒载体的安全性，可期望构建在初始引入细胞之后不能够进一步繁殖的病毒载体。此种限制不期望的载体在接受者中繁殖的安全机制可以通过使用具有嵌合ITR的rAAV来提供，如US2003148506中所述。在优选的实施方案中，编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列包含至少一个符合读框的编码免疫逃避重复的序列的插入，如WO 2009/154452中所述。这导致形成了所谓的自我互补或单体双链体细小病毒的病毒粒，其具有显示出降低的免疫应答的优势。在优选的实施方案中，编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的序列包含单体双链体或自我互补的基因组。为制备单体双链体AAV载体，在本发明的昆虫细胞中以及在包含至少一个AAV ITR的载体的存在下表达AAV Rep蛋白和AAV衣壳蛋白，其中Rep52和/或Rep40蛋白表达相对于Rep78和/或Rep68蛋白表达有提升。单体双链体AAV载体，也可以通过在昆虫细胞中表达AAV Rep蛋白和AAV Cap蛋白来制备(存在旁侧至少有一个AAV ITR的载体基因组构建物)，其中所述Rep78和/或Rep 60的切口活性相对于Rep52和/或Rep 40的解旋酶/包壳作用活性有降低，如例如WO2011/122950中所述。
本发明中所使用的载体或核酸构建物的数目不受限制。例如，可以使用一个、两个、三个、四个、五个、六个、或更多个载体来在本发明的昆虫细胞中产生AAV。如果使用六个载体，一个载体编码AAV VP1、另一载体编码AAV VP2、另一载体编码AAV VP3、另一载体编码Rep52或Rep40、而Rep78或Rep68由另一载体编码、以及最后的载体编码至少一个AAV ITR。可以使用额外的载体来表达，例如，Rep52和Rep40、以及Rep78和Rep 68。如果使用少于六个载体，载体可包含至少一个AAV ITR和VP1、VP2、VP3、Rep52/Rep40、和Rep78/Rep68编码序列的各种组合。优选地，使用两个载体或三个载体，更优选使用两种载体，如上文所述。如果使用两个载体，优选所述昆虫细胞包含：(a)如上文所定义的用于表达AAV衣壳蛋白的第一核酸构建物，所述构建物还包含如上文(b)和(c)中所定义的第三和第四核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包含可操作地连接至至少一个表达控制序列(用于昆虫细胞中表达)的Rep52或Rep40编码序列，而所述第四核苷酸序列包含可操作地连接至至少一个表达控制序列(用于昆虫细胞中表达)的Rep78或ep68编码序列；和(b)包含如上文(a)所定义的第二核苷酸序列的第二核酸构建物，其包含至少一个AAV ITR核苷酸序列。如果使用三个载体，优选使用两个载体的相同设置，除了使用分别的载体用于表达衣壳蛋白和用于表达Rep52、Rep40、Rep78和Rep68蛋白。每个载体上的序列彼此之间可以为任何顺序。例如，如果一个载体包含ITR和ORF(含编码VP衣壳蛋白的核苷的序列)，该VP ORF可位于载体上，从而通过复制ITR序列之间的DNA，该VP ORF得到复制或没有得到复制。另例如，编码Rep的序列和/或包含编码VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF在载体上可以是任何顺序。应理解第二、第三和另外的核酸构建物优选也是昆虫细胞-相容性的载体，优选如上文所述的杆状病毒载体。或者，在本发明的昆虫细胞中，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、和第四核苷酸序列以及任选存在的其它核苷酸序列中的一或多个可稳定地被整合至昆虫细胞的基因组中。本领域技术人员知道如何稳定地将核苷酸序列引入至昆虫基因组以及如何鉴别在基因组中具有此核苷酸序列的细胞。例如，可以通过使用包含与昆虫基因组的区域高度同源的核苷酸序列的载体，来帮助并入基因组中。使用特定的序列如转座子，是将核苷酸序列引入基因组的另一方式。
因而，在优选的实施方案中，本发明的昆虫细胞包含：(a)本发明的第一核酸构建物，其中该第一核酸构建物还包含上文所定义的第三和第四核苷酸序列；和(b)包含上文所定义的第二核苷酸序列的第二核酸构建物，其中该第二核酸构建物优选是昆虫细胞-相容性载体，更优选杆状病毒载体。
在本发明优选的实施方案中，本发明的昆虫细胞中存在第二核苷酸序列，也即，包含至少一个AAV ITR的序列还包含至少一个编码感兴趣基因产物的核苷酸序列(优选用于在哺乳动物细胞中表达)，其中优选所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列并入至昆虫细胞中产生的AAV的基因组中。优选地，编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列是用于在哺乳动物细胞中表达的序列。优选地，第二核苷酸序列包含两个AAV ITR核苷酸序列并且其中所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列位于两个AAV ITR核苷酸序列之间。优选地，编码感兴趣基因产物的核苷酸序列(用于在哺乳动物中表达)将被并入昆虫细胞中产生的AAV基因组内(如果其位于两个常规ITR之间，或者位于经改造具有两个D区的ITR的任意侧。因而，在优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明的昆虫细胞，其中第二核苷酸序列包含两个AAV ITR核苷酸序列并且其中所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列位于两个AAV ITR核苷酸序列之间。
通常，感兴趣的基因产物(包括ITR)，长度为5,000个核苷酸(nt)或更少。在另一实施方案中，通过使用本发明所述的AAV载体，可以在体外和体内表达超大DNA，也即长度超过5,000nt。超大的DNA在此理解为超过5kbp的最大AAV包装限度的DNA。因此，也可以生成这样的AAV载体，其能够产生通常由大于5.0kb的基因组编码的重组蛋白。例如，本发明人已经在昆虫细胞中生成了rAAV5载体，其含有部分地、单一朝向包装的hFVIII片段。至少涵盖了5.6kb的载体基因组总大小包装至两个群体的含有FVIII片段的AAV5颗粒中。这些变体AAV5-FVIII载体显示出活跃地分泌FVIII。这在体外得到了证实，其中包含感兴趣的基因产物(编码因子VIII)的AAV载体在感染Huh7细胞之后导致产生有活性的FVIII蛋白。类似地，在小鼠中尾静脉输送rAAV FVIII导致产生有活性的FVIII蛋白。包壳作用产物的分子分析清楚无疑地显示出5.6kbp的FVIII表达盒在AAV颗粒中没有完整的被包壳。不是要受理论局限，我们假设经包壳分子的+和-DNA链反映出丢失的5′末端。这与此前报道的单一方向(从3′末端起始)包装机制(根据“头部完全原则(head-full principia)”具有4.7-4，9kb的限制)一致(参见例如Wu等人[2010]Molecular Therapy 18(1)：80-86；Dong等人[2010]Molecular Therapy 18(1)：87-92；Kapranov等人[2012]Human Gene Therapy 23：46-55；以及特别是Lai等人[2010]Molecular Therapy 18(1)：75-79。虽然仅有大约5kb的全部5.6kb载体基因组经包壳，但是该载体是有效力的且导致有活性FVIII的表达。我们已经显示出用于产生FVIII的正确模板在靶细胞中基于+和-DNA链的部分互补而组装，随后是第二链的合成。
上文所定义的第二核苷酸序列因而可包含至少编码″感兴趣基因产物″的核苷酸序列用于在哺乳动物细胞中表达，其位置使得其将会并入在昆虫细胞中复制的AAV基因组之内。任何核苷酸序列都可以被并入以用于随后在哺乳动物细胞(转染有根据本发明产生的AAV)中表达，只要是该构建物保持在AAV病毒粒的包装容量之内即可。所述核苷酸序列可以例如编码蛋白，其可以表达RNAi物质，也即能够进行RNA干扰的RNA分子如例如shRNA(短发夹RNA)或siRNA(短干扰RNA)。″siRNA″意指小的干扰RNA，其是长度较短的双链RNA，在哺乳动物细胞中无毒性(Elbashir等人，2001，Nature 411：494-98；Caplen等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742-47)。在优选的实施方案中，第二核苷酸序列可以包含两个核苷酸序列，且每个均编码一种感兴趣的基因产物用于在哺乳动物细胞中表达。编码感兴趣产物的两个核苷酸序列中的每个的位置都使得其会被并入至在昆虫细胞中复制的rAAV基因组之内。
所述用于在哺乳动物细胞中表达的感兴趣产物可以是治疗性基因产物。治疗性基因产物可以是多肽、或RNA分子(siRNA)、或其他基因产物，当其在靶细胞中表达时，提供期望的治疗效果，如例如不期望活性的消融，例如感染细胞的消融、或者遗传缺陷的互补，例如引起酶活性的缺失。治疗性多肽基因产物的实例包括CFTR、因子IX、脂蛋白脂肪酶(LPL，优选LPL S447X；参见WO 01/00220)、载脂蛋白A1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)、色素性视网膜炎GTPase调节性相互作用蛋白(RP-GRIP)、细胞因子或白细胞介素如例如IL-10、肌养蛋白、PBGD、NaGLU、Treg167、Treg289、EPO、IGF、IFN、GDNF、FOXP3、因子VIII、VEGF、AGXT和胰岛素。作为选择或额外作为第二基因产物，上文所定义的第二核苷酸序列可包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽用作标记蛋白来评估细胞的转化和表达。用于此目的的适宜标记蛋白例如有荧光蛋白GFP，和选择性标记基因HSV胸苷激酶(用于在HAT介质上筛选)，细菌潮霉素B磷酸转移酶(用于在潮霉素B上筛选)，Tn5氨基糖苷类磷酸转移酶(用于在G418上筛选)，和二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于在甲氨蝶呤上筛选)，CD20，低亲和性神经生长因子基因。获得这些标记基因的来源及其使用方法在Sambrook和Russel(2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd edition)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中有描述。另外，上文所定义的第二核苷酸序列可包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽可用作故障保障机制，其使得能将对象从转导了本发明rAAV的细胞治愈(如果认为有需要的话)。此类核苷酸序列(常常称作自杀基因)，编码能够将前体药物转化为毒性物质的蛋白，其能够杀死表达该蛋白的转基因细胞。此类自杀基因适宜的实例包括例如大肠杆菌(E.coli)胞嘧啶脱氨酶基因或者来自单纯疱疹病毒、细胞巨化病毒和水痘-带状疱疹病毒的一种胸苷激酶基因，在该情况中更昔洛韦可以被用作前体药物来杀死目标中的转基因细胞(参见例如Clair等人，1987，Antimicrob.Agents Chemother.31：844-849)。
在另一实施方案中感兴趣的基因产物可以是AAV蛋白。具体而言，Rep蛋白(如Rep78或Rep68)，或者其功能性片段。编码Rep78和/或Rep68的核苷酸序列，如果存在于本发明的rAAV基因组中并且在转导有本发明rAAV的哺乳动物细胞中表达时，将使得该rAAV整合至经转导哺乳动物细胞的基因组内。Rep78和/或Rep68在经rAAV-转导或感染哺乳动物细胞中的表达，可以通过由所述rAAV长期或永久表达任何引入细胞内的感兴趣的基因产物，从而提供所述rAAV某种用途的优势。
在本发明的rAAV载体中，编码用于在哺乳动物细胞中表达的感兴趣的基因产物的核苷酸序列，优选可操作地连接至至少一个哺乳动物细胞-相容性的表达控制序列，例如，启动子。许多此类启动子是本领域已知的(参见Sambrook和Russel，2001，上文所述文献)。可以使用在许多细胞类型中广泛表达的组成性启动子，如CMV启动子。然而，更优选的是可诱导的、组织特异性的、细胞类型特异性的、或细胞循环特异性的启动子。例如，用于肝特异性的表达，则启动子可选自α1-抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、LPS(甲状腺素结合球蛋白)启动子、HCR-ApoCII杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子和载脂蛋白E启动子、LP1、HLP、最小TTR启动子、FVIII启动子、超子增强子、ealb-hAAT。其它实例包括用于肿瘤选择性的E2F启动子，以及，具体而言，神经细胞肿瘤选择性表达(Parr等人，1997，Nat.Med.3：1145-9)或者用于单核血细胞的IL-2启动子(Hagenbaugh等人，1997，JExp Med；185：2101-10)。
AAV能够感染许多哺乳动物细胞。参见，例如，Tratschin等人，Mol.Cell Biol.，5(11)：3251-3260(1985)和Grimm等人，Hum.Gene Ther.，10(15)：2445-2450(1999)。然而，人滑膜成纤维细的AAV转导显著比相似的鼠类细胞中更有效，Jennings等人，Arthritis Res，3：1(2001)，并且AAV的细胞向性在血清型之间有差异。See，例如，Davidson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(7)：3428-3432(2000)(讨论了AAV2、AAV4、和AAV5之间关于哺乳动物CNS细胞向性以及转导效率的差异)。
可在本发明中用于在昆虫细胞中产生AAV的AAV序列可以源自任何AAV血清型的基因组。一般而言，AAV血清型在氨基酸和核酸水平上具有基因组序列的显著同源性，提供了相同的一套遗传功能，产生基本上在物理上和功能上等价的病毒粒，并且以特别相同的机制来进行复制和组装。对于各种AAV血清型的基因组序列以及基因组相似性的综述，参见例如GenBank登记号U89790；GenBank登记号J01901；GenBank登记号AF043303；GenBank登记号AF085716；Chlorini等人(1997，J.Vir.71：6823-33)；Srivastava等人(1983，J.Vir.45：555-64)；Chlorini等人(1999，J.Vir.73：1309-1319)；Rutledge等人(1998，J.Vir.72：309-319)；和Wu等人(2000，J.Vir.74：8635-47)。人或猿腺相关病毒(AAV)血清型是用于本发明背景的AAV核苷酸序列的优选来源，更优选通常感染人的AAV血清型(例如，血清型1、2、3A、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13)或灵长类(例如，血清型1和4)。
优选用于本发明背景的AAV ITR序列源自AAV1、AAV2、AAV5和/或AAV4。同样，Rep52、Rep40、Rep78和/或Rep68编码序列优选源自AAV1、AAV2、和/或AAV4。用于本发明背景的编码VP1、VP2、和VP3衣壳蛋白的序列可以取自任何已知的42种血清型，更优选取自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或者新开发的通过例如衣壳改组技术和AAV衣壳库所获得的类AAV颗粒。在优选的实施方案中，用于编码VP1、VP2、和VP3衣壳蛋白的序列来自AAV5或AAV8，更优选来自AAV5。
AAV Rep和ITR序列在大部分血清型中是特别保守的。各种AAV血清型的Rep78蛋白为例如超过89％相同，并且AAV2、AAV3A、AAV3B、和AAV6之间在基因组水平总的核苷酸序列相同性大约82％(Bantel-Schaal等人，1999，J.Virol.，73(2)：939-947)。此外，许多AAV血清型的Rep序列和ITR已知在哺乳动物细胞中生成AAV颗粒方面有效地交叉互补(也即，功能性地替代)来自其它血清型的相应序列。US2003148506报道了AAV Rep和ITR序列在昆虫细胞中也有效地交叉互补其它AAV Rep和ITR序列。
AAV VP蛋白已知确定AAV病毒粒的细胞向性。VP蛋白编码序列在不同的AAV血清型之间显著地不如Rep蛋白和基因那样保守。Rep和ITR序列与其它血清型的相应序列交叉互补的能力，使得可以产生包含血清型(例如，AAV3)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型(例如，AAV2)的Rep和/或ITR序列的假型的AAV颗粒。此类假型的AAV颗粒是本发明的一部分。
经修改的″AAV″序列也可用于本发明的背景，例如用于在昆虫细胞中产生rAAV载体。此类经修改的序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9的ITR、Rep、或VP具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％，或更高的核苷酸和/或氨基酸序列相同性的序列(例如，具有75-99％核苷酸序列相同性的序列)，可用于替换野生型AAV的ITR、Rep、或VP序列。
虽然在许多方面与其它AAV血清型相似，比起其它人和猿血清型，AAV5与其它人和猿AAV血清型的差异更大。有鉴于此，在昆虫中生产AAV5可以与其它血清型不同。当使用本发明的方法啦来产生rAAV5时，优选在超过一个载体的情况下共同包括含有以下核苷酸序列的一或多个载体：包含AAV5 ITR的核苷酸序列、包含AAV5 Rep52和/或Rep40编码序列的核苷酸序列以及包含AAV5 Rep78和/或Rep68编码序列的核苷酸序列。此类ITR和Rep序列可以经过修改以期在昆虫细胞中获得rAAV5或假型的rAAV5载体的有效产生。例如，Rep序列的起始密码子可以经过修改。
在优选的实施方案中，所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列以及任选存在的第四核苷酸序列被稳定整合至昆虫细胞的基因组中。
第四方面本发明涉及AAV病毒粒。优选地，所述AAV病毒粒在其基因组中包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列，其中该至少一个核苷酸序列优选不是天然AAV核苷酸序列，并且其中所述AAV VP1衣壳蛋白从N-末端至C-末端包含以下或者由以下组成：
(i)第一氨基酸残基，其由翻译启动密码子编码，优选是由选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子编码；
(ii)第二氨基酸残基，其选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；
(iii)任选存在的，跟随所述第二氨基酸残基的一或多个额外的氨基酸残基；和，
(iv)AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列，其中该序列缺乏由VP1翻译启动密码子所编码的氨基酸残基。优选其中所述序列仅仅缺乏由VP1翻译启动密码子编码的氨基酸残基，或者换个说法，其中所述序列所缺乏的不超过由VP1翻译启动密码子编码的氨基酸残基。
优选地，仅缺乏VP1翻译启动密码子所编码的氨基酸残基的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列是AAV VP1衣壳蛋白天然存在的氨基酸序列(仅缺乏天然存在的VP1翻译启动密码子所编码的氨基酸残基)。由次优翻译启动密码子所编码的第一个氨基酸残基，通常是甲硫氨酸残基。
或者，在此方面本发明涉及AAV病毒粒，其中所述AAV病毒粒在其基因组包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列，其中该至少一个核苷酸序列优选不是天然AAV核苷酸序列，并且其中所述AAV VP1衣壳具有一或多个额外的氨基酸残基插入至启动密码子和对应于野生型衣壳蛋白的位置2处氨基酸残基的氨基酸残基之间，其中紧随着启动密码子的所述额外氨基酸残基选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
优选地，在本发明的病毒粒中，AAV VP1、VP2、和VP3衣壳蛋白的化学计量如下，VP1的量：(a)至少为VP2的量的100％、105％、110％、120％、150％、200％或400％；或者(b)至少为VP3的量的8％、10％、10.5％、11％、12％、15％、20％或40％；或者(c)至少为(a)和(b)中所定义的。优选地，使用识别VP1、VP2和VP3的每个都共有的表位的抗体来确定VP1、VP2和VP3的量。现有技术中有各种免疫测定可用于对VP1，VP2和/或VP3的相对量进行定量(参见例如Using Antibodies，E.Harlow和D.Lane，1999，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)。用于识别三种衣壳蛋白每个都共有的表位的适宜抗体例如有，小鼠抗-Cap B1抗体(可商业得自Progen，Germany)。
本发明优选的AAV是这样的病毒粒，在其基因组中包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列，其中该至少一个核苷酸序列优选不是天然AAV核苷酸序列，并且其中该AAV病毒粒包含在位置1含有甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸或缬氨酸的VP1衣壳蛋白。更优选的本发明的AAV病毒粒具有上文所定义的比例的衣壳蛋白，并且包含在位置1含有亮氨酸或缬氨酸的VP1衣壳蛋白。更优选的是可从下文多定义的方法中得自上文所定义的昆虫细胞的AAV病毒粒。更优选的是在VP1衣壳蛋白的位置1包含苏氨酸或亮氨酸的AAV病毒粒，更优选苏氨酸残基。
本发明AAV病毒粒的优势在于其改善的感染性。不是要受理论限制，具体而言似乎随着衣壳中VP1蛋白的量相对于衣壳中VP2和/或VP3的量的提升，感染性会有提升。AAV病毒粒的感染性在本文中理解为是指病毒粒中包含的转基因的转导效率，这可以从转基因的表达率以及从转基因表达的产物的量或活性来推断。
优选地，本发明的AAV病毒粒包含感兴趣的基因产物，其编码选自以下组的多肽基因产物：CFTR、因子IX、脂蛋白脂肪酶(LPL，优选LPL S447X；参见WO 01/00220)、载脂蛋白A1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)、色素性视网膜炎GTPase调节性相互作用蛋白(RP-GRIP)、细胞因子或白细胞介素如例如IL-10、肌养蛋白、PBGD、NaGLU、Treg167、Treg289、EPO、IGF、IFN、GDNF、FOXP3、因子VIII、VEGF、AGXT和胰岛素。更优选地，感兴趣的基因产物编码因子IX或因子VIII蛋白。
另一方面本发明因而涉及用于在昆虫细胞中产生AAV的方法。优选所述方法包括以下步骤：(a)在产生AAV的条件下培养上文所定义的昆虫细胞；和，任选地，(b)回收所述AAV。昆虫细胞在培养中的生长个条件、以及培养中的昆虫细胞中异源产物的产生是本领域熟知的，并且在例如上文引用的昆虫细胞的分子工程的参考文献中有描述。
优选所述方法还包括使用抗AAV抗体亲和性纯化AAV的步骤，优选固定的抗体。所述抗AAV抗体优选是单克隆抗体。特别适宜的抗体为单链骆驼科(camelid)抗体或其片段，例如可得自骆驼或美洲驼(参见例如Muyldermans，2001，Biotechnol.74：277-302)。用于AAV亲和性纯化的抗体优选是特异性地接合AAV衣壳蛋白上表位的抗体，其中优选所述表位是存在于超过一种AAV血清型的衣壳蛋白上的表位。例如所述抗体可以基于对AAV2衣壳的特异性结合来产生或者选择，但是同时其也特异性地结合AAV1、AAV3和AAV5衣壳。
在此文献及其权利要求中，动词″包含″及其变形是以其非限制性的含义来使用的，意指跟随该词的条目包括在内，但是没有明确提到的条目也并未排除在外。另外，以不定冠词″a″或″an″提到的原件并不排除存在超过一个元件的可能性，除非上下文清楚地要求有且只有一个该元件。因而不定冠词″a″或″an″通常意指″至少一个″。
本说明书中引用的所有专利和文献参考均以其整体援引加入本文。
以下实施例仅用于解释说明的目的，而不是要以任何方式限制本发明的范围。
附图简述
图1纯化了各种携有报道转基因SEAP的突变体衣壳并在NuPage凝胶上解析。显示了三种衣壳蛋白VP1(87kDa)、VP2(72kDa)和VP3(62kDa)。
图2用携有seap表达盒的各种AAV5衣壳突变体在Hela细胞中进行的体外效力测定。报道基因的活性间接地测量为光的发射并表示为RLU(相对光单位)。NTC＝阴性对照。
图3用携有seap表达盒的各种AAV5衣壳突变体在Huh7细胞中进行的体外效力测定。报道基因的活性间接地测量为光的发射并表示为RLU(相对光单位)。NTC＝阴性对照。
图4用携有seap表达盒的各种衣壳突变体在C57BL/6小鼠中进行的体内效力测定。报道基因的活性间接地测量为光的发射并表示为RLU(相对光单位)。
图5用携有FIX表达盒的各种衣壳突变体在C57BL/6小鼠中进行的体内效力测定。通过施用两种不同的载体也即衣壳变体160和765来监测FIX的表达。两种衣壳均携有FIX表达盒。在注射后1、2和4周通过特异性ELISA的手段在血浆中测量FIX。IU/ml表示在1ml的血浆中发现的FIX蛋白的国际单位。PBS＝磷酸缓冲盐水。
图6纯化了携有报道转基因SEAP的突变体衣壳并在NuPage凝胶上进行了解析，以显示三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。显示了构建物43的3个克隆。
图7用携有seap表达盒的各种AAV5衣壳突变体在Hela细胞中进行的体外效力测定(A)和在Huh7细胞中进行的体外效力测定(B)。报道基因的活性间接地测量为光的发射并表示为RLU(相对光单位)(a.u.：任意单位)。
实施例
1.介绍
用于产生rAAV的初始杆状病毒系统在Urabe等人(Urabe等人[2002]Human GeneTherapy 13(16)：1935-1943)中有描述，并且由三种杆状病毒组成，也即Bac-Rep、Bac-cap和Bac-vec，其共同感染昆虫细胞例如SF9导致生成rAAV。如此产生的rAAV的性质(也即物理和分子特征包括效力)与哺乳动物细胞中生成的rAAV没有显著差异(Urabe[2002]，上文所述文献)。为了实现在昆虫细胞中有效生成rAAV载体，需用于此目的的AAV蛋白必需以适当的水平表达。这需要对编码Rep和Cap蛋白的操纵子进行许多调整。野生型AAV从两个不同的启动子p5和p19分别表达大的Rep78至小的Rep52，并且两个信使的剪接导致生成Rep68和Rep52变体。此操纵子的组织导致Rep78的有限表达以及Rep52相对较高的表达。为了模拟78对52的低比例，Urabe和同事构建了DNA盒，其中Rep78的表达受到即刻早期1基因(ΔIE-1)的部分缺失的启动子的推动，而Rep52的表达受到强多角体蛋白启动子(polh)的控制。大的和小的Rep的剪接变体未在昆虫细胞中观察到，这可能是由于哺乳动物和昆虫细胞之间剪接过程的差异。另一个需要克服的技术挑战与三种主要病毒蛋白(VP)的表达相关。野生型AAV从p40启动子达VP1、VP2和VP3。将出现的信使RNA剪接成两个种类：一个负责VP1的表达，而第二个则经“渗漏核糖体扫描机制”表达VP2和VP3，其中蛋白从非标准起始处也即ACG开始，其经常被核糖体复合物错过继而其继续进行直至找到VP3的标准起始。由于脊椎动物和昆虫细胞之间剪机制的差异，上文所述的机制并未导致在昆虫细胞中生成适当的衣壳。Urabe等人决定引入VP1翻译起始的修改，其以这样的方式与VP2中发现的那些相似，也即VP1的翻译起始改变为ACG以及起始背景，也即将VP1之前的9个核苷酸更换为VP2之前的那些。这些遗传改变导致了三种VP以正确的化学计量表达，这可以适当地组装至衣壳中形成单一的多顺反子mRNA。另一方面所述转基因盒类似于此前描述用于基于哺乳动物体系的那些，旁侧有ITR作为仅有的用于复制和包装所需的反式元件。
随着新发现的具有不同期望性质的AAV血清型数目的日益增加，有需要再BEV系统中生成这些衣壳。虽然已经显示出在昆虫细胞中成功产生AAV2，但并不是所有的血清型在针对AAV2调适的系统中都表现相同。调适新的血清型以用于最佳的生产和效力似乎并不是微不足道的任务，其需要定制的措施。此前尝试调适rAAV5序列以用于通过BEVS在昆虫细胞中进行生产并不太成功，导致了VP1对衣壳的低并入(Kohlbrenner等人(2005)MolecularTherapy 12(6)：1217-1225；Urabe等人(2006)Journal of Virology 80(4)：1874-1885)。为了避免此问题，Urabe等人生成了嵌合类型的2/5病毒，其含有来自AAV2型的N-末端的136个氨基酸残基以及来自AAV血清型5的剩余部分序列。据报道此种病毒生产良好并且展现出与野生型AAV5类似的效力(Urabe等人(2006)，上文所述文献)。然而，所得的病毒粒是嵌合体而其不代表“真正的”rAAV5血清型。
为了在昆虫细胞中生成具有改善的感染性和/或效力的真正的rAAV5，我们设计了若干衣壳蛋白5突变体。对于感染性而言重要的是要将三种病毒蛋白的化学计量进行平衡。例如，如此前所报道的，我们注意到了缺乏VP1的合成显著影响了载体的效力。另外，我们观察到载体的效力与VP3的高并入负相关(相较于VP1和VP2)。以过量的VP3制备病毒在体外和体内转导细胞方面表现不佳。最后我们构建了真正的(或“真实的”)rAAV5衣壳，其相较于Urabe等人生成的嵌合rAAV5(2006，上文所述文献)而言展现出优越的效力。发现此新衣壳具有平衡的VP化学计量，以及与嵌合AAV2/5相比相似的或优越的效力。
2.方法
2.1.rAAV5载体的生成
通过共感染昆虫细胞系(Protein Sciences Corporation)和三种不同的杆状病毒来生成了rAAV5批次，分别包含衣壳(rAAV5变体库)的表达盒、复制酶和转基因(Seap或因子IX)以及在CMV和LP1启动子的控制下。衣壳表达盒多角体启动子的控制下。Rep表达盒如WO 2009/14445中所描述(BAC.VD183)并且在分别推动Rep78和Rep52表达的ΔE1和多角体启动子的控制下。使用新鲜扩增的杆状病毒母液，以5∶1∶1(Rep∶Cap∶转基因)的体积比感染细胞。在28℃温育72小时后，在28℃用10x溶解缓冲液(1.5MNaCl，0.5M Tris-HCl，1mM MgCl2，1％Triton X-100，pH＝8.5)将细胞溶解一小时。通过用Benzonase在37℃处理1小时来消化基因组DNA。通过以1900xg离心15分钟去除细胞碎片，之后将含有rAAV5颗粒的上清液储存于4℃。使用针对转基因的启动子区域的特异性Q-PCR，在这个称之为粗细胞裂解液中确定载体效价。简言之，通过Q-PCR分析亲和性纯化的载体。用DNAse在37℃处理AAV以降解基因外DNA。继而通过1M NaOH处理将AAV DNA从颗粒释放。在短暂的热处理(30分钟37℃)之后，用等量的1M HCl将碱性环境中和。经中和的样品含有Taqman Q-PCR中使用的AAV DNA。使用下表1所列的引物和探针根据标准程序进行Q-PCR。
2.2.rAAV5载体的纯化
使用AVB琼脂糖(亲和树脂，GE healthcare)通过批次结合方案从粗裂解液纯化rAAV5颗粒。将rAAV5粗细胞裂解液添加至经洗涤(用0.2M HPO4pH＝7.5缓冲液)的树脂。随后，将样品在室温柔和搅拌下温育2小时。温育之后在0.2M HPO4 pH＝7.5缓冲液中洗涤树脂，并通过添加0.2M甘氨酸pH＝2.5来将载体洗脱。所洗脱载体的pH立即通过添加0.5MTris-HClpH＝8.5来进行中和。纯化的rAAV5批次储存在-20℃。纯化的载体经特异性Q-PCR确定效价。
为了生成较高的载体量用于体内研究，使用了经修改的纯化方案。简言之，随着收获之后，将澄清的裂解液通过0.22μm的过滤器(Millipak 60，0.22μm)。接下来，载体颗粒经8ml AVB琼脂糖柱(GE Healthcare)的措施在AKTA Explorer(FPLC chromatographysystem，GE healthcare)上进行了亲和性纯化。用0.2M甘氨酸pH＝2.5将结合的rAAV5颗粒洗脱。洗脱液立即用60mM Tris HCl pH＝7.5中和。借助于100KDa超滤(Millipore)过滤器将中和的洗脱液的缓冲液更换为PBS 5％蔗糖。在0.22μm过滤器(Millex GP)上将终产物过滤，分装并储存在-20℃直至进一步使用。纯化后用特异性Q-PCR确定病毒的效价。
表1.TAQMAN Q-PCR引物
2.3.rAAV5变体的VP蛋白组成
在用Sypro Ruby染色Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶上(Nupage，Life Technologies)确定纯化的rAAV5变体的VP蛋白组成。简言之，将15μl的纯化rAAV5与5μl的4x LDS装载缓冲液(Life technologies)混合，并装载至Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶。将样品在100伏特经电泳分离2小时。在电泳之后将蛋白与10％NaAC/7％EtOH混合30分钟并用Sypro Ruby(Lifetechnologies)染色2小时。继而在UV光下于ImageQuant系统(GE Healthcare)上将VP蛋白显像。
2.4.体外效力
为了研究不同血清型5衣壳变体的体外效力，使用了两个连续的细胞系。此处，用rAAV5变体以各种感染多重性来感染1x105Hela和Huh7。在24-孔平板中以大约80％的铺满按1e5个细胞/孔进行实验。在两个实验中，都以30的感染重复性使用了野生型腺病毒。野生型腺病毒的添加仅适用于体外效力测试，以便将第二链的合成过程加速至约24小时之内，由此使得测定在相对较短的时间段里进行并避免细胞传代的需要。感染开始48小时后，在上清中使用Seap报道基因测定试剂盒(Roche)测量了Seap的表达。在Spectramax L光度计(Molecular devices)上于470nm以1秒的整合时间对发光进行了测量。
2.5.体内效力
为了研究不同血清型5衣壳变体的体内效力，进行了两种不同的实验。简言之，在C57BL/6小鼠中研究了携有Seap报道基因的rAAV5载体构建物159-164的效力。将不同载体以5x1012gc/kg的剂量肌肉内注射至小鼠中。每个组由5只小鼠组成，总共7组包括PBS组。在注射后的2、4和6周获取小鼠血浆，之后处死小鼠。使用来自Roche的Seap报道基因测定试剂盒在血浆中测量了Seap活性。在Spectramax L光度计(Molecular Devices)上于470nm以1秒的整合时间测量了发光。
接下来，将变体AAV5(765)的效力与AAV5(160)和AAV5(92)进行了比较。AAV5(92)受赠于Kotin博士的实验室(Urabe等人，2006)，以2x1012gc/kg和2x1013gc/kg的剂量用都携有FIX作为报道基因的765或160静脉内注射C57BL/6小鼠。在总共7个5只小鼠的组中，每个注射的包括PBS组。在注射后的1、2和4周收集血浆，之后处死小鼠。用因子IX特异性ELISA(VisuLize FIX antigen kit，Kordia)测量了血浆中存在的因子IX蛋白。在450nm与Versamax ELISA平板读取器(Molecular Devices)上测量了光密度。
3.结果
3.1.rAAV5在BEVS中的生成
AAV是哺乳动物病毒，其使用宿主的机构来表达自己的基因，其中有cap基因。在哺乳动物宿主中实现VP1：VP2：VP3的正确化学计量的机制在昆虫细胞中不存在或者不是最佳。因此，Urabe等人开发了对cap多顺反子mRNA的组织进行遗传调整的策略，其导致在昆虫细胞中以正确的化学计量产生AAV2的三种VP(Urabe等人(2002)，上文所述文献)。尝试建立类似的方法来在BEVS中产生rAAV5被证明在实现有效感染颗粒方面是不成功的。不是要受理论局限，这似乎是由VP1对衣壳的低并入所引起的(Urabe等人(2006)，上文所述文献)。由此，Urabe等人在之前2型血清型成功的基础上，将5型VP1的N末端部分替换为2型的部分，以产生感染性的AAV5颗粒(Urabe等人(2006)，上文所述文献)。虽然成功了，但是嵌合的AAV2/5嵌合衣壳并不包含真正的5型颗粒因而与AAV5相比可具有改变的性质，其可代表两种衣壳的组合而不是5型的。
为了使得在昆虫细胞中产生具有改善的感染性和效力的AAV5病毒粒，在本发明中对AAV5的cap5表达盒进行了一系列的遗传学改变(表2)。如此前注意到的(Urabe等人(2006)，上文所述文献)，野生型cap5基因(此处克隆号763)并不支持生成rAAV。在昆虫细胞中缺乏对天然AAV剪接信号的识别最可能导致分离的VP的低表达以及载体产生的缺乏。由于真核核糖体单一取向的从5’至3’读取mRNA，多顺反子cap5 mRNA的第一个翻译起始起点(此处VP1)对于所有三种蛋白的表达是不利的。野生型起始起点由ATG组成，所谓的翻译启动密码子，其不允许核糖体读取并由此阻止了其它两种VP的表达，这导致rAAV生产的缺乏。由于野生型AAV使用核糖体读取来表达VP2(非标准翻译起始起点，ACG)和VP3(ATG)，使我们研究了VP1的翻译起点以及其紧邻的周围，以改变三种VP的表达和/或组装。
此前有报道翻译起点的核苷酸背景对翻起始的强度有影响(Kozak(1987)NucleicAcid Research 15(20)：8125-8148；WO2007/046703)。优选的核苷酸似乎是A在位置(-3)和G在位置(+4)以及AUG分别计为+1、+2和+3(Kozak，上文所述文献；WO2007/046703)。表2详述了引入翻译起始起点的具体改变，其上游和下游的背景以协调三种VP的表达。我们已经研究了原本包围VP2翻译起点的上游起始背景；各种非标准起始密码子(ACG、CTG、TTG，GTG)，各种对+2野生型三联体的改变以及在+1起始三联体和+2野生型三联体之间的插入。涵盖了这些特征的组合的表达盒被用于生成rAAV。
3.2.围绕VP1翻译起始起点的小核苷酸改变对于载体的效力有深厚的影响
成功生成了表2中所列的携有cap5表达盒的所有变体的杆状病毒构建物。随后，这些杆状病毒构建物与携有Rep和转基因(报道基因例如SEAP或FIX)的杆状病毒的组合被用于生成rAAV。一些测试的构建物虽然经多次尝试却并未支持生成rAAV的生产。这包括野生型AAV5(构建物763)和一些携有非标准起点的构建物：TTG(构建物764)、GTG(构建物766)。表2中所列的所有其它构建物导致成功生成rAAV。
分离了成功产生的rAAV 5型变体的三种病毒蛋白(VP)。通过纯化载体的电泳分离(SDS-PAGE)研究了该三种VP的化学计量(图1和6)。显然引入cap5基因表达盒的小修改对三种VP蛋白的表达和/或组装有深厚的影响，这在衣壳的组成中的到了反映。我们已经注意到了血清型5衣壳对昆虫细胞的调适，也即通过引入非标准起始密码子(ACG)以及9个核苷酸的上游背景CCTGTTAAG(由Urabe等人报道，作为允许昆虫细胞生产血清型2的修改)，导致了VP1的低并入(低VP1/VP2比例)以及有过量水平的VP3并入至衣壳(高VP3/VP1比例)，这造成了三种VP的异常化学计量(图1，构建物159)。类似地，核苷酸+4修改为构成G以及组装更近的常规Kozak序列，这导致了位置+2的丝氨酸更换为丙氨酸(构建物161)，造成VP1的低并入以及VP3的高并入(低VP1/VP2高VP3/VP1)。使用不同的非标准密码子CTG与上游的CCTGTTAAG和下游的修改组合，也即将+4核苷酸改变为A(构建物162)，或+4-5改为AG(构建物164)或者插入ACT作为第二个三联体而将原始的+2三联体改为AGC(构建物163)并未改善VP1并入衣壳，造成了低VP1/VP2高VP3/VP1。显示出接近1的VP1/VP2比例的一个构建物是构建物160，其涵盖了直接上游插入的CCTGTTAAG，非标准ACG和在位置+2插入GCT编码的丙氨酸(相较于野生型序列)，虽然VP3的并入依然过量(想等的VP1/VP2高VP2/VP1)。随后，将构建物160中的启动子序列突变，从而使其更准确地组装野生型多角体蛋白启动子。这产生了突变体761。去除了VP2的起始背景创建了突变体762。在两种情况中(761和762)与构建物160比较都对病毒的化学计量有轻微的负面影响(较低的VP1并入)(图1)。接下来，将构建物160中的VP1翻译起始起点位点(为了保留翻译起始密码子直接上游的有益GCT)改变为野生型ATG(突变体763)、TTG(突变体764)、CTG(突变体765)、GTG(突变体766)。除了765突变体外所有其它的突变体都导致了缺乏可检测的rAAV产生。有趣的是，CTG作为非标准VP1起始起点以及紧随翻译起始之后添加GCT三联体(编码额外的丙氨酸)的组合(765)导致了VP1的并入高于VP2以及VP3的大量衰减，最终造成平衡的类似野生型AAV的VP化学计量(高VP1/VP2中等VP3/VP1)。最后，构建物43，其类似于构建物160具有CTG作为VP1启动密码子(代替ACG)，导致了VP1以近乎天然的VP比例产生(图6)。
3.3.VP3的过多表达造成了真实的5型AAV突变体在BEVS中的低效力。
为了研究具有不同VP化学计量的血清型5衣壳库的效力，也即，载体推动其遗传材料表达的能力，进行了体外和体内的研究。使用了两种不同的连续细胞系也即Hela(图2和图7A)和Huh7(图3和图7B)。在两种情况中，突变体组都显示出VP1的并入低于VP2以及VP3的过量并入(构建物159，161-164)，显示出降低的效力(图2-3)。通过平衡VP1和VP2的并入大大改善了载体的效力(构建物160)。缩短启动子(构建物761)以及去除起始子的构建物(构建物762)对载体效力有负面影响。最有效力的载体，构建物765(图2-3)显示出有利于前者的VP1对VP2比例以及显著降低的VP3并入。最后，polH启动子(未缩短)与起始子构建物、CTG启动密码子和额外的GCT三联体(编码额外的丙氨酸)的组合(构建物43)显示出良好的效力，虽然有些低于构建物765的效力(图7A和B)。
在体内测试了突变体的亚集(构建物159-164)的效力(C57BL/6小鼠)。所述载体携有报道基因SEAP。小鼠以5e12gc/kg的剂量注射了衣壳5变体并及时监测。与体外的观察一致，在所测试的集合中显示出最佳效力的变体(160)也具有等摩尔量的VP1/VP2(图4)。
3.4.昆虫细胞产生的真正的AAV5(765)在体内表现优于嵌合类型的2/5突变体
为了研究AAV5(765)在体内的效力，制备了三个载体批次。这些包括嵌合类型2/5(92)(Urabe等人(2006)，上文所述文献)，含有过量VP3的真正类型的AAV5(160)和体外表现最佳的具有野生型VP化学计量的真正的5型AAV(765)。所有的批次都在相同条件下使用携有Rep蛋白和FIX表达盒的杆状病毒构建物来产生(如WO 2006/36502中所描述)。为了比较三种载体制备物的效力，向黑色的6只小鼠注射了两种不同计量的载体，也即低剂量2e12gc/kg和高计量2e13gc/kg。实验中包含了包括载剂组的总共7个组(每个由5只动物组成)。在实验起始之后，在第1、2和4周收集血液。通过特异性ELISA的手段在血液中监测FIX的表达。结果支持了此前体外的发现，新生成的765突变体显示出比160构建物显著改善的效力。有趣的是，765构建物也显著优于2/5型嵌合体(构建物92)由Urabe等人发表(2006)(上文所述文献)(图5)。使用未匹配的t检验来研究765对比160以及765对比92的差异。在所有情况中(也即第1、2和4周)具有统计学显著的差异，p值＜0,05。
4.讨论
在昆虫细胞中生成rAAV需要对cap基因的遗传组织进行许多调整。在哺乳动物细胞中，AAV通过利用可变剪接以及VP2利用不佳的ACG起始子而从单一的开放读框表达其VP蛋白。这导致了1∶1∶10的VP1∶VP2∶VP3化学计量。在昆虫细胞中这些机制未能产生具有正确VP化学计量的AAV载体(Urabe等人(2002)，上文所述文献)。这是已知的问题，Urabe等人已经对其进行了克服，通过将VP1起始子三联体更换为ACG以及通过将翻译起始起点位点上游的9个核苷酸突变从而生成了rAAV2血清型。这些改变导致了以正确的化学计量产生了所有三种rAAV2 VP。在rAAV5表达盒中的相似遗传改变导致了低VP1产生以及所产生病毒的低效力。在rAAV2成功的遗传调适的基础上，Urabe等人决定制备一系列的6个结构域交换突变体，其中rAAV5接受了来自AAV2的VP1的各种长度的N-末端部分(范围从7个氨基酸直至136个氨基酸)。此方式导致产生了嵌合rAAV5，其显示出正确的VP化学计量。此外，结构域交换突变体，导致了与293T细胞中产生的rAAV5或者更优越的效力(Urabe等人(2006)，上文所述文献)。虽然，Urabe等人证明了嵌合rAAV5可以从昆虫细胞中生成，但是所得的载体不包含真正的AAV5颗粒，因而可以在各个方面有差异，如对于预先存在的中和抗体的易感性、胞内运输、生物分布和/或靶向真正的AAV5血清型。同时Urabe等人报道了产生感染性的真正rAAV5的尝试，由于VP1多肽的低合成而失败了(Urabe等人(2006)，上文所述文献)。
此处我们已经构建了cap5突变体的库，目的在于理解昆虫细胞中产生的真正rAAV5低效力背后的决定因素。首先，我们已经检验了加入此前成功用于在昆虫细胞中生成rAAV2的许多调适的突变体(159)(Urabe等人(2002)，上文所述文献)。此突变体含有VP2起始子临近序列上游的9核苷酸替代了VP1翻译起始和非标准翻译起始起点ACG的上游。此9个核苷酸此前由Urabe等人用来在昆虫细胞中表达血清型2基因(Urabe等人(2002)，上文所述文献)。此特定序列天然存在于VP2的非标准起始密码子(ACG)的旁侧。接下来，将野生型ATG替换为ACG或者CTG，并且为了提供起始密码子最佳的下游背景，引入了各种突变。大部分的突变体显示出异常的VP化学计量，其中VP1并入偏低以及存在过量的VP3(低VP1/VP2和高VP3/VP1比例)。在遗传设计160中大大改善了VP1/VP2比例，然而依然显示出过量的VP3并入了载体颗粒。最终，一种遗传设计也即765显示出了高VP1并入(高VP1/VP2比例)以及与其它经测试变体相比降低的VP3并入(平衡的VP3/VP2比例)。
低比例的VP1/VP2蛋白之前曾被推定是造成低载体效力的原因(Hermonat等人(1984)Journal of Virology 51(2)：329-339；Tratschin等人(1984)Journal ofVirology 51(3)：611-619)。AAV独特的VP1部分被包埋在衣壳内部并在病毒于胞内运输至细胞核时暴露出来。其首先是作内涵体的腔中pH降低的结果而得以暴露的。VP1游离的N末端部分含有磷脂酶结构域，其在暴露于衣壳之外时会变成可用的水解酶特异于磷底物的2-酰基酯(sn-2)键，导致释放溶血磷脂和游离脂肪酸，接着使得AAV可以胞内体逃逸。VP1的独特部分含有核定位信号(碱性氨基酸簇)并且与AAV的核靶向相关联。最后，一些作者提议VP1的独特部分可以在病毒于核内的脱壳中发挥作用。低VP1/VP2比例以及过量的VP3并入病毒颗粒(高VP3/VP1比例)可导致1)平均减少的VP1并入组装的颗粒中或者2)生成两种颗粒群体A)正确组装的颗粒(具有接近野生型的化学计量1∶1∶10，也即每个载体颗粒5个VP1分子)B)仅有VP3/VP2的颗粒。在两种情况中(1和2)，此种载体都会具有改变的效力。载体制备物中存在的过量的VP3蛋白(与VP1或VP2相比)可能会导致载体运输至核受损(由于受干扰的胞内体逃逸)。为了测试VP化学计量对载体效力具有决定性的假说，以及为了生成更有效力的载体，在体外和体内测试了血清型5衣壳的突变体库。
看起来VP的化学计量与载体的效力具有良好的关联。如之前所示(Hermonat等人(1984)，上文所述文献；Tratschin等人(1984)，上文所述文献；WO2007046703A2)，低VP1/VP2比例对于病毒的效力有强烈的影响。突变体159、161-164全都显示出低VP1/VP2比例以及显著降低的效力。VP1/VP2之间改善的比例对载体的效力有显著影响(160)。有趣的是，进一步改善VP1/VP2比例并降低VP3对载体颗粒的并入(降低VP3/VP1比例)，导致生成了改善的载体43以及所测试集合中最有效力的载体(构建物765)。此数据清楚地表明载体颗粒的分子构成对于其效力起决定作用。改善VP1的并入以及同时减少VP3似乎提供了在载体效力方面的最佳结果。此前已有报道，在BEVS中生成的颗粒的低VP1/VP2比例，对载体效力有负面影响。VP2/VP3的比例目前还未予以考虑，主要是由于其用于在BEVS中生产的遗传设计与野生型AAV病毒相同。由此，预期其不会导致改变的VP2/VP3比例。然而，基于本文给出的所有突变体中的一种，我们观察到过量并入载体颗粒的的VP3(高VP3/VP1比例)表明，VP1翻译起始周围的改变对VP2和VP3的表达有强烈的影响。只有突变体765显示出平衡的化学计量，其具有高VP1/VP2比例和降低的VP3并入，这导致效力与其它经测试变体相比得以提高。另外，在体内(小鼠)将765变体的效力与BEVS中产生的类AAV5载体(构建物92)相比。所述92构建物是AAV血清型5与血清型2的N末端136个氨基酸部分的嵌合体(Urabe等人(2006)，上文所述文献)。虽然构建物92并不包含真正的AAV5，但是其是目前用于在BEVS中生成类AAV5颗粒的唯一选择。所述765构建物显示出相对于构建物92在统计学上显著的优越性。
我们假设VP1翻译的诱变改变对下游VP2和VP3表达的强烈影响的原因在于，翻译过程本身。翻译在真核中是单一取向的并从mRNA的5’起始。核糖体一旦与mRNA结合，则向前进行直至在适宜的背景下找到翻译ATG起始，以开始蛋白合成。有时弱的起始起点例如ACG或CTG，如果周围有适宜的核苷酸背景的话，可以非标准的方式开始蛋白合成。此机制称作渗漏核糖体扫描。AP1处渗漏核糖体扫描的强度将决定核糖体“渗漏”至VP2和VP3的部分以及蛋白从后二者表达的强度。继而所有三种组分的表达将决定其在最终组装的衣壳中的存在。
Claims (16)
1.核酸分子，其具有包含开放读框的核苷酸序列，其中所述开放读框以5’至3’的顺序包含：
(i)第一密码子，其是选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子；
(ii)第二密码子，其编码选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基；
(iii)任选存在的，跟随所述第二密码子之后的编码额外氨基酸残基的一或多个密码子；和，
(iv)编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的序列，其中该序列仅仅缺少VP1翻译启动密码子。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV血清型5、AAV血清型8、或AAV血清型9衣壳蛋白，优选其中所述衣壳蛋白具有选自SEQ ID NO：22、28、30、71和73的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的核酸分子，其中所述第二密码子编码丙氨酸。
4.权利要求1或2的核酸分子，其中所述第二密码子选自GCT、GCC、GCA、GCG和GGU，优选其中所述密码子为GCT。
5.核酸构建物，其包含权利要求1-4任一项的核酸分子，其中所述编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的读框的核苷酸序列可操作地连接至用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列。
6.权利要求5的核酸构建物，其中所述读框的核苷酸序列可操作地连接至选自以下组的启动子：多角体启动子、p10启动子、4xHsp27 EcRE+最小Hsp70启动子、ΔE1启动子、E1启动子。
7.权利要求5或6的核酸构建物，其中所述构建物是昆虫相容性载体，优选杆状病毒载体。
8.权利要求5-7任一项的核酸构建物，其中所述核酸分子包含选自以下组的开放读框：SEQ ID NO：51、69、42、47、48和50，优选SEQ ID NO：51。
9.昆虫细胞，其包含权利要求5-8任一项的核酸构建物。
10.权利要求9的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞还包含：
(a)第二核苷酸序列，其包含至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；
(b)第三核苷酸序列，其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep78或Rep68编码序列；
(c)任选存在的，第四核苷酸序列，其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep52或Rep40编码序列。
11.权利要求10的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞包含：
(a)权利要求5-8任一项的核酸构建物，其中所述第一核酸构建物还包含权利要求10的(b)和(c)中所定义的第三和第四核苷酸序列；和，
(b)第二核酸构建物，其包含权利要求10的(a)中所定义的第二核苷酸序列，其中所述第二核酸构建物优选是昆虫细胞-相容性载体，更优选杆状病毒载体。
12.权利要求10-11任一项的昆虫细胞，其中第二核苷酸序列还包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中表达)，并且其中所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列并入至昆虫细胞中产生的AAV血清型5的基因组中，优选其中第二核苷酸序列包含两个AAV ITR核苷酸序列，并且其中所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列位于两个AAV ITR核苷酸序列之间。
13.权利要求10的昆虫细胞，其中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列以及任选存存的第四核苷酸序列被稳定整合至昆虫细胞的基因组中。
14.AAV病毒粒，在其基因组中包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列，其中所述至少一个核苷酸序列不是天然AAV核苷酸序列，并且其中所述AAV VP1衣壳蛋白从N末端到C末端包含：
(i)第一氨基酸残基，其由翻译启动密码子编码，优选是由选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子编码；
(ii)第二氨基酸残基，其选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；
(iii)任选存在的，跟随所述第二氨基酸残基的一或多个额外的氨基酸残基；和，
(iv)AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列，其中该序列仅缺乏由VP1翻译启动密码子所编码的氨基酸残基。
15.用于在昆虫细胞中产生AAV的方法，其包括以下步骤：(a)在产生AAV的条件下培养权利要求9-13任一项所定义的昆虫细胞；和任选地(b)回收所述AAV。
16.权利要求14的AAV病毒粒，其中所述感兴趣基因产物编码因子IX或因子VIII蛋白。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |