JP6683397B2 - 昆虫細胞で産生される、さらに改善されたａａｖベクター - Google Patents

Description

本発明は、昆虫細胞でのアデノ随伴ウイルスの産生、及び感染性の改善をもたらすアデノ随伴ウイルスに関する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子治療のための、最も有望なウイルスベクターのうちの１つと考えることができる。ＡＡＶは、分裂ヒト細胞のほか、非分裂ヒト細胞にも効率的に感染する能力を有し、ＡＡＶウイルスゲノムは、宿主細胞のゲノムの単一の染色体部位へと一体化するが、最も重要なことは、ＡＡＶは、多くのヒトにおいて存在するが、いかなる疾患とも関連したことがないことである。これらの利点に照らし、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、Ｂ型血友病、悪性黒色腫、嚢胞性線維症、及び他の疾患のための遺伝子治療の臨床試験において査定されつつある。多数の臨床試験及び欧州で最初の遺伝子治療薬である、アリポジーンチパルボベック（グリベラ（Ｇｌｙｂｅｒａ）（登録商標）、ユニキュア（ｕｎｉＱｕｒｅ）社）に対する近年の承認により、ＡＡＶが臨床的実践の支柱となることが有望視されている。

一般に、組換えＡＡＶのための２つの主要な種類の産生系が存在する。一方では、哺乳動物細胞型（２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞など）の従来型の産生系が存在するが、他方では、より近年になって、昆虫細胞を使用する産生系が開発されている。

哺乳動物産生系は、複数の欠点を抱えているが、そのうち、治療における使用にとって最も重要な欠点は、細胞１個当たりに作り出されるｒＡＡＶ粒子の数が限定されていることである（粒子１０^４個の桁数（Ｃｌａｒｋ、２００２、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、６１（補遺１）：９〜１５において総説されている））。臨床研究には、１０^１５個を超えるｒＡＡＶ粒子が要求される場合がある。この数のｒＡＡＶ粒子を産生させるには、１７５ｃｍ^２のフラスコ５，０００本等量の細胞である、約１０^１１個の培養ヒト２９３細胞を伴うトランスフェクション及び培養が要求されようが、これは、最大１０^１１個の２９３細胞にトランスフェクトすることを意味する。従って、ｒＡＡＶの大スケールの産生であって、哺乳動物細胞培養系を使用して、臨床試験のための材料を得る産生は、既に問題含みであり、市販スケールでの産生は、実現可能でさえない場合がある。さらに、哺乳動物細胞培養物中で産生される臨床使用のためのベクターは、哺乳動物宿主細胞に存在する、所望されない、おそらくは病原性の材料により汚染される危険性も常に存在する。

哺乳動物産生系のこれらの問題を克服するために、昆虫細胞を使用するＡＡＶ産生系が開発されている（Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１３：１９３５〜１９４３；米国特許出願公開第２００３０１４８５０６号及び米国特許出願公開第２００４０１９７８９５号）。昆虫細胞のＡＡＶの産生のため、３つのＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）の正確な当量比を達成するためには、何らかの修飾が必要であったが、これは、２つのスプライスアクセプター部位の交互の利用と、昆虫細胞では正確に複製されない、ＶＰ２のためのＡＣＧ開始コドンの次善の活用との組合せに依拠する。昆虫細胞で、カプシドタンパク質の正確な当量比を模倣するために、Ｕｒａｂｅら（２００２、前出）は、スプライシングの要求なしに、３つのＶＰタンパク質全てを発現させることが可能な、単一のポリシストロニックのメッセンジャーへと転写される構築物を使用しているが、この場合、最も上流のイニシエーターコドンは、次善のイニシエーターコドンであるＡＣＧで置きかえられている。

国際公開第ＷＯ２００７／０４６７０３号は、昆虫細胞のＡＡＶカプシドタンパク質の当量比の最適化による、バキュロウイルスで産生されたｒＡＡＶベクターの感染性のさらなる改善について開示している。

Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら（２００５、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１２：１２１７〜２５）は、Ｕｒａｂｅらにより使用されている、２つのＲｅｐタンパク質の発現のためのバキュロウイルス構築物が、固有の不安定性を抱えていることについて報告した。Ｕｒａｂｅによる元のベクターの２つのＲｅｐ遺伝子のパリンドローム配向を２つに分け、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８を発現させるための、２つの個別のバキュロウイルスベクターをデザインすることにより、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら（２００５、前出）は、ベクターの継代培養安定性を増大させた。しかし、昆虫細胞の、２つの独立のバキュロウイルス−Ｒｅｐ構築物からの、少なくとも５代の継代培養にわたる、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２の着実な発現にも拘らず、ｒＡＡＶベクターの収率は、Ｕｒａｂｅら（２００２、前出）によりデザインされた、元のバキュロウイルス−Ｒｅｐ構築物と比較して、５分の１〜１０分の１である。

国際公開第ＷＯ２００９／０１４４４５号は、示差的なコドンバイアスを伴うコード配列の反復を使用することにより、バキュロウイルスベースのｒＡＡＶベクターの産生時における安定性を改善するための代替法を提示する。

Ｕｒａｂｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００６、８０（４）：１８７４〜１８８５）は、ＶＰ１カプシドタンパク質の開始コドンとしてＡＣＧを使用してバキュロウイルス系で産生されたＡＡＶ５粒子の感染性は低度であり、（ＶＰ１をＡＣＧ開始コドンから発現させるＡＡＶ２とは対照的に）ＡＡＶ５ ＶＰ１コード配列の＋４位をＧ残基へと突然変異させても、感染性は改善されなかったことについて報告している。Ｕｒａｂｅらは、キメラＡＡＶ２／５ ＶＰ１タンパク質を構築することにより、この問題に取り組んだが、そこでは、ビリオンの感染性を改善するために、ＡＡＶ５ ＶＰ１のうちの少なくとも４９アミノ酸のＮ末端部分が、ＡＡＶ２ ＶＰ１の対応する部分で置きかえられている。従って、当技術分野では、ＡＣＧ開始コドンから発現させるＡＡＶ５ ＶＰ１であって、広範にわたる修飾を伴わずに感染性を保持するＡＡＶ５ ＶＰ１が、依然として必要とされている。

しかし、本発明者らは、ＡＡＶベクター、特に、Ｕｒａｂｅ（Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１３：１９３５〜１９４３）、国際公開第ＷＯ２００７／０４６７０３号、又は国際公開第ＷＯ２００９／０１４４４５号に従い修飾され、バキュロウイルス系で産生される、非キメラＡＡＶ５ベクターなどのＡＡＶ５ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究及びマウスによるｉｎ ｖｉｖｏ研究において、例えば、従来の哺乳動物２９３細胞で産生された、対応するＡＡＶベクターと比較して、感染性の低減を示すことを見出した。よって、感染性を改善したｒＡＡＶベクターのための、バキュロウイルスベースの産生系が、依然として必要とされている。

第１の態様では、本発明は、オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を有し、リーディングフレームが、５’から３’の順序で
（ｉ）ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される、次善の翻訳開始コドンである第１のコドンと、
（ｉｉ）アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする第２のコドンと、
（ｉｉｉ）任意選択で、第２のコドンに続く、さらなるアミノ酸残基をコードする１又は複数のコドンと、
（ｉｖ）ＶＰ１翻訳開始コドンだけを欠く、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードする配列と
を含むか又はこれらからなる、
核酸分子に関する。

好ましい実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型８、又はＡＡＶ血清型９カプシドタンパク質であり、より好ましくは、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２２、２８、３０、７１、及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせた、さらに好ましい実施形態では、第２のコドンは、アラニンをコードする。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせた、さらに好ましい実施形態では、第２のコドンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、及びＧＧＵからなる群から選択され、好ましくは、コドンは、ＧＣＴである。

第２の態様では、本発明は、本発明に従う核酸分子を含み、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするリーディングフレームのヌクレオチド配列が、昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されている、核酸構築物に関する。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせた、さらに好ましい実施形態では、リーディングフレームのヌクレオチド配列は、ポリヘドロン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター、ｐ１０プロモーター、４×Ｈｓｐ２７ ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーター、デルタＥ１プロモーター、Ｅ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。本発明の好ましい実施形態では、構築物は、昆虫適合性ベクター、好ましくは、バキュロウイルスベクターである。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせて、核酸分子は、配列番号５１、６９、４２、４７、４８、及び５０、好ましくは、配列番号５１又は配列番号６９、より好ましくは、配列番号５１からなる群から選択されるオープンリーディングフレームを含む。

第３の態様では、本発明は、本発明に従う核酸構築物を含む昆虫細胞に関する。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせた、さらに好ましい実施形態では、昆虫細胞は、（ａ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列と、（ｂ）昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第３のヌクレオチド配列と、（ｃ）任意選択で、昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第４のヌクレオチド配列とをさらに含む。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせた、さらに好ましい実施形態では、昆虫細胞は、（ａ）上記で規定された第３及び第４のヌクレオチド配列をさらに含む、本発明に従う第１の核酸構築物と、（ｂ）上記で規定された第２のヌクレオチド配列を含み、好ましくは、昆虫細胞適合性ベクター、より好ましくは、バキュロウイルスベクターである、第２の核酸構築物とを含む。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせた、さらに好ましい実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（哺乳動物細胞で発現させるための）をさらに含み、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、昆虫細胞で産生されるＡＡＶ血清型５のゲノムへと組み込まれている。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせた、さらに好ましい実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列の間に配置されている。

代替的に、又は任意の先行する実施形態と組み合わせた、さらに好ましい実施形態では、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列と、第３のヌクレオチド配列と、任意選択で、第４のヌクレオチド配列とは、昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれている。

第４の態様では、本発明は、ゲノムに、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つのヌクレオチド配列が、好ましくは、天然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
（ｉ）翻訳開始コドン、好ましくは、ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される次善の翻訳開始コドンによりコードされる、第１のアミノ酸残基と、
（ｉｉ）アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択される第２のアミノ酸残基と、
（ｉｉｉ）任意選択で、第２のアミノ酸残基に続く、１又は複数のさらなるアミノ酸残基と、
（ｉｖ）ＶＰ１翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基だけを欠く、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列と
を含むか又はこれらからなる、ＡＡＶビリオンに関する。

本発明に従うＡＡＶビリオンは、第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする、目的の遺伝子産物を含むことが好ましい。

第５の態様では、本発明は、ＡＡＶを昆虫細胞で産生させるための方法であって、（ａ）本発明に従う昆虫細胞を、ＡＡＶが産生されるような条件下で培養するステップと、任意選択で、（ｂ）ＡＡＶを回収するステップとを含む方法に関する。

レポーター導入遺伝子ＳＥＡＰを持つ多様な突然変異体カプシドを、精製し、ＮｕＰａｇｅゲルで分解したことを示す図である。３つのカプシドタンパク質である、ＶＰ１（８７ｋＤａ）、ＶＰ２（７２ｋＤａ）、及びＶＰ３（６２ｋＤａ）を示す。 Ｈｅｌａ細胞における、ｓｅａｐ発現カセットを保有する多様なＡＡＶ５カプシド突然変異体についての、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイを示す図である。レポーター遺伝子の活性は、光の放射として間接的に測定し、ＲＬＵ（相対光単位）として表す。ＮＴＣ＝陰性対照である。 Ｈｕｈ７細胞における、ｓｅａｐ発現カセットを保有する多様なＡＡＶ５カプシド突然変異体についての、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイを示す図である。レポーター遺伝子の活性は、光の放射として間接的に測定し、ＲＬＵ（相対光単位）として表す。ＮＴＣ＝陰性対照である。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ｓｅａｐ発現カセットを保有する多様なカプシド突然変異体についての、ｉｎ ｖｉｖｏ効力アッセイを示す図である。レポーター遺伝子の活性は、光の放射として間接的に測定し、ＲＬＵ（相対光単位）として表す。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＦＩＸ発現カセットを保有する多様なＡＡＶ５カプシド突然変異体についての、ｉｎ ｖｉｖｏ効力アッセイを示す図である。ＦＩＸの発現は、マウスにおいて、２つの異なるベクター、すなわち、カプシド変異体１６０及びカプシド変異体７６５を投与したときにモニタリングした。いずれのカプシドも、ＦＩＸ発現カセットを保有する。ＦＩＸは、注射後１、２、及び４週目において、特異的ＥＬＩＳＡを介して、血漿中で測定する。ＩＵ／ｍｌとは、１ｍｌの血漿中で見出されるＦＩＸタンパク質についての国際単位を表す。ＰＢＳ＝リン酸干渉生理食塩液である。 レポーター導入遺伝子ＳＥＡＰを持つ突然変異体カプシドを精製し、ＮｕＰａｇｅゲルで分解して、３つのカプシドタンパク質である、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を示したことを示す図である。構築物４３の３つのクローンを示す。 ＨｅＬａ細胞（Ａ）及びＨｕｈ７細胞（Ｂ）にｓｅａｐ発現カセットを保有する多様なＡＡＶ５カプシド突然変異体についての、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイを示す図である。レポーター遺伝子の活性は、光の放射として間接的に測定し、ＲＬＵ（相対光単位）（ａ．ｕ．：任意単位）として表す。

定義
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、ポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントの、機能的関係における連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されている」。例えば、転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が、連続配列であることが典型的であり、２つのタンパク質コード領域を接合することが必要な場合、連続配列であり、リーディングフレームにあることを意味する。

「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列が、ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節する場合、発現制御配列は、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」。従って、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前方の開始コドン、イントロンのためのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含みうる。「発現制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が、発現に影響を及ぼすようにデザインされている配列を含むことを意図するが、また、さらなる有利な構成要素も含みうる。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は、発現制御配列である。「発現制御配列」という用語はまた、フレーム内外の、所望されない、潜在的な開始コドンを、配列から除去するような、核酸配列のデザインも含みうる。この用語はまた、所望されない、潜在的なスプライス部位を除去するような、核酸配列のデザインも含みうる。この用語は、ポリＡテール、すなわち、ｍＲＮＡの３’末端におけるアデニン残基の連なりである、ポリＡ配列と称する配列の付加を方向づける配列又はポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。発現制御配列はまた、ｍＲＮＡの安定性を増強するようにデザインすることもできる。昆虫細胞では、転写及び翻訳の安定性に影響を及ぼす発現制御配列、例えば、プロモーターのほか、翻訳を実行する配列、例えば、コザック配列が公知である。発現制御配列は、それが作動可能に連結されたヌクレオチド配列を、低発現レベル又は高発現レベルを達成するようにモジュレートするような性質でありうる。

本明細書で使用される「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、１又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に照らして上流に配置され、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位、並びに転写因子結合性部位、リプレッサータンパク質結合性部位及びアクチベータータンパク質結合性部位、及びプロモーターからの転写の量を、直接的又は間接的に調節するように作用することが当業者に公知である、他の任意のヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、他の任意のＤＮＡ配列のための結合部位の存在により構造的に同定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターとは、大半の生理学的条件下及び発生学的条件下にある大半の組織で活性のプロモーターである。「誘導的」プロモーターとは、例えば、化学的誘導剤の適用により、生理学的又は発生学的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特異的種類の組織又は細胞だけで活性である。

「実質的に同一な」、「実質的同一性」、又は「本質的に類似の」、又は「本質的類似性」という用語は、デフォルトのパラメータを使用する、ギャップ（ＧＡＰ）プログラム又はベストフィット（ＢＥＳＴＦＩＴ）プログラムなどにより、最適に配列決定される場合の、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列が、本明細書の別の箇所で定義される、少なくともある特定の百分率の配列同一性を共有することを意味する。ギャップでは、マッチの数を最大化し、ギャップの数を最小化して、それらの全長にわたり、２つの配列を配列決定するのに、ニードルマン及びヴンシュによるグローバルアライメントアルゴリズムを使用する。一般に、ギャップ創出ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）とし、ギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）とする、ギャップによるデフォルトのパラメータを使用する。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトのスコアリング行列は、ｎｗｓギャップＤＮＡ（ｎｗｓｇａｐｄｎａ）であり、タンパク質では、デフォルトのスコアリング行列は、ブローサム６２（Ｂｌｏｓｕｍ６２）である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ、８９、９１５〜９１９）。ＲＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と本質的に類似であるか、又はある特定の程度の配列同一性を有するという場合、ＤＮＡ配列のチミン（Ｔ）を、ＲＮＡ配列のウラシル（Ｕ）と等価であると考えることが明らかである。配列アライメント及び配列同一性百分率についてのスコアは、アクセルリス社（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１−３７５２ ＵＳＡ）製のＣＣＧウィスコンシンパッケージバージョン１０．３（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３）、又はオープンソースソフトウェアであるＥｍｂｏｓｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（最新バージョン：２．７．１−０７）などのコンピュータープログラムを使用して決定することができる。代替的に、類似性パーセント又は同一性パーセントは、ファスタ（ＦＡＳＴＡ）、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）などのデータベースに照らして検索することにより決定することもできる。

本発明のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、配列番号１のヌクレオチド配列と、中程度のハイブリダイゼーション条件下、又は、好ましくは、厳密なハイブリダイゼーション条件下のそれぞれでハイブリダイズするそれらの能力により定義することもできる。本明細書では、厳密なハイブリダイゼーション条件を、少なくとも約２５、好ましくは、約５０ヌクレオチド、７５又は１００ヌクレオチドであり、最も好ましくは、約２００又はこれを超えるヌクレオチドの核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液中、好ましくは、６倍濃度のＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する他の任意の溶液中、約６５℃の温度でハイブリダイズすること、及び約０．１Ｍ又はこれ未満の塩を含む溶液中、好ましくは、０．２倍濃度のＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する他の任意の溶液中、６５℃で洗浄することを可能とする条件として定義する。ハイブリダイゼーションは、一晩にわたり、すなわち、少なくとも１０時間にわたり実施することが好ましく、洗浄は、少なくとも２回にわたり洗浄液を交換して、少なくとも１時間にわたり実施することが好ましい。これらの条件は通例、約９０％又はこれを超える配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能とするであろう。

本明細書では、中程度の条件を、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは、約２００又はこれを超えるヌクレオチドの核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液中、好ましくは、６倍濃度のＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する他の任意の溶液中、約４５℃の温度でハイブリダイズすること、及び約１Ｍの塩を含む溶液中、好ましくは、６倍濃度のＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する他の任意の溶液中、室温で洗浄することを可能とする条件として定義する。ハイブリダイゼーションは、一晩にわたり、すなわち、少なくとも１０時間にわたり実施することが好ましく、洗浄は、少なくとも２回にわたり洗浄液を交換して、少なくとも１時間にわたり実施することが好ましい。これらの条件は通例、最大５０％の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能とするであろう。当業者は、５０〜９０％の間で同一性が変化する配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を改変することが可能であろう。
発明の詳細な説明

本発明は、動物性パルボウイルスの使用であって、特に、哺乳動物細胞の核酸の導入及び／又は発現のためのベクターとしての使用のための、感染性ヒトＡＡＶ又は感染性サルＡＡＶ、及びこれらの構成要素（例えば、動物性パルボウイルスゲノム）などのディペンドウイルスの使用に関する。特に、本発明は、昆虫細胞で産生される場合の、このようなパルボウイルスベクターの感染性の改善に関する。

パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスは、小型の動物性ＤＮＡウイルスである。パルボウイルス科は、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）と、昆虫に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）とに分けることができる。本明細書では、パルボウイルス亜科のメンバーを、パルボウイルスと称し、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属を含む。それらの属の名称から推定されうる通り、ディペンドウイルス属のメンバーは、それらが通例、細胞培養物中の産生性感染のために、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスによる共感染を要求するという点で固有である。ディペンドウイルス属は、通常ヒトに感染するＡＡＶ（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３）、又は通常霊長動物に感染するＡＡＶ（例えば、血清型１及び４）、及び他の温血動物に感染する類縁のウイルス（例えば、ウシ科動物アデノ随伴ウイルス、イヌ科動物アデノ随伴ウイルス、ウマ科動物アデノ随伴ウイルス、及びヒツジ科動物アデノ随伴ウイルス）を含む。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーについてのさらなる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、６９章、「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（３版、１９９６）において記載されている。簡便さのため、本明細書では、ＡＡＶに言及することにより、本発明をさらに例示し、記載する。しかし、本発明は、ＡＡＶに限定されず、他のパルボウイルスにも同等に適用されうることが理解される。

公知のＡＡＶ血清型全てのゲノム構成は、極めて類似している。ＡＡＶのゲノムは、約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の長さである、直鎖状、一本鎖のＤＮＡ分子である。逆位末端反復配列（ＩＴＲ）は、非構造的複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造的（ＶＰ）タンパク質の、固有のコードヌクレオチド配列を挟む。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）は、カプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは、自己相補性であり、Ｔ字型ヘアピンを形成する、エネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成されうるように構成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製のための起点として機能し、細胞内ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして用いられる。哺乳動物細胞のｗｔＡＡＶの感染の後、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）は、それぞれ、Ｐ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現し、いずれのＲｅｐタンパク質も、ウイルスゲノムの複製において機能を果たす。Ｒｅｐ ＯＲＦのスプライシングイベントの結果として、実際には４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）の発現がなされる。しかし、哺乳動物細胞では、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする、非スプライシングｍＲＮＡでも、ＡＡＶベクターの産生には十分であることが示されている。また、昆虫細胞でも、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質で、ＡＡＶベクターの産生に十分である。３つのカプシドタンパク質である、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３は、ｐ４０プロモーターにより、単一のＶＰリーディングフレームから発現する。カプシドタンパク質産生のための、哺乳動物細胞のｗｔＡＡＶの感染は、２つのスプライスアクセプター部位の交互の利用と、ＶＰ２のためのＡＣＧ開始コドンの次善の活用との組合せに依拠する。しかし、ＡＣＧ開始コドンは、昆虫細胞では正確に複製されないため、ＡＡＶカプシドタンパク質の正確な当量比を得るには、さらなる特徴が要求される。

第１の態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を有する核酸分子に関する。カプシドタンパク質をコードするリーディングフレームは、少なくとも：（ｉ）ＡＴＧ開始コドンの、ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される次善の翻訳開始コドンへの置きかえ；並びに（ｉｉ）１又は複数のアミノ酸残基のコドンの、次善の翻訳開始コドンと、カプシドタンパク質のアミノ酸配列の２位におけるアミノ酸残基、好ましくは、野生型カプシドタンパク質のアミノ酸配列の２位におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基をコードするコドンとの間における挿入により、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする野生型オープンリーディングフレームと比較して修飾することが好ましい。（野生型）カプシドタンパク質のアミノ酸配列の２位は、好ましくは、（野生型）ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列の２位を指すことが理解される。次善の翻訳開始コドンの直後には、その３’末端において、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基のコドンが続くことが好ましい。

代替的に、この態様では、本発明は、オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を有し、オープンリーディングフレームが、５’から３’の順序で、
（ｉ）ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される、次善の翻訳開始コドンである第１のコドンと、
（ｉｉ）アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択される第２のコドンと、
（ｉｉｉ）任意選択で、第２のコドンに続く、さらなるアミノ酸残基の１又は複数のコドンと、
（ｉｖ）ＶＰ１翻訳開始コドンを欠き、好ましくは、ＶＰ１翻訳開始コドンだけを欠き、又は、代替的に言えば、ＶＰ１翻訳開始コドンを欠くにすぎない、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列と
を含むか又はこれらからなる、核酸分子に関する。

従って、（ｉｖ）では、配列は、好ましくは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの残余であって、カプシドタンパク質をコードする野生型オープンリーディングフレームの第２のアミノ酸位置に対応する位置で始まる残余を含むか又はこれらからなる。

本明細書では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を有する核酸分子は、動物性パルボウイルスのＶＰ１カプシドタンパク質、ＶＰ２カプシドタンパク質、及びＶＰ３カプシドタンパク質の、好ましくは３つ全てをコードするヌクレオチド配列を含むことが理解される。

本明細書では、「ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される次善の翻訳開始コドンで始まる」又は「ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される、次善の翻訳開始コドンである第１のコドン」という語句は、ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ末端をコードする位置における、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの開始コドンが、ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される次善の翻訳開始コドンであることを意味するように理解される。

本明細書では、次善とは、コドンが、他の点では同一なコンテキストにおいて、通常のＡＴＧコドンと比較して、翻訳の開始が効率的でないことを意味するように理解される。ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンは、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ、及びＣＴＧから選択されることが好ましく、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンは、ＣＴＧ及びＡＣＧから選択されることがより好ましく、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンは、ＣＴＧであることが最も好ましい。動物性パルボウイルスは、好ましくは、ディペンドウイルスであり、より好ましくは、ヒトアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はサルＡＡＶである。

特に好ましい実施形態では、ＶＰ１の次善の開始コドンは、ＣＴＧであり、さらなる１つのコドンを、次善の開始コドンにすぐ隣接して、その３’末端に導入し、さらなるコドンは、アラニンをコードする。カプシドタンパク質は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質であることが好ましい。これは、ＡＡＶ５ビリオンの効力の改善を結果としてもたらす。本明細書では、「効力」という用語は、その遺伝子材料の発現を駆動するベクターの能力を意味するように使用される。

オープンリーディングフレームは、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする第２のコドン、好ましくは、アラニンをコードする第２のコドンをさらに含む。第２のコドンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、及びＧＧＵからなる群から選択されことがより好ましく、コドンは、ＧＣＴであることが好ましい。オープンリーディングフレームは、任意選択で、第２のコドンに続く、さらなるアミノ酸残基をさらにコードする１又は複数のコドン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のさらなるアミノ酸であるが、好ましくは、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、又は１４未満のさらなるアミノ酸残基のコドンを含むことが好ましい。たやすく理解される通り、さらなるアミノ酸残基をコードするコドンは、カプシドタンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームである。

ある実施形態では、オープンリーディングフレームを、野生型カプシドタンパク質と比較する場合、カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、対応する野生型カプシドタンパク質に、１又は複数のアミノ酸残基をコードするコドンであって、ＶＰ１の次善の翻訳開始コドンと、アミノ酸残基をコードするコドンであり、翻訳開始コドンに、その３’末端においてすぐ隣接するコドンとの間に挿入されるコドンをさらに含む。例えば、オープンリーディングフレームは、対応する野生型カプシドタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のさらなるアミノ酸残基のコドンを含む。オープンリーディングフレームは、対応する野生型カプシドタンパク質と比較して、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、又は１４未満のさらなるアミノ酸残基のコドンを含むことが好ましい。たやすく理解される通り、さらなるアミノ酸残基をコードするコドンは、カプシドタンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームである。対応する野生型カプシドタンパク質と比較して、さらなるアミノ酸残基をコードするこれらのコドンのうち、第１のコドン、すなわち、次善の翻訳開始コドンに、その３’末端においてすぐ隣接するコドンは、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする。従って、翻訳開始コドンと、アミノ酸残基をコードするコドンであって、野生型配列の残基２に対応するコドンとの間に、さらなる１つのコドンだけが存在する場合、そのさらなるコドンは、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする。翻訳開始コドンと、野生型配列のアミノ酸残基２をコードするコドンとの間に、１つを超えるさらなるコドンが存在する場合、翻訳開始コドンの直後に続くコドンは、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする。次善の翻訳開始コドンの直後に（すなわち、その３’末端において）続く、さらなるアミノ酸残基は、アラニン、グリシン、又はバリンであることが好ましく、アラニンであることがより好ましい。言い換えると、本発明の好ましい実施形態では、次善の翻訳開始コドンの直後に続くコドンは、アラニンをコードする。

本発明の好ましい実施形態では、次善の翻訳開始コドンの直後に続くコドン、すなわち、第２のコドンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＧからなる群から選択され、好ましくは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、及びＧＧＵからなる群から選択され、なおより好ましくは、コドンは、ＧＣＴである。

ステップ（ｉｖ）の、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１３のカプシド配列など、天然で見出されるカプシド配列であることが可能であり、これらのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、配列番号１３〜３８及び配列番号７０〜７３に示す。よって、配列（ｉｖ）の、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群から選択されるカプシド配列でありうる。代替的に、配列は、人工配列であり、例えば、配列は、ハイブリッド形態の場合もあり、例えば、ＡｃｍＮＰｖ又はツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のコドン利用などを介して、コドン最適化する場合もある。例えば、カプシド配列が、ＡＡＶ１のＶＰ２配列及びＶＰ３配列から構成されうるのに対し、ＶＰ１配列の残余は、ＡＡＶ５のＶＰ１配列である。好ましいカプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号２２に示されるＡＡＶ５、好ましくは、配列番号２８に示されるＡＡＶ８、又は、好ましくは、配列番号３０、配列番号７１、若しくは配列番号７３に示されるＡＡＶ９である。従って、好ましい実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、本発明に従い修飾された、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型８、又はＡＡＶ血清型９カプシドタンパク質である。カプシドタンパク質が、ＡＡＶ９である場合、カプシドタンパク質は、例えば、国際公開第ＷＯ０３／０５２０５２号若しくは国際公開第ＷＯ０５／０３３３２１号において開示されている配列、又は配列番号２９、３０、７０、７１、７２、７３若しくは７４に示されている配列などの配列を有することが好ましい。カプシドタンパク質が、ＡＡＶ９である場合、カプシドタンパク質は、配列番号７２及び７３に示されている配列を有することがより好ましい。ＡＡＶカプシドタンパク質は、本発明に従い修飾された、ＡＡＶ血清型５カプシドタンパク質であることがより好ましい。カプシドタンパク質の正確な分子量のほか、翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルスの間で異なりうることが理解される。しかし、当業者には、ＡＡＶ−５以外のパルボウイルスに由来するヌクレオチド配列の対応する位置をどのようにして同定するのかが公知であろう。代替的に、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば、定方向進化実験の結果としての人工配列である。これは、ＤＮＡシャフリング、エラープローンＰＣＲ、バイオインフォマティックスによる合理的デザイン、部位飽和突然変異誘発を介するカプシドライブラリーの作製を含みうる。結果として得られるカプシドは、既存の血清型に基づくが、このようなカプシドの特徴を改善する、多様なアミノ酸変化又はヌクレオチド変化を含有する。結果として得られるカプシドは、既存の血清型の多様な部分の組合せである、「シャフリングされたカプシド」の場合もあり、１又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドの、完全に新規の変化、すなわち、群で構成されるか、又は遺伝子若しくはタンパク質の全長にわたり広がる、付加、欠失、又は置換を含有する場合もある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｆｆｅｒ及びＭａｈｅｓｈｒｉ、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ２６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ ＥＭＢＳ」、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、２００４年９月１〜５日、３５２０〜３５２３頁、Ａｓｕｒｉら（２０１２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０（２）：３２９〜３３８９、Ｌｉｓｏｗｓｋｉら（２０１４）、Ｎａｔｕｒｅ、５０６（７４８８）：３８２〜３８６を参照されたい。

本発明の好ましい実施形態では、ＶＰ３カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ＡＣＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＡＡ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＴＴＧ、ＴＡＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される非カノニカルの翻訳開始コドンで始まる。非カノニカルの翻訳開始コドンは、ＧＴＧ、ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧからなる群から選択されることが好ましく、非カノニカルの翻訳開始コドンは、ＣＴＧであることがより好ましい。

ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、ＶＰ２イニシエーターコンテキストを含む発現制御配列を含むヌクレオチド配列である。本明細書では、ＶＰ２イニシエーターコンテキストは、ＶＰ２の非カノニカル翻訳模倣始点に先行する多数のヌクレオチドを意味するように理解される。好ましい実施形態では、ＶＰイニシエーターコンテキストは、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の次善の翻訳開始コドンの上流にある、好ましくは、次善の翻訳開始コドンのすぐ上流にある、すなわち、次善の翻訳開始コドンに、その５’末端においてすぐ隣接する、配列番号３の９つのヌクレオチド配列又は配列番号３と実質的に相同なヌクレオチド配列である。配列番号３のヌクレオチド配列に対する実質的同一性を伴い、ＶＰ１の発現を増大させる一助となる配列は、例えば、配列番号３の９つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％の同一性、好ましくは、１００％の同一性を有する配列である。

ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための、本発明のさらに好ましいヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの近傍において、コザックコンセンサス配列を含む、発現制御配列を含むヌクレオチド配列である。本明細書では、コザックコンセンサス配列を、ＧＣＣＲＣＣ（ＮＮＮ）Ｇ（配列番号４）［配列中、Ｒは、プリン（すなわち、Ａ又はＧ）であり、（ＮＮＮ）は、本明細書の上記で規定された、次善の開始コドンのうちのいずれかを表す］と規定する。本発明のヌクレオチド配列のコザックコンセンサス配列では、Ｒは、Ｇであることが好ましい。従って、ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための、本発明のヌクレオチド配列であって、コザックコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列は、ＧＣＣＡＣＣ（ＡＣＧ）Ｇ（配列番号５）、ＧＣＣＧＣＣ（ＡＣＧ）Ｇ（配列番号６）、ＧＣＣＡＣＣ（ＴＴＧ）Ｇ（配列番号７）、ＧＣＣＧＣＣ（ＴＴＧ）Ｇ（配列番号８）、ＧＣＣＡＣＣ（ＧＴＧ）Ｇ（配列番号９）、ＧＣＣＧＣＣ（ＧＴＧ）Ｇ（配列番号１０）、ＧＣＣＡＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ（配列番号１１）、及びＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ（配列番号１２）から選択されることが好ましく、コザックコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列は、ＧＣＣＡＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ（配列番号１１）及びＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ（配列番号１２）から選択されることがより好ましく、コザックコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列は、ＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ（配列番号１２）であることが最も好ましい。本明細書の、括弧内のヌクレオチドは、ＶＰ１タンパク質の開始コドンの位置を指し示す。

ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための、本発明のヌクレオチド配列は、さらに好ましくは、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１カ所の修飾であって、ヌクレオチド１２位におけるＧ、ヌクレオチド２１位におけるＡ、及びヌクレオチド２４位におけるＣの中から選択される修飾を含み、この場合、ヌクレオチド位置は、例えば、配列番号２１において示される、野生型ヌクレオチド配列のヌクレオチド位置に対応する。本明細書では、「潜在的な模造開始部位／可能な模造開始部位」又は「潜在的な模造翻訳開始コドン／可能な模造翻訳開始コドン」とは、カプシドタンパク質（複数可）のコード配列に配置された、インフレームのＡＴＧコドンを意味するように理解される。他の血清型のＶＰ１の翻訳のための、可能な模造開始部位の消失を、当業者は、昆虫細胞で認識されうる、推定スプライス部位の消失として、よく理解するであろう。例えば、ヌクレオチドＴは、模造ＡＴＧコドンをもたらさないので、１２位におけるヌクレオチドの修飾は、組換えＡＡＶ５には要求されない。例えば、ＡＡＶ５のための、ヌクレオチド配列のさらなる修飾は、配列番号３９に示される通りでありうる。適正な昆虫細胞での発現のための、野生型ＡＡＶ配列の多様な修飾は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて記載されているような、周知の遺伝子操作法の適用により達成する。当業者には、ＶＰコード領域の、多様な、さらなる修飾であって、ＶＰ及びビリオンの収率を増大させる可能性もあり、ビリオンの向性の変化又は抗原性の低減など、他の所望の効果を及ぼす可能性もある修飾が公知である。これらの修飾は、本発明の範囲内にある。

好ましい実施形態では、本発明に従う核酸分子は、配列番号５１、６９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５０、及び５２からなる群から選択されるオープンリーディングフレームを含むか又はこれらからなり、より好ましくは、本発明に従う核酸分子は、配列番号５１、６９、４２、４３、４７、４８、及び５０からなる群から選択されるオープンリーディングフレームを含むか又はこれらからなり、なおより好ましくは、本発明に従う核酸分子は、配列番号６９又は５１を含むか又はこれらからなり、さらにより好ましくは、本発明に従う核酸分子は、配列番号５１を含むか又はこれらからなる。

ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、本発明のヌクレオチド配列は、昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されていることが好ましい。従って、第２の態様では、本発明は、本発明に従う核酸分子を含み、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が、昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されている、核酸構築物に関する。これらの発現制御配列は、少なくとも、昆虫細胞で活性のプロモーターを含むであろう。昆虫宿主細胞で外来遺伝子を発現させるための技法であって、当業者に公知の技法を使用して、本発明を実施することができる。昆虫細胞のポリペプチドの分子操作及び発現のための方法は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ、１９８６、「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ、第７５５５号、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ、Ｌｕｃｋｏｗ、１９９１、Ｐｒｏｋｏｐら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、９７〜１５２、Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．及びＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２、「Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．、１９９５、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３９巻、米国特許第４，７４５，０５１号、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号、並びに国際公開第ＷＯ０３／０７４７１４号において記載されている。ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、本発明のヌクレオチド配列の転写に特に適するプロモーターは、例えば、配列番号５３に示されているｐｏｌＨプロモーター、及び配列番号５４に示されている短縮型ｐｏｌＨプロモーターなどのポリヘドロン（ｐｏｌＨ）プロモーターである。しかし、当技術分野では、昆虫細胞で活性の他のプロモーター、例えば、ポリヘドリン（ｐｏｌＨ）プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ３５プロモーター、４×Ｈｓｐ２７ ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーター、デルタＥ１プロモーター、Ｅ１プロモーター、又はＩＥ−１プロモーター、及び上記の参考文献において記載されている、さらなるプロモーターも公知である。

昆虫細胞のＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターであることが好ましい。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の、産生用形質転換又は産生用トランスフェクションが可能な核酸分子であることが理解される。例示的な生物学的ベクターは、プラスミド、直鎖状核酸分子、及び組換えウイルスを含む。昆虫細胞適合性である限りにおいて、任意のベクターを援用することができる。ベクターは、昆虫細胞ゲノムへと一体化しうるが、昆虫細胞のベクターの存在は、恒久的である必要はなく、一過性のエピソームベクターも含まれる。ベクターは、任意の公知の手段により、例えば、細胞の化学的処理、電気穿孔、又は感染により導入することができる。好ましい実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドである。より好ましい実施形態では、ベクターは、バキュロウイルスである、すなわち、構築物は、バキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びそれらの使用のための方法については、昆虫細胞の分子操作についての、上記で引用された参考文献において記載されている。

好ましい実施形態では、本発明に従う核酸構築物に含まれる核酸分子は、配列番号５１、６９、４２、４３、４７、４８、及び５０からなる群から選択されるオープンリーディングフレームを含むか又はこれらからなり、より好ましくは、本発明に従う核酸構築物に含まれる核酸分子は、配列番号５１又は配列番号６９を含むか又はこれらからなり、なおより好ましくは、本発明に従う核酸構築物に含まれる核酸分子は、配列番号５１を含むか又はこれらからなる。

第３の態様では、本発明は、上記で規定された、本発明の核酸構築物を含む昆虫細胞に関する。ＡＡＶの複製を可能とし、培養物中に維持されうる、任意の昆虫細胞を、本発明に従い使用することができる。例えば、使用される細胞株は、ツマジロクサヨトウ、ショウジョウバエ細胞株、又は蚊細胞株、例えば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来の細胞株に由来しうる。好ましい昆虫細胞又は細胞株は、バキュロウイルス感染を受けやすい昆虫種に由来する細胞であって、例えば、エクスプレスＳＦ＋（ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋）（登録商標）、ドロソフィラシュナイダー２（Ｓ２）セル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２（Ｓ２）Ｃｅｌｌｓ）、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１〜４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製のハイファイブ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）を含む細胞である。

本発明に従う好ましい昆虫細胞は、（ａ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列と、（ｂ）昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列と、（ｃ）昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列とをさらに含む。

本発明の文脈では、「少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列」は、大半が相補性であり、対称的に配置された配列であって、「Ａ」領域、「Ｂ」領域、及び「Ｃ」領域とも称する配列を含む、パリンドローム配列を意味することが理解される。ＩＴＲは、複製において「シス」の役割を有する部位、すなわち、トランスで作用する複製タンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）に対する認識部位であって、パリンドロームと、パリンドロームに対して内部の特異的配列とを認識する認識部位である、複製起点として機能する。ＩＴＲ配列の対称性に対する１つの例外は、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。「Ｄ」領域は、固有である（１つのＩＴＲ内に相補体を有さない）。Ａ領域とＤ領域との間の接合部では、一本鎖ＤＮＡのニッキングが生じる。Ａ領域とＤ領域との間の接合部は、新たなＤＮＡ合成が開始される領域である。Ｄ領域は通常、パリンドロームの片側に位置し、核酸複製ステップに方向づけを与える。哺乳動物細胞で複製されるＡＡＶは、２つのＩＴＲ配列を有することが典型的である。しかし、結合性部位が、Ａ領域の両方の鎖上にあり、Ｄ領域が、パリンドロームの各側に１つずつ、対称的に配置されるように、ＩＴＲを操作することが可能である。そこで、二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（例えば、プラスミド）では、Ｒｅｐ７８支援型核酸複製又はＲｅｐ６８支援型核酸複製が、いずれの方向にも進行し、環状ベクターによるＡＡＶ複製には、単一のＩＴＲで十分となる。従って、本発明の文脈では、１つのＩＴＲヌクレオチド配列を使用することができる。しかし、２つ又は別の偶数の、左右対称のＩＴＲを使用することが好ましい。２つのＩＴＲ配列を使用することが最も好ましい。ウイルスベクターの安全性に照らすと、細胞への初期導入の後では、さらなる繁殖が不可能となるウイルスベクターを構築することが所望でありうる。レシピエントにおける、所望されないベクターの繁殖を制限するための、このような安全性機構は、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号において記載されている、キメラＩＴＲを伴うｒＡＡＶを使用することによりもたらすことができる。好ましい実施形態では、パルボウイルスのＶＰ１カプシドタンパク質、ＶＰ２カプシドタンパク質、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、国際公開第ＷＯ２００９／１５４４５２号などに記載されている免疫回避リピートをコードする配列の、少なくとも１カ所の、インフレームの挿入を含む。この挿入は、いわゆる自己相補性パルボウイルスビリオン又は単量体二重鎖パルボウイルスビリオンの形成を結果としてもたらすが、この形成は、パルボウイルスビリオンが免疫応答の低減を示すという利点を有する。好ましい実施形態では、パルボウイルスのＶＰ１カプシドタンパク質、ＶＰ２カプシドタンパク質、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、単量体二重鎖ゲノム又は自己相補性ゲノムを含む。単量体二重鎖ＡＡＶベクターを調製するためには、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶカプシドタンパク質を、本発明に従う昆虫細胞内、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムの存在下で発現させ、Ｒｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０タンパク質の発現を、Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８タンパク質の発現と比べて増大させる。単量体二重鎖ＡＡＶベクターはまた、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１／１２２９５０号において記載されている通り、昆虫細胞内、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲが隣接するベクターゲノム構築物の存在下で、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を発現させ、Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６０のニッキング活性を、Ｒｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０のヘリカーゼ活性／カプシド形成活性と比べて低減することによっても調製することができる。

本発明では、援用されるベクター又は核酸構築物の数は、限定的ではない。例えば、１、２、３、４、５、６、又はこれを超えるベクターを援用して、本発明に従う昆虫細胞で、ＡＡＶを産生させることができる。６つのベクターを援用する場合、１つのベクターは、ＡＡＶ ＶＰ１をコードし、別のベクターは、ＡＡＶ ＶＰ２をコードし、さらに別のベクターは、ＡＡＶ ＶＰ３をコードし、なおさらに別のベクターは、Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードし、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８は、別のベクターがコードし、最後のベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む。さらなるベクターを援用して、例えば、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０、並びにＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８を発現させることができるであろう。６つより少ないベクターを使用する場合、ベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ、並びにＶＰ１コード配列、ＶＰ２コード配列、ＶＰ３コード配列、Ｒｅｐ５２／Ｒｅｐ４０コード配列、及びＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８コード配列の多様な組合せを含みうる。２つのベクター又は３つのベクターを使用することが好ましく、上記で記載した通り、２つのベクターがより好ましい。２つのベクターを援用する場合、昆虫細胞は、（ａ）上記で規定された、ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための第１の核酸構築物であって、上記の（ｂ）及び（ｃ）で規定された第３及び第４のヌクレオチド配列をさらに含み、第３のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含み、第４のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む構築物と、（ｂ）上記の（ａ）で規定された第２のヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築物とを含むことが好ましい。３つのベクターを援用する場合、カプシドタンパク質の発現のためのベクターと、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８、及びＲｅｐ６８タンパク質の発現のためのベクターとで別個のベクターを使用することを除き、２つのベクターのために使用される構成と同じ構成を使用することが好ましい。各ベクターの配列は、互いと比べて任意の順序でありうる。例えば、１つのベクターが、ＩＴＲとＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦとを含む場合、ＩＴＲ配列間のＤＮＡが複製されるときに、ＶＰ ＯＲＦが複製されるか又は複製されないように、ＶＰ ＯＲＦをベクターに配置することができる。別の例では、Ｒｅｐコード配列及び／又はＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、ベクターで任意の順序でありうる。また、第２の核酸構築物、第３の核酸構築物、及びさらなる核酸構築物（複数可）も、好ましくは、昆虫細胞適合性ベクターであり、好ましくは、上記で記載した通り、バキュロウイルスベクターであることが理解される。代替的に、本発明の昆虫細胞では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、及び第４のヌクレオチド配列、並びに任意選択のさらなるヌクレオチド配列のうちの１又は複数を、昆虫細胞のゲノムに、安定的に組み込むことができる。当業者には、ヌクレオチド配列を昆虫ゲノムに、どのようにして安定的に導入するのかが公知であり、このようなヌクレオチド配列をゲノムに有する細胞をどのようにして同定するのかも公知である。ゲノムへの組込みは、例えば、昆虫ゲノムの領域と高度に相同なヌクレオチド配列を含むベクターの使用を一助とすることができる。トランスポゾンなど、特異的配列の使用は、ヌクレオチド配列をゲノムへと導入する別の方式である。

従って、好ましい実施形態では、本発明に従う昆虫細胞は、（ａ）上記で規定された第３及び第４のヌクレオチド配列をさらに含む、本発明に従う第１の核酸構築物と、（ｂ）上記で規定された第２のヌクレオチド配列を含み、好ましくは、昆虫細胞適合性ベクター、より好ましくは、バキュロウイルスベクターである、第２の核酸構築物とを含む。

従って、本発明の好ましい実施形態では、本発明の昆虫細胞に存在する第２のヌクレオチド配列、すなわち、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む配列は、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（好ましくは、哺乳動物細胞で発現させるための）をさらに含み、好ましくは、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、昆虫細胞で産生されるＡＡＶのゲノムへと組み込まれている。目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞で発現させるための配列であることが好ましい。第２のヌクレオチド配列は、２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列の間に配置されることが好ましい。目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列（哺乳動物細胞で発現させるための）は、それが２つの左右対称のＩＴＲの間に配置されるか、又は２つのＤ領域により操作された、ＩＴＲの両側に配置される場合、昆虫細胞で産生されるＡＡＶゲノムへと組み込まれることが好ましい。従って、好ましい実施形態では、本発明は、第２のヌクレオチド配列が、２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が、２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列の間に配置されている、本発明に従う昆虫細胞を提供する。

ＩＴＲを含む目的の遺伝子産物は、５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）又はこれ未満の長さであることが典型的である。別の実施形態では、本発明で記載されるＡＡＶベクターを使用することにより、過剰サイズのＤＮＡ、すなわち、５，０００ｎｔを超える長さのＤＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで発現させることもできる。本明細書では、過剰サイズのＤＮＡを、ＡＡＶの最大パッケージング限界である５ｋｂｐを超えるＤＮＡと理解する。従って、５．０ｋｂを超えるゲノムにより通例コードされる組換えタンパク質を産生させることが可能なＡＡＶベクターの作製もまた、実現可能である。例えば、本発明者らは、昆虫細胞で、部分的に、一方向にパッケージングされたｈＦＶＩＩＩ断片を含有するｒＡＡＶ５ベクターを作り出した。全サイズが少なくとも５．６ｋｂを包含するベクターゲノムを、ＦＶＩＩＩ断片を含有するＡＡＶ５粒子の２つの集団へとパッケージングする。これらの変異体ＡＡＶ５−ＦＶＩＩＩベクターは、ＦＶＩＩＩを活発に分泌することが示された。これを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで確認したところ、Ｈｕｈ７細胞の感染後において、第ＶＩＩＩ因子をコードする目的の遺伝子産物を含むＡＡＶベクターは、活性のＦＶＩＩＩタンパク質の産生を結果としてもたらした。同様に、マウスにおけるｒＡＡＶ．ＦＶＩＩＩの尾静脈送達は、活性のＦＶＩＩＩタンパク質の産生を結果としてもたらした。カプシド形成産物の分子解析は、５．６ｋｂｐのＦＶＩＩＩ発現カセットが、ＡＡＶ粒子で完全にカプシド形成されるわけではないことを明白に示した。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、カプシド形成された分子の＋鎖ＤＮＡ及び−鎖ＤＮＡにより、５’末端の逸失が明らかにされたと仮定する。これは、かつて報告された一方向（３’末端で始まる）パッケージング機構であって、４．７〜４，９ｋｂｐを限界とする「ヘッド−フル原理」に従い作動するパッケージング機構（例えば、Ｗｕら［２０１０］、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１８（１）：８０〜８６、Ｄｏｎｇら［２０１０］、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１８（１）：８７〜９２、Ｋａｐｒａｎｏｖら［２０１２］、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２３：４６〜５５、及び、特に、Ｌａｉら［２０１０］、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１８（１）：７５〜７９を参照されたい）と符合する。５．６ｋｂのベクターゲノム全体のうち、カプシド形成されたのは、約５ｋｂだけであるが、ベクターは、強力であり、活性ＦＶＩＩＩの発現をもたらした。本発明者らは、ＦＶＩＩＩの産生のための正確な鋳型が、＋鎖ＤＮＡと−鎖ＤＮＡとによる部分的な相補体形成に続く、第２鎖の合成に基づき、標的細胞でアセンブルされることを示した。

従って、本明細書の上記で規定された、第２のヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞で発現させるための、少なくとも１つの「目的の遺伝子産物」をコードするヌクレオチド配列であって、それが、昆虫細胞で複製されるＡＡＶゲノムへと組み込まれるように配置されたヌクレオチド配列を含みうる。構築物が、ＡＡＶビリオンのパッケージング容量内にとどまる限りにおいて、本発明に従い産生されたＡＡＶをトランスフェクトされた哺乳動物細胞でのその後の発現のために、任意のヌクレオチド配列を組み込むことができる。ヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質をコードする場合もあり、又はＲＮＡｉ剤、すなわち、例えば、ｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）若しくはｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）など、ＲＮＡ干渉が可能なＲＮＡ分子を発現させる場合もある。「ｓｉＲＮＡ」とは哺乳動物細胞で毒性でない、長さの短い二本鎖ＲＮＡである、低分子干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４〜９８、Ｃａｐｌｅｎら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：９７４２〜４７）。好ましい実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、２つのヌクレオチド配列を含むことが可能であり、各ヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞で発現させるための、１つの目的の遺伝子産物をコードする。目的の産物をコードする２つのヌクレオチド配列の各々は、昆虫細胞で複製されるｒＡＡＶゲノムへと組み込まれるように配置されている。

哺乳動物細胞で発現させるための、目的の産物は、治療用遺伝子産物でありうる。治療用遺伝子産物は、ポリペプチド、又はＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、又は、標的細胞で発現させると、例えば、所望されない活性の除去、例えば、感染細胞の除去、若しくは、例えば、酵素活性の欠如を引き起こす遺伝子欠損の補完など、所望の治療効果をもたらす、他の遺伝子産物でありうる。治療用ポリペプチド遺伝子産物の例は、ＣＦＴＲ、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくは、ＬＰＬ Ｓ４４７Ｘ、国際公開第ＷＯ０１／００２２０号を参照されたい）、アポリポタンパク質Ａ１、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、色素性網膜炎ＧＴＰアーゼ調節因子相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、例えば、ＩＬ−１０、ジストロフィン、ＰＢＧＤ、ＮａＧＬＵ、Ｔｒｅｇ１６７、Ｔｒｅｇ２８９、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＩＦＮ、ＧＤＮＦ、ＦＯＸＰ３、第ＶＩＩＩ因子、ＶＥＧＦ、ＡＧＸＴ、及びインスリンなどのサイトカイン又はインターロイキンを含む。代替的に、又は、第２の遺伝子産物として加えて、本明細書の上記で規定された、第２のヌクレオチド配列は、細胞の形質転換及び発現を評価するマーカータンパク質として用いられる、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含みうる。この目的に適するマーカータンパク質は、例えば、蛍光タンパク質であるＧＦＰ、並びに選択用マーカー遺伝子である、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地での選択のための）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢでの選択のための）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８での選択のための）、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサートでの選択のための）、ＣＤ２０、低アフィニティー神経増殖因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を得るための供給源、及びそれらの使用のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、（３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて提示されている。さらに、本明細書の上記で規定された、第２のヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、必要だと考えられる場合、対象が、本発明のｒＡＡＶを形質導入された細胞から治癒することを可能とするフェイルセーフ機構として用いられうるヌクレオチド配列を含みうる。このようなヌクレオチド配列は、プロドラッグを、タンパク質を発現させるトランスジェニック細胞を死滅させることが可能な毒性物質へと転換することが可能なタンパク質をコードする、自殺遺伝子と称することが多い。このような自殺遺伝子の適切な例は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子、又は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘帯状疱疹ウイルスに由来するチミジンキナーゼ遺伝子のうちの１つを含み、この場合は、ガンシクロビルを、対象におけるトランスジェニック細胞を死滅させるプロドラッグとして使用することができる（例えば、Ｃｌａｉｒら、１９８７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３１：８４４〜８４９を参照されたい）。

別の実施形態では、目的の遺伝子産物は、ＡＡＶタンパク質でありうる。特に、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８、又はこれらの機能的断片などのＲｅｐタンパク質でありうる。Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、本発明のｒＡＡＶゲノムに存在し、本発明のｒＡＡＶを形質導入された哺乳動物細胞で発現させる場合、ｒＡＡＶの、形質導入された哺乳動物細胞のゲノムへの組込みを可能とする。Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８の、ｒＡＡＶ形質導入哺乳動物細胞又はｒＡＡＶ感染哺乳動物細胞での発現は、ｒＡＡＶにより細胞に導入された他の任意の目的の遺伝子産物の、長期にわたる発現又は恒久的発現を可能とすることにより、ｒＡＡＶのある特定の使用の利点をもたらしうる。

本発明のｒＡＡＶベクターでは、哺乳動物細胞で発現させるための、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（複数可）は、少なくとも１つの哺乳動物細胞適合性発現制御配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結されていることが好ましい。当技術分野では、多くのこのようなプロモーターが公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、２００１、前出を参照されたい）。ＣＭＶプロモーターなど、多くの細胞型で広く発現する構成的プロモーターも使用することができる。しかし、誘導的、組織特異的、細胞型特異的、又は細胞周期特異的なプロモーターが、より好ましいであろう。例えば、肝臓特異的発現プロモーターは、α１−抗トリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合性グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合性グロブリン）プロモーター、ＨＣＲ−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーター、ＬＰ１、ＨＬＰ、最小ＴＴＲプロモーター、ＦＶＩＩＩプロモーター、ハイペロンエンハンサー、ｅａｌｂ−ｈＡＡＴから選択することができる。他の例は、腫瘍選択性発現のためのＥ２Ｆプロモーター、及び、特に、神経細胞腫瘍選択性発現のためのＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：１１４５〜９）、又は単核血球における使用のためのＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈら、１９９７、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８５：２１０１〜１０）を含む。

ＡＡＶは、多数の哺乳動物細胞に感染することが可能である。例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５（１１）：３２５１〜３２６０（１９８５）及びＧｒｉｍｍら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０（１５）：２４４５〜２４５０（１９９９）を参照されたい。しかし、ＡＡＶの、ヒト滑膜線維外細胞への形質導入は、同様のマウス細胞への形質導入より著しく効率的であり（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ、３：１（２００１））、ＡＡＶの細胞指向性は、血清型間で異なる。例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（７）：３４２８〜３４３２（２０００）（哺乳動物ＣＮＳ細胞向性及び形質導入効率に関する、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５の間の差違について論じている）を参照されたい。

昆虫細胞でのＡＡＶの産生のために、本発明で使用しうるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来しうる。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸レベル及び核酸レベルにおいて、著しく相動的なゲノム配列を有し、同一な遺伝子機能のセットをもたらし、本質的に、物理的及び機能的に同等なビリオンを産生させ、実質的に同一な機構により複製され、アセンブルされる。多様なＡＡＶ血清型のゲノム配列、及びゲノムの類似性の概観については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３〜３３）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３、Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５〜６４）、Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒ．、７３：１３０９〜１３１９）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒ．、７２：３０９〜３１９）、及びＷｕら（２０００、Ｊ．Ｖｉｒ．、７４：８６３５〜４７）を参照されたい。ヒトアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型又はサルＡＡＶ血清型は、本発明の文脈における使用のためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源であり、より好ましくは、ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３）又は霊長動物（例えば、血清型１及び４）に、通常、感染するＡＡＶ血清型は、本発明の文脈における使用のためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源である。

本発明の文脈における使用のためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５及び／又はＡＡＶ４に由来することが好ましい。同様に、Ｒｅｐ５２コード配列、Ｒｅｐ４０コード配列、Ｒｅｐ７８コード配列、及び／又はＲｅｐ６８コード配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４に由来することが好ましい。本発明の文脈における使用のための、ＶＰ１カプシドタンパク質、ＶＰ２カプシドタンパク質、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、公知の４２の血清型のうちのいずれかから採取することができ、より好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、若しくはＡＡＶ９、又は例えば、カプシドシャフリング法及びＡＡＶカプシドライブラリーにより得られる、新開発のＡＡＶ様粒子から採取することができる。好ましい実施形態では、ＶＰ１カプシドタンパク質、ＶＰ２カプシドタンパク質、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８、より好ましくは、ＡＡＶ５に由来する。

ＡＡＶ Ｒｅｐ配列及びＡＡＶ ＩＴＲ配列は特に、大半の血清型間で保存されている。多様なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば、８９％を超えて同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６の間の、ゲノムレベルにおける全ヌクレオチド配列の同一性は、約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（２）：９３９〜９４７）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞のＡＡＶ粒子の産生時に、他の血清型に由来する対応する配列を、効率的に交差補完する（すなわち、機能的に置換する）ことが公知である。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号は、ＡＡＶ Ｒｅｐ配列及びＡＡＶ ＩＴＲ配列はまた、昆虫細胞でも、他のＡＡＶ Ｒｅｐ配列及びＡＡＶ ＩＴＲ配列を効率的に交差補完することについて報告している。

ＡＡＶ ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞指向性を決定することが公知である。ＶＰタンパク質コード配列は、異なるＡＡＶ血清型間の保存が、Ｒｅｐタンパク質及びＲｅｐ遺伝子より著しく低度である。Ｒｅｐ配列及びＩＴＲ配列が、他の血清型の対応する配列を交差補完する能力は、ある血清型（例えば、ＡＡＶ３）のカプシドタンパク質並びにＲｅｐ及び／又は別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＩＴＲ配列を含む偽型ＡＡＶ粒子の産生を可能とする。このような偽型ＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。

本発明の文脈ではまた、例えば、昆虫細胞のｒＡＡＶベクターの産生のために、修飾「ＡＡＶ」配列も使用することができる。このような修飾配列であって、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９の、ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又はこれを超えるヌクレオチド酸配列同一性及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含む修飾配列を、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列、野生型ＡＡＶ Ｒｅｐ配列、又は野生型ＡＡＶ ＶＰ配列の代わりに使用することができる。

多くの点で、他のＡＡＶ血清型と類似するが、ＡＡＶ５は、他のヒトＡＡＶ血清型及びサルＡＡＶ血清型と異なり、他の公知のヒト血清型及びサル血清型より大きく異なる。この点に照らすと、昆虫細胞のＡＡＶ５の産生は、他の血清型の産生と異なりうる。本発明の方法を援用して、ｒＡＡＶ５を産生させる場合、１又は複数のベクターは、１つを超えるベクターの場合は併せて、ＡＡＶ５ ＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５ Ｒｅｐ５２コード配列及び／又はＡＡＶ５ Ｒｅｐ４０コード配列を含むヌクレオチド配列、並びにＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８コード配列及び／又はＡＡＶ５ Ｒｅｐ６８コード配列を含むヌクレオチド配列を含むことが好ましい。このようなＩＴＲ配列及びＲｅｐ配列を、所望の通りに修飾して、昆虫細胞での、ｒＡＡＶ５ベクター又は偽型ｒＡＡＶ５ベクターの効率的な産生を得ることができる。例えば、Ｒｅｐ配列の開始コドンを修飾することができる。

好ましい実施形態では、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列と、第３のヌクレオチド配列と、任意選択で、第４のヌクレオチド配列とは、昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれている。

さらなる態様では、本発明は、ＡＡＶビリオンに関する。ＡＡＶビリオンは、そのゲノムに、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つのヌクレオチド配列は、好ましくは、天然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、
（ｉ）翻訳開始コドン、好ましくは、ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される次善の翻訳開始コドンによりコードされる、第１のアミノ酸残基と、
（ｉｉ）アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択される第２のアミノ酸残基と、
（ｉｉｉ）任意選択で、第２のアミノ酸残基に続く、１又は複数のさらなるアミノ酸残基と、
（ｉｖ）ＶＰ１翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基を欠き、好ましくは、ＶＰ１翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基だけを欠き、又は、代替的に言えば、ＶＰ１翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基を欠くにすぎない、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列と
を含むか又はこれらからなることが好ましい。

ＶＰ１翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基だけを欠く、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列は、自然発生のＶＰ１翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基だけを欠く、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の自然発生のアミノ酸配列であることが好ましい。次善の翻訳開始コドンによりコードされる、第１のアミノ酸残基は、メチオニン残基であることが典型的である。

代替的に、この態様では、本発明は、そのゲノムに、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つのヌクレオチド配列が、好ましくは、天然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドには、開始コドンと、野生型カプシドタンパク質の２位におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基との間に、１又は複数のさらなるアミノ酸残基が挿入されており、開始コドンの直後に続くさらなるアミノ酸残基が、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択される、ＡＡＶビリオンに関する。

本発明に従うビリオンでは、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質と、ＶＰ２カプシドタンパク質と、ＶＰ３カプシドタンパク質との当量比は、以下の通りであることが好ましい：ＶＰ１の量は、（ａ）ＶＰ２の量の少なくとも１００、１０５、１１０、１２０、１５０、２００、若しくは４００％であるか、又は（ｂ）ＶＰ３の量の少なくとも８、１０、１０．５、１１、１２、１５、２０、若しくは４０％であるか、又は（ｃ）少なくとも、（ａ）及び（ｂ）の両方で定義されている通りであることが好ましい。ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の量は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の各々に共通のエピトープを認識する抗体を使用して決定することが好ましい。当技術分野では、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３の相対量の定量化を可能とする、多様なイムノアッセイが利用可能である（例えば、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ、１９９９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。３つのカプシドタンパク質の各々に共通のエピトープを認識するのに適する抗体は、例えば、マウス抗Ｃａｐ Ｂ１抗体（プローゲン（Ｐｒｏｇｅｎ）社、Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている）である。

本発明に従う、好ましいＡＡＶは、そのゲノムに、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つのヌクレオチド配列が、好ましくは、天然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶビリオンが、アミノ酸の１位に、メチオニン、トレオニン、ロイシン、又はバリンを含む、ＶＰ１カプシドタンパク質を含む、ビリオンである。本発明に従う、より好ましいＡＡＶビリオンは、上記で規定された比のカプシドタンパク質を有し、アミノ酸の１位に、ロイシン又はバリンを含む、ＶＰ１カプシドタンパク質を含む。例えば、本明細書の下記で定義される方法により、上記で規定された昆虫細胞から得られるＡＡＶビリオンが、なおより好ましい。ＶＰ１カプシドタンパク質の１位に、トレオニン又はロイシンを含むＡＡＶビリオンがなおより好ましく、トレオニン残基を含むＡＡＶビリオンがさらにより好ましい。

本発明のＡＡＶビリオンの利点は、それらの感染性の改善である。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、特に、感染性は、カプシドのＶＰ２及び／又はＶＰ３の量と比べた、カプシドのＶＰ１タンパク質の量の増大と共に増大すると考えられる。本明細書では、ＡＡＶビリオンの感染性は、ビリオンに含まれる導入遺伝子の形質導入の効率であって、導入遺伝子の発現率及び導入遺伝子から発現する産物の量又は活性から推定されうる効率を意味するように理解される。

本発明のＡＡＶビリオンは、ＣＦＴＲ、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくは、ＬＰＬ Ｓ４４７Ｘ、国際公開第ＷＯ０１／００２２０号を参照されたい）、アポリポタンパク質Ａ１、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、色素性網膜炎ＧＴＰアーゼ調節因子相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、例えば、ＩＬ−１０、ジストロフィン、ＰＢＧＤ、ＮａＧＬＵ、Ｔｒｅｇ１６７、Ｔｒｅｇ２８９、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＩＦＮ、ＧＤＮＦ、ＦＯＸＰ３、第ＶＩＩＩ因子、ＶＥＧＦ、ＡＧＸＴ、及びインスリンなどのサイトカイン又はインターロイキンからなる群から選択されるポリペプチド遺伝子産物をコードする、目的の遺伝子産物を含むことが好ましい。目的の遺伝子産物は、第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードすることがより好ましい。

従って、別の態様では、本発明は、ＡＡＶを昆虫細胞で産生させるための方法に関する。方法は、（ａ）本明細書の上記で規定された昆虫細胞を、ＡＡＶが産生されるような条件下で培養するステップと、任意選択で、（ｂ）ＡＡＶを回収するステップとを含むことが好ましい。当技術分野では、培養物中の昆虫細胞のための増殖条件、及び培養物中の昆虫細胞の異種産物の産生が周知であり、例えば、昆虫細胞の分子操作についての、上記で引用された参考文献において記載されている。

方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは、固定化抗体を使用して、ＡＡＶをアフィニティー精製するステップをさらに含むことが好ましい。抗ＡＡＶ抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。特に適する抗体は、例えば、ラクダ又はラマから得られる、単鎖ラクダ科動物抗体又はその断片である（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４：２７７〜３０２を参照されたい）。ＡＡＶのアフィニティー精製のための抗体は、ＡＡＶカプシドタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体であることが好ましく、エピトープは、１つを超えるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質に存在するエピトープであることが好ましい。例えば、抗体は、ＡＡＶ２カプシドへの特異的結合に基づき、作製又は選択しうるが、同時にまた、抗体は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ３カプシド、及びＡＡＶ５カプシドにも特異的に結合する。

本明細書及びその特許請求の範囲では、「〜を含む」という動詞及びその活用形を、「〜を含む」という語に続く項目を含むが、具体的に言及されていない項目も除外しないことを意味するように、非限定的な意味で使用する。加えて、文脈により、存在するのは要素のうちの１つであり、１つだけであることが明らかに要求されない限りにおいて、不定冠詞である「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」による要素への言及も、１つを超える要素が、存在する可能性を除外しない。従って、不定冠詞である「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」は通例、「少なくとも１つの」を意味する。

本明細書で引用される、全ての特許及び参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。

以下の例は、例示的な目的のためだけに提示するものであり、いかなる形でも、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

１．序説
ｒＡＡＶを産生させるための初期バキュロウイルス系は、Ｕｒａｂｅら（Ｕｒａｂｅら［２００２］、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１３（１６）：１９３５〜１９４３）により記載され、３つのバキュロウイルス、すなわち、Ｂａｃ−Ｒｅｐ、Ｂａｃ−ｃａｐ、及びＢａｃ−ｖｅｃからなり、これらの昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞への共感染は、ｒＡＡＶの産生を結果としてもたらした。このような産生されたｒＡＡＶの特性、すなわち、効力を含む物理的特徴及び分子的特徴は、哺乳動物細胞で産生されたｒＡＡＶとあまり異ならなかった（Ｕｒａｂｅ［２００２］、前出）。昆虫細胞のｒＡＡＶベクターの効率的な産生を達成するためには、工程に必要とされるＡＡＶタンパク質を、適切なレベルで発現させなければならなかった。これは、多数のＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質をコードするオペロンの適合を要求した。野生型ＡＡＶは、大型のＲｅｐ７８及び小型のＲｅｐ５２を、それぞれ、２つの顕著に異なるプロモーターであるｐ５及びｐ１９から発現させ、２つのメッセンジャーのスプライシングの結果として、Ｒｅｐ６８変異体及びＲｅｐ５２変異体の産生をもたらす。このオペロンの組織化は、限定的なＲｅｐ７８の発現と、比較的高量のＲｅｐ５２の発現とを結果としてもたらす。Ｒｅｐ７８のＲｅｐ５２に対する比の小ささを模倣するために、Ｕｒａｂｅらは、Ｒｅｐ７８の発現は、即初期１遺伝子（ΔＩＥ−１）の、部分的に欠失させたプロモーターにより駆動する一方で、Ｒｅｐ５２の発現は、強力なポリヘドリンプロモーター（ｐｏｌｈ）により制御する、ＤＮＡカセットを構築した。昆虫細胞では、大型のＲｅｐ及び小型のＲｅｐのスプライシングされた変異体が観察されなかったが、これは、哺乳動物細胞と昆虫細胞とのスプライシング工程の差違と関連する可能性が高い。克服すべき別の技術的課題は、３つの主要なウイルスタンパク質（ＶＰ）の発現に関連していた。野生型ＡＡＶは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を、ｐ４０プロモーターから発現させる。生じるメッセンジャーＲＮＡは、２つの分子種へとスプライシングされる：１つの分子種が、ＶＰ１発現の一因となるのに対し、第２の分子種は、タンパク質が、場合によって、リボソーム複合体により看過される非カノニカルの始点、すなわち、ＡＣＧから開始される「漏出性リボソーム走査機構」を介して、ＶＰ２及びＶＰ３の両方を発現させるが、このとき、リボソーム複合体は、それが、ＶＰ３のカノニカルの始点を見出すまで、さらに前進する。脊椎動物細胞と昆虫細胞との、スプライシング機構の差違のために、上記で記載された機構は、昆虫細胞では、適正なカプシドの産生を結果としてもたらさなかった。Ｕｒａｂｅらは、ＶＰ１の翻訳始点を、ＡＣＧへと変化させ、ＶＰ１に先行する９ヌクレオチドからなる開始コンテキストを、ＶＰ２に先行するヌクレオチドへと変化させるような形で、ＶＰ２に見出される修飾と類似する、ＶＰ１の翻訳始点の修飾を導入することを決定した。これらの遺伝子変化は、単一のポリシストロニックのｍＲＮＡに由来するカプシドへと適正にアセンブルされうる、３つのＶＰの、正確な当量比での発現を結果としてもたらした。他方で、導入遺伝子カセットは、哺乳動物ベースの系についてかつて記載されたカセットと類似し、複製及びパッケージングに要求される、唯一のイントランスのエレメントとしてのＩＴＲに挟まれた。

新たに発見されたＡＡＶ血清型であって、異なる所望の特性を保持するＡＡＶ血清型の数が増大するにつれ、これらのカプシドの、ＢＥＶ系における産生が必要とされる。昆虫細胞でのＡＡＶ２の産生の成功が示されているが、全ての血清型の効能が、ＡＡＶ２に適合させた系で同等に良好なわけではない。新たな血清型を、最適な産生及び効力に適合させることは、些末な作業ではなく、テーラーメイドの手法を要求することが考えられる。ｒＡＡＶ５配列を、昆虫細胞のＢＥＶＳによる産生に適合させようとするかつての試みが収めた成功は限定的なものであり、結果として得られる、ＶＰ１の、カプシドへの組込みは、低度なものであった（Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら（２００５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１２（６）：１２１７〜１２２５、Ｕｒａｂｅら（２００６）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８０（４）：１８７４〜１８８５）。この問題を回避するために、Ｕｒａｂｅらは、２型ＡＡＶに由来するＮ末端の１３６アミノ酸残基と、ＡＡＶ血清型５に由来する残余の配列とを含有する、２／５型キメラウイルスを作り出した。このようなウイルスは、産生が良好であり、野生型ＡＡＶ５の効力と同様な効力を提示することが報告された（Ｕｒａｂｅら（２００６）、前出）。しかし、結果として得られるビリオンは、キメラビリオンであり、「真性の」ｒＡＡＶ５血清型を表さない。

昆虫細胞で、感染性及び／又は効力を改善した、純種のｒＡＡＶ５を産生させるために、本発明者らは、複数のカプシドタンパク質５の突然変異体をデザインした。感染性には、３つのウイルスタンパク質の当量比が均衡していることが重要であると考えられる。例えば、かつて報告された通り、本発明者らは、ＶＰ１合成の欠如は、ベクターの効力に多大な影響を及ぼすことに気付いた。さらに、本発明者らは、ベクターの効力は、ＶＰ１及びＶＰ２と比較して、ＶＰ３の高度な組込みと負に相関することを観察した。過剰量のＶＰ３を伴うウイルス調製物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞への形質導入が低度であった。最後に、本発明者らは、Ｕｒａｂｅら（２００６、前出）により作り出されたキメラｒＡＡＶ５より優れた効力を提示する、純種の（又は「真性の」）ｒＡＡＶ５カプシドを構築した。この新たなカプシドは、キメラＡＡＶ２／５と比較して均衡したＶＰ当量比と、同様であるか又は優れた効力とを有することが見出された。
２．方法
２．１．ｒＡＡＶ５ベクターの産生

ｒＡＡＶ５のバッチは、エクスプレスＳＦ＋（登録商標）昆虫細胞株（プロテインサイエンス社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に、カプシド（ｒＡＡＶ５変異体ライブラリー）、レプリカーゼ、及び導入遺伝子（Ｓｅａｐ又は第ＩＸ因子）の発現カセットを含む、３つの異なるバキュロウイルスを、それぞれ、ＣＭＶプロモーター及びＬＰ１プロモーターの制御下で共感染させることにより産生させた。カプシド発現カセットは、ポリヘドロンプロモーターの制御下に置いた。Ｒｅｐ発現カセットは、国際公開第ＷＯ２００９／１４４４５号において記載されている通り（ＢＡＣ．ＶＤ１８３）であり、それぞれ、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２の発現を駆動する、デルタＥ１及びポリヘドロンプロモーターの制御下に置いた。エクスプレスＳＦ＋（登録商標）細胞は、増幅したばかりのバキュロウイルス原液を使用して、５：１：１（Ｒｅｐ：Ｃａｐ：導入遺伝子）の容量比で感染させた。２８℃で７２時間にわたるインキュベーションの後、細胞を、１０倍濃度の溶解緩衝液（１，５ＭのＮａＣｌ、０，５Ｍのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ＝８．５）で、２８℃で１時間にわたり溶解させた。ゲノムＤＮＡは、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）処理により、３７℃で１時間にわたり消化した。細胞破砕物は、１９００×ｇで１５分間にわたる遠心分離により除去し、その後、ｒＡＡＶ５粒子を含有する上清を、４℃で保存した。ベクター力価は、この、いわゆる粗細胞溶解物中で、導入遺伝子のプロモーター領域を指向する特異的Ｑ−ＰＣＲにより決定した。略述すると、アフィニティー精製されたベクターを、Ｑ−ＰＣＲで解析した。ＡＡＶを、３７℃、ＤＮアーゼで処理して、遺伝子外ＤＮＡを分解した。次いで、ＡＡＶ ＤＮＡを、１ＭのＮａＯＨ処理により、粒子から放出させた。短時間の加熱処理（３７℃で３０分間にわたる）の後、アルカリ性環境を、等容量の１Ｍ ＨＣｌで中和した。中和された試料は、タクマンＱ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ Ｑ−ＰＣＲ）で使用されるＡＡＶ ＤＮＡを含有した。Ｑ−ＰＣＲは、下記の表１に列挙されるプライマー及びプローブを使用して、標準的な手順に従い実施した。
２．２．ｒＡＡＶ５ベクターの精製

ｒＡＡＶ５粒子を、粗溶解物から、ＡＶＢセファロース（アフィニティー樹脂、ＧＥヘルスケア社（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用する、バッチ結合プロトコールにより精製した。ｒＡＡＶ５粗細胞溶解物を、洗浄された（ｐＨ＝７．５の０．２Ｍ ＨＰＯ_４緩衝液により）樹脂へと添加した。その後、試料を、静かに混合しながら、室温で２時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、樹脂を、ｐＨ＝７．５の０．２Ｍ ＨＰＯ_４緩衝液で洗浄し、結合したベクターを、０．２Ｍのグリシン、ｐＨ＝２．５を添加することにより溶出させた。溶出させたベクターのｐＨは、０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．５を添加することにより、速やかに中和した。精製されたｒＡＡＶ５バッチは、−２０℃で保存した。精製されたベクターは、特異的Ｑ−ＰＣＲで滴定した。

ｉｎ ｖｉｖｏ研究のための高量のベクターを産生させるために、改変精製プロトコールを使用した。略述すると、採取の後、清明化させた溶解物を、０．２２μｍのフィルター（ミリパック６０（Ｍｉｌｌｉｐａｋ ６０）、０．２２μｍ）に通した。次に、ベクター粒子を、ＡＫＴＡエクスプローラー（ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ）（ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム、ＧＥヘルスケア社）で、８ｍｌのＡＶＢセファロースカラム（ＧＥヘルスケア社）を介してアフィニティー精製した。結合したｒＡＡＶ５粒子を、０．２Ｍのグリシン、ｐＨ＝２．５により、カラムから溶出させた。溶出物は、６０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ＝７．５で速やかに中和した。中和された溶出物の緩衝液を、１００ＫＤａの限外濾過（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社）フィルターを一助として、５％のスクロースを含むＰＢＳと交換した。次いで、最終産物を、０．２２μｍのフィルター（ミレックスＧＰ（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ））で濾過し、アリコート分割し、さらなる使用まで、−２０℃で保存した。精製の後、特異的Ｑ−ＰＣＲにより、ウイルス力価を決定した。

２．３．ｒＡＡＶ５変異体のＶＰタンパク質組成物

精製ｒＡＡＶ５変異体のＶＰタンパク質組成物を、ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（ニューページ（Ｎｕｐａｇｅ）、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）で決定し、シプロルビー（Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ）で染色した。略述すると、１５μｌの精製ｒＡＡＶ５を、４倍濃度のＬＤＳローディング緩衝液（ライフテクノロジーズ社）５μｌと混合し、ビス−トリスポリアクリルアミドゲルにロードした。試料を、電気泳動により、１００ボルトで２時間にわたり分離した。電気泳動の後、タンパク質を、１０％のＮａＡＣ／７％のＥｔＯＨで、３０分間にわたり固定し、シプロルビー（ライフテクノロジーズ社）で２時間にわたり染色した。次いで、ＶＰタンパク質を、イメージクォント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）システム（ＧＥヘルスケア社）のＵＶ光下で可視化した。
２．４．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力

異なる血清型５カプシド変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力について調べるため、２つの継代細胞株を使用した。本実施例では、Ｈｅｌａ細胞及びＨｕｈ７細胞１×１０^５個に、ｒＡＡＶ５変異体を、多様な感染多重度で感染させた。実験は、２４ウェルプレートに、ウェル１つ当たりの細胞１×１０^５個、約８０％のコンフルエンシーで実施した。いずれの実験でも、野生型アデノウイルスを、３０の感染多重度で使用した。第２鎖の合成工程を、約２４時間以内に早めて実施し、これにより、アッセイを比較的短時間で実施し、細胞を継代培養する必要を回避することを可能とするために、この野生型アデノウイルスの添加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力試験だけに適用した。感染開始の４８時間後に、上清中のＳｅａｐ発現を、Ｓｅａｐレポーターアッセイキット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社）を使用して測定した。発光を、スペクトラマックスＬ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｌ）発光計（モレキュラーデバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）社）、４７０ｎｍで、組込み時間を１秒間として測定した。
２．５．ｉｎ ｖｉｖｏにおける効力

異なる血清型５カプシド変異体のｉｎ ｖｉｖｏにおける効力について調べるため、２つの異なる実験を実施した。略述すると、Ｓｅａｐレポーター遺伝子を持つｒＡＡＶ５ベクター構築物１５９〜１６４の効力について、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて調べた。異なるベクターを、マウスに、５×１０^１２ｇｃ／ｋｇの用量で筋肉内注射した。実験群は、ＰＢＳ群を含む、各々マウス５匹ずつの合計７つの群からなった。マウス血漿は、注射の２、４、及び６週後に得、その後、マウスを屠殺した。ロシュ社製のＳｅａｐレポーターアッセイキットを使用して、Ｓｅａｐ活性を、血漿中で測定した。発光を、スペクトラマックスＬ発光計（モレキュラーデバイシズ社）、４７０ｎｍで、組込み時間を１秒間として測定した。

次に、変異体ＡＡＶ５（７６５）のｉｎ ｖｉｖｏにおける効力を、ＡＡＶ５（１６０）及びＡＡＶ５（９２）の効力と比較した。ＡＡＶ５（９２）は、Ｋｏｔｉｎ博士の研究室から恵与されたものであった（Ｕｒａｂｅら、２００６）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、レポーター遺伝子としてのＦＩＸを持つ７６５又は１６０の両方を、２×１０^１２ｇｃ／ｋｇ及び２×^１３ｇｃ／ｋｇの用量で、静脈内注射した。ＰＢＳ群を含む、各々マウス５匹ずつの合計７つの群に注射した。血漿は、注射の１、２、及び４週後に回収し、その後、マウスを屠殺した。血漿中に存在する第ＩＸ因子タンパク質は、第ＩＸ因子特異的ＥＬＩＳＡ（ビジュアライズフィックス（ＶｉｓｕＬｉｚｅ ＦＩＸ）抗原キット、コルディア（Ｋｏｒｄｉａ）社）で測定した。光学濃度は、バーサマックス（Ｖｅｒｓａｍａｘ）ＥＬＩＳＡプレートリーダー（モレキュラーデバイシズ社）、４５０ｎｍで測定した。
３．結果
３．１．ＢＥＶＳでのｒＡＡＶ５の産生

ＡＡＶとは、その宿主の機構を使用して、ｃａｐ遺伝子など、その遺伝子を発現させる哺乳動物ウイルスである。ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の正確な当量比を達成する哺乳動物宿主の機構は、昆虫細胞には存在しないか、又は昆虫細胞では最適ではない。従って、Ｕｒａｂｅらは、昆虫細胞におけるＡＡＶ２の３つのＶＰの産生を正確な当量比で結果としてもたらす、ポリシストロニックのｃａｐ ｍＲＮＡを構成するための遺伝子調整戦略を開発した（Ｕｒａｂｅら（２００２）、前出）。ＢＥＶＳでｒＡＡＶ５を産生させる類似の方法を確立する試みは、十分な感染性粒子を達成することに成功しなかった。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、これは、ＶＰ１の、カプシドへの組込みが低度であることにより引き起こされると考えられる（Ｕｒａｂｅら（２００６）、前出）。このため、Ｕｒａｂｅらは、血清型２についてのかつての成功に基づき、５型ＶＰ１のＮ末端部分を、２型ＶＰ１のＮ末端部分で置きかえて、感染性ＡＡＶ５粒子を産生させた（Ｕｒａｂｅら（２００６）、前出）。成功はしたが、キメラＡＡＶ２／５カプシドは、真正の５型粒子を含まず、それ自体、ＡＡＶ５と比較して特性を変化させており、これは、５型に由来するカプシドではなく、２つのカプシドの組合せを表しうるであろう。

昆虫細胞の、感染性及び効力を改善したＡＡＶ５ビリオンの産生を可能とするために、本発明では、ＡＡＶ５のｃａｐ５発現カセットに対して、一連の遺伝子変化を施した（表２）。既に言及されている（Ｕｒａｂｅら（２００６）、前出）通り、野生型ｃａｐ５遺伝子（本発明では、クローン番号７６３）は、ｒＡＡＶの産生を支援しなかった。昆虫細胞における天然のＡＡＶスプライシングシグナルの認識を欠くために、個別のＶＰの低発現及びベクター産生の欠如を結果としてもたらした可能性が高い。真核細胞のリボソームは、ｍＲＮＡを、５’から３’へと一方向に読み取るという事実のために、ポリシストロニックのｃａｐ５ ｍＲＮＡの最初の翻訳開始点（本発明では、ＶＰ１）は、３つのタンパク質全ての発現のために有害である。野生型の開始点は、リボソームのリードスルーを可能とせず、このため、他の２つのＶＰの発現を遮断する、いわゆる強力な翻訳開始コドンである、ＡＴＧから構成されており、これにより、ｒＡＡＶ産生の欠如がもたらされる。野生型ＡＡＶが、リボソームのリードスルーを使用して、ＶＰ２（非カノニカルの翻訳開始点であるＡＣＧ）及びＶＰ３（ＡＴＧ）を発現させるという事実から、本発明者らは、３つのＶＰの発現及び／又はアセンブリーを変化させるように、ＶＰ１の翻訳始点と、そのすぐの周囲部分とについて調べた。

かつて、翻訳始点のヌクレオチドコンテキストは、翻訳開始の強度に影響を及ぼすことが報告された（Ｋｏｚａｃ（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５（２０）：８１２５〜８１４８、国際公開第ＷＯ２００７／０４６７０３号）。好ましいヌクレオチドは、ＡＵＧを、それぞれ、＋１、＋２、及び＋３とするときの、（−３）位におけるＡ及び（＋４）位におけるＡであると考えられる（Ｋｏｚａｃ、前出、国際公開第ＷＯ２００７／０４６７０３号）。表２は、３つのＶＰの発現を調整するように、翻訳開始点、その上流及び下流のコンテキストへと導入された特異的変化を詳細に示す。本発明者らは、本来ＶＰ２翻訳始点の周囲に配置されている上流の開始コンテキスト：多様な非カノニカルの開始コドン（ＡＣＧ、ＣＴＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ）、＋２位の野生型三項対への多様な突然変異誘発性変化、及び＋１位の開始三項対と、＋２位の野生型三項対との間の挿入について調べた。これらの特徴の組合せを包含する発現カセットを、ｒＡＡＶの産生のために使用した。

３．２．ＶＰ１の翻訳開始点周囲の小さなヌクレオチド変化は、ベクターの効力に対して重大な効果を及ぼす

表２に列挙されるｃａｐ５発現カセットの全ての変異体を持つバキュロウイルス構築物を作り出すことに成功した。その後、Ｒｅｐ（複数可）及び導入遺伝子（レポーター遺伝子、例えば、ＳＥＡＰ又はＦＩＸ）を持つバキュロウイルスと組み合わせた、これらのバキュロウイルス構築物を、ｒＡＡＶの産生のために使用した。被験構築物のうちの一部は、複数回の試みにも拘らず、ｒＡＡＶの産生を支援しなかった。これは、野生型ＡＡＶ５（構築物７６３）及び非カノニカルの始点である、ＴＴＧ（構築物７６４）、ＧＴＧ（構築物７６６）を持つ構築物のうちの一部を含んだ。表２に列挙される他の全ての構築物は、ｒＡＡＶの産生の成功を結果としてもたらした。

産生に成功した５型ｒＡＡＶ変異体の３つのウイルスタンパク質（ＶＰ）を単離した。３つのＶＰの当量比について、精製されたベクターの電気泳動による分離（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により調べた（図１及び６）。ｃａｐ５遺伝子の発現カセットへと導入される小さな修飾は、３つのＶＰタンパク質の発現及び／又はアセンブリーに対して重大な効果を及ぼし、これは、カプシドの組成に反映されると考えられる。本発明者らは、Ｕｒａｂｅらにより、昆虫細胞による血清型２の産生を可能とする修飾として報告された、非カノニカルの開始コドン（ＡＣＧ）及び９ヌクレオチドの上流コンテキストであるＣＣＴＧＴＴＡＡＧの導入を介する、血清型５カプシドの、昆虫細胞への適合が、ＶＰ１の低度の組込み（低ＶＰ１／ＶＰ２比）及び過剰レベルのＶＰ３のカプシドへの組込み（高ＶＰ３／ＶＰ１比）を結果としてもたらし、３つのＶＰの当量比の異常を結果としてもたらしたことに注目した（図１、構築物１５９）。同様に、Ｇを構成する、＋４位のヌクレオチドの修飾、カノニカルのコザック配列に酷似させる修飾であって、＋２位のセリンの、アラニン（構築物１６１）への交換を結果としてもたらす修飾も、ＶＰ１の低度の組込み及びＶＰ３の高度の組込み（低ＶＰ１／ＶＰ２及び高ＶＰ３／ＶＰ１）を結果としてもたらした。上流のＣＣＴＧＴＴＡＡＧ及び下流の修飾、すなわち、＋４位のヌクレオチドのＡへの変化（構築物１６２）、又は＋４〜５位のヌクレオチドのＡＧへの変化（構築物１６４）、又は元の＋２位の三項対のＡＧＣへの修飾を伴う、第２の三項対としてのＡＣＴの挿入（構築物１６３）と組み合わせた、異なる非カノニカルのコドンであるＣＴＧの使用も、ＶＰ１のカプシドへの組込みを改善せず、低ＶＰ１／ＶＰ２及び高ＶＰ３／ＶＰ１を結果としてもたらした。１に近いＶＰ１／ＶＰ２比を示す構築物のうちの１つは、すぐの上流におけるＣＣＴＧＴＴＡＡＧの挿入、非カノニカルのＡＣＧ、及び野生型配列と比較した、＋２位における、ＧＣＴによりコードされる、さらなるアラニンの挿入を包含する構築物１６０であったが、ＶＰ３の組込みは、やはり過剰であった（等ＶＰ１／ＶＰ２及び高ＶＰ３／ＶＰ１）。その後、構築物１６０のプロモーター配列を、野生型のポリヘドリンプロモーターにより正確に相似するように突然変異させた。これにより、突然変異体７６１を作り出した。ＶＰ２の開始コンテキストを除去して、突然変異体７６２を創出した。いずれの場合（７６１及び７６２）にも、構築物１６０と比較して、ウイルスの当量比に対する否定的影響（低度のＶＰ１組込み）がわずかに認められた（図１）。次に、構築物１６０のＶＰ１の翻訳開始部位（翻訳開始コドンのすぐ下流の有益なＧＣＴを保存する）を、野生型のＡＴＧ（突然変異体７６３）、ＴＴＧ（突然変異体７６４）、ＣＴＧ（突然変異体７６５）、ＧＴＧ（突然変異体７６６）へと変化させた。突然変異体７６５以外の全ては、ｒＡＡＶの検出可能な産生の欠如を結果としてもたらした。興味深いことに、非カノニカルのＶＰ１開始点としてのＣＴＧと、翻訳始点（７６５）の直後に続く、ＧＣＴ三項対（追加のアラニンをコードする）の付加との組合せは、ＶＰ１の、ＶＰ２より高度の組込みと、ＶＰ３の強力な減衰を結果としてもたらし、最終的に、野生型ＡＡＶ様の均衡したＶＰ当量比（高ＶＰ１／ＶＰ２及び中ＶＰ３／ＶＰ１）を結果としてもたらした。最後に、構築物１６０と同様に、ＶＰ１開始コドンとして、ＡＣＧではなく、ＣＴＧを伴う構築物４３は、ほぼ天然のＶＰ比を伴うＶＰ１産生を結果としてもたらした（図６）。
３．３．ＶＰ３の過剰発現は、ＢＥＶＳの真性５型ＡＡＶ突然変異体の低効力の一因である

血清型５カプシドライブラリーの効力、すなわち、ＶＰ当量比の異なるベクターが、その遺伝子材料の発現を駆動する能力について研究するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究及びｉｎ ｖｉｖｏ研究を実施した。２つの異なる継代細胞株、すなわち、Ｈｅｌａ細胞株（図２及び図７（Ａ））及びＨｕｈ７細胞株（図３及び図７（Ｂ））を使用した。いずれの場合にも、ＶＰ２の組込みを下回るＶＰ１の組込みと、ＶＰ３の過剰な組込みとを示す突然変異体のセット（構築物１５９、１６１〜１６４）は、効力の大幅な低減を示した（図２〜３）。ベクターの効力は、ＶＰ１の組込みとＶＰ２の組込みとを均衡させることにより、大きく改善された（構築物１６０）。プロモーターの短縮（構築物７６１）及びイニシエーター構築物の除去（構築物７６２）は、ベクターの効力に対して否定的な影響を及ぼした。最も強力なベクター、構築物７６５（図２〜３）は、ＶＰ１に有利なＶＰ１対ＶＰ２比と、ＶＰ３組込みの著しい減殺とを示した。最後に、イニシエーター構築物、ＣＴＧ開始コドン、及びさらなるＧＣＴ三項対（追加のアラニンをコードする）と組み合わせたｐｏｌＨプロモーター（非短縮型）（構築物４３）は、構築物７６５の効力を幾分下回るが、良好な効力を示した（図７（Ａ）及び（Ｂ））。

突然変異体のサブセット（構築物１５９〜１６４）を、ｉｎ ｖｉｖｏ（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）において、効力について調べた。ベクターは、レポーター遺伝子であるＳＥＡＰを保有した。マウスに、カプシド５変異体を、５×１０^１２ｇｃ／ｋｇの用量で注射し、ある時間にわたりモニタリングした。被験セット中で最良の効力を示した変異体（１６０）はまた、ＶＰ１／ＶＰ２が当モル量でもあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける観察と符合した（図４）。
３．４．昆虫細胞により産生される純種のＡＡＶ５（７６５）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、キメラ２／５型突然変異体より優れた効能を示す

ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＡＶ５（７６５）の効力について調べるために、３つのベクターバッチを調製した。これらのバッチは、キメラ２／５型（９２）（Ｕｒａｂｅら（２００６）、前出）、過剰量のＶＰ３を含有する純種５型ＡＡＶ（１６０）、及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて最良の効能を示す純種５型ＡＡＶであって、野生型のＶＰ当量比を示す純種５型ＡＡＶ（７６５）を含んだ。全てのバッチは、Ｒｅｐタンパク質及びＦＩＸ発現カセットを持つバキュロウイルス構築物（国際公開第ＷＯ２００６／３６５０２号において記載されている）を使用して、同じ条件下で産生された。３つのベクター調製物の効力を比較するために、ｂｌａｃｋ６マウスに、２つの異なる用量、すなわち、２ｅ１２ｇｃ／ｋｇの低用量及び２ｅ１３ｇｃ／ｋｇの高用量のベクターを注射した。媒体群を含む、マウス５匹ずつからなる、合計７つの群を、実験に組み入れた。実験の開始後、１、２、及び４週目に血液を回収した。ＦＩＸの発現は、特異的ＥＬＩＳＡを介して、血液中でモニタリングした。結果は、新たに作り出された突然変異体７６５は、構築物１６０に対する効力の有意な改善を提示するという、かつてのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける知見を裏付けた。興味深いことに、構築物７６５はまた、Ｕｒａｂｅら（２００６）（前出）により公表された、２／５型キメラ（構築物９２）より有意に良好でもあった（図５）。対応のないｔ検定を使用して、７６５と１６０との差違、及び７６５と９２との差違について調べた。全ての場合において、すなわち、１、２、及び４週目において、ｐ値＜０．０５とする統計学的有意差が認められた。
４．考察

昆虫細胞のｒＡＡＶの産生は、ｃａｐ遺伝子の遺伝子構成における多数の調整を要求する。哺乳動物細胞では、ＡＡＶは、代替法スプライシングを活用し、ＶＰ２のＡＣＧイニシエーター始点の活用を低下させることにより、そのＶＰタンパク質を、単一のオープンリーディングフレームから発現させる。これは、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の当量比として、１：１：１０を結果としてもたらす。昆虫細胞では、これらの機構は、ＡＡＶベクターを、正確なＶＰ当量比で産生させることができない（Ｕｒａｂｅら（２００２）、前出）。これは、かつて、ＶＰ１イニシエーター三項対を、ＡＣＧへと変化させ、翻訳開始部位に由来する上流の９ヌクレオチドを突然変異させることにより、ｒＡＡＶ２血清型を作り出すために、Ｕｒａｂｅらにより回避された公知の問題である。これらの変化は、３つのｒＡＡＶ２ ＶＰ全ての、正確な当量比における産生を結果としてもたらした。ｒＡＡＶ５発現カセットの同様の遺伝子変化は、低度のＶＰ１産生及び産生されたウイルスの低効力を結果としてもたらした。ｒＡＡＶ２に対する遺伝子適合の成功に基づき、Ｕｒａｂｅらは、ｒＡＡＶ５が、ＶＰ１の多様な長さのＮ末端部分を、ＡＡＶ２から受け取る（７アミノ酸〜最大１３６アミノ酸の範囲にわたる）、一連の６ドメインスワップ突然変異体を作製することを決定した。この手法は、正確なＶＰ当量比を示す、キメラｒＡＡＶ５の産生を結果としてもたらした。さらに、ドメインスワップ突然変異体は、２９３Ｔ細胞で産生されたｒＡＡＶ５の効力（Ｕｒａｂｅら（２００６）、前出）と同様であるか又はこれより優れた効力を結果としてもたらした。Ｕｒａｂｅらは、キメラｒＡＡＶ５を、昆虫細胞で産生させうることを裏付けたが、得られるベクターは、真正のＡＡＶ５粒子を含まず、それ自体、既存の中和抗体に対する感受性、細胞内トラフィッキング、生体内分布、及び／又はターゲティングなど、多様な側面において、真性のＡＡＶ５血清型と異なりうる。同時に、Ｕｒａｂｅらは、ＶＰ１ポリペプチドの合成が低度であるために、純種の感染性ｒＡＡＶ５を産生させようとする試みが、失敗したことについても報告した（Ｕｒａｂｅら（２００６）、前出）。

本実施例では、本発明者らは、昆虫細胞で産生される純種のｒＡＡＶ５の低効力の根底をなす決定因子を理解することを目的として、ｃａｐ５突然変異体のライブラリーを構築した。まず、本発明者らは、昆虫細胞のｒＡＡＶ２の産生の成功でかつて使用された多数の適合を組み込んだ突然変異体（１５９）について検討した（Ｕｒａｂｅら（２００２）、前出）。この突然変異体は、ＶＰ１翻訳始点及び非カノニカルの翻訳開始点ＡＣＧの上流に配置された、上流の９ヌクレオチドである、ＶＰ２イニシエーターコンテキストを含有する。これらの９ヌクレオチドは、かつて、Ｕｒａｂｅらにより、昆虫細胞で血清型２遺伝子を発現させるのに使用された（Ｕｒａｂｅら（２００２）、前出）。この特定の配列は、天然で、ＶＰ２の非カノニカルの開始コドン（ＡＣＧ）に隣接する。次に、野生型のＡＴＧを、ＡＣＧ又はＣＴＧへと変化させ、開始コドンから下流の最適のコンテキストを用意するために、多様な突然変異を導入した。大半の突然変異体は、ＶＰ１組込みが低度であり、ＶＰ３が過剰に存在する、ＶＰ当量比の異常（低ＶＰ１／ＶＰ２比及び高ＶＰ３／ＶＰ１比）を示した。遺伝子デザイン１６０では、ＶＰ１／ＶＰ２の比が大きく改善されたが、なおも、ベクター粒子へのＶＰ３の過剰な組込みを示した。最後に、遺伝子デザインのうちの１つ、すなわち、７６５は、他の被験変異体と比較して、ＶＰ１の高度の組込み（高ＶＰ１／ＶＰ２比）を示し、ＶＰ３の組込みを低減した（ＶＰ３／ＶＰ２比の均衡）。

低ＶＰ１タンパク質／ＶＰ２タンパク質比は、以前、低ベクター効力の一因であると仮定された（Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５１（２）：３２９〜３３９、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５１（３）：６１１〜６１９）。ＡＡＶの固有のＶＰ１部分は、カプシド内部に埋め込まれており、ウイルスの、核への細胞内トラフィッキング時に露出される。このＶＰ１部分は、まず、エンドソーム腔のｐＨの低下への応答として露出される。ＶＰ１の遊離Ｎ末端部分は、カプシドの外部へと曝露されると、リン脂質基質のヒドロラーゼ特異的な２−アシルエステル（ｓｎ−２）結合に利用され、リゾリン脂質及び遊離脂肪酸の放出を結果としてもたらし、これにより、エンドソームからのＡＡＶの漏出を可能とする、ホスホリパーゼドメインを含有する。固有のＶＰ１部分は、核局在化シグナル（塩基性アミノ酸のクラスター）を含有し、ＡＡＶの核ターゲティングに関与していた。最後に、一部の研究者は、固有のＶＰ１部分は、核でのウイルスの脱殻において役割を果たしうることを示唆している。低ＶＰ１／ＶＰ２比及びウイルス粒子へのＶＰ３の過剰な組込み（高ＶＰ３／ＶＰ１比）は、１）平均における、アセンブルされる粒子へのＶＰ１の組込みの減殺、又は２）２つの粒子集団：Ａ）正確にアセンブルされた粒子（当量比が野生型の１：１：１０に近い粒子、すなわち、ベクター粒子１つ当たりのＶＰ１分子５つの粒子）、Ｂ）ＶＰ３／ＶＰ２だけによる粒子の産生のいずれかを結果としてもたらしうる。両方いずれの状況（１及び２）においても、このようなベクター調製物は、効力を変化させている。ベクター調製物中に存在する過剰なＶＰ３タンパク質（ＶＰ１又はＶＰ２と比較して）は、エンドソーム漏出の攪乱のために、ベクターの核へのトラフィッキングの障害を結果としてもたらす可能性が高い。ＶＰ当量比は、ベクター効力に有害であるという仮説を検証し、より強力なベクターを作り出すために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、血清型５カプシドの突然変異体のライブラリーについて調べた。

ＶＰ当量比は、ベクターの効力とよく相関すると考えられた。以前に示された通り（Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）、前出、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）、前出、国際公開第ＷＯ２００７０４６７０３Ａ２号）、低ＶＰ１／ＶＰ２比は、ウイルスの効力に強力な影響を及ぼす。突然変異体１５９、１６１〜１６４は全て、低ＶＰ１／ＶＰ２比及び効力の多大な低減を示した。ＶＰ１／ＶＰ２の間の比の改善は、ベクターの効力に対して、著しい影響を及ぼした（１６０）。興味深いことに、ＶＰ１／ＶＰ２比のさらなる改善及びベクター粒子へのＶＰ３の組込みの減殺（ＶＰ３／ＶＰ１比の低下）は、改善されたベクター４３及び被験セットの中で最も強力なベクター（構築物７６５）の作製を結果としてもたらした。このデータは、ベクター粒子の分子組成が、その効力にとって有害であることを明らかに指し示す。ＶＰ１の組込みの改善と、同時的なＶＰ３の組込みの減殺は、ベクター効力の点で、最良の結果をもたらすと考えられる。既に、ＢＥＶＳで産生される低ＶＰ１／ＶＰ２比の粒子の影響は、ベクター効力に対して否定的な影響を及ぼすことが報告されている。これまで、ＶＰ２／ＶＰ３の比については、主に、ＢＥＶＳの産生のための、その遺伝子デザインが、野生型ＡＡＶウイルスにおけるデザインと同じであるという事実のために、考えられてこなかった。このため、ＢＥＶＳの産生のための遺伝子デザインが、ＶＰ２／ＶＰ３比の変化をもたらすことは、予期されなかった。しかし、本明細書で提示される突然変異体のうちの１つを除く全てについて、本発明者らがベクター粒子へのＶＰ３の過剰な組込み（高ＶＰ３／ＶＰ１比）を観察したことから、翻訳始点周囲のＶＰ１の変化は、ＶＰ２及びＶＰ３の発現に強力な影響を及ぼすことが指し示される。突然変異体７６５だけが、ＶＰ１／ＶＰ２比を高値とし、ＶＰ３の組込みを減殺させる当量比の均衡を示し、これは、他の被験変異体と比較した効力の増大を結果としてもたらした。さらに、変異体７６５の効力を、ｉｎ ｖｉｖｏ（マウス）において、ＢＥＶＳで産生されるＡＡＶ５様ベクター（構築物９２）と比較した。構築物９２は、ＡＡＶ血清型５の、血清型２のＮ末端の１３６アミノ酸部分とのキメラである（Ｕｒａｂｅら（２００６）、前出）。構築物９２は、真性のＡＡＶ５を含まないが、ＢＥＶＳでＡＡＶ５様粒子を作製するために現在利用可能な唯一の代替法である。構築物７６５は、構築物９２に対する統計学的に有意な優位性を示した。

本発明者らは、ＶＰ１の翻訳動機の突然変異誘発性変化による、下流のＶＰ２及びＶＰ３の発現に対する強力な影響は、翻訳過程自体と関連すると仮定する。真核生物では、翻訳は、一方向であり、ｍＲＮＡの５’で始まる。リボソームは、ｍＲＮＡと係合すると、タンパク質の合成を開始するのに適切なコンテキストにおいて、ＡＴＧの翻訳始点を見出すまで前進する。場合によって、弱い開始点、例えば、ＡＣＧ又はＣＴＧであっても、周囲に適切なヌクレオチドコンテキストが存在すれば、非カノニカル方式でタンパク質の合成を開始しうる。この機構は、漏出性リボソーム走査と呼ばれる。ＶＰ１における漏出性リボソーム走査の強度は、リボソームの、ＶＰ２及びＶＰ３への「漏出」、及びＶＰ２及びＶＰ３からのタンパク質の発現の強度の一部を決定するであろう。逆に、３つの構成要素全ての発現は、アセンブルされる最終的なカプシドにおけるそれらの存在を決定するであろう。

Claims (15)

1. 改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のヌクレオチド配列を有し、前記オープンリーディングフレームが、５’から３’の順序で
   （ｉ）ＣＴＧ及びＡＣＧからなる群から選択される、次善の翻訳開始コドンである第１のコドンと、
   （ｉｉ）アラニンをコードする、前記第１のコドンの後のさらなる第２のコドンと、
   （ｉｉｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、前記第２のコドンの直後に続く配列であって、ＶＰ１翻訳開始コドンＡＴＧを有さない野生型のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームである、配列と
   を含む、核酸分子。
2. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型８、又はＡＡＶ血清型９カプシドタンパク質であり、好ましくは、前記カプシドタンパク質が、配列番号２２、２８、３０、７１、及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
3. 前記第２のコドンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、及びＧＣＧからなる群から選択され、好ましくは、前記コドンが、ＧＣＴである、請求項１又は請求項２に記載の核酸分子。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が、昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されている、核酸構築物。
5. 改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が、ポリヘドロンプロモーター、ｐ１０プロモーター、４×Ｈｓｐ２７ ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーター、デルタＥ１プロモーター、及びＥ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４に記載の核酸構築物。
6. 昆虫適合性ベクター、好ましくは、バキュロウイルスベクターである、請求項４又は請求項５に記載の核酸構築物。
7. 前記核酸分子が、配列番号５１、６９、４２、４７、及び４８、好ましくは、配列番号５１からなる群から選択されるオープンリーディングフレームを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
8. 請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む昆虫細胞。
9. 前記第１のヌクレオチド配列に加えて、
   （ａ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列と、
   （ｂ）昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第３のヌクレオチド配列と、
   （ｃ）任意選択で、昆虫細胞での発現用の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第４のヌクレオチド配列と
   を含む、請求項８に記載の昆虫細胞。
10. （ａ）請求項９の（ｂ）及び（ｃ）に記載の第３及び第４のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載の第１の核酸構築物と、
    （ｂ）請求項９の（ａ）に記載の第２のヌクレオチド配列を含み、好ましくは、昆虫細胞適合性ベクター、より好ましくは、バキュロウイルスベクターである、第２の核酸構築物と
    を含む、請求項９に記載の昆虫細胞。
11. 前記第２のヌクレオチド配列が、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（哺乳動物細胞で発現させるための）をさらに含み、目的の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、前記昆虫細胞で産生されるＡＡＶ血清型５のゲノムへと組み込まれ、好ましくは、前記第２のヌクレオチド配列が、２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、目的の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、前記２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列の間に配置されている、請求項９又は１０に記載の昆虫細胞。
12. 前記第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列と、第３のヌクレオチド配列と、任意選択で、第４のヌクレオチド配列とが、前記昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項９に記載の昆虫細胞。
13. ゲノムに、目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、天然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
    （ｉ）ＣＴＧ及びＡＣＧからなる群から選択される次善の翻訳開始コドンによりコードされる第１のアミノ酸残基と、
    （ｉｉ）前記第１のアミノ酸残基の後のさらなる第２のアミノ酸残基であるアラニンと、
    （ｉｉｉ）前記第２のアミノ酸残基の直後に続くアミノ酸配列であって、ＶＰ１翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基を有さない野生型のＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列である、アミノ酸配列と
    を含む、ＡＡＶビリオン。
14. ＡＡＶを昆虫細胞で産生させるための方法であって、（ａ）請求項８〜１２のいずれか一項に記載の昆虫細胞を、ＡＡＶが産生されるような条件下で培養するステップと、任意選択で、（ｂ）前記ＡＡＶを回収するステップとを含む方法。
15. 前記目的の遺伝子産物が、第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする、請求項１３に記載のＡＡＶビリオン。

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