KR20160131032A - 곤충 세포에서 생산된 더욱 향상된 aav 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곤충 세포에서 아데노 연관 바이러스 벡터의 생산에 관한 것이다. 따라서, 상기 곤충 세포는 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 AAV VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 논-ATG, 차선 개시 코돈이며, 그리고 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 코딩 서열은 상기 차선 번역 개시 코돈과 제1 아미노산 잔기가 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 또는 글루탐산인 와일드 타입 캡시드 단백질 아미노산 서열의 위치 2의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 삽입된다. 상기 곤충 세포는 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep52 또는 Rep40 코딩 서열을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열; 및 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep78 또는 Rep68 코딩 서열을 포함하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 본 발명은 또한 변경된 비율의 상기 바이러스 캡시드 단백질들을 갖는 아데노 연관 바이러스 벡터에 관한 것이다.

Description

곤충 세포에서 생산된 더욱 향상된 AAV 벡터{FURTHER IMPROVED AAV VECTORS PRODUCED IN INSECT CELLS}
본 발명은 곤충 세포에서 아데노 연관 바이러스의 생산 및 향상된 감염성을 제공하는 아데노 연관 바이러스에 관한 것이다.
아데노 연관 바이러스(AAV)는 인간 유전자 치료를 위한 가장 유망한 바이러스 벡터 중 하나로서 간주될 수 있다. AAV는 분열하지 않는 인간 세포뿐만 아니라 분열하는 인간 세포를 효율적으로 감염시키는 능력을 가지며, 상기 AAV 바이러스 게놈은 숙주 세포의 게놈 내의 단일 염색체 위치 내로 통합되며, 그리고 가장 중요하게도, AAV가 많은 인간들 내에 존재함에도 불구하고, 이는 어떠한 질병과 결코 연관되지 않아왔다. 이러한 이점의 견지에서, 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)는 B형 혈우병, 악성 흑색종, 낭성 섬유증, 및 기타 질병을 위한 유전자 치료 임상 시험에 평가되어 지고 있다. 유럽에서 1차 유전자 치료약, Alipogene tiparvovec (Glybera®, uniQure)의 수많은 임상 시험 및 최근의 승인은 AAV가 임상 수행의 중심이 되는 가능성을 받쳐준다.
일반적으로, 재조합 AAV를 위한 두 가지 주요 타입의 생산 시스템이 있다. 한편으로, (293 세포, COS 세포, HeLa 세포, KB 세포와 같은) 포유류 세포 타입에서 통상적인 생산 시스템이 있으며, 다른 한편으로 보다 최근에, 곤충 세포를 이용한 생산 시스템이 개발되었다.
포유류 생산 시스템은 여러 결점을 겪으며, 그 중에서 치료 용도를 위해 가장 중요한 것은 세포당 만들어지는 rAAV 파티클의 제한된 수이다(104 파티클의 자릿수(Clark, 2002, Kidney Int. 61(Suppl. 1): 9-15에서 리뷰됨)). 임상 연구를 위해, 1015 이상의 rAAV 파티클이 요구될 수 있다. 이러한 수의 rAAV 파티클을 생산하기 위해, 5,000 175-cm2 플라스크의 세포들과 동등한, 약 1011 배양된 인간 293 세포를 이용한 트랜스펙션 및 배양이 요구될 수 있으며, 이는 최대 1011 293 세포의 트랜스펙팅을 의미한다. 임상 시험을 위한 재료를 확보하기 위해 포유류 세포 배양 시스템을 이용한 rAAV의 대규모 생산은 이미 문제가 있으며, 상업적 규모의 생산은 전혀 실현 가능한 것이 아닌 것으로 입증되었다. 또한, 포유류 세포 배양에서 생산되는 임상용 벡터는 포유류 숙주 세포에 존재하는 원하지 않는, 아마도 병원성의 물질로 오염될 위험이 항상 존재한다.
포유류 생산 시스템의 이러한 문제를 해소하기 위해, 곤충 세포를 이용한 AAV 생산 시스템이 개발되었다(Urabe 등, 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943; US 20030148506 및 US 20040197895). 곤충 세포에서 AAV의 생산에 있어서, 3가지 AAV 캡시드 단백질(VP1, VP2 및 VP3)의 정확한 화학양론을 달성하기 위해 일부 변형이 필요하였으며, 이는 2가지 스플라이스 억셉터 사이트의 교대적인 사용과 곤충 세포에 의해 정밀하게 재생성되지 않는 VP2에 대한 ACG 개시 코돈의 차선적인 활용의 조합에 의존한다. 곤충 세포에서 캡시드 단백질의 정확한 화학양론을 모방하기 위해, Urabe 등(2002, 상기 참조)은 스플라이싱이 필요없이 3가지 모든 VP 단백질을 발현할 수 있는 단일의 폴리시스트론성 메신저 내로 전사되는 구조체를 사용하며, 그리고 여기서 가장 상류의 개시 코돈은 차선의 개시 코돈 ACG로 대체된다.
WO2007/046703에는 곤충 세포에서 AAV 캡시드 단백질의 화학양론의 최적화에 의한 생산에 기초한 배큘로바이러스-생산된 rAAV 벡터의 감염성의 추가 향상이 개시되어 있다.
Kohlbrenner 등(2005, Mol. Ther. 12: 1217-25)은 Urabe 등에 의해 사용된 2가지 Rep 단백질의 발현을 위한 배큘로바이러스 구조체가 내재된 불안정성을 겪는 것으로 보고하였다. Urabe의 오리지널 벡터에서 2가지 Rep 유전자의 회문구조 배향(palindromic orientation)을 분열시키고, Rep52 및 Rep78을 발현하는 2가지 개별 배큘로바이러스 벡터를 디자인함으로써, Kohlbrenner 등(2005, 상기 참조)은 벡터의 패시징 안정성을 증가시켰다. 그러나, 적어도 5 패시지에 걸쳐 곤충 세포에서 2 독립적인 배큘로바이러스-Rep 구조체로부터 Rep78 및 Rep52의 일관된 발현에도 불구하고, rAAV 벡터 수율은 Urabe 등(2002, 상기 참조)에 의해 디자인된 오리지널 배큘로바이러스-Rep 구조체에 비해 5 내지 10 배 더 낮다.
WO2009/014445는 차등 코돈 바이어스(differential codon biases)를 갖는 반복된 코딩 서열을 이용하여 배큘로바이러스-기초 rAAV 벡터 생산 중에 안정성을 향상시키는 대안을 제공한다.
Urabe 등(J. Virol., 2006, 80(4):1874-1885)은 VP1 캡시드 단백질의 개시 코돈으로서 ACG를 사용하는 배큘로바이러스 시스템에서 생산된 AAV5 파티클이 저조한 감염성을 가지며, 그리고 ACG 개시 코돈으로부터 발현된 VP1을 갖는 AAV2와 대조적으로, AAV5 VP1 코딩 서열에서 +4 위치를 G-잔기로 돌연변이시키는 것은 감염성을 향상시키지 못한 것으로 보고한다. Urabe 등은 이 문제를, 비리온의 감염성을 향상시키기 위해 AAV5 VP1의 적어도 49 아미노산이 AAV2 VP1의 이에 상응하는 부분으로 대체된 키메릭 AAV2/5 VP1 단백질을 제작함으로써 해소하였다. 따라서, 광범위한 변형 없이 감염성을 보유하는 ACG 개시 코돈으로부터 발현된 AAV5 VP1에 대한 요구가 당해 기술분야에 여전히 존재한다.
그러나, 본 발명자들은 AAV 벡터, 특히 배큘로바이러스 시스템에서 생산된, Urabe(Urabe 등, 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943), WO2007/046703 또는 WO2009/014445에 따라 변형된 논-키메릭 AAV5 벡터와 같은 AAV5 벡터가 예를 들어, 통상적인 포유류 293 세포에서 생산된 이에 상응하는 AAV 벡터와 비교하여 마우스에서 시험관 내 및 생체 내 시험에서 감소된 감염성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이런 이유로, 향상된 감염성을 갖는 rAAV 벡터를 위한 배큘로바이러스-기초 생산 시스템에 대한 요구가 여전히 존재한다.
발명의 설명
발명의 간단한 설명
제1 견지로, 본 발명은 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자로서, 여기서 상기 리딩 프레임은 5'에서 3' 순서로
(i) CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선 번역 개시 코돈인, 제1 코돈;
(ii) 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기를 암호화하는 제2 코돈;
(iii) 선택적으로, 상기 제2 코돈 다음에 부가적인 아미노산 잔기를 암호화하는 하나 이상의 코돈; 및
(iv) 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 서열로서, 이에 따른 서열은 단지 VP1 번역 개시 코돈만이 결핍된, 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 서열
을 포함하거나, 또는 이로 구성되는, 핵산 분자에 관한 것이다.
바람직한 구현으로, AAV 캡시드 단백질은 AAV 혈청형 5, AAV 혈청형 8, 또는 AAV 혈청형 9 캡시드 단백질이며, 보다 바람직하게 AAV 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 22, 28, 30, 71 및 73으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 보다 바람직한 구현으로 제2 코돈은 알라닌을 암호화한다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 보다 바람직한 구현으로 제2 코돈은 GCT, GCC, GCA, GCG 및 GGU로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게 여기서 상기 코돈은 GCT이다.
제2 견지로, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조체로서, 여기서 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 구조체에 관한 것이다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 보다 바람직한 구현으로, 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 폴리헤드론(polyhedron) 프로모터, p10 프로모터, 4xHsp27 EcRE+minimal Hsp70 프로모터, deltaE1 프로모터, E1 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 발명의 바람직한 구현으로, 상기 구조체는 곤충-호환성 벡터, 바람직하게 배큘로바이러스 벡터이다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 51, 69, 42, 47, 48 및 50으로 구성된 그룹으로부터 선택된 오픈 리딩 프래임, 바람직하게는 SEQ ID NO:51 또는 SEQ ID NO:69, 보다 바람직하게 SEQ ID NO:51의 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
제3 견지로, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 구조체를 포함하는 곤충 세포에 관한 것이다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 보다 바람직한 구현으로, 곤충 세포는 또한 (a) 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; (b) 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep78 또는 Rep68 코딩 서열을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열; (c) 선택적으로, 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep52 또는 Rep40 코딩 서열을 포함하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 보다 바람직한 구현으로, 곤충 세포는 (a) 본 발명에 따른 제1 핵산 구조체로서, 이에 따라 제1 핵산 구조체는 상기 정의한 바와 같은 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 제1 핵산 구조체; 및 (b) 상기 정의한 바와 같은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산 구조체로서, 여기서 제2 핵산 구조체는 바람직하게 곤충 세포-호환성 벡터, 보다 바람직하게 배큘로바이러스 벡터인 제2 핵산 구조체를 포함한다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 보다 바람직한 구현으로, 제2 뉴클레오타이드 서열은 (포유류 세포에서 발현을 위한) 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 그리고 이에 따라 상기 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 생산된 AAV 혈청형 5의 게놈 내로 통합된다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 보다 바람직한 구현으로, 제2 뉴클레오타이드 서열은 2개의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 그리고 여기서 상기 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 상기 2개의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열 사이에 위치한다.
변형적으로 또는 어떠한 이전의 구현과 조합으로, 보다 바람직한 구현으로, 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 뉴클레오타이드 서열 및 선택적으로 제4 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다.
제4 견지로, 본 발명은 AAV 비리온으로서, 이의 게놈 내에 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이에 따른 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 네이티브 AAV 뉴클레오타이드 서열이 아니며, 그리고 여기서 AAV VP1 캡시드 단백질은 N 말단으로부터 C 말단으로
(i) 제1 아미노산 잔기로서, 이는 번역 개시 코돈에 의해 암호화되며, 바람직하게 CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선의 번역 개시 코돈에 의해 암호화되는 제1 아미노산 잔기;
(ii) 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 제2 아미노산 잔기;
(iii) 선택적으로, 제2 아미노산 잔기 다음에 하나 이상의 부가적인 아미노산 잔기; 및
(iv) AAV VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열로서, 이에 따른 서열은 VP1 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 아미노산 잔기만 결핍된 AAV VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열
을 포함하거나, 또는 이로 구성되는, AAV 비리온에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 AAV 비리온은 팩터 IX 또는 팩터 VIII 단백질을 암호화하는 관심있는 유전자 산물을 포함한다.
제5 견지로, 본 발명은 (a) AAV가 생산되는 조건하에서 본 발명에 따른 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로 (b) 상기 AAV의 회수 단계를 포함하는, 곤충 세포에서 AAV를 생산하는 방법에 관한 것이다.
도 1: 리포터 트랜스진 SEAP가 은닉되어 있는 다양한 돌연변이 캡시드들을 NuPage 겔 상에서 정제 및 분석하였다. 3가지 캡시드 단백질, VP1(87kDa), VP2(72kDa) 및 VP3(62kDa)이 나타났다.
도 2: Hela 세포에서 seap 발현 카세트를 운반하는 다양한 AAV5 캡시드 돌연변이들을 이용한 시험관 내 효능 어세이. 리포터 유전자의 활성은 광 방출로서 간접적으로 측정되고, RLU(상대적인 광 유니트, relative light units)로 표현된다. NTC=네가티브 컨트롤.
도 3: Huh7 세포에서 seap 발현 카세트를 운반하는 다양한 AAV5 캡시드 돌연변이들을 이용한 시험관 내 효능 어세이. 리포터 유전자의 활성은 광 방출로서 간접적으로 측정되고, RLU(상대적인 광 유니트, relative light units)로 표현된다. NTC=네가티브 컨트롤.
도 4: C57BL/6 마우스에서 seap 발현 카세트를 운반하는 다양한 캡시드 돌연변이들의 생체 내 효능 어세이. 리포터 유전자의 활성은 광 방출로서 간접적으로 측정되고, RLU(상대적인 광 유니트, relative light units)로 표현된다.
도 5: C57BL/6 마우스에서 FIX 발현 카세트를 운반하는 다양한 AAV5 캡시드 돌연변이들의 생체 내 효능 어세이. FIX 발현은 두 가지 다른 벡터, 즉 캡시드 변이체 160 및 765의 투여시 마우스에서 모니터되었다. 두 캡시드 모두 FIX 발현 카세트를 운반한다. FIX는 특정 ELISA을 이용하여 주사 후 1주, 2주 및 4주에 혈장에서 측정된다. IU/ml은 1ml의 혈장에서 발견된 FIX 단백질의 국제 유니트를 나타낸다. PBS=인산완충용액
도 6: 리포터 트랜스진 SEAP가 은닉되어 있는 돌연변이 캡시드들을 NuPage 겔 상에서 정제 및 분석하여 3가지 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3를 나타내었다. 구조체 43의 3개의 클론들이 나타났다.
도 7: HeLa 세포(A) 및 Huh7 세포(B)에서 seap 발현 카세트를 운반하는 다양한 AAV5 캡시드 돌연변이들을 이용한 시험관 내 효능 어세이. 리포터 유전자의 활성은 광 방출로서 간접적으로 측정되고, RLU(상대적인 광 유니트, relative light units)로 표현된다(a.u.: 임의 단위(arbitrary units)).
정의
본 명세서에 사용된, 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 폴리뉴클레오타이드(또는 폴리펩타이드) 엘리먼트의 기능적으로 관련된 연결을 칭한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 경우 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전사 조절 서열이 암호 서열의 전사에 영향을 준다면 암호 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된이란, 연결되는 DNA 서열이 전형적으로 인접해 있으며, 두 단백질 암호 리전을 인접적으로, 그리고 리딩 프레임내에 연결하는 것이 필연적인 경우를 의미한다.
"발현 조절 서열"은 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 칭한다. 발현 조절 서열은 발현 조절 서열이 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절 및 조정하는 경우 뉴클레오타이드 서열에 "작동가능하게 연결"된다. 따라서, 발현 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 내재 리보좀 진입 부위(IRES), 전사 종결자, 단백질-암호 유전자 앞쪽에 출발 코돈, 인트론에 대한 스플라이싱 신호, 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 용어 "발현 조절 서열"은 최소한 이의 존재가 발현에 영향을 미치도록 디자인된 서열을 포함하도록 의도되며, 또한 부가적인 이로운 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열이 발현 조절 서열이다. 이 용어는 또한 프레임 안 및 밖에서 바람직하지 않은 잠재적인 개시 코돈이 서열로부터 제거되도록 하는 핵산 서열의 디자인을 포함할 수 있다. 이는 또한 바람직하지 않은 잠재적인 스플라이스 부위가 제거되도록 하는 핵산 서열의 디자인을 포함할 수 있다. 이는 폴리A 꼬리의 첨가, 즉, mRNA의 3'-말단에서의 아데닌 잔기의 스트링, 폴리A 서열로 칭하여지는 서열의 첨가를 지시하는 서열 또는 폴리아데닐화 서열(pA)을 포함한다. 이는 또한 mRNA 안정성을 증진시키도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 프로모터와 같이 전사 및 번역 안정성에 영향을 주는 발현 조절 서열뿐만 아니라 예를 들어 Kozak 서열과 같이 번역에 영향을 주는 서열이 곤충 세포에서 알려져 있다. 발현 조절 서열은 작동가능하게 연결되는 뉴클레오타이드 서열을 보다 낮은 발현 수준 또는 보다 높은 발현 수준이 이루어지도록 하는 것과 같은 특성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "프로모터(promoter)" 또는 "전사 조절 서열(transcription regulatory sequence)"은 하나 이상의 암호 서열의 전사를 조절하는 기능을 하며, 상기 암호 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 업스트림에 위치하며, 구조적으로 DNA-의존성 RNA 폴리머라아제에 대한 바인딩 부위, 전사 개시 부위 및 어느 다른 DNA 서열의 존재로 확인되는 핵산 프래그먼트를 칭하며, 이에 한정하는 것은 아니나 전사 인자 바인딩 부위, 리프레서 및 액티베이터 단백질 바인딩 부위, 및 프로모터로부터 전사량을 직접 또는 간접적으로 조절하는 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 어느 다른 서열을 포함한다. "구성적인(constitutive)" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발생학적 조건하에서 대부분의 조직에서 활성적인 프로모터이다. "유도성(inducible)" 프로모터는 예를 들어, 화학적 유도인자의 적용에 의해 생리학적으로 또는 발생학적으로 조절되는 프로모터이다. "조직 특이적(tissue specific)" 프로모터는 특정 타입의 조직 또는 세포에만 활성적인 프로모터이다.
용어 "실질적으로 동일한(substantially identical)", "실질적 동일(substantial identity)" 또는 "본질적으로 유사한(essentially similar)" 또는 "본질적 유사성(essential similarity)"은 두 펩타이드 또는 두 뉴클레오타이드 서열이 예를 들어, 디폴트 파라미터를 이용한 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해서 최적으로 정렬될 경우, 본 명세서의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 적어도 특정 퍼센트의 서열을 공유하는 것을 의미한다. GAP는 이들의 전장에 걸친 두 서열에 대해 매칭된 수를 최대화하고, 갭의 수를 최소화하는 Needleman과 Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘을 사용한다. 일반적으로, GAP 디폴트 파라미터는 갭 생성 페널티 = 50(뉴클레오타이드)/8(단백질) 및 갭 연장 페널티 = 3(뉴클레오타이드)/2(단백질)로 사용된다. 뉴클레오타이드에 대해 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 nwsgapdna이며, 단백질에 대한 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62이다(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). RNA 서열이 DNA 서열과 본질적으로 동일하거나 특정 정도의 서열 동일성을 갖는 것으로 표현될 경우, DNA 서열에서 티민(T)은 RNA 서열의 우라실(U)와 동일한 것으로 간주되는 것은 명확하다. 퍼센트 서열 동일성에 대한 서열 정렬 및 스코어는 GCG Wisconsin Package, Version 10.3(Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA) 또는 오픈 소스 소프트웨어 Emboss for Windows(현 버전 2.7.1-07)와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 검출될 수 있다. 택일적으로 퍼센트 유사성 또는 동일성은 FASTA, BLAST 등과 같은 데이타베이스에 대해 서치함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 파보바이러스 Rep 단백질 암호 뉴클레오타이드 서열은 또한 각각, 모더레이트, 또는 바람직하게 스트링전트 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO.1의 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드하는 이들의 능력으로 정의될 수 있다. 스트링전트 하이브리드화 조건은 본 명세서에서 적어도 약 25, 바람직하게 약 50뉴클레오타이드, 75 또는 100, 가장 바람직하게 약 200이상의 뉴클레오타이드의 핵산 서열이 약 1M 염, 바람직하게 6 x SSC를 포함하는 용액에서 또는 이에 상당한 이온 강도를 갖는 어느 다른 용액에서 약 65℃의 온도에서 하이브리드하고, 약 0.1M이하의 염, 바람직하게 0.2 x SSC를 포함하는 용액 또는 이에 상당한 이온 강도를 갖는 어느 다른 용액에서 65℃에서 세척하는 조건으로 정의된다. 바람직하게, 하이브리드는 밤새, 즉, 적어도 10시간동안 수행되며, 바람직하게 세척은 세척 용액을 적어도 2회 교체하여 적어도 1시간동안 수행된다. 이러한 조건은 일반적으로 약 90%이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 하이브리드가 일어나도록 한다.
모더레이트 조건은 본 명세서에서 적어도 50 뉴클레오타이드, 바람직하게 약 200 이상의 뉴클레오타이드의 핵산 서열이 약 1M 염, 바람직하게 6 x SSC를 포함하는 용액에서 또는 이에 상당하는 이온 강도를 갖는 어느 다른 용액에서 약 45℃의 온도에서 하이브리드하고, 약 1M 염, 바람직하게 6 x SSC를 포함하는 용액 또는 이에 상당한 이온 강도를 갖는 어느 다른 용액에서 실온에서 세척하는 조건으로 정의된다. 바람직하게, 하이브리드는 밤새, 즉, 적어도 10시간동안 수행되며, 바람직하게 세척은 세척 용액을 적어도 2회 교체하여 적어도 1시간동안 수행된다. 이러한 조건은 일반적으로 약 50%이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 하이브리드가 일어나도록 한다. 당 기술분야의 숙련자는 동일성 50-90% 사이로 달라지는 서열을 특이적으로 확인하기위해 이러한 하이브리드 조건을 변형할 수 있을 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 포유류 세포에서 핵산의 도입 및/또는 발현을 위한 벡터로서 사용하는 동물 파보바이러스, 특히 감염성 휴먼 또는 시미언 AAV와 같은 디펜도바이러스 및 이의 성분(예, 동물 파보바이러스 게놈)의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 곤충 세포에서 생성될 경우 이러한 파보바이러스 벡터의 감염성 향상에 관한 것이다.
파보바이러스과의 바이러스는 소(small) DNA 동물 바이러스이다. 파보바이러스과는 두 아과로 나뉠 수 있다: 척추동물을 감염시키는 파보비리네, 및 곤충을 감염시키는 덴소비리네. 파보바이러스 아과의 멤버는 본 명세서에서 파보바이러스로 칭하여지며, 디펜도바이러스속을 포함한다. 이의 속명으로부터 추정될 수 있는 바와 같이, 디펜도바이러스의 멤버는 이들이 일반적으로 세포배양시 생산적 감염을 위해 아데노바이러스나 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스와 함께 동시감염되는 것을 필요로하는 점에서 독특하다. 디펜도바이러스속은 일반적으로 사람(예, 혈청형 1, 2, 3A, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13) 또는 영장류(예, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 AAV 및 다른 온혈 동물(예, 소, 개, 말, 및 양 아데노 연관 바이러스)을 감염시키는 관련 바이러스를 포함한다. 파보바이러스 및 파보바이러스과의 다른 멤버에 대한 추가 정보는 Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in Fields Virology(3d Ed. 1996)에 기재되어 있다. 편의상 본 발명은 AAV를 기준으로 본 명세서에서 더욱 예시되고 설명된다. 그러나, 본 발명은 AAV로 한정되는 것은 아니며 다른 파보바이러스에 동등하게 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
알려진 모든 AAV 혈청형의 게놈 조직은 매우 유사하다. AAV의 게놈은 약 5,000미만의 뉴클레오타이드(nt) 길이를 갖는 선형의 단일 스트랜드 DNA 분자이다. 역위 말단 반복(ITRs)은 비구성 복제(Rep) 단백질 및 구성(VP) 단백질에 대한 독특한 코딩 뉴클레오타이드 서열 측면에 배치된다. VP 단백질(VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성한다. 말단 145nt는 자기-상보적이며(self-complementary), T-형상 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 듀플렉스가 형성될 수 있도록 조직된다. 이러한 헤어핀 구조는 세포성 DNA 폴리머라아제 복합체에 대한 프라이머로 제공하는 바이러스 DNA 복제용 오리진으로 작용한다. 포유류 세포에서 wtAAV 감염이후에, Rep 유전자(즉, Rep78 및 Rep52)는 각각, P5 프로모터 및 P19 프로모터로부터 발현되며, 두 Rep 단백질 모두 바이러스 게놈의 복제에 일 기능을 갖는다. Rep ORF에서 스플라이싱 이벤트는 실제로 4개의 Rep 단백질(즉, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)의 발현을 일으킨다. 그러나, 포유류 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질을 암호하는 스플라이싱되지 않은 mRNA는 AAV 벡터 생산에 충분한 것으로 나타났다. 또한, 곤충 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질은 AAV 생산에 충분하다. 3가지 캡시드 단백질, VP1, VP2 및 VP3는 p40 프로모터의 단일 VP 리딩 프레임으로부터 발현된다. 포유류 세포에서 wtAAV 감염은 캡시드 단백질 생산을 위해 2개의 스플라이스 억셉터 사이트의 교대 사용과 VP2를 위한 ACG 개시 코돈의 차선 활용의 조합에 의존한다. 그러나, 이는 곤충 세포에서 정확하게 재생산되지 않아, AAV 캡시드 단백질의 정확한 화학양론(stoichiometry)을 획득하기 위해 추가 특징을 필요로 한다.
제1 견지로, 본 발명은 아데노 연관 바이러스(AAV)를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게 캡시드 단백질을 암호화하는 리딩 프레임은 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 와일드 타입 오픈 리딩 프레임에 비해, 적어도: (i) ATG 개시 코돈의 CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선 번역 개시 코돈으로의 대체; 및 (ii) 상기 차선 번역 개시 코돈과 캡시드 단백질 아미노산 서열의 위치 2의 아미노산 잔기, 바람직하게 와일드 타입 캡시드 단백질 아미노산 서열의 위치 2의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 삽입된 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입에 의해 변형된다. (와일드 타입) 캡시드 단백질 아미노산 서열의 위치 2는 바람직하게 (와일드 타입) AAV VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 위치 2를 칭하는 것으로 이해된다. 바람직하게, 상기 차선 번역 개시 코돈은 이의 3'-엔드에서 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에 대한 코돈 직후에 존재한다.
변형적으로, 이러한 견지에서 본 발명은 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자로서, 여기서 상기 리딩 프레임은 5'에서 3' 순서로
(i) CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선 번역 개시 코돈인, 제1 코돈;
(ii) 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 제2 코돈;
(iii) 선택적으로, 상기 제2 코돈 다음에 부가적인 아미노산 잔기를 위한 하나 이상의 코돈; 및
(iv) AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 서열로서, 이에 따른 서열은 VP1 번역 개시 코돈이 결핍된 것이며, 바람직하게 이에 따른 서열은 VP1 번역 개시 코돈만이 결핍된 것이거나 또는, 변형적으로 이에 따른 상기 서열은 단지 VP1 번역 개시 코돈만이 결핍된 것인 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 서열
을 포함하거나, 또는 이로 구성되는, 핵산 분자에 관한 것이다.
따라서, (iv)에서, 상기 서열은 바람직하게 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임의 잔부를 포함하거나, 또는 이로 구성되며, 이에 따른 상기 잔부는 상기 캡시드 단백질을 암호화하는 와일드 타입 오픈 리딩 프레임 내의 제2 아미노산 위치에 상응하는 위치에서 시작한다.
아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자는 본 명세서에서 동물 파보바이러스의 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 암호화하는, 바람직하게는 상기 3가지 모든 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것으로 이해된다.
구절 "CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선 번역 개시 코돈으로 시작하는" 또는 "CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선 번역 개시 코돈인, 제1 코돈"은 본 명세서에서 VP1 캡시드 단백질의 아미노 말단을 암호화하는 위치에서 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈이 CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선 번역 개시 코돈인 것을 의미하는 것으로 이해된다.
차선은 본 명세서에서 그 코돈이 정상적인 ATG 코돈에 비해 다른 이상적인 맥락에서 번역 개시에 덜 효율적인 것을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게 AAV VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 ACG, TTG, GTG, 및 CTG로부터 선택되며, 보다 바람직하게 AAV VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 CTG 및 ACG로부터 선택되며, 그리고 가장 바람직하게 AAV VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 CTG이다. 동물 파보바이러스는 바람직하게 디펜도바이러스, 보다 바람직하게 인간 또는 시미언 아데노 연관 바이러스(AAV)이다.
특히 바람직한 구현으로, VP1의 차선 개시 코돈은 CTG이며, 하나의 부가적인 코돈이 이의 3' 엔드에서 상기 차선 개시 코돈에 바로 인접하게 도입되며, 상기 부가적인 코돈은 알라닌을 코딩한다. 바람직하게 상기 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질이다. 이는 AAV5 비리온의 향상된 효능을 일으킨다. 용어 "효능(potency)"은 본 명세서에서 벡터가 이의 유전 물질의 발현을 유도하는 능력을 의미하는 것으로 사용된다.
상기 오픈 리딩 프레임은 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기를 암호화하는, 바람직하게 알라닌을 암호화하는 제2 코돈을 더 포함한다. 보다 바람직하게, 제2 코돈은 GCT, GCC, GCA, GCG 및 GGU로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게 여기서 상기 코돈은 GCT이다. 상기 오픈 리딩 프레임은 선택적으로 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20, 바람직하게 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15 또는 14의 부가적인 아미노산 잔기 미만의 부가적인 아미노산에 대한 코돈과 같은 제2 코돈 다음에 추가로 부가적인 아미노산 잔기를 암호화하는 하나 이상의 코돈을 포함한다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 부가적인 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈은 캡시드 단백질의 오픈 리딩 프레임과 함께 프레임 내에 존재한다.
일 구현으로, 오픈 리딩 프레임이 와일드 타입 캡시드 단백질과 비교되는 경우에, 캡시드 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임은 VP1의 차선 번역 개시 코돈과 이에 상응하는 와일드 타입 캡시드 단백질에서 이의 3' 엔드 상의 개시 코돈에 바로 인접한 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 삽입된 하나 이상의 아미노산 잔지를 암호화하는 코돈을 더 포함한다. 예를 들어, 오픈 리딩 프레임은 이에 상응하는 와일드 타입 캡시드 단백질에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 부가적인 아미노산 잔기에 대한 코돈을 포함한다. 바람직하게, 오픈 리딩 프레임은 이에 상응하는 와일드 타입 캡시드 단백질에 비해 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15 또는 14 미만의 부가적인 아미노산 잔기에 대한 코돈을 포함한다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 부가적인 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈은 캡시드 단백질의 오픈 리딩 프레임과 함께 프레임 내에 존재한다. 이에 상응하는 와일드 타입 캡시드 단백질에 비해 부가적인 아미노산 잔기를 암호화하는 이러한 코돈 중에서, 제1 코돈, 즉 이의 3' 엔드에서 차선 번역 개시 코돈에 바로 인접한 코돈은 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기를 암호화한다. 따라서, 번역 개시 코돈과 와일드 타입 서열의 잔기 2에 상응하는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 단지 하나의 부가적인 코돈이 존재하는 경우에, 그 부가적인 코돈은 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기를 암호화한다. 번역 개시 코돈과 와일드 타입 서열의 잔기 2에 상응하는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 하나가 넘는 부가적인 코돈이 존재하는 경우에, 번역 개시 코돈 바로 다음의 코돈은 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기를 암호화한다. 바람직하게, 차선 번역 개시 코돈 (즉, 이의 3' 엔드에서) 바로 다음의 부가적인 아미노산 잔기는 알라닌, 글리신 또는 발린이며, 보다 바람직하게 알라닌이다. 즉, 본 발명의 바람직한 구현으로, 차선 번역 개시 코돈 바로 다음의 코돈은 알라닌을 암호화한다.
본 발명의 바람직한 구현으로, 차선 번역 개시 코돈 바로 다음의 코돈, 즉 제2 코돈은 GCT, GCC, GCA, GCG, GGU, GGC, GGA, GGG, GUU, GUC, GUA, GUG, GAU, GAC, GAA 및 GAG로 구성된 그룹으로부터, 바람직하게 GCT, GCC, GCA, GCG 및 GGU로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 코돈은 GCT이다.
단계 (iv)에서 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 서열은 예를 들어, AAV1 - AAV13과 같이 자연적으로 발견되는 캡시드 서열일 수 있으며, 이의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13 - 38 및 SEQ ID NO: 70 - 73에 나타내었다. 이런 이유로, 단계 (iv)에서 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 서열은 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 및 AAV13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 캡시드 서열일 수 있다. 변형적으로, 상기 서열은 인공적인 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 서열은 하이브리드 형태이거나 또는 예를 들어 AcmNPv 또는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda)의 코돈 사용에 의한 것과 같이 최적화된 코돈일 수 있다. 예를 들어, 캡시드 서열은 AAV1의 VP2 및 VP3 서열로 구성될 수 있으며, 반면에 VP1 서열의 잔부는 AAV5로 구성된다. 바람직한 캡시드 단백질은 AAV5, 바람직하게 SEQ ID NO: 22로 제공된 AAV5, AAV8, 바람직하게 SEQ ID NO: 28로 제공된 AAV8 또는 AAV9, 바람직하게 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 71 또는 SEQ ID NO: 73으로 제공된 AAV9이다. 따라서, 바람직한 구현으로, AAV 캡시드 단백질은 본 발명에 따라 변형된 AAV 혈청형 5, AAV 혈청형 8, 또는 AAV 혈청형 9 캡시드 단백질이다. 캡시드 단백질이 AAV9인 경우에, 캡시드 단백질은 예를 들어, WO 03/052052 또는 WO 05/033321에 개시된 것과 같은 서열 또는 SEQ ID NO: 29, 30, 70, 71, 72, 73 또는 74로 제공된 서열을 갖는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 캡시드 단백질이 AAV9인 경우에, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 72 및 73에 제공된 서열을 갖는다. 보다 바람직하게, AAV 캡시드 단백질은 본 발명에 따라 변형된 AAV 혈청형 5 캡시드 단백질이다. 캡시드 단백질의 정확한 분자량뿐만 아니라 번역 개시 코돈의 정확한 위치는 다양한 파보바이러스들 간에 다를 수 있는 것으로 이해된다. 그러나, 숙련자는 AAV-5와 다른 파보바이러스로부터 뉴클레오타이드 서열에서 이에 상응하는 위치를 확인하는 방법을 알 것이다. 변형적으로, AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 서열은 유도 진화 실험(directed evolution experiments)의 결과로서 얻어지는 것과 같은 인공 서열이다. 이는 DNA 셔플링을 통한 캡시드 라이브러리의 생성, 에러 프론(error prone) PCR, 바이오인포마틱 래셔널 디자인(bioinformatic rational design), 사이트 세츄레이티드 돌연변이 생성(site saturated mutagenesis)을 포함한다. 결과적으로 형성된 캡시드는 기존 혈청형에 기초하지만 이러한 캡시드의 특징을 향상시키는 다양한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 변화를 함유한다. 결과적으로 형성된 캡시드는 기존 혈청형의 다양한 부분들의 조합, "셔플드 캡시드(shuffled capsids)"이거나 또는 완전히 새로운 변화, 즉, 전체 길이의 유전자 또는 단백질에 걸쳐 그룹으로 조직화되거나 펼쳐진 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 첨가, 결실 또는 치환을 함유할 수 있다. 참조 예 Schaffer 및 Maheshri; Proceedings of the 26th Annual International Conference of the IEEE EMBS San Francisco, CA, USA; September 1-5, 2004, pages 3520-3523; Asuri 등. (2012) Molecular Therapy 20(2):329-3389; Lisowski 등. (2014) Nature 506(7488):382-386(본 명세서에 참고문헌으로 편입됨)
본 발명의 바람직한 구현으로, VP3 캡시드 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임은 ACG, ATT, ATA, AGA, AGG, AAA, CTG, CTT, CTC, CTA, CGA, CGC, TTG, TAG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 비-고전적인 번역 개시 코돈으로 시작한다. 바람직하게, 비-고전적인 번역 개시 코돈은 GTG, CTG, ACG, TTG로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 보다 바람직하게 비-고전적인 번역 개시 코돈은 CTG이다.
AAV 캡시드 단백질의 발현을 위한 본 발명의 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 VP2 개시자 콘텍스트(initiator context)를 포함하는 발현 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이다. VP2 개시자 콘텍스트는 본 명세서에서 VP2의 비-고전적인 번역 모방(imitation) 시작에 선행하는 다수의 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 구현으로, VP 개시자 콘텍스트는 AAV VP1 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 차선 번역 개시 코돈의 업스트림, 바람직하게 차선 번역 개시 코돈의 상류 바로 옆, 즉, 이의 5' 엔드에서 차선 번역 개시 코돈에 바로 인접한 SEQ. ID NO: 3의 9 뉴클레오타이드 서열 또는 SEQ. ID NO: 3과 실질적으로 상동적인 뉴클레오타이드이다. SEQ. ID NO: 3의 뉴클레오타이드 서열과 실질적 동일성을 가지며, VP1의 발현을 증가시키는 것을 돕는 서열은 예를 들어, SEQ ID NO: 3의 9 뉴클레오타이드 서열과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일성, 바람직하게 100% 동일성을 갖는 서열이다.
AAV 캡시드 단백질의 발현을 위한 본 발명의 더욱 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 AAV VP1 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 개시 코돈 주위에 Kozak 콘센서스(consensus)를 포함하는 발현 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이다. Kozak 콘센서스 서열은 본 명세서에서 GCCRCC(NNN)G (SEQ. ID NO: 4)로 정의되며, 여기서 R은 퓨린(즉, A 또는 G)이며, 그리고 여기서 (NNN)은 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 어느 차선 개시 코돈을 나타낸다. 바람직하게, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 내의 Kozak 콘센서스 서열에서, R은 G이다. 따라서 Kozak 콘센서스 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질의 발현을 위한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 GCCACC(ACG)G (SEQ ID NO: 5), GCCGCC(ACG)G (SEQ ID NO: 6), GCCACC(TTG)G (SEQ ID NO: 7), GCCGCC(TTG)G (SEQ ID NO: 8), GCCACC(GTG)G (SEQ ID NO: 9), GCCGCC(GTG)G (SEQ ID NO: 10), GCCACC(CTG)G (SEQ ID NO: 11) 및 GCCGCC(CTG)G (SEQ ID NO: 12)로부터 선택되며, 보다 바람직하게 Kozak 콘센서스 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 GCCACC(CTG)G (SEQ ID NO: 11) 및 GCCGCC(CTG)G (SEQ ID NO: 12)으로부터 선택되며, 가장 바람직하게, Kozak 콘센서스 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 GCCGCC(CTG)G (SEQ ID NO: 12)이다. 여기서 괄호안의 뉴클레오타이드는 VP1 단백질의 개시 코돈의 위치를 나타낸다.
AAV 캡시드 단백질의 발현을 위한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 또한 바람직하게 뉴클레오타이드 위치 12의 G, 뉴클레오타이드 위치 21의 A, 및 뉴클레오타이드 위치 24의 C 중에서 선택된 AAV VP1 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나의 변형을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오타이드 위치들은 예를 들어 SEQ ID NO:21에 나타낸 바와 같은 와일드 타입 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 위치들에 상응한다. "잠재적인/가능한 폴스 출발 사이트(potential/possible false start site)" 또는 "잠재적인/가능한 폴스 번역 개시 코돈(potential/possible false translation initiation codon)"은 본 명세서에서 캡시드 단백질(들)의 코딩 서열에 위치한 인-프레임 ATG 코돈을 의미하는 것으로 이해된다. 다른 혈청형의 VP1의 번역을 이한 가능한 폴스 출발 사이트의 제거는 곤충 세포에서 인식되는 바와 같이 추정 스플라이스 사이트의 제거가 되는 것으로 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 이해될 것이다. 예를 들어, 위치 12에서 뉴클레오타이드의 변형은, 뉴클레오타이드 T가 폴스 ATG 코돈을 일으키지 않기 때문에 재조합 AAV5에 요구되지 않는다. 예를 들어, AAV5에 대한 뉴클레오타이드 서열의 추가 변형은 SEQ ID NO:39로 나타낸 바와 같을 수 있다. 곤충 세포에서 적절한 발현을 위한 와일드 타입 AAV 서열의 다양한 변형은 예를 들어, Sambrook 및 Russell(2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd edition)"(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 기술된 바와 같이 잘 알려진 유전공학기술의 적용에 의해 이루어진다. VP 코딩 리전의 다양한 추가 변형은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 이는 VP 및 비리온의 수율을 증가시키거나, 변화된 친화성 또는 비리온의 항원성을 감소시키는 것과 같은 다른 원하는 효과를 가질 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
바람직한 구현으로, 본 발명에 따른 핵산 분자는 SEQ ID NO: 51, 69, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50 및 52로 구성된 그룹으로부터 선택된 오픈 리딩 프레임을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 보다 바람직하게 본 발명에 따른 핵산 분자는 SEQ ID NO: 51, 69, 42, 43, 47, 48 및 50으로 구성된 그룹으로부터 선택된 오픈 리딩 프레임을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 그리고 보다 바람직하게 이는 SEQ ID NO: 69 또는 51을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 그리고 보다 바람직하게 이는 SEQ ID NO:51을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
바람직하게 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 발현을 위해 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 제2 견지로, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조체로서, 여기서 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 발현을 위해 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 구조체에 관한 것이다. 이러한 발현 조절 서열은 적어도 곤충 세포에서 활성적인 프로모터를 포함할 것이다. 곤충 숙주 세포에서 외부 유전자를 발현하기 위한 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 기술이 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 곤충 세포에서 폴리펩타이드의 분자공학 및 발현을 위한 방법은 예를 들어, Summers 및 Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. In Prokop 등, Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. 및 R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman 및 Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W. H. Freeman 및 Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; US 4,745,051; US2003148506; 및 WO 03/074714에 기술되어 있다. AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 전사를 위해 특히 적절한 프로모터는 예를 들어, SEQ ID NO:53에 제공된 polH 프로모터 및 SEQ ID NO:54에 제공된 쇼트 polH 프로모터와 같은 폴리헤드론(polH) 프로모터이다. 그러나, 곤충 세포에서 활성적인 다른 프로모터들이 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들면 폴리헤드린(polH) 프로모터, p10 프로모터, p35 프로모터, 4xHsp27 EcRE+minimal Hsp70 프로모터, deltaE1 프로모터, E1 프로모터 또는 IE-1 프로모터 및 상기 참고문헌에 기재된 다른 프로모터들이 있다.
바람직하게 곤충 세포에서 AAV 캡시드 단백질의 발현을 위한 핵산 구조체는 곤충 세포 호환성 벡터이다. "곤충 세포 호환성 벡터(insect cell-compatible vector)" 또는 "벡터(vector)"는 곤충 또는 곤충 세포의 생산적인 트랜스포메이션 또는 트랜스펙션을 할 수 있는 핵산 분자로 이해된다. 예시적인 생물학적 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자, 및 재조합 바이러스를 포함한다. 곤충 세포 호환성이라면 어떠한 벡터도 사용될 수 있다. 벡터는 곤충 세포 게놈 내로 통합될 수 있으나, 곤충 세포 내에서 벡터의 존재는 영구적일 필요는 없으며 일시성 에피솜 벡터가 또한 포함된다. 상기 벡터는 예를 들어, 세포의 화학적 처리, 일렉트로포레이션 또는 감염에 의한 것과 같이 어느 알려진 수단에 의해 도입될 수 있다. 바람직한 구현으로, 상기 벡터는 배큘로바이러스, 바이러스 벡터, 또는 플라스미드이다. 보다 바람직한 구현으로, 상기 벡터는 배큘로바이러스이다. 즉, 상기 구조체는 배큘로바이러스이다. 배큘로바이러스 벡터 및 이의 사용방법은 곤충 세포의 분자공학에 관한 상기 언급된 참고문헌에 기술되어 있다.
바람직한 구현으로, 본 발명에 따른 핵산 구조체에 포함된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 51, 69, 42, 43, 47, 48 및 50으로 구성된 그룹으로부터 선택된 오픈 리딩 프레임을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 보다 바람직하게 이는 SEQ ID NO:51 또는 SEQ ID NO:69를 포함하거나 또는 이로 구성되며, 보다 바람직하게 이는 SEQ ID NO:51을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
제3 견지로, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 구조체를 포함하는 곤충 세포에 관한 것이다. AAV의 복제를 가능하게 하며 배양시 유지될 수 있는 어느 곤충 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 세포주는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda), 초파리(drosophila) 세포주, 또는 예를 들어, 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 유래 세포주와 같은 모기 세포주의 것일 수 있다. 바람직한 곤충 세포 또는 세포주는 예를 들어, expresSF+®, Drosophila Schneider 2 (S2) Cells, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, Ha2302, Hz2E5 및 High Five(Invitrogen)를 포함하는 배큘로바이러스 감염에 민감한 곤충종들의 세포들이다.
본 발명에 따른 바람직한 곤충 세포는 또한 (a) 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; (b) 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep52 또는 Rep40 코딩 서열을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열; 및 (c) 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep78 또는 Rep68 코딩 서열을 포함하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 정황상 "적어도 하나의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열"은 "A", "B" 및 "C" 리전으로도 칭하여지는 주로 상보적으로, 대칭적으로 배열된 서열을 포함하는 회문적 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 ITR은 복제시 "시스" 역할을 갖는, 즉, 회문 및 회문내부의 특정 서열을 인지하는 트랜스 액팅 복제 단백질(예, Rep 78 또는 Rep68)에 대한 인식 부위인 복제 오리진으로 작용하는 것이다. 상기 ITR 서열의 대칭성에 대한 일 예외는 ITR의 "D" 리전이다. 이는 (하나의 ITR 내에 하나의 컴플리먼트를 갖지 않는) 독특한 것이다. 단일 스트랜드 DNA의 니킹이 A와 D 리전 사이의 연결지점에서 일어난다. 이는 새로운 DNA 합성이 시작되는 리전이다. 상기 D 리전은 일반적으로 회문의 일측에 위치하고, 핵산 복제 단계에 대한 방향성을 제공한다. 포유류 세포에서 AAV 복제는 전형적으로 두 ITR 서열을 갖는다. 그러나, A 리전 및 D 리전의 양 스트랜드상에 바인딩 사이트가 회문의 각 측면상에 하나씩 대칭적으로 위치하도록 ITR을 합성하는 것이 가능하다. 그 다음, 이중-스트랜드 환형 DNA 주형상에서(예, 플라스미드), Rep78- 또는 Rep68-어시스티드 핵산 복제는 양 방향으로 진행되며, 단일 ITR가 환형 벡터의 AAV 복제에 충분하다. 따라서, 하나의 ITR 뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 정황상 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게, 둘 이상의 레귤라 ITRs이 사용된다. 가장 바람직하게, 두개의 ITR 서열이 사용된다. 바이러스 벡터 안전상의 견지로 세포 내로 초기 도입후 추가적인 증식이 불가능한 바이러스 벡터를 구성하는 것이 바람직할 수 있다. 수용체에서 원하지 않는 벡터 증식을 제한하는 이러한 안전성 메카니즘은 US2003148506에 기재된 바와 같은 키메릭 ITR을 갖는 rAAV를 이용함으로써 제공될 수 있다. 바람직한 구현으로, 파보바이러스 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 WO 2009/154452에 기재되어 있는 바와 같이 면역 회피 반복을 코딩하는 서열의 적어도 하나의 인 프레임 삽입을 포함한다. 이는 소위 자가-상보적 또는 모노머 듀플렉스 파보바이러스 비리온의 형성을 이끌며, 감소된 면역 반응을 나타내는 이점을 갖는다. 바람직한 구현으로, 파보바이러스 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 암호화하는 서열은 모노머 듀플렉스 또는 자가 상보적 게놈을 포함한다. 모노머 듀플렉스 AAV 벡터의 제조를 위해, AAV Rep 단백질 및 AAV 캡시드 단백질은 본 발명에 따른 곤충 세포에서 그리고 적어도 하나의 AAV ITR을 포함하는 벡터 게놈의 존재하에서 발현되며, 여기서 Rep52 및/또는 Rep40 단백질 발현은 Rep78 및/또는 Rep68 단백질 발현에 비해 증가된다. 모노머 듀플렉스 AAV 벡터는 또한 적어도 하나의 AAV ITR 측면에 위치한 벡터 게놈 구조체의 존재하에서 AAV Rep 단백질 및 AAV Cap 단백질을 곤충 세포에서 발현시킴으로써 제조될 수 있으며, 여기서 Rep78 및/또는 Rep 60의 니킹(nicking) 활성은 예를 들어 WO 2011/122950에 기재된 바와 같이 Rep52 및/또는 Rep 40의 헬리케이즈/캡슐화 활성에 비해 감소된다.
사용되는 벡터 또는 핵산 구조체의 수는 본 발명에서 제한되지 않는다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 벡터가 본 발명에 따라 곤충 세포에서 AAV를 생산하는데 사용될 수 있다. 6 벡터가 사용되는 경우, 일 벡터는 AAV VP1을 암호화하며, 다른 벡터는 AAV VP2를 암호화하며, 또 다른 벡터는 AAV VP3를 암호화하며, 또 다른 벡터는 Rep52 또는 Rep40을 암호화하며, 한편 Rep78 또는 Rep 68은 또 다른 벡터에 의해 암호화되며, 그리고 최종의 벡터는 적어도 하나의 AAV ITR을 포함한다. 예를 들어, Rep52 및 Rep40, 및 Rep78 및 Rep 68과 같은 부가적인 벡터가 발현을 위해 사용될 수 있다. 6 벡터 보다 적은 벡터가 사용되는 경우, 그 벡터들은 적어도 하나의 AAV ITR 및 VP1, VP2, VP3, Rep52/Rep40, 및 Rep78/Rep68 코딩 서열의 다양한 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게, 2 또는 3 벡터가 사용되며, 2 벡터를 사용하는 것이 상기한 바와 같이 보다 바람직하다. 2 벡터가 사용되는 경우에, 바람직하게 곤충 세포는 (a) 상기 정의한 바와 같은 AAV 캡시드 단백질의 발현을 위한 제1 핵산 구조체로서, 이 구조체는 또한 상기 (b) 및 (c)에서 정의한 바와 같은 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 발현을 위한 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep52 또는 Rep40 코딩 서열을 포함하며, 그리고 상기 제4 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 발현을 위한 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep78 또는 Rep68 코딩 서열을 포함하는, 제1 핵산 구조체; 및 (b) 상기 (a)에서 정의한 바와 같은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산 구조체로서, 이는 적어도 하나의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 제2 핵산 구조체를 포함한다. 3 벡터가 사용되는 경우에, 바람직하게 캡시드 단백질의 발현을 위해 그리고 Rep52, Rep40, Rep78 및 Rep68 단백질의 발현을 위해 별도의 벡터가 사용되는 것을 제외하고 2 벡터에 사용된 것과 동일한 형태가 사용된다. 각 벡터 상의 서열은 서로에 대해 어느 순서로 존재할 수 있다. 예를 들어, 만일 하나의 벡터가 ITRs 및 VP 캡시드 단백질을 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 ORF를 포함하는 경우에, VP ORF는 ITR 서열간의 DNA의 복제시 VP ORF가 복제되거나 복제되지 않도록 벡터 상에 위치할 수 있다. 다른 예로, Rep 암호 서열 및/또는 VP 캡시드 단백질을 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 ORF는 벡터 상에 어느 순서로 존재할 수 있다. 또한, 제2, 제3 및 추가의 핵산 구조체(들)은 바람직하게 곤충 세포 호환성 벡터, 바람직하게 상기 정의한 바와 같은 배큘로바이러스 벡터이다. 변형적으로, 본 발명의 곤충 세포에서, 하나 이상의 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 뉴클레오타이드 서열, 및 제4 뉴클레오타이드 서열 및 선택적으로 추가의 뉴클레오타이드 서열이 곤충 세포의 게놈 내에 안정하게 통합될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 뉴클레오타이드 서열을 곤충 게놈 내로 안정하게 도입하는 방법 및 게놈 내에 이러한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포를 확인하는 방법을 알 수 있다. 게놈 내로의 도입은 예를 들어, 곤충 게놈의 리전에 고 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터의 사용에 의해 지원될 수 있다. 트랜스포손과 같은 특정 서열의 사용은 뉴클레오타이드 서열을 게놈 내로 도입하는 다른 한 방법이다.
따라서, 바람직한 구현으로, 본 발명에 따른 곤충 세포는 (a) 본 발명에 따른 제1 핵산 구조체로서, 이에 따른 제1 핵산 구조체는 상기 정의한 바와 같은 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 제1 핵산 구조체; 및 (b) 상기 정의한 바와 같은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산 구조체로서, 여기서 상기 제2 핵산 구조체는 바람직하게 곤충 세포 호환성 벡터, 보다 바람직하게 배큘로바이러스 벡터인 제2 핵산 구조체를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현, 본 발명의 곤충 세포에 존재하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 즉, 적어도 하나의 AAV ITR을 포함하는 서열은, (바람직하게 포유류 세포에서 발현을 위한) 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 여기서 바람직하게 상기 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 생산된 AAV의 게놈 내로 통합된다. 바람직하게, 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 포유류 세포에서 발현을 위한 서열이다. 바람직하게, 제2 뉴클레오타이드 서열은 2개의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열들을 포함하며, 그리고 여기서 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 상기 2개의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열들 사이에 위치한다. 바람직하게, (포유류 세포에서 발현을 위한) 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 2개의 레귤라 ITRs 사이에 존재하거나, 또는 두 D 리전들로 가공된 ITR의 어느 한 편에 위치하는 경우에 곤충 세포에서 생산된 AAV 게놈 내로 통합될 것이다. 따라서, 바람직한 구현으로, 본 발명은 본 발명에 따른 곤충 세포로서, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 2개의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열들을 포함하며, 그리고 여기서 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 상기 2개의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열들 사이에 위치하는, 곤충 세포를 제공한다.
전형적으로, ITRs를 포함하는 관심있는 유전자 산물은 길이 5,000 이하의 뉴클레오타이드(nt)이다. 또 다른 구현으로, 오버사이즈 DNA, 즉, 길이 5,000 nt가 넘는 DNA는 본 발명에 의해 기재된 AAV 벡터를 사용하여 시험관 내 또는 생체 내에서 발현될 수 있다. 여기서 오버사이즈 DNA는 5kbp의 최대 AAV 패키징 제한을 초과하는 DNA로서 이해된다. 따라서, 일반적으로 5.0kb보다 큰 게놈으로 암호화된 재조합 단백질을 생산할 수 있는 AAV 벡터의 생성이 또한 실현 가능하다. 예를 들어, 본 발명자들은 곤충 세포에서 부분적으로, 단방향으로 패키지된 hFVIII의 프래그먼트를 함유하는 rAAV5를 생성하였다. 적어도 5.6kb를 포함하는 벡터 게놈의 총 사이즈를 2 집단의 FVIII 프래그먼트-함유 AAV5 파티클 내로 패키지하였다. 이러한 변종 AAV5-FVIII 벡터들은 활성적으로 FVIII를 분비하는 것으로 나타났다. 이는 시험관 내에서 확인되었으며, 여기서 Huh7 세포의 감염 후에 팩터 VIII를 암호화하는 관심있는 유전자 산물을 포함하는 AAV 벡터는 활성 FVIII 단백질의 생산을 이끌었다. 마찬가지로, 마우스에서 rAAV FVIII의 꼬리 정맥 운반은 활성 FVIII 단백질의 생산을 이끌었다. 캡슐화 산물의 분자 분석은, 5.6kbp FVIII 발현 카세트가 AAV 파티클에 완전히 캡슐화되지 않음을 보여주었다. 어떠한 이론으로 국한하려는 것은 아니라, 본 발명자들은 캡슐화된 분자들의 + 및 - DNA 스트랜드는 5' 엔드가 없어진 것으로 나타났음을 제기한다. 이는 4.7-4.9kbp 제한을 가진 "헤드-풀 원리(head-full principia)"에 따른 기존 보고된 단방향(3'엔드에서 출발) 패키징 메커니즘 오퍼레이팅과 일치한다(참조 예: Wu 등 [2010] Molecular Therapy 18(1):80-86; Dong 등 [2010] Molecular Therapy 18(1):87-92; Kapranov 등 [2012] Human Gene Therapy 23:46-55; 및 특히 Lai 등 [2010] Molecular Therapy 18(1):75-79). 전체 5.6kb 벡터 게놈 중에서 단지 약 5kb만이 캡슐화되었음에도 불구하고, 그 벡터는 강력하였으며, 활성 FVIII의 발현을 이끌었다. 본 발명자들은 FVIII의 생산을 위한 정확한 주형은 + 및 - DNA 스트레인의 부분적 상보성에 기초하여 표적 세포에서 어셈블리된 다음 제2 스트랜드 합성이 이루어진 것을 보여주었다.
따라서, 본 명세서에 정의된 제2 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 복제된 AAV 게놈 내로 편입되도록 위치하는, 포유류 세포에서 발현을 위한 적어도 하나의 "관심있는 유전자 산물(gene product of interest)"을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 구조체가 AAV 비리온의 패키징 용량 내에 유지되는 한, 어떠한 뉴클레오타이드 서열이 본 발명에 따라 생산된 AAV로 트랜스펙션된 포유류 세포에서 더 늦은 발현을 위해 편입될 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 예를 들자면, RNAi 제제, 즉, 예를 들어 shRNA(짧은 헤어핀 RNA) 또는 siRNA(짧은 간섭 RNA)와 같이 RNA 간섭을 할 수 있는 RNA 분자를 발현할 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다. "siRNA"는 포유류 세포에서 독성적이지 않은 짧은 길이의 이중 스트랜드 RNA인 소 간섭 RNA를 의미한다(Elbashir 등, 2001, Nature 411: 494-98; Caplen 등, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-47). 바람직한 구현으로, 제2 뉴클레오타이드 서열은 2개의 뉴클레오타이드 서열들을 포함할 수 있으며, 각각은 포유류 세포에서 발현을 위한 관심있는 하나의 유전자 산물을 암호화한다. 관심있는 산물을 암호화하는 각각의 두 뉴클레오타이드 서열들은 곤충 세포에서 복제된 rAAV 게놈 내로 편입되도록 위치한다.
포유류 세포에서 발현을 위한 관심있는 산물은 치료 유전자 산물일 수 있다. 치료 유전자 산물은 폴리펩타이드, 또는 RNA 분자(siRNA)이거나, 또는 표적 세포에서 발현시 예를 들어, 감염된 세포의 제거와 같은 예를 들어, 원하지 않는 활성의 제거, 또는 효소적 활성의 결함을 일으키는 것과 같은 유전적 결함의 보완과 같은 원하는 치료 효과를 제공하는 다른 유전자 산물일 수 있다. 치료 폴리펩타이드 유전자 산물의 예는 CFTR, 팩터 IX, 리포프로틴 리파아제(LPL, 바람직하게 LPL S447X; WO 01/00220 참조), 아폴리포프로틴 A1, 유리딘 디포스페이트 글루쿠로노실트랜스퍼라아제(Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase, UGT), 레티니티스 피그멘토사 GTP아제 레귤라 인터액팅 프로틴(Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator Interacting Protein, RP-GRIP), 예를 들어 IL-10, 디스트로핀(dystrophin), PBGD, NaGLU, Treg167, Treg289, EPO, IGF, IFN, GDNF, FOXP3, Factor VIII, VEGF, AGXT과 같은 사이토카인 또는 인터루킨 및 인슐린을 포함한다. 변형적으로, 또는 제2 유전자 산물로서 부가적으로, 본 명세서에 상기 정의된 제2 뉴클레오타이드 서열은 세포 트랜스포메이션 및 발현을 평가하기 위한 마커 단백질로서 제공되는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적절한 마커 단백질은 예를 들어, 형광 단백질 GFP, 및 (HAT 배지 상에서 선별을 위한) 선별 마커 유전자 HSV 티미딘 키나아제, (하이그로마이신 B 상에서의 선별을 위한) 박테리아 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제, (G418 상에서의 선별을 위한) Tn5 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라아제, 및 (메토트렉사트 상에서의 선별을 위한) 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), CD20, 저 친화성 신경 성장 인자 유전자이다. 이러한 마커 유전자들을 획득하기 위한 자료 및 이의 사용 방법은 Sambrook 및 Russel(2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(3차 개정, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 제공된다. 또한, 본 명세서에 상기 정의된 제2 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 rAAV로 형질도입된 세포로부터 대상자를 치유하는 것을 가능하게 하는 페일 세이프 메커니즘(fail-safe mechanism)으로서 제공할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 종종 자살 유전자라고도 칭하여지는 이러한 뉴클레오타이드 서열은 프로드럭을 유전자 도입 세포를 사멸할 수 있는 독성 물질로 전환시킬 수 있는 단백질을 암호화하며, 유전자 도입 세포에서 상기 단백질이 발현된다. 이러한 자살 유전자의 적절한 예는, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 시토신 디아미나아제 유전자 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 및 수두대상포진 바이러스(Varicella-Zoster virus) 중 하나를 포함하며, 이러한 케이스에서 간시클로비르(ganciclovir)가 대상자에서 유전자 도입 세포를 사멸하기 위한 프로드럭으로서 사용될 수 있다(참조 예: Clair 등, 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 844-849).
또 다른 구현으로, 관심있는 유전자 산물은 AAV 단백질일 수 있다. 특히, Rep78 또는 Rep68과 같은 Rep 단백질, 또는 이의 기능성 프래그먼트일 수 있다. 본 발명의 rAAV 게놈 상에 존재하고, 본 발명의 rAAV로 유전자 도입된 포유류 세포에서 발현될 경우에, Rep78 및/또는 Rep68을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 유전자 도입된 포유류 세포의 게놈 내로 rAAV의 통합을 가능하게 한다. rAAV-유전자 도입되거나 감연된 포유류 세포에서 Rep78 및/또는 Rep68의 발현은 rAAV에 의해 세포에 도입된 관심있는 어느 다른 유전자 산물의 장기간 또는 영구적인 발현을 가능하게 함으로써 rAAV의 특정 사용에 대한 이점을 제공할 수 있다.
본 발명의 rAAV 벡터에서, 포유류 세포에서 발현을 위한 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열(들)은, 바람직하게 예를 들어, 프로모터와 같은 적어도 하나의 포유류 세포 호환성 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 다수의 이러한 프로모터가 당해 기술분야에 알려져 있다(Sambrook 및 Russel, 2001, 상기 참조). CMV 프로모터와 같은 다수의 세포 타입들에서 광범위하게 발현되는 구성적인 프로모터들이 사용될 수 있다. 그러나, 유도성의 조직-특이적, 세포 타입-특이적 또는 세포 사이클-특이적인 프로모터가 보다 바람직할 것이다. 예를 들어, 간-특이적 발현을 위해 프로모터는 α1-안티-트립신 프로모터, 티로이드 호르몬-바인딩 글로블린 프로모터, 알부민 프로모터, LPS(티록신-바인딩 글로블린) 프로모터, HCR-ApoCII 하이브리드 프로모터, HCR-hAAT 하이브리드 프로모터 및 아폴리포프로틴 E 프로모터, LP1, HLP, 미니멀 TTR 프로모터, FVIII 프로모터, 하이페론 인핸서, ealb-hAAT로부터 선택될 수 있다. 다른 예는 종양-선별성, 특히 신경 세포 종양-선별성 발현을 위한 E2F 프로모터(Parr 등, 1997, Nat. Med. 3:1145-9) 또는 혈액 단핵구 세포에 사용하기 위한 IL-2 프로모터(Hagenbaugh 등, 1997, J Exp Med; 185: 2101-10)를 포함한다.
AAV는 또한 다수의 포유류 세포를 감염시킬 수 있다. 참조 예, Tratschin 등, Mol. Cell Biol., 5(11):3251-3260(1985) 및 Grimm 등, Hum. Gene Ther., 10(15):2445-2450(1999). 그러나, 인간 활막 섬유아세포(human synovial fibroblasts)의 AAV 트랜스덕션이 유사한 뮤린 세포에서보다 더 현저히 효율적이며(Jennings 등, Arthritis Res, 3:1 (2001)), AAV의 세포 친화성은 혈청형에 따라 다르다. 참조 예, Davidson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(7):3428-3432 (2000)(포유류 CNS 세포 트로피즘 및 트랜스덕션 효율성에 관한 AAV2, AAV4, 및 AAV5 간의 차이에 대해 논의되어 있음).
곤충 세포에서 AAV의 생산을 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 AAV 서열은 어느 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 상기 AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 현저한 상동성의 게놈 서열을 가지며, 동일한 셋트의 유전적 기능을 제공하며, 본질적으로 물리적 및 기능적으로 동등한 비리온을 생산하며, 그리고 사실상 동일한 메커니즘에 의해 복제 및 어셈블리된다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성의 개관에 대하여 하기를 참조바람. GenBank Accession number U89790; GenBank Accession number J01901; GenBank Accession number AF043303; GenBank Accession number AF085716; Chlorini 등(1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava 등(1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini 등(1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge 등(1998, J. Vir. 72:309-319); 및 Wu 등 (2000, J. Vir. 74: 8635-47). 인간 또는 시미언 아데노 연관 바이러스(AAV) 혈청형이 본 발명의 정황에 사용하기에 바람직한 AAV 뉴클레오타이드 서열의 공급원이며, 보다 바람직하게는 일반적으로 인간에 감염하는 AAV 혈청형(예, 혈청형 1, 2, 3A, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13) 또는 영장류에 감염하는 AAV 혈청형(예, 혈청형 1 및 4)이다.
바람직하게 본 발명의 정황에서 사용되는 AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2, AAV5 및/또는 AAV4로부터 유래된다. 마찬가지로, Rep52, Rep40, Rep78 및/또는 Rep68 코딩 서열은 바람직하게 AAV1, AAV2, 및/또는 AAV4로부터 유래된다. 본 발명의 정황에서 사용되는 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 대한 코딩 서열은 알려진 42 혈청형들 중 어느 것으로부터, 보다 바람직하게 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9로부터, 또는 예를 들어 캡시드 셔플링 기술 및 AAV 캡시드 라이브러리에 의해 획득되는 새롭게 개발된 AAV-류 파티클로부터 취해질 수 있다. 바람직한 구현으로, VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질에 대한 코딩 서열은 AAV5 또는 AAV8로부터 취해지며, 보다 바람직하게 AAV5로부터 취해진다.
대부분의 혈청형 중에서 AAV Rep 및 ITR 서열은 특히 보존된다. 다양한 AAV 혈청형들의 Rep78 단백질은 예를 들어, 89% 이상 동일하며, AAV2, AAV3A, AAV3B, 및 AAV6 사이에 게놈 수준에서 총 뉴클레오타이드 서열 동일성은 약 82%이다(Bantel-Schaal 등, 1999, J. Virol., 73(2):939-947). 더욱이, 다수 AAV 혈청형들의 Rep 서열 및 ITRs는 포유류 세포에서 AAV 파티클의 생산시 다른 혈청형들의 상응하는 서열들을 효율적으로 교차-보완(즉, 기능적으로 대체)하는 것으로 알려져 있다. US2003148506에는 AAV Rep 및 ITR 서열이 또한 곤충 세포에서 다른 AAV Rep 및 ITR 서열을 효율적으로 교차-보완한다는 것이 보고되어 있다.
상기 AAV VP 단백질은 AAV 비린온의 세포 친화성을 결정하는 것으로 알려져 있다. VP 단백질 암호화 서열은 다른 AAV 혈청형 중에서 Rep 단백질 및 유전자 보다 덜 보존된다. 다른 혈청형의 상응하는 서열을 교차-보완하는 Rep 및 ITR 서열의 능력은 한 혈청형(예, AAV3)의 캡시드 단백질 및 다른 AAV 혈청형(예, AAV2)의 Rep 및/또는 ITR 서열을 포함하는 슈도타입 AAV 파티클의 생산을 가능하게 한다. 이러한 슈도타입 AAV 파티클은 본 발명의 일부이다.
변형된 "AAV" 서열이 또한, 예를 들어 곤충 세포에서 rAAV 벡터의 생산을 위해 본 발명의 정황에 사용될 수 있다. 이러한 변형된 서열은 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9 ITR, Rep 또는 VP에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열(예, 약 75-99% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하며, 와일드 타입 AAV ITR, Rep 또는 VP 서열 대신에 사용될 수 있다.
다수의 측면에서 다른 AAV 혈청형과 유사함에도 불구하고, AAV5는 다른 알려진 인간 및 시미언 혈청형보다 다른 인간 및 시미언 AAV 혈청형과 상이하다. 이의 견지에서, AAV5의 생산은 곤충 세포에서 다른 혈청형의 생산과 상이할 수 있다. 본 발명의 방법이 rAAV5를 생산하는데 사용되는 경우에, 하나 이상의 벡터의 경우에 AAV5 ITR을 포함하는 하나의 뉴클레오타이드 서열을 집합적으로 포함하는 하나 이상의 벡터는, 하나의 뉴클레오타이드 서열이 AAV5 Rep52 및/또는 Rep40 코딩 서열을 포함하고, 하나의 뉴클레오타이드 서열은 AAV5 Rep78 및/또는 Rep68 코딩 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 ITR 및 Rep 서열은 곤충 세포에서 rAAV5 또는 슈도타입 rAAV5 벡터의 효율적인 생산을 확보하는데 필요시 변형될 수 있다.
바람직한 구현으로, 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 뉴클레오타이드 서열 및 선택적으로 제4 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다.
다른 견지로, 본 발명은 AAV 비리온에 관한 것이다. 바람직하게, AAV 비리온은 이의 게놈 내에 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 네이티브 AAV 뉴클레오타이드 서열이 아니며, 그리고 여기서 AAV VP1 캡시드 단백질은 N-말단 엔드로부터 C-말단 엔드로
(i) 제1 아미노산 잔기로서, 번역 개시 코돈에 의해 암호화되며, 바람직하게는 CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 제1 아미노산 잔기;
(ii) 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 제2 아미노산 잔기;
(iii) 선택적으로, 상기 제2 아미노산 잔기 다음에 하나 이상의 부가적인 아미노산 잔기; 및,
(iv) AAV VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열로서, 이에 따른 상기 서열은 VP1 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 아미노산 잔기가 결핍된 AAV VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열
을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 바람직하게 이에 따른 상기 서열은 VP1 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 아미노산 잔기만 결핍되거나, 또는 변형적으로 이에 따른 상기 서열은 단지 VP1 번역 개시 코돈만이 결핍된 것이다.
바람직하게, VP1 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 아미노산 잔기만 결핍된 AAV VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 자연적으로 발생하는 VP1 개시 코돈에 의해 암호화된 아미노산 잔기만 결핍된 AAV VP1 캡시드 단백질의 자연적으로 발생하는 아미노산 서열이다. 차선 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 제1 아미노산 잔기는 전형적으로 메티오닌 잔기이다.
변형적으로, 이러한 견지에서 본 발명은 AAV 비리온에 관한 것으로, 여기서 AAV 비리온은 이의 게놈 내에 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 네이티브 AAV 뉴클레오타이드 서열이 아니며, 그리고 여기서 AAV VP1 캡시드는 개시 코돈과 와일드 타입 캡시 단백질의 위치 2의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기 사이에 삽입된 하나 이상의 부가적인 아미노산 잔기를 가지며, 여기서 상기 개시 코돈 바로 다음의 부가적인 아미노산 잔기는 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 비리온에서, AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질의 화학양론은 다음과 같다; VP1의 양: (a)는 VP2의 양의 적어도 100, 105, 110, 120, 150, 200 또는 400%이거나; 또는 (b)는 VP3의 양의 적어도 8, 10, 10.5, 11, 12, 15, 20 또는 40%이거나; 또는 (c)는 적어도 (a) 및 (b) 모두에서 정의한 바와 같다. 바람직하게, VP1, VP2 및 VP3의 양은 각각의 VP1, VP2 및 VP3에 공통적인 에피토프를 인지하는 항체를 이용하여 검출된다. VP1, VP2 및/또는 VP3의 상대적인 양을 정량화하는 것을 가능하게 하는 다양한 면역어세이가 당해 기술분야에서 이용가능하다(참조 예, Using Antibodies, E. Harlow 및 D. Lane, 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 각각의 상기 3개의 캡시드 단백질에 공통적인 에피토프를 인지하는 적절한 항체는 예를 들어 마우스 안티-Cap B1 항체(Progen(독일)로부터 상업적으로 구입가능함)이다.
본 발명에 따른 바람직한 AAV는 이의 게놈 내에 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비리온이며, 이에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 네이티브 AAV 뉴클레오타이드 서열이 아니며, 그리고 이에 따른 AAV 비리온은 아미노산 위치 1에 메티오닌, 트레오닌, 루신 또는 발린을 포함하는 VP1 캡시드 단백질을 포함한다. 본 발명에 따른 보다 바람직한 AAV 비리온은 상기 정의한 바와 같은 캡시드 단백질들의 비를 가지며 아미노산 위치 1에 루신 또는 발린을 포함하는 VP1 캡시드 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 하기에 정의된 바와 같은 방법으로 상기 정의된 바와 같은 곤충 세포로부터 획득가능한 AAV 비리온이 보다 바람직하다. VP1 캡시드 단백질의 위치 1에 트레오닌 또는 루신을 포함하는 AAV 비리온이 보다 바람직하며, 보다 바람직하게는 트레오닌 잔기를 포함하는 AAV 비리온이다.
본 발명의 AAV 비리온의 이점은 이들의 향상된 감염성이다. 어떠한 이론으로 규정하려는 것은 아니나, 특히 감염성은 캡시드 내의 VP2 및/또는 VP3의 양과 관련하여 캡시드 내의 VP1 단백질의 양의 증가에 따라 증가하는 것으로 보인다. AAV 비리온의 감염성은 본 명세서에서 비리온에 포함된 트랜스진(이식 유전자)의 트랜스덕션(형질도입)의 효능을 의미하는 것으로 이해되며, 트랜스진의 발현율 및 트랜스진으로부터 발현된 산물의 양이나 활성으로부터 추정될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 AAV 비리온은 CFTR, 팩터 IX, 리포프로틴 리파아제(LPL, 바람직하게 LPL S447X; WO 01/00220 참조), 아폴리포프로틴 A1, 유리딘 디포스페이트 글루쿠로노실트랜스퍼라아제(Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase, UGT), 레티니티스 피그멘토사 GTP아제 레귤라 인터액팅 프로틴(Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator Interacting Protein, RP-GRIP), 예를 들어 IL-10, 디스트로핀(dystrophin), PBGD, NaGLU, Treg167, Treg289, EPO, IGF, IFN, GDNF, FOXP3, Factor VIII, VEGF, AGXT과 같은 사이토카인 또는 인터루킨 및 인슐린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 유전자 산물을 암호화하는 관심있는 유전자 산물을 포함한다. 보다 바람직하게, 관심있는 유전자 산물은 팩터 IX 또는 팩터 VIII 단백질을 암호화한다.
따라서, 다른 견지로 본 발명은 곤충 세포에서 AAV를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 상기 방법은 (a) AAV가 생산되는 조건하에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로 (b) 상기 AAV의 회수 단계를 포함한다. 배양시 곤충 세포를 위한 성장 조건, 및 배양시 곤충 세포에서 이종 산물의 생산은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 곤충 세포의 분자공학에 대한 상기 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
바람직하게 상기 방법은 안티-AAV 항체, 바람직하게 고정화된 항체를 이용한 AAV의 친화-정제 단계를 더 포함한다. 안티-AAV 항체는 바람직하게 모노클로날 항체이다. 특히 적절한 항체는 예를 들어 낙타 또는 라마로부터 획득가능한 단일 사슬 낙타과 항체 또는 이의 프래그먼트이다(참조 예, Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302). AAV의 친화-정제를 위한 항체는 바람직하게 AAV 캡시드 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 바인딩하는 항체이며, 여기서 바람직하게 상기 에피토프는 하나 이상의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 상에 존재하는 에피토프이다. 예를 들어, 상기 항체는 AAV 캡시드에 대한 특이적 바인딩에 기초하여 얻어지거나 선택될 수 있으나, 또한 동시에 이는 AAV1, AAV3 및 AAV5 캡시드에 특이적으로 바인딩할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서, 동사 "포함하다" 및 이의 동사활용은 상기 단어에 후속하는 아이템들이 포함되나 특별히 언급되지 않은 아이템들이 배제되지 않음을 의미하는 것으로 비제한적 관점으로 사용된다. 또한, 부정관사 "a" 또는 "an"에 의한 엘리먼트에 대한 언급은 그 문맥이 분명히 하나이거나 엘리먼트들중 단지 하나임을 요구하지 않는한 하나 이상의 엘리먼트가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정관사 "a" 또는 "an"은 보통 "적어도 하나(at least one)"를 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌 참고문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어느 방식으로 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
실시예
1. 서론
rAAV의 생산을 위한 초기 배큘로바이러스 시스템은 Urabe 등(Urabe 등[2002] Human Gene Therapy 13(16):1935-1943)에 의해 기술되었으며, 3가지 배큘로바이러스, 즉 Bac-Rep, Bac-cap 및 Bac-vec으로 구성되며, 이의 SF9와 같은 곤충 세포 내로의 동시 감염은 rAAV의 생성을 이끌었다. 이렇게 생산된 rAAV의 특성, 즉, 효능을 포함하는 물리적 및 분자적 특성은 포유류에서 생성된 rAAV와 현저히 다르지 않았다(Urabe[2002] 상기 참조). 곤충 세포에서 rAAV 벡터의 효율적인 생성을 완수하기 위해, 공정에 요구되는 AAV 단백질은 적절한 수준으로 발현되어야 하는 것이었다. 이는 Rep 및 Cap 단백질을 암호화하는 다수의 오페론 적응을 요구하였다. 와일드 타입 AAV는 각각 두 가지 개별적인 프로모터 p5 및 p19로부터 라지 Rep78 대 스몰 Rep52를 발현하며, 이 두 메신저의 스플라이싱은 Rep68 및 Rep52 변이체의 생성을 일으킨다. 이 오페론 기구는 Rep78의 제한된 발현을 일으키며, 상대적으로 더 높은 Rep52 발현을 일으킨다. 낮은 78 대 52 비율을 모방하기 위해, Urabe 및 동료들은 Rep78의 발현이 급초기 1 유전자(Δ IE -1)에 대하여 부분적으로 결실된 프로모터에 의해 유도되는 것에 반해, Rep52 발현은 강한 폴리헤드린 프로모터(polh)에 의해 조절되는 DNA 카세트를 제작하였다. 라지 및 스몰 Reps의 스플라이싱된 변이체들은 곤충 세포에서 관찰되지 않았으며, 이는 아마도 포유류 및 곤충 세포 사이에 스플라이싱 공정의 차이와 관련이 있는 것으로 보인다. 극복해야할 또 다른 기술적 과제는 상기 3가지 주 바이러스 단백질(VP's)의 발현과 관련되었다. 와일드 타입 AAV는 p40 프로모터로부터 VP1, 2 및 3을 발현한다. 발생된 메신저 RNA는 두 종으로 스플라이싱된다: VP1 발현에 책임있는 하나와 그리고 한편으로는 "리키 리보솜 스케닝 메커니즘(leaky ribosomal scanning mechanism)"을 통해 VP2 및 VP3 모두를 발현하는 두 번째 것. 여기서 단백질은 고전적이지 않은 출발로부터 개시되는 것으로, 즉 ACG는 리보좀 복합체에 의해 종종 놓쳐지며, 이는 VP3의 고전적인 출발이 찾아낼 때까지 계속 진행된다. 척추동물 세포와 곤충 세포 사이의 스플라이싱 기구의 차이에 기인하여, 상기한 메커니즘은 곤충 세포에서 적절한 캡시드의 생성을 일으키지 못하였다. Urabe 등은 VP1의 번역 출발이 ACG로 변하고, VP1에 선행하는 9 뉴클레오타이드로 구성된 개시 콘텍스트가 VP2에 선행하는 것들로 변하는 식으로 VP2에서 발견된 것들과 유사한 VP1의 번역 출발의 변형을 도입하기로 결정하였다. 이러한 유전적 변경은 단일 폴리시스트론성 mRNA로부터 캡시드 내로 적절히 어셈블리할 수 있는 정확한 화학양론으로 상기 3가지 VPs의 발현을 일으켰다. 다른 한편으로 트랜스진 카세트는 복제 및 패키징을 위해 단지 인 트랜스(in trans)로 요구되는 요소로서 ITRs 측면에 위치한 포유류 기초 시스템에 대해 이전에 기재된 것과 유사하였다.
다른 원하는 특성들을 가진 새로 발견된 AAV 혈청형의 수가 증가함에 따라, BEV 시스템에서 이러한 캡시드들의 생성에 대한 요구가 존재한다. 곤충 세포에서 AAV2의 성공적인 생산이 나타났음에도 불구하고, AAV2에 적응된 시스템에서 모든 혈청형이 동등하게 잘 수행되는 것은 아니다. 최적의 생산 및 효능을 위해 새로운 혈청형을 적응시키는 것은 사소한 과업이 아니며, 맞춤형 접근이 요구될 것이다. 곤충 세포에서 BEVS에 의한 생산을 위해 rAAV5 서열을 적응시키기 위한 이전의 시도들은 제한된 성공에 직면하였으며, 이는 VP1의 캡시드로의 낮은 통합을 일으켰다((Kohlbrenner 등(2005) Molecular Therapy 12 (6):1217-1225; Urabe 등(2006) Journal of Virology 80(4):1874-1885). 이러한 문제를 우회하기 위해, Urabe 등은 AAV 타입의 N-말단 136 아미노산 잔기와 그리고 AAV 타입 5의 나머지 서열을 함유하는 키메릭 타입 2/5 바이러스를 생성하였다. 이러한 바이러스는 잘 생산되는 것으로 보고되었으며, 와일드 타입 AAV5의 것과 유사한 효능을 나타내는 것으로 보고되었다(Urabe 등(2006), 상기 참조). 그러나, 결과적으로 형성된 비리온은 키메라이며, 이는 "진정한(true)" rAAV5 혈청형을 대표하지 못한다.
향상된 감염성 및/또는 효능으로 곤충 세포에서 진성 rAAV5를 생성하기 위해, 본 발명자들은 여러 캡시드 단백질 5 돌연변이들을 디자인하였다. 상기 3가지 바이러스 단백질들의 화학양론의 균형을 맞추어 주는 것이 감염성에 중요한 것으로 보인다. 예를 들어, 이전에 보고된 바와 같이, 본 발명자들은 VP1 합성의 결핍이 벡터의 효능에 대폭적으로 영향을 주는 것을 알았다. 더욱이, 본 발명자들은 벡터의 효능이 VP1 및 VP2에 비해 VP3의 높은 통합과 부정적으로 상관성이 있음을 관찰하였다. 과도한 양의 VP3를 갖는 바이러스 제조물은 시험관 내 및 생체 내에서 세포 트랜스덕션시 좋지 못하였다. 결국 본 발명자들은 Urabe 등(2006, 상기 참조)에 의해 생성된 키메릭 rAAV5에 비해 더 우수한 효능을 나타내는 진성(또는 "진정한(true)") rAAV5 캡시드를 제작하였다. 이 새로운 캡시드는 균형잡힌 VP 화학양론을 가지며, 그리고 키메릭 AAV2/5에 비해 유사하거나 또는 더 우수한 효능을 갖는 것으로 발견되었다.
2. 방법
2.1. rAAV5 벡터의 생성
rAAV5 뱃치들은 expressSF+® 곤충 세포주(Protein Sciences Corporation)에 3개의 다른 배큘로바이러스로 동시 감염시킴으로써 생성되었으며, 여기서 3개의 다른 배큘로바이러스는 각각, CMV 및 LP1 프로모터의 조절 하에서 캡시드(rAAV5 변이체 라이브러리), 리플리케이즈 및 트랜스진(Seap 또는 팩터 IX)에 대한 발현 카세트를 포함하였다. 캡시드 발현 카세트는 폴리헤드론 프로모터의 조절 하에 존재하였다. Rep 발현 카세트는 WO 2009/14445(BAC.VD183)에 기재된 바와 같았으며, 각각 Rep78 및 Rep52의 발현을 유도하는 deltalE1 및 폴리헤드론 프로모터의 조절 하에 존재하였다. ExpresSF+® 세포들은 새로 증폭된 배큘로바이러스 스톡을 사용하여 5:1:1(Rep:Cap:트랜스진) 용적비로 감염되었다. 28℃에서 72시간 배양 후, 세포들을 28℃에서 1시간 동안 10x 용균 버퍼(1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl, 1mM MgCl2, 1% Triton X-100, pH=8.5)로 용해하였다. 게놈 DNA는 37℃에서 1시간 동안 벤조나아제 처리로 다이제스션하였다. 세포 찌꺼기는 1900xg에서 15분간 원심분리하여 제거한 후, rAAV5 파티클을 함유한 상층액을 4℃에 보관하였다. 벡터 타이터는 상기 트랜스진의 프로모터 리전에 대해 특이적인 Q-PCR을 이용하여 소위 크루드 셀 라이세이트(crude cell lysate)에서 검출되었다. 간략히, 친화 정제된 벡터들은 Q-PCR에 의해 분석되었다. AAVs는 37℃에서 DNAse로 처리하여 외생(extrageneous) DNA를 분해하였다. 그 다음, AAV DNA는 1M NaOH 처리에 의해 파티클로부터 방출되었다. 짧은 열처리(37℃, 30분) 후, 알칼리 환경은 동 체적의 1M HCl로 중화되었다. 중화된 시료는 Taqman Q-PCR에 사용된 AAV DNA를 함유하였다. Q-PCR은 하기 표 1에 열거한 프라이머 및 프로브를 사용하여 표준 방법에 따라 수행되었다.
2.2. rAAV5 벡터의 정제
rAAV5 파티클은 AVB 세파로즈(친화성 레진, GE healthcare)를 사용하여 뱃치 바인딩 프로토콜에 의해 크루드 라이세이트로부터 정제되었다. rAAV5 크루드 셀 라이세이트는 (0.2M HPO4 pH=7.5 버퍼로) 세정된 레진에 첨가되었다. 후속적으로, 시료들은 온화한 혼합 하에 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 배양 후, 레진을 0.2M HPO4 pH=7.5 버퍼로 세정하고, 바인딩된 벡터들은 0.2M 글리신 pH=2.5의 첨가로 용출되었다. 용출된 벡터들의 pH는 0.5M Tris-HCl pH=8.5의 첨가에 의해 즉시 중화되었다. 정제된 rAAV5 뱃치들은 -20℃에 보관되었다. 정제된 벡터들은 특이적 Q-PCR에 의해 타이터가 측정되었다.
생체 내 시험에 있어서 보다 높은 벡터 양을 생성하기 위해, 변형된 정제 프로토콜이 사용되었다. 간략히, 수거 후, 투명해진 라이세이트를 0.22㎛ 필터(Millipak 60, 0.22㎛)에 걸쳐 통과시켰다. 그 다음, 벡터 파티클을 AKTA explorer(FPLC 크로마토그래피 시스템, GE healthcare) 상에서 8ml AVB 세파로즈 컬럼에 의해 친화 정제하였다. 바인딩된 rAAV5 파티클은 0.2M 글리신 pH=2.5로 상기 컬럼으로부터 용출되었다. 용출물은 즉시 60mM Tris-HCl pH=7.5에 의해 중화되었다. 중화된 용출물의 버퍼는 100 Kda 한외여과(Millipore) 필터의 도움으로 PBS 5% 수크로즈로 교환되었다. 그 다음, 최종 산물은 0.22㎛ 필터(Millex GP) 상에서 여과하고, 분액하고, 추가 사용시까지 -20℃에 보관하였다. 정제 후, 바이러스 타이터는 특이적 Q-PCR을 이용하여 검출되었다.
Figure pct00001
2.3. rAAV5 변이체들의 VP 단백질 조성
정제된 rAAV5 변이체들의 VP 단백질 조성은 Sypro Ruby로 염색된 Bis-트리스 폴리아크릴아미드 겔(Nupage, Life technologies) 상에서 검출되었다. 간략히, 15㎕의 정제된 rAAV5를 5㎕ 4x LDS 로딩 버퍼(Life technologies)와 혼합하고, Bis-트리스 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하였다. 시료들은 100 볼트에서 2시간 동안 전기영동으로 분리되었다. 전기영동 후, 단백질들은 10% NaAC/7% EtOH로 30분간 고정되고, 2시간 동안 Sypro Ruby(Life technologies)로 염색되었다. 그 다음, VP 단백질들은 ImageQuant system(GE Healthcare) 상에서 UV 광 하에 가시화되었다.
2.4. 시험관 내 효능
여러 가지 혈청형 5 캡시드 변이체들의 시험관 내 효능을 조사하기 위해, 2가지 연속 세포주를 사용하였다. 여기서, 1x105 Hela 및 Huh7이 다양한 감염 다중도(multiplicity of infection)로 rAAV5 변이체들로 감염되었다. 실험은 le5 cells/well에서 약 80% 컨플루언시를 갖는 24-웰 플래이트에서 수행되었다. 두 실험 모두에서, 와일드 타입 아데노바이러스는 30 감염 다중도로 사용되었다. 와일드 타입 아데노바이러스의 이러한 첨가는 약 24시간 내에 제2 스트랜드 합성의 공정을 촉진하기 위해 시험관 내 효능 시험에만 적용되어, 이에 따라 이 어세이는 상대적으로 보다 짧은 기간으로 수행될 수 있고, 세포 패시지의 요구를 피할 수 있다. 감염 시작 후 48시간에, Seap 발현은 Seap 리포터 어세이 키트(Roche)를 이용하여 상층액에서 측정되었다. 1초의 인테그레이션 시간으로 470nm에서 Spectramax L luminometer(Molecular devices) 상에서 발광을 측정하였다.
2.5. 생체 내 효능
여러 가지 혈청형 5 캡시드 변이체들의 생체 내 효능을 조사하기 위해, 2가지 다른 실험을 수행하였다. 간략히, Seap 리포터 유전자가 은닉되어 있는 rAAV5 벡터 구조체들 159-164의 효능이 C57BL/6 마우스에서 조사되었다. 다양한 벡터들이 5x1012 gc/kg의 도즈로 마우스에 근육 내 주사되었다. 그룹들은 각 5마리의 마우스로 구성되었으며, PBS 그룹을 포함하여 총 7그룹들이 존재하였다. 마우스 혈장은 주사 후 2, 4 및 6주에 획득되었으며, 이후에 마우스는 희생되었다. Seap 활성은 Roche의 Seap 리포터 어세이 키트를 사용하여 혈장에서 측정되었다. 1초의 인테그레이션 시간으로 470nm에서 Spectramax L luminometer(Molecular devices) 상에서 발광을 측정하였다.
그 다음, 변이체 AAV5(765)의 생체 내 효능을 AAV5(160) 및 AAV5(92)의 생체 내 효능과 비교하였다. AAV5(92)는 Kotin 박사의 실험실(Urabe 등, 2006)로부터 친절히 제공받았다. C57BL/6 마우스에 리포터 유전자로서 FIX가 모두 은닉된 765 또는 160을 2x1012 gc/kg 및 2x1013 gc/kg의 도즈로 정맥 내 주사하였다. PBS 그룹을 포함하여 5마리의 마우스로 된 총 7 그룹에 각각 주사하였다. 혈장은 주사 후 1, 2 및 4주에 수집되었으며, 이후 마우스들은 희생되었다. 혈장에 존재하는 팩터 IX 단백질은 팩터 IX 특이적 ELISA(VisuLize FIX antigen kit, Kordia)로 측정되었다. 광학 밀도는 Versamax ELISA 플래이트 리더(Molecular devices) 상에서 450nm에서 측정되었다.
3. 결과
3.1. BEVS 에서 rAAV5 의 생성
AAV는 이의 유전자들, 특히 cap 유전자를 발현하기 위해 그 숙주의 기구를 이용하는 포유류 바이러스이다. 포유류 숙주에서 VP1:VP2:VP3의 정확한 화학양론에 의해 달성되는 메커니즘은 곤충 세포에서 존재하지 않거나 또는 최적이 아니다. 따라서, Urabe 등은 정확한 화학양론으로 곤충 세포에서 AAV2의 3가지 VP 단백질의 생산을 일으키는 cap 폴리시스트론성 mRNA의 조직화를 위한 유전적 조정의 전략을 개발하였다(Urabe 등(2002), 상기 참조). BEVS에서 rAAV5를 생산하는 유사한 방법을 확립하기 위한 시도들은 충분한 감염성 파티클을 달성하는데 성공적이지 못한 것으로 입증되었다. 어떠한 이론으로 국한하려는 것은 아니나, 이는 VP1의 캡시드 내로의 낮은 통합에 기인하는 것으로 보인다(Urabe 등(2002), 상기 참조). 이 때문에, 타입 2 혈청형을 이용한 이전의 성공을 기반으로 하여 Urabe 등은 감염성 AAV5 파티클을 생산하기 위해 타입 5 VP1의 N-말단 부분을 타입 2의 것으로 치환하였다(Urabe 등(2002), 상기 참조). 성공적임에도 불구하고, 키메릭 AAV2/5 키메릭 캡시드는 bona fide 타입 5 파티클을 포함하지 않으며, 그러므로 AAV5에 비해 변화된 특성을 가질 수 있으며, 이는 타입 5의 것과는 다른 두 캡시드의 조합을 나타낼 수 있다.
향상된 감염성 및 효능으로 곤충 세포에서 AAV5 비리온 생산을 가능하게 하기 위해, 본 발명에서 AAV5의 cap5 발현 카세트에 대한 일련의 유전적 변화를 만들었다(표 2). 기존에 언급된 바와 같이(Urabe 등(2002), 상기 참조) 와일드 타입 cap5 유전자(여기서는 클론 넘버 763)는 rAAV의 생성을 뒷받침하지 못하였다. 곤충 세포에서 네이티브 AAV 스플라이싱 신호의 인지의 결핍은 아마도 개별 VP 단백질의 낮은 발현 및 벡터 생산의 결핍을 일으켰다. 진핵 리보솜은 mRNA를 5'으로부터 3'으로 단방향으로 읽기 때문에, 폴리시스트론성 cap5 mRNA의 제1 번역 개시 출발(여기서는 VP1)은 3가지 모든 단백질들의 발현에 해롭다. 와일드 타입 개시 출발은 소위 강한 번역 개시 코돈인 ATG로 구성되며, 이는 리보솜 번역초과(read through)를 허용하지 않으며, 이에 따라 다른 두 VPs의 발현을 차단하여, rAAV 생산의 결핍을 이끈다. 와일드 타입 AAV는 VP2(비-고전적인 번역 개시 출발, ACG) 및 VP3(ATG)를 발현하기 위해 리보좀 번역초과(read through)를 사용한다는 사실로 인하여, VP1의 번역 출발 및 3가지 VP 단백질들의 발현 및/또는 어셈블리를 변경하기 위해 이의 인접 환경을 조사하였다.
번역 출발의 뉴클레오타이드 콘텍스트는 번역 개시의 강도에 영향을 미친다는 것이 이전에 보고되었다(Kozak(1987) Nucleic Acid Research 15(20):8125 8148; WO2007/046703). 바람직한 뉴클레오타이드는 위치(-3)에 A 및 위치(+4)에 G가 존재하며, 각각 AUG 카운팅 +1, +2 및 +3이 있는 것으로 보인다(Kozak, 상기 참조; WO2007/046703). 표 2는 번역 개시 출발, 3가지 VPs의 발현을 조정하기 위한 이의 업스트림 및 다운스트림 콘텍스트에 도입된 특정 변화들을 상세히 나타낸다. 본 발명자들은 VP2 번역 출발을 본래 둘러싸는 업스트림 개시 콘텍스트; 다양한 비-고전적인 출발 코돈들(ACG, CTG, TTG, GTG), +2 와일드 타입 트리플릿에 대한 다양한 돌연변이유발 변화 및 +1 개시 트리플릿과 +2 와일드 타입 트리플릿 사이의 삽입을 조사하였다. 이러한 특징들의 조합을 포함하는 발현 카세트들이 rAAV의 생성을 위해 사용되었다.
Figure pct00002
3.2. VP1 의 번역 개시 출발 주위의 작은 뉴클레오타이드 변화는 벡터의 효능에 깊은 영향을 미친다.
표 2에 열거된 cap5 발현 카세트들의 모든 변이체들이 은닉되어 있는 배큘로바이러스 구조체가 성공적으로 생성되었다. 후속적으로, Rep(s) 및 트랜스진(리포터 유전자, 예, SEAP 또는 FIX)이 은닉된 배큘로바이러스들과 함께 이러한 배큘로바이러스를 rAAV의 생성을 위해 사용하였다. 여러 시도에 관계없이 시험된 구조체들의 일부는 rAAV 생산의 생성을 뒷받침하지 못하였다. 이는 와일드 타입 AAV5(구조체 763) 및 비-고전적인 출발, TTG(구조체 764), GTG(구조체 766)가 은닉된 구조체들의 일부를 포함하였다. 표 2에 열거된 다른 모든 구조체들은 rAAV의 성공적인 생성을 이끌었다.
성공적으로 생산된 rAAV 타입 5 변이체들의 3가지 바이러스 단백질들(VPs)이 분리되었다. 이 3가지 VPs의 화학양론은 정제된 벡터들의 전기영동 분리(SDS-PAGE)에 의해 조사되었다(도 1 및 6). cap5 유전자의 발현 카세트에 도입된 작은 변형들은 캡시드의 구성에 나타나는 상기 3가지 VP 단백질들의 발현 및/또는 어셈블리에 깊은 영향을 미치는 것으로 보인다. 본 발명자들은 비-고전적인 출발 코돈(ACG) 및 혈청형 2의 곤충 세포 생산을 가능하게 하는 변형으로서 Urabe 등에 의해 보고된 9가지의 뉴클레오타이드 업스트립 콘텍스트 CCTGTTAAG를 도입하는 것에 의한 혈청형 5 캡시드의 곤충 세포에 대한 적응이, VP1의 낮은 통합(낮은 VP1/VP2 비율) 및 캡시드 내로의 VP3의 과도한 수준의 통합(높은 VP3/VP1 비율)을 일으키며, 이는 상기 3가지 VPs의 일탈적인 화학양론을 일으키는 것을 알았다(도 1, 구조체 159). 마찬가지로, 알라닌에 대해 위치 +2에서 세린의 교환을 일으킨, G를 구성하기 위한 그리고 고전적인 Kozak 서열에 보다 유사하게 하기 위한 뉴클레오타이드 +4의 변형(구조체 161)은 VP1의 낮은 통합 및 VP3의 높은 통합(낮은 VP1/VP2 높은 VP3/VP1)을 일으켰다. 업스트림 CCTGTTAAG 및 다운스트림 변형, 즉 A에 대한 +4 뉴클레오타이드(구조체 162), 또는 AG에 대한 +4-5(구조체 164) 변화 또는 AGC에 대한 오리지널 +2 프리플릿의 변형과 함께 제2 트리플릿으로서 ACT의 삽입이 함께한 다양한 비=고전적 코돈 CTG의 사용은 낮은 VP1/VP2 높은 VP3/VP1을 일으키는 캡시드의 VP1 통합을 향상시키지 못하였다. 1에 가까운 VP1/VP2 비율을 보인 구조체들 중 하나는 구조체 160이었으며, 이는 와일드 타입 서열에 비해 CCTGTTAAG의 직접적인 업스트림 삽입, 비-고전적 ACG 및 GCT에 의해 암호화된 위치 +2 내의 부가적인 알라닌의 삽입을 포함하는 것이었으나, 그럼에도 불구하고 VP3의 통합은 여전히 과도하였다(동등한 VP1/VP2 높은 VP2/VP1). 후속적으로, 구조체 160에서 프로모터 서열은 보다 정확하게 와일드 타입 폴리헤드린 프로모터와 유사하도록 돌연변이되었다. 이는 돌연변이 761을 생성하였다. VP2 개시 콘텍스트는 제거되어 돌연변이 762가 생성되었다. 두 케이스 모두에서(761 및 762), 구조체 160에 비해 바이러스의 화학양론에 약간의 부정적인 영향이 있었다(보다 낮은 VP1 통합)(도 1). 그 다음, (번역 출발 코돈으로부터 직접적으로 다운스트림의 유익한 GCT를 보존하기 위해) 구조체 160에서 VP1의 번역 개시 출발 사이트는 와일드 타입 ATG(돌연변이 763), TTG(돌연변이 764), CTG(돌연변이 765), CTG(돌연변이 766)으로 변경되었다. 765 돌연변이를 제외하고 모두 rAAV의 검출가능한 생산의 결핍을 일으켰다. 흥미롭게도, 비-고전적인 VP1 개시 출발로서 CTG와 번역 출발 바로 다음의 (여분의 알라닌을 암호화하는) GCT 트리플릿의 첨가의 조합(765)은 VP2보다 더 높은 VP1의 통합 및 VP3의 강한 감쇄를 일으켰으며, 궁극적으로 균형잡힌 와일드 타입 AAV 유사 VP 화학양론(높은 VP1/VP2 중간의 VP3/VP1)을 일으켰다. 결국, ACG 대신 VP1 개시 코돈으로서 CTG를 갖는 구조체 160을 닮은 구조체 43은 거의 네이티브 VP 비율로 VP1 생산을 이끌었다(도 6).
3.3. VP3 의 불필요한 발현은 BEVS 에서 진성 타입 5 AAV 돌연변이들의 낮은 효능에 원인이 된다.
혈청형 5 캡시드의 라이브러리의 효능, 즉 벡터가 다른 VP 화학양론을 갖는 이의 유전 물질의 발현을 유도해 내는 능력을 시험하기 위해, 시험관 내 및 생체 내 시험이 수행되었다. 두 가지 다른 연속 세포주, 즉 Hela(도 2 및 도 7a) 및 Huh7(도 3 및 도 7b)가 사용되었다. 두 가지 모든 경우에, VP2의 통합보다 낮은 VP1의 통합 및 VP3의 과도한 통합을 보인 돌연변이들의 셋트(구조체 159, 161-164)는 매우 감소된 효능을 나타내었다(도 2 - 3). 벡터의 효능은 VP1 및 VP2 통합의 균형을 ??춤으로써 상당히 향상되었다(구조체 160). 프로모터의 단축(구조체 761) 및 개시자 구조체의 제거(구조체 762)는 벡터 효능에 부정적인 영향을 미쳤다. 가장 강력한 벡터, 구조체 765(도 2 - 3)는 전자에서 더 유리한 VP1 대 VP2 비율을 나타내었으며, VP3 통합을 현저히 감소시켰다. 결국, 개시자 구조체, CTG 개시 코돈 및 (여분의 알라닌을 암호화하는) 부가적인 GCT 트리플릿을 함께 갖는 (단축되지 않은) polH 프로모터(구조체 43)는 비록 구조체 765의 효능보다 다소 낮을지라도 우수한 효능을 나타내었다(도 7a 및 b).
돌연변이들의 부분집합(구조체 159-164)은 효능에 대해 생체 내에서(C57BL/6 마우스) 시험되었다. 벡터는 리포터 유전자 SEAP를 운반하였다. 마우스에 5e12 gc/kg의 도즈로 캡시드 5 변이체들을 주사하고, 시간에 맞춰 모니터하였다. 시험관 내 관찰에 따라, 시험된 셋트 중에서(160) 가장 우수한 효능을 나타낸 변이체는 또한 등몰 양으로 VP1/VP2를 가졌다(도 4).
3.4. 곤충 세포 생산된 진성 AAV5 (765)는 생체 내에서 키메릭 타입 2/5 돌연변이에 비해 더 우수하게 수행한다.
생체 내에서 AAV5(765)의 효능을 조사하기 위해, 3가지 벡터 뱃치들을 제조하였다. 이들은 키메릭 타입 2/5(92)(Urabe 등(2006), 상기 참조), 과도한 양의 VP3를 함유하는 진성 타입 AAV5(160) 및 VP 단백질의 와일드 타입 화학양론을 갖는 시험관 내에서 가장 우수하게 수행되는 진성 타입 5 AAV(765)를 포함하였다. 모든 뱃치들은 (WO 2006/36502에 기재된 바와 같이) Rep 단백질 및 FIX 발현 카세트가 은닉된 배큘로바이러스 구조체들을 사용하여 동일한 조건 하에서 생산되었다. 이 3가지 벡터 제조물의 효능을 비교하기 위해, 6마리의 검정 마우스에 상기 벡터들의 두 가지 다른 도즈를 주사하였다. 즉, 저 도즈 2e12 gc/kg 및 고 도즈 2e13 gc/kg. 각 5 마리의 동물로 구성된 비이클 그룹을 포함하여 총 7 그룹이 실험에 포함되었다. 실험 시작 후, 혈액을 1, 2 및 4주에 수집하였다. FIS의 발현은 특이적 ELISA에 의해 혈액에서 모니터되었다. 그 결과는, 앞선 시험관 내 발견이 160 구조체보다 현저하게 향상된 효능을 나타내는 765 돌연변이가 새롭게 생성되었음을 입증하였다. 흥미롭게도, 765 구조체는 또한 Urabe 등(2006)(상기 참조)에 의해 공개된 타입 2/5 키메라(구조체 92)보다 더 현저히 우수하였다(도 5). 765과 160 그리고 765와 92 사이의 차이를 조사하기 위해 언페어드 t 테스트가 사용되었다. 모든 케이스에서, 즉 1, 2 및 4주에서, p 값<0.05으로 통계학적으로 유의한 차이가 있었다.
4. 디스커션
곤충 세포에서 rAAV의 생성은 cap 유전자의 유전학적 기구에서 다수의 조정을 필요로 한다. 포유류 세포에서 AAV는 VP2에 대한 ACG 개시자 출발로부터 이의 VP 단백질들을 발현한다. 이는 1:1:10의 VP1:VP2:VP3 화학양론을 이끈다. 곤충 세포에서, 이러한 메커니즘은 정확한 VP 화학양론으로 AAV 벡터를 생산하는데 실패하였다(Urabe 등(2002), 상기 참조). 이는 VP1 개시자 트리플릿을 ACG로 변화시키고, 번역 개시 출발 사이트로부터 9 뉴클레오타이드 업스트림을 돌연변이 유발시킴으로써 rAAV2 혈청형을 생성하는데 있어서 Urabe 등에 의해 이전에 회피된 알려진 문제이다. 이러한 변화들은 정확한 화학양론으로 3가지 모든 rAAV2 VP 단백질의 생산을 이끌었다. rAAV5 발현 카세트에서 유사한 유전적 변화는 낮은 VP1 생산 및 생산된 바이러스의 낮은 효능을 일으켰다. rAAV2에 대한 유전적 적응의 성공을 기반으로 하여, Urabe 등은 일련의 6 도메인 스와프(swap) 돌연변이를 제조하기로 하였으며, 여기서 rAAV5는 AAV2로부터 VP1의 (7 아미노산 내지 136 아미노산까지 범위의) 다양한 길이의 N-말단부를 받아들였다. 이 접근은 VP 단백질의 정확한 화학양론을 나타낸 키메릭 rAAV5의 생산을 이끌었다. 더욱이, 상기 도메인 스와프 돌연변이는 293T 세포에서 생산된 rAAV5의 효능과 유사하거나 더 우수한 효능을 이끌었다(Urabe 등(2002), 상기 참조). Urabe 등은 키메릭 rAAV5가 곤충 세포에서 생성될 수 있음을 입증했음에도 불구하고, 획득된 벡터는 bona fide AAV5 파티클을 포함하지 않으며, 그러므로 기존의 중화 항체에 대한 민감성, 세포 내 수송(intracellular trafficking), 바이오 디스트리뷰션(bio-distribution) 및/또는 진정한 AAV5 혈청형으로부터의 표적화와 같은 다양한 견지에서 상이할 수 있다. 이와 동시에, Urabe 등은 VP1 폴리펩타이드의 낮은 합성에 기인하여 감염성 진성 rAAV5를 생산하기 위한 시도가 실패하였음을 보고하였다(Urabe 등(2002), 상기 참조).
여기서 본 발명자들은 곤충 세포에서 생산된 진성 rAAV5의 저 효능에 대한 근본적인 결정 요인을 이해하는데 목적을 둔 cap5 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. 우선, 본 발명자들은 곤충 세포에서 rAAV2의 성공적인 생성을 위해 기존에 사용된 다수의 적응들이 편입된 돌연변이(159)를 조사하였다(Urabe 등(2002), 상기 참조). 이 돌연변이는 VP1 번역 출발의 업스트림에 위치한 9 뉴클레오타이드 업스트림 VP2 개시자 콘텍스트 및 비-고전적인 번역 개시 출발 ACG를 함유한다. 이들 9 뉴클레오타이드는 곤충 세포에서 혈청형 2 유전자를 발현하기 위해 Urabe 등에 의해 기존에 사용되었다(Urabe 등(2002), 상기 참조). 이 특정 서열은 자연적으로 VP2의 비-고전적인 출발 코돈(ACG) 측면에 위치한다. 그 다음, 와일드 타입 ATG는 ACG 또는 CTG로 변하였으며, 그리고 출발 코돈으로부터 최적의 다운스트림 콘텍스트를 제공하기 위해 다양한 돌연변이들이 도입되었다. 대부분의 돌연변이들은 VP1의 낮은 통합 및 VP3의 과잉 존재를 갖는 일탈적인 VPs 화학양론(낮은 VP1/VP2 및 높은 VP3/VP1 비율)을 나타내었다. VP1/VP2 비율은 유전학적 디자인 160에서 상당히 향상되었으며, 그러나 이는 VP3의 벡터 파티클 내로의 과도한 통합을 여전히 나타내었다. 마지막으로, 유전학적 디자인들 중 하나, 즉 765가 다른 시험된 변이체들에 비해 VP1의 높은 통합(높은 VP1/VP2 비율) 및 VP3의 감소된 통합(균형잡힌 VP3/VP2 비율)을 나타내었다.
VP1/VP2 단백질의 낮은 비율은 낮은 벡터 효능에 책임이 있는 것으로 이전에 가정되어 왔다(Hermonat 등(1984) Journal of Virology 51(2):329-339; Tratschin 등(1984) Journal of Virology 51(3):611-619). AAV의 독특한 VP1 부분은 캡시드 내부에 매립되며, 바이러스의 핵으로의 수송 중에 노출된다. 이는 엔도솜의 루멘의 pH 저하에 대한 반응으로서 처음 노출된다. VP1의 프리 N-말단부는 캡시드의 외부에 노출시 인지질 기질의 2-아실 에스테르(sn -2) 결합을 특이적으로 가수분해하는데 유용하게 되는 포스포리파아제 도메인을 함유하며, 이는 리소인지질 및 유리 지방산의 방출을 일으키며, 그 다음 AAV의 엔도솜 탈출을 가능하게 한다. VP1의 독특한 부분은 핵 국소화 신호(베이직 아미노산 클러스터)를 함유하며, AAV의 핵 표적화에 연루되었다. 마침내, 일부 저자들은 VP1의 독특한 부분이 핵에서 바이러스 언코팅에 역할을 담당할 수 있음을 제시한다. 낮은 VP1/VP2 비율 및 VP3의 바이러스 파티클 내로의 과도한 통합(높은 VP3/VP1 비율)은 1) 평균적으로 VP1의 어셈블리된 파티클 내로의 감소된 통합을 일으키거나 또는 2) 두 가지 파티클 집단 A) (와일드 타입 화학양론 1:1:10, 즉 벡터 파티클 당 5 VP1 분자에 근접하게 갖는) 정확하게 어셈블리된 파티클 B) 단지 VP3/VP2 파티클의 생성을 일으킬 수 있다. 두 가지 모두의 상황에서(1 및 2), 이러한 벡터 제조물은 변경된 효능을 가질 수 있다. 벡터 제조물에 존재하는 (VP1 또는 VP2에 비해) VP3 단백질들의 과도한 양은 아마도 방해받은 엔도솜 탈출에 기인하여 벡터의 핵으로의 손상된 수송을 일으킨다. VP 화학양론이 벡터 효능에 유해하다는 가정을 시험하기 위해 그리고 보다 강력한 벡터를 생성하기 위해, 혈청형 5 캡시드 돌연변이들의 라이브러리를 시험관 내 및 생체 내에서 시험하였다.
VP의 화학양론은 상기 벡터의 효능과 매우 상관관계에 있는 것으로 보였다. 이전에 나타난 바와 같이(Hermonat 등(1984), 상기 참조; Tratschin 등(1984), 상기 참조; WO2007046703A2), 낮은 VP1/VP2 비율은 바이러스의 효능에 대해 강한 영향을 미친다. 돌연변이 159, 161-164는 모두 낮은 VP1/VP2 비율을 나타내었으며, 급격하게 감소된 효능을 나타내었다. VP1/VP2 사이의 향상된 비율은 벡터의 효능에 현저한 영향을 미쳤다(160). 흥미롭게도 VP1/VP1 비율의 추가 향상 및 VP3의 벡터 파티클로의 통합 감소(VP3/VP1 비율 감소)는 향상된 벡터 43의 생성을 이끌었으며, 이는 시험된 셋트 중 가장 강력한 벡터(구조체 765)의 생성을 이끌었다. 이 데이터는 벡터 파티클의 분자 형성이 이의 효능에 유해함을 분명히 보여준다. VP1의 통합 향상 및 이와 동시에 VP3의 통합 감소는 벡터 효능면에서 가장 우수한 결과를 주는 것으로 보인다. BEVS에서 생성된 파티클의 낮은 VP1/VP2 비율의 영향은 벡터 효능에 부정적인 영향을 미치는 것으로 이전에 보고되었다. VP2/VP3의 비율은 BEVS에서 생산을 위한 이의 유전학적 디자인이 와일드 타입 AAV 바이러스에서와 동일하다는 사실에 주로 기인하여, 이제까지 고려되지 않았다. 이러한 이유로, 이것이 변경된 VP2/VP3 비율을 이끈다는 것이 기대되지 않는다. 그러나, 여기서 존재하는 하나의 돌연변이를 제외한 모든 돌연변이에서 본 발명자들은 VP3의 벡터 파티클 내로의 과도한 통합(높은 VP3/VP1 비율)을 관찰하였으며, 이는 VP1 번역 출발 주위의 변화가 VP2 및 VP3의 발현에 강한 영향을 미친다는 것을 나타내었다. 단지 돌연변이 765만이 높은 VP1/VP2 비율 및 VP3의 감소된 통합을 갖는 균형된 화학양론을 나타내었으며, 이는 다른 시험된 변이체들에 비해 증가된 효능을 이끌었다. 또한, 765 변이체의 효능은 BEVS(구조체 92)에서 생산된 AAV5 유사 벡터에 대해 생체 내(마우스)에서 비교되었다. 상기 92 구조체는 혈청형 2의 N-말단 136 아미노산부를 갖는 AAV 혈청형 5의 키메라이다(Urabe 등(2006), 상기 참조). 구조체 92는 진정한 AAV5를 포함하지 않음에도 불구하고, 이는 BEVS에서 AAV5 유사 파티클의 생성을 위해 현재 이용가능한 유일한 대안이다. 765 구조체는 92 구조체에 비해 통계학적으로 유의한 우수성을 보였다.
본 발명자들은 VP1 번역 리즌(translational reason)의 돌연변이 유발 변화에 의한 다운스트림 VP2 및 VP3의 발현에 대한 강한 영향은 번역 프로세스 자체와 관련되어 있다는 가설을 세운다. 진핵생물에서 번역은 단방향적이며, mRNA 5'로 출발한다. mRNA와 한번 연관된 리보솜은, 이들이 단백질 합성을 개시하기 위해 적절한 콘텍스트에서 번역 ATG 출발을 찾을 때까지 계속해서 진행한다. 때로는 예를 들어 ACG 또는 CTG와 같은 위크 개시 코돈은, 만일 적절한 뉴클레오타이드 콘텍스트로 둘러쌓여진 경우에 비-고전적인 방식으로 단백질 합성을 개시할 수 있다. 이 메커니즘은 누설 리보솜 스캐닝(leaky ribosomal scanning)이라 불린다. VP1에서 누설 리보솜 스캐닝의 강도는 VP2 및 VP3에 대한 리보솜 "누설(leakage)"의 부분을 결정할 것이며, 그리고 후자의 두 가지로부터 단백질 발현의 강도를 결정할 것이다. 결과적으로 3가지 모든 성분들의 발현은 최종 어셈블리된 캡시드에서 이들의 존재를 결정할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> uniQure IP B.V. <120> Further improved AAV vectors produced in insect cells <130> P6049115PCT <150> EP 14158610.7 <151> 2014-03-10 <160> 73 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1876 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <220> <221> CDS <222> (11)..(1876) <223> Rep78 coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (683)..(1876) <400> 1 cgcagccgcc atg ccg ggg ttt tac gag att gtg att aag gtc ccc agc 49 Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser 1 5 10 gac ctt gac gag cat ctg ccc ggc att tct gac agc ttt gtg aac tgg 97 Asp Leu Asp Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp 15 20 25 gtg gcc gag aag gaa tgg gag ttg ccg cca gat tct gac atg gat ctg 145 Val Ala Glu Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu 30 35 40 45 aat ctg att gag cag gca ccc ctg acc gtg gcc gag aag ctg cag cgc 193 Asn Leu Ile Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg 50 55 60 gac ttt ctg acg gaa tgg cgc cgt gtg agt aag gcc ccg gag gcc ctt 241 Asp Phe Leu Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu 65 70 75 ttc ttt gtg caa ttt gag aag gga gag agc tac ttc cac atg cac gtg 289 Phe Phe Val Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val 80 85 90 ctc gtg gaa acc acc ggg gtg aaa tcc atg gtt ttg gga cgt ttc ctg 337 Leu Val Glu Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu 95 100 105 agt cag att cgc gaa aaa ctg att cag aga att tac cgc ggg atc gag 385 Ser Gln Ile Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu 110 115 120 125 ccg act ttg cca aac tgg ttc gcg gtc aca aag acc aga aat ggc gcc 433 Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala 130 135 140 gga ggc ggg aac aag gtg gtg gat gag tgc tac atc ccc aat tac ttg 481 Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu 145 150 155 ctc ccc aaa acc cag cct gag ctc cag tgg gcg tgg act aat atg gaa 529 Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu 160 165 170 cag tat tta agc gcc tgt ttg aat ctc acg gag cgt aaa cgg ttg gtg 577 Gln Tyr Leu Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val 175 180 185 gcg cag cat ctg acg cac gtg tcg cag acg cag gag cag aac aaa gag 625 Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu 190 195 200 205 aat cag aat ccc aat tct gat gcg ccg gtg atc aga tca aaa act tca 673 Asn Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser 210 215 220 gcc agg tac atg gag ctg gtc ggg tgg ctc gtg gac aag ggg att acc 721 Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr 225 230 235 tcg gag aag cag tgg atc cag gag gac cag gcc tca tac atc tcc ttc 769 Ser Glu Lys Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe 240 245 250 aat gcg gcc tcc aac tcg cgg tcc caa atc aag gct gcc ttg gac aat 817 Asn Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn 255 260 265 gcg gga aag att atg agc ctg act aaa acc gcc ccc gac tac ctg gtg 865 Ala Gly Lys Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val 270 275 280 285 ggc cag cag ccc gtg gag gac att tcc agc aat cgg att tat aaa att 913 Gly Gln Gln Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile 290 295 300 ttg gaa cta aac ggg tac gat ccc caa tat gcg gct tcc gtc ttt ctg 961 Leu Glu Leu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu 305 310 315 gga tgg gcc acg aaa aag ttc ggc aag agg aac acc atc tgg ctg ttt 1009 Gly Trp Ala Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe 320 325 330 ggg cct gca act acc ggg aag acc aac atc gcg gag gcc ata gcc cac 1057 Gly Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His 335 340 345 act gtg ccc ttc tac ggg tgc gta aac tgg acc aat gag aac ttt ccc 1105 Thr Val Pro Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro 350 355 360 365 ttc aac gac tgt gtc gac aag atg gtg atc tgg tgg gag gag ggg aag 1153 Phe Asn Asp Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys 370 375 380 atg acc gcc aag gtc gtg gag tcg gcc aaa gcc att ctc gga gga agc 1201 Met Thr Ala Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser 385 390 395 aag gtg cgc gtg gac cag aaa tgc aag tcc tcg gcc cag ata gac ccg 1249 Lys Val Arg Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro 400 405 410 act ccc gtg atc gtc acc tcc aac acc aac atg tgc gcc gtg att gac 1297 Thr Pro Val Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp 415 420 425 ggg aac tca acg acc ttc gaa cac cag cag ccg ttg caa gac cgg atg 1345 Gly Asn Ser Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met 430 435 440 445 ttc aaa ttt gaa ctc acc cgc cgt ctg gat cat gac ttt ggg aag gtc 1393 Phe Lys Phe Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val 450 455 460 acc aag cag gaa gtc aaa gac ttt ttc cgg tgg gca aag gat cac gtg 1441 Thr Lys Gln Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val 465 470 475 gtt gag gtg gag cat gaa ttc tac gtc aaa aag ggt gga gcc aag aaa 1489 Val Glu Val Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys 480 485 490 aga ccc gcc ccc agt gac gca gat ata agt gag ccc aaa cgg gtg cgc 1537 Arg Pro Ala Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg 495 500 505 gag tca gtt gcg cag cca tcg acg tca gac gcg gaa gct tcg atc aac 1585 Glu Ser Val Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn 510 515 520 525 tac gca gac agg tac caa aac aaa tgt tct cgt cac gtg ggc atg aat 1633 Tyr Ala Asp Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn 530 535 540 ctg atg ctg ttt ccc tgc aga caa tgc gag aga atg aat cag aat tca 1681 Leu Met Leu Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser 545 550 555 aat atc tgc ttc act cac gga cag aaa gac tgt tta gag tgc ttt ccc 1729 Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro 560 565 570 gtg tca gaa tct caa ccc gtt tct gtc gtc aaa aag gcg tat cag aaa 1777 Val Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys 575 580 585 ctg tgc tac att cat cat atc atg gga aag gtg cca gac gct tgc act 1825 Leu Cys Tyr Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr 590 595 600 605 gcc tgc gat ctg gtc aat gtg gat ttg gat gac tgc atc ttt gaa caa 1873 Ala Cys Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln 610 615 620 taa 1876 <210> 2 <211> 621 <212> PRT <213> adeno-associated virus 2 <400> 2 Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp 1 5 10 15 Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu 20 25 30 Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile 35 40 45 Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu 50 55 60 Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val 65 70 75 80 Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu 85 90 95 Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile 100 105 110 Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu 115 120 125 Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys 145 150 155 160 Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu 165 170 175 Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His 180 185 190 Leu Thr His Val Ser Gln 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aatggcgccg 540 cgtgagtaag gccccggagg ccctcttctt tgttcagttc gagaagggcg agtcctactt 600 ccacctccat attctggtgg agaccacggg ggtcaaatcc atggtgctgg gccgcttcct 660 gagtcagatt agggacaagc tggtgcagac catctaccgc gggatcgagc cgaccctgcc 720 caactggttc gcggtgacca agacgcgtaa tggcgccgga ggggggaaca aggtggtgga 780 cgagtgctac atccccaact acctcctgcc caagactcag cccgagctgc agtgggcgtg 840 gactaacatg gaggagtata taagcgcctg tttgaacctg gccgagcgca aacggctcgt 900 ggcgcagcac ctgacccacg tcagccagac ccaggagcag aacaaggaga atctgaaccc 960 caattctgac gcgcctgtca tccggtcaaa aacctccgcg cgctacatgg agctggtcgg 1020 gtggctggtg gaccggggca tcacctccga gaagcagtgg atccaggagg accaggcctc 1080 gtacatctcc ttcaacgccg cttccaactc gcggtcccag atcaaggccg ctctggacaa 1140 tgccggcaag atcatggcgc tgaccaaatc cgcgcccgac tacctggtag gccccgctcc 1200 gcccgcggac attaaaacca accgcatcta ccgcatcctg gagctgaacg gctacgaacc 1260 tgcctacgcc ggctccgtct ttctcggctg ggcccagaaa aggttcggga agcgcaacac 1320 catctggctg tttgggccgg ccaccacggg caagaccaac atcgcggaag ccatcgccca 1380 cgccgtgccc ttctacggct gcgtcaactg gaccaatgag aactttccct tcaatgattg 1440 cgtcgacaag atggtgatct ggtgggagga gggcaagatg acggccaagg tcgtggagtc 1500 cgccaaggcc attctcggcg gcagcaaggt gcgcgtggac caaaagtgca agtcgtccgc 1560 ccagatcgac cccacccccg tgatcgtcac ctccaacacc aacatgtgcg ccgtgattga 1620 cgggaacagc accaccttcg agcaccagca gccgttgcag gaccggatgt tcaaatttga 1680 actcacccgc cgtctggagc atgactttgg caaggtgaca aagcaggaag tcaaagagtt 1740 cttccgctgg gcgcaggatc acgtgaccga ggtggcgcat gagttctacg tcagaaaggg 1800 tggagccaac aaaagacccg cccccgatga cgcggataaa agcgagccca agcgggcctg 1860 cccctcagtc gcggatccat cgacgtcaga cgcggaagga gctccggtgg actttgccga 1920 caggtaccaa aacaaatgtt ctcgtcacgc gggcatgctt cagatgctgt ttccctgcaa 1980 gacatgcgag agaatgaatc agaatttcaa catttgcttc acgcacggga cgagagactg 2040 ttcagagtgc ttccccggcg tgtcagaatc tcaaccggtc gtcagaaaga ggacgtatcg 2100 gaaactctgt gccattcatc atctgctggg gcgggctccc gagattgctt gctcggcctg 2160 cgatctggtc aacgtggacc tggatgactg tgtttctgag caataaatga cttaaaccag 2220 gt atg gct gcc gat ggt tat ctt cca gat tgg ctc gag gac aac ctc 2267 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu 1 5 10 15 tct gag ggc att cgc gag tgg tgg gac ttg aaa cct gga gcc ccg aag 2315 Ser Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys 20 25 30 ccc aaa gcc aac cag caa aag cag gac gac ggc cgg ggt ctg gtg ctt 2363 Pro Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu 35 40 45 cct ggc tac aag tac ctc gga ccc ttc aac gga ctc gac aag ggg gag 2411 Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu 50 55 60 ccc gtc aac gcg gcg gac gca gcg gcc ctc gag cac gac aag gcc tac 2459 Pro Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr 65 70 75 gac cag cag ctc aaa gcg ggt gac aat ccg tac ctg cgg tat aac cac 2507 Asp Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His 80 85 90 95 gcc gac gcc gag ttt cag gag cgt ctg caa gaa gat acg tct ttt ggg 2555 Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly 100 105 110 ggc aac ctc ggg cga gca gtc ttc cag gcc aag aag cgg gtt ctc gaa 2603 Gly Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu 115 120 125 cct ctc ggt ctg gtt gag gaa ggc gct aag acg gct cct gga aag aaa 2651 Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys 130 135 140 cgt ccg gta gag cag tcg cca caa gag cca gac tcc tcc tcg ggc atc 2699 Arg Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile 145 150 155 ggc aag aca ggc cag cag ccc gct aaa aag aga ctc aat ttt ggt cag 2747 Gly Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 160 165 170 175 act ggc gac tca gag tca gtc ccc gat cca caa cct ctc gga gaa cct 2795 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 cca gca acc ccc gct gct gtg gga cct act aca atg gct tca ggc ggt 2843 Pro Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly 195 200 205 ggc gca cca atg gca gac aat aac gaa ggc gcc gac gga gtg ggt aat 2891 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly 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Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn 435 440 445 aga act caa aat cag tcc gga agt gcc caa aac aag gac ttg ctg ttt 3611 Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe 450 455 460 agc cgt ggg tct cca gct ggc atg tct gtt cag ccc aaa aac tgg cta 3659 Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu 465 470 475 cct gga ccc tgt tat cgg cag cag cgc gtt tct aaa aca aaa aca gac 3707 Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp 480 485 490 495 aac aac aac agc aat ttt acc tgg act ggt gct tca aaa tat aac ctc 3755 Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu 500 505 510 aat ggg cgt gaa tcc atc atc aac cct ggc act gct atg gcc tca cac 3803 Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His 515 520 525 aaa gac gac gaa gac aag ttc ttt ccc atg agc ggt gtc atg att ttt 3851 Lys Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe 530 535 540 gga aaa gag agc gcc gga gct tca aac act gca ttg gac aat gtc atg 3899 Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met 545 550 555 att aca gac gaa gag gaa att aaa gcc act aac cct gtg gcc acc gaa 3947 Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 560 565 570 575 aga ttt ggg acc gtg gca gtc aat ttc cag agc agc agc aca gac cct 3995 Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro 580 585 590 gcg acc gga gat gtg cat gct atg gga gca tta cct ggc atg gtg tgg 4043 Ala Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 caa gat aga gac gtg tac ctg cag ggt ccc att tgg gcc aaa att cct 4091 Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 cac aca gat gga cac ttt cac ccg tct cct ctt atg ggc ggc ttt gga 4139 His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 ctc aag aac ccg cct cct cag atc ctc atc aaa aac acg cct gtt cct 4187 Leu Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 640 645 650 655 gcg aat cct ccg gcg gag ttt tca gct aca 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cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca 1020 aggggattac ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca 1080 atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta 1140 tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt 1200 ccagcaatcg gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt 1260 ccgtctttct gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg 1320 ggcctgcaac taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct 1380 acgggtgcgt aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg 1440 tgatctggtg ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc 1500 tcggaggaag caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga 1560 ctcccgtgat cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga 1620 ccttcgaaca ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc 1680 tggatcatga ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa 1740 aggatcacgt ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa 1800 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gga gac gca gac 2742 Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ala Asp 165 170 175 180 tca gta cct gac ccc cag cct ctc gga cag cca cca gca gcc ccc tct 2790 Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro Ala Ala Pro Ser 185 190 195 ggt ctg gga act aat acg atg gct aca ggc agt ggc gca cca atg gca 2838 Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly Ala Pro Met Ala 200 205 210 gac aat aac gag ggc gcc gac gga gtg ggt aat tcc tcg gga aat tgg 2886 Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp 215 220 225 cat tgc gat tcc aca tgg atg ggc gac aga gtc atc acc acc agc acc 2934 His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr 230 235 240 cga acc tgg gcc ctg ccc acc tac aac aac cac ctc tac aaa caa att 2982 Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile 245 250 255 260 tcc agc caa tca gga gcc tcg aac gac aat cac tac ttt ggc tac agc 3030 Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr Phe Gly Tyr Ser 265 270 275 acc cct tgg ggg tat ttt gac ttc aac aga ttc cac tgc cac ttt tca 3078 Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser 280 285 290 cca cgt gac tgg caa aga ctc atc aac aac aac tgg gga ttc cga ccc 3126 Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro 295 300 305 aag aga ctc aac ttc aag ctc ttt aac att caa gtc aaa gag gtc acg 3174 Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr 310 315 320 cag aat gac ggt acg acg acg att gcc aat aac ctt acc agc acg gtt 3222 Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val 325 330 335 340 cag gtg ttt act gac tcg gag tac cag ctc ccg tac gtc ctc ggc tcg 3270 Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser 345 350 355 gcg cat caa gga tgc ctc ccg ccg ttc cca gca gac gtc ttc atg gtg 3318 Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Val 360 365 370 cca cag tat gga tac ctc acc ctg aac aac ggg agt cag gca gta gga 3366 Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly 375 380 385 cgc 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1440 tctggtggga ggagggcaag atgacggcca aggtcgtgga gagcgccaag gccattctgg 1500 gcggaagcaa ggtgcgcgtg gaccaaaagt gcaagtcatc ggcccagatc gaacccactc 1560 ccgtgatcgt cacctccaac accaacatgt gcgccgtgat tgacgggaac agcaccacct 1620 tcgagcatca gcagccgctg caggaccgga tgtttgaatt tgaacttacc cgccgtttgg 1680 accatgactt tgggaaggtc accaaacagg aagtaaagga ctttttccgg tgggcttccg 1740 atcacgtgac tgacgtggct catgagttct acgtcagaaa gggtggagct aagaaacgcc 1800 ccgcctccaa tgacgcggat gtaagcgagc caaaacggga gtgcacgtca cttgcgcagc 1860 cgacaacgtc agacgcggaa gcaccggcgg actacgcgga caggtaccaa aacaaatgtt 1920 ctcgtcacgt gggcatgaat ctgatgcttt ttccctgtaa aacatgcgag agaatgaatc 1980 aaatttccaa tgtctgtttt acgcatggtc aaagagactg tggggaatgc ttccctggaa 2040 tgtcagaatc tcaacccgtt tctgtcgtca aaaagaagac ttatcagaaa ctgtgtccaa 2100 ttcatcatat cctgggaagg gcacccgaga ttgcctgttc ggcctgcgat ttggccaatg 2160 tggacttgga tgactgtgtt tctgagcaat aaatgactta aaccaggt atg gct gct 2217 Met Ala Ala 1 gac ggt tat ctt cca gat tgg ctc gag gac aac ctt tct gaa ggc 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gac aga gtc atc acc acc agc 2937 Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser 230 235 240 acc aga acc tgg gcc ctg ccc act tac aac aac cat ctc tac aag caa 2985 Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln 245 250 255 atc tcc agc caa tca gga gct tca aac gac aac cac tac ttt ggc tac 3033 Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr Phe Gly Tyr 260 265 270 275 agc acc cct tgg ggg tat ttt gac ttt aac aga ttc cac tgc cac ttc 3081 Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe 280 285 290 tca cca cgt gac tgg cag cga ctc att aac aac aac tgg gga ttc cgg 3129 Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg 295 300 305 ccc aag aaa ctc agc ttc aag ctc ttc aac atc caa gtt aga ggg gtc 3177 Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Arg Gly Val 310 315 320 acg cag aac gat ggc acg acg act att gcc aat aac ctt acc agc acg 3225 Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr 325 330 335 gtt caa gtg ttt 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aat cct ctg att gac cag 3449 Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln 430 435 440 tac ctg tac tac ttg tct cgg act caa aca aca gga ggc acg gca aat 3497 Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn 445 450 455 acg cag act ctg ggc ttc agc caa ggt ggg cct aat aca atg gcc aat 3545 Thr Gln Thr Leu Gly Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn 460 465 470 475 cag gca aag aac tgg ctg cca gga ccc tgt tac cgc caa caa cgc gtc 3593 Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val 480 485 490 tca acg aca acc ggg caa aac aac aat agc aac ttt gcc tgg act gct 3641 Ser Thr Thr Thr Gly Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala 495 500 505 ggg acc aaa tac cat ctg aat gga aga aat tca ttg gct aat cct ggc 3689 Gly Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly 510 515 520 atc gct atg gca aca cac aaa gac gac gag gag cgt ttt ttt ccc agt 3737 Ile Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser 525 530 535 aac ggg atc ctg att 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gac cgc ttc ttt cca tca agt ggc 3735 Met Ala Ser His Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly 525 530 535 540 gtt ctc ata ttt ggc aag caa gga gcc ggg aac gat gga gtc gac tac 3783 Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Asn Asp Gly Val Asp Tyr 545 550 555 agc cag gtg ctg att aca gat gag gaa gaa att aaa gcc acc aac cct 3831 Ser Gln Val Leu Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro 560 565 570 gta gcc aca gag gaa tac gga gca gtg gcc atc aac aac cag gcc gct 3879 Val Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Ala Val Ala Ile Asn Asn Gln Ala Ala 575 580 585 aac acg cag gcg caa act gga ctt gtg cat aac cag gga gtt att cct 3927 Asn Thr Gln Ala Gln Thr Gly Leu Val His Asn Gln Gly Val Ile Pro 590 595 600 ggt atg gtc tgg cag aac cgg gac gtg tac ctg cag ggc cct att tgg 3975 Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp 605 610 615 620 gct aaa ata cct cac aca gat ggc aac ttt cac ccg tct cct ctg atg 4023 Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met 625 630 635 ggt gga 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Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn 210 215 220 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn 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acttggatga ctgtgtttct 1860 gagcaataaa tgacttaaac caggt atg gct gct gac ggt tat ctt cca gat 1912 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp 1 5 tgg ctc gag gac aac ctc tct gag ggc att cgc gag tgg tgg gac ctg 1960 Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu 10 15 20 25 aaa cct gga gcc ccc aag ccc aag gcc aac cag cag aag cag gac gac 2008 Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp 30 35 40 ggc cgg ggt ctg gtg ctt cct ggc tac aag tac ctc gga ccc ttc aac 2056 Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn 45 50 55 gga ctc gac aag ggg gag ccc gtc aac gcg gcg gac gca gcg gcc ctc 2104 Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu 60 65 70 gag cac gac aag gcc tac gac cag cag ctc aaa gcg ggt gac aat ccg 2152 Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro 75 80 85 tac ctg cgg tat aac cac gcc gac gcc gag ttt cag gag cgt ctg caa 2200 Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln 90 95 100 105 gaa 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3544 Pro Ser Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp 540 545 550 aat gtg gac tac agc agc gtt atg cta aca agc gaa gaa gaa att aaa 3592 Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys 555 560 565 acc act aac cct gta gcc aca gaa caa tac ggc gtg gtg gct gac aac 3640 Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn 570 575 580 585 ttg cag caa gcc aat aca ggg cct att gtg gga aat gtc aac agc caa 3688 Leu Gln Gln Ala Asn Thr Gly Pro Ile Val Gly Asn Val Asn Ser Gln 590 595 600 gga gcc tta cct ggc atg gtc tgg cag aac cga gac gtg tac ctg cag 3736 Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln 605 610 615 ggt ccc atc tgg gcc aag att cct cac acg gac ggc aac ttt cac ccg 3784 Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro 620 625 630 tct cct ctg atg ggc ggc ttt gga ctt aaa cac ccg cct cca cag atc 3832 Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile 635 640 645 ctg atc aag aac acg ccg gta cct gcg gat cct 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aac ggg agt cag gcg gta gga cgc tct tcc ttt tac tgc 3126 Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys 380 385 390 ctg gag tac ttt cct tct cag atg ctg cgt act gga aac aac ttt cag 3174 Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln 395 400 405 ttt agc tac act ttt gaa gac gtg cct ttc cac agc agc tac gct cac 3222 Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His 410 415 420 425 agc caa agt ctg gac cgt ctc atg aat cct ctg atc gac cag tac ctg 3270 Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu 430 435 440 tac tat ctg aac agg aca caa aca gcc agt gga act cag cag tct cgg 3318 Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr Gln Thr Ala Ser Gly Thr Gln Gln Ser Arg 445 450 455 cta ctg ttt agc caa gct gga ccc acc agt atg tct ctt caa gct aaa 3366 Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly Pro Thr Ser Met Ser Leu Gln Ala Lys 460 465 470 aac tgg ctg cct gga cct tgc tac aga cag cag cgt ctg tca aag cag 3414 Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Gln 475 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cagctgccct acgtcgtcgg caacgggacc gagggatgcc tgccggcctt ccctccgcag 1080 gtctttacgc tgccgcagta cggttacgcg acgctgaacc gcgacaacac agaaaatccc 1140 accgagagga gcagcttctt ctgcctagag tactttccca gcaagatgct gagaacgggc 1200 aacaactttg agtttaccta caactttgag gaggtgccct tccactccag cttcgctccc 1260 agtcagaacc tgttcaagct ggccaacccg ctggtggacc agtacttgta ccgcttcgtg 1320 agcacaaata acactggcgg agtccagttc aacaagaacc tggccgggag atacgccaac 1380 acctacaaaa actggttccc ggggcccatg ggccgaaccc agggctggaa cctgggctcc 1440 ggggtcaacc gcgccagtgt cagcgccttc gccacgacca ataggatgga gctcgagggc 1500 gcgagttacc aggtgccccc gcagccgaac ggcatgacca acaacctcca gggcagcaac 1560 acctatgccc tggagaacac tatgatcttc aacagccagc cggcgaaccc gggcaccacc 1620 gccacgtacc tcgagggcaa catgctcatc accagcgaga gcgagacgca gccggtgaac 1680 cgcgtggcgt acaacgtcgg cgggcagatg gccaccaaca accagagctc caccactgcc 1740 cccgcgaccg gcacgtacaa cctccaggaa atcgtgcccg gcagcgtgtg gatggagagg 1800 gacgtgtacc tccaaggacc catctgggcc aagatcccag agacgggggc gcactttcac 1860 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splice sites removed and point mutations at positions 4 and 5 <400> 68 agttttgttg atcacccacc cgattggt 28 <210> 69 <211> 2187 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial sequence based on AAV5 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> VP2 initiator context <220> <221> misc_feature <222> (10)..(12) <223> suboptimal translation initiation codon <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> additional triplet added to sequence <220> <221> mutation <222> (33)..(33) <223> remove splice site <220> <221> mutation <222> (36)..(36) <223> remove splice site <400> 69 cctgttaagc tggcttcttt tgttgatcac ccacccgatt ggttggaaga agttggtgaa 60 ggtcttcgcg agtttttggg ccttgaagcg ggcccaccga aaccaaaacc caatcagcag 120 catcaagatc aagcccgtgg tcttgtgctg cctggttata actatctcgg acccggaaac 180 ggtctcgatc gaggagagcc tgtcaacagg gcagacgagg tcgcgcgaga gcacgacatc 240 tcgtacaacg agcagcttga ggcgggagac aacccctacc tcaagtacaa ccacgcggac 300 gccgagtttc aggagaagct cgccgacgac acatccttcg ggggaaacct cggaaaggca 360 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Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly 225 230 235 gac aga gtc atc acc acc agc acc cga acc tgg gca ttg ccc acc tac 2871 Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr 240 245 250 aac aac cac ctc tac aag caa atc tcc aat gga aca tcg gga gga agc 2919 Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser 255 260 265 acc aac gac aac acc tac ttt ggc tac agc acc ccc tgg ggg tat ttt 2967 Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe 270 275 280 gac ttc aac aga ttc cac tgc cac ttc tca cca cgt gac tgg cag cga 3015 Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg 285 290 295 300 ctc atc aac aac aac tgg gga ttc cgg cca aag aga ctc aac ttc aag 3063 Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys 305 310 315 ctg ttc aac atc cag gtc aag gag gtt acg acg aac gaa ggc acc aag 3111 Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Glu Gly Thr Lys 320 325 330 acc atc gcc aat aac ctt acc agc acc gtc cag gtc ttt acg gac tcg 3159 Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser 335 340 345 gag tac cag cta ccg tac gtc cta ggc tct gcc cac caa gga tgc ctg 3207 Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu 350 355 360 cca ccg ttt cct gca gac gtc ttc atg gtt cct cag tac ggc tac ctg 3255 Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu 365 370 375 380 acg ctc aac aat gga agt caa gcg tta gga cgt tct tct ttc tac tgt 3303 Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys 385 390 395 ctg gaa tac ttc cct tct cag atg ctg aga acc ggc aac aac ttt cag 3351 Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln 400 405 410 ttc agc tac act ttc gag gac gtg cct ttc cac agc agc tac gca cac 3399 Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His 415 420 425 agc cag agt cta gat cga ctg atg aac ccc ctc atc gac cag tac cta 3447 Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu 430 435 440 tac tac ctg gtc aga aca cag aca act gga act ggg gga act caa act 3495 Tyr Tyr Leu Val Arg Thr Gln Thr Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gln Thr 445 450 455 460 ttg gca ttc agc caa gca ggc cct agc tca atg gcc aat cag gct aga 3543 Leu Ala Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ser Ser Met Ala Asn Gln Ala Arg 465 470 475 aac tgg gta ccc ggg cct tgc tac cgt cag cag cgc gtc tcc aca acc 3591 Asn Trp Val Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr 480 485 490 acc aac caa aat aac aac agc aac ttt gcg tgg acg gga gct gct aaa 3639 Thr Asn Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Ala Lys 495 500 505 ttc aag ctg aac ggg aga gac tcg cta atg aat cct ggc gtg gct atg 3687 Phe Lys Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Met Asn Pro Gly Val Ala Met 510 515 520 gca tcg cac aaa gac gac gag gac cgc ttc ttt cca tca agt ggc gtt 3735 Ala Ser His Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val 525 530 535 540 ctc ata ttt ggc aag caa gga gcc ggg aac gat gga gtc gac tac agc 3783 Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Asn Asp Gly Val Asp Tyr Ser 545 550 555 cag gtg ctg att aca gat gag gaa gaa att aaa gcc acc aac cct gta 3831 Gln Val Leu Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val 560 565 570 gcc aca gag gaa tac gga gca gtg gcc atc aac aac cag gcc gct aac 3879 Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Ala Val Ala Ile Asn Asn Gln Ala Ala Asn 575 580 585 acg cag gcg caa act gga ctt gtg cat aac cag gga gtt att cct ggt 3927 Thr Gln Ala Gln Thr Gly Leu Val His Asn Gln Gly Val Ile Pro Gly 590 595 600 atg gtc tgg cag aac cgg gac gtg tac ctg cag ggc cct att tgg gct 3975 Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala 605 610 615 620 aaa ata cct cac aca gat ggc aac ttt cac ccg tct cct ctg atg ggt 4023 Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly 625 630 635 gga ttt gga ctg aaa cac cca cct cca cag att cta att aaa aat aca 4071 Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr 640 645 650 cca gtg ccg gca gat cct cct ctt acc ttc aat caa gcc aag ctg aac 4119 Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Leu Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Asn 655 660 665 tct ttc atc acg cag tac agc acg gga caa gtc agc gtg gaa atc gag 4167 Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu 670 675 680 tgg gag ctg cag aaa gaa aac agc aag cgc tgg aat cca gag atc cag 4215 Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln 685 690 695 700 tat act tca aac tac tac aaa tct aca aat gtg gac ttt gct gtc aat 4263 Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn 705 710 715 acc gaa ggt gtt tac tct gag cct cgc ccc att ggt act cgt tac ctc 4311 Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu 720 725 730 acc cgt aat ttg taa ttgcctgtta atcaataaac cggttaattc gtttcagttg 4366 Thr Arg Asn Leu 735 aactttggtc tctgcg 4382 <210> 71 <211> 736 <212> PRT <213> adeno-associated virus 9 <400> 71 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Glu Ala Pro Ser Gly Leu Gly Pro Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn 260 265 270 Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr 405 410 415 Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Val 435 440 445 Arg Thr Gln Thr Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gln Thr Leu Ala Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Ser Ser Met Ala Asn Gln Ala Arg Asn Trp Val Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Asn Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Ala Lys Phe Lys Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Met Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Ala Gly Asn Asp Gly Val Asp Tyr Ser Gln Val Leu Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu 565 570 575 Tyr Gly Ala Val Ala Ile Asn Asn Gln Ala Ala Asn Thr Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Leu Val His Asn Gln Gly Val Ile Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Leu Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 72 <211> 2211 <212> DNA <213> adeno-associated virus AAV9 <220> <221> CDS <222> (1)..(2211) <223> coding sequence for VP1 <220> <221> misc_feature <222> (412)..(2211) <223> coding sequence for VP2 <220> <221> misc_feature <222> (607)..(2211) <223> coding sequence for VP3 <400> 72 atg gct gcc gat ggt tat ctt cca gat tgg ctc gag gac aac ctt agt 48 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 gaa gga att cgc gag tgg tgg gct ttg aaa cct gga gcc cct caa ccc 96 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 aag gca aat caa caa cat caa gac aac gct cga ggt ctt gtg ctt ccg 144 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 ggt tac aaa tac ctt gga ccc ggc aac gga ctc gac aag ggg gag ccg 192 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 gtc aac gca gca gac gcg gcg gcc ctc gag cac gac aag gcc tac gac 240 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 cag cag ctc aag gcc gga gac aac ccg tac ctc aag tac aac cac gcc 288 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 gac gcc gag ttc cag gag cgg ctc aaa gaa gat acg tct ttt ggg ggc 336 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 aac ctc ggg cga gca gtc ttc cag gcc aaa aag agg ctt ctt gaa cct 384 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 ctt ggt ctg gtt gag gaa gcg gct aag acg gct cct gga aag aag agg 432 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 cct gta gag cag tct cct cag gaa ccg gac tcc tcc gcg ggt att ggc 480 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 aaa tcg ggt gca cag ccc gct aaa aag aga ctc aat ttc ggt cag act 528 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 ggc gac aca gag tca gtc cca gac cct caa cca atc gga gaa cct ccc 576 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 gca gcc ccc tca ggt gtg gga tct ctt aca atg gct tca ggt ggt ggc 624 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 gca cca gtg gca gac aat aac gaa ggt gcc gat gga gtg ggt agt tcc 672 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 tcg gga aat tgg cat tgc gat tcc caa tgg ctg ggg gac aga gtc atc 720 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 acc acc agc acc cga acc tgg gcc ctg ccc acc tac aac aat cac ctc 768 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 tac aag caa atc tcc aac agc aca tct gga gga tct tca aat gac aac 816 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 gcc tac ttc ggc tac agc acc ccc tgg ggg tat ttt gac ttc aac aga 864 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 ttc cac tgc cac ttc tca cca cgt gac tgg cag cga ctc atc aac aac 912 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 aac tgg gga ttc cgg cct aag cga ctc aac ttc aag ctc ttc aac att 960 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 cag gtc aaa gag gtt acg gac aac aat gga gtc aag acc atc gcc aat 1008 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 aac ctt acc agc acg gtc cag gtc ttc acg gac tca gac tat cag ctc 1056 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 ccg tac gtg ctc ggg tcg gct cac gag ggc tgc ctc ccg ccg ttc cca 1104 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 gcg gac gtt ttc atg att cct cag tac ggg tat ctg acg ctt aat gat 1152 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 gga agc cag gcc gtg ggt cgt tcg tcc ttt tac tgc ctg gaa tat ttc 1200 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 ccg tcg caa atg cta aga acg ggt aac aac ttc cag ttc agc tac gag 1248 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 ttt gag aac gta cct ttc cat agc agc tac gct cac agc caa agc ctg 1296 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 gac cga cta atg aat cca ctc atc gac caa tac ttg tac tat ctc tca 1344 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 aag act att aac ggt tct gga cag aat caa caa acg cta aaa ttc agt 1392 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 gtg gcc gga ccc agc aac atg gct gtc cag gga aga aac tac ata cct 1440 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 gga ccc agc tac cga caa caa cgt gtc tca acc act gtg act caa aac 1488 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 aac aac agc gaa ttt gct tgg cct gga gct tct tct tgg gct ctc aat 1536 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 gga cgt aat agc ttg atg aat cct gga cct gct atg gcc agc cac aaa 1584 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 gaa gga gag gac cgt ttc ttt cct ttg tct gga tct tta att ttt ggc 1632 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 aaa caa gga act gga aga gac aac gtg gat gcg gac aaa gtc atg ata 1680 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 acc aac gaa gaa gaa att aaa act act aac ccg gta gca acg gag tcc 1728 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 tat gga caa gtg gcc aca aac cac cag agt gcc caa gca cag gcg cag 1776 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 acc ggc tgg gtt caa aac caa gga ata ctt ccg ggt atg gtt tgg cag 1824 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 gac aga gat gtg tac ctg caa gga ccc att tgg gcc aaa att cct cac 1872 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 acg gac ggc aac ttt cac cct tct ccg ctg atg gga ggg ttt gga atg 1920 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 aag cac ccg cct cct cag atc ctc atc aaa aac aca cct gta cct gcg 1968 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 gat cct cca acg gcc ttc aac aag gac aag ctg aac tct ttc atc acc 2016 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 cag tat tct act ggc caa gtc agc gtg gag atc gag tgg gag ctg cag 2064 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 aag gaa aac agc aag cgc tgg aac ccg gag atc cag tac act tcc aac 2112 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 tat tac aag tct aat aat gtt gaa ttt gct gtt aat act gaa ggt gta 2160 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 tat agt gaa ccc cgc ccc att ggc acc aga tac ctg act cgt aat ctg 2208 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 taa 2211 <210> 73 <211> 736 <212> PRT <213> adeno-associated virus AAV9 <400> 73 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735

Claims (16)

  1. 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자로서, 여기서 상기 리딩 프레임은 5'에서 3' 순서로
    (i) CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선 번역 개시 코돈인, 제1 코돈;
    (ii) 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기를 암호화하는 제2 코돈;
    (iii) 선택적으로, 상기 제2 코돈 다음에 부가적인 아미노산 잔기를 암호화하는 하나 이상의 코돈; 및
    (iv) 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 서열로서, 이에 따른 서열은 단지 VP1 번역 개시 코돈만이 결핍된, 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 서열
    을 포함하는, 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    AAV 캡시드 단백질은 AAV 혈청형 5, AAV 혈청형 8, 또는 AAV 혈청형 9 캡시드 단백질이며, 바람직하게 여기서 상기 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 22, 28, 30, 71 및 73으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 코돈은 알라닌을 암호화하는, 핵산 분자.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 코돈은 GCT, GCC, GCA, GCG 및 GGU로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게 여기서 상기 코돈은 GCT인, 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조체로서, 여기서 상기 아데노 연관 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 리딩 프래임의 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 발현을 위해 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 핵산 구조체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 리딩 프래임의 뉴클레오타이드 서열은 폴리헤드론 프로모터, p10 프로모터, 4xHsp27 EcRE+minimal Hsp70 프로모터, deltaE1 프로모터, E1 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로모터에 작동가능하게 연결된, 핵산 구조체.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 구조체는 곤충-호환성 벡터, 바람직하게 배큘로바이러스 벡터인, 핵산 구조체.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 51, 69, 42, 47, 48 및 50으로 구성된 그룹으로부터 선택된 오픈 리딩 프래임, 바람직하게는 SEQ ID NO:51의 오픈 리딩 프래임을 포함하는, 핵산 구조체.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조체를 포함하는 곤충 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 곤충 세포는
    (a) 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열;
    (b) 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep78 또는 Rep68 코딩 서열을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열;
    (c) 선택적으로, 곤충 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep52 또는 Rep40 코딩 서열을 포함하는 제4 뉴클레오타이드 서열
    을 더 포함하는, 곤충 세포.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 곤충 세포는
    (a) 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제1 핵산 구조체로서, 이에 따른 제1 핵산 구조체는 제10항의 (b) 및 (c)에서 정의한 바와 같은 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 제1 핵산 구조체; 및
    (b) 제10항의 (a)에서 정의한 바와 같은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산 구조체로서, 여기서 제2 핵산 구조체는 바람직하게 곤충 세포-호환성 벡터, 보다 바람직하게 배큘로바이러스 벡터인 제2 핵산 구조체
    를 포함하는, 곤충 세포.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제2 뉴클레오타이드 서열은 (포유류 세포에서 발현을 위한) 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 그리고 이에 따른 상기 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에서 생산된 AAV 혈청형 5의 게놈 내로 통합되며, 바람직하게 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열은 2개의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열들을 포함하며, 그리고 여기서 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 상기 2개의 AAV ITR 뉴클레오타이드 서열들 사이에 위치하는, 곤충 세포.
  13. 제10항에 있어서,
    제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 뉴클레오타이드 서열 및 선택적으로 제4 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는, 곤충 세포.
  14. AAV 비리온으로서, 이의 게놈 내에 관심있는 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이에 따른 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열은 네이티브 AAV 뉴클레오타이드 서열이 아니며, 그리고 여기서 AAV VP1 캡시드 단백질은 N 말단으로부터 C 말단으로
    (i) 제1 아미노산 잔기로서, 이는 번역 개시 코돈에 의해 암호화되며, 바람직하게 CTG, ACG, TTG 및 GTG로 구성된 그룹으로부터 선택된 차선의 번역 개시 코돈에 의해 암호화되는 제1 아미노산 잔기;
    (ii) 알라닌, 글리신, 발린, 아스파트산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 제2 아미노산 잔기;
    (iii) 선택적으로, 제2 아미노산 잔기 다음에 하나 이상의 부가적인 아미노산 잔기; 및
    (iv) AAV VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열로서, 이에 따른 서열은 VP1 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 아미노산 잔기만 결핍된 AAV VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열
    을 포함하는, AAV 비리온.
  15. (a) AAV가 생산되는 조건하에서 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로 (b) 상기 AAV의 회수 단계를 포함하는, 곤충 세포에서 AAV를 생산하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    관심있는 유전자 산물은 팩터 IX 또는 팩터 VIII 단백질을 암호화하는 AAV 비리온.
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