KR20090037401A - 곤충세포 내 ａａｖ의 생산에 유용한 ａａｖ-ｒｅｐ78의 번역을 위한 변형된 개시 코돈을 갖는 벡터 - Google Patents

곤충세포 내 ａａｖ의 생산에 유용한 ａａｖ-ｒｅｐ78의 번역을 위한 변형된 개시 코돈을 갖는 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 곤충 세포 내 재조합 파보바이러스(예컨데 아데노-관련 바이러스) 벡터의 핵산 컨스트럭트 내지 이러한 컨스트럭트를 포함하는 곤충 세포 및 상기 세포가 제조합 파보바이러스 비리온의 생산을 위해 사용되는 방법에 관한 것이다. 상기 곤충 세포는 바람직하게는 상기 파보바이러스 rep 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하며 파보바이러스 Rep78 단백질의 번역을 위한 개시코돈은 곤충 세포 내 발현 상 부분적 엑손 스키핑에 영향을 미치는 차선의 개시 코돈이다. 상기 곤충 세포는 적어도 하나의 피보바이러스(AAV) 반전된(inverted) 10 말단 반복(ITR) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 뉴클레오티드 서열 및 파보바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 제 3 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함한다.
곤충 세포, 파보바이러스, 비리온, rep 단백질, 개시코돈

Description

곤충세포 내 ＡＡＶ의 생산에 유용한 ＡＡＶ-ＲＥＰ78의 번역을 위한 변형된 개시 코돈을 갖는 벡터{VECTORS WITH MODIFIED INITIATION CODON FOR THE TRANSLATION OF AAV-REP78 USEFUL FOR PRODUCTION OF AAV IN INSECT CELLS}
본 발명은 곤충 세포 내에서의 아데노 관련 바이러스(AAV ; adeno-associated virus)의 생산 및 발현 및 곤충에서 아데노 관련 바이러스 백터의 생산성을 증가시키는 바이러스 rep 단백질의 안정성이 개선된 아데노신 관련 바이러스에 관한 것이다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 인간 유전자 치료를 위한 가장 전도유만한 라이러스 벡터 중 하나로 고려될 수 있다. AAV는 인간의 증식세포(dividing cell) 뿐만 아니라 비증식 세포를 효과적으로 감염(infect)시키는 능력을 가지며, 상기 AAV 바이러스 게놈은 숙주 세포의 게놈 내의 단일의 크로모좀 사이트(chromosomal site)로 통합(integrate)되고, 가장 중요하게는 AAV가 많은 인간에 존재하는 경우에도 어떠한 질병과도 관련되지 않는다. 이러한 장점의 관점에서, 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)가 형우병 B, 악성 흑색종, 낭포성 섬유증, 및 다른 질병에 대 한 유전차 치료의 임상 싫험에서 평가되었다.
실험실 내(in vitro) 복제에서 AAV를 부양하는 숙주세포는 모두 포유류 세포 유형으로부터 유래되었다. 따라서, 유전자 치료에서의 사용을 위한 rAAV는 예를 들어 293 세포, COS세포, HeLa 세포, KB 세포, 및 다른 포유류 세포주(예컨데 US 6,156,303, US 5,387,484, US 5,741,683, US 5,691,176, US 5,688,676, US 20020081721, WO 00/47757, WO 00/24916, 및 WO 96/17947 참조)와 같은 포유류 세포주에 대해 주로 생산되었다. rAAV 벡터는 전형적으로 AAV 복제의 원점(origin)(반전 말단 반복 또는 ITRs), AAV 복제 단백질에 대한 유전자 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40, 그리고 비리온 또는 구조 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 거느리며 치료 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드를 제공하여 이러한 포유류 세포 배양 시스템에서 생산된다. 추가로, 아데노바이러스로부터의 조기 유전자(early gene)(E2A, E4ORF6, VARNA)를 포함하는 플라스미드가 상기 AAV 유전자 발현의 향상 및 벡터 수율의 향상을 위해 제공된다(예컨데 Grimm 등, 1998, Hum. Gene Ther. 9:2745-2760참조). 그러나, 대부분의 이러한 포유류 세포 배양 시스템에서 세포 당 발생된 상기 AAV 입자의 수는 대략 104 입자이다(Clark, 2002, Kidney Iny. 61(Suppl. 1): 9-15에서 검토 됨). 임상 실험을 위해, rAAV 1015 입자를 초과할 것이 요구된다. 이러한 수의 rAAV 입자를 생산하기 위해서, 트랜스펙션(transfection) 및 약 1011 배양된 인간 293 세포와의 배양, 5,000 175cm2 플라스 크 세포 상당량이 요구되며, 이는 1011 293 세포까지의 트랙스펙션을 의미한다. 따라서, 임상 실험 재료를 얻기 위한 포유류 세포 배양 시스템을 이용한 rAAV의 대량생산은 문제가 있는 것으로 이미 증명되었으며, 상업적 규모에서의 생산도 실행이 어렵다. 나아가 포유류 세포 배양에서 생산된 임상용 벡터는 포유류 숙주 세포에 존재하는 바라지 않는, 어쩌면 병원성, 물질로 오염될 위험이 있다.
이러한 포유류 생산 시스템의 문제를 극복하기 위해, 최근 곤충 세포를 이용한 AAV 생산 시스템이 개발되었다(Urabe 등, 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943; US 20030148606 및 US 20040197895). 곤충 세포 내에서의 AAV 생산을 위해 세 개의 AAV 캡시드 단백질(VP1, VP2 및 VP3)의 정확학 화학양론(stoichiometry)을 획득하기 위한 몇몇 변형(modifiction)이 필요하며, 이는 두 개의 스플라이스 억셉터 사이트(splice acceptor site)의 교체 사용과 곤충 세포에 의해 정확히 복제되지 않는 VP2에 대한 ACG 시작 코돈의 차선의 사용의 조합에 의지한다. 곤충 단백질에서 캡시드 단백질의 정확한 화학양론을 모방하기 위해 Urabe 등(2002, supra)은 스플라이싱 없이 모든 세 개의 VP 단백질을 발현할 수 있는 단일의 폴리시스트론닉 메신저(polycistronic messenger)로 전사되는 구조를 사용하며, 이때 가장 상류의 시작 코돈이 차선의 시작 코돈 ACG에 의해 대체된다. 함께 펜딩 중인 출원(PCT/NL2005/050018)에서 본 발명자들은 곤충 세포 내의 AAV 캡시드 단백질의 화학량을 보다 적합화한 생산에 기하여 바큘로바이러스(baculovirus)-생산된 rAAV 벡터의 감염성(infectivity)을 더욱 개선하였다.
AAV 곤충 세포 발현 시스템 내에서의 AAV Rep 단백질의 발현을 위해 초기에 Urabe 등(2002, suora)에 의해 개발된 것와 같이, 두 개의 독립적인 Rep 발현 단위(하나는 Rep 78 용, 하나는 Rep 52 용)를 제공하는 재조합 바큘로스 구조가 각각 분리된 곤충 세포 프로모터, △IEI 및 PolH 프로모터 각각의 조절 하에서 사용되었다. 이러한 시스템에서, PolH 프로모터 보다 매우 약한 프로모터인 상기 △IEI 프로모터가 Rep78의 발현을 위해 선택되었으며, 이는 포유류 세포 내에서 Rep 52에 비해 Rep 78의 발현이 낮은 것이 높은 벡터 수율을 지지하는 것으로 알려져 있기 때문이다(Li 등, 1997, J Virol. 71: 5236-43; Grimm 등, 1998, supra).
그러나 보다 최근에 Kohlbrenner 등(2005, Mol. Ther. 12: 1217-25)은 Urabe 등에서 사용된 것과 같은 두 개의 Rep 단백질의 발현을 위한 바큘로스바이러스는 유전적인 불안정성을 갖는 것을 보고하였다. Urabe의 본래 벡터 내 팰린드롬 배향(palindromic orientation)의 분리 및 Rep 52 및 Rep 78의 발현을 위한 두 개의 분리된 바큘로스 벡터의 디자인에 의해, Kohlbrenner 등(2005, supra)는 상기 벡터의 계대배양 안정성(passaging stability)을 증가시켰다. 그러나, 곤충 세포 내 상기 독립의 바큘로바이러스-Rep 구조로부터 Rep 52 및 Rep 78의 5 계대배양을 넘는 일관된 발현에 불구하고, rAAV 벡터 수율은 Urabe 등(2002, supra)에 의해 디자인된 본래 바큘로바이러스-Rep 구조와 비교할 때 5 내지 10배 낮다.
따라서 곤충 세포 내에서 AAV 벡터의 대량(상업적인) 생산에 대한 상기의 심각한 제한을 극복하기 위한 요구가 아직 존재한다. 따라서, 본 발명의 목적 중 하나는 곤충 세포 내에서 안정하고 높은 수율(대량)의 AAV 벡터 생산이 가능하게 하 는 수단 및 방법을 제공하는 것이다
정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 작용(functional) 관계에 있어서 폴리뉴클레오티드(또는 폴리펩타이드) 구성 요소의 연결을 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 작용 관계로 배치되는 경우에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 전사 조절 서열은 이 서열이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. DNA 서열이 연결된 작동가능하게 연결된 수단은 전형적으로 인접하며, 리딩 프레임에서 두 개의 단백질 인코딩 영역과 결합하는 것이 필수적이다.
"발현 조절 단백질"은 핵산 서열이 작덩가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 나타낸다. 발현 조절 서열은 상기 발현 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 제어 및 조절하는 경우 뉴크레오티드 서열에 "작동가능하게 연결"된다. 따라서, 발현 조절 서열은 프로모터, 인헨서, IRES(internal ribosome entry sites), 전사 종결부위, 단백질-인코딩 유전자 앞의 시작 코돈, 인트론에 대한 스플라이싱 신호, 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 상기 용어 "발현 조절 서열"은 적어도 그 존재가 발현에 영향을 미치도록 디자인된 서열을 포함하며, 추가의 구성성분도 포함할 수 있는 것으로 의도된다. 예를 들어 리더(leader) 서열 및 융합 파트너(fusion partner) 서열은 발현 조절 서열이다. 상기 용어는 또한 프레임 내부 및 외부에 있는 바람직하지 않는, 잠재 시작 코돈 핵산 서열이 서열에서 제거된 디자인을 포함할 수 있다. 또한 바람직하지 않은 잠재 스플라이싱 사이트가 제거된 핵산 서열의 디자인을 포함할 수 있다. 이는 폴리 A 꼬리, 즉 폴리 A 서열이라 불리는 일련의 아데닌 잔기를 mRNA의 3'-말단에 첨가하도록 지시하는 서열 또는 폴리아데닐레이션 서열(pA)을 포함한다. 이는 또한 mRNA 안정성이 향상되도록 디자인될 수 있다. 전사 및 번역의 안정성에 영향을 미치는 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 뿐만 아니라 번역에 영향을 미치는 서열, 예를 들어 Kozak 서열이 곤충 세포 내에 알려져 있다. 발현 조절 서열은 이것이 작동가능하게 연결되어 낮은 발현 수준 혹은 높은 발현 수준을 획득하여 뉴클레오티드 서열을 조절하는 특징을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "프로모터(promoter)" 또는 "전사 조절 서열(transcription regulatory sequence)"는 하나 혹은 그 이상의 코딩 서열의 전사를 조절하기 위해 작용하며, 코딩 서열의 전사 개시 지점의 전사 방향에 대한 관점으로 상류에 위치하며, 구조적으로 DNA-의존 RNA 폴리머라제(DNA-dependent RNA polymerase) 결합 위치, 전사 개시 지점 및 전사 인자 결합 지점, 억제 및 활성 단백질 결합 지점, 및 당해 기술 분야의 숙련자에게 직접적으로 혹은 간접적으로 프로모터로부터의 전사량 조절에 작용하는 것으로 알려진 뉴클레오티드의 다른 어떠한 서열을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 어떠한 다른 DNA 서열의 존재에 의해 식별되는 핵산 분획을 나타낸다. "구성(constitutive)" 프로모터는 대부분의 생리적 및 발달적 조건 하의 조직에서 활성인 프로모터를 나타낸다. "유도성(inducible)" 프로모터는 생리적으로 혹은 발달적으로 예를 들어 화학적 유도제의 적용에 의해 조절된다. "조직 특이적(tissue specific)" 프로모터는 오직 특정한 유형의 조직 또는 세포에서 활성이다.
용어 "실질적으로 동일", "실질적 동인" 또는 "본질적으로 유사" 또는 "본질적 유사"는 두 개의 펩티드 또는 두 개의 뉴클레오티드 서열이 디폴트(default) 파라미터를 이용한 GAP 또는 BESTFIT 프로그램 등에 의해 최적으로 정렬되는 경우, 본 명세서의 다른 곳에서 정의되는 바와 같은 특정 퍼센트의 서열의 동일성을 공유한다. GAP은 두 개의 서열을 전체 길이에 대해 정렬하기 위해 Needlema 및 Wunsch 글로벌 정령 얼고리즘을 사용하며, 일치하는 수를 최대화하고 갭(gap)의 수를 최소화 한다. 일반적으로, 상기 GAP 디폴트 파라미터가 갭 유발 페널티(penalty)=50(뉴클레오티드)/8(단백질) 및 갭 연장 페널티=3(뉴클레오티드)/2(단백질)와 함께 사용된다. 뉴클레오티드에 대해 사용된 상기 디폴트 기록 매트릭스는 nwsgapdna이고 단백질에 대한 디폴트 기록 매트릭스는 Blosum 62(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919)이다. RNA 서열이 본질적으로 DNA 서열과 유사하거나 특정 정도의 동일한 서열을 갖는 경우에는 DNA 서열의 티민(T)은 RNA 서열의 우라실(U)과 동일한 것으로 인정되는 것이 명백할 것이다. 퍼센트 서열 동일성을 위한 서열의 정렬 및 기록은 Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA로 부터 입수가능한 GCG Wisconsin Package, 버젼 10.3 또는 오픈-소스 소프트웨어 Emboss for Windows(현재 버전 2.7.1-07)와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 택일적으로 퍼센트 유사성 또는 동일성은 FASTA, BLAST 등과 같은 데이타베이스에 대한 서치에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 그들이 SEQ ID NO.10의 뉴클레오티드 서열과 보통의(moderate), 혹은 바람직하게는 엄격한 잡종화 조건 하에서 각각 잡종화(hybridise)하는 능력에 의해 결정될 수 있다. 엄격한 잡종화 조건은 본 명세서에서 최소 약 25, 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드, 75 또는 100 그리고 가장 바람직하게는 약 200 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 핵산 서열이 약 65℃의 온도의 약 1M 염, 바람직하게는 6×SSC 또는 유사한 이온 강도를 갖는 다른 어떠한 용액을 포함하는 용액에서 잡종 가능하게 하며, 65℃에서 약 0.1M 염, 또는 그 미만, 바람직하게는 0.2×SSC 또는 유사한 이온 강도를 갖는 다른 어떠한 용액을 포함하는 용액 내에서 세척되는 조건으로 정의된다. 상기 잡종화는 하룻밤 동안, 즉 적어도 10 시간 동안 수행되는 것이 바람직하고 세척은 적어도 한 시간 동안 세척 용액을 최소 두 번 바꾸어 수행되는 것이 바람직하다. 이러한 조건은 통상적으로 약 90% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 잡종화를 가능하게 한다.
보통의 조건은 본 명세서에서 최소 약 25, 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 200 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 핵산 서열이 약 45℃의 온도의 약 1M 염, 바람직하게는 6×SSC 또는 유사한 이온 강도를 갖는 다른 어떠한 용액을 포함하는 용액에서 잡종 가능하게 하며, 실온에서 약 1M 염, 바람직하게는 6×SSC 또는 유사한 이온 강도를 갖는 다른 어떠한 용액을 포함하는 용액 내에서 세척되는 조건으로 정의된다. 상기 잡종화는 하룻밤 동안, 즉 적어도 10 시간 동안 수행되는 것이 바람직하고 세척은 적어도 한 시간 동안 세척 용액을 최소 두 번 바꾸어 수행되는 것이 바람직하다. 이러한 조건은 통상적으로 약 50% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 잡종화를 가능하게 한다. 당해 기술 분야의 숙련자는 50% 및 90% 동일성 사이에서 변하는 서열을 명확히 식별하기 위해 상기 잡종화 조건을 변경할 수 있을 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 동물 파보바이러스, 특히 감염성 인간 혹은 유인원 AAV와 같은 데펜도바이러스(dependovirus)의 용도, 및 포유류에 핵산의 도입 및/또는 발현을 위한 벡터로서 사용하기 위한 이의 구성 요소(예컨데 동물 파보바이러스 게놈)에 관한 것이다. 특히 본 발명은 곤충 세포에서 생산되는 경우 이러한 파보바이러스 벡터의 생산성의 개선에 관한 것이다.
파보바이러스과(Parvoviridae) 패밀리의 바이러스 는 작은 DNA 동물 바이러스이다. 상기 패밀리 파보바이러스과는 두 개의 서브패밀리로 구분될 수 있다: 척추 동물을 감염시키는 파보바이러스속(Parvovirinae), 및 곤충을 감염시키는 덴소바이러스속(Densovirinae). 상기 서브패밀리 파보바이러스과의 일원은 본 명세서에서 파보바이러스로 나타내고 덴소바이러스속(genus)을 포함한다. 이들의 속의 명칭으로부터 추론할 수 있는 바와 같이, 상기덴소바이러스의 일원은 이들이 세포 배양에서 생산성 감염을 위해 일반적으로 어데노바이러스 또는 허피스바이러스(herpes virus)와 같은 헬퍼 바이러스와의 동시감염(coinfection)을 요구하는 점에서 독특하다. 상기 속 데펜도바이러스(dependovirus)는 보통 인간(예컨데 항원형(serotype) 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 및 6) 또는 영장류(예컨데 항원형 1 및 4)를 감염시키는 AAV, 및 다른 온혈 동물(예컨데, 소, 개, 말, 및 양-관련 바이러스)을 감염시키는 관련 바이러스를 포함한다. 파보바이러스 및 파보바이러스과의 일원에 대한 추가 정보는 Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Fields Virology 내의 69 챕터(3판, 1996)에 나타나 있다. 본 병세서에서 편의를 위해 본 발명은 AAV를 참고하여 더욱 예시화되고 설명되었다. 그러나 본 발명은 AAV에 제한되는 것이 아니며 다름 파보바이러스에도 동일하게 적용될 수 있음이 이해되어야 한다.
모든 알려진 AAV 항원형의 게놈 구조는 매우 유사하다. 싱기 AAV의 게놈은 선형의, 단일-가닥의 DNA 분자이며 약 5,000 뉴클레오티드(nt) 미만의 길이이다. ITRs(Inverted terminal repeats)는 비-구조(non-structual) 복제(Rep) 단백질 및 구조(VP) 단백질을 위한 독특한 코딩 뉴클레오티드 서열의 옆(flank)에 있다. 상기 VP 단백질(VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성한다. 상기 말단 145nt는 자기-상보적( self-complementary)이고 따라서 T-형 헤어핀의 형태일 수 있는 에너지적으로 안정한 분자 내 이중 구조로 구성되어 있다. 이러한 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제를 위한 원점(origin)으로 작용하며 세포 DNA 폴리머라제 복합체에 대한 프라이머로 작용한다. 포유류 세포에서 wtAAV 감염에 따라 상기 Rep 유전자(즉 Rep 78 및 Rep 52)가 P5 프로모터 및 P19로부터 각각 발현되며 두 Rep 단백질을 모두 바이러스 게놈의 복제에서의 작용을 갖는다. Rep ORF에서의 스플라이싱 사건은 실제로 네 개의 Rep 단백질(즉, Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40) 발현의 결과를 가져온다. 그러나, 포유류 세포에서 Rep 78 및 Rep 52를 인코딩하는 스플라이스되지 않은 mRNA는 AAV 벡터 생산을 위해 충분한 것으로 나타났다. 또한 곤충 세포에서 상기 Rep 78 및 Rep 52 단백질은 AAV 벡터 생산을 위해 충분하다.
본 명세서의 "재조합 파보바이러스 또는 AAV 벡터"(또는 "rAAV 벡터")는 하나 혹은 그 이상의 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열, 관심있는 유전자 또는 파보바이러스 또는 AAV ITRs 옆에 있는 "트랜스유전자(transgene)"을 포함하는 벡터를 나타낸다. 이러한 rAAV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 곤충 숙주 세포에 존재하는 경우 복제되어 감염성 바이러스 입자로 포장될 수 있다. rAAV 벡터가 보다 큰 핵산 구조(예컨데 크로모좀 내 또는 클로님이나 트랜스펙션을 위해 사용되는 플라스키드 혹은 배큘로바이러스와 같은 다른 벡터 내)에 편입되는 경우에 상기 rAAV 벡터는 전형적으로 "전-벡터(pro-vector)"로 언급되며 이는 AAV 패키징 작용물(functions) 및 필수적인 헬퍼 작용물의 존재 하에서 복제 및 이입(encapsidation)에 의해 구제(rescue)될 수 있다.
본 발명의 일 견지는 동물 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ORF(open reading frame)를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이며, 파보바이러스 Rep 78 단백질의 번역을 위한 상기 개시 코돈은 차선의(suboptimal) 개시 코돈이다. 상기 차선의 개시 코돈은 부분적 엑손 스키핑(partial exon skipping)에 영향을 미치는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 부분적 엑손 스키핑은 리보솜의 적어도 일부가 Rep78 단백질의 차선의 개시 코돈에서 번역을 시작하지 않으나 더욱 하류(downstream)의 개시코돈에서 개시를 시작하며, 그에 따라 바람직하게는 보다 하류에 있는 개시 코돈이 Rep 52 단백질의 개시 코돈인 것을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 차선의 개시 코돈은 바람직하게는 곤충 세포 내 뉴클레오티드 서열의 발현 상에 부분적 엑손 스키핑에 영향을 미친다. 바람직하게는, 상기 차선의 개시 코돈은 곤충 세포 내에서 부분적 엑손 스키핑에 영향을 미쳐서 곤충 세포 내에서 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 또는 1:3 내지 3:1의 범위의 몰비의 Rep 78 및 Rep 52를 바람직하게는 감염 후 약 20-40 시간, 더욱 바람직하게는 감염 후 약 30-40 시간에 배큘로바이러스(baculovirus) 발현을 이용하여 생산한다. Rep 78 및 Rep 52의 몰비는 실시예 1.1.3에 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯 방법에 의해 바람직하게는 Rep 78 및 Rep 52의 공동(common) 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체를 사용하거나 또는 실시예 1.1.3에 기술된 항체를 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 상기 용어 "차선의 개시 코돈"은 트리뉴클레오티드 개시 코돈 그 자체뿐만 아니라 그 콘텍스트(context)도 나타낸다. 따라서, 차선의 개시 코돈은 예컨데 Kozak 콘텍스트와 같은 차선의 콘텍스트 내의 "최선의(optimal)" ATG 코돈으로 이루어질 수 있다. 그러나, 상기 트리-뉴클레오티드 개시 코돈 자체가 차선인 즉, ATG가 아닌 개시 코돈이 보다 바람직하다. 본 명세서에서 차선(suboptimal)은 일반적인 ATG 코돈과 비교하는 경우 상기 코돈이 번역의 개시에 있어서 다른 동일한 콘텍스트에서 보다 덜 효과적인 것을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게, 상기 차선 코돈의 효율은 다른 동일한 콘텍스트 내 일반 ATG 코돈의 효율의 90, 80, 60, 40 또는 20% 미만이다. 번역의 개시의 상대 효율의 비교를 위한 방법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알여져 있다. 바람직한 차선의 개시 코돈은 ACG, TTG, CTG, 및 GTG로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는 ACG이다.
동물 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 Rep 78 및 Rep 52 단백질과 같은 곤충 세포 내에서 피보바이러스 벡터 생산에 요구되고 충분한 상기 비-구조(non-structural) Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이해된다. 상기 동물 파보바이러스 뉴클레오티드 서열은 데펜도바이러스로부터 유래된 것이 바람직하며, 인간 또는 유인원 아데노-관련 바이러스(AAV)으로부터 유래된 것이 보다 바람직하며, 일반적으로 인간(여컨데 항원형 1,2,3A,3B,4,5, 및 6) 또는 영장류(예컨데 항원형 1 및 4)를 감염시키는 AAV로부터 유래된 것이 가장 바람직하다. 동물 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예가 SEQ ID No. 10에 제공되며, 이는 상기 Rep 단백질을 인코딩하는 AAV 항원형-2-서열 게놈의 일부를 나타낸다. 상기 Rep 78코딩 서열은 뉴클레오티드 11-1876를 포함하며 상기 Rep 52 코딩 서열은 뉴클레오티드 683-1876을 포함한다. 상기 Rep 78 및 Rep 52 단백질의 정확한 분자량뿐만 아니라 상이한 파보바이러스 사이에서 다를 수 있는 번역 개시 코돈의 정확한 위치가 이해되었다. 그러나, 당해 기술 분야의 숙련자들은 AAV-2가 아닌 다른 바이러스로부터 유래한 뉴클레오티드 서열 내에서 대응하는 위치를 어떻게 확인하는지 알 것이다. 동물 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 따라서 하기 뉴클레오티드 서열로서 정의될 수 있다:
a) SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열과 적어도 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 또는 9% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 것;
b)SEQ ID NO. 10의 위치 11-1876의 뉴클레오티드 서열과 적어도 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99% 서열 상동성을 갖는 것;
c)(a) 또는 (b)의 핵산 분자 서열에 잡종화하는(hybridise) 상보적 가닥;
d)유전자 코드의 축퇴(degeneracy)에 의해 서열이 (c)의 핵산 분자의 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열.
바람직하게, 상기 뉴클레오티드 서열은 곤충 세포 내 파보바이러스 벡터 생산을 위해 요구되고 충분한 동물 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩한다.
본 발명의 보다 바람직한 뉴클레오티드 서열은 SEQ.ID NO: 7의 9개의 뉴클레오티드 서열 또는 실질적으로 SEQ. ID NO: 7에 상동인 뉴클레오티드 서열을 상기 파보바이러스 Rep 78 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드의 개시 코돈 상류에 포함하는 발현 조절 서열을 포함한다. 상기 SEQ.ID NO:7 뉴클레오티드 서열이 대해 실질적 동일성을 갖고 파보바이러스 Rep 78 단백질의 발현을 증가시키는 것을 도와주는 서열은 예를 들어 SEQ ID NO:7의 상기 9개의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열이다.
Rep 단백질 코딩 서열로부터 다른 파보바이러스의, Rep 78 및 Rep 52 번역 개시 지점이 아닌, 가능한 오류(flase) 번역 개시 위치의 제거가 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있을 것이며, 곤충 세포 내에서 인지되는 추정(putative)의 스플라이스 위치의 제거 또한 마찬가지일 것이다. 곤충 세포 내에서 적절한 발현을 위한 야생형 파보바이러스 서열의 상기 바이러스 변형이 예컨데 Sambrook 및 Russel(2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3판), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York"에 기술된 바와 같은 잘 알려진 유전 공학 기술의 적용에 의해 획득되었다. Rep 단백질의 수율을 증가시킬 수 있는 Rep 단백질 코딩 부위의 다양한 추가 변형이 당해 기술 분야의 숙련자에 알려져 있다. 이러한 변형은 본 발명의 견지 내에 포함된다.
또 다른 견지로 본 발명은 상기에서 정의된 바와 같이 뉴클레오티드 서열 인코딩 파보바이러스 Rep 단백질을 포함하는 핵산 구조에 관한 것이다. 바람직하게, 구조 내에, 상기 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 곤충 세포 내에서의 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 이러한 발현 조절 서열은 적어도 곤충 세포 내에서 활성인 프로모터를 포함한다. 당해 기술 분야의 숙련자에게 알려진 곤충 숙주 세포 내 외부(foreign) 유전자 발현에 대한 기술이 본 발명의 실행을 위해 사용될 수 있다. 분자 공학 및 곤충 세포 내에서의 폴리펩티드의 발현에 대한 방법론이 예를 들어 Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex; Luckow. 1991. In Prokop 등, Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vector's Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; Kinh, L.A. 및 R.D. Posse, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D.R., L.K. Miller, V.A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W. H. Freeman and Richardson, C.D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; US 4,745,051; US2003148506; 및 WO03/074714에 기술되어 있다.
파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 번역을 위한 특히 적절한 프로모터는 예를 들어 폴리헤드론(polyhedron) 프로모터이다. 그러나, 곤충 세포에서 활성인 다른 프로모터가 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 p10, 035, IE-1 또는 △IE-1 프로모터 및 상기 참고문헌에 기술된 다른 프로모터이다.
바람직하게 곤충 새포 내 파보바이러스 Rep 단백질의 발현을 위한 상기 핵산 구조는 곤충 세포-호환성(compatible) 벡터이다. "곤충 세포-호환성 벡터" 또는 "벡터"는 곤충 또는 곤충 세포의 생산성(productive) 트랜스포메이션(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection)이 가능한 핵산 분자로 이해된다. 예시적인 생물학적 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자, 및 재조합 바이러스를 포함한다. 곤충 세포-호환성이라면 어떠한 벡터도 사용될 수 있다. 상기 벡터는 상기 곤충 세포 게놈으로 통합될 수 있으나 곤충 세포 내 벡터의 존재는 영구적일 필요가 없으며 일시적인 에피솜(episomal) 벡터 또한 포함된다. 상기 벡터는 예를 들어 세포의 화학적 처리, 전기천공법(electroporation), 또는 인펙션(infection)과 같은 어떠한 알려진 방법에 의해 도입될 수 있다. 바람직한 구현으로, 상기 벡터는 배큘로바이러스, 바이러스 벡터, 또는 플라스미드이다. 보다 바람직한 구현에서 상기 벡터는 배큘로바이러스이며, 즉 상기 구조는 배큘로바이러스 구조이다. 배큘로바이러스 벡터 및 이의 사용을 위한 방법은 곤충 세포의 분자 공학에 대한 상기 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 견지로 본 발명은 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 단일의 ORF(open reading frame)를 포함하는 단지 단일 형태의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 곤충 세포에 관한 것이다. 바람직하게 상기 단일의 ORF는 하나 혹은 그 이상의 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하며, 더욱 바란직하게 상기 ORF은 파보바이러스 Rep 단백질 모두를 인코딩하며, 가장 바람직하게는 상기 ORF는 전체 길이 Rep 78 단백질를 인코딩하며 바람직하게는 이로부터 적어도 Rep 52 및 Rep 78 단백질 모두가 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 상기 곤충 세포가, 예를 들어 다중 복제(multicopy) 에피솜 벡터 내에, 뉴클레오티드 서열의 단일 형태의 하나 이상의 복제를 포함할 수 있으나, 이들은 필수적으로 단일의 그리고 동일한 핵산 분자의 다중 복제이거나 또는 예를 들어 유전자 코드의 퇴화에 따라서만 서로 상이한 핵산 분자와 같이 단일의 그리고 동일한 Rep 아미노산 서열을 인코딩하는 최소 핵산 분자인 것이 본 명세서에서 이해된다. 상기 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 단일 형태의 핵산 분자만의 존재는 Rep 서열을 포함하는 다른 유형의 벡터에 존재할 수 있는 상동성 서열 사이의 재조합을 회피하며, 이는 곤충 세포 내 파보바이러스 생산 수준(의 안정성)에 영향을 미치는 불완전 Rep 발현 구조을 야기한다. 바람직하게 곤충 세포 내에서 하나 혹은 그 이상의 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 단일의 ORF를 포함하는 상기 뉴클레오티드 서열은 핵산 구조의 일부이며, 이 때 상기 뉴클레오티드 서열은 곤충 세포 내에서의 밸현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 보다 바람직한 곤충 세포는 "제 1(first)" 뉴클레오티드 서열로서 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 상술한 차선의 개시 코돈을 갖는 코딩 서열, 또는 상기 정의된 핵산 구조를 포함하거나 상기 곤충 세포는 제 1(first)" 핵산 구조로서 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 정의된 핵산 구조를 포함한다.
재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터의 복제를 가능하게 하고 배양에서 유지될 수 있는 어떠한 곤충 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용된 상기 세포주는 나비목해충(Spodoptera frugiperda), 초파리 세포주 또는 예를 들어 흰줄숲모기(aedes albopictus)와 같은모기 세포주로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직한 곤충 세포 또는 세포주는 상기 곤충 종으로부터 유래된 배큘로바이러스 감염되기 쉬운(susceptible) 세포이며 예를 들어 Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, Ha2302, Hz2E5, High Five(Invitrogen, CA, USA) 및 expresSF+®(US 6,103,526; Protein Sciences Corp., CT, USA)을 포함한다.
상술한 "제 1" 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 구조에 더하여 발명에 따른 바람직한 곤충 세포는 하기를 추가로 포함한다:
a) 적어도 하나의 파보바이러스 ITR(inverted terminal repeat) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 뉴클레오티드 서열; 및
b) 곤충 세포 내에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 파보바이러스 Cap 단백질 코딩 서열을 포함하는 제 3 뉴클레오티드 서열.
본 발명의 문맥에서 "적어도 하나의 파보바이러스 ITR 뉴클레오티드 서열"은 "A", "B", 및 "C" 영역으로도 불리는 대부분 상보적인, 대칭적으로 배열된 서열을 포함하는 팰린드롬(palindronic) 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 ITR은 복제에 있어서 "cis" 역할을 하는 지점, 즉 예를 들어 상기 팰린드롬 및 팰린드롬 내부의 특정 서열을 인식하는 Rep78(또는 Rep 68)과 같은 트랜스-작용(acting) 복제 단백질에 대한 인식 지점을 갖는 복제의 원점으로서 작용한다. ITR 서열의 대칭에 대한 일 예외는 ITR의 "D"영역이다. 이 것은 독특하다(하나의 ITR 내 상보물을 갖지 않음). 단일 가닥 DNA의 닉형성(nicking)은 A 및 B 영역 사이의 접합점(junction)에서 일어난다. 이 것은 새로운 DNA 합성이 개시되는 영역이다. 상기 D 영역은 보통 상기 팰린드롬의 한 편에 위치하고 핵산 복제 단계에 대한 방향성을 제공한다. 포유류 세포 내 파보바이러스 복제는 전형적으로 두 개의 ITR 서열을 갖는다. 그러나, 결합 지점(binding site)가 A 영역 및 D 영역의 양 가닥 상에 존재하고 D 영역이 상기 팰린드롬의 각 면에 하나씩 대칭적으로 존재하는 ITR을 설계하는 것이 가능한다. 이중-가닥 원형 DNA 주형(예컨데 플라스미드) 상에, 상기 Rep 78- 또는 Rep 68-는 핵산 복제를 돕고 양 방향에서 진행하며 단일 ITR은 원형 벡터의 파보바이러스 복제를 위해 충분하다. 따라서, 하나의 ITR 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 문맥상 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 두개 또는 다른 짝수개의 통상의 ITRs가 사용된다. 가장 바람직하게, 두개의 ITR 서열이 사용된다. 바람직한 피보바이러스 ITR는 AAV ITR이다. 안전을 위해 세포에 최초 도입 후 추가의 증식을 할 수 없는 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터를 구성하는 것이 바람직하다. 수여자 내에서 원하지 않는 벡터 증식을 제한하기 위한 이러한 안전 메카니즘은 US2003148506에 기술된 바와 같이 키메라(chimeric) ITR과 함께 rAAV를 사용하여 제공된다.
곤충 세포 내 상기 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터의 생산에 사용된 핵산 컨스트럭트(construct)의 수는 본 발명에서 제한되지 않는다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 분리된 컨스트럭트가 사용되어 본 발명의 방법에 따라 곤춘 세포 내에서 rAAV를 생산할 수 있다. 5개의 컨스트럭트가 사용되는 경우, 하나의 컨스트럭트는 AAV 1을 인코딩하며, 다른 컨스트럭트는 AAV VP2를 인코딩하며, 또 다른 컨스트럭트는 AAV VP3을 인코딩하며, 또 다른 컨스트럭트는 상술된 Rep 단백질을 인코딩하며, 마지막 컨스트럭트는 적어도 하나의 AAV ITR을 포함한다. 5개의 컨스트럭트보다 작은 수가 사용된 경우, 상기 컨스트럭트는 적어도 하나의 AAV ITR 및 상기 VP1, VP2, VP3, 및 상기 Rep 단백질 코딩 서열의 다양한 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게, 두 개의 컨스트럭트 또는 세 개의 컨스트럭트가 사용되며, 두 개의 컨스트럭트가 상술한 바와 같이 보다 바라직하다. 두 개의 컨스트럭트가 사용되는 경우, 바람직하게 상기 곤충 세포는 하기를 포함한다:(a) (적어도 하나의 곤충 세포에서의 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 파보바이러스 Cap 단백질 코딩 서열을 포함하는; 하기 참조)상기 (b)에서 정의된 바와 같은 제 3 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 상술한 Rep 단백질의 발현을 위한 제 1 핵산 컨스트럭트; 및 (c) (적어도 하나의 파보바이러스/AAV ITR 뉴클레오티드 서열을 포함하는)상기 (a)에서 정의된 바와 같은 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 핵산 컨스트럭트. 세 개의 컨스트럭트가 사용되는 경우, 분리된 컨스트럭트가 상기 캡시드 단백질의 발현 및 상기 Rep 단백질의 발현을 위해 사용되는 것은 제외하고는 바람직하게 두 개의 컨스트럭트에 대해 사용된 바와 같은 동일한 배열이 사용된다. 각 컨스트럭트 상의 서열은 서로에 관하여 어떠한 순서일 수 있다. 예를 들어, 하나의 컨스트럭트가 ITRs 및 VP 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ORF를 포함하는 경우, 상기 VP ORF은 상기 컨스트럭트 상에 위치할 수 있으며, ITR 서열 사이 DNA의 복제에서 상기 VP ORF가 복제되거나 복제되지 않는다. 다른 예로, 상기 Rep 코딩 서열 및/또는 VP 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 ORF은 컨스트럭트 상에서 어떠한 순서일 수 있다. 상기 제 2, 제3 및 추가의 핵산 컨스트럭트 또한 바람직하게는 곤충 세포-호환성 벡터이며, 바람직하게는 상기 정의된 배큘로바이러스 벡터인 것이 이해되어야 한다. 택일적으로, 본 발명의 곤충 세포 내에는 하나 또는 그 이상의 제 1 뉴클레오티드 서열, 제 2 뉴클레오티드 서열, 제 3 뉴클레오티드 서열, 및 제 4 뉴클레오티드 서열 및 임의의 추가 뉴클레오티드 서열이 안정하게 곤충의 게놈에 편입될 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련자는 뉴클레오티드 서열을 상기 곤충 게놈 내로 어떻게 안정하게 도입하는지 그리고 상기 게놈 내에서 이러한 뉴클레오티드 서열을 같는 세포를 어떻게 확인하는지 인지하고 있다. 상기 게놈으로의 편입은 예를 들어 곤충 게놈의 영역에 대해 고도로 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터의 사용에 의해 도움을 받을 수 있다. 트랜스포존과 같은 특정 서열의 사용은 게놈에 뉴클레오티드 서열을 도입하는 또 다른 방법이다.
본 발명에서, 파보바이러스 캡시드(Cap) 단배질 코딩 서열을 포함하는 상기 제 3 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 세 개의 파보바이러스 캡시드 단백질, VP1, -2 및 -3을 각각 코딩하는 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 상기 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함하는 상기 뉴클레오티드 서열은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어 각각의 캡시드 단백질 VP1, -2 및 -3에 대한 분리된(separate) 코딩 서열이 사용될 수 있으며, 이에 따라 각 코딩 서열이 곤충 세포 내 발명을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 그러나 보다 바람직하게는 상기 제 3 뉴클레오티드 서열은 모든 세 개의 상기 동물 파보바이러스(AAV) AP1, AP2, 및 VP3 캡시드 다백질을 코딩하는 단일의 ORF을 포함하며, 이 때 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 상기 개시 코돈은 Urabe 등(2002, supra)에 기술된 바와 같이 ATG가 아닌 차선의 개시코돈이다. VP1 캡시드 단백질에 대한 차선의 개시 코돈은 Rep78 단백질에 대해 상술한 바와 같다. VP1 캡시드 단백질에 대한 더욱 바람직한 차선의 개시 코돈은 ACG, TTG, CTG 및 GTG로부터 선택될 수 있으며, 이 중 CTG 및 GTG가 가장 바람직하다. 상기 캡시드 단백질의 발현에 대한 바람직한 제 3 뉴클레오티드 서열은 SEQ. ID NO:7의 9개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 조절 서열 또는 SEQ. ID NO:7에 실질적으로 상동인 뉴클레오티드 서열을, VP1 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 개시 코돈의 상류에 추가로 포함한다. SEQ. ID NO:7의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동이며 VP1의 발현 증가를 돕는 서열은 예를 들어 SEQ. ID NO:7의 9개의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%의 상동성을 갖는 서열이다. 캡시드 단백질의 발현을 위한 보다 바람직한 제 3 뉴클레오티드 서열은 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 12의 C, 뉴클레오티드 위치 21의 A, 및 뉴클레오티드 위치 24의 C(번역 개시 코돈의 제 1 뉴클레오티드인 위치 1 참조; SEQ. ID NO.1 참조) 중에서 선택된 상기 VP1 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 변형을 포함한다. 다른 항원형의 VP1의 번역을 위한 오류(flase) 가능성 개시 코돈의 제거가 당해 기술 분야의 숙련자에게 이해될 것이며, 곤충 세포에서 인식되는 추정의(putative) 스플라이스 위치의 제거도 마찬가지이다. VP 및 바이러스의 수율 증가 또는 변경된 향성(tropism) 또는 비리온의 감소된 항원성과 같은 다른 바람직한 효과를 갖는 VP 코딩 영역의 다양한 추가의 변형이 당해 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 이러한 변형은 본 발명의 기술적 사상 내에 있다. 바람직하게 파보바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 본 발명의 상기 뉴클레오티드 서열은 곤충 세포 내 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있으며, 곤충 세포 내에서 활성인 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. 이러한 조절 서열 및 곤충 숙주 세포 내 파보바이러스 캡시드 단백질의 발현을 위한 추가의 기술 및 재료(예컨데 벡터)는 Rep 단백질에 대하여 이미 기술하였다.
본 발명의 바람직한 구현에서, 본 발명의 곤충 세포 내에 존재하는 상기 제 2 뉴클레오티드 서열, 즉 적어도 하나의 파보바이러스(AAV) ITR을 포함하는 상기 서열은, 관심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 바람직하게는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 곤충 세포 내에서 생산되는 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터의 게놈에 편입된다. 바람직하게, 관심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 포유류 세포 내에서의 발현을 위한 서열이다. 바람직하게, 상기 제 2 뉴클레오티드 서열은 두 개의 파보바이러스(AAV) ITR 뉴클레오티드 서열을 포함하며 여기서 관심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 두 개의 파보바이러스(AAV) ITR 뉴클레오티드 서열 사이에 위치한다. 두 개의 일반 ITRs 사이에 위치하거나 또는 두 개의 D영역으로 설계된 ITR의 각 면에 위치하는 경우, 바람직하게, 관심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은(포유류 세포 내에서의 발현을 위한) 곤충 세포에서 생산된 상기 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터에 편입된다.
본 명세서에서 정의된 상기 제 2뉴클레오티드 서열은 따라서 포유류 세포 내에서 발현하기 위한 적어도 하나의 "관심 있는 유전자 생성물(gene product of interet)"을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 따라서 곤충 세포에서 본제된 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터에 편입된다. 본 발명에 따라 생산된 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터로 트랜스펙션된 포유류 세포 내에서 나중의 발현을 위해 어떠한 뉴클레오티드 서열이 편입될 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 shRNA(short hairpin RNA) 또는 siRNA(short interfering RNA)와 같이 RNA 간섭(interference)이 가능한 RNA 분자인 RNA1 작용제(agent)를 발현할 수 있는 단백질을 인코딩할 수 있다. "siRNA"는 짧은-길이 이중-가닥인 RNA로 포유류 세포에서 독성이 없는 작은 갑섭 RNA를 의미한다(Elbashir 등, 2001, Nature 411: 494-98; Caplen 등, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-47). 바람직한 구현으로, 상기 제 2 뉴클레오티드 서열은 두 개의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고 각각은 포유류 세포에서의 발현을 위해 관심 있는 하나의 유전자 생성물을 인코딩한다. 관심있는 생성물을 인코딩하는 상기 두 뉴클레오티드 서열 각각이 배치되며, 이는 곤충 세포 내에서 복제된 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터로 편입된다.
포유류 세포 내 발현을 위한 관심 있는 생성물은 치료적 유전자 생성물일 수 있다. 치료적 유전자 생성물은 폴리펩티드 또는 RNA 분자(siRNA), 또는 표적 세포에서 발현되는 경우 예를 들어 감염된 세포의 절제, 또는 예컨데 효소적 활성에서의 결핍 같은 유전적 결함의 보완과 같은 바라는 치료 효과를 제공하는 다른 유전자 생성물일 수 있다. 치료적 폴리펩티드 유전자 생성물의 예는 CFTR, IX 인자, LPL(Lipoprotein lipase, 바람직하게는 LPL S447X; WO 01/00220 참조), 아포리포프로테인(apolipoprotein) A1, UDG(uridine diphosphate glucuronosyltransferase), RP-GRIP(Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator Interacting Protein) 및 사이토카인 또는 IL-10와 같은 인터루킨을 포함한다.
택일적으로 또는 추가로 제 2 유전자 생성물로서, 상기 본 명세서에서 정의된 제 2 뉴클레오티드 서열은 세포 변형 및 발현을 평가하기 위한 마커(marker) 단백질로 작용하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적절한 마커 단백질은 예를 들어 상기 형광 단백질 GFP, 및 상기 선택가능한 마커 유전자 HSV 티미딘 키나아제(HAT 배지 상의 선택을 위해), Tn5 아미노글리코시드 포스포포트랜스퍼라제(aminoglycoside phosphotransferase)(G418 상의 선택을 위해), 및 DHFR(dihydrofolate reductase)(메토트렉세이트 상의 선택을 위해), CD 20, 낮은 친화성 신경(low affinity nerve) 성장 인자 유전자이다. 이러한 마커 유전자 획득을 위한 출처 및 이들의 사용을 위한 방법은 Sambrook and Russel(2001)"Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3판), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York"에 제공되어 있다. 나아가, 본 명세서에서 정의된 제 2 뉴클레오티드 서열은 필요한 경우 본 발명의 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터로 형질도입된 세포로부터 대상을 고치는 안전장치 메카니즘으로 작용할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 종종 자살 유전자라고 불리는 이러한 뉴클레오티드 서열은 프로드럭(prodrug)을 이식 유전자를 갖는 세포를 죽일 수 있는 독성 물질로 변환할 수 있는 단백질을 인코딩하며, 상기 단백질은 상기 세포에서 발현한다. 이러한 자살 유전자의 적절한 예는 예를 들어 대장균(E.coli) 시토신 디아미나제(deaminase) 유전자 또는 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스, 사이토메갈로 바이러스 및 배리셀라-조스터(Varicella-Zoster) 바이러스 유래 티미딘 키나아제 유전자 중 하나를 포함하며, 상기의 경우 겐사이클로비르(ganciclovir)가 대상(subject) 내에서 이식 유전자를 갖는 세포를 죽이기 위한 프로드럭으로 사용될 수 있다(예를 들어 Clair 등, 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31:844-849 참조).
다른 구현으로 관심 있는 유전자 생성물의 하나는 AAV 단백질일 수 있다. 특히, Rep78 또는 Rep 68과 같은 Rep 단백질 또는 이의 지능성 조각일 수 있다. Rep78 및/또는 Rep 68을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 본 발명의 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터의 게놈 상에 존재하고 상기 벡터로 형질전환된 포유류 세포 내에서 발현되는 경우, 상기 형질전환된 푸유류 세포의 게놈 내로 상기 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터의 통합을 가능하게 한다. rAAV-형질전환된 또는 감염된(infected) 포유류 세포 냐 Rep 78 및/또는 Rep 68의 발현은 벡터에 의해 세포 내로 도입된 관심 있는 어떠한 다른 유전자 생성물의 장기간 또는 영구적인 발현이 가능하게 함으로써 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터의 특정 용도에 대한 이점을 제공할 수 있다.
포유류 세포 내에서의 발현을 위한 관심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 본 발명의 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터 내 하나의 뉴클레오티드 서열은, 바람직하게는 예컨데 프로모터 같은 적어도 하나의 포유류 세포-호환성 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 이러한 많은 프로모터가 당해 기술분야에 알려져 있다(Sambrook and Russel, 2001, supra). CMV 프로모터와 같은 많은 세포-유형에서 광범위하게 발현되는 구조 프로모터가 사용될 수 있다. 그러나, 유도성(inducible), 조직-특이적, 세포-유형-특이적인 프로모터가 보다 바람직하다. 예를 들어, 간-특이적 발현을 위해 α1-항(anti)-트립신 프로모터, 갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터, 알부민 프로모터, LPS(thyroxine-binding globlin) 프로모터, HCR-ApoCII 잡종(hybrid) 프로모터, HCR-hAAT 잡종 프로모터 및 아포리포단백질(apolipoprotein) E 프로모터로부터 프로모터가 선택될 수 있다. 다른 예는 종양-선택적, 그리고 특히 신경 세포 종양-선택적 발현을 위한 프로모터(Parr 등, 1997, Nat. Med. 3: 1145-9) 또는 단핵 혈액 세포에서의 사용을 위한 IL-2프로모터(Hagenbaugh 등, 1997, J Exp Med; 185: 2101-10)를 포함한다.
AAV는 여러 포유류 세포를 감염시킬 수 있다. 예를 들어 Tratschin 등(1985, Mol. Cell Biol. 5:3251-3260) 및 Grimm 등(1999, Hum. Gene Ther. 10:2445-2450)을 참조할 수 있다. 그러나, 인간 활막 섬유모세포(synovial fibroblast)의 AAV 형질전환은 유사한 쥐 세포에서 보다 더욱 상당히 효과적이고, Jennings 등, Arthritis Res, 3:1(2001), 상기 AAV의 세포 향성(tropicity)은 항원형 간에 서로 상이하다. 예를 들어 Davidson 등(2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:3428-3432)을 참조할 수 있으며, 포유류의 CNS 세포 향성(tropism) 및 형질도입 효능과 관련하여 AAV2, AAV4 및 AAV5 사이의 차이점을 논의한다.
곤충 세포 내에서 재조합 AAV 벡터의 생산을 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 AAV 서열은 어떠한 AAV 항원형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 상기 AAV 항원형은 아미노산 및 핵산 수준에서 상당한 상동성의 게놈 서열을 가지며, 유전적 작용의 동일한 세트를 제공하고, 필수적으로 물리적 및 기능적으로 동등한 비리온을 생산하며, 실질적으로 동일한 메카니즘에 의해 복제 및 조립된다. 다양한 AAV 항원형의 게놈 서열 및 게놈 유사성의 개괄을 위해 예를 들어 GenBank Accession 번호 U89790; GenBank Accession 번호 J01901; GenBank Accession 번호 AF043303; GenBank Accession 번호 AF085716; Chlorini 등(1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava 등(1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini 등(1999, J.Vir. 73:1309-1319); Rutledge 등(1998, J. Vir. 72:309-319); 및 Wu 등(2000, J. Vir. 74:8635-47)을 참조한다. AAV 항원형 1, 2, 3, 4 및 5는 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 AAV 뉴클레오티드 서열의 바람직한 출처이다. 바람직하게 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 상기 AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2, 및/또는 AAV4로부터 유래된다. 마찬가지로, 상기 Rep(Rep 78 및 Rep 52) 코딩 서열은 AAV1, AAV2, 및/또는 AAV4로부터 유래되는 것이 바람직하다. 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 상기 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 상기 서열은 그러나 어떠한 알려진 42항원형으로부터, 더욱 바람직하게는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AA9V 또는 예를 들어 캡시드 혼합(shuffling) 기술 등에 의해 획득된 새롭게 개발된 AAV-유사 입자 및 AAV 캡시드 라이브러리로부터 채용된다.
AAV Rep 및 ITR 서열은 특히 대부분의 항원형 사이에서 보존되었다(conserved). 다양한 AAV 항원형의 상기 Rep 78단백질은 예를 들어 89%를 초과하는 상동성이고 게놈 수준에서 AAV2, AAV3A, AAV3B, 및 AAV6 사이의 총 뉴클레오티드 서열 상동성은 약 82%이다(Bantel-Schaal 등, 1999, J. Virol, 73(2):939-947). 나아가, 상기 Rep 서열 및 많은 AAV 항원형의 ITRs는 포유류 세포 내 AAV 입자의 생산에 있어서 다른 항원형으로부터 유래된 서열에 상응하는 효과적으로 상호-보완(cross-complement)(즉, 기능적으로 대체) 것으로 알려져 있다. US2003148506은 AAV Rep 및 ITR 서열 또한 효과적으로 곤충 세포 내 다른 AAV Rep 및 ITR 서열을 상호-보완하는 것으로 보고한다.
상기 AAV VP 단백질은 AAV 비리온의 향성(tropicity)결정하는 것으로 알려져 있다. 상기 VP 단백질-인코딩 서열은 Rep 단백질 및 유전자 보다 상이한 AAV 항원형 사이에서 상당히 적게 보존되어있다(conserved). 다른 항원형의 상응하는 서열을 상호-보완하는 Rep 및 ITR 서열의 능력은 하나의 항원형(예컨데 AAV3)의 캡시드 단백질 및 상기 Rep 및/또는 다른 AAV 항원형(예컨데 AAV2)의 ITR 서열을 포함하는 가짜형(pseudotype) rAAV 입자의 생산을 가능하게 한다. 이러한 rAAV 입자는 본 발명의 일부이다.
변형된 "AAV" 서열 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 곤충 세포 내 rAAV 벡터의 생산을 위해 사용될 수 있다. 이러한 변형된 서열은 예를 들어 야생형 AAV ITR, Rep, 또는 VP 서열 대신 사용될 수 있는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9 ITR, Rep, 또는 VP에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 상동성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어 약 75-99% 뉴클레오티드 서열 상동성).
많은 관점에서 다른 AAV 항원형과 유사하지만, AAV5는 알려진 다른 인간 및 유인원 항원형보다 다른 인간 및 유인원 AAV 항원형과 상이하다. 이의 관점에서, rAAV5의 생산은 곤충 세포 내 다른 항원형의 생산과 상이할 수 있다. 본 발명의 방법이 rAAV5 생산에 사용되는 경우, 하나의 구성에 이상의 경우 집합적으로, AAV5 ITR을 포함하는 뉴클레오티드 서열, AAV5 Rep 코딩 서열(즉 뉴클레오티드 서열은 AAV5 Rep78을 포함한다)을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 컨스트럭트(construct) 것이 바람직하다. 이러한 ITR 및 Rep 서열은 곤충 세포 내의 효과적인 rAAV5 또는 가짜형(pseudotyped) rAAV5 벡터의 생산을 획득하기 위해 바람직하게 변형될 수 있다. 예를 들어 Rep 서열의 시작 코돈이 변형될 수 있고, VP 스플라이스 위치가 변형되거나 제거될 수 있고, 그리고/또는 상기 VP1 개시 코돈 및 근처 뉴클레오티드가 변형되어 곤충 세포 내 rAAV5 벡터의 생산을 향상시킬 수 있다.
따라서 본 발명의 다른 구현은 곤충 세포 내 재조합 파보바이러스(rAAV) 비리온(상술한 바와 같이 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터를 포함)의 생산 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 조건 하에서 곤충 세포를 배양하여 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터를 생산하는 단계; 및 (b) 상기 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터를 회수하는 단계. 본 명세서에서 상기 방법에서 생산된 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터는 상기 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터 핵산을 포함하는 감염성 파보바이러스 또는 AAV 비리온인 것이 이해된다. 배양 내 곤충 세포에 대한 성장조건, 및 배양 내 곤충 세포 내 이종기원의(heterologous) 생산물의 생산은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 곤충 세포의 분자 공학에 대한 상기 인용된 참고문헌에 잘 나타나 있다.
바람직하게는 상기 방법은 항-AAV 항체, 바람직하게는 고정된 항체를 사용한 상기 재조합 파보바이러스(rAAV) 벡터(이를 포함하는 비리온)의 친화성 정제 (affinity purification) 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게 상기 항-AAV 항체는 모노클로날 항테이다. 특히 적절한 항체는 단쇄 카멜리드(camelid) 항체 또는 이의 분획이며, 예를 들어 낙타 또는 라마로부터 획득된다(예를 들어 Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302 참조). rAAV의 친화성 정제를 위한 바람직한 항체는 AAV 캡시드 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이며, 그에 따라 바람직하게 상기 에피토프는 하나 이상의 AAV 항원형 캡시드 단백질 상에 존재하는 에피토프이다. 예를 들어 상기 항체는 AAV2 캡시드에 대한 특이적으로 결합하나 또한 동시에 AAV1, AAV3 및 AAV5에도 특이적으로 결합한에 근거하여 수집되거나 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 견지는 상기 핵산 컨스트럭트 및 상기에서 정의된 세포를 사용하여 상술한 본 발명의 방법에 의해 생산된 rAAV 비리온 생성물에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 rAAV 비리온은 고유한 AAV 뉴클레오티드 서열이 아닌, 그 게놈 내에 관심 있는 유전자 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그리고 이 때 AAV, VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질의 화학량론 내 VP1는:(a)는 VP2 양의 최소 100, 105, 110, 120, 150, 200 또는 400%; 또는 (b)는 VP3 양의 최소 8, 10, 10.5, 11, 12, 15, 20 또는 40%; 또는 (c)는 적어도 상기 (a) 및 (b)에서 정의된 바와 같다. 바람직하게, VP1, VP2 및 VP3의 양은 VP1, VP2 및 VP3에 각각 공통되는 에피토프를 인식하는 항체를 이용하여 결정된다. VP1, VP2 및/또는 VP3의 상대량을 정량할 수 있는 당해 기술분야의 다양한 면역분석이 사용될 수 있다(예컨데 Using Antibodies, E. Harlow and D. Lane, 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York참조). 세 개의 캡시드 단백질 공통의 에피토프를 인식하는 적절한 항체는 예를 들어 쥐 항-Cap B1 항체이다(Progen, Germany로부터 입수가능). 본 발명에 따른 바람직한 rAAV 비리온은 그 게놈 내에 관심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 비리온이며, 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 본래(native)의 AAV 뉴클레오티드 서열이 아니며, 그리고 상기 AAV 비리온은 아미노산 위치 1에 류신 또는 발린을 포함하는 VP1 캡시드 단백질을 포함한다. 본 발명에 따른 더욱 바람직한 AAV 비리온은 상기에서 정의된 캡시드 단백질의 비율을 가지며 아미노산 위치 1에 류신 또는 발린을 포함하는 VP1 캡시드 단백질을 포함한다.
본 명세서 및 그 청구범위에서, 상기 "포함한다"는 동사 및 그 활용은 상기 단어를 따르는 항목을 포괄하는 것을 의미하는 비제한적인 의미로 사용되었으며, 특히 언급되지 않은 항목을 배제하는 것은 아니다. 나아가, 구성 요소와 관련하여 부정관사 "a" 또는 "an"은 문맥산 하나 및 오직 단일의 구성 요소가 존재할 것이 명백히 요구되지 않는한 상기 구성 요소 중 하나 이상이 존재할 가능성을 배제하는 것은 아니다. 상기 부정관사 "a" 또는 "an"은 따라서 통상적으로 "at least one"을 의미한다.
도 1: A) 야생형 AAV 게놈 내 Rep 발현의 구성. 상기 Rep78 및 Rep52 유전자는 P5 및 P19 프로모터로부터 각각 발현된다. Rep68 및 Rep40(이는 각각 Rep78 및 Rep52의 스플라이스된 변형체임)의 발현은 나타내지 않았다. 두 발현 단위는 ATG0갸시 지점을 포함한다.
B) 본 발명의 컨스트럭트는 단일의 프로모터의 조절 하에서 Rep ORF를 갖는 다(예를 들어 PolH(polyhedron) 프로모터). 상기 프로모터는 Rep78 및 Rep52의 발현을 작동시키며, 이는 상기 Rep78 개시 코돈 ATG가 택일적인 ACG 개시 코돈로 바뀌고 리보손에 의해 부분적으로 건너뛰었기 때문이다.
C) Urabe 등(2002, supra)에 의한 본래의 컨스트럭트는 Rep78 및 Rep52를 두 개의 상이한 프로모터(각각 △IE1 및 polH)로부터 독립적으로 작동시킨다.
도 2: 곤충 세포 상에 5회 계대배양된(passaged) 재조합 배큘로스로부터 발현된 Rep 단백질의 웨스턴 블럿 분석. Urabe 등, 2002(original REP/Bac-to-Bac)에 의해 디자인된 본래의 배큘로바이러스는 5 계대배양에 대한 Rep78/52 발현의 느린 감소의 결과를 가져온다. 배큘로스 백본 PSC(original REP/PSC) 삽입된 Urabe 등, 2002에 의해 디자인된 Rep78 및 Rep52에 대한 상기 발현 단위 또한 곤충 세포 상 계대배양에 따른 Rep78/52 발현의 감소 결과를 가져왔다. 그러나, PSC 백(REP-ACG.PSC)본에 ACG 개시 코돈을 포함하는 상기 REP 발현 단위를 갖는 상기 배큘로바이러스는 최소 5 계대배양에 대한 안정한 Rep78/52의 발현 결과를 가져왔다. 실시예 1.1.3에 기술된 바와 같은 웨스턴 블럿 분석이 수행되었다.
도 3: 그래프에 도시된 표 1의 결과
도 4: 곤충 세포 내 다양한 rAAV 컨스트럭트의 안정성 비교. 실시예 1에 기술된 바와 같이 SF+ 세포 내 rAAV 생산이 수행되었다. 모든 생산에 대해 ITR 함유 배큘로바이러스 및 캡시드 유전자 함유 배큘로바이러스가 동일하였으며, 계대배양 수가 Rep 유전자 함유 배큘로바이러스와 동일하였다. 4개의 다른 Rep 유전자 함유 배큘로바이러스가 사용되었다: 1) 상기 REP-ACG/PSC, 2) SLR: Urabe 등(2092, supra)에 의한 상기 본래의 컨스트럭트, 3) Rep 52+ Rep78(B2B): 두 개의 분리된 Bsc-to-Bac 배큘로바이러스, 하나는 상기 Rep78 유전자를 포함하고 다른 하나는 상기 Rep 52유전자를 포함한다. 4) Rep52+Rep78(PSC): 두 개의 분리된 단백질 과학 배큘로스 하나는 상기 Rep78 유전자를 포함하고 다른 하나는 상기 Rep52 유전자를 포함한다.
도 5: 상기 REP-ACG/PSC 배큘로스 컨스트럭트의 안정성은 계대배양 8까지이다. SF+ 세포 내 rAAV 생산이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
도 6: 본 발명에 따른 REP-ACG/PSC 컨스트럭트와 Urabe 등(2002 supra)로 부터의 본래 컨스트럭트의 rep 단백질 발현에 대한 계대배양 효과의 비교. 상기 배큘로바이러스 계대배양 및 웨스턴 블럿은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 실시되었다. 상기 rep 배큘로바이러스의 일반 계대배양 중, 상기 배큘로바이러스를 SF 세포에 첨가한 후 40시간에 샘플을 취하여 웨스턴 블럿을 행하였다.
실시예 1: Rep 컨스트럭트
1.1. 재료&방법
1.1.1 배큘로바이러스 플라스미드 컨스트럭트
단독의 바이시스크로닉(bicistronic) mRNA로부터 Rep 78 및 Rep 52을 발현하기 위해, 발현 벡터 pFastBacDualSLR(Urabe 등, 2002, supra) 상에 위치한 Rep78의 ATG 개시 코돈이 ACG로 변환되었다. 사용된 상류(upstream) 프라이머는 하기와 같다:
Figure 112008088030315-PCT00001
순방향 프라이머 서열
PCR 반응에 사용된 상기 3'-프라이머가 REP78 유전자 측면에 위치되었으며, XbaI 위치(TCTAGA)을 포함한다:
Figure 112008088030315-PCT00002
역방향 프라이머 서열
상술한 프라이머 세트 사이의 서열은 PCR에 의해 증폭된다(반응 부피 50 μl; lx Pfx 증폭 완충제, 0.3mM dNTP's. 1mM MgSO4, 150mM 순방향 프라이머, 150 mM 역방향 프라이머, 2x 향상(enhancer) 용액, 주형 50ng(pFastBacDualSLR), 1U 플래티늄 Pfx(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 하기의 프로토콜을 사용한다: 95℃ 1회, 5분; 95℃ 35회 15초, 55℃ 30초; 72℃, 2분; 72℃ 1회 10분; 4℃ 항상(for ever)). 상기 PCR 생성물은 PCR-blunt II-TOPO에서 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 클로닝되었다. 상기 Rep78은 pFastBacDual(Invitrogen)로 저한 위치 SpeI 및 Xbal을 이용하여 서브클로닝되었다. 돌연변이된 Rep 발현 카세트(cassette)가 최종적으로 (제한 효소 BstZ17I 및 AvrII을 이용하여) 상기 배큘로바이러스 발현 컨스트럭트(EcoRV 및 XbaI로 절단)pPSC10로 클로닝되었다(Protein Science Corporation, Meriden, CT, USA). 상기 컨스트럭트의 서열 분석은 Baseclear, Leiden, the Netherlands에 의해 검증되었다.
1.1.2 재조합 배큘로바이러스 생산
AcNPV(Autographa californica nuclear polyhydrosis virus)로부터 유래된 재조합 배큘로바이러스가 GeneXpress BaculoKIT(Protein Science Corporation)을 이용하여 생산되었다. 트랜스펙션(transfection)이 하기와 같이 수행되었다: 둥근 바닥 14ml 튜브 200μl GRACE 배지를 6μl cellfectine(Invitrogen)과 혼합하고, 에펜도르프(eppendorf) 튜브 200μl GRACE 배지를 50μl 바이러스 DNA(protein sciences) 및 2μg 이동 플라스미드(REP)와 혼합하였다. 상기 에펜도르프 튜브로부터의 내용물을 상기 튜브에 첨가하고 조심스럽게 혼합하였다. RT에서 30분의 인큐베이션 기간 후 1,300μl GRACE를 트랜스펙션 혼합물에 첨가하였다. T25 플라스트 내의 곤충 세포를 GRACE 배지로 세척하고 상기 트랜스펙션 혼합물을 상기 세포 층에 적가하였다. 28℃에서 6 시간의 인큐베이션 후 10% FBS로 보충된 SF900II을 조심스럽게 첨가하고 상기 T25 플라스크를 28℃ 스토브에 5일간 놓아둔 후 상기 재조 합 배큘로바이러스를 수확한다.
1.1.3 웨스턴블럿 분석
곤충 세포(SF+)를 배큘로바이러스-REP로 감염(infection)시킨다. 감염 후 16, 40, 및 64 시간에 세포 시료를 취하여 0.1 V 10 x TRIS 용해(lysis) 완충제(1.5M NaCl, 0.5M TRIS, 0.01M MgCl, 1% TRITON X-100, pH8.5, 필터 멸균)의 첨가에 의해 용해되고 28℃의 교반기(Innova 44, New Brunswick)에서 30분간 인큐베이션 되었다. 자유(free) DNA 및 RNA를 벤조네이즈(benzonase)로 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 분해한다. 세포 용해물을 원심분리한다(1,900xg; 15분; 4℃). NuPAGE LDS 시료 완충제(4x, Invitrogen)을 상층액(supernatant)의 시료에 첨가하고 4-12% Bis-Tris 겔(120V)상에 로딩하였다. 단백질을 PVDF 막(BioRad) 상에 30분간, 10V에서 블럿(blot)한다(Semidry blotting). 웨스턴 면역화학은 막을 Superblock-PBS 블로킹 완충제(PIERCE)로 블로킹하고 후속적으로 쥐 항-Rep(303.9, Progen, Germany; 희석 1:50) 및 토끼 항-쥐-HRP(DAKO, 희석 1:500)로 인큐베이션하여 수행된다. 상기 Rep-단백질은 lumi light 더하기 Western-blotting substrate(Roche)를 이용한 화학발광(chemoluminescent) 염색에 의해 가시화한다.
1.2 결과
새롭게 디자인된 본 발명의 Rep-컨스트럭트(REP-ACG/PSC)의 수행이 본래의 Rep 컨스트럭트와 1) PSC 배큘로바이러스 백본 및 2) Bac-to-Bac 배큘로바이러스 백본(Urabe 등, 2002)의 모두에서 비교되었다. 세 개의 모든 컨스트럭트가 연속적으로 5 계대배양까지 연속적으로 계대배양되었다. AAV1-LPL 생산 실험이 계대배양 2, 3, 4및 5 Rep-컨스트럭트를 AAV-LPL 및 계대배양 2, 3, 4 및 5 각각의 AAV-Cap 재조합 배큘로바이러스(여기서 사용된 AAV-LPL 및 AAV-Cap 재조합 배큘로바이러스가 하기 실시예 2에 기술되었다.)와의 조합으로 이용하여 수행되었다. AAV1-LPL 생산 수율은 qPCR에 의해 결정되고 표 1에 나타내었다. Urabe 등, 2002에 의해 디자인된 상기 본래의 배큘로바이러스(original REP/Bac-to-Bac)는 5 계대배양에 중 AAV 생산의 빠른 감소의 결과를 나타냈다. 배큘로바이러스 백본 PSC에 삽입된 Urabe 등, 2002에 의해 디자인된 Rep에 대한 상기 발현 단위(REP/PSC) 또한 곤충 세포 상의 계대배양에 따라 AAV 생산 감소의 결과를 가져왔다. 그러나, PSC 백본 내에 ACG 개시 코돈을 포함하는 상기 REP 발현 단위(REP-ACG/PSC)를 갖는 상기 배큘로바이러스는 최소 5 계대배양 동안 안정한 AAV 생산의 결과를 가져왔다. 따라서, 몇차례의 계대배양 동안 AAV-LPL의 복제가능한 생산 수율(예컨데 2 내지 5)은 상기 REP-ACG 컨스트럭트를 포함하는 배큘로바이러스를 이용하여 획득하였다.
계대배양 본래 REP/PSC vg/ml REP-ACG/PSC vg/ml 본래 REP/Bac-to-Bac vg/ml
2 5.38E+09 3.04E+09 3.62E+10
3 9.57E+09 4.77E+09 7.28E+09
4 1.66E+09 7.81E+09 7.59E+08
5 7.35E+08 9.90E+09 2.03E+08
표 1: 몇차례 계대배양의 상기 배큘로바이러스 컨스트럭트를 이용한 rAAV 비리온의 생산: 계대배양 2, 3, 4, 또는 5의 LPL-벡터 단위, 계대배양 2, 3, 4 또는 5의 Rep-발현 단위, 및 계대배양 2, 3, 4 또는 5의 Cap-발현 단위를 인코딩하는 세 개의 재조합 배큘로바이러스로 Sf9 세포를 감염시켰다. 3일 후 세포를 수확하고 AAV 수율(ml 당 벡터 게놈; vg/ml)을 qPCR로 결정하였다.
적정 농도(gc's/ml)
ORF Rep78 Rep52 ORF/Rep78 비 ORF/Rep78 비
본래 REP/Bac-to-Bac P2 본래 REP/Bac-to-Bac P3 본래 REP/Bac-to-Bac P4 본래 REP/Bac-to-Bac P5 REP-ACG/PSC(C4)P2 REP-ACG/PSC(C4)P3 REP-ACG/PSC(C4)P4 REP-ACG/PSC(C4)P5 REP-ACG/PSC(A3)P2 REP-ACG/PSC(A3)P3 REP-ACG/PSC(A3)P4 REP-ACG/PSC(A3)P5 본래 REP/Bac-to-Bac P2 본래 REP/Bac-to-Bac P3 본래 REP/Bac-to-Bac P4 본래 REP/Bac-to-Bac P5 1,4E+09 6,4E+08 2,1E+09 1,7E+09 3,0E+09 2,3E+09 2,5E+09 2,7E+09 2,5E+09 4,2E+09 2,7E+09 1,5E+09 1,0E+09 7,1E+08 1,3E+08 1,3E+08 2,2E+08 5,6E+07 7,1E+07 3,2E+07 2,7E+09 2,0E+09 2,2E+09 2,1E+09 2,2E+09 3,9E+09 2,4E+09 1,5E+09 1,1E+09 6,7E+08 1,1E+08 5,3E+07 2,4E+08 5,0E+07 6,5E+07 2,5E+07 2,9E+09 2,2E+09 2,3E+09 2,5E+09 2,5E+09 4,0E+09 2,5E+09 1,5E+09 1,1E+09 8,1E+08 1,3E+08 6,9E+07 6,42 11,43 29,47 35,68 1,11 1,11 1,13 1,26 1,18 1,08 1,10 1,03 0,95 1,07 1,18 2,34 5,82 12,93 32,02 69,67 1,04 1,05 1,08 1,07 1,00 1,04 1,05 0,98 0,87 0,88 1,03 1,82
표 2: 곤충 세포 상의 계대배양에 따른 다양한 Bac-Rep 컨스트럭트 상의 Q-PCR 수행
표 2는 재조합 배큘로바이러스 내 Rep-발현 단위 및 플랭킹(flanking) 배큘로바이러스 ORF를 위해 디자인된 정량 PCR(Q-PCR) 분석의 결과를 나타낸다(ml 당 유전자카피; gc's/ml). 상기 Q-PCR 값 사이의 비율이 Rep-배큘로마이러스 내 결실의 존재를 결정한다. 1의 비율은 이론적으로 상기 배치(batch) 내 모든 배큘로바이러스가 재조합 Rep78 또는 52-서열을 포함하는 것을 의미한다. Urabe 등, 2002에 의해 디자인 된 상기 본래 배큘로바이러스(original REP/Bac-to-Bac)는 5 계대배양에서의 상당한 양의 재조합 배큘로바이러스가 Rep서열에 결실을 갖는 것을 나타낸다. 배큘로바이러스 백본 에 삽입된 PSC Urabe 등, 2002에 의해 디자인 된 Rep78 및 52에 대한 상기 발현 단위(original REP/PSC)는 매우 이른 그리고 극적인 재조 합 배큘로바이러스의 손실을 나타낸다. 그러나, ACG 개시 코돈을 PSC 백본에 함유하는 REP 발현 단위를 갖는 상기 배큘로바이러스(REP-ACG/PSC)(클론 C3 및 A3)는 5 계대배양 동안 안정한 재조합 배큘로바이러스를 나타낸다.
실시예 2: Cap 컨스트럭트
2.1.1 배큘로바이러스 플라스미드 구성
단독의 바이시스크로닉(bicistronic) mRNA로부터 VP1, 2, 3을 발현하기 위해, 배큘로바이러스-AAV-Cap 컨스트럭트가 상술한 바와 같이 디자인 되었다(Urabe 증, 2002, supra). 요약하면, VP1의 ATG 개시 코돈을 ACG로 돌연변이시킨다. 11위치의 잠재(potential) ATG 개시 코돈이 ACG로 변환되었다. VP1 개시 코돈 하류의 스플라이스 수용 위치를 소실시켰다(21 및 24 위치에서의 돌연변이). 상기 돌연변이된 Cap 발현 카세트(cassette)를 배큘로바이러스 발현 컨스트럭트로 클로닝하였다; BamH1/StyI 제한 위치를 갖는 pFastBacDual(pFBDAAV1VPm11). 상기 플라스미드(pFBDAAV1VPm11)는 VP1에 대한 택일적인 개시 코돈의 도입을 위한 출발 물질이다. 상술한 돌연변이를 도입하기 위해 Urabe 등(2002, supra)에 의해 사용된 상기 순방향 프리이머는 하기와 같다:
Figure 112008088030315-PCT00003
하기 순방향 프라이머가 pFBDAAV1VPm11(Urabe 등, 2002, supra)을 이용하여 출발물질로서 발현 컨스트럭트 제작을 위해 사용되었다:
Figure 112008088030315-PCT00004
상기 순방향 프라이머와 함께 PCR 반응에서 사용된 역방향 프라이머가VP1 개시코돈의 ~230bp 하류 위치로 유도되었고 독특한 Stu I 위치(AGGCCT)를 포함한다.
Figure 112008088030315-PCT00005
단편이 상술한 순방향 및 역방향 프라이머 쌍의 세트와 함께 PCR에 의해 증폭되었다. BamHI 및 StuI를 이용한 PCR 생성물의 분해(digestion)에 후속적으로 상기 PCR 생성물을 pFBDAAV1vpm11의 BamHI/StuI 위치로 서브클로닝하여 다양한 시험될 배큘로바이러스-AAV0Cap 컨스트럭트의 결과를 가져온다. DNA 컨스트럭트는 Baseclear, Leiden, the Netherlands에서 서열 분석에 의해 확인되었다.
2.1.2. 재조합 배큘로바이러스 생산
AcNPV(Autographa california nuclear polyhydrosis virus)로 부터 유래한 재조합 배큘로바이러스가 Bac-to-Bac 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 생산되었다(Invitrogen). rBac-Cap 을 0.1dml moi에서 ml 당 2x106 Sf9 세포 감염에 의해 증폭하였다. 감염 3일 후 상기 세포를 스핀다운(spin down)하고 바이러스를 함우하는 상층액을 회수하였다.
2.1.3 재조합 AAV 생산
Urabe 등, 2002에 따른 세 개의 재조합 배큘로바이러스를 사용하여 rAAV 배치(batch)를 생산하였다. 그러나, 이러한 연구를 위해 하나의 배큘로바이러스가 LPLS447X-트랜스유전자(transgene)를 위한 발현 컨스트럭트를 갖도록 하였다. 상기 트랜스유전자로부터 밸현되는 치료학적으로 활성제는 자연적으로 발생하는 인간 리포단백리파제(lipoprotein lipase:LPL), 448 아미노산의 단쇄 폴리펩티드의 변형체이다. 상기 LPLS447X 변형체는 단백질의 C-말단에 두 개의 아미노산 결실을 갖는다. 제 2 배큘로바이러스는 AAV 복제 유전자, Rep78 및 Rep 52를 위한 발현 컨스트럭트를 갖는다. 제 3 배큘로바이러스는 VP1을 위한 개시코돈 ACG 또는 TTG, CTG, GTG와 함께 AAV1 캡시드 서열을 갖는다.
플라스미드-트랜스펙션 시스템으로 생산된 포유류-rAAV 배치(batch)가 Grimm 등, 1998에 따라 제조되었다(Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 1998 Dec 10;9(18):2745-60).
2.1.3 웨스턴 블럿 분석
곤충 세포를 배큘로바이러스-Cap로 감염시킨다. 감염 3일 후 세포를 원심분리하였다(3,000g; 15분). 0.22um Millex 필터로 상층액을 여과하였다. NuPAGE LDS 시료 완충제(Invitrogen)를 상기 상층액의 시료에 추가하고 4-12% Bis-Tris 겔 상에 로딩하였다. 상기 겔을 100V에서 실행하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막(BioRad) 상에 1시간 동안, 100V, 350mA로 블로팅하였다. 상기 막을 1% 마블(marvel), 건조 스팀 밀크로 블로킹하고 후속적으로 쥐 항-Cap(Progen, Germany로 부터의 B1; 희석 1:50) 및 토끼 항-쥐-HRP(DAKO, 희석 1:100)와 함께 인큐베이션하여 웨스턴 면역화학이 수행되었다. VP1, 2 및 3은 lumi light 더하기 Western-blotting substrate(Roche)를 이용한 화학발광(chemoluminescent) 염색에 의해 가시화한다.
2.1.4 생화학적 측정
상술한 바와 같이 방사성 트리올레오일글리세롤 에멀션 기질(Nilsson-Ehle and Scholtz, 1976)을 이용하여 인간 LPLS447X 활성이 분석되었다. 인간 LPLS447X 면역활성 질량을 닭 IgY 및 쥐 5D2 항-hLPL 항체와 함께 샌드위치 ELISA를 이용하여 분 석하였다(Liu 등. 2000). 제조 프로토콜에 따라 상업적 키트를 이용하여 플라스마 트리글리세라이드 수준을 측정하였다(Boehringer Mannheim, #450032).
2.2 결과
2.2.1 재조합 배큘로바이러스의 구성
Urabe 등(2002, supra)에 의해 디자인된 배큘로바이러스 플라스미드 내에서 VP1 발현을 위한 상이한 택일적 개시 코돈을 도입하기 위해 BamHI 제한 위치 및 TTG, ATT, GTG 또는 CTG 코돈을 VP1의 개시코돈 ACG 대신 포함하는 일련의 상류 프라이머가 디자인되었다. 이러한 프라이머를 StuI 위치를 포함하는 하류 프라이머와 조합으로 사용한 PCR은 증폭된 단편의 결과를 가져오며 이는 pFBDVPm11(Bac-Cap)의 BamHI/StuI 위치로 서브클로닝한다. 상기 결과 배큘로바이러스 플라스미드가 상기Bac-to-Bac 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 배큘로바이러스의 제조를 위해 사용되었다. AAV 캡시드를 생산하기 위해 상기 제조된 재조합 배큘로바이러스를 곤충 세포 생상에 감염시킨다. 감염 후 3일에 상이한 배큘로스 배치의 바이러스 단백질 발현이 웨스컨블럿 상에서 결정되었다. VP1 발현을 위해 TTG 개시 코돈을 포함하는 배큘로바이러스 컨스트럭트는 이전에 사용된 ACG 개시 코돈과 비교할 때 상기 담백질을 높은 수준으로 발현하는 것이 웨스턴블럿으로부터 것이 명백해졌다. TTG 코동을 사용한 VP1 및 VP2 사이의 비율은 1:1로 나타났으며, 이는 야생형 AAV에 대해 보고된 바와 유사하다(나타내지 않음).
2.2.2 배양 내 세포 상의 rAAV 배치 감염
TTG 개시 코돈을 갖는 재조합 배큘로바이러스로부터 유래한 AAV 캡시드의 감염성을 조사하기 위해 rAAV가 유도되었다. 또한 rAAV 배치가 플라스키드 포유류 HEK293 세포 상의 트랜스펙션에 의해 유도되었다. 도 rAAV 배치의 벡터 게놈 적정농도(titer)가 qPCR에 의해 결정되었다. 상기 적정농도는 마이크로티터 플레이트 내 증가하는 moi에서 HEK 293 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 감염 후 2일에 트랜스유전자 생성물(LPLS447X)을 위한 정량적 분석(LPLS447X-질량 분석)이 감염된 세포의 배지 상에서 수행되었다. 상기 분석은 배큘로바이러스-생산된 rAAV에 의해 생산된 LPLS447X의 양이 플라스미드-생산된 rAAV에 의해 생산된 LPL(나타내지 않음)과 유사한 것을 나타내었다.
2.2.3 쥐에 rAAV 배치의 주입
상기 배큘로바이러스-생산 시스템 및 통상의 포유류 플라스미드-생산 시스템과 함께 생산된 상기 rAAV 배치를 마우스의 근육내로 주입하여 LPLS447X-단백질 활성 및 트리글리세라이드 단식을 생체내에서(in vivo) 수행하였다. 주입 후 3일, 7일 및 2주에 형액 시료를 취하여 평가하였다. 포유류-rAAV가 주입된 두 마우스 및 배큘로-rAAV가 주입된 하나의 마우스로부터 시료화된 바이러스 투여 3 및 5일 사이의 혈액-플라즈마가 우유빛에서 투명하게 변하였다. 하나의 배큘로-rAAV-주입된 마우스로부터 유래된 혈액 플라즈마는 상대적으로 우유빛으로 잔존하나 지방의 수준은 명백하게 감소하였다. 트리글리세라이드 수준은 모든 처리된 쥐에서 각각 낮아졌다(나타내지 않음). 14일에 두 포유류-AAV 및 배큘로바이러스-(TTG)-AAV 처리된 마우스dml TG 수준은 96%감소되었다. 바이러스 투여 2주 후에 취한 플라즈마 시료는 배큘로바이러스-AAV 및 포유류-AAV로 처리된 마우스의 LPLS447X-활성이 유사함을 나타내었다(나타내지 않음).
실시예 3: 곤충 세포 내 변형된 Rep78 개시 코돈을 갖는 rAAV 컨스트럭트의 안정성
3.1 곤충 세포 내 다양한 rAAV 컨스트럭트의 안정성의 비교
SF+ 세포 내에서의 rAAV 생산이 실시예 1에 상술한 바와 같이 수행되었다. 모든 생산에 대해 상기 ITR 함유 배큘로바이러스 및 캡시드 유전자 함유 배큘로바이러스가 동일하였고, 계대배양 수가 Rep 유전자 함유 배큘로바이러스와 동일하였다. 4 개의 상이한 Rep 유전자 함유 배큘로바이러스가 사용되었다: 1) REP-ACG/PSC, 2) SLR: Urabe 등(2002, supra)에 의한 본래 컨스트럭트, 3) Rep52+Rep78(B2B): 하나는 Rep78유전자를 함유하고 다른 하나는 Rep52을 함유하는 두 개의 분리된 Bac-to-Bac 배큘로바이러스, 4)Rep52+Rep78(PSC): 하나는 Rep78 유전자를 함유하고 다른 하나는 Rep 52 유전자를 함유하는 두 개의 분리된 단백질 과학 배큘로바이러스.
결과를 도 4에 나타내었다. 5번째 배큘로바이러스 계대배양 rAAV 생산은 본 래 Rep 구성 및 파괴된(spilt) Rep 컨스트럭트와 비교할 때 이미 본 발명에 따라 REP-ACG/PSC를 이용하여 인자(factor) 10이상 향상되었다.
3.2 계대배양 8까지의 배큘로바이러스 컨스트럭트의 안정성
rSF+ 세포 내 AAV 생산이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다. 모든 생산에 대해 ITR 함유 배큘로바이러스 및 캡시드 유전자 함유 배큘로바이러스가 동일하였으며, 계대배양 수는 REP-ACG/PSC 배큘로바이러스와 동일하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 상기 REP-ACG.PSC 배큘로바이러스는 적저오 8 계대배양따지 안정하다. REP-ACG/PSC의 rAAV 생산 농도적정(titer)은 상기 캐뷸로바이러스의 적어도 계대배양 8까지 안정하였다.
3.3 rep 단백질 발현에 대한 계대배양 효과
Urabe 등(2002, supra)로부터의 본래 컨스트럭트를 위한 Rep 단백질의 발현에 대한 Rep 계대배양 수의 효과를 본 발명에 따른 REP-ACG/PSC 컨스트럭트와 비교하였다. 배큘로바이러스 계대배양 및 웨스턴 블럿이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다. rep 배큘로바이러스의 일반적인 계대배양 중, 배큘로바이러스를 SF에 첨가한 후 40시간에 시료를 취하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 도 6은 본래의 Urabe 컨스트럭트(SLR)에 대해 이른 계대매양과 비교할 때 높은 계대배양에서 Rep 발현이 감소된 반면, REP-ACG/PSC 컨스트럭트 내 Rep 발현은 낮은 계대배양과 비교할 때 보다 높은 볘대배양에서도 동일하게 유지되는 것을 명백하게 나타낸다.
<110> Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. <120> Vectors with modified initiation codon for the translation of AAV-Rep78 useful for production of AAV in insect cells <150> EP06115804.4 <151> 2006-06-21 <150> US60/815,262 <151> 2006-06-21 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgcggatcct gttaagacgg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgcggatcct gttaagttgg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgcggatcct gttaagattg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgcggatcct gttaaggtgg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgcggatcct gttaagctgg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtcgtaggcc ttgtcgtgct cgagggccgc 30 <210> 7 <211> 9 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 7 cctgttaag 9 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgcggatcct gttaagacgg cggggtttta cgagattgtg attaaggtc 49 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aggctctaga ttcgaaagcg gcccg 25 <210> 10 <211> 1876 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <220> <221> CDS <222> (11)..(1873) <223> Rep 78 <220> <221> misc_feature <222> (683)..(1876) <223> coding sequence Rep 52 <400> 10 cgcagccgcc atg ccg ggg ttt tac gag att gtg att aag gtc ccc agc gac 52 Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp 1 5 10 ctt gac gag cat ctg ccc ggc att tct gac agc ttt gtg aac tgg gtg 100 Leu Asp Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val 15 20 25 30 gcc gag aag gaa tgg gag ttg ccg cca gat tct gac atg gat ctg aat 148 Ala Glu Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn 35 40 45 ctg att gag cag gca ccc ctg acc gtg gcc gag aag ctg cag cgc gac 196 Leu Ile Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp 50 55 60 ttt ctg acg gaa tgg cgc cgt gtg agt aag gcc ccg gag gcc ctt ttc 244 Phe Leu Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe 65 70 75 ttt gtg caa ttt gag aag gga gag agc tac ttc cac atg cac gtg ctc 292 Phe Val Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu 80 85 90 gtg gaa acc acc ggg gtg aaa tcc atg gtt ttg gga cgt ttc ctg agt 340 Val Glu Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser 95 100 105 110 cag att cgc gaa aaa ctg att cag aga att tac cgc ggg atc gag ccg 388 Gln Ile Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro 115 120 125 act ttg cca aac tgg ttc gcg gtc aca aag acc aga aat ggc gcc gga 436 Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly 130 135 140 ggc ggg aac aag gtg gtg gat gag tgc tac atc ccc aat tac ttg ctc 484 Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu 145 150 155 ccc aaa acc cag cct gag ctc cag tgg gcg tgg act aat atg gaa cag 532 Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln 160 165 170 tat tta agc gcc tgt ttg aat ctc acg gag cgt aaa cgg ttg gtg gcg 580 Tyr Leu Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala 175 180 185 190 cag cat ctg acg cac gtg tcg cag acg cag gag cag aac aaa gag aat 628 Gln His Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn 195 200 205 cag aat ccc aat tct gat gcg ccg gtg atc aga tca aaa act tca gcc 676 Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala 210 215 220 agg tac atg gag ctg gtc ggg tgg ctc gtg gac aag ggg att acc tcg 724 Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser 225 230 235 gag aag cag tgg atc cag gag gac cag gcc tca tac atc tcc ttc aat 772 Glu Lys Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn 240 245 250 gcg gcc tcc aac tcg cgg tcc caa atc aag gct gcc ttg gac aat gcg 820 Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala 255 260 265 270 gga aag att atg agc ctg act aaa acc gcc ccc gac tac ctg gtg ggc 868 Gly Lys Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly 275 280 285 cag cag ccc gtg gag gac att tcc agc aat cgg att tat aaa att ttg 916 Gln Gln Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu 290 295 300 gaa cta aac ggg tac gat ccc caa tat gcg gct tcc gtc ttt ctg gga 964 Glu Leu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly 305 310 315 tgg gcc acg aaa aag ttc ggc aag agg aac acc atc tgg ctg ttt ggg 1012 Trp Ala Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly 320 325 330 cct gca act acc ggg aag acc aac atc gcg gag gcc ata gcc cac act 1060 Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr 335 340 345 350 gtg ccc ttc tac ggg tgc gta aac tgg acc aat gag aac ttt ccc ttc 1108 Val Pro Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe 355 360 365 aac gac tgt gtc gac aag atg gtg atc tgg tgg gag gag ggg aag atg 1156 Asn Asp Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met 370 375 380 acc gcc aag gtc gtg gag tcg gcc aaa gcc att ctc gga gga agc aag 1204 Thr Ala Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys 385 390 395 gtg cgc gtg gac cag aaa tgc aag tcc tcg gcc cag ata gac ccg act 1252 Val Arg Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr 400 405 410 ccc gtg atc gtc acc tcc aac acc aac atg tgc gcc gtg att gac ggg 1300 Pro Val Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly 415 420 425 430 aac tca acg acc ttc gaa cac cag cag ccg ttg caa gac cgg atg ttc 1348 Asn Ser Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe 435 440 445 aaa ttt gaa ctc acc cgc cgt ctg gat cat gac ttt ggg aag gtc acc 1396 Lys Phe Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr 450 455 460 aag cag gaa gtc aaa gac ttt ttc cgg tgg gca aag gat cac gtg gtt 1444 Lys Gln Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val 465 470 475 gag gtg gag cat gaa ttc tac gtc aaa aag ggt gga gcc aag aaa aga 1492 Glu Val Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg 480 485 490 ccc gcc ccc agt gac gca gat ata agt gag ccc aaa cgg gtg cgc gag 1540 Pro Ala Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu 495 500 505 510 tca gtt gcg cag cca tcg acg tca gac gcg gaa gct tcg atc aac tac 1588 Ser Val Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr 515 520 525 gca gac agg tac caa aac aaa tgt tct cgt cac gtg ggc atg aat ctg 1636 Ala Asp Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu 530 535 540 atg ctg ttt ccc tgc aga caa tgc gag aga atg aat cag aat tca aat 1684 Met Leu Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn 545 550 555 atc tgc ttc act cac gga cag aaa gac tgt tta gag tgc ttt ccc gtg 1732 Ile Cys Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val 560 565 570 tca gaa tct caa ccc gtt tct gtc gtc aaa aag gcg tat cag aaa ctg 1780 Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu 575 580 585 590 tgc tac att cat cat atc atg gga aag gtg cca gac gct tgc act gcc 1828 Cys Tyr Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala 595 600 605 tgc gat ctg gtc aat gtg gat ttg gat gac tgc atc ttt gaa caa 1873 Cys Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln 610 615 620 taa 1876 <210> 11 <211> 621 <212> PRT <213> adeno-associated virus 2 <400> 11 Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp 1 5 10 15 Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu 20 25 30 Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile 35 40 45 Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu 50 55 60 Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val 65 70 75 80 Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu 85 90 95 Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile 100 105 110 Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu 115 120 125 Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys 145 150 155 160 Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu 165 170 175 Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His 180 185 190 Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn 195 200 205 Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr 210 215 220 Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys 225 230 235 240 Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala 245 250 255 Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys 260 265 270 Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln 275 280 285 Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu 290 295 300 Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala 305 310 315 320 Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala 325 330 335 Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro 340 345 350 Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp 355 360 365 Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala 370 375 380 Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg 385 390 395 400 Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val 405 410 415 Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser 420 425 430 Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe 435 440 445 Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln 450 455 460 Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val 465 470 475 480 Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala 485 490 495 Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val 500 505 510 Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp 515 520 525 Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu 530 535 540 Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys 545 550 555 560 Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu 565 570 575 Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr 580 585 590 Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp 595 600 605 Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln 610 615 620

Claims (25)

  1. 파보바이러스 Rep78 단백질의 번역을 위한 개시 코돈이 부분적 엑손 스키핑(partial exon skipping)에 영향을 미치며, 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ORF(open reading frame)을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 개시 코돈은 ACG, TTG, CTG, 및 GTG로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  3. 제 1항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ. ID NO:7의 9 개의 뉴클레오티드 서열 또는 실질적으로 SEQ. ID NO:7에 동일한 뉴클레오티드 서열을 AAV Rep78 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 개시코돈의 상류(upstream)에 포함하는 발현 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파보바이러스 Rep 단백질은 아데노-관련 바이러스(AAV) Rep 단백질인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  5. 곤충 세포 내 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된(operably linked) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 컨스트럭트(construct).
  6. 제 5항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 폴리헤드론(polyhedron) 프로모터에 작동가능하게 열결된 것을 특징으로 하는 핵산 컨스트럭트.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 곤충 세포-혼화성(compatible) 벡터이며, 바라직하게는 배큘로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 핵산 컨스트럭트.
  8. 하나 이상의 피보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 하나의 ORF(open reading frame)를 포함하는 단일 유형의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 곤충 세포.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 하나의 ORF는 전체-길이의 Rep 78 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 하나 이상의 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 하나의 ORF 를 포함하는 상기 뉴클레오티드 서열은 핵산 컨스트럭트의 일부이며, 상기 뉴클레오티드 서열은 곤충 세포 내 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  11. 제 8한 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충 세포는 제1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 파보바이러스 Rep 단백질을 인코딩하는 하나의 ORF을 포함하는 제 1 뉴클레오티드 서열, 또는 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같이 뉴클레오티드 서열이 곤충 세포 내 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 제 1 핵산 컨스트럭트를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 곤충 세포는
    a) 적어도 하나의 파보바이러스 ITR(inverted terminal repeat) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 곤충 세포 내 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 파보바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함하는 제 3 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 곤충 세포는
    a) 상기 제 1 핵산 컨스트럭트가 제 9항의 (b)에서 정의된 제 3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 제 1 청구항 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 제 1 핵산 컨스트럭트.
    b) 9항의 (a)에서 정의된 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 핵산 컨스트럭트
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 제 2 핵산 컨스트럭트는 곤충 세포-호환성(compatibel) 벡터이며, 바람직하게는 배큘로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  15. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 힌 항에 있어서, 상기 제 2 핵산 서열은 관심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 상기 심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 곤충 세포 내에서 생산된 파보바이러스 벡터의 게놈 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 제 2 뉴클레오티드 서열은 두 개의 파보바이러스 ITR 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 관심 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 상기 두 개의 파보바이러스 ITR 뉴클레오티드 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  17. 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 3 뉴클레오티드 서 열은 파보바이러스 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ORF를 포함하며, 상기 파보바이러스 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 ACG, TTG, CTG, 및 GTG로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 제 3 뉴클레오티드 서열은 SEQ.ID NO:7의 9 개의 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ.ID NO:7에 실질적으로 상동인 뉴클레오티드 서열을 파보바이러스 VP1 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 개시 코돈의 상류에(upstream) 포함하는 발현 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 제 3 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 위치 12의 C, 뉴클레오티드 위치 21의 A, 및 뉴클레오티드 위치 24의 C 중 선택된 파보바이러스 VP1 캡시드 단백질을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 변형(odification)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  20. 제 12항 내지 제 19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제 1 뉴클레오티드 서열, 제 2 뉴클레오티드 서열, 및 제 3 뉴클레오티드 서열은 곤충 세포의 게놈에 안정하게 통합된(intergrated) 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  21. 제 8항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파보바이러스는 AAV인 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  22. 비리온은 제 12, 15 및 16항 중 어느 한 항에서 정의된 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
    a) 제 12항 내지 제 21항 중 어느 한 항에서 정의된 곤충 세포를 재조합 파보바이러스 비리온을 생산하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 재조합 파보바이러스 비리온을 회수하는 단계
    를 포함하는, 곤충 세포 내 재조합 파보바이러스 비리온의 생산 방법
  23. 제 22항에 있어서, 항-파보바이러스 항체, 바람직하게는 고정화된 항체를 이용한 비리온의 친화성 정제 (affinity purification) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 항-파보바이러스 항체는 단쇄 카멜리드(camelid) 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 피보바이러스 비리온은 재조합 AAV 비리온인 것을 특징으로 하는 방법.
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