JP2009540823A - 昆虫細胞におけるaavの生成に有用なaav−rep78の翻訳の改変型開始コドンを有するベクター - Google Patents
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Abstract
Description
定義
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、機能的関係のポリヌクレオチド(又はポリペプチド)要素の連結を指す。それが他の核酸配列と機能的関係に置かれているとき、核酸は「作動可能に連結している」。例えば、それがコード配列の転写に影響を与える場合、転写制御配列はコード配列と作動可能に連結している。作動可能な連結は、連結したDNA配列は典型的には隣接しており、必要な場合2つのタンパク質コード領域が接合して、隣接しリーディングフレーム内に存在することを意味する。
本発明は、哺乳動物細胞中の核酸の導入及び/又は発現用のベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、具体的には感染性のヒト又はサルAAVなどのデペンドウイルス属、及びそれらの構成要素(例えば、動物パルボウイルスゲノム)の使用に関する。具体的には本発明は、昆虫細胞中での生成時のこのようなパルボウイルスベクターの生産性の改善に関する。
a)配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも50、60、70、80、88、89、90、95、97、98、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
b)配列番号10の11〜1876位のヌクレオチド配列と少なくとも50、60、70、80、81、82、85、90、95、97、98、又は99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
c)その相補鎖が(a)又は(b)の核酸分子配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
d)遺伝コードの縮重のために(c)の核酸分子の配列とその配列が異なるヌクレオチド配列
として定義することもできる。
a)少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復(ITR)ヌクレオチド配列を含む第2のヌクレオチド配列と、
b)昆虫細胞における発現用の発現制御配列と作動可能に連結しているパルボウイルスCapタンパク質コード配列を含む第3のヌクレオチド配列と
をさらに含む。
Rep構築体
1.1.材料及び方法
1.1.1 バキュロウイルスプラスミドの構築
1つの2シストロン性メッセンジャーRNAからRep78及びRep52を発現させるために、発現ベクターpFastBacDualSLR(Urabe et al.、2002、上記)上に位置するRep78のATG開始コドンをACGに転換した。使用した上流プライマーは以下の通りであった:
BamHI
5'-cgcggatcctgttaagACGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTC-3'
(配列番号8)
プライマー配列、正方向
XbaI
5'-AGGCTCTAGATTCGAAAGCGGCCCG-3'
(配列番号9)
プライマー配列、逆方向
オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)由来の組換えバキュロウイルスを、GeneXpress BaculoKIT(Protein Sciences Corporation)を使用して生成した。トランスフェクションは以下のように実施した:丸底14m1チューブ内で200μlのGRACE培地を6μlのセルフェクチン(Invitrogen)と混合し、エッペンドルフチューブ内で200μlのGRACE培地を、50μlのウイルスDNA(プロテインサイエンス)及び2μgのトランスファープラスミド(REP)と混合した。エッペンドルフチューブからの内容物をチューブに加え、注意深く混合した。室温で30分間のインキュベーション後、1,300μlのGRACEをトランスフェクション混合物に加えた。T25フラスコ中の昆虫細胞はGRACE培地で洗浄し、トランスフェクション混合物は細胞層に一滴ずつ加えた。28℃で6時間のインキュベーション後、10%のFBSを補ったSF900II血清を注意深く加え、T25フラスコは5日間28℃のストーブ内に置き、その後組換えバキュロウイルスを採取した。
バキュロウイルス−REPを用いて昆虫細胞(SF+)を感染させた。細胞感染後16、40、及び64時間でサンプルを採取し、0.1V10×TRIS溶解バッファー(1.5MのNaCl、0.5MのTRIS、0.01MのMgCl、1%のTRITON X−100、pH8.5、濾過滅菌済)を加えることによって細胞を溶かし、シェーカー(Innova 44、New Brunswick)内で28℃において30分間インキュベートした。30分間37℃でのベンゾナーゼとのインキュベーションによって、遊離DNA及びRNAを分解した。細胞溶解物は遠心分離にかけた(1,900×g;15分間;4℃)。NuPAGE LDSサンプルバッファー(4×、Invitrogen)を上清のサンプルに加え、4〜12%のBis−Trisゲル(120V)に載せた。タンパク質は、10V(半乾燥ブロッティング)で30分間PVDF膜(BioRad)にブロッティングした。ウェスタンブロットによる免疫化学測定法を、Superblock−PBSブロッキングバッファー(PIERCE)で膜をブロッキングし、マウス抗Rep(303.9、Progen、ドイツ;希釈1:50)及びウサギ抗マウスHRP(DAKO、希釈1:500)と後にインキュベートすることによって実施した。lumi−light plusウェスタンブロッティング基質(Roche)を用いた化学発光染色によって、Rep−タンパク質を視覚化した。
本発明の新たに設計したRep−構築体(REP−ACG/PSC)の成績を、1)PSCバキュロウイルス骨格と2)Bac−to−Bacバキュロウイルス骨格(Urabe et al.、2002)の両方の原型Rep構築体と比較した。全3個の構築体を第5代まで連続して継代した。AAV1−LPL生成の実験は、それぞれ第2、3、4及び5代のAAV−LPL及びAAV−Cap組換えバキュロウイルスと組合せた、第2、3、4及び5代のRep−構築体を使用して実施した(ここで使用したAAV−LPL及びAAV−Cap組換えバキュロウイルスは、実施例2中で以下に記載する)。AAV1−LPLの生成収率はqPCRによって測定し、表1中に示す。Urabe et al.、2002によって設計された原型バキュロウイルス(原型REP/Bac−to−Bac)は、5回の継代でAAV生成の急速な低下をもたらす。バキュロウイルス骨格PSC(原型REP/PSC)に挿入した、Urabe et al.、2002によって設計されたRepの発現単位も、昆虫細胞での継代後にAAV生成の低下をもたらす。しかしながら、PSC骨格中にACG開始コドンを含むRep発現単位を有するバキュロウイルス(REP−ACG/PSC)は、少なくとも5回の継代で安定したAAV生成をもたらす。したがって、数回の継代(例えば、第2代〜第5代)におけるAAV−LPLの再現性のある生成収率は、REP−ACG構築体を含むバキュロウイルスを使用してのみ得られた。
表1:数回継代したバキュロウイルス構築体を使用したrAAVビリオンの生成:Sf9細胞を、第2、3、4又は5代のLPL−ベクター単位、第2、3、4又は5代のRep−発現単位、及び第2、3、4又は5代のCap−発現単位をコードする3つの組換えバキュロウイルスで感染させた。3日後に細胞を採取し、AAV収率(1ml当たりのベクターゲノム;vg/ml)をqPCRによって測定した。
表2:昆虫細胞の継代(第2代〜第5代)後に様々なBac−Rep構築体で実施したQ−PCR。
Cap構築体
2.1.1 バキュロウイルスプラスミドの構築
1つのポリシストロン性メッセンジャーRNAからVP1、2、3を発現させるために、(Urabe et al.、2002、上記)によって記載されたのと同様にバキュロウイルス−AAV−Cap構築体を設計した。簡単に言うと、VP1のATG開始コドンをACGに突然変異させた。11位の考えられるATG開始コドンはACGに変わった。VP1開始コドンの下流のスプライス受容体部位を破壊した(21及び24位における突然変異)。突然変異Cap発現カセットは、BamH1/StuI制限部位を有するバキュロウイルス発現構築体;pfastBacDual(pFBDAAV1VPm11)にクローニングした。このプラスミド(pFBDAAV1VPm11)は、VP1用の他の開始コドンを導入するための出発物質であった。前述の突然変異を導入するためにUrabe et al.(2002、上記)によって使用された正方向プライマーは、以下の通りであった:
BamHI 1 11 21 24
5'-cgcggatcctgttaagACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
(配列番号1)
5'-cgcggatcctgttaagTTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
(配列番号2)
5'-cgcggatcctgttaagATTGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
(配列番号3)
5'-cgcggatcctgttaagGTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
(配列番号4)
5'-cgcggatcctgttaagCTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
(配列番号5)
5'-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3'
(配列番号6)
オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)由来の組換えバキュロウイルスを、Bac−to−Bacバキュロウイルス発現系(Invitrogen)を使用して生成した。0.1のmoiで1ml当たり2×106個のSf9細胞を感染させることによってrBac−Capを増幅した。感染後3日で細胞を遠心し、ウイルスを含む上清を回収した。
Urabe et al.、2002による3つの組換えバキュロウイルスを使用してrAAVバッチを生成した。しかしながら、この試験に関しては、1つのバキュロウイルスはLPLS447X−導入遺伝子の発現構築体を有していた。この導入遺伝子から発現される治療活性物質は、ヒトリポタンパク質リパーゼの天然に存在する変異体、448アミノ酸の単鎖ポリペプチドである。LPLS447Xの変異体は、タンパク質のC末端に2アミノ酸の欠失を有する。第2のバキュロウイルスはAAV複製遺伝子、Rep78及びRep52の発現構築体を有していた。第3のバキュロウイルスはAAV1カプシド配列及びVP1のACG又はTTG、CTG、GTG開始コドンのいずれかを有していた。
バキュロウイルス−Capを用いて昆虫細胞を感染させた。感染後3日で、細胞を遠心分離にかけた(3,000g;15分間)。上清は0.22umのMillexフィルターを介して濾過した。NuPAGE LDSサンプルバッファー(Invitrogen)を上清のサンプルに加え、4〜12%のBis−Trisゲル(120V)に載せた。ゲルは100Vで施した。タンパク質は1時間、100V、350mAでニトロセルロース膜(BioRad)にブロッティングした。ウェスタンブロットによる免疫化学測定法を、1%マーヴェル、乾燥スキムミルクで膜をブロッキングし、マウス抗Cap(Progen、ドイツからのB1;希釈1:50)及びウサギ抗マウス−HRP(DAKO、希釈1:100)と後にインキュベートすることによって実施した。発光及びウェスタンブロッティング基質(Roche)を用いた化学発光染色によって、VP1、2及び3を視覚化した。
放射性トリオレオイルグリセロールエマルジョン基質を使用して以前に記載されたのと同様に(Nilsson−Ehle and Scholtz、1976)、ヒトLPLS447Xの活性をアッセイした。ヒトLPLS447Xの免疫反応体を、ニワトリIgY及びマウス5D2抗hLPL抗体(Liu et at.、2000)を用いたサンドウィッチELISAを使用してアッセイした。血漿トリグリセリドレベルは、製造者のプロトコル(Boehringer Mannheim、#450032)に従い市販のキットを使用することによって測定した。
2.2.1 組換えバキュロウイルスの構築
Urabe et al.(2002、上記)により設計されたバキュロウイルスプラスミド中でのVP1の発現用の異なる他の開始コドンを導入するために、BamHI制限部位及びVP1のACG開始コドンの代わりにTTG、ATT、GTG又はCTGコドンのいずれかを含む一連の上流プライマーを設計した。StuI部位を含む下流プライマーと組合せてこれらのプライマーを使用したPCRによって、いくつかの増幅断片を生成し、これらはpFBDVPm11(Bac−Cap)のBamHI/StuI部位にサブクローニングした。生成したバキュロウイルスプラスミドは、Bac−to−Bacバキュロウイルス発現系を使用する組換えバキュロウイルスの調製に使用した。調製した組換えバキュロウイルスは昆虫細胞に感染させて、AAVカプシドを生成した。感染後3日で、異なるバキュロウイルスバッチのウイルスタンパク質の発現を、ウェスタンブロットで測定した。ウェスタンブロットから、VP1のTTG開始コドンを含むバキュロウイルス構築体は、以前に使用したACG開始コドンと比較して高いレベルで、このタンパク質を発現したことが明らかになった。TTGコドンを使用したVP1とVP2の間の比は、野生型AAVに関して報告される比と同様に1:1であったことが分かった(示さず)。
TTG開始コドンを有する組換えバキュロウイルス由来のAAVカプシドの感染性を調べるために、rAAVを作製した。さらにrAAVバッチを、哺乳動物HEK293細胞におけるプラスミドトランスフェクションによって作製した。両rAAVバッチのベクターゲノム力価をqPCRによって測定した。この力価を使用して、高いmoiでマイクロタイタープレート中のHEK293細胞を感染させた。感染後2日で、導入遺伝子産物(LPLS447X)に関する定量アッセイ(LPLS447X−質量アッセイ)を、感染細胞の培地で実施した。このアッセイは、バキュロウイルス生成rAAVによって生成したLPLS447Xの量は、プラスミド生成rAAVによって生成したLPLと同等であったことを示した(示さず)。
バキュロウイルス生成系、及び従来の哺乳動物プラスミド生成系によって生成したrAAVバッチをマウスの筋肉内に注射して、in vivoでのLPLS447X−タンパク質活性及びトリグリセリド非摂取を追跡した。注射後第3日、第7日及び第2週で、血液サンプルを採取し評価した。ウイルス投与後第3日と第7日の間に、哺乳動物rAAVを注射した両マウス及びバキュロrAAVを注射した1マウスからサンプル採取した血液−血漿は、乳濁状から完全に透明な状態に変わった。1匹のバキュロrAAV注射マウス由来の血液血漿は依然として比較的乳濁状であったが、しかしながら脂肪レベルは明らかに低下した。トリグリセリドレベルは、すべての治療マウスのそれぞれで低下した(示さず)。第14日に、両方の哺乳動物rAAV及びバキュロウイルス−(TTG)−AAV治療マウスにおけるTGレベルは、TGレベルが96%低下した。ウイルス投与後2週間で採取した血漿サンプルは、バキュロウイルス−AAVと哺乳動物−AAVで治療したマウスのLPLS447X−活性は、同等であったことを示した(示さず)。
昆虫細胞における改変型Rep78開始コドンを有するrAAV構築体の安定性
3.1 昆虫細胞における様々なrAAV構築体の安定性の比較
SF+細胞におけるrAAV生成は、実施例1中に前に記載したのと同様に実施した。すべての生成に関して、ITR含有バキュロウイルスとカプシド遺伝子含有バキュロウイルスは同一であり、継代数はRep遺伝子含有バキュロウイルスと同じであった。4つの異なるRep遺伝子含有バキュロウイルス:1)REP−ACG/PSC、2)SLR:Urabe et al.(2002、上記)による原型構築体、3)Rep52+Rep78(B2B):1つがRep78遺伝子を含みもう1つがRep52遺伝子を含む、2つの別個のBac−to−Bacバキュロウイルス、4)Rep52+Rep78(PSC):1つがRep78遺伝子を含みもう1つがRep52遺伝子を含む、2つの別個のプロテインサイエンスのバキュロウイルスを使用した。
SF+細胞におけるrAAV生成は、実施例1中に記載したのと同様に実施した。すべての生成に関して、ITR含有バキュロウイルスとカプシド遺伝子含有バキュロウイルスは同一であり、継代数はREP−ACG/PSCバキュロウイルスと同じであった。結果は図5中に示す。REP−ACG/PSCバキュロウイルスは少なくとも第8代まで安定性がある。REP−ACG/PSCのrAAV生成力価は、少なくとも第8代のバキュロウイルスまで安定している。
Urabe et al.(2002、上記)からの原型構築体Repタンパク質の発現に対する継代数の影響を、本発明によるREP−ACG/PSC構築体と比較した。バキュロウイルスの継代及びウェスタンブロットは、実施例1中に記載したように実施した。repバキュロウイルスの正常な継代の間に、SF細胞にバキュロウイルスを加えた後40時間でサンプルを採取し、ウェスタンブロットを実施した。図6は、原型Urabe構築体(SLR)の初期継代と比較した多数回継代の低下したRep発現を明らかに示すが、一方REP−ACG/PSC構築体におけるRep発現は、少数回の継代と比較して多数回の継代で同じ状態である。
Claims (25)
- パルボウイルスRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列であって、パルボウイルスRep78タンパク質の翻訳の開始コドンが、昆虫細胞における発現後に部分的なエキソンスキッピングを行う開始コドンであるヌクレオチド配列。
- 開始コドンがACG、TTG、CTG、及びGTGから選択される、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- AAVRep78タンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号7の9ヌクレオチドの配列、又は配列番号7と実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を含む、請求項1又は2に記載のヌクレオチド配列。
- パルボウイルスRepタンパク質がアデノ随伴ウイルス(AAV)Repタンパク質である、請求項1から3までのいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
- ヌクレオチド配列が昆虫細胞における発現用の発現制御配列と作動可能に連結している、請求項1から4までのいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む核酸構築体。
- ヌクレオチド配列が多角体プロモーターと作動可能に連結している、請求項5に記載の核酸構築体。
- 昆虫細胞適合性ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである、請求項5又は6に記載の核酸構築体。
- 1つ又は複数のパルボウイルスRepタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む唯一の型のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞。
- 単一のオープンリーディングフレームが完全長Rep78タンパク質をコードする、請求項8に記載の昆虫細胞。
- 1つ又は複数のパルボウイルスRepタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列が核酸構築体の一部分であり、ヌクレオチド配列が昆虫細胞における発現用の発現制御配列と作動可能に連結している、請求項8又は9に記載の昆虫細胞。
- 請求項1から4までのいずれか一項に記載の1つ又は複数のパルボウイルスRepタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む第1のヌクレオチド配列、又は請求項5から7までのいずれか一項に記載の、ヌクレオチド配列が昆虫細胞における発現用の発現制御配列と作動可能に連結している第1の核酸構築体を含む、請求項8から10までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- a)少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復(ITR)ヌクレオチド配列を含む第2のヌクレオチド配列と、
b)昆虫細胞における発現用の発現制御配列と作動可能に連結している配列をコードするパルボウイルスカプシドタンパク質を含む第3のヌクレオチド配列と
をさらに含む、請求項11に記載の昆虫細胞。 - a)請求項9の(b)に記載の第3のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項5から7までのいずれか一項に記載の第1の核酸構築体と、
b)請求項9の(a)に記載の第2のヌクレオチド配列を含む第2の核酸構築体と
を含む、請求項12に記載の昆虫細胞。 - 第2の核酸構築体が昆虫細胞適合性ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである、請求項13に記載の昆虫細胞。
- 第2のヌクレオチド配列が対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含み、前記対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列が、昆虫細胞において生成されるパルボウイルスベクターのゲノムに組み込まれる、請求項12から14までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- 第2のヌクレオチド配列が2つのパルボウイルスITRヌクレオチド配列を含み、対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列が、前記2つのパルボウイルスITRヌクレオチド配列間に位置する、請求項15に記載の昆虫細胞。
- 第3のヌクレオチド配列がパルボウイルスVP1、VP2、及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含み、パルボウイルスVP1カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンがACG、TTG、CTG、及びGTGから選択される、請求項12から16までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- 第3のヌクレオチド配列が、パルボウイルスVP1カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号7の9ヌクレオチドの配列、又は配列番号7と実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を含む、請求項17に記載の昆虫細胞。
- 第3のヌクレオチド配列が、12ヌクレオチド位におけるC、21ヌクレオチド位におけるA、及び24ヌクレオチド位におけるCから選択されるパルボウイルスVP1カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変をさらに含む、請求項17又は18に記載の昆虫細胞。
- 少なくとも1つの第1のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列、及び第3のヌクレオチド配列が昆虫細胞のゲノムに安定して組み込まれている、請求項12から19までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- パルボウイルスがAAVである、請求項8から20までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- 請求項12、15及び16のいずれか一項に記載の第2のヌクレオチド配列を含む組換えパルボウイルスビリオンを昆虫細胞において生成するための方法であって、
a)組換えパルボウイルスビリオンが生成するような条件下で請求項12から21までのいずれか一項に記載の昆虫細胞を培養するステップと、
b)組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップと
を含む方法。 - 抗パルボウイルス抗体、好ましくは固定化抗体を使用する、ビリオンの親和性精製のステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 抗パルボウイルス抗体が単鎖ラクダ抗体又はその断片である、請求項23に記載の方法。
- 組換えパルボウイルスビリオンが組換えAAVビリオンである、請求項22から24までのいずれか一項に記載の方法。
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