CN108699565B - 用于定向腺相关病毒(aav)的靶向肽 - Google Patents

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Abstract

本文公开了能够将腺相关病毒(AAV)定向至靶标特定环境(例如神经系统和心脏)的肽序列。还公开了具有包含所公开的肽序列的非天然存在的衣壳蛋白的AAV，以及使用AAV治疗疾病的方法。

Description

用于定向腺相关病毒(AAV)的靶向肽
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根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求于2015年12月11日提交的美国临时申请No.62/266184以及于2016年11月14日提交的美国临时申请No.62/421891的优先权。本申请还涉及于2014年9月12日提交的美国专利申请No.14/485024。这些相关申请的内容明确地通过全文引用并入本文。
关于联邦政府资助研发的声明
本发明是在政府的支持下完成的，获得国立卫生研究院的基金nos.5R01AG047664、IDP2NS087949、5U01NS090577和1R21MH103824-01。政府对本发明享有某些权利。
参考序列表
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背景技术
技术领域
本申请通常涉及基因递送领域。更具体而言，本申请涉及能够将腺相关病毒(AAV)定向至靶标组织或器官的肽序列、新型重组AAV以及使用AAV治疗各种疾病的方法。
背景技术的说明
重组腺相关病毒(rAAV)是用于体内基因转移以实施基因治疗并促进基因转移的载体，对于各种基础科学研究而言至关重要。作为基因递送载体，若干特征使得rAAV具有吸引力：(i)rAAV提供长期的转基因表达，(ii)rAAV与任何已知的人类疾病无关，(iii)rAAV能够引起相对较弱的免疫应答，(iv)rAAV能够转导各种分裂的和非分裂的细胞类型以及(v)可以将rAAV基因组包装到具有不同的转导特征和组织嗜性的各种病毒的衣壳或外壳蛋白中。使用rAAV载体的基因疗法已在临床试验中获得成功，包括治疗莱伯氏先天性黑蒙、与IX因子缺陷相关的血友病和脂蛋白脂肪酶缺乏症。此外，基于rAAV基因的治疗已在各种疾病的临床前模型中获得成功，包括雷特综合征、先天性ALS、帕金森氏病、亨廷顿氏病和脊髓性肌萎缩症。基于rAAV的疗法还在递送中性抗体以治疗诸如HIV和流感之类的感染性疾病方面获得成功。rAAV也是用于非治疗性科学研究(如光遗传学)的转基因的体内递送的常用载体。然而，对于疾病的治疗和科学研究的基因递送而言，rAAV在许多应用中的成功使用受到了下列限制：缺乏能够有效地转导某些困难细胞类型的衣壳血清型，并且缺乏在全身施用后，能够有效地且选择性地靶向所需细胞类型/器官的血清型。
发明内容
本文公开了一种AAV载体，其包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的至少4个连续的氨基酸。氨基酸序列可以为(例如)AAV载体的衣壳蛋白的一部分。在一些实施方案中，序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)被插入到载体的AAV序列(SEQ IDNO：45)的AA588至AA589之间。在一些实施方案中，序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)被插入到载体的AAV序列(SEQ ID NO：45)的AA586至AA592之间。在一些实施方案中，氨基酸序列还包含SEQ ID NO：45的氨基酸587、588、589或590中的至少两者。
还公开了一种AAV载体，其包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中
X1为D、A、E、Q、N、G或S；
X2为G、N、S、T、Q或V；
X3为T、S或N；
X4为L或V；
X5为A、S、Q、P或T；
X6为V、T、Q、N、L或M；
X7为P；
X8为F、Y、V、L、C或S；
X9为K、R或S；
X10为A或N；并且
X11为Q或P，其中AAV载体不包含氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，所述11和连续的氨基酸的序列为靶向肽的一部分，或者包含靶向肽。在一些实施方案中，X1为D，X2为G，X3为T，X4为L，X6为V或T，X8为F，它们的任意组合。在一些实施方案中，X1为D，X2为G，X3为T，X4为L，X6为V或T，或者X8为F。在一些实施方案中，X1为D，X2为G，X3为T，X4为L，X6为V或T，并且X8为F。在一些实施方案中，X4为L，X5为A，X6为V，X7为P，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q。在一些实施方案中，氨基酸X1X2X3为DGT、GGT、EGT、DST、EST、QGT、NQT、SGS、SGN、ATT、AVT或ART。在一些实施方案中，氨基酸X1X2为AQ，X6为V，X7为P，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q。在一些实施方案中，X3为T并且X4为L。在一些实施方案中，X5为A。在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q。在一些实施方案中，氨基酸X5X6X7为AVP、ATP、AQP、QQP、PQP、SNP、STP、SQP、QLP、TMP或TTP。在一些实施方案中，氨基酸X1X2X3X4X5X6为AQTLAV并且X10X11为AQ。在一些实施方案中，氨基酸X7X8X9为PFK。在一些实施方案中，氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8为AQTLAVPF。在一些实施方案中，氨基酸X9X10X11为KAQ、KAP或SNP。在一些实施方案中，所述11个连续的氨基酸的序列为AAV载体的衣壳蛋白的一部分。在一些实施方案中，所述11个连续的氨基酸的序列被插入到载体的AAV衣壳蛋白序列(例如SEQ ID NO：45)的AA586至AA589之间。在一些实施方案中，所述11个连续的氨基酸的序列为SEQ ID Nos：1至36中的一者。
本文公开了一种药物组合物，包含一种或多种本文公开的AAV载体和一种或多种可药用的载体。
本文还公开了一种肽，其中该肽包含如SEQ ID NOs：1至44、48至53、65至68以及80至93中的一者所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽结合至纳米颗粒、第二分子、病毒衣壳蛋白或它们的组合。在一些实施方案中，肽为AAV的一部分。例如，肽可以为AAV的衣壳蛋白。
本文公开的一些实施方案提供了核酸序列，其编码全部的肽，包括靶向肽及其片段。
本文还公开了一种衣壳蛋白，其包含本文公开的一种或多种靶向肽。例如，衣壳蛋白可以包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的至少4个连续的氨基酸。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中
X1为D、A、E、Q、N、G或S；
X2为G、N、S、T、Q或V；
X3为T、S或N；
X4为L或V；
X5为A、S、Q、P或T；
X6为V、T、Q、N、L或M；
X7为P；
X8为F、Y、V、L、C或S；
X9为K、R或S；
X10为A或N；并且
X11为Q或P，其中衣壳蛋白不包含氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，X1为D，X2为G，X3为T，X4为L，X6为V或T，或者X8为F。在一些实施方案中，X4为L，X5为A，X6为V，X7为P，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q。在一些实施方案中，氨基酸X1X2X3为DGT、GGT、EGT、DST、EST、QGT、NQT、SGS、SGN、ATT、AVT或ART。在一些实施方案中，氨基酸X1X2为AQ，X6为V，X7为P，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q。在一些实施方案中，X3为T并且X4为L。在一些实施方案中，X5为A。在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q。在一些实施方案中，氨基酸X5X6X7为AVP、ATP、AQP、QQP、PQP、SNP、STP、SQP、QLP、TMP或TTP。在一些实施方案中，氨基酸X1X2X3X4X5X6为AQTLAV并且X10X11为AQ。在一些实施方案中，氨基酸X7X8X9为PFK。在一些实施方案中，氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8为AQTLAVPF。在一些实施方案中，氨基酸X9X10X11为KAQ、KAP或SNP。还提供了核酸序列，其编码本文公开的衣壳蛋白及其片段。
还公开了一种将核酸递送至有需要的受试者的靶标环境的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供含有AAV的组合物，其中AAV包含衣壳蛋白，该衣壳蛋白包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，并且其中AAV包含将被递送至受试者的靶标环境的核酸，其中
X1为D、A、E、Q、N、G或S；
X2为G、N、S、T、Q或V；
X3为T、S或N；
X4为L或V；
X5为A、S、Q、P或T；
X6为V、T、Q、N、L或M；
X7为P；
X8为F、Y、V、L、C或S；
X9为K、R或S；
X10为A或N；并且
X11为Q或P，其中衣壳蛋白不包含氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)；以及将组合物施用于受试者。在一些实施方案中，该方法包括：提供含有AAV的组合物，其中AAV包含衣壳蛋白，该衣壳蛋白包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的至少4个连续的氨基酸，并且其中AAV包含将被递送至受试者的靶标环境的核酸；以及将组合物施用于受试者。靶标环境可以为(例如)心脏、神经系统或它们的组合。在一些实施方案中，靶标环境为中枢神经系统、外周神经系统、心脏或它们的组合。在一些实施方案中，靶标环境为神经元、星形胶质细胞、心肌细胞或它们的组合。在一些实施方案中，组合物为药物组合物。在一些实施方案中，将被递送至神经系统的核酸包含下列中的一者或多者：a)编码营养因子、生长因子或可溶性蛋白的核酸序列；b)恢复人或动物的携带有基因突变的基因的蛋白质功能的cDNA；c)编码可以用于控制或改变细胞的活性或状态的蛋白质的cDNA；d)编码用于评估细胞状态的蛋白质或核酸的cDNA；e)用于进行基因组工程的cDNA和/或相关的向导RNA；f)用于通过同源重组进行基因编辑的序列；g)编码治疗性RNA的DNA序列；h)shRNA或人工miRNA递送系统；以及i)影响内源性基因的剪接的DNA序列。有需要的受试者可以(例如)患有或处于发展成为下列中的一者或多者的风险：慢性疼痛、心力衰竭、心律失常、弗里德赖希氏共济失调、亨廷顿氏病(HD)、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩症I型和II型(SMA I和II)、弗里德赖希氏共济失调症(FA)、脊髓小脑性共济失调、涉及CNS内细胞的溶酶体贮积症。溶酶体贮积症可以为(例如)克拉贝病、桑德霍夫病、黑蒙性家族痴呆症、戈谢病(I型、II型或III型)、尼曼-皮克病(NPC1或NPC2缺陷)、赫尔勒综合征、庞贝病或巴滕病。在一些实施方案中，通过静脉内施用或全身施用将AAV施用于受试者。神经系统可以为(例如)中枢神经系统。在一些实施方案中，将核酸递送至受试者的背根神经节、内脏器官或它们的组合。在一些实施方案中，将核酸递送至受试者的星形胶质细胞、神经元或它们的组合。在一些实施方案中，受试者为成年动物。
附图简要说明
图1示出了用于生产AAV-PHP.B-XXX文库的多样化策略的示意图。含有AAV-PHP.B7聚体的AAV衣壳在由XXX指示的3个连续的氨基酸位置处产生多样化，其在2个氨基酸(以下称为“AA”)处，从7聚体的插入开始并延续至+9个AA。通过2个AA使各XXX文库变化。生成总共5个XXX文库以涵盖11个AA。然后，如美国专利公开2015/0079038所述，将AAV-PHP.B-XXXPCR片段组装到rAAV-Cap-in-cis-受体质粒中。并且使用该rAAV基因组生成AAV病毒文库，然后将AAV病毒文库以1x1011 vg/小鼠的剂量注射到成年的GFAP-Cre小鼠、Vgat-IRES-Cre小鼠和Vglut-IRES-Cre小鼠中，用于筛选能够分别转导星形胶质细胞、GAGA能神经元(GABAergic neurons)和谷氨酸能神经元的变体。在两轮筛选以后，发现许多变体富集在从一种或多种Cre细胞系中回收的序列中。选择其中一种序列AAV-PHP.N(DGTLAVPFKAQ(SEQID NO：4))作为单个变体进行表征。AAV-PHP.N的三个氨基酸不同于AAV-PHP.B，其为DGT，并且不同于AAV-PHP.B的序列为DG。
图2示出了比AAV-PHP.B更有效地转导CNS神经元的AAV-PHP.N。在静脉注射低剂量(3.3x1010 vg/小鼠)的AAV-CAG-mNeonGreen(包装到AAV-PHP.B(上)或AAV-PHP.N(下))中的之后2周拍摄图像。亮点表示mNeonGreen蛋白的表达(并由此表明AAV的转导)。相比于AAV-PHP.B表达，图像在皮质、小脑和齿状回中表现出更高的AAV-PHP.N表达。因此，与AAV-PHP.B相比，AAV-PHP.N在若干脑部区域为具有神经元形态的细胞提供了更高的转导。比例尺为200μm。
图3A至图3D示出了与AAV9相比，在小鼠心脏和外周神经中的AAV-PHP.S转导增强。图3A示出了在对成年小鼠进行静脉注射2x1012 vg/小鼠的ssAAV9:CAG-NLS-GFP或ssAAV-PHP.S:CAG-NLS-GFP(NLS，核定位信号)之后3周，进入小鼠背侧脊髓的感觉纤维。如相对于经AAV9处理的样品，经AAV-PHP.S处理的样品的更明亮的染色所显示的那样，AAV-PHP.S在感觉纤维中提供了比AAV9更强的GFP表达。图3B示出了在静脉内施用1x1012载体基因组(vg)/小鼠的重组单链(ss)AAV9:CAG-GFP-2A-Luc或ssAAV-PHP.S:CAG-GFP-2A-Luc之后3周，由来自心脏的明亮信号显示的来自GFP蛋白表达的天然荧光的图像。图3C示出了在注射1x1012 vg的ssAAV-PHP.S:CAG-mNeonGreen和1x1012 vg的ssAAV-PHP.S:CAG-mTurquoise的混合物之后4周，显示出在小鼠的背根神经节的天然荧光的3D投影图像。在灰度图像中一同示出两个通道。图3D示出了在静脉注射之后，在肠道神经系统内转导细胞的AAV-PHP.S。亮点标记出由AAV-PHP.S转导的细胞。图像示出了在静脉内施用1x1012 vg/小鼠的ssAAV-PHP.S:CAG-mNeonGreen之后3周所评估的来自成年小鼠肠的最大强度投影。亮点示出来自AAV-PHP.S载体的mNeon-Green表达(参见左图和右上图)。用抗pgp9.5的抗体对具有肠肌丛的神经元进行标记，并且在下部右图中示出了由DAPI标记的细胞核。
图4A至图4G示出了AAV衣壳序列从转导的靶细胞中的Cre依赖性回收。图4A示出了CREATE筛选过程的概述。PCR用于将多样性(全可见光谱垂直带)引入到衣壳基因片段中。将片段克隆到含有剩余衣壳基因的rAAV基因组中，并用于生成病毒变体文库。将该文库注射到Cre转基因动物中，并使用PCR从Cre+细胞中选择性地回收衣壳序列。图4B示出了rAAV-Cap-in-cis-lox rAAV基因组。Cre对两侧为lox71位点和lox66位点的聚腺苷酸化(pA)序列进行反转。PCR引物(半箭头)用于选择性地扩增Cre重组序列。图4C示出了来自衣壳文库序列的Cre重组依赖性(上图)和非依赖性(下图)扩增的PCR产物，从两个Cre+或Cre-小鼠中回收衣壳文库序列。示意图(底部)示出了PCR扩增策略(详见图8A至图8B)。图4D为Rep-AAPAAV辅助质粒内的AAV基因和由cap基因编码的蛋白质的示意图。插入到cap基因中的终止密码子消除了VP1、VP2和VP3衣壳蛋白表达。图4E示出了用分裂的AAV2/9rep-AAP和rAAV-Cap-in-cis-lox基因组生成的DNA酶抗性AAV载体基因组(vg)(上图)，其与用标准AAV2/9rep-cap辅助物和rAAV-UBC-mCherry基因组生成的vg(中图)或者用AAV2/9rep-AAP和rAAV-UBCmCherry基因组生成的vg(下图)相比较。每组N＝3次独立试验；平均值±s.d.；**p<0.01，***p<0.001；单向ANOVA和Tukey多重比较检验。图4F示出了将7聚体衣壳文库克隆到rAAV-ΔCap-in-cis载体中。图4G示出了AAV9表面模型。图4F至图4G示出了在AA588至AA589之间插入的7聚体的位置。
图5A至图5G示出了对成年小鼠进行静脉注射后通过CNS的AAV-PHP.B介导的基因递送。在图5A至图5F中，以1x1012 vg/小鼠或1x1011 vg/小鼠的剂量将ssAAV9:CAG-GFP或ssAAV-PHP.B:CAG-GFP通过静脉注射至成年小鼠。图5A示出了在注射之后三周，分别给予AAV9的小鼠(左)和给予AAV-PHP.B的小鼠(中和右)中GFP表达(表明由指定的衣壳递送的ssAAV基因组的表达)的图像。由明亮的信号示出GFP表达。图5B示出了在50μm最大强度投影(MIP)共聚焦图像中皮质或纹状体中的GFP的表达(由明亮信号表示)。图5C示出了PARS清除的腰部脊髓中的GFP蛋白的表达(由明亮信号表示)。图5D示出了视网膜中的GFP蛋白的表达(由明亮信号表示)(左：20μm MIP，横切面；右：全标本包埋MIP)。图5E至图5F示出了PARS清除的组织的3D MIP图像中的GFP蛋白的表达(由明亮信号表示)，PARS清除的组织来自AAV-PHP.B转导的皮质和纹状体，以及来自用AAV9(上图)和AAV-PHP.B(下图)转导的小鼠的标示器官。在图5F中，箭头突出显示了表达衣壳蛋白的神经。胰脏图像中的星号突出显示了表达GFP的胰岛细胞。3D投影中的主刻度线为100μm。图5G示出了在对成年小鼠进行静脉注射1x1011 vg之后25天，在标示的CNS区域和器官中的AAV生物分布。对于AAV-PHP.B为N＝3并且对于AAV9为n＝4；平均值+/-s.d；**p<0.01，***p<0.001，以非配对t检验对使用Holm-Sidak方法的多重比较进行校正。比例尺：1mm(图5A和图5C(左侧))；50μm(图5B、图5C(右侧)、图5D和图5E)。图5C、图5E和图5F的3D投影中的主刻度线为100μm。
图6A至图6I示出了比AAV9更有效地转导多种CNS细胞类型的AAV-PHP.B。图6A至图6E为示出AAV-PHP.B转导星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的图像：在对成年小鼠进行静脉注射1x1011(图6A)或1x1012(图6B至图6E)的ssAAV-PHP.B:CAG-GFP之后3周，GFP蛋白的表达。图6A示出了海马体中染色的MIP图像。明亮信号表示AAV-PHP.B构建体的表达，而黑暗信号表示GFAP表达。图6B示出了免疫组织化学法检测的皮质中的AAV-PHP.B的表达以及CC1标记物。编号框突出显示了双重阳性细胞的例子。示出了相应的单通道图像(右侧)。星号突出显示了没有可检测到的GFP表达的细胞。图6C示出了免疫组织化学法检测的在标示的脑部区域中AAV-PHP.B的转导和NeuN标记物。图6D示出了中脑中的GFP荧光和TH IHC的MIP图像，GFP荧光示出AAV-PHP.B的转导。图6E示出了小脑中的AAV-PHP.B转导和钙结合蛋白(Calb)IHC。图6F至图6H示出了在注射之后3周，对于标示的脑部区域中的AAV-PHP.B转导阳性细胞的百分比的定量。图6I示出了转导ChAT脊髓运动神经元的AAV-PHP.B。亮点显示了AAV-PHP.B表达。较暗的信号显示了用于ChAT的IHC。图像示出了横向全脊髓切片(左侧)或腹角MIP图像(右侧)。在横向全脊髓切片(左侧)或腹角MIP图像(右侧)中ChAT的百分比。各脊髓区域中表达AAV-PHP.B的ChAT神经元的百分比的置信区间为+/-95％。为了定量，每组n＝5；平均值+/-s.d.；以非配对t检验对使用Holm-Sidak方法的多重比较进行校正之后，发现AAV9对AAV-PHP.B的全部对的平均值均不同(***p<0.001)。比例尺：20μm(图6A至图6B和图6D)、50μm(图6C和图6I(右侧))、200μm(图6E)和1mm(图6I(左侧))。
图7A至图7F示出了CNS星形细胞的AAV-PHP.A转导以及外周器官向性的降低。图7A至图7C和图7E示出了在对成年小鼠进行静脉注射3x1011的ssAAV9:CAG-GFP或ssAAV-PHP.A:CAG-GFP之后3周，AAV-PHP.A的表达。图7A至图7B示出了ssAAV9:CAG-GFP和AAV-PHP.A:CAG-GFP的代表性IHC图像。图7C示出了海马体中GFP蛋白的IHC。黑暗信号显示了海马体中GFAP的IHC。编号框突出显示了表达GFP蛋白和GFAP两者的细胞的例子。在右侧示出相应的单通道图像。在图7D中，将2.5x1011 vg的ssAAV-PHP.A:CAG-NLS-GFP通过静脉注射到成年小鼠中。图表显示了对于NLS-GFP阳性的Aldh1l1和NeuN细胞的百分比的定量。图7E示出了肝脏中的AAV-PHP.A表达(明亮信号)(组织自发荧光显示为黒暗信号)。图7F示出了在对成年小鼠进行全的静脉注射之后25天，在CNS区域和外周器官中的AAV生物分布。在图7E至图7F中，每组N＝4；平均值±s.d；**p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，以非配对t检验对使用Holm-Sidak方法的多重比较进行校正。比例尺：1mm(图7A)；100μm(图7B)和50μm(图7C)。
图8A至图8B示出了PCR产物和rAAV-Cap-in-cis基因组的示意图。图8A为具有7个氨基酸(在本文中称为“7AA”)的PCR产物的示意图，所述7AA为在氨基酸588之后插入的随机的序列(由全谱垂直柱表示)。由名称和半箭头表明用于生成文库的引物。对PCR模板进行修饰，从而消除衣壳基因片段(xE)中天然存在的Earl限制性酶切位点(详见实施例)。图8B为示出rAAV-Cap-in-cis基因组和用于定量载体基因组并且回收具有转导的Cre表达细胞的序列的引物的示意图。基于PCR的回收分两步进行。步骤1通过选择性地扩增Cap序列来提供靶细胞特异性序列回收，所述Cap序列来自经历了下游聚腺苷酸化(pA)序列的Cre依赖性反转的基因组。对于第1步，在由Cre重组的模板上，9CapF起到正向引物的作用，而CDF引物起到反向引物的作用。步骤2使用引物XF和AR来生成PCR产物，其被克隆到rAAV-ΔCap-in-cis质粒(文库再生)中或克隆到AAV2/9rep-cap反式质粒(变体特征)中。表1提供了可用于图8A至图8B所示的PCR中的引物序列的非限制性实例。
图9A至图9B示出了来自各选择的三种最为富集的变体(即，AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2和AAV-PHP.B3)的衣壳特征和生产效率。图9A为来自小鼠的代表性矢状脑切片的图像，在注射3.3x1010 vg/小鼠的包装到AAV-PHP.B或第二或第三最为富集的变体(AAV-PHP.B2和AAV-PHP-B3)中的ssAAV-CAG-mNeonGreen-法尼基化物(mNeGreen-f)之后2周对小鼠进行评估。明亮信号示出了GFP蛋白的表达。数据代表每组2只(AAV-PHP.B)和3只(AAV-PHP.B2和AAV-PHP.B3)小鼠。图9B示出了从GFAP-Cre筛选中回收的个体变体的制备中得到的DNA酶抗性vg的量。产量以每150mm培养皿生产细胞的纯化的载体基因组拷贝的数量给出；平均值+/-s.d.*p<0.05，单向ANOVA和Tukey多重比较检验。柱中示出各衣壳的独立制备的数量。
图10A至图10G为示出AAV-PHP.B转导若干中间神经元细胞类型和内皮细胞但不转导小胶质细胞的图像。在图10A至图10D中，向成年小鼠注射1x1012 vg的AAV-PHP.B:CAG-GFP，并且在3周后评估GFP蛋白的表达。代表性图像示出了针对AAV-PHP.B表达(图10A至图10C)的IHC或来自GFP蛋白表达的天然荧光(图10D)连同针对指定抗原和脑部区域的IHC。在图10E中，向成年小鼠注射3.3x1010 vg的ssAAV-PHP.B:CAG-mNeGrn-f，并在注射之后2周进行评估。来自mNeGrn-f的天然荧光与一些内皮细胞表达CD31共定位。在图10F至图10G中，向成年小鼠注射2x1012 vg的ssAAV-PHP.B:CAG-NLS-GFP并在注射之后3周进行评估。明亮信号示出了AAV-PHP.B的表达，黒暗信号示出了Iba1的表达。星号表示表达了指定抗原的细胞，但没有可检测到的AAV-PHP表达。小清蛋白(PV)、钙结合蛋白(Calb)和钙网膜蛋白(CR)。比例尺：20μm(图10A至图10D)；50μm(图10E至图10F)和500μm(图10G)。
图11示出了用AAV-PHP.B进行基因转移后，脑中的长期AAV-PHP.B表达。向成年小鼠静脉注射指定剂量的包装到AAV9或AAV-PHP.B中的ssAAV-CAG-GFP，并在377天后评估天然eGFP荧光。明亮信号表示eGFP表达。每个载体/剂量为N＝1。
图12A至图12D为天然荧光的代表性图像，其来自通过AAV-PHP.B:CAG-NLS-GFP转导后的若干神经元和神经胶质细胞类型的GFP蛋白表达和IHC。在图12A至图12D中，向成年小鼠注射2x1012 vg的ssAAV-PHP.B:CAG-NLS-GFP，并在注射后3周进行评估。图像示出了来自GFP蛋白表达的天然荧光以及指定脑部区域中的指定抗原的IHC。在所有的图中，箭头表示GFP表达和针对指定抗原的IHC的共定位。图12B至图12C为单平面共聚焦图像；图12A和图12D为MIP。胼胝体(cc)、黑质致密部(SNc)、腹侧被盖区(VTA)。比例尺：50μm。
图13A至图13C示出了在相关培养物和完整3D皮质培养物中的人类iPSC衍生的皮质神经元和星形胶质细胞的AAV-PHP.A和AAV-PHP.B转导。图13A示出了在相关的单层培养物中AAV-PHP.B提供较高的人类神经元和星形胶质细胞的转导。代表性图像示出了来自GFPcDNA的表达，在体外分化的分离的iPSC衍生的人类皮质球状体的病毒转导(包装到AAV9、AAV-PHP.A或AAV-PHP.B中的ssAAV-CAG-NLS-GFP；1x109 vg/孔)之后五天，使用AAV9、AAV-PHP.A和AAV-PHP.B衣壳来递送所述GFP cDNA。如白色箭头所示，表达GFP蛋白的细胞与针对GFAP的免疫染色的星形胶质细胞或针对MAP2的免疫染色的神经元共定位。图13B示出了对于由AAV9、AAV-PHP.A或AAV-PHP.B转染的GFAP+或MAP2+细胞的百分比的定量(n＝3分化为来自两名受试者的两种人类iPSC系的皮质球体；双向ANOVA，Tukey多重比较检验；平均值+/-s.d.)。图13C示出了AAV9、AAV-PHP.A和AAV-PHP.B转导完整的人类3D皮质培养物(由人类iPSC分化的皮质球状体)。用包装到AAV9、AAV-PHP.A或AAV-PHP.B中的ssAAV-CAG-NLS-GFP转导的人类iPSC衍生的皮质球状体冷冻切片(体外分化的第205天)的图像示出了来自GFP蛋白表达的天然荧光以及GFAP和MAP2的免疫染色。插图示出了GFP蛋白与GFAP+星形胶质细胞(青色)或MAP2+神经元的共标记。比例尺：40μm(图13A)和100μm(图13C)。
图14A至图14D示出了在静脉注射之后以及在施用后沿着脉管系统转导细胞24小时之后，定位于脑脉管系统的AAV-PHP.B和AAV-PHP.A衣壳。如所示，向成年小鼠注射1x1011vg的包装到AAV9、AAV-PHP.A或AAV-PHP.B中的ssAAV-CAG-NLS-GFP。图14A至图14B为使用B1抗AAV VP3抗体的衣壳免疫染色(明亮染色)的代表性图像，对小鼠进行静脉注射，一小时后通过心脏灌注进行固定，B1抗AAV VP3抗体能够识别小鼠脑部的小脑(图14A)或纹状体(图14B)中的共享内部表位。在注射AAV-PHP.A和AAV-PHP.B的小鼠的整个脑中都可检测到衣壳免疫染色，但在接受相同剂量的AAV9的小鼠的脑中几乎见不到衣壳免疫染色。用DAPI标记(黑暗染色)细胞核。可以通过脂褐质自体荧光存在于绿色通道和红色通道两者中而将其与衣壳染色区分开来。图14A的插图示出了在AAV-PHP.B图像中突出显示的区域的3D MIP图像。箭头突出显示了衣壳IHC信号；星号表示血管腔。数据代表每组2只(无病毒和AAV-PHP.A)或3只(AAV9和AAV-PHP.B)小鼠。图14C为在施用AAV-PHP.B之后24小时，使用DAPI(白色染色)和CD31(黑暗染色)的GFP表达(明亮染色)的代表性图像。箭头突出显示了GFP表达细胞。图14D示出了对于在指定的脑部区域中沿着脉管系统存在的GFP表达细胞的数量的定量。每组N＝3；平均值±s.d.：AAV-PHP.B对AAV9和AAV-PHP.A，对于所有区域***p<0.001；AAV9对AAV-PHP.A，不显著；双向ANOVA，比例尺：200μm(图14A)；50μm(图14B至图14C)；在高度放大插图中的主刻度线为50μm(图14A)。
图15A至图15B示出了从GFAP-Cre小鼠中回收的前面三种变体的报道基因表达。图15A示出了小鼠的代表性矢状脑切片的图像，在注射3.3x1010 vg/小鼠的包装到AAV-PHP.B或第二或第三最为富集的变体(AAV-PHP.B2和AAV-PHP-B3)中的ssAAV-CAG-mNeonGreen-法尼基化物(mNeGreen-f)之后2周对小鼠进行评估。明亮信号示出了来自cDNA的mNeGrn-f表达，所述cDNA由三种富集的变体AAV-PHP.B(左)、AAV-PHP.B2(中)和AAV-PHP.B3(右)递送。图15B示出了脑切片中NLS-GFP表达的高倍率(40x)灰度图像，其在注射2x1012 vg/小鼠的包装到AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2或AAV-B3中的ssAAV-CAG-NLS-GFP之后3周进行评估。
图16为示出来自AAV-PHP.B变体的报道基因表达的图像。亮点表明来自AAV-PHP.B变体的报道基因表达。在IV注射1x1011 vg(合计)/小鼠的AAV-PHP.B或指定的AAV-PHP.B变体之后2周，评估来自小鼠的脑切片的单平面共聚焦图像。各变体用于包装报道基因的混合物：ssAAV-CAG-mTurquoise2、mNeonGreen和mKate 2.5。要注意，mKate2.5似乎在一些细胞类型中聚集，最显著的是在神经元和内皮细胞中。
图17示出了来自AAV-PHP.B变体的报道基因表达。亮点表明来自AAV-PHP.B变体的报道基因表达。在注射3x1011 vg(合计)/小鼠的指定的AAV-PHP.B变体之后3周，评估来自小鼠的脑切片的单平面共聚焦图像。各变体用于包装报道基因的混合物：ssAAV-CAG-mTurquoise2、mNeonGreen和mRuby 2。
图18为示出来自AAV-PHP.B变体的报道基因表达的图像。亮点表明来自AAV-PHP.B变体的报道基因表达。在IV注射1x1011 vg(合计)/小鼠的指定的AAV-PHP.B变体之后11天，评估来自小鼠的脑切片的单平面共聚焦图像。各变体用于包装报道基因的混合物：ssAAV-CAG-mTurquoise2、mNeonGreen和mRuby2。
图19A至图19C示出了在成人IV施用后，通过AAV-PHP.B-DGT的CNS转导比通过AAV-PHP.B更有效。图19A示出IV施用1x1011 vg/小鼠的包装到指定衣壳中的ssAAV-CAG-NLS-GFP之后3周，ssAAV-CAG-NLS-GFP表达的全脑图像(背面图)。通过明亮的灰度信号表明ssAAV-CAG-NLS-GFP的表达。图19B示出了显示表达GFP的总的细胞核(DAPI+)在运动皮质(左侧)或纹状体(右侧)中的百分比的图。图19C示出了显示每个GFP+细胞核的ssAAV-CAG-NLS-GFP的平均表达的图。每组N＝4只动物。
图20A至图20D示出了相比于AAV9，通过AAV-PHP.S的外周神经转导。图20A为IV施用1x1012 vg/小鼠的包装到指定衣壳中的ssAAV-CAG-NLS-GFP之后三周，AAV-PHP.S表达的全脑图像(左侧为背面图，而右侧为腹面图)。以灰度图表明GFP的表达。要注意，虽然使用核定位的GFP，但是在这些全脑图像中可见进入脊髓和脑干的外周神经元轴突中GFP的表达足够强。图20B为示出用3x1012 vg(合计)的ssAAV-PHP.S:CAG-XFPmix转导后的横向脊髓切片的图像。图20C为示出在注射1x1012 vg的ssAAV-PHP.S:CAG-mNeonGreen和1x1012的ssAAV-PHP.S:CAGmTurquoise的混合物之后4周，小鼠的背根神经节中的天然荧光的3D投影图像。图20D为示出静脉注射后转导肠神经系统内细胞的AAV-PHP.S的图像。天然mNeonGreen荧光(明亮信号)标记由AAV-PHP.S转导的细胞。图像示出了在静脉施用1x1012vg/小鼠的ssAAV-PHP.S:CAG-mNeonGreen之后3周评估的来自成年小鼠肠的最大强度投影。用抗pgp9.5的抗体(灰色染色)标记神经元，并用深色染色示出用DAPI标记的细胞核。右侧示出单个通道图。右上图示出肠神经系统中的mNeonGreen表达，其表明通过AAV-PHP.S:CAG-mNeonGreen的转导。
图21示出了AAV-PHP.B 7聚体肽和侧翼序列的进化。将PHP.B7聚体插入AAV9衣壳的AA588至AA589之间。通过PCR生成五位点饱和文库(XXX1-XXX5)，将其等量混合并用于生成DNA。然后使用DNA生成AAV衣壳文库。
图22A至图22B示出了AAV-PHP.N VP1衣壳(图22A)和AAV-PHP.SVP1衣壳(图22B)的氨基酸序列。图22A：AAV-PHP.S7聚体插入部分标有下划线，并且突出显示了与AAV-PHP.B 7聚体不同的两个氨基酸。图22B：AAV-PHP.S 7聚体标有下划线。
图23A至图23E示出了两种AAV衣壳(AAV-PHP.S和AAV-PHP.N)分别有效地将基因导入外周神经系统和中枢神经系统。向成年小鼠静脉注射指定剂量的病毒。图23A示出了全脑中GFP表达的图像。图23B至图23C为矢状脑切片中GFP表达的图像。图23D至图23E为横向脊髓切片中GFP表达的图像。图像中的明亮信号表明了GFP表达。
图24A至图24G示出了比AAV-PHP更有效的AAV-PHP.N转导若干神经元群体。图24A至图24C为示出注射有AAV-PHP.B(上图)或AAV-PHP.N(下图)的成年小鼠的脑切片的皮质(图24A)、纹状体(图24B)和小脑(图24C)中的来自GFP蛋白表达的天然GFP荧光的图像。由明亮信号表明GFP表达。图24D示出了注射AAV-PHP.B或AAV-PHP.N之后，表达GFP的细胞的细胞核(DAPI+)的百分比。图24E示出了小脑中表达GFP的NeuN+神经元(皮质或纹状体)或钙结合蛋白+(Calb)浦肯野神经元的百分比。图24F示出了表达GFP的S100b+细胞的百分比。图24G示出了指定脑部区域中单个GFP+细胞核的平均荧光强度。通过取各细胞核的平均荧光值而产生数据。*p<0.05，**p<0.01，非配对斯氏T检验(student unpairedT test)。
图25A至图25D示出了比AAV9更有效的AAV-PHP.S转导外周感觉神经元。图25A为示出1x1012 vg的包装到AAV9或AAV-PHP.S中的ssAAV-CAG-NLS-GFP的转导之后，天然GFP荧光的图像。由明亮信号表明GFP表达。图25B示出了表达细胞核GFP的PGP9.5+DRG神经元的百分比。图25C示出了用指定的载体转导的GFP+细胞的荧光介质强度(median fluorescenceintensity)的中位数平均值。图25D示出了转导心脏神经节和心肌的AAV-PHP.S。由明亮信号表明AAV-PHP.S表达。**p<0.01，****p<0.0001，非配对斯氏T检验。
发明详述
在下面的详细描述中，参考形成本文一部分的附图。在附图中，除非上下文另有指明，否则相似的符号通常标示相似的组分。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并非旨在限制。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以进行其他改变。将容易理解的是，如本文一般性描述的以及在附图中图示的本公开的方面可以以各种不同的构造方式进行排列、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确地涉及并构成本公开的一部分
本申请提供了一种能够将核酸递送至用AAV进行转导的受试者的靶标环境(例如，细胞、细胞群、组织、器官或它们的组合)的AAV。例如，AAV可用于将核酸递送至受试者的神经系统，例如中枢神经系统(CNS)和/或外周神经系统(PNS)。在一些实施方案中，AAV可用于将核酸递送至受试者的心脏。本文还公开了能够将AAV定向至靶标环境(例如，神经系统、心脏或它们的组合)的肽、包含所述肽的AAV衣壳蛋白、包含具有包含所述肽的衣壳蛋白的AAV载体的组合物(例如药物组合物)以及编码所述肽和AAV衣壳蛋白的核酸序列。此外，还公开了制备和使用AAV载体的方法。在一些实施方案中，AAV载体用于预防和/或治疗一种或多种疾病和病症，例如与神经系统和/或心脏有关的疾病和病症。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。参见，例如Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology第2版，J.Wiley&Sons(New York，NY1994)；Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor，NY1989)。出于本公开的目的，下面定义了以下术语。
如本文所用的术语“载体”可以指用于携带或转移核酸的媒介物。载体的非限制性实例包括质粒和病毒(例如，AAV病毒)。
如本文所用，术语“构建体”是指为了特定核苷酸序列的表达的目的被产生、或将在其他重组核苷酸序列的构建中被使用的重组核酸。
如本文所用，术语“质粒”是指可用于在宿主生物体内复制重组DNA序列的核酸。序列可以为双链DNA。
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”为可互换的并且是指任意核酸，不论是由磷酸二酯键或经修饰的键诸如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硅氧烷键、碳酸酯键、羧甲酯键、乙酰胺酯键、氨基甲酸酯键、硫醚键、桥连氨基磷酸酯键、桥连亚甲基膦酸酯键、桥连氨基磷酸酯键、桥连氨基磷酸酯键、桥连亚甲基膦酸酯键、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、二硫代磷酸酯键、桥连硫代磷酸酯键或磺内酯键以及此类键的组合构成的。术语“核酸”和“多核苷酸”还具体包括由除了五种生物上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基构成的核酸。
如本文所用，两个或更多个连续的氨基酸的肽序列的氨基酸“Xn”或“Bn”是指肽序列的第n个(n为正整数)位置的氨基酸。例如，在11个连续的氨基酸的肽序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11中，X1为肽序列的位置1(即第1个位置)处的氨基酸，X2为肽序列的位置2(即第2个位置)处的氨基酸，X3为肽序列的位置3(即第3个位置)处的氨基酸，X4为肽序列的位置4(即第4个位置)处的氨基酸，X5为肽序列的位置5(即第5个位置)处的氨基酸，X6为肽序列的位置6(即第6个位置)处的氨基酸，X7为肽序列的位置7(即第7个位置)处的氨基酸，X8为肽序列的位置8(即第8个位置)处的氨基酸，X9为肽序列的位置9(即第9个位置)处的氨基酸，X10为肽序列的位置10(即第10个位置)处的氨基酸，X11为肽序列的位置11(即第11个位置)处的氨基酸。例如，如果在肽序列中位置9处为A，位置10处为G并且位置11处为Q，则描述为氨基酸X9X10X11为AGQ。作为另一个例子，在QAB3B4TSL的肽序列中，表示B3为肽序列的位置3处的氨基酸，而B4为肽序列的位置4处的氨基酸。
术语“重组酶识别序列”或“重组酶识别位点”是指可被重组酶识别的核酸序列，并且可用作由所述重组酶催化的重组事件的底物。序列可以为(例如)双链DNA。
术语“病毒基因组”是指侧接顺式作用核酸序列的核酸序列，所述顺式作用核酸序列能够介导核酸包装到病毒衣壳中。对于AAV和细小病毒，例如已知位于病毒基因组5'和3'末端的“末端反向重复序列”(ITR)具有这种功能，并且ITR可以介导异源的包装，例如，非野生型病毒基因组，进入病毒衣壳。
术语“元件”是指某物的单独的或分离的部分，例如在更长的核酸序列内具有独立功能的核酸序列。术语“调控元件”和“表达控制元件”在本文中可互换使用，并且是指能够影响特定宿主生物体中有效连接的编码序列的表达的核酸分子。这些术语被广泛使用并涵盖促进或调节转录的所有元件，包括启动子、RNA聚合酶和转录因子基本相互作用所需的核心元件、上游元件、增强子和应答元件(参见，例如，Lewin，“Genes V”(Oxford UniversityPress，Oxford)第847至873页)。原核生物中的示例性调控元件包括启动子、操纵基因序列和核糖体结合位点。用于真核细胞的调节元件可以包括但不限于转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号、内部核糖体进入元件(IRES)、2A序列等，其在宿主细胞中提供和/或调节编码序列的表达和/或编码的多肽的产生。
如本文所用，术语“变体”是指具有与参考多核苷酸或多肽基本相似的序列的多核苷酸或多肽。在多核苷酸的情况下，与参考多核苷酸相比，变体可以在5'末端、3'末端和/或一个或多个内部位点处具有一个或多个核苷酸的缺失、替换、添加。可以使用本领域已知的常规技术(例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术)来检测变体和参考多核苷酸之间序列的相似性和/或差异。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，如(例如)通过使用定点诱变产生的多核苷酸。通常，多核苷酸的变体包括但不限于DNA，如通过技术人员已知的序列比对程序所确定的，其与参考多核苷酸的序列同一性可以为至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。在多肽的情况下，与参考多肽相比，变体可以具有一个或多个氨基酸的缺失、替换、添加。可以使用本领域已知的常规技术(例如蛋白质印迹)来检测变体和参考多肽之间序列的相似性和/或差异。通常，如通过技术人员已知的序列比对程序所确定的，多肽的变体与参考多肽的序列同一性可以为至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。
术语“AAV”或“腺相关病毒”是指病毒的细小病毒科属内的依赖性病毒(Dependoparvovirus)。例如，AAV可以为来源于天然存在的“野生型”病毒的AAV；来源于rAAV基因组的AAV，rAAV基因组包装在来源于由天然存在的cap基因编码的衣壳蛋白的衣壳中和/或rAAV基因组包装在来源于由非天然衣壳cap基因(例如，AAV-PHP.N和AAV-PHP.S)编码的衣壳蛋白的衣壳中。如本文所公开的，术语“AAV-PHP.eB”、“AAV-PHP.N”和“AAV-PHP.B-DGT”可互换使用，以指具有非天然衣壳蛋白的AAV变体，非天然衣壳蛋白包含11聚体氨基酸序列DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：4，本文中分别称为“PHP.eB”、“PHP.N”、“PHP.B-DGT”序列)。
术语“rAAV”是指“重组AAV”。在一些实施方案中，重组AAV具有AAV基因组，其中部分或全部rep和cap基因已被异源序列取代。
术语“rep-cap辅助质粒”是指提供病毒rep和cap基因功能的质粒。该质粒可以用于由缺乏功能性rep和/或衣壳基因序列的rAAV基因组产生AAV。
术语“载体”被定义为用于携带或转移核酸的媒介物。载体的非限制性实例包括质粒和病毒。
术语“cap基因”是指对衣壳蛋白进行编码的核酸序列，所述衣壳蛋白能够形成或有助于形成病毒的衣壳或蛋白质壳。在AAV的情况下，衣壳蛋白可以为VP1、VP2或VP3。对于其他细小病毒，衣壳蛋白的名称和数量可能不同。
术语“rep基因”是指对病毒复制和生成所需的非结构蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)进行编码的核酸序列。
“文库”可以为多种线性核酸、质粒、病毒颗粒或病毒载体的形式。文库将包括至少两种线性核酸。
当插入的核酸序列随机产生时，N＝A、C、G或T；K＝G或T；M＝A或C.
除非另有说明，否则本文讨论的任意单链多核苷酸序列的左侧末端为5'末端；双链多核苷酸序列的左侧方向被称为5'方向。
如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的材料或在自然界中发现的材料的形式。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。可以根据制造商的说明书或如本领域的常规技术或如本文所描述的那样来进行酶促反应和纯化技术。通常可以根据本领域众所周知的常规方法，并如本说明书通篇引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述的那样进行上述技术和程序。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，出于任何目的，将其通过引用并入本文。除非提供特定的定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术为本领域众所周知和常用的术语、实验室程序和技术。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
如本文所用，“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。“动物”包括冷血和温血的脊椎动物和无脊椎动物，如鱼类、贝类、爬行动物，和特别是哺乳动物。如本文所用，“哺乳动物”是指属于哺乳纲(Mammalia)的个体，并且包括但不限于人类、家养和农场动物、动物园动物、体育和宠物动物。哺乳动物的非限制性实例包括小鼠；大鼠；兔；豚鼠；狗；猫；绵羊；山羊；牛；马；灵长类动物，如猴、黑猩猩和猿，和特别是人。在一些实施方案中，哺乳动物为人。然而，在一些实施方案中，哺乳动物不为人。
如本文所用，术语“治疗”是指对由患者，特别是患有一种或多种血清素相关疾病的患者所表现出的疾病、病症或生理状况作出的干预。治疗的目的可以包括但不限于下列中的一者或多者：缓解或预防症状；减缓或停止疾病、病症或症状的进展或恶化以及缓解疾病、病症或症状。术语“治疗”和“疗法”包括(例如)治疗性治疗、预防性治疗以及能够降低受试者将发展出疾病的风险或其他风险因素的用途。治疗不需要完全治愈病症，并且包括能够减轻症状或潜在的风险因素的实施方案。在一些实施方案中，“治疗”是指治疗性治疗和保护性或预防性措施两者。需要治疗的患者包括已经受到疾病或病症或不希望的生理状况影响的患者以及要预防疾病或病症或不希望的生理状况的患者。例如，在一些实施方案中，治疗可以提高或降低受试者的血清素水平，从而减少、缓解或根除一种或多种疾病的一种或多种症状。如本文所用，术语“预防”是指减轻随后表达那些血清素相关疾病症状的个体负担的任意活动。这可以在一级、二级和/或三级预防水平进行，其中：a)一级预防避免症状/病症/症状的发展；b)二级预防活动旨在疾病/病症/症状治疗的早期阶段，从而增加干预的机会以预防疾病/病症/症状的进展和症状的出现；以及c)三级预防通过(例如)恢复功能和/或减少任意的疾病/病症/症状或相关并发症来减少已经建立的疾病/病症/症状的负面影响。术语“预防”并不要求100％消除事件的可能性。相反，它表示在化合物或方法存在下事件发生的可能性已降低。
如本文所用，术语“有效量”是指足以产生有益的或令人满意的生物学和/或临床结果的量。
“可药用的”载体为在所用剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的载体。“可药用的”载体可以为但不限于有机或无机的、固体或液体的赋形剂，其适合于所选择的施用方式，如口服施用或注射，并且以常规药物制剂的形式(如固体如片剂、颗粒、粉末、胶囊；以及液体如溶液、乳液、悬浮液等)施用。通常生理上可接受的载体为pH缓冲溶液，如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。生理上可接受的载体还可以包括以下的一者或多者：抗氧化剂，其包括抗坏血酸、低分子量(少于约10个残基)多肽、蛋白(如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白)；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合剂(如EDTA)、糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)、成盐抗衡离子(如钠)以及非离子表面活性剂(如TweenTM、聚乙二醇(PEG)和PluronicsTM)。还可以将辅助剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂、粘合剂、pH调节剂控制剂、等渗剂和其他常规添加剂添加到载体中。
靶标序列
本文公开了能够将AAV定向(例如，为了递送一种或多种核酸的目的而对AAV进行定向)至受试者的靶标环境的靶向肽。靶标环境可以为(例如)受试者的细胞、细胞群、一种或多种组织、一种或多种器官或它们的组合。在一些实施方案中，靶标环境为中枢神经系统(CNS)。在一些实施方案中，靶标环境为外周神经系统(PNS)。在一些实施方案中，靶标环境为心脏。在一些实施方案中，靶向肽能够将AAV定向至(或主要定向至)受试者的CNS(本文中称为“CNS靶向肽”)。在一些实施方案中，靶向肽能够将AAV定向至(或主要定向至)受试者的PNS(本文中称为“PNS靶向肽”)。在一些实施方案中，靶向肽能够将AAV定向至(或主要定向至)受试者的心脏(本文中称为“心脏靶向肽”)。在一些实施方案中，靶向肽为CNS靶向肽。在一些实施方案中，靶向肽为PNS靶向肽。在一些实施方案中，靶向肽为心脏靶向肽。例如，在一些实施方案中，CNS靶向肽可以定向AAV以将核酸递送至CNS的神经元、神经胶质、内皮细胞、星形胶质细胞、小脑浦肯野细胞或它们的组合。在一些实施方案中，靶向肽能够定向AAV以将核酸递送至受试者的CNS、心脏(例如心脏中的心肌细胞)、外周神经或它们的组合。在一些实施方案中，受试者为成年人，例如三岁以上的受试者。
靶向肽(例如，CNS靶向肽、PNS靶向肽和心脏靶向肽)可以在长度上变化。例如，靶向肽的长度可以为(或者可以为至少)三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十五个、十八个、二十个、二十五个、三十个氨基酸或这些值中任意两者之间的范围。在一些实施方案中，靶向肽的长度为(或为约)七个氨基酸。在一些实施方案中，靶向肽的长度为(或为约)十一个氨基酸。在一些实施方案中，靶向肽的长度为(或为约)七个至十一个氨基酸。
在一些实施方案中，靶向肽包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11或由11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11构成，其中
X1为D、A、E、Q、N、G或S；
X2为G、N、S、T、Q或V；
X3为T、S或N；
X4为L或V；
X5为A、S、Q、P或T；
X6为V、T、Q、N、L或M；
X7为P；
X8为F、Y、V、L、C或S；
X9为K、R或S；并且
各X10和X11独立地为任意氨基酸。
在一些实施方案中，靶向肽不为(或不包含)氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。在一些靶向肽的实施方案中，X10和X11可以独立地为为任意氨基酸，例如任意的标准氨基酸。如本文所用，标准氨基酸包括丙氨酸(缩写为“Ala”或“A”)、精氨酸(缩写为“Arg”或“R”)、天冬酰胺(缩写为“Asn”或“N”)、天冬氨酸(缩写为“Asp”或“D”)、半胱氨酸(缩写为“Cys”或“C”)、谷氨酸(缩写为“Glu”或“E”)、谷氨酰胺(缩写为“Gln”或“Q”)、甘氨酸(缩写为“Gly”或“G”)、组氨酸(缩写为“His”或“H”)、异亮氨酸(缩写为“Ile”或“I”)、亮氨酸(缩写为“Leu”或“L”)、赖氨酸(缩写为“Lys”或“K”)、蛋氨酸(缩写为“Met”或“M”)、苯丙氨酸(缩写为“Phe”或“F”)、脯氨酸(缩写为“Pro”或“P”)、丝氨酸(缩写为“Ser”或“S”)、苏氨酸(缩写为“Thr”或“T”)、色氨酸(缩写为“Trp”或“W”)、酪氨酸(缩写为“Tyr”或“Y”)、缬氨酸(缩写为“Val”或“V”)。在一些实施方案中，X10为A或N。在一些实施方案中，X11为Q或P。X10和X11可以为相同或不同的氨基酸。在一些实施方案中，X1为D。在一些实施方案中，X2为G。在一些实施方案中，X3为T。在一些实施方案中，X4为L。在一些实施方案中，X6为V或T。在一些实施方案中，X8为F。在一些实施方案中，氨基酸序列X4X5X6X7X8X9X10X11为LAVPFKAQ(SEQ ID NO：80)。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3为DGT、GGT、EGT、DST、EST、QGT、NQT、SGS、SGN、ATT、AVT或ART。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2为AQ，并且氨基酸X6X7X8X9X10X11为VPFKAQ(SEQ IDNO：81)。在一些实施方案中，X3为T并且X4为L。在一些实施方案中，X5为A。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2为AQ，氨基酸序列X3X4为TL，并且氨基酸序列X8X9X10X11为FKAQ(SEQ IDNO：82)。在一些实施方案中，氨基酸序列X5X6X7为AVP、ATP、AQP、QQP、PQP、SNP、STP、SQP、QLP、TMP或TTP。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3X4X5X6为AQTLAV(SEQ ID NO：83)并且氨基酸序列X10X11为AQ。在一些实施方案中，氨基酸X7X8X9为PFK。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8为AQTLAVPF(SEQ ID NO：84)。在一些实施方案中，氨基酸序列X9X10X11为KAQ、KAP或SNP。在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11为DGTLATPFKXX(X可以为任意氨基酸，SEQ ID NO：68)。在一些实施方案中，11个连续的氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11为GGTLATPFKAQ(SEQ ID NO：10)。本文描述的实施方案的各种组合包含在本公开的范围内。例如，当X10为A时，X11可以为Q或P；当X1为D时，X2可以为G、N、S、T和V中的任意一者。作为另一个实例，当X3为T并且X4为L时，X5可以为A。
在一些实施方案中，X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10和X11分别为L、A、V、P、F、K、A和Q；并且X3为T、S或N。在一些实施方案中，X3为T是有利的。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3为AQT、DGT、GGT、EGT、DST、EST、QGT、NQT、SGS、SGN、ATT、AVT或ART。
在一些实施方案中，X1为A并且X2为Q；X6、X7、X8、X9、X10和X11分别为V、P、F、K、A、Q；X3为T并且X4为L。在一些实施方案中，氨基酸序列X3X4X5为TLA。
在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q，并且氨基酸序列X5X6X7为AVP、ATP、AQP、QQP、PQP、SNP、STP、SQP、QLP、TMP或TTP。
在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列为AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。
在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，X5为A，X6为V，X7为P并且X8为F，并且氨基酸序列X9X10X11是KAQ、KAP或SNP。
靶向肽还可以包含本文公开的任意一种靶向肽的至少4个连续的氨基酸，或者由本文公开的任意一种靶向肽的至少4个连续的氨基酸构成，例如SEQ ID NO：1至44、48至53以及65之68的靶向肽。在一些实施方案中，靶向肽包含SEQ ID NO：37至44以及65至68中的一者的4个、5个或6个连续的氨基酸，或者由SEQ ID NO：37至44以及65至68中的一者的4个、5个或6个连续的氨基酸构成。在一些实施方案中，靶向肽包含SEQ ID NO：1至36中的一者的4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续的氨基酸，或者由EQ ID NO：1至36中的一者的4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续的氨基酸构成。
靶向肽还可以包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的至少4个连续的氨基酸，或者由序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的至少4个连续的氨基酸构成。在一些实施方案中，靶向肽包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的4个、5个或6个连续的氨基酸，或者由序列QAVRTSL(SEQID NO：37)的4个、5个或6个连续的氨基酸构成。例如，靶向肽可以包含选自下列的氨基酸序列，或者由选自下列的氨基酸序列构成：QAVR(SEQ ID NO：85)、AVRT(SEQ ID NO：86)、VRTS(SEQ ID NO：87)、RTSL(SEQ ID NO：88)、QAVRT(SEQ ID NO：89)、AVRTS(SEQ ID NO：90)、VRTSL(SEQ ID NO：91)、QAVRTS(SEQ ID NO：92)和AVRTSL(SEQ ID NO：93)。在一些实施方案中，靶向肽还可以包含与SEQ ID NO：37具有一个或两个错配的氨基酸序列，或者由与SEQID NO：37具有一个或两个错配的氨基酸序列构成。例如，靶向肽可以包含QAB3B4TSL的氨基酸序列，或者由QAB3B4TSL的氨基酸序列构成，其中B3和B4可以独立地为任意标准氨基酸。在一些实施方案中，B3不为V，B4不为R，或两者。作为另一个实例，靶向肽可以包含QAVRB5SL的氨基酸序列，或者由QAVRB5SL的氨基酸序列构成，其中B5可以为任意标准氨基酸。在一些实施方案中，B5不为T。
本文公开的靶向肽可以为独立的肽，或者可以与纳米颗粒、第二分子、病毒衣壳蛋白或它们的组合缀合，或者可以为纳米颗粒、第二分子、病毒衣壳蛋白或它们的组合的一部分。在一些实施方案中，将靶向肽插入到AAV9衣壳序列(SEQ ID NO：45)的氨基酸588和589之间。
在一些实施方案中，靶向肽包含SEQ ID NO：1至44、48至53以及65至68中的一者的四个或更多个连续的氨基酸，或者由SEQ ID NO：1至44、48至53以及65至68中的一者的四个或更多个连续的氨基酸构成。在一些实施方案中，CNS靶向肽包含SEQ ID NO：1至44、48至53以及65至68中任一者的4个、5个或6个氨基酸，或者由SEQ ID NO：1至44、48至53以及65至68中任一者的4个、5个或6个氨基酸构成。在一些实施方案中，可以改变SEQ ID NO：1至44,、48至53以及65至68中任一者的2个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，改变为(本文提供的任意靶向序列内的)保守改变。在一些实施方案中，改变为(本文提供的任意靶向序列内的)一个或两个氨基酸的缺失或插入。在一些实施方案中，靶向肽与本文提供的靶向序列中的一者的序列同一性可以为至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高。在一些实施方案中，靶向肽不同于本文公开的靶向序列中的一者的氨基酸可以为一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个。
在一些实施方案中，靶向肽包含上述序列的任意一者或多者，或者由上述序列的任意一者或多者构成，或者基本由上述序列的任意一者或多者构成。在一些实施方案中，如本文所述，将靶向肽插入到较长的肽中。表1提供了靶向肽的非限制性实例。
表1.本文公开的靶向肽的示例性实例(X可以为任意标准氨基酸)
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本文还公开了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码本文公开的靶向肽中的一者或多者。
在一些实施方案中，靶向肽为AAV的一部分，例如AAV衣壳蛋白(SEQ ID NO：45)的一部分。本文提供了AAV衣壳蛋白，其包含本文公开的靶向肽中的一者或多者。例如，AAV衣壳蛋白可以包含靶向肽部分，其包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的至少4个连续的氨基酸。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含靶向肽部分，其包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的4个、5个或6个连续的氨基酸，或者由序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的4个、5个或6个连续的氨基酸构成。
本文还公开了包含靶向肽部分的AAV衣壳蛋白，所述靶向肽部分包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中
X1为D、A、E、Q、N、G或S；
X2为G、N、S、T、Q或V；
X3为T、S或N；
X4为L或V；
X5为A、S、Q、P或T；
X6为V、T、Q、N、L或M；
X7为P；
X8为F、Y、V、L、C或S；
X9为K、R或S；并且
X10和X11独立地为任意氨基酸。
在一些实施方案中，靶向肽不为(或不包含)氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白不包含氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。如本文所述，X10和X11可以独立地为任意氨基酸，例如任意的标准氨基酸。在一些实施方案中，X10为A或N。在一些实施方案中，X11为Q或P。在一些实施方案中，X1为D。在一些实施方案中，X2为G。在一些实施方案中，X3为T。在一些实施方案中，X4为L。在一些实施方案中，X6为V或T。在一些实施方案中，X8为F。在一些实施方案中，氨基酸序列X4X5X6X7X8X9X10X11为LAVPFKAQ(SEQ IDNO：80)。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3为DGT、GGT、EGT、DST、EST、QGT、NQT、SGS、SGN、ATT、AVT或ART。在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，并且氨基酸序列X6X7X8X9X10X11为VPFKAQ(SEQ ID NO：81)。在一些实施方案中，X3为T并且X4为L。在一些实施方案中，X5为A。在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，并且氨基酸序列X8X9X10X11为FKAQ(SEQ ID NO：82)。在一些实施方案中，氨基酸序列X5X6X7为AVP、ATP、AQP、QQP、PQP、SNP、STP、SQP、QLP、TMP或TTP。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3X4X5X6为AQTLAV(SEQ ID NO：83)，X10为A，并且X11为Q。在一些实施方案中，氨基酸序列X7X8X9为PFK。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8为AQTLAVPF(SEQ ID NO：84)。在一些实施方案中，氨基酸序列X9X10X11为KAQ、KAP或SNP。在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11为DGTLATPFKXX(X可以为任意氨基酸，SEQ ID NO：68)。在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11为GGTLATPFKAQ(SEQ ID NO：10)。本文描述的实施方案的各种组合包含在本公开的范围内。例如，当X10为A时，X11可以为Q或P；而当X1为D时，X2可以为G、N、S、T和V中的任一者。作为另一个实例，当X3为T并且X4为L时，X5可以为A。
在一些实施方案中，X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10和X11分别为L、A、V、P、F、K、A和Q；并且X3为T、S或N。在一些实施方案中，X3为T是有利的。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3为AQT、DGT、GGT、EGT、DST、EST、QGT、NQT、SGS、SGN、ATT、AVT或ART。
在一些实施方案中，X1为A并且X2为Q；X6、X7、X8、X9、X10和X11分别为V、P、F、K、A、Q，并且X3为T，并且X4为L。在一些实施方案中，氨基酸序列X3X4X5为TLA。
在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q，并且氨基酸序列X5X6X7为AVP、ATP、AQP、QQP、PQP、SNP、STP、SQP、QLP、TMP或TTP。
在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列为AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。
在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，X5为A，X6为V，X7为P并且X8为F，并且氨基酸序列X9X10X11为KAQ、KAP或SNP。
衣壳蛋白的靶向肽部分可以包含本文公开的靶向肽中的任意一者的序列，或者可以由本文公开的靶向肽中的任意一者的序列构成，或者可以包含本文公开的靶向肽中的任意一者的至少4个连续的氨基酸，或者可以由本文公开的靶向肽中的任意一者的至少4个连续的氨基酸构成。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含靶向肽部分，其包含SEQ ID NO：1至44、48至53以及65至68中的任一者的至少4个连续的氨基酸，或者由SEQ ID NO：1至44、48至53以及65至68中的任一者的至少4个连续的氨基酸构成。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含靶向肽部分，其包含SEQ ID NO：37至44以及65至68的4个、5个或6个连续的氨基酸，或者由SEQ ID NO：37至44以及65至68的4个、5个或6个连续的氨基酸构成。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含靶向肽部分，其包含SEQ ID NO：1至36的4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续的氨基酸，或者由SEQ ID NO：1至36的4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续的氨基酸构成。
在一些实施方案中，靶向肽为AAV9衣壳序列SEQ ID NO：45的一部分。在一些实施方案中，可以将靶向肽连接至任意的根据需要应被靶向的分子。在一些实施方案中，可以将靶向肽连接至或缀合至(但不限于)重组蛋白、抗体、细胞、诊断剂、治疗剂、纳米分子或它们的组合。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47的序列，或者由SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47的序列构成。
在一些实施方案中，可以将靶向肽插入到蛋白质的任意所需的部分。在一些实施方案中，可以将靶向肽插入到衣壳蛋白中。在一些实施方案中，将靶向肽插入到所需的蛋白质的表面上。在一些实施方案中，将靶向肽插入到蛋白质的一级序列中。在一些实施方案中，将靶向肽连接至蛋白质。在一些实施方案中，将靶向肽共价地连接至蛋白质。在一些实施方案中，将靶向肽插入到所需的蛋白质的非结构化环中。在一些实施方案中，非结构化环可以为经由蛋白质的结构模型识别的环。
本文还提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码本文公开的AAV衣壳蛋白中的一者或多者。
腺相关病毒(AAV)载体和重组AAV
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长度约4.7kb，包括145个核苷酸的末端反向重复序列(ITR)。ITR在AAV的DNA整合进入宿主细胞基因组中发挥作用。当AAV感染宿主细胞时，病毒基因组整合进入宿主的染色体，导致细胞的潜伏性感染。在自然系统中，辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)提供允许AAV病毒在被感染的细胞中产生的基因。在腺病毒的情况下，基因E1A、E1B、E2A、E4和VA提供辅助功能。当用辅助病毒感染时，AAV前病毒得到拯救和扩增，并且产生AAV和腺病毒两者。在不具有Rep和/或Cap基因的重组AAV载体的情况下，AAV可以为非整合的。
提供了AAV载体，其包含一种或多种目标蛋白的编码区。AAV载体可以包括AAV的5'末端反向重复序列(ITR)、3'AAV ITR、启动子和启动子下游的限制性酶切位点，以允许编码一个或多个目标蛋白的多核苷酸的插入，其中启动子和限制性酶切位点位于5'AAV ITR的下游和3'AAV ITR的上游。在一些实施方案中，AAV载体包含位于限制性酶切位点下游且位于3'AAV ITR上游的转录后调控元件。在一些实施方案中，本文公开的AAV载体可以用作AAV转移载体，其携带编码目标蛋白的转基因，从而产生可以在宿主细胞中表达目标蛋白的重组AAV病毒。
本文提供了rAAV基因组。基因组可以(例如)包括至少一个末端反向重复序列，将其配置为能够包装到载体和cap基因中。在一些实施方案中，还可以包括cap基因表达和剪接所需的rep基因中的序列。在一些实施方案中，基因组还可以包括能够表达VP3的序列。在一些实施方案中，表达的唯一蛋白为VP3(构成组装的衣壳的大部分的衣壳结构蛋白中最小的蛋白，组装的衣壳由60个单位的VP蛋白组成，其中约50个为VP3)。在一些实施方案中，仅VP3表达就足以使筛选方法充分可行。
可以使用本领域众所周知的任何合适的基因工程技术来完成病毒载体的生成，所述基因工程技术包括但不限于限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，例如Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press，N.Y.(1989))所述的技术。
病毒载体可以掺入到来自任意已知生物的基因组的序列中。序列可以以其天然形式掺入或者可以以任意方式修饰以获得期望的活性。例如，序列可以包含插入、缺失或取代。
在一些实施方案中，病毒载体可以包括使得载体适合于在真核生物中复制和整合的另外的序列。在其他实施方案中，本文公开的病毒载体可以包括使得载体适合于在原核生物和真核生物两者中复制和整合的穿梭元件。在一些实施方案中，病毒载体可以包括另外的转录和翻译起始序列，如启动子和增强子；以及另外的转录和翻译终止子，如聚腺苷酸化信号。美国专利公开2012/0232133中已经详细描述了可以包括在AAV载体中的各种调控元件，其通过全文引用并入本文。
本文公开了包含靶向肽的AAV载体，所述靶向肽能够将AAV定向至受试者的靶标环境(例如，CNS、PNS和心脏)。在一些实施方案中，靶向肽为AAV载体的衣壳蛋白的一部分。在一些实施方案中，AAV载体可以包含蛋白质，其包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的至少4个连续的氨基酸。在一些实施方案中，AAV的衣壳可以包含氨基酸序列，其包含序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)的至少4个连续的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸序列为AAV载体的衣壳蛋白的一部分。在一些实施方案中，将序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)插入到载体的AAV序列(SEQ ID NO：45)的AA588至AA589之间。在一些实施方案中，将序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)插入到载体的AAV序列(SEQ ID NO：45)的AA586至AA592之间。在一些实施方案中，序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)还包含SEQ ID NO：45的氨基酸587、588、589和590中的至少两者。
在一些实施方案中，例如AAV载体的衣壳蛋白，包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中
X1为D、A、E、Q、N、G或S；
X2为G、N、S、T、Q或V；
X3为T、S或N；
X4为L或V；
X5为A、S、Q、P或T；
X6为V、T、Q、N、L或M；
X7为P；
X8为F、Y、V、L、C或S；
X9为K、R或S；并且
各X10和X11独立地为任意氨基酸。
在一些实施方案中，所述11个连续的氨基酸的序列不为(或不包含)氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白不包含氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。如本文所述，X10和X11可以独立地为任意氨基酸，例如任意的标准氨基酸。在一些实施方案中，X10为A或N。在一些实施方案中，X11为Q或P。在一些实施方案中，X1为D。在一些实施方案中，X2为G。在一些实施方案中，X3为T。在一些实施方案中，X4为L。在一些实施方案中，X6为V或T。在一些实施方案中，X8为F。在一些实施方案中，氨基酸序列X4X5X6X7X8X9X10X11为LAVPFKAQ(SEQ ID NO：80)。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3为DGT、GGT、EGT、DST、EST、QGT、NQT、SGS、SGN、ATT、AVT或ART。在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，并且氨基酸序列X6X7X8X9X10X11为VPFKAQ。在一些实施方案中，X3为T并且X4为L。在一些实施方案中，X5为A。在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，并且氨基酸序列X8X9X10X11为FKAQ。在一些实施方案中，氨基酸序列X5X6X7为AVP、ATP、AQP、QQP、PQP、SNP、STP、SQP、QLP、TMP或TTP。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3X4X5X6为AQTLAV(SEQ ID NO：83)，X10为A，并且X11为Q。在一些实施方案中，氨基酸序列X7X8X9为PFK。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8为AQTLAVPF(SEQ ID NO：84)。在一些实施方案中，氨基酸序列X9X10X11为KAQ、KAP或SNP。在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11为DGTLATPFKXX(X可以为任意氨基酸，SEQ ID NO：68)。在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11为GGTLATPFKAQ(SEQ ID NO：10)。本文描述的实施方案的各种组合包含在本公开的范围内。例如，当X10为A时，X11可以为Q或P；而当X1为D时，X2可以为G、N、S、T和V中的任一者。作为另一个实例，当X3为T并且X4为L时，X5可以为A。
在一些实施方案中，X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10和X11分别为L、A、V、P、F、K、A和Q；并且X3为T、S或N。在一些实施方案中，X3为T是有利的。在一些实施方案中，氨基酸序列X1X2X3为AQT、DGT、GGT、EGT、DST、EST、QGT、NQT、SGS、SGN、ATT、AVT或ART。
在一些实施方案中，X1为A并且X2为Q；X6、X7、X8、X9、X10和X11分别为V、P、F、K、A、Q，并且X3为T，并且X4为L。在一些实施方案中，氨基酸序列X3X4X5为TLA。
在一些实施方案中，X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，X8为F，X9为K，X10为A，并且X11为Q，并且氨基酸序列X5X6X7为AVP、ATP、AQP、QQP、PQP、SNP、STP、SQP、QLP、TMP或TTP。
在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列为AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：1)。
X1为A，X2为Q，X3为T，X4为L，X5为A，X6为V，X7为P并且X8为F，并且氨基酸序列X9X10X11为KAQ、KAP或SNP。
在一些实施方案中，氨基酸序列为AAV载体的衣壳蛋白的一部分。在一些实施方案中，将11个连续的氨基酸的序列插入到载体的AAV衣壳蛋白序列SEQ ID NO：45的AA586和AA589之间。在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列还包含SEQ ID NO：45的氨基酸587、588、589或590中的至少两者。在一些实施方案中，11个连续的氨基酸的序列为SEQ IDNO NOs：1至36。在一些实施方案中，AAV载体包含SEQ ID NO：1至44、48至53以及65至68中的一者的至少4个连续的氨基酸。
如本文所述，rAAV可以从衣壳文库中确定，所述衣壳文库包括通过在AAV衣壳蛋白的AA588和AA589之间插入随机化序列的7个氨基酸(AA)而制备的变体。在一些实施方案中，与野生型AAV衣壳蛋白相比，AAV衣壳蛋白可以具有各种取代，包括但不限于K449R取代、A587D取代、Q588G取代、A587G取代、Q588G取代、V592T取代、K595S取代、A595N取代、Q597P取代以及它们的任意组合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白的序列与野生型AAV9衣壳相同，但其具有K449R取代。在一些实施方案中，AAV9衣壳蛋白包含氨基酸取代A587D和Q588G。在一些实施方案中，AAV9衣壳蛋白包含氨基酸取代A587G和Q588G。在一些实施方案中，AAV9衣壳蛋白包含氨基酸取代V592T。在一些实施方案中，AAV9衣壳蛋白包含氨基酸取代K595S、A595N和Q597P。
在一些实施方案中，一种或多种靶向肽可以用于单个系统中(例如，单个AAV载体、单个AAV衣壳蛋白或单个rAAV中)。例如，可以使用一种或多种靶向序列并且还可以修饰其他位点，以减少存在于受试者(如人)中的预先存在的抗体对AAV的识别。在一些实施方案中，AAV载体可包括衣壳，其影响趋向性/靶向性、表达速度和可能的免疫应答。载体还可以包括rAAV，该基因组携带转基因/治疗方面(例如，序列)以及调控序列。在一些实施方案中，载体可以包括基底内/上的靶向序列，所述基底为所需分子(治疗性分子、诊断性分子等)或者所述基底运输所需分子。
在一些实施方案中，相比于不包含靶向肽的AAV，本文公开的靶向肽可以增加rAAV向受试者的靶标环境(例如，CNS、PNS、心脏或它们的组合)的转导效率。例如，相比于不包含靶向肽的AAV，rAAV中包含本文公开的靶向肽中的一者或多者能够使转导效率提高(或至少提高)10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或者这些值中的任意两个之间的范围。在一些实施方案中，提高为至少2倍。在一些实施方案中，提高为40倍至90倍的增加。在一些实施方案中，提高了将rAAV转导至CNS的转导效率。在一些实施方案中，提高了将rAAV转导至PNS的转导效率。在一些实施方案中，提高了将rAAV转导至心脏的转导效率。在一些实施方案中，提高了将rAAV转导至心肌细胞、感觉神经元、背根神经节、内脏器官或它们的任意组合的转导效率。
在一些实施方案中，提供了一种包括AAV基因组的衣壳文库，所述AAV基因组包括经修饰的全rep和cap序列两者，所述序列经修饰以便不阻碍病毒在其能够正常复制(哺乳动物细胞以及诸如腺病毒之类的辅助病毒的共感染)的条件下的复制。假野生型(“wt”)基因组可以为在“wt”AAV基因组中具有经过基因工程处理的cap基因的基因组。
在一些实施方案中，衣壳文库在含有侧接末端反向重复序列(ITRs)的病毒复制基因(rep)和衣壳基因(cap)的“假野生型”AAV基因组中产生。在一些实施方案中，衣壳文库不是在含有侧接末端反向重复序列(ITRs)的病毒复制基因(rep)和衣壳基因(cap)的“假野生型”AAV基因组中产生的。
在一些实施方案中，rAAV基因组含有cap基因并且仅含有rep基因内表达和剪接cap基因产物所需的那些序列。在一些实施方案中，提供了衣壳基因重组酶识别序列，这些序列上侧接有末端反向重复序列。
在一些实施方案中，系统可以用于开发显示出增强的特定细胞/器官的靶向性的衣壳、筛选逃避免疫的衣壳、筛选在同源重组中更多的基因组、筛选在细胞中提高单链AAV基因组转化为双链DNA基因组的转化效率的基因组元件和/或筛选对于在细胞中增加AAV基因组向持久环化形式转变的基因组元件。
AAV载体和rAAV的用途
本文公开的AAV载体可以被有效地转导至受试者的靶标环境(例如，CNS、PNS、心脏、它们的任意组合和其他一种或多种所需系统)中，例如用于递送核酸。在一些实施方案中，提供了将核酸序列递送至神经系统的方法。该方法可以包括提供蛋白质，其包含本文提供靶向序列的任意一者或多者。蛋白质可以为AAV的衣壳的一部分。AAV可包含将被递送至神经系统的核酸序列。然后可以对受试者施用AAV。
在一些实施方案中，将被递送至靶标环境(例如，神经系统)的核酸序列包含一种或多种序列，其对神经系统和/或局部递送或周围组织或环境有一定的用途或益处。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为编码目标蛋白的核酸，包括但不限于营养因子、生长因子或可能从转导细胞中释放并影响该细胞和/或周围细胞的存活或功能的其他可溶性因子。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为cDNA，其能够恢复携带该基因中的遗传突变的人或动物的蛋白质功能。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为cDNA，其编码可用于控制或改变细胞活性或状态的蛋白质。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为cDNA，其编码用于评估细胞状态的蛋白质或核酸。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为用于进行基因组工程的cDNA和/或相关RNA。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为通过同源重组进行基因组编辑的序列。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为编码治疗性RNA的DNA序列。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为shRNA或人工miRNA递送系统。在一些实施方案中，所述核酸序列可以为影响内源基因剪接的DNA序列。
如本文所用，“目标蛋白”可以为任意蛋白，包括天然存在的蛋白和非天然存在的蛋白。在一些实施方案中，编码一种或多种目标蛋白的多核苷酸可以存在于本文公开的AAV载体的一者中，其中多核苷酸与启动子有效地连接。在一些情况下，启动子可以驱动目标蛋白在宿主细胞(例如，人类神经元)中的表达。在一些实施方案中，目标蛋白为抗tau抗体、抗AB抗体、ApoE同种型。
目标蛋白的实例包括但不限于萤光素酶；荧光蛋白(例如，GFP)；生长激素(GHs)及其变体；胰岛素样生长因子(IGFs)及其变体；粒细胞集落刺激因子(G-CSFs)及其变体；促红细胞生成素(EPO)及其变体；胰岛素，如胰岛素原、前胰岛素原、胰岛素、胰岛素类似物等；抗体及其变体，如杂合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单克隆抗体；抗体的抗原结合片段(Fab片段)、抗体的单链可变片段(scFV片段)；肌营养不良蛋白及其变体；凝血因子及其变体；囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)及其变体；以及干扰素及其变体。
在一些实施方案中，目标蛋白为治疗性蛋白或其变体。治疗性蛋白的非限制性实例包括血液因子，如β-球蛋白、血红蛋白、组织纤溶酶原激活物和凝血因子；集落刺激因子(CSF)；白介素，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等；生长因子，如角质形成细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、纤维母细胞生长因子(FGF，如碱性FGF和酸性FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、生长分化因子-9(GDF-9)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、血小板源生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)等；可溶性受体，如可溶性TNF-α受体、可溶性VEGF受体、可溶性白介素受体(例如，可溶性IL-1受体和可溶性II型IL-1受体)、可溶性γ/δT细胞受体、可溶性受体的配体结合片段等；酶，如α-葡萄糖苷酶、伊米苷酶、β-葡糖脑苷脂酶和阿糖脑苷酶；酶激活因子，如组织型纤溶酶原激活因子；趋化因子，如IP-10、γ干扰素诱导的单核因子(Mig)、Groα/IL-8、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、PF-4等；血管生成剂，如血管内皮生长因子(VEGFs，例如VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2)、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子、胶质瘤源性生长因子、血管生成素、血管生成素-2等；抗血管生成剂，如可溶性VEGF受体；蛋白疫苗；神经活性肽，如神经生长因子(NGF)、缓激肽、缩胆囊素、胃泌素、促胰液素、催产素、促性腺激素释放激素、β-内啡肽、脑啡肽、P物质、生长抑素、催乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、铃蟾肽、强啡肽、华法林、神经降压肽、胃动素、促甲状腺素、神经肽Y、黄体生成素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、血管升压素、血管紧张素II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽等；血栓溶解剂；心房钠尿肽；松弛肽；胶质原纤维酸性蛋白；卵泡刺激素(FSH)；人α-1抗胰蛋白酶；白血病抑制因子(LIF)；转化生长因子(TGFs)；组织因子、黄体生成素；巨噬细胞活化因子；肿瘤坏死因子(TNF)；嗜中性粒细胞趋化因子(NCF)；神经生长因子；组织金属蛋白酶抑制剂；血管活性肠肽；血管生成素；血管趋向肽；血纤蛋白；蛭素；IL-1受体拮抗剂等。目标蛋白的一些其他非限制性实例包括睫状神经营养因子(CNTF)；脑源性神经营养因子(BDNF)；神经营养因子3和4/5(NT-3和4/5)；胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)；芳香氨基酸脱羧酶(AADC)；血友病相关的凝血蛋白，如因子VIII、因子IX、因子X；抗肌萎缩蛋白或nini-抗肌萎缩蛋白；溶酶体酸性脂肪酶；苯丙氨酸羟化酶(PAH)；糖原贮积病相关酶，如葡萄糖-6-磷酸酶、酸性麦芽糖酶、糖原脱支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶(例如，PHKA2)、葡萄糖转运蛋白(例如，GLUT2)、醛缩酶A、β-烯醇酶和糖原合成酶；溶酶体酶(例如，β-N-乙酰己糖胺酶A)以及它们的任意变体。
在一些实施方案中，目标蛋白为蛋白的活性片段，所述蛋白如任意上述的蛋白。在一些实施方案中，目标蛋白为融合蛋白，其包含两种或多种蛋白中的一些或全部。在一些实施方案中，融合蛋白可以包含任意上述蛋白的全部或部分。
在一些实施方案中，病毒载体包含多核苷酸，所述多核苷酸其包括两种或多种目标蛋白的编码区。两种或多种目标蛋白可以为彼此相同的或不同的。在一些实施方案中，所述两种或多种目标蛋白为相关多肽，例如相同抗体的一个或多个轻链以及一个或多个重链。
在一些实施方案中，目标蛋白为多亚基蛋白。例如，目标蛋白可以包括两个或多个亚基，或者两个或多个独立的多肽链。在一些实施方案中，目标蛋白可以为抗体。抗体的实例包括但不限于各种同种型的抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM)；通过本领域技术人员已知的任何方式产生的单克隆抗体，包括单克隆抗体的抗原结合片段；人源化抗体；嵌合抗体；单链抗体；抗体片段，如Fv、F(ab')2、Fab'、Fab、Facb、scFv等；只要抗体能够结合抗原。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，目标蛋白不是免疫粘附素。
在一些实施方案中，所得的靶向分子可以用于涉及体内基因转移应用于长龄细胞群的方法和/或疗法中。在一些实施方案中，这些可以应用于任何基于rAAV的基因疗法，包括例如：脊髓性肌萎缩症(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、弗里德赖希氏共济失调症、庞贝病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、巴滕病、溶酶体贮积症、多形性成胶质细胞瘤、雷特综合征、莱伯氏先天性黑蒙、慢性疼痛、中风、脊髓损伤、创伤性脑损伤和溶酶体贮积症。此外，rAAV还可以用于为了非治疗性科学研究的转基因的体内递送，如光遗传学、基因过表达、使用shRNA或miRNA的基因敲低、使用miRNA海绵或诱饵调节内源性miRNA、用于条件基因缺失的重组酶递送、条件(重组酶依赖)表达或用CRISPRs、TALENs和锌指核酸酶进行基因编辑。
本文提供了使用本文所述的方法和组合物治疗和/或预防亨廷顿氏病的方法。治疗和/或预防亨廷顿氏病的方法可以包括鉴别受试者，如本文提供的，提供用于将多核苷酸递送至受试者的神经系统的载体，以有效剂量对受试者施用载体，从而治疗和/或预防受试者的亨廷顿氏病。在一些实施方案中，用于治疗患有亨廷顿氏病的受试者的方法涉及这样的组合物，其中所述载体递送含有锌指蛋白(ZFP)的多核苷酸组合物，将所述ZFP设计成能够抑制亨廷顿蛋白(HTT)基因的转录。在一些实施方案中，通过以CAG重复长度依赖性方式与HTT基因的CAG重复区域结合，使ZFP选择性地抑制引起受试者的亨廷顿氏病的HTT基因等位基因的转录。在一些实施方案中，ZNFTR选择性地抑制HTT基因的两个等位基因的转录。
在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含短发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)，其通过引起RNA分子的选择性降解或抑制从RNA分子的翻译来敲低(knockdown)亨廷顿蛋白的表达，所述RNA分子通过与CAG重复序列结合而转录自引起疾病的HTT等位基因。在一些实施方案中，治疗患有亨廷顿氏病的患者的方法包括将亨廷顿蛋白特异性微小RNA表达盒掺入到rAVV基因组中。然后可以将其包装到公开用于经由脉管系统递送的序列变体的一者中。
在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含短发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)，其通过引起RNA分子的降解或抑制从RNA分子的翻译来敲低亨廷顿蛋白的表达，所述RNA分子转录自HTT基因的两个等位基因的一者或两者。在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含短发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)，其通过引起RNA分子的选择性降解或抑制从RNA分子的翻译来敲低亨廷顿蛋白的表达，所述RNA分子通过选择性识别引起疾病的等位基因中存在的一种或多种核苷酸多态性而转录自引起疾病的HTT等位基因。本领域技术人员可以使用核苷酸多态性来区分正常的等位基因和引起疾病的等位基因。
在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含多核苷酸，其编码改变HTTRNA的剪接或产生的RNA或蛋白质。在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含多核苷酸，其编码一种或多种多肽和/或RNA，用于使用转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或由本领域技术人员设计的聚集的规则间隔短回文形式的重复序列，即cas9基因(CRISPR/Cap9)系统进行基因组编辑，从而引起HTT基因内或附近的DNA切口或双链DNA断裂以引起HTT基因序列的改变。在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含多核苷酸，其编码多肽，该多肽能够结合来自HTT基因的多肽，改变来自HTT基因的多肽的构象或者改变来自HTT基因的多肽组装到聚集体内或者改变来自HTT基因的多肽的半衰期。在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含多核苷酸，其编码能够引起或防止来自HTT基因的多肽的转录后修饰的RNA或多肽。在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含多核苷酸，其编码来自本领域技术人员已知的伴侣蛋白的多肽，从而影响来自HTT基因的多肽的构象和/或稳定性。
在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包括本领域技术人员已知的调节元件，以影响由受试者的所需细胞内的多核苷酸编码的RNA和/或蛋白质产物的表达。
在一些实施方案中，待施用于受试者的治疗性物质包含适用于任意所选的疾病或病症的治疗性物质。在一些实施方案中，其可包括使用本文所述的方法和组合物治疗和/或预防阿尔茨海默氏病的组合物，例如，用于阿尔茨海默氏病的ApoE2或ApoE3；用于治疗SMA的SMN；用于治疗弗里德赖希氏共济失调的共济蛋白递送；和/或用于治疗ALS的shRNA或miRNA。
在一些实施方案中，本文的变体可用作将基因导入心肌的有效手段。这样做可能有助于研究和治疗许多不同的疾病和损伤，包括弗里德赖希氏共济失调、心力衰竭、缺血性心脏病、心脏肥大、慢性疼痛和外周神经损伤。在一些实施方案中，当通过脉管系统施用时，本文的变体可用于转导外周神经。
在一些实施方案中，用于递送的治疗性物质为基于蛋白质(对蛋白质进行编码)或RNA的策略，其能够减少用于治疗帕金森氏病的突触核蛋白的聚集。例如，递送编码抗聚集的突触核蛋白变体的多核苷酸，从而破坏内源性突触核蛋白的聚集。
在一些实施方案中，对用于治疗AD、PD、ALS、SMA或HD的营养因子进行编码的转基因可以作为涉及的治疗性物质。在一些实施方案中，可以使用营养因子，并且营养因子可以包括(例如)BDNF、GDNF、NGF、LIF和/或CNTF。
病毒载体的剂量可以主要取决于诸如被治疗的病症、患者的年龄、体重和健康之类的因素，并且可能因此在患者中存在不同。例如，病毒载体的治疗有效的人用剂量范围通常为约0.1ml至约100ml含有浓度为约1×109至1×1016的基因组病毒载体的溶液。优选的人用剂量可以为约1×1013至1×1016的AAV基因组。将对剂量进行调整以平衡治疗效果与任何副作用，并且这种剂量可能根据使用重组载体的治疗用途而变化。可以监测转基因的表达水平，以确定由载体产生的剂量频率。
在一些实施方案中，载体还可以包含本领域技术人员已知的调节控制元件，以影响由受试者的所需细胞中的多核苷酸编码的RNA和/或蛋白质产物的表达。
在一些实施方案中，在功能上，多核苷酸的表达至少部分地由有效连接的调控元件控制，使得所述元件调节多核苷酸的转录、由多核苷酸编码的RNA的转运、加工和稳定性以及(适当时)转录物的翻译。表达控制元件的具体实例为启动子，其通常位于转录序列的5'末端。表达控制元件的另一个实例为增强子，其可以位于转录序列的5'末端或3'末端，或位于转录序列内。调控元件的另一个实例为微小RNA的识别序列。调控元件的另一个实例为内含子和调控所述内含子的剪接的剪接供体序列和剪接受体序列。调控元件的另一个实例为转录终止信号和/或聚腺苷酸化序列。
表达控制元件和启动子包括在特定组织或细胞类型中有活性的元件，在本文中被称为“组织特异性表达控制元件/启动子”。组织特异性表达控制元件通常在特定细胞或组织(例如在肝脏、脑、中枢神经系统、脊髓、眼睛、视网膜或肺中)中具有活性。表达控制元件通常在这些细胞、组织或器官中有活性，是因为它们能够被特定细胞、组织或器官类型所特有的转录激活蛋白或转录的其他调控因子识别。
表达控制元件还包括普遍存在的或混杂的启动子/增强子，其能够驱动多种不同细胞类型中的多核苷酸的表达。此类元件包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子序列、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列以及在多种哺乳动物细胞类型中有活性的其他病毒启动子/增强子；来自普遍表达或混杂表达的哺乳动物基因的启动子/增强子序列，其包括但不限于β肌动蛋白、泛素或EF1α；或者在自然界中不存在的合成元件。
表达控制元件还可以以可调节的方式赋予表达，即，信号或刺激提高或降低有效连接的多核苷酸的表达。响应信号或刺激而提高有效连接的多核苷酸的表达的可调节元件也被称为“诱导型元件”(即，其由信号引起)。具体实例包括但不限于激素(例如，类固醇)诱导型启动子。响应信号或刺激而降低有效连接的多核苷酸的表达的可调节元件被称为“阻遏型元件”(即，信号降低表达，使得当信号被去除或不存在时，表达增加)。典型地，由此类元件赋予的增加或减少的量与信号或刺激存在的量成比例；信号或刺激的量越大，表达的增加或减少越多。
在一些实施方案中，具有包含一种或多种本文公开的靶向肽的衣壳蛋白的rAAV可用于有效地转导神经系统。这使得rAAV可用于治疗例如亨廷顿氏病(HD)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症、I型和II型脊髓性肌萎缩症、弗里德赖希氏共济失调、脊髓小脑共济失调以及任意的溶酶体贮积症，溶酶体贮积症包括但不限于克拉贝病、桑德霍夫病、黑蒙性家族痴呆症、戈谢病(I型、II型或III型)、尼曼-皮克病(NPC1或NPC2缺陷)、赫尔勒综合征、庞贝病和/或巴滕病。
在一些实施方案中，具有包含一种或多种本文公开的靶向肽的衣壳蛋白的rAAV可用于有效地转导心肌、外周神经或它们的任意组合。这使得rAAV可用于递送治疗剂以治疗例如弗里德赖希氏共济失调、心力衰竭、缺血性心脏病、心脏肥大、慢性疼痛和/或外周神经损伤。
在一些实施方案中，具有包含一种或多种本文公开的靶向肽的衣壳蛋白的rAAV可用于将基因递送至受试者的靶标环境中的特定细胞类型。例如，rAAV可用于将基因递送至受试者(例如哺乳动物)的神经系统(包括PNS、CNS或者PNS和CNS两者)中的神经元和神经胶质。靶向肽可以为(例如)AAV-PHP.N(SEQ ID NO：46)。本文公开的组合物和方法可用于(例如)(i)通过(例如)在rAAV基因组内掺入亨廷顿蛋白特异性微小RNA表达盒并将rAAV基因组包装到rAAV变体(例如，AAV-PHP.N)中用于经由(例如)脉管系统递送来降低患有亨廷顿氏病的患者体内的突变亨廷顿蛋白的表达，(ii)将共济蛋白基因的功能性拷贝递送至患有弗里德赖希氏共济失调的患者，(iii)在由于基因突变而缺乏酶表达的患者(例如，患有尼曼-皮克病、III型粘多糖病和/或戈谢病的患者)体内，恢复对正常溶酶体功能至关重要的酶的表达，(iv)使用rAAV(例如，AAV-PHP.N)产生疾病的动物模型，或者它们的组合。
药物组合物和施用方法
本文还公开了药物组合物，其包含一种或多种本文公开的rAAV病毒和一种或多种可药用的载体。该组合物还可以包含其他成分，如稀释剂、稳定剂、赋形剂和佐剂。如本文所用，“可药用的”载体、赋形剂，稀释剂，佐剂或稳定剂为以采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或受试者为无毒的(优选惰性的)或具有由熟练从业人员确定的可接受的毒性水平的那些。
载体、稀释剂和佐剂可以包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽(例如，少于约10个残基)；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如TweenTM、PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，生理上可接受的载体为pH缓冲水溶液。
待施用的rAAV的滴度将根据(例如)具体的rAAV、施用方式、治疗目标、个体和靶细胞类型而不同，并且可以通过本领域标准方法确定。
对于本领域技术人员显而易见的是，待施用的重组病毒的有效体内剂量和具体的施用方式将根据年龄、体重、痛苦的严重程度和治疗的动物种类、所用的表达目标蛋白的具体重组病毒以及采用重组病毒用于特定的用途而不同。有效剂量水平，即获得所需结果必需的剂量水平的确定，可由本领域技术人员使用常规药理方法实现。典型地，产品的人临床应用以较低的剂量水平开始，增加剂量水平直到获得预期效果。或者，可使用体外可接受的研究以使用已建立的药理方法确立通过本发明方法鉴定的组合物的有效剂量和施用途径。
尽管将基于逐个药物来确定确切的剂量，但在大部分情况下，可以作出一些关于剂量的概括。在一些实施方案中，用于将核酸递送至受试者的神经系统(例如，CNS)的rAAV可以(例如)以这样的剂量通过注射施用于受试者，即每kg受试者的1x1010基因组拷贝(GC)的重组病毒和每kg 2x1014之间的剂量，例如，5x1011 GC/kg和5x1012GC/kg之间。在一些实施方案中，施用于受试者的rAAV的剂量不超过每kg 2x1014 GC。在一些实施方案中，施用于受试者的rAAV的剂量不超过每kg 5x1012 GC。在一些实施方案中，施用于受试者的rAAV的剂量不超过每kg5x1011 GC。
可以将本文公开的重组病毒施用于需要其的受试者(例如，人)。对于施用途径没有特别限制。例如，可以通过本领域标准的途径将重组病毒的治疗有效的量施用于受试者。途径的非限制性实例包括肌肉内、阴道内、静脉内、腹膜内、皮下的、表皮的、皮内的、直肠的、眼内的、肺的、颅内的、骨内的、口内的、颊的、系统的或鼻的。在一些实施方案中，通过系统转导将重组病毒施用于受试者。在一些实施方案中，通过肌内注射将重组病毒施用于受试者。在一些实施方案中，通过阴道内注射将重组病毒施用于受试者。在一些实施方案中，通过非肠道途径(例如，通过静脉内、肌肉内或皮下注射)、通过表面划破(surfacescarification)或通过接种到受试者的体腔中将rAAV施用于受试者。施用途径和rAAV病毒的AAV成分的血清型可由本领域技术人员考虑到被治疗的感染和/或疾病病情以及表达目标蛋白的靶细胞/组织容易确定。在一些实施方案中，通过静脉内施用来施用rAAV可能是有利的。
rAAV的实际施用可以通过使用将rAAV运输到受试者的靶组织中的任意物理方法来完成。例如，可以静脉内施用rAAV。如本文所公开的，可以修饰rAAV的衣壳蛋白，使得rAAV靶向特定的感兴趣的靶标环境，如中枢神经系统，并增强对感兴趣的靶标环境的趋向性(例如，CNS趋向性)。在一些实施方案中，rAAV将核酸递送至心脏、外周神经或它们的组合。药物组合物可以制备成(例如)可注射制剂。
待使用的重组病毒可以以液体或冷冻干燥形式(与一种或多种合适的防腐剂和/或在冷冻干燥过程中保护病毒的保护剂组合)被利用。关于基因治疗(例如，可以通过特定基因产物而改善的神经障碍)，将表达治疗性蛋白的重组病毒的治疗有效剂量施用于需要此治疗的宿主。本文公开的重组病毒在制造用于诱导宿主中的免疫力或向宿主提供基因治疗的药剂中的用途在本申请的范围内。
在rAAV的人用剂量已对至少一些病症确立的情况下，可以施用那些相同的剂量，或在确立的人用剂量的约0.1％和500％之间的剂量，更优选在约25％和250％之间的剂量。在没有确立人用剂量的情况下，如对于新发现的药物组合物的情况，可以从ED50或ID50值或源自体外或体内研究，如动物中的毒性研究和功效研究证明合格的其他合适的值来推断合适的人用剂量。
可以在各种时间点向受试者施用治疗有效量的rAAV。例如，可以在受试者患有疾病或病症之前、期间或之后将rAAV施用于受试者。还可以在疾病或病症(例如，亨廷顿氏病(HD)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症、I型和II型脊髓性肌萎缩症、弗里德赖希氏共济失调症、脊髓小脑性共济失调以及任意的涉及CNS内细胞的溶酶体贮积症，溶酶体贮积症包括但不限于克拉贝病、桑德霍夫病、黑蒙性家族痴呆症、戈谢病(I型、II型或III型)、尼曼-皮克病(NPC1或NPC2缺陷)、赫尔勒综合征、庞贝病、巴滕病或它们的任意组合)慢性疼痛、心力衰竭、心律失常或它们的组合出现之前、期间或之后将rAAV施用于受试者。在一些实施方案中，在疾病或病症的缓解期间将rAAV施用于受试者。在一些实施方案中，在疾病或病症发作之前将rAAV施用于受试者。在一些实施方案中，将rAAV施用于具有发展成疾病或病症风险的受试者。
rAAV病毒的施用频率可以不同。例如，可以约每周一次、约每两周一次、约每月一次、约每六个月一次、约每年一次、约每两年一次、约每三年一次、约每四年一次、约每五年一次、约每六年一次、约每七年一次、约每八年一次、约每九年一次、约每十年一次或约每十五年一次将rAAV病毒施用于受试者。在一些实施方案中，至多约每周一次、至多约每两周一次、至多约每月一次、至多约每六个月一次、至多约每年一次、至多约每两年一次、至多约每三年一次、至多约每四年一次、至多约每五年一次、至多约每六年一次、至多约每七年一次、至多约每八年一次、至多约每九年一次、至多约每十年一次或至多约每十五年一次将rAAV病毒施用于受试者。
实施例
在以下实施例中进一步详细地公开了上述实施方案的一些方面，这些实施例并非旨在以任何方式限制本公开的范围。
实施例1
使AAV-PHP.B进化以生成变体
为了进化出能够提供更高的CNS转导和更具选择性的神经元转导的AAV-PHP.B的变体，通过将7聚体序列的3个氨基酸和7聚体侧翼的2个氨基酸重叠置换为随机的氨基酸，从而将美国专利公开No.2015/0079038(将其内容通过全文引用并入本文)中描述的AAV-PHP.B 7聚体序列(SEQ ID NO：40)部分地随机化。图1示出了用于使AAV-PHP.B进化的这一策略的概述(X表示20种标准氨基酸中的任意一种)。
AAV-PHP.N
在两轮筛选以后，发现许多变体富集在从一种或多种Cre细胞系中回收的序列中。选择其中一种序列AAV-PHP.N(DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：4))作为单个变体进行表征。
序列DGTLAVPFKAQ占从Vgat-IRES-Cre小鼠回收的总序列的8.1％、从Vglut2-IRES-Cre小鼠回收的序列的4.4％、从GFAP-Cre小鼠回收的序列的0％及从肝脏回收的序列的0％(非cre依赖性回收)。基于这些数据，据信DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：4)将会选择性地在用星形胶质细胞转导神经元时更为有效。DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：4)氨基酸序列独立地选自2个不同的核苷酸序列：(i)GAT GGG ACT TTG GCG GTG CCT TTT AAG GCA CAG(SEQ IDNO：54)，(ii)GAT GGG ACG TTG GCG GTG CCT TTT AAG GCA CAG(SEQ ID NO：55)。在两轮筛选以后，具有一致性的共有序列D/ES/G-TLAVPFK(SEQ ID NO：40)占从Vgat-IRES-Cre小鼠回收的总序列的18.9％，占从Vglut2-IRES-Cre小鼠回收的序列的15.6％，占从GFAP-Cre小鼠回收的序列的8.3％，占从肝脏回收(非cre依赖性回收)的序列的0％。
图2示出了AAV-PHP.N(DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：4))的数据。通过使用本文公开的CREATE方法，使得含有AAV-PHP.N序列(SEQ ID NO：46)的衣壳的识别成为可能，从而在多个Cre转基因小鼠品系中进行同时筛选。总之，结论为(i)AAV-PHP.N序列(SEQ ID NO：46)选择性地回收自CNS神经元，而不是回收自CNS星形胶质细胞或肝脏以及(ii)AAV-PHP.N衣壳提供了选择性地增强神经元的转导，而不是神经胶质和肝脏的转导(相比于AAV-PHP.B)，证明了在多种细胞类型中进行体内筛选从而设计具有更理想的转导特征的有用性。
AAV-PHP.S
通过筛选更有效地靶向表达GFAP-Cre的细胞的AAV衣壳，从而发现了AAV-PHP.S变体(SEQ ID NO：47)。从文库中鉴定变体，其中将7AA(7聚体)的随机化序列插入到衣壳蛋白(VP1编号)的氨基酸588至589之间。AAV-PHP.S具有7聚体序列QAVRTSL(SEQ ID NO：37)，其由核酸序列CAG GCG GTT AGG ACG TCT TTG(SEQ ID NO：56)编码。
AAV9为用于基因导入心肌的主要候选载体，并且还在通过脉管系统施用时提供外周神经的转导。图3A至图3D所示的数据证明，与不含有AAV-PHP.S靶向肽的AAV9(SEQ IDNO：45)相比，系统递送的AAV-PHP.S(SEQ ID NO：47)在心脏和感觉神经中提供了显著更多的表达。
实施例2
使用基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE)回收新型AAV衣壳序列
定向进化已用于产生逃避中和抗体的AAV(Maheshri等2006)和更好的靶向神经胶质瘤细胞(McGuire等2010)、气道上皮细胞(Excoffon等2009)以及玻璃体内注射之后视网膜内的光感受器(Dalkara等2013)。此外，使用人/小鼠嵌合肝模型(Lisowski等)开发了一种特异性且有效靶向人肝细胞的rAAV(2013)。本文描述的一些实施方案提供了使用重组依赖性回收策略从序列变体文库中富集和选择性回收具有所需特性的序列的方法。
已经用于开发具有改进的组织/细胞类型靶向的rAAV的一种方法是在AAV衣壳基因上进行定向进化。通常，这通过制备有复制能力的AAV的文库来完成，对所述有复制能力的AAV进行修饰以将随机突变引入到AAV cap基因中，其编码决定组织趋向性的衣壳蛋白。然后将AAV衣壳病毒文库注射到动物体内或递送至培养的细胞中。一段时间后，回收存在于目标细胞/组织中的衣壳序列。然后使用这些回收的序列生成新的病毒库，然后重复该过程。通过反复轮次的筛选/序列回收，将富集能够产生具有更好的功能的衣壳的序列(即，重复地通过筛选过程的序列)。然后可以回收表现出改进的转导靶标能力的衣壳，并将其评估为单个克隆或进一步突变并进行另外的轮次的筛选。
该实施例描述了用于被称为基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE)的筛选策略的方法和材料，CREATE能够开发在体内更有效地转导确定的Cre表达细胞群的AAV衣壳。如本文所述，CREATE用于产生AAV变体，其在静脉内注射后有效且广泛地转导成年小鼠中枢神经系统(CNS)。使用该方法产生的变体可以在整个CNS中转移基因，其效率有时是当前标准品(AAV914-17)效率的40倍，并且跨多个CNS区域转导大部分星形胶质细胞和神经元。在体外应用中，变体可以比AAV9更有效地转导人神经元和星形胶质细胞，证明了CREATE生产用于生物医学用途的定制AAV载体的潜力。
实验材料与方法
修饰rAAV-Cap-in-cis-lox基因组质粒的方法
rAAV-Cap-in-cis-lox基因组质粒包括侧翼为AAV2 ITR的三个主要元件：(i)mCherry表达盒，包含mCherry cDNA上游的人UBC基因的398bp片段及随后的合成多腺苷酸化序列40；(ii)AAV9衣壳基因和调控序列，其包含AAV5 p41启动子序列(GenBankAF085716.1的1680-1974)和取自AAV2 rep基因的剪接序列；(iii)Cre依赖性开关，其包含侧翼为反向lox71和lox66位点的SV40多腺苷酸化序列(pA)。进一步修饰rAAV-Cap-in-cis-lox基因组质粒，从而在衣壳序列中引入两个独特的限制性酶切位点XbaI和AgeI。这些位点位于区域(AA450至AA592)的侧翼，所述区域被随机化的文库片段取代。XbaI位点的引入引起了K449R突变，其对载体的产生或转导没有明显影响。需要插入AgeI位点的突变为沉默的。对于用于衣壳文库克隆的rAAV-ΔCap-in-cis受体质粒，除去XbaI位点和AgeI位点之间的编码区以防止由缺少文库片段的受体质粒产生病毒。
作为文库片段的模板，经修饰的AAV9的跨越XbaI位点和AgeI位点的区域为PCR扩增的。修饰该序列以除去独特的EarI限制性酶切位点并插入独特的KpnI位点(两者均为沉默突变)，从而产生xE片段。将经修饰的xE片段TA克隆到pCRII(Life Technologies)中以产生pCRII-9Cap-xE。消除EarI位点提供了第二种方法，如果需要，可以用于选择性地消化通过PCR回收的受污染(AAV9)的衣壳序列，但不消化源自文库的序列。使用rAAV-ΔCap-in-cis受体克隆文库并采取标准化PCR预防措施(例如，UV处理试剂和移液器)足以防止污染。
通过在VP1 AAs：6、10、142、148和216处将5个终止密码子引入到AAV9基因的VP阅读框架的编码序列中来构建AAV2/9REP-AAP辅助质粒。将位于AA216的终止密码子设计成不破坏AAP蛋白的编码序列，在另一种阅读框架内编码AAP蛋白。
在该研究中使用了若干rAAV基因组。每个都在单链(ss)rAAV基因组内构建，单链rAAV基因组具有由普遍存在的CMV-β-肌动蛋白-内含子-β-球蛋白杂合启动子(CAG)驱动的报道基因。为简单起见，载体描述在文中已经缩写。ssAAV-CAG-GFP是指ssAAV-CAG-eGFP-2A-Luc-WPRE-SV40 polyA。ssAAV-CAG-NLS-GFP是指ssAAV-CAG-NLSGFP-WPRE-SV40polyA，其通过在GFP的N-和C-末端两者插入核定位序列PKKKRKV而构建。ssAAV-CAG-mNeGreen-f是指具有人生长激素polyA信号的ssAAV-CAGmNeonGreen-f-WPRE。用来自c-Ha-Ras的膜靶向(法尼基化和棕榈酰化信号)序列修饰mNeonGreen。
衣壳蛋白文库产生的方法
使用Q5热启动高保真DNA聚合酶(NEB；M0493)、引物XF和7xMNN以及pCRII-9Cap-xE作为模板，通过PCR产生随机7聚体文库片段(插入到氨基酸588和589之间)。示出大概的引物结合位点的示意图示于图8A至图8B，而表2提供了引物序列。为了产生基于rAAV的文库，使用Gibson组装(NEB；E2611)组装含有文库以及XbaI和AgeI消化的rAAV-ΔCap-in-cis受体质粒的PCR产物。然后用质粒安全(PS)DNA酶(Epicentre；E3105K)处理反应产物以消化任何未组装的片段，并使用QIAquick PCR纯化套件(Qiagen)进行纯化。该反应通常产生超过100ng的组装质粒(由PS DNA酶消化步骤后剩余的DNA的量来定义)。100ng足以在10ng/皿下转染10个150mm组织培养皿。应注意，也可以通过连接或Gibson组装，然后在大肠杆菌中扩增来构建文库，但细菌转化降低了文库多样性。通过直接转染组装的反应产物，文库多样性反而受限于成功转染的HEK293生产细胞的数量。
表2.引物序列
病毒的生产和纯化方法
使用聚乙烯亚胺(PEI)通过293T细胞(ATCC)的三重转染生产重组AAV。在转染后72小时从培养基中并在120小时从细胞和培养基中收获病毒颗粒。将细胞沉淀重悬浮于含有2mM MgCl2、pH 8的10mM的Tris中，冻融三次，并在37℃下用100U/mL的核酸酶(Epicentre)处理至少1小时。通过用含有500mM氯化钠的8％聚乙二醇8000(Sigma-Aldrich)沉淀来对病毒培养基进行浓缩，将其重悬于Tris-MgCl2中，然后添加到裂解液中。然后将合并的原液调节至500mM NaCl，在37℃下孵育30分钟，并通过以2000x g的离心进行澄清。然后用碘克沙醇(Optiprep，Sigma；D1556)对澄清的原液进行不连续梯度(15％、25％、40％和60％)纯化。将病毒浓缩并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制。通过使用线性化基因组质粒作为标准的qPCR来测定DNaseI抗性vg的数量，从而确定病毒滴度。
对于衣壳文库病毒的生产，对上述病毒生产方案进行了两次修改，从而减少可能由同一细胞中多个衣壳序列的存在而引起的嵌合衣壳的生产。首先，仅转染10ng的rAAV-Cap-in-cis文库质粒(每150mm培养皿)以增加大部分转染细胞仅接受一个衣壳变体序列的可能性。其次，在48小时(培养基)和60小时(细胞和培养基)收集病毒，而不是在如上所述的72小时和120小时收集病毒，从而使以释放到培养基中的Raav文库病毒对生产细胞的二次转导最小化。
动物
在小鼠GFAP启动子的控制下表达Cre的GFAP-Cre小鼠(012886)和C57B1/6J小鼠(000664)购自Jackson Laboratory(JAX)。通过将病毒注射到眶后窦中来进行rAAV载体的静脉内施用。将小鼠随机分配到预定样本量的组。这些分析未排除任何小鼠。实验者了解样本组。
体内筛选
对于GFAP-Cre小鼠中的筛选，将1x1011 vg的衣壳文库通过静脉注射到任一性别的成年Cre+小鼠中。注射后7天至8天，对小鼠实施安乐死并收集脑和脊髓。使用4ml至5ml的Trizol(Life Technologies；15596)从脑的一个半球和一半脊髓回收载体DNA。为了纯化病毒DNA，根据制造商的提取方案收集上部含水部分。我们发现含水部分含有大部分的病毒DNA基因组以及RNA。然后在37℃下通过用1uL的RNase A(Qiagen)处理过夜来消化RNA。接下来，使用两步PCR扩增策略从Cre重组的基因组中选择性地回收Cap序列。第一扩增步骤使用引物9CapF和CDF优先扩增Cre重组的rAAV-Cap-in-cis-lox序列(参见图8A至图8B)。使用Q5热启动高保真DNA聚合酶，以95℃20秒、60℃20秒和72℃30秒的20个至26个循环来进行PCR。然后以1:10或1:100稀释PCR产物，然后将其作为模板使用引物XF和AR进行第二次Cre非依赖性PCR反应(图8A至图8B和表2)。如上所述，第二次PCR产生克隆回到rAAV-ΔCap-in-cis受体质粒中的片段。然后将1μL的Gibson组装反应以1:10稀释并转化到SURE2感受态细胞(Agilent；200152)中，从而产生用于测序的单个克隆。
将示出富集迹象的变体克隆到AAV Rep-Cap质粒中并转化到DH5α感受态细胞(NEB)中。然后使用上述报道基因组中的一者对新型AAV Rep-Cap变体或作为对照的AAV2/9Rep-Cap进行评价。
载体生物分布
向6周龄雌性小鼠C57Bl/6小鼠静脉注射1x1011 vg的包装到指定的AAV衣壳中的ssAAV-CAG-GFP载体。将动物随机分配到组中。注射后25天，对小鼠实施安乐死，收集组织和指定的脑部区域并在-80℃下冷冻。使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue套件从组织样品中分离DNA。使用结合WPRE元件的PCR引物对载体基因组进行检测，并使用对小鼠胰高血糖素基因特异的引物以小鼠基因组对载体基因组进行归一化。使用已知浓度的线性化质粒标准品的连续稀释液进行绝对定量46。从生物分布研究中取出一个随机选择的注射AAV-PHP.B的动物用于组织学分析。
组织制备，免疫组织化学和成像
使用Nembutal对小鼠进行麻醉，并使用pH 7.4的室温(RT)下的0.1M的磷酸盐缓冲液(PB)，然后用新鲜制备的冰冷的含有4％多聚甲醛(PFA)的PB对小鼠进行心脏灌注。将脑在4％的PFA中后固定过夜，然后通过振动切片机切片或冷冻保护并通过低温恒温器切片。在含有10％山羊或驴血清和0.5％Triton X-100(GAD67染色不使用洗涤剂)的PBS中具有一抗和二抗的漂浮切片上进行IHC。使用的一抗为小鼠抗AAV衣壳(1:20；American ResearchProducts，03-65158，克隆B1)、兔抗GFP(1:1000；Invitrogen，A11122)、鸡抗GFP(1:1000；Abcam，ab13970)、小鼠抗CC1(1:200；Calbiochem，OP80)、兔抗GFAP(1:1000；Dako，Z0334)、小鼠抗NeuN(1:500；Millipore，MAB377)、兔抗IbaI(1:500；Biocare Medical，CP290)、小鼠抗钙结合蛋白D28K(1:200；Sigma，CB-955)、兔抗钙网膜蛋白(1:1000；Chemicon，AB5054)、小鼠抗GAD67(1:1000；Millipore，MAB5406)、豚鼠抗MAP2(1:1000；Synaptic Systems，188004)、小鼠抗小清蛋白(1:1000；Sigma)、酪氨酸羟化酶(1:1000，Aves)和兔抗CD31(1:50；Abcam，ab28364)。在室温下进行一抗孵育16小时至24小时。然后洗涤切片并与第二Alexa-缀合的抗体(1:1000；Invitrogen)孵育2小时至16小时。对于使用识别内部表位的B1抗体的衣壳检测，在37℃下将浮动切片用2M的HCl处理15分钟，然后用PBS充分洗涤之后用一抗进行孵育。对于一些图像，调整16位绿色通道(GFP)伽马，从而使存在于同一视野内的低和高GFP表达细胞能够可视化(没有过饱和)。在所有情况下，伽马或对比度的变化以及显微镜和激光的设置在各组图像中保持一致。使用配置有以下物镜的Zeiss LSM 780共聚焦显微镜拍摄图像：Fluar 5x/0.25M27Plan-Apochromat 10x/0.45M27(焦距2.0mm)、Plan-Apochromat25x/0.8Imm Corr DIC M27多次油浸和LD CApochromat 40x/1.1WKorr和Plan-Apochromat 100x/1.46油DIC物镜。使用Imaris(Bitplane)生成3D MIP图像和辅助影片。
细胞类型特异性转导的定量
将6周龄雌性小鼠随机分组，并静脉注射2x1012 vg的包装到AAV9、AAV-PHP.B或AAV-PHP.A中的ssAAV-CAG-NLS-GFP。三周后，如上所述对小鼠进行灌注并对脑部进行处理并对指定的抗原进行免疫染色。每组的动物数量是预先确定的；分析未排除任何动物。拍摄细胞类型特异性免疫染色和天然NLS-GFP荧光的共聚焦单平面图像。为了防止偏置，在图像采集之前，从仅观察细胞类型特异性免疫染色通道而确定的指定匹配区域获取图像，而不是从GFP表达来获取图像。同样地，通过观察IHC通道，通过首先计数并标记由细胞特异性抗原染色的每个细胞来进行细胞计数。接下来，对那些对于天然GFP荧光为阳性的标记的IHC+细胞进行计数。由于衣壳之间存在明显的转导效率差异，因此对计数的组知情。
组织清除
如上所述用60ml至80mL冰冷的含有4％PFA的PB以14mL/分钟的流速对小鼠进行灌注。然后将流速降至2mL/分钟至3mL/分钟并在室温下持续2小时。然后将小鼠置于单独的定制腔室中，并用200mL的RT下循环的含有4％丙烯酰胺的PB以2mL/分钟至3mL/分钟进行灌注过夜，然后用PB冲洗2小时，以从脉管系统中除去残留的聚合物/单体。通过将腔室置于42℃的水浴中并(通过灌注(2mL/分钟至3mL/分钟))递送200mL含有0.25％的VA-044引发剂的循环、脱气的PB 2小时至4小时来启动聚合过程。然后用含有8％SDS的PB(pH7.5)对小鼠进行7天的灌注。在7天期间将含有SDS的溶液更新两次，然后通过灌注2L的非循环性PB过夜将含有SDS的溶液冲掉。将清除的组织样品置于RIMS溶液(折射率为1.46)中用于成像。
从人iPSC产生皮质球状体
如前所述，从iPSC产生人皮质球状体。简言之，在以下培养基中，来自两个健康对照个体的iPSC系在灭活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上生长：DMEM/F12、敲除血清20％、1mM非必需氨基酸(1:100)、GlutaMax(1:200)、β-巯基乙醇(0.1mM)、青霉素和链霉素(1:100)(Life Technologies)。定期测试培养物并保持无支原体。用分散酶(0.35mg/ml，Invitrogen)完整地分离iPSC的集落，并转移至补充有dorsomorphin(5μM，Sigma)和SB-431542(10μM，Tocris)的iPSC培养基中的低附着板中，并且每天更换培养基。在体外分化的第6天，将神经球状体转移至NPC培养基(Neurobasal A、不含维生素A的B27、GlutaMax(1:100)、青霉素和链霉素；Life Technologies)，其中补充有EGF(20ng/ml)和FGF2(20ng/ml)直至第24天，然后从第25天至第42天补充BDNF(20ng/ml)和NT3(20ng/ml)。从第43天开始，将皮质球状体保持在NPC培养基中，每4天更换一次培养基。
皮质球状体的解离和病毒感染
对于单层细胞中的酶促解离和培养，在37℃下，将在体外分化第170天至200天的皮质球状体(来自一个个体的iPSC系的两个独立神经分化和来自另一个体的iPSC系的一个分化)与细胞消化液(Innovative Cell Technologies)一起孵育25分钟，用NPC培养基洗涤三次，并用P-200移液管轻轻吹打。将细胞以约300,000个细胞/孔接种在涂覆有聚鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃盖玻片(15mm)上，并在最初24小时保持在补充有BDNF(20ng/ml)和NT3(20ng/ml)的NPC培养基中，然后保持在不含生长因子的NPC培养基中。
以1x109 vg/孔的滴度用每种病毒感染在盖玻片上生长的培养物，并在5天后用4％的多聚甲醛(PFA)固定10分钟。对于免疫细胞化学，将细胞用0.2％的Triton X-100透化10分钟，并用含有10％山羊血清的PBS封闭1小时。然后将盖玻片与在封闭溶液中稀释的抗体一起孵育2小时。用Hoechst 33258(Life Technologies，1:10,000)使细胞核显现。
由使用40×物镜的Zeiss M1 Axioscope对细胞进行成像。对于每种实验条件，在每个盖玻片的10个随机视野的图像中对用GFAP或MAP2共标记的GFP+细胞的比例进行定量。给出的结果是两次单独的解离和感染实验的平均值。
为了用AAV感染完整的3D培养物，将在体外分化第197天的单个人皮质球状体转移到含有6x109 vg/400μl的NPC培养基的1.5ml Eppendorf管中过夜，并于7天后在4％的PFA中固定过夜。然后将固定的球状体转移到30％的蔗糖中24小时，包埋在O.C.T.(FisherScientific)中并切割成14μm的切片。对于免疫组织化学，用含有10％的山羊血清、0.3％Triton-X100的PBS封闭切片1小时。用Leica TCS SP8共聚焦显微镜获取图像。
使用CREATE生成rAAV变体
CREATE使用rAAV衣壳基因组(rAAV-Cap-in-cis-lox)，所述rAAV衣壳基因组受到来自AAV Rep基因的调节元件(图4B)的控制而将全长AAV Cap基因与Cre可逆开关(图4B)偶联。通过在rAAV-Cap-in-cis-lox骨架内构建衣壳文库并将病毒文库传递至在确定的细胞群中具有Cre表达的动物，该系统能够选择性扩增和回收已转导靶标群体的序列(图4C)。因为rAAV-Cap-in-cis-lox基因组缺乏功能性Rep基因，所以必须以反式提供Rep以用于病毒生产。为此目的，可以通过在每个衣壳蛋白VP1-3的阅读框架内插入框内终止密码子来修饰AAV2/9rep-cap质粒，从而消除衣壳蛋白的表达(图4D)。这些终止密码子不改变组装活化蛋白(AAP)的氨基酸序列，其由Cap基因内的替代阅读框架表达22。这种分裂的rAAV-Cap-in-cis-lox基因组和Rep-AAP AAV辅助系统有效地产生rAAV(图4E)并且是CREATE筛选平台的基础，其使得能够在异源组织样品中从遗传定义的Cre表达细胞群体中回收衣壳序列(参见图8A至图8B)。
在rAAV-Cap-in-cis-lox受体基因组内，通过在AAV9衣壳的AA588至AA589(VP1位置)之间插入随机序列(7聚体)的7个氨基酸(AA)，来产生AAV变体的文库(图4F至图4G)。为了筛选穿过BBB并在整个CNS中转导细胞的载体，将衣壳文库静脉施用到成年GFAP-Cre小鼠中，该小鼠在星形胶质细胞中表达Cre。一周后，从脑和脊髓组织中分离DNA，并通过PCR从已经历Cre介导的重组的病毒基因组中回收衣壳序列。将回收的Cap序列的整个文库克隆回到rAAV-Cap-in-cis-lox受体基因组中，从而产生GFAP1文库并随机筛选13个克隆用于测序。从GFAP1文库中回收的所有测试序列都是独特的，因此GFAP1质粒文库用于产生第二个病毒文库并在GFAP-Cre小鼠中进行另一轮筛选。在第二次筛选后，若干变体被富集(参见表3)并示出增强的CNS转导(图9A)。选择最为富集的变体AAV-PHP.B用于进一步的体内趋向性评估。AAV-PHP.B占回收文库序列的25％并编码7聚体序列TLAVPFK(SEQ ID NO：40)。
AAV-PHP.B和AAV9衣壳用于包装由普遍存在的CAG启动子(ssAAV-CAG-GFP)驱动的单链(ss)GFP报道载体。AAV-PHP.B和AAV9两者都以相似的效率产生病毒(图9B)。通过静脉注射向6周龄小鼠施用1x1012量的任一载体的载体基因组(vg)。三周后通过GFP表达来对转导进行评估。如通过对GFP免疫组织化学(IHC)(图5A)或几个脑部区域(图5B)、脊髓(图5C)和视网膜(图5D)中的天然eGFP荧光进行成像所示的，数据显示AAV-PHP.B以高效率转导整个成年CNS。使用基于PARS的CLARITY进行全身组织清除24，通过来自脊髓(图5C)、皮质和纹状体(图5E)的清除的组织切片来检测天然eGFP荧光。这些3D效果图证实了使用AAV-PHP.B载体能够进行广泛而有效的CNS转导。在CNS之外，AAV-PHP.B和AAV9的细胞水平趋向性在除胰脏之外的若干器官中看来相似，胰脏中AAV-PHP.B的转导效率与AAV9相比降低(图5f)。
为了量化与AAV9相比的由AAV-PHP.B将基因导入CNS和外周器官的效率，于注射后25天在若干脑部区域和器官中测定存在的病毒基因组的数量(图5G)。AAV-PHP.B提供了显著高于AAV9的向每个检测的CNS区域的基因转移：皮质(40倍)、纹状体(92倍)、丘脑(76倍)、小脑(41倍)以及脊髓(75倍)。CNS之外的载体基因组生物分布示出了AAV-PHP.B将基因导入胰脏和肾上腺的效率低于AAV9(图5G)。在肝脏、心脏、骨骼肌和肾脏中未发现两种载体之间的显著差异。当与CNS生物分布数据一起考虑时，在除小脑以外的所有CNS区域中，在经AAV-PHP.B处理的小鼠中检测到的病毒基因组的数量与在肝脏中检测的病毒基因组的数量相似(肝脏为由AAV921,25有效转导的器官)，并且比在其他器官中观察到的病毒基因组的数量更多。相反，向每个已检测的CNS区域的AAV9介导的基因转移至少比在肝脏中低120倍。因此，尽管AAV-PHP.B的趋向性不是CNS特异性的，但该载体的增强的基因转移特征是CNS特异性的。
当通过静脉递送至成年小鼠和非人灵长类动物时，AAV9优先转导星形胶质细胞，但AAV9也转导若干区域中的神经元。为了检验由AAV-PHP.B转导的细胞类型，分析了GFP与若干细胞类型标记物的共定位。由于高度有效的转导，在接受1x1012 vg AAV-PHP.B的小鼠中难以辨别表达GFP的单个星形胶质细胞(图5A)，但是通过在接受减少10倍病毒的动物(图5A至图5B)中星形胶质细胞的紧密的、高度分枝的过程并通过GFAP与IHC的共定位(图6A)可以更容易地在形态上识别。除星形胶质细胞以外，AAV-PHP.B转导CC1+少突胶质细胞(图6B)和所检测的所有神经元亚型，包括整个脑中的NeuN+(图6C)以及中脑酪氨酸羟化酶(TH)+多巴胺能神经元(图6D)、钙结合蛋白+小脑浦肯野细胞(图6E)和若干中间神经元群(图10A至图10D)。AAV-PHP.B还转导CD31+内皮细胞(图10E)，但似乎不转导Iba1+小胶质细胞(图10F至图10G)。在静脉内的AAV-PHP.B递送后观察到的GFP+小胶质细胞的缺乏与先前在该细胞群中罕见或不存在的AAV介导的基因表达的报道一致14,27-30。在施用AAV-PHP.B后一年内在整个脑中观察到来自GFP蛋白表达的天然GFP荧光，表明AAV-PHP.B能够提供长期的、CNS定向的转基因表达(图11)。
接下来，对由AAV-PHP.B转导的几种细胞类型的部分进行定量并与AAV9相比较。为了便于可靠的个体细胞计数，构建了在CAG启动子控制下表达核定位GFP(NLS-GFP)的载体ssAAV-CAG-NLS-GFP。在所检测的所有脑部区域中，单次注射2x1012vg/小鼠的ssAAV-PHP.B:CAG-NLS-GFP转导大部分Aldh1L1+星形胶质细胞(图6F和图12A)和NeuN+神经元(图6G和图12B)，以及适度部分的Olig2+少突胶质细胞系细胞(图6H和图12C)。在所有情况下，与相同剂量的AAV9相比，AAV-PHP.B提供显著增强的转导。特别是，AAV-PHP.B还在整个脊髓中转导超过94％的Chat+运动神经元(图6I)、91.4±1.6％的TH+中脑多巴胺能神经元(图12D)和91.7±5.8％的钙结合蛋白+浦肯野细胞(n＝5)。总之，AAV-PHP.B的成年动物静脉内施用能够有效地靶向成年小鼠中的多种神经元和神经胶质细胞类型。
用于识别AAV-PHP.B的方法仅筛选靶细胞群的转导；其未必筛选特异性。然而，在GFAP-Cre小鼠的单独试验中，(在两轮体内筛选后)识别了另一种AAV衣壳变体AAV-PHP.A。AAV-PHP.A包含7聚体序列YTLSQGW(SEQ ID NO：38)，与AAV9相比，其表现出更为有效和更具选择性的CNS星形胶质细胞转导(图7A至图7D)，以及降低的肝脏(图7E至图7F)和其他外周器官(图7F)的趋向性。AAV-PHP.A对比AAV9，将基因导入CNS比将基因导入肝脏的特异性增加为400倍对1200倍，这是由于增强的成年动物CNS基因转移(根据具体区域而多2.6倍至8倍)和减少的肝脏基因转移(152倍)的组合。相比于AAV9，在该试验中富集的两种其他变体(图9A)在CNS神经元或神经胶质中未示出GFP表达的增强。
为了确定AAV-PHP.A和AAV-PHP.B是否也可以转导人神经细胞，使用3D分化方法在皮质神经元和衍生自人诱导多能干细胞(hiPSCs)的星形胶质细胞上测试这些变体。将来自两个个体的HiPSC系分化为3D大脑皮质样结构(皮质球状体)，并在体外维持长达200天。老化的皮质球状体含有表层和深层皮质兴奋性神经元和高达20％的星形胶质细胞31。在以单层形式暴露于三种病毒的解离的皮质球状体中，与AAV9或AAV-PHP.A相比，AAVPHP.B更有效地转导表达GFAP的星形胶质细胞和表达MAP2的神经元两者(图12；双向ANOVA p<0.01，n＝3)。此外，全部三种病毒都能够转导完整的3D皮质球状体(图5C)。
在对于星形胶质细胞靶向的两个试验中，确定了变体AAV-PHP.B、B2和B3(图9)。这些变体提供神经元和神经胶质两者的广泛CNS转导，以及AAV-PHP.A提供了选择性更有效的星形胶质细胞转导。期望来自相同的筛选方案的对于具有独特性质的衣壳的鉴定考虑到所用的回收方法是选择用于星形胶质细胞转导的，而不是用于任意特定的中间步骤，例如脑血管缔合、BBB转胞吞作用或星形胶质细胞结合/内在化。因此，应该在筛选过程中回收在任意的这些中间步骤中更有效的衣壳变体。
通过对衣壳的免疫染色，发现不同于AAV9，AAV-PHP衣壳在静脉施用不久之后易于定位于脑部脉管系统(图14A至图14B)。此外，在施用后24小时，与接受AAV9或AAV-PHP.A的小鼠相比，在接受AAV-PHP.B的小鼠中，沿着脑部脉管系统观察到显著更多的GFP表达细胞(图14C至图14D)。与体内(图5A至图5G、图6A至图6I和图7A至图7F)和人神经培养物(图13A至图13C)中的AAV-PHP.B和AAV-PHP.A的转导特征一起考虑，这些数据表明虽然两种AAV-PHP载体都更有效地与脑部脉管系统结合，但它们在随后的细胞类型特异性进入或转运步骤中可能不同。
表3
使用CREATE，开发了新型AAV变体，其使在静脉施用后向成年小鼠的有效的广泛基因转移成为可能。该系统的一个重要优点为其引入了衣壳的选择性压力，所述衣壳介导有效的细胞内运输和单链病毒基因组转换为长期转导所必需的持久性双链DNA(dsDNA)形式(只有dsDNA基因组应该作为Cre的基底)。功能性衣壳的这种另外的选择性压力可能有助于在仅两轮体内筛选后在独立试验中鉴定(本文公开的)AAVPHP.A和AAV-PHP.B变体。相比之下，许多先前的体内和体外AAV衣壳筛选方法已经应用于3轮至10轮的筛选来确定具有增强特性的衣壳变体。
不受任何特定理论的束缚，据信CREATE可用于发现AAV衣壳变体，其能够靶向任意器官中确定的、CRE表达细胞类型。因此，CREATE不仅可用于转基因动物(如本文所示)，还可用于开发AAV变体，其能够靶向(i)球状体培养物或器官样培养物中的特定Cre+细胞类型，(ii)在非转基因动物中，通过(例如)病毒注射以得到基于群体、基于投影33或基于活性的Cre表达，从而产生Cre+的细胞或者(iii)在人类/小鼠嵌合动物中的Cre+人类细胞。考虑到所报道的动物模型和人类之间的AAV趋向性差异，用于开发改进的临床应用载体的理想方式可能为：在体内使用人Cre+细胞的筛选方案、在三维hiPSC衍生的细胞模型中的细胞特异性Cre表达的筛选方案或者将来的Cre转基因狨猴的筛选方案。此外，基于AAV的基因疗法(特别是那些需要全身递送的基因疗法)的成功，可能受到人群中存在的中和AAV衣壳抗体的阻碍。通过使用CREATE连同将AAV文库暴露于混合的人血清，人们可以设想同时选择具有保持或增强的转导特征的衣壳，其对抗体介导的中和也不太敏感。
CREATE还可以与下一代测序一起使用，从而在单独地测试变体之前更好地预测回收序列的特征。对从表达Cre的靶细胞中回收的整个变体库以及未选择的病毒库两者进行测序应该能够定量各回收序列的相对富集程度。此外，对从多个表达Cre或不表达Cre的群体中回收的衣壳进行测序可以在单个实验中提供在多种细胞类型中进行阳性和阴性筛选的手段。此类体内-计算机筛选方法应该增加CREATE的能力以增强向CNS和其他难以靶向的细胞群的基因转移。
本文公开了通过使用CREATE方法开发的新型CNS靶向序列。在一些实施方案中，制备了在AAV9衣壳蛋白的氨基酸588至599之间具有7聚体插入序列的DNA文库。在从DNA文库产生病毒文库后，使用CREATE方法来选择和回收新型AAV衣壳序列，新型AAV衣壳序列在施用后一周转导Cre表达细胞。从筛选过程中回收的变体示于表4。
表4
CREATE用于确定三种CNS群体的转导：GFAP-Cre(星形胶质细胞)、Vgat-IRES-Cre(GAGA能神经元)和Vglut2-IRES-Cre(谷氨酸能神经元的子集)。在从脑和脊髓分离DNA后，在2轮筛选后通过克隆和/或下一代测序评估回收的变体。该方法已经实现了对表现出有效CNS转导的载体的鉴定(参见表5)。发现许多鉴定的载体在CNS转导中比PHP.B更有效，例如PHP.B-DGT(PHP.N)、PHP.B-EST和PHP.B-ATT-T。
表5
实施例3
用于有效转导CNS神经元和神经胶质的AAV-PHP.B变体的制造方法
通过三个连续的氨基酸的位点饱和诱变进一步使AAV-PHP.B的7聚体肽和侧翼序列进化(参见图13)。通过PCR产生五个饱和文库(XXX1至XXX5)，以等量混合并用于产生DNA。DNA用于产生AAV衣壳文库。使用CREATE，并行进行筛选以转导三种CNS群体：GFAP-Cre(星形胶质细胞)、Vgat-IRES-Cre(GABA能神经元)和Vglut2-IRES-Cre(谷氨酸能神经元的子集)。从脑和脊髓中分离DNA。在2轮筛选后通过克隆和/或下一代测序评估回收的变体。该方法已经实现了对另外的表现出有效CNS转导的载体的鉴定(参见表3和表4)。基于以下一个或多个标准选择用于个体验证的序列(i)在两轮筛选后各变体出现的频率(以较高频率出现的序列可能在体内筛选期间富集)，(ii)编码相同氨基酸序列的多种核酸序列变体的存在，以及(iii)与病毒文库相比所观察到的富集。
实施例4
制造AAV-PHP.B的变体
将AAV-PHP.B 7聚体(SEQ ID NO：40)部分随机化，从而通过将7聚体序列的3个氨基酸和7聚体侧翼的2个氨基酸重叠置换为随机的氨基酸来制造相应的变体。制造AAV-PHP.B变体的策略概述示于图21。
在两轮筛选后，选择序列DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：4)用于表征。序列DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO：4)独立地选自2种不同的氨基酸序列：(i)GAT GGG ACT TTG GCG GTG CCT TTTAAG GCA CAG(SEQ ID NO：54)和(ii)GAT GGG ACG TTG GCG GTG CCT TTT AAG GCA CAG(SEQ ID NO：55)。
在一些实施方案中，将7AA(7聚体)序列插入AAV9衣壳蛋白的氨基酸588至589之间。AAV-PHP.S的7聚体插入(SEQ ID NO：37)具有下列7聚体序列：QAVRTSL(SEQ ID NO.37)。其选自核苷酸序列：CAG GCG GTT AGG ACG TCT TTG(SEQ ID NO 56)。
实施例5
AAV-PHP.N(SEQ ID NO：46)和AAV-PHP.S(SEQ ID NO：47)的表征
该实施例提供了两种AAV变体AAV-PHP.N(SEQ ID NO：46)和AAV-PHP.S(SEQ IDNO：47)的其他表征。AAV-PHP.N与AAV-PHP.B的不同之处在于两个氨基酸取代(A587D和Q588G)。与AAV-PHP.N衣壳相比，AAV-PHP.B衣壳显示出提高的向若干CNS神经元群体的基因递送效率，其可以使基因转移至细胞的更多部分或用较低剂量的病毒进行高效率的转导。
为了定量评估AAV-PHP.N(SEQ ID NO：46)和AAV-PHP.B的转导效率，向年轻的成年小鼠静脉注射1x1011 vg的包装到AAV-PHP.N(SEQ ID NO：46)或AAV-PHP.B中的单链(ss)AAV-CAG-NLS-GFP(图23A至E)。施用三周后，对皮质和纹状体中表达核定位的GFP的DAPI+细胞的比例进行评估。与AAV-PHP.B相比，AAV-PHP.N(SEQ ID NO：46)在皮质中转导显著更大比例的DAPI+细胞(图24A、图24D)。在纹状体中观察到类似的趋势(p＝0.054)。接下来，对于在皮质和纹状体(Neun+)以及小脑浦肯野神经元(Calbindin+)中由各载体转导的神经元的百分比进行测定(图24B，图24E)。在各区域中，AAV-PHP.N提供了显著更有效的神经元转导。相比于AAV-PHP.B，在AAV-PHP.N对提高的转导效率的进一步支持中，观察到接受AAV-PHP.N(SEQ ID NO：46)的小鼠的大脑中每一细胞的GFP荧光强度(每一细胞核的GFP荧光的中值强度的平均值)显著增加(图24G)。
实施例6
通过AAV-PHP.S对转导定量
AAV-PHP.S(SEQ ID NO：47)衣壳提供了背根神经节(DRG)和包括肠神经系统的内脏器官中的外周感觉神经元的有效转导。检测了与AAV9(SEQ ID NO：45)相比，用AAV-PHP.S(SEQ ID NO：47)转导外周神经元的效率。将AAV-PHP.S和AAV9用于包装上文使用的相同的ss AAV-CAG-NLS-GFP基因组，并且将病毒以1x 1012vg的剂量静脉注射到年轻的成年小鼠中。三周后，测定由两种载体转导的PGP9.5+DRG神经元的百分比。在接受AAV-PHP.S的小鼠中，观察到表达核GFP的PGP9.5+细胞的百分比的显著提高以及(如通过荧光强度所测量的)每一细胞的GFP表达的显著增加。此外，相对于AAV9，心脏神经节内细胞中的平均GFP强度也增加了(图24A至G)。
不受任何特定理论的束缚，据信AAV-PHP.S可有效用于研究和治疗各种疾病和损伤，包括但不限于弗里德赖希氏共济失调、心力衰竭、缺血性心脏病、心脏肥大、慢性疼痛和外周神经损伤。
实施例7
使用靶向肽的治疗方法
确定患有可通过应用受试者体内待表达的核酸来进行治疗的病症的受试者。然后向受试者施用第一剂量的AAV载体，其包括待表达的多核苷酸。多核苷酸编码治疗性蛋白质。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括靶向肽部分，该靶向肽部分包含SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者，或者由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成，从而使待表达的蛋白能够适当靶向至受试者体内合适的系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内合适的系统中表达了治疗有效量的待表达的蛋白。
实施例8
治疗亨廷顿氏病的方法
确定患有亨廷顿氏病的受试者。然后向受试者施用第一剂量的AAV载体，其包括待表达的多核苷酸。多核苷酸编码治疗性蛋白质。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的蛋白能够适当靶向至受试者体内的神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的待表达的蛋白。
实施例9
治疗亨廷顿氏病的方法
确定患有亨廷顿氏病的受试者。然后向受试者施用第一剂量的AAV载体，其包括编码小的非编码RNA(小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA))的多核苷酸，将所述小的非编码RNA设置为通过其序列来降低亨廷顿蛋白的表达。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使所述多核苷酸能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的小的非编码RNA。
实施例10
治疗亨廷顿氏病的方法
确定患有亨廷顿氏病的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码锌指蛋白(ZFP)的多核苷酸，将所述锌指蛋白被设计为抑制亨廷顿(HTT)基因的转录。AAV载体将包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使ZFP能够相对于其他器官，适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的ZFP。
实施例11
亨廷顿氏病的方法
确定患有亨廷顿氏病的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码小的非编码RNA(小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA))的多核苷酸，所述小的非编码RNA由本领域技术人员设计以减少亨廷顿蛋白的表达。AAV载体将包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使多核苷酸能够相对于其他器官，适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的小的非编码RNA。
实施例12
治疗阿尔茨海默氏病的方法
确定患有阿尔茨海默氏病的受试者。然后向受试者施用第一剂量的AAV载体，其包括编码抗Abeta抗体或抗体片段的多核苷酸。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的抗体或抗体片段能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的抗体或抗体片段。
实施例13
治疗阿尔茨海默氏病的方法
确定患有阿尔茨海默氏病的受试者。然后向受试者施用第一剂量的AAV载体，其包括编码载脂蛋白E(ApoE)蛋白的多核苷酸，所述载脂蛋白E蛋白优选人apoE多肽apoE2或经修饰的apoE2变体。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的抗体或抗体片段能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的ApoE蛋白。
实施例14
治疗SMA的方法
确定患有脊髓性肌萎缩症(SMA)的受试者。然后向受试者施用第一剂量的AAV载体，其包括编码存活运动神经元1(SMN1)多肽的多核苷酸。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的SMN蛋白能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的SMN蛋白。
实施例15
治疗弗里德赖希氏共济失调的方法
确定患有弗里德赖希氏共济失调的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码共济蛋白的多核苷酸。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQID NO：1至44、48至53、65-68以及74-93中的任一个组成的靶向肽部分，从而使待表达的共济蛋白能够相对于其他器官，适当靶向至神经系统和心脏。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统和心脏中表达了治疗有效量的共济蛋白。
实施例16
治疗庞贝病的方法
确定患有庞贝病的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码酸性α-葡糖苷酶(GAA)蛋白的多核苷酸。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQID NO：1至44、48-53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的GAA蛋白能够相对于其他器官，适当靶向至神经系统和心脏。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统和心脏中表达了治疗有效量的GAA蛋白。
实施例17
治疗晚期婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病的方法
确定患有晚期婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(LINCL)的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码三肽基肽酶1蛋白的CLN2多核苷酸。载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的三肽基肽酶1蛋白能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的三肽基肽酶1蛋白。
实施例18
治疗巴滕病的方法
确定患有少年NCL形式的巴滕病的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码巴腾蛋白(batternin protein)的CLN3多核苷酸。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的巴腾蛋白能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的巴腾蛋白。
实施例19
治疗卡纳万病的方法
确定患有卡纳万病的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码天冬氨酸酰基转移酶蛋白的ASPA多核苷酸。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的天冬氨酸酰基转移酶蛋白能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的天冬氨酸酰基转移酶蛋白。
实施例20
治疗帕金森氏病的方法
确定患有帕金森氏病的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的一种或多种AAV载体，每种载体包括一种或多种核苷酸，所述一种或多种核苷酸编码用于从非多巴胺能细胞增加多巴胺产量所必需的一种或多种酶。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的所述一种或多种酶能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的一种或多种酶。
实施例21
治疗帕金森氏病的方法
确定患有帕金森氏病的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码减少内源性α-突触核蛋白聚集的经修饰的、抗聚集形式的α-突触核蛋白的多核苷酸。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的抗聚集α-突触核蛋白能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的蛋白。
实施例22
治疗肌萎缩性侧索硬化症或额颞痴呆(Frontal Dementia)的方法
确定患有由C9ORF72中的突变所引起的肌萎缩性侧索硬化症或额颞痴呆的受试者。然后向受试者施用第一剂量的AAV载体，其包括编码一种或多种非编码RNA的多核苷酸，所述一种或多种非编码RNA能够减少受试者细胞中由六核苷酸扩增(GGGGCC)所引起的核RNA病灶。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的一种或多种RNA能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的一种或多种RNA。
实施例23
治疗多发性硬化症的方法
确定患有多发性硬化症的受试者。然后向受试者全身施用第一剂量的AAV载体，其包括编码营养或免疫调节因子(例如白血病抑制因子(LIF)或睫状神经营养因子(CNTF))的多核苷酸。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的所述因子能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的因子。
实施例24
治疗肌萎缩性侧索硬化症的方法
确定患有由SOD1突变所引起的肌萎缩性侧索硬化症的受试者。然后向受试者施用第一剂量的AAV载体，其包括编码小的非编码RNA(小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA))的多核苷酸，所述小的非编码RNA由本领域技术人员设计以减少突变体SOD1蛋白的表达。AAV载体包括衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括由SEQ ID NO：1至44、48至53、65至68以及74至93中的任一者构成的靶向肽部分，从而使待表达的小的非编码RNA能够适当靶向至神经系统。如果需要，向受试者施用第二或第三剂量的载体，直至受试者体内的神经系统中表达了治疗有效量的小的非编码RNA。
本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中所引用的未在其范围内的参考文献，均在此通过全文引用并入本文。在通过引用并入的参考文献中提供的任意定义或术语与本文提供的术语和讨论不同的情况下，以本发明的术语和定义为准。
认为前述书面说明书足以使本领域技术人员能够实践本发明。前述说明书和实施例详述了本发明的某些优选实施方案，并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解的是，无论前述内容如何详细地出现在文本中，本发明可以以多种方式实施，并且本发明应该根据所附权利要求及其任意的等同物来解释。
在至少一些先前描述的实施方案中，一个实施方案中使用的一个或多个元件可以互换地用于另一个实施方案中，除非此替换在技术上不可行。本领域技术人员将领会的是，可以对上述方法和结构进行各种其他的删减、添加和修改，而不脱离所要求保护的主题范围。所有的此类修改和改变都旨在落入由所附权利要求所限定的主题的范围内。
关于本文中使用的基本上任何复数和/或单数术语，本领域技术人员可以从复数理解为单数和/或从单数理解为复数，只要对上下文和/或申请是合适的。为清楚起见，可在本文清楚阐述各种单数/复数排列。
本领域技术人员将理解的是，通常，本文、及尤其是在所附权利要求书中使用的术语(例如，所附权利要求书的主体部分)通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应当被理解为“包括(including)但不限于”，术语“具有”应当被理解为“具有至少”，术语“包括(includes)”应当被理解为“包括(includes)但不限于”等。本领域技术人员还将理解的是，如果意图引入的权利要求列举(recitation)的特定数量，则将在权利要求中清楚地列举这样的意图，且不存在此列举时无此意图存在。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求书可以包含引导性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用以引入权利要求的列举。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”引入的权利要求列举将包含此引入的权利要求的任何特定权利要求限制到只包含一个此列举的实施方案，即使是当相同的权利要求包括引导性短语“一个或多个”或“至少一个”和诸如“一个(a)”或“一个(an)”之类的不定冠词(例如，“一个(a)”和/或“一个(an)”应该被理解为“至少一个”或“一个或多个”)；同样适用于使用定冠词引入权利要求列举。另外，即使清楚地列举了特定数量的被引入的权利要求列举，本领域技术人员将认识到，此类列举应当被理解为意味着至少的列举数量(例如，“两个列举”的列举，没有其他修饰的情况下，意味着至少两个列举，或者两个或多个列举)。此外，在使用类似于“至少一个A、B和C等”惯例的那些情况下，一般而言，此类结构意在从本领域技术人员将理解该惯例的意义上讲(例如，“具有至少一个A、B和C的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起的系统等)。在使用类似于“至少一个A、B或C等”惯例的那些情况下，一般而言，此类结构意在从本领域技术人员将理解该惯例的意义上讲(例如，“具有至少一个A、B或C的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起的系统等)。本领域技术人员还将理解的是，几乎任何代表两个或多个可选的术语的转折性词语和/或短语，不论是在说明书、权利要求书或附图中，都应该被理解为涉及包括一个术语、术语之一或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
另外，当按照马库什组描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本公开还因此根据马库什组的任何单独的成员或成员亚组的形式被描述。
如本领域技术人员将理解的是，出于任何和所有目的，诸如根据提供书面说明而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。可以将任何所列的范围容易地识别为充分描述并使得相同的范围能够被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制的示例，可以将本文讨论的每个范围容易地分解为下部三分之一、中间三分之一和上部三分之一等。如本领域技术人员还将理解的是，所有语言诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”，以及类似的包括列举的数量并且指的是能够如以上讨论的被随后分解成子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的是，范围包括每个单独的成员。因此，(例如)具有1个至3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1个至5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
尽管本文已经公开了各种方面和实施方案，但是其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方案是出于说明的目的而不是意图限制，真正的范围和精神由下面的权利要求书指示。
序列表
<110> 加州理工学院
Deverman, Benjamin E.
Gradinaru, Viviana
Chan, Ken Y.
<120> 用于定向腺相关病毒(AAV)的靶向肽
<130> CALTE.118WO
<150> 62/266184
<151> 2015-12-11
<150> 62/421891
<151> 2016-11-14
<160> 93
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B
<400> 1
Ala Gln Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B2
<400> 2
Ala Gln Ser Val Ser Lys Pro Phe Leu Ala Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B3
<400> 3
Ala Gln Phe Thr Leu Thr Thr Pro Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.N/PHP.B-DGT
<400> 4
Asp Gly Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-EST
<400> 5
Glu Ser Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-GGT
<400> 6
Gly Gly Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
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<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-ATP
<400> 7
Ala Gln Thr Leu Ala Thr Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-ATT-T
<400> 8
Ala Thr Thr Leu Ala Thr Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-DGT-T
<400> 9
Asp Gly Thr Leu Ala Thr Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-GGT-T
<400> 10
Gly Gly Thr Leu Ala Thr Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-SGS
<400> 11
Ser Gly Ser Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-AQP
<400> 12
Ala Gln Thr Leu Ala Gln Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-QQP
<400> 13
Ala Gln Thr Leu Gln Gln Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-SNP(3)
<400> 14
Ala Gln Thr Leu Ser Asn Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-SNP
<400> 15
Ala Gln Thr Leu Ala Val Pro Phe Ser Asn Pro
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-QGT
<400> 16
Gln Gly Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-NQT
<400> 17
Asn Gln Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-EGS
<400> 18
Glu Gly Ser Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-SGN
<400> 19
Ser Gly Asn Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-EGT
<400> 20
Glu Gly Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-DST
<400> 21
Pro His Pro Asx Asp Ser Thr
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-DST
<400> 22
Ala Val Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-STP
<400> 23
Ala Gln Thr Leu Ser Thr Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-PQP
<400> 24
Ala Gln Thr Leu Pro Gln Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-SQP
<400> 25
Ala Gln Thr Leu Ser Gln Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-QLP
<400> 26
Ala Gln Thr Leu Gln Leu Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-TMP
<400> 27
Ala Gln Thr Leu Thr Met Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-TTP
<400> 28
Ala Gln Thr Leu Thr Thr Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.A
<400> 29
Ala Gln Tyr Thr Leu Ser Gln Gly Trp Ala Gln
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 30
Ala Gln Met Asn Ala Thr Lys Asn Val Ala Gln
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 31
Ala Gln Val Ser Gly Gly His His Ser Ala Gln
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 32
Ala Gln Thr Leu Pro Gln Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B-ATP
<400> 33
Ala Gln Thr Leu Ala Thr Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 34
Ala Gln Thr Leu Thr Met Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 35
Ala Gln Thr Leu Thr Met Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 36
Ala Gln Thr Leu Ser Lys Pro Phe Lys Ala Gln
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV-PHP.S
<400> 37
Gln Ala Val Arg Thr Ser Leu
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.A
<400> 38
Tyr Thr Leu Ser Gln Gly Trp
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G2A3
<400> 39
Leu Ala Lys Glu Arg Leu Ser
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B
<400> 40
Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B2
<400> 41
Ser Val Ser Lys Pro Phe Leu
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PHP.B3
<400> 42
Phe Thr Leu Thr Thr Pro Lys
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G2B4
<400> 43
Met Asn Ser Thr Lys Asn Val
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G2B5
<400> 44
Val Ser Gly Gly His His Ser
1 5
<210> 45
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV9 衣壳序列
<400> 45
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Arg Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln
580 585 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 46
<211> 743
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV-PHP.N VP1 衣壳序列
<400> 46
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Arg Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Asp Gly Thr Leu Ala Val
580 585 590
Pro Phe Lys Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile
595 600 605
Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro
610 615 620
Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro
625 630 635 640
Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile
645 650 655
Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp
660 665 670
Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val
675 680 685
Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro
690 695 700
Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe
705 710 715 720
Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr
725 730 735
Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740
<210> 47
<211> 743
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV-PHP.S VP1 衣壳序列
<400> 47
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Arg Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Gln Ala Val Arg
580 585 590
Thr Ser Leu Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile
595 600 605
Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro
610 615 620
Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro
625 630 635 640
Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile
645 650 655
Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp
660 665 670
Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val
675 680 685
Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro
690 695 700
Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe
705 710 715 720
Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr
725 730 735
Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 48
Ser Ala Gln Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln Ala Gln
1 5 10
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<220>
<221> 变体（VARIANT）
<222> 2-4
<223> Xaa = 任意氨基酸
<400> 49
Ser Xaa Xaa Xaa Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln Ala Gln
1 5 10
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<220>
<221> 变体（VARIANT）
<222> 4-6
<223> Xaa = 任意氨基酸
<400> 50
Ser Ala Gln Xaa Xaa Xaa Val Pro Phe Lys Ala Gln Ala Gln
1 5 10
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<220>
<221> 变体（VARIANT）
<222> 6-8
<223> Xaa = 任意氨基酸
<400> 51
Ser Ala Gln Thr Leu Xaa Xaa Xaa Phe Lys Ala Gln Ala Gln
1 5 10
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<220>
<221> 变体（VARIANT）
<222> 8-10
<223> Xaa = 任意氨基酸
<400> 52
Ser Ala Gln Thr Leu Ala Val Xaa Xaa Xaa Ala Gln Ala Gln
1 5 10
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<220>
<221> 变体（VARIANT）
<222> 10-12
<223> Xaa = 任意氨基酸
<400> 53
Ser Ala Gln Thr Leu Ala Val Pro Phe Xaa Xaa Xaa Ala Gln
1 5 10
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 54
gatgggactt tggcggtgcc ttttaaggca cag 33
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 55
gatgggacgt tggcggtgcc ttttaaggca cag 33
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 56
caggcggtta ggacgtcttt g 21
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 57
caggtcttca cggactcaga ctatcag 27
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 58
caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat cg 32
<210> 59
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 59
actcatcgac caatacttgt actatctctc tagaac 36
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 60
ggaagtattc cttggttttg aaccca 26
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 61
ggtcgcggtt cttgtttgtg gat 23
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 62
cgaccttgaa gcgcatgaac tcct 24
<210> 63
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<220>
<221> 混合特性（misc_feature）
<222> 42, 43, 45, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 57, 58, 60, 61
<223> n = a, c, t 或 g
<400> 63
gtattccttg gttttgaacc caaccggtct gcgcctgtgc mnnmnnmnnm nnmnnmnnmn 60
nttgggcact ctggtggttt gtc 83
<210> 64
<400> 64
000
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 65
Thr Asn His Gln Ser Ala Gln
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 66
Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 67
Asp Gly Thr Leu Ala Thr Pro Phe Lys
1 5
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<220>
<221> 变体（VARIANT）
<222> 10-11
<223> Xaa = 任意氨基酸
<400> 68
Asp Gly Thr Leu Ala Thr Pro Phe Lys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 69
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<220>
<221> 混合特性（misc_feature）
<222> 36, 37, 39, 40, 42, 43
<223> n = a, c, t 或 g
<400> 69
gtattccttg gttttgaacc caaccggtct gcgcmnnmnn mnnaaaaggc accgccaaag 60
tttg 64
<210> 70
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<220>
<221> 混合特性（misc_feature）
<222> 42, 43, 45, 46, 48, 49
<223> n = a, c, t 或 g
<400> 70
gtattccttg gttttgaacc caaccggtct gcgcctgtgc mnnmnnmnnc accgccaaag 60
tttgggcact 70
<210> 71
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<220>
<221> 混合特性（misc_feature）
<222> 48, 49, 51, 52, 54, 55
<223> n = a, c, t 或 g
<400> 71
gtattccttg gttttgaacc caaccggtct gcgcctgtgc cttaaamnnm nnmnncaaag 60
tttgggcact ctggtgg 77
<210> 72
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<220>
<221> 混合特性（misc_feature）
<222> 54, 55, 57, 58, 60, 61
<223> n = a, c, t 或 g
<400> 72
gtattccttg gttttgaacc caaccggtct gcgcctgtgc cttaaaaggc acmnnmnnmn 60
nttgggcact ctggtggttt gtg 83
<210> 73
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 反向引物序列用于生成
AAV-PHP.B-XXX 文库
<220>
<221> 混合特性（misc_feature）
<222> 57, 58, 60, 61, 63, 64
<223> n = a, c, t 或 g
<400> 73
ttccttggtt ttgaacccaa ccggtctgcg cctgtgcctt aaaaggcacc gccaamnnmn 60
nmnnactctg gtggtttgtg gccacttgtc 90
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 74
actttggcgg tgccttttaa g 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 75
agtgtgagta agcctttttt g 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 76
tttacgttga cgacgcctaa g 21
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 77
tatactttgt cgcagggttg g 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 78
caggcggtta ggacgtcttt g 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的核苷酸序列
<400> 79
cttgcgaagg agcggctttc g 21
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 80
Leu Ala Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 81
Val Pro Phe Lys Ala Gln
1 5
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 82
Phe Lys Ala Gln
1
<210> 83
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 83
Ala Gln Thr Leu Ala Val
1 5
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 84
Ala Gln Thr Leu Ala Val Pro Phe
1 5
<210> 85
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 85
Gln Ala Val Arg
1
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 86
Ala Val Arg Thr
1
<210> 87
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 87
Val Arg Thr Ser
1
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 88
Arg Thr Ser Leu
1
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 89
Gln Ala Val Arg Thr
1 5
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 90
Ala Val Arg Thr Ser
1 5
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 91
Val Arg Thr Ser Leu
1 5
<210> 92
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 92
Gln Ala Val Arg Thr Ser
1 5
<210> 93
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的氨基酸序列
<400> 93
Ala Val Arg Thr Ser Leu
1 5

Claims (26)

1.一种靶向中枢神经系统(CNS)的腺相关病毒(AAV)肽，其包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中所述11个连续的氨基酸的序列是SEQ ID NO:4-15中的一个序列。
2.根据权利要求1所述的靶向CNS的AAV肽，其包含氨基酸序列DGTLAVPFKAQ(SEQ IDNO:4)。
3.一种靶向中枢神经系统(CNS)的腺相关病毒(AAV)肽，包括SEQ ID NO：4-14中的任一者的序列。
4.一种药物组合物，包含权利要求1至3中任一项所述的靶向CNS的AAV肽以及一种或多种可药用的载体。
5.根据权利要求3所述的靶向CNS的AAV肽，其中所述肽结合至纳米颗粒、第二分子、病毒衣壳蛋白或它们的组合。
6.根据权利要求3所述的靶向CNS的AAV肽，其中所述肽为AAV的一部分。
7.根据权利要求6所述的靶向CNS的AAV肽，其中所述肽为所述AAV的衣壳蛋白。
8.一种核酸序列，其编码权利要求3所述的靶向CNS的AAV肽。
9.一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含靶向CNS的肽，所述靶向CNS的肽包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中所述11个连续的氨基酸的序列是SEQ IDNO:4-15中的一个序列。
10.根据权利要求9所述的AAV衣壳蛋白，其中所述靶向CNS的肽包含氨基酸序列DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:4)。
11.根据权利要求9所述的AAV衣壳蛋白，其中所述11个连续的氨基酸的序列为靶向CNS的AAV肽的衣壳蛋白的一部分。
12.根据权利要求9所述的AAV衣壳蛋白，其中所述11个连续的氨基酸的序列被插入到所述AAV衣壳蛋白序列SEQ ID NO：45的AA586至AA589之间。
13.一种核酸序列，其编码权利要求9至12中任一项所述的AAV衣壳蛋白。
14.含有AAV的组合物用于制备治疗有需要的受试者的相关疾病的药物组合物的用途，其中含有AAV的组合物将核酸递送至有需要的受试者的靶标环境，包括：
提供含有AAV的组合物，其中所述AAV包含衣壳蛋白，该衣壳蛋白包含11个连续的氨基酸的序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中所述AAV包含将被递送至所述受试者的所述靶标环境的核酸，并且其中所述11个连续的氨基酸的序列是SEQ ID NO:4-15中的一个序列；和
将所述组合物施用于所述受试者。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述靶标环境为心脏、神经系统或它们的组合。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述靶标环境为中枢神经系统、外周神经系统、心脏或它们的组合。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述靶标环境为神经元、星形胶质细胞、心肌细胞或它们的组合。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述被递送至神经系统的核酸包含下列中的一者或多者：
a)编码营养因子、生长因子或可溶性蛋白的核酸序列；
b)恢复人或动物的携带有基因突变的基因的蛋白质功能的cDNA；
c)编码可以用于控制或改变细胞的活性或状态的蛋白质的cDNA；
d)编码用于评估细胞状态的蛋白质或核酸的cDNA；
e)用于进行基因组工程的cDNA和/或相关的向导RNA；
f)用于通过同源重组进行基因编辑的序列；
g)编码治疗性RNA的DNA序列；
h)shRNA或人工miRNA递送系统；以及
i)影响内源性基因的剪接的DNA序列。
19.根据权利要求14所述的用途，其中所述有需要的受试者患有或处于发展成为下列中的一者或多者的风险：慢性疼痛、心力衰竭、心律失常、亨廷顿氏病(HD)、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩症I型和II型(SMA I和II)、弗里德赖希氏共济失调症(FA)、脊髓小脑性共济失调、与CNS内的细胞有关的溶酶体贮积症。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述溶酶体贮积症为克拉贝病、桑德霍夫病、黑蒙性家族痴呆症、戈谢病(I型、II型或III型)、尼曼-皮克病、赫尔勒综合征、庞贝病或巴滕病。
21.根据权利要求14至19中任一项所述的用途，其中通过静脉内施用或全身施用将所述AAV施用于所述受试者。
22.根据权利要求15所述的用途，其中所述神经系统为中枢神经系统。
23.根据权利要求14至19中任一项所述的用途，其中将所述核酸递送至所述受试者的背根神经节、内脏器官或它们的组合。
24.根据权利要求14至19中任一项所述的用途，其中将所述核酸递送至所述受试者的星形胶质细胞、神经元或它们的组合。
25.根据权利要求14至19中任一项所述的用途，其中所述受试者为成年动物。
26.根据权利要求14所述的用途，其中所述AAV包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含氨基酸序列DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:4)。
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