JP2001500014A - 組換えアデノ随伴ウイルスの生産のためにｃｒｅ―ｌｏｘを用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組換えＡＡＶの効率よい生産方法が記述される。一つの態様として、３個のベクターが宿主細胞中に導入される。第一ベクターはｃｒｅ組換え酵素の発現を導き、第二ベクターはプロモーター、ｌｏｘＰ部位が両側に位置するスペーサー配列及びｒｅｐ／ｃａｐを含有し、そして第三ベクターはＡＡＶ ＩＴＲ ＩＴＲが両側に位置する導入遺伝子及び調節配列を含有するミニ遺伝子を含む。別の態様として、宿主細胞がｃｒｅ組換え酵素を安定または誘導的に発現し、そして系の他の成分を保有する２個のベクターが宿主細胞中に導入される。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えアデノ随伴ウイルスの生産のためにＣＲＥ−ＬＯＸを用いる方法発明の分野 本発明は一般的に組換えウイルスの生産方法に、そしてより具体的には組換え アデノ随伴ウイルスの生産方法に関する。発明の背景 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損性パルボウイルスであり、そのゲノ ムは１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含んで約４．６ｋｂ の長さである。２つのオープンリーディングフレームは一連のｒｅｐ及びｃａｐ ポリペプチドをコードする。ｒｅｐポリペプチド（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒ ｅｐ ６２及びｒｅｐ４０）はＡＡＶゲノムの複製、レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ） 及び組込みに関与する。ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）はビリ オンキャプシドを形成する。ｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームに ５’及び３’末端で隣接するのは１４５ｂｐの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）で あり、その最初の１２５ｂｐはＹまたはＴ状デュープレックス構造を形成するこ とができる。ＡＡＶベクターの開発のために重要なことには、全ｒｅｐ及びｃａ ｐ ドメインを取り出して治療またはレポーター導入遺伝子で置き換え可能である ことが挙げられる［Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒ ｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」中、編集、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ｐ ｐ．１５５−１６８（１９９０）］。ＩＴＲはＡＡＶゲノムの複製、レスキュー 、パッケージング及び組込みのために必要な最小配列であることが示されている 。 この非病原性ヒトウイルスがヒト細胞に感染すると、ウイルスゲノム は第１９染色体中に組込まれ、細胞の潜伏感染をもたらす。その細胞がアデノウ イルスまたはヘルペスウイルスのような溶菌ヘルパーウイルスに同時感染しなけ れば感染性ウイルスの生産及びウイルスの複製は起こらない。ヘルパーウイルス に感染すると、ＡＡＶプロウイルスはレスキューされ、増幅され、そしてＡＡＶ 及びヘルパーウイルスの両方が生産される。感染する親のｓｓＤＮＡはｒｅｐに 依存してデュープレックス複製型（ＲＦ）ＤＮＡに増補される。レスキューされ たＡＡＶゲノムは前以て形成されたタンパク質キャプシド（直径約２０ｎｍの正 二十面体）中にパッケージされ、そして細胞溶解後に＋または−のいずれかのｓ ｓＤＮＡゲノムをパッケージした感染性ビリオンとして放出される。 ＡＡＶは外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にす る独特な特徴を有する。様々なグループが疾病状態の処置におけるＡＡＶの可能 性のある使用を研究している。遺伝子治療のための形質導入ベクターとしてＡＡ Ｖを確立することへの進展は様々な理由のために遅れている。静止細胞中に組込 むＡＡＶの能力は可能性のある形質導入遺伝子の長期間の発現の点で重要である が、組込まれるプロウイルスが第１９染色体中の特定の部位のみを優先的に標的 とする傾向はその有用性を減少する。 しかしながら、ＤＮＡの送達のためにＡＡＶを使用することに対する障害は、 組換えゲノムの包膜化及び感染性ビリオンの生産のために非常に効率よいスキー ムがないことである。［Ｒ．Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５： ７９３−８０１（１９９４）を参照］。一つのそのような方法はｒＡＡＶゲノム を宿主細胞中にトランスフェクトし、続いて、野生型ＡＡＶ及びアデノウイルス で同時感染させることを伴う。 しかしながら、この方法は容認できない高いレベルの野生型ＡＡＶを生じる。混 入する野生型ＡＡＶまたはヘルパーアデノウイルスの非存在下で細胞をｒＡＡＶ とインキュベーションすると、わずかな組換え遺伝子発現に結びつく。ｒｅｐの 非存在下では、組込みは効率が悪く、そして第１９染色体に導かれない。 形質導入するＡＡＶビリオンを生産するために一般に認められた方法は、２個 の異なるが相補的なプラスミドでの同時トランスフェクションを伴う。これらの 一方は２個のシスに作用するＡＡＶ ＩＴＲの間に挟まれた治療またはレポータ ー導入遺伝子を含む。子孫組換えゲノムのレスキュー及びそれに続くパッケージ ングのために必要とされるＡＡＶ成分は、ウイルスのｒｅｐ及びｃａｐタンパク 質のオープンリーディングフレームをコードするもう一方のプラスミドによりト ランスに与えられる。Ｒｅｐタンパク質の過剰発現はアデノウイルス及び細胞増 殖に対していくらかの阻害作用を有する［Ｊ．Ｌｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１ ：５２３６−５２４３（１９９７）］。この毒性は、有用なｒＡＡＶ遺伝子治療 ベクターの構築のためにトランスにこれらの遺伝子を与えることが困難である主 要な原因である。 体細胞遺伝子治療用ベクターとしての使用のためにＡＡＶ及び組換えＡＡＶウ イルスの効率よい生産を可能にする方法が当該技術分野において依然として必要 とされている。発明の要約 本発明はｒＡＡＶの効率よい生産を可能にする方法を提供し、それは先行する 類似技術が直面した困難を克服する。この方法は遺伝子治療において有用な組換 えＡＡＶベクターの生産のために特に望ましい。この 方法は （ａ）取り除かれるとｒｅｐ及びｃａｐの活性化を導くｒｅｐ及びｃａｐ遺伝 子抑制配列をスプライシングして除くことを可能にするｃｒｅ導入遺伝子； （ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、これらの遺伝子の５’にはｌｏｘ部 位が両側に位置するスペーサーがある； （ｃ）ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が両側に位置する治療導入遺伝子 を含んでなるミニ遺伝子；並びに （ｄ）アデノウイルスまたはヘルペスウイルスヘルパー機能を宿主細胞に与え ることを伴う。 従って、一つの態様として、本発明はインビトロで遺伝子産物を発現する配列 の調節制御下にｃｒｅ導入遺伝子を含有する第一ベクター、ｒｅｐ及びｃａｐ遺 伝子の５’にある、ｌｏｘ部位が両側に位置するスペーサーを含有する第二ベク ター、並びにＡＡＶ ＩＴＲが両側に位置する治療導入遺伝子を含有する第三ベ クターを宿主細胞中に導入することを含んでなるｒＡＡＶの生産方法を提供する 。これらのベクターはプラスミドまたは組換えウイルスであってもよい。これら のベクターの一つは組換えアデノウイルスまたはヘルペスウイルスであってもよ く、それはｒＡＡＶ粒子を生産するために必須のウイルスヘルパー機能を宿主細 胞に与ることができる。しかしながら、全てのベクターがプラスミドである場合 は、細胞を適切なヘルパーウイルスにも感染させなければならない。次に、ｃｒ ｅ組換え酵素を生産できるようにする条件下で細胞を培養する。組換え酵素はｒ ｅｐ ／ｃａｐ遺伝子の上流のｌｏｘ部位が両側に位置するスペーサーの欠失を引 き起こす。スペーサーの除去によりｒｅｐ 及びｃａｐ遺伝子が発現され、これは次にＡＡＶ ＩＴＲが両側に位置す る治療導入遺伝子のパッケージングを可能にする。 別の態様として、本発明はｌｏｘ部位が両側に位置するスペーサーをｒｅｐ及 びｃａｐ遺伝子の５’に保有するベクター及び上記の治療ミニ遺伝子を含有する ベクターでｃｒｅ組換え酵素を発現する宿主細胞を同時トランスフェクトする方 法を提供する。本明細書に記述される方法によりヘルパー機能を与えて、細胞を 次に適切な条件下で培養する。培養するとｃｒｅ組換え酵素はスペーサーの欠失 を引き起こし、従って、ｒｅｐ／ｃａｐの発現を活性化し、上記のようなｒＡＡ Ｖを生じる。 さらに別の態様として、本発明は本発明の方法により製造されるｒＡＡＶベク ターを提供する。 本発明の他の態様及び利点は以下のその好ましい態様の詳細な説明中にさらに 記述される。図面の簡単な説明 図１は本発明のベクター中のスペーサーとして有用なグリーン蛍光タンパク質 （ＧＦＰ）ｃＤＮＡ、イントロン及びポリアデニル化（ｐＡまたはポリＡ）シグ ナルを含有する１６００ｂｐ ＤＮＡフラグメントの概要図である。 図２はスペーサーとして有用なネオマイシン耐性（ｎｅｏ^R）をコードする遺 伝子及びポリＡを含有する１０００ｂｐ ＤＮＡフラグメントの概要図である。 図３は本発明の方法におけるヒト胚腎臓２９３細胞のトランスフェクションの ために有用なプラスミドｐＧ．ＣＭＶ．ｎｌｓ．ＣＲＥを示す。 図４は本発明の方法に有用なプラスミドｐＡｄ．Ｐ５．Ｓｐ．Ｒｅｐ ／Ｃａｐを示す。 図５は本発明の方法に有用な組換えアデノウイルス、Ａｄ．ＣＭＶ．ＮＬＳ− ＣＲＥの構築を示す。 図６ＡはＡｄ．ＣＡＧ．Ｓｐ．ＬａｃＺウイルスの構造を示す。 図６Ｂは１のｍ．ｏ．ｉ．でＬａｃＺウイルスに感染させた２９３細胞から単 離され、ＮｏｔＩで切断されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を与える。１ ０００ｂｐの³²Ｐ−ＮＥＯスペーサーをプローブとして用いた。ＮｏｔＩでの切 断後に（ｃｒｅにより媒介される組換えのない）６２００ｂｐの制限フラグメン ト及び／または（ｃｒｅにより媒介される組換えのある）５２００ｂｐの制限フ ラグメントを検出することができる。 図６Ｃは１０のｍ．ｏ．ｉ．でＬａｃＺウイルスに感染させた２９３細胞から 単離され、ＮｏｔＩで切断されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を与える。 １０００ｂｐの³²Ｐ−ＮＥＯスペーサーをプローブとして用いた。ＮｏｔＩでの 切断後に（ｃｒｅにより媒介される組換えのない）６２００ｂｐの制限フラグメ ント及び／または（ｃｒｅにより媒介される組換えのある）５２００ｂｐの制限 フラグメントを検出することができる。 図６Ｄは１００のｍ．ｏ．ｉ．でＬａｃＺウイルスに感染させた２９３細胞か ら単離され、ＮｏｔＩで切断されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を与える 。１０００ｂｐの³²Ｐ−ＮＥＯスペーサーをプローブとして用いた。ＮｏｔＩで の切断後に（ｃｒｅにより媒介される組換えのない）６２００ｂｐの制限フラグ メント及び／または（ｃｒｅにより媒介される組換えのある）５２００ｂｐの制 限フラグメントを検出するこ とができる。 図７はＡｄ．Ｔｒｅ．ＣＭＶ．ＧＦＰ．Ｒｅｐ／Ｃａｐウイルスの構造を示す 。発明の詳細な説明 本発明はｃｒｅ−ｌｏｘ系を用いたｒＡＡＶの生産方法を提供し、それは組換 えＡＡＶの効率よい生産系を提供することにおいて以前に経験された困難を克服 する。本発明の方法は治療導入遺伝子を保有するｒＡＡＶを生産し、それらは遺 伝子治療用途に特に有用である。 要約すると、本発明は （ａ）ｃｒｅ導入遺伝子、 （ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、これらの遺伝子の５’にはｌｏｘ部 位が両側に位置するスペーサーがある； （ｃ）ＡＡＶ ＩＴＲが両側に位置する治療導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝 子；並びに （ｄ）アデノウイルスまたはヘルペスウイルスヘルパー機能を含有する選択さ れた宿主細胞を培養することを伴う。 本明細書の全体にわたって「ベクター」という用語の使用は、所望する成分を トランスフェクションまたは感染により宿主細胞に導入することができるプラス ミドまたはウイルスベクターのいずれかをさす。「宿主細胞」という用語はＨＥ Ｋ２９３細胞及び他のパッケージング細胞のような、アデノウイルスパッケージ ング細胞として機能することができる、すなわち、ＡＡＶの生産のために必須で あるあらゆるアデノウイルスタンパク質を発現するあらゆる哺乳類細胞を意味す る。「ミニ遺伝子」という用語は宿主細胞において発現を導く調節配列と適切に 結合し且つ ＡＡＶ ＩＴＲが両側に位置する治療導入遺伝子を与える配列を意味する。「導 入遺伝子」という用語はベクター中に挿入される異種起源の遺伝子を意味する。 望ましくは、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を別個のプラスミド配列上に保有 するか、または組み換えウイルス中の導入遺伝子として保有することができる。 あるいは、ｃｒｅタンパク質を選択した宿主細胞により発現させることができ、 従って、ベクターによるトランスフェクションを必要としない。これらの成分の 各々には、現在、組換えアデノウイルスが好ましい。しかしながら、本明細書に 与えられる情報及び既知の技術を用いて、当業者は宿主細胞において選択した成 分の発現を導くことができる別の組換えウイルス（すなわち、非アデノウイルス ）またはプラスミドベクターを容易に構築することができるはずである。例えば 、非分裂細胞に感染することができないために優先度は低いけれども、例えば、 レトロウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、この系の必要成分、例えば、 ｃｒｅ組換え酵素を保有するベクターを容易に構築することができる。従って、 本発明は宿主細胞中にｃｒｅ組換え酵素、ｒｅｐ／ｃａｐまたはミニ遺伝子を導 入する目的のために選択されるウイルスまたはプラスミドにより限定されない。 しかしながら、望ましくは、これらのベクターの少なくとも１つは細胞にヘル パー機能（ｄ）も与える組換えウイルスである。あるいは、通常のように、ヘル パーウイルス、すなわち、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスに細胞を同時 感染させることによりヘルパー機能を与えることができる。ミニ遺伝子を含有す る得られたｒＡＡＶをそこから単離することができる。 Ａ． Ｃｒｅ導入遺伝子 ｃｒｅタンパク質は３４ｂｐの特定の配列（ｌｏｘＰ）を認識するバクテリオ ファージＰ１から単離された組換え酵素である。（ｃｒｅタンパク質により触媒 される）２個のｌｏｘＰ部位間の組換えにより、ある場合に、これらの部位が両 側に位置する配列の喪失が生じる［総説には、Ｎ．Ｋｉｌｂｙ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． 、９：４１３−４２１（１９９３）を参照］。ｃｒｅの配列はＮ ．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８７：１９７−２１２（ １９８６）中に与えられており、あるいは、他の商業的及び学術的供給者から入 手することができる。細胞におけるｃｒｅタンパク質の発現は本発明の方法にと って必須である。 理論に結びつけられると思わずに、本発明者等は宿主細胞におけるｃｒｅ組換 え酵素の発現により、第二ベクター中のプロモーターとｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子の 間に存在する「スペーサー」ＤＮＡ配列を欠失させることができると考える。こ のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子抑制配列の欠失によりｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を 発現及び活性化することができ、そしてＡＡＶゲノムの複製及びパッケージング をもたらす。 ｃｒｅタンパク質を２つの選択肢の方法で与えることができる。タンパク質を コードする遺伝子が適切な宿主細胞中にトランスフェクトされる別の成分であっ てもよい。あるいは、ｒＡＡＶの発現のために選択される宿主細胞が構成的にま たは誘導性プロモーターの下でｃｒｅタンパク質を発現してもよい。 Ｂ． 三重感染／トランスフェクション法 本発明の一つの態様として、本方法はｒＡＡＶの生産のために選択し た宿主細胞に感染／トランスフェクトさせるために３個のベクター、すなわち、 組換えウイルスまたはプラスミドを用いる。第一ベクターは発現制御配列に適切 に連結されたｃｒｅ導入遺伝子を含んでなる。第二ベクターはスペーサー配列の 下流にＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含んでなり、スペーサー配列はｌｏｘ 部位が両側に位置し、そしてそれ自体が発現制御配列の下流にある。第三ベクタ ーは治療ミニ遺伝子、すなわち、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に位置する導入遺伝子及 び調節配列を含んでなる。これらのベクターを宿主細胞中に導入するために適当 な技術は以下に説明され、そして当業者に知られている。全てのベクターが細胞 中に存在し、そして細胞にヘルパー機能が与えられる場合に、ｒＡＡＶは効率よ く生産される。 １． 第一ベクター 上に記述したように、好ましい態様として、第一ベクターは発現制御配列に適 切に連結されたｃｒｅ導入遺伝子をアデノウイルスＥ１欠失の位置に含有する組 み換え複製欠損性アデノウイルス、例えば、Ａｄ．ＣＭＶ．ＮＬＳ−ＣＲＥであ る。図５参照。好ましくは、以下の実施例におけるように、ｃｒｅ遺伝子は適当 な核局在化シグナル（ＮＬＳ）に適切に連結される。適当なＮＬＳは短い配列、 すなわち、約２１ｂｐの範囲であり、通常の技術を用いてそれを容易に合成する ことができ、またはＰＣＲプライマー中にＮＬＳ配列を含むことによりベクター 上に作製することができる。以下の実施例１に詳細に記述されるように、ｃｒｅ 遺伝子及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）は以前に記述されたプラスミドから得ら れる。 望ましくは、ｃｒｅ遺伝子はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期 プロモーター／エンハンサー［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ等、Ｃｅｌｌ、４１：５ ２１−５３０（１９８５）を参照］の制御下にある。しかしながら、当業者は他 の適当なプロモーターを容易に選択することができる。有用なプロモーターは構 成性プロモーターまたは調節性（誘導性）プロモーターであってもよく、発現さ れるｃｒｅ遺伝子産物の量を制御することができる。例えば、別の適当なプロモ ーターは、限定することなしにラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハ ンサーを含む。当業者はさらに別のプロモーター／エンハンサー配列を選択する ことができる。 さらに、組換えウイルスはベクターでトランスフェクトした細胞においてｃｒ ｅ組換え酵素の発現を導くために必要な通常の調節成分も含む。そのような調節 成分は当業者に知られており、限定することなしにポリＡ配列、複製起点等を含 む。 ２． 第二ベクター 本方法のこの態様に有用なもう一つの「第二」ベクターはＡｄ．Ｓｐ．Ｒｅｐ ／Ｃａｐとして実施例２に記述される。それはスペーサー配列の下流にＡＡＶ ｒｅｐ 及びｃａｐ遺伝子を含有し、スペーサー配列はｌｏｘ部位が両側に位置し 、それ自体が発現制御配列の下流にある。 ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ配列は常法により得られる。好ましくは、プロモー ターはＡＡＶ Ｐ５プロモーターである。しかしながら、当業者は他の適当なプ ロモーターを容易に代用することができる。そのようなプロモーターの例は第一 ベクターに関連して上に説明される。 スペーサーはプロモーターと遺伝子の間の介在ＤＮＡ配列（ＳＴＯＰ）である 。それはｌｏｘＰが両側に位置し、そして多数の翻訳開始及び終 結コドンを含む。スペーサーは「組換えにより活性化される遺伝子発現（ＲＡＧ Ｅ）」法［Ｂ．Ｓａｕｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２２５：８９ ０−９００（１９９３）］を用いることがきるように設計される。そのような方 法は与えられた遺伝子（この場合、ｒｅｐ／ｃａｐ）の発現を制御する。ｒｅｐ ／ｃａｐを発現させるためには、スペーサーは第一ベクターのｃｒｅタンパク質 の発現及びそのｌｏｘ配列との相互作用により切り出されなければならない。 現在、２つの特に好ましいスペーサーがある。これらのスペーサーは以下に記 述するように市販のプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得られるＧＦＰ ｃＤ ＮＡ、イントロン及びポリアデニル化シグナルを含有する１６００ｂｐ ＤＮＡ フラグメント（図１）を含む。もう一つの好ましいスペーサーは記述されたよう な［Ｍ．Ａｎｔｏｎ及びＦ．Ｇｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：４６００ −４６０６（１９９５）］ｐＢＳ６４の１．３ｋｂｐ ＳｃａＩ−ＳｍａＩフラ グメントとして得られる翻訳開始及び終結配列を含有する１３００ｂｐフラグメ ントである。別の望ましいスペーサーはネオマイシン耐性コーディング配列及び ポリアデニル化シグナルを含有する１０００ｂｐフラグメントである［Ｙ．Ｋａ ｎｅｇａｅ等、ＮｕｃＩ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３：３８１６−３８２１（ １９９５）］（図２参照）。 本明細書に与えられる情報を用いて、長さ、少なくとも１組の翻訳開始及び終 結シグナルの存在並びに場合によりポリアデニル化部位の存在のような因子を考 慮して、当業者は他の適当なスペーサーを選択及び設計することができる。これ らのスペーサーは典型的に最後の２つの成分（すなわち、開始／終結及びポリＡ 部位）を含む遺伝子を含有してもよ い。望ましくは、組み換えの可能性を減らすために、スペーサーは２ｋｂｐ未満 の長さである。しかしながら、本発明はそのように限定されない。 以下に記述するように、スペーサーにはｌｏｘＰ部位が両側に位置し、それは ｃｒｅタンパク質により認識され、そしてスペーサーの欠失に関与する。ｌｏｘ Ｐ の配列は様々な出典［Ｒ．Ｈ．Ｈｏｅｓｓ及びＫ．Ａｂｒｅｍｓｋｉ、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 、８１：１０２６−１０２９（１９８４） ］から公的に利用できる。適当なスペーサーを選択し、そして既知の技術を利用 すると、本発明の方法における使用のためにスペーサー配列の末端にｌｏｘＰ部 位を容易に作製することができる。 さらに、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びスペーサーを保有する組み換えウイルスは 、ｌｏｘＰが両側に位置するスペーサーをｃｒｅ組換え酵素により切り出した後 に、組換えウイルスでトランスフェクトされた細胞においてｒｅｐ及びｃａｐの 発現を導くために必要な通常の調節成分も含む。そのような調節成分は当業者に 知られている。 ３． 第三ベクター 第三ベクターは適当な導入遺伝子、プロモーター及び導入遺伝子の発現のため に必要な他の調節成分を含んでなる配列として定義されるミニ遺伝子を含有し、 これら全体の両側にＡＡＶ ＩＴＲが位置する。第三ベクターがＬａｃＺ遺伝子 を保有する以下の実施例において、ｒＡＡＶの存在はβ−ガラクトシダーゼ活性 のアッセイにより検出される。しかしながら、望ましくは、第三ベクターはこの 方法で生産されるｒＡＡＶにより動物に送達することができる治療遺伝子を保有 する。 用いられるＡＡＶ配列は好ましくはシスに作用する５’及び３’逆方向末端反 復配列（ＩＴＲ）配列［例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」中、編集、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ、ＣＲＣ Ｐ ｒｅｓｓ、ｐｐ．１５５−１６８（１９９０）を参照］である。ＩＴＲ配列は約 １４３ｂｐの長さである。この使用にはこれらの配列のある程度のわずかな改変 が許容されると考えられるが、好ましくは、ＩＴＲをコードする実質的に全配列 をベクター中に用いる。これらのＩＴＲ配列を改変する技量は当該分野の技術の 範囲内である。［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９ ８９）のような研究書；Ｃａｒｔｅｒ等、上に引用；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 、７０：５２０−５３２（１９９６）を参照］。 現在同定されているヒトＡＡＶ型を初めとするあらゆる既知のＡＡＶからＡＡ Ｖ ＩＴＲ配列を得ることができる。同様に、他の動物に感染することが知られ ているＡＡＶも本発明のベクター構築に用いることができる。ＡＡＶの選択は以 下の発明を限定すると思われない。各種ＡＡＶ株、１−４型はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手でき、または様々 な商業的及び機関の供給者から要求に応じて入手可能である。以下の代表的な態 様では便宜上ＡＡＶ−２を用いる。 ５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は選択した導入遺伝子配列及び結合した調節 成分の両側に位置する。ベクターの導入遺伝子配列は目的のポ リペプチドまたはタンパク質をコードする、ＡＡＶ配列に対して異種起源の核酸 配列である。導入遺伝子配列の性質は得られるベクターが用いられる用途により 決まる。例えば、導入遺伝子配列の一つの型は、発現時に検出できるシグナルを 生じるレポーター配列を含む。そのようなレポーター配列は限定することなしに 大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）ｃＤＮＡ、アルカリホスファターゼ遺 伝子及びグリーン蛍光タンパク質遺伝子を含む。これらの配列は、それらの発現 を導く調節配列と結合されると、常法、例えば、紫外線波長吸光度、肉眼で見え る色の変化等により検出できるシグナルを与える。 導入遺伝子配列のより好ましい型は宿主細胞において適切な遺伝子産物を発現 する治療遺伝子である。これらの治療核酸配列は典型的に遺伝的もしくは非遺伝 的遺伝子欠損を置き換えるかもしくは修正するため、または後成的疾患もしくは 疾病を処置するためにインビボまたはエクスビボで患者に投与し、そして発現さ せるための産物をコードする。導入遺伝子配列の選択は本発明の制限ではない。 上に同定される主要な成分に加えて、ミニ遺伝子はこのベクターでトランスフ ェクトされた細胞において導入遺伝子の発現を導くために必要な通常の調節成分 も含む。従って、導入遺伝子に連結され、そしてＡＡＶ ＩＴＲ配列の間の導入 遺伝子内に位置する選択されたプロモーターをミニ遺伝子は含んでなる。 導入遺伝子の発現を導くために用いられるプロモーターの選択は日常的なこと であり、ベクターの制限ではない。有用なプロモーターは第一ベクター成分に関 連して上に説明されるものを含む。 また、ミニ遺伝子は望ましくは転写産物の効率よいポリアデニル化の ために必要なシグナルを与える配列並びに機能的なスプライス供与及び受容部位 を含むイントロンを初めとする異種起源の核酸配列を含む。本発明の代表的なベ クターに用いられる共通のポリ−Ａ配列はパポーバウイルスＳＶ−４０から得ら れるものである。通常、ポリ−Ａ配列は導入遺伝子配列の後ろで且つ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。共通のイントロン配列もＳＶ−４０から得られ 、ＳＶ−４０ Ｔイントロン配列と呼ばれる。また、本発明のミニ遺伝子は、望 ましくは、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子の間に位置する上述の ようなイントロンも含む。これら及び他の共通のベクター成分の選択は慣例であ り、多数のそのような配列が利用できる［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等及びそれ に引用される参考文献を参照］。 ミニ遺伝子を含有するｒＡＡＶベクターをプラスミドバックボーン上に保有し 、選択した宿主細胞をトランスフェクトするために用いてもよく、または選択し た宿主細胞にそれが感染できるようにするウイルス配列（例えば、アデノウイル ス配列）が両側に位置してもよい。適当なＡｄ／ＡＡＶ組み換えウイルスを既知 の技術により製造することができる。例えば、引用することにより本明細書に組 み込まれる１９９６年５月９日に公開された国際特許出願ＷＯ９６／１３５９８ 号；１９９５年９月８日に公開されたＷＯ９５／２３８６７号及び１９９５年３ 月９日に公開されたＷＯ９５／０６７４３号を参照。 Ｃ． 宿主細胞／二重感染またはトランスフェクション系 本発明の方法の別の態様として、ｃｒｅ組換え酵素を発現するパッケージング 細胞系を構築する。本方法のこの態様により、ｃｒｅ組換え酵素を発現するこの 細胞系を上記のようなｃｒｅ遺伝子を保有するベクタ ーまたはプラスミドの代わりにすることができる。従って、上記の第二及び第三 ベクターのみを続いて細胞中に導入する。 代表的な適当なｃｒｅ発現細胞系は図３に示されるベクターを用いて作製され ている。この細胞系の作製は以下の実施例４に詳細に記述される。しかしながら 、本発明はこれらの構築物に限定されない。本明細書に与えられる情報を与えら れれば、当業者は適当な選択マーカー（例えば、ｎｅｏ^R）を含有する別のプラ スミドを容易に作製することができる。次に、そのようなプラスミドを本発明の ｃｒｅ組み換え酵素発現細胞系の作製のために用いることができる。 そのようなｃｒｅを発現する細胞系を得ると、この細胞系に上記のｒｅｐ／ｃ ａｐ遺伝子を含有するベクター及びミニ遺伝子を含有するベクターを感染（また はトランスフェクト）させることができる。 Ｄ． ベクター及びｒＡＡＶの製造 上記のベクターの各々の中に含まれる選択したＤＮＡ配列の組み立ては通常の 技術を利用する。そのような技術は研究書［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上に引用］中 に記述されるもののようなｃＤＮＡクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み 合わせたアデノウイルス、ＡＡＶゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使 用及び所望するヌクレオチド配列を与える他の適当な方法を含む。 ３個のベクター系、またはｃｒｅを発現する宿主細胞と２個のベクターを用い ようと、宿主細胞中へのベクターの導入は既知の技術を用いて成し遂げられる。 適切な場合、相補性ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞系（トランスに作用するＥ １ａタンパク質を与える機能的なアデノウイルスＥ１ａ遺伝子を含有するヒト腎 臓細胞系）を用いて標準的なトラン スフェクション及び同時トランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ₄トラン スフェクション技術を利用する。本発明に用いられる他の常法はウイルスゲノム の相同的組み換え、寒天オーバーレイにおけるウイルスのプラーク形成、シグナ ル生成を測定する方法等を含む。 感染／トランスフェクション後に、宿主細胞を次に標準条件下で培養してｒＡ ＡＶを生産できるようにする。例えば、Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ及びＬ．Ｐｒｅｖ ｅｃ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１０９−１２８（１９９１） を参照。望ましくは、常法によりいったんｒＡＡＶが同定されると、標準技術を 用いてそれを回収し、精製することができる。 以下の実施例は本発明の好ましい方法を示す。これらの実施例は実例であり、 本発明の範囲を限定すると考えられない。実施例１−Ａｄ．ＣＭＶ．ＮＬＳ−ＣＲＥの構築 サイトメガロウイルスプロモーターの制御下に核局在化シグナル及びｃｒｅ遺 伝子を含有する組み換えアデノウイルスの構築を図５に関して以下に記述する。 ＳｆｃｉＩ及びＰａｃＩで消化し、次にクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化することによりプラスミドｐｅｘＣＡＮＣＲＥ ［Ｙ．Ｋａｎｅｇａｅ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３：３８１６− ３８２１（１９９５）］からｎｌｓ−ＣｒｅｃＤＮＡを単離した。次に、ＮＬＳ −ＣｒｅフラグメントをプラスミドｐＡｄ．ＣＭＶ．Ｌｉｎｋ（Ｘ．Ｙｅ等、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． 、２７１：３６３９−３６４６（１９９６）中に記述さ れるようにＥ１ａ及びＥ１ｂを欠失している、ヒトＡｄ５配列、地図単位０ない し１６を 含有するプラスミド）のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。得られたプラスミド ｐＡｄ．ＣＭＶ．ＮＬＳ−ＣＲＥ中の核局在化シグナルの方向及び存在をシーク エンシングにより確かめた。 ｃｒｅ導入遺伝子を保有する組換えアデノウイルスを生産するために、ｐＡｄ ．ＣＭＶ．ＮＬＳ−ＣＲＥ組み換えベクターを２９３細胞中にＡｄ ｄ１３２７ バックボーンと同時にトランスフェクトした。１０日後に、１５個のプラークを 選択し、それらの５個を２９３細胞で増やした。Ｙ．Ｋａｎｅｇａｅ等、Ｎｕｃ ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． 、２３：３８１６−３８２１（１９９５）中に記述さ れるアデノウイルス構築物を用いてＣＡＧプロモーター（β−アクチン）とバク テリアのＬａｃＺコーディング配列の間に位置するスペーサーを取り除く能力を 評価することにより、ウイルスをそれらの組換え酵素活性に関してスクリーニン グした。２個のウイルスがβ−ガラクトシダーゼ活性に関して陽性の結果であり 、これはｃｒｅ組換え酵素活性を示している。必要な場合、これらの組換えウイ ルスを２回のプラーク精製により精製することができる。実施例２−Ａｄ．ｓｐ．Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築 ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有する代表的な組換えアデノウイルスを 以下のように製造することができる。 以下のプライマー対： ＸｂａＩ ＩＴＲ右向き：配列番号２ Ｂａｍ Ｐ５右向き：配列番号３Ｂａｍ Ｐ５左向き：配列番号４ ＳａｃＩ左向き：配列番号５ を用いてＰＣＲにより全ＡＡＶ２ゲノム［Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｊ．Ｖ ｉｒｏｌ． 、６１：３０９６−３１０１（１９８７）］を含有するプラスミドｐｓｕｂ２０１ からの１２１ｂｐのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントからＡＡＶ Ｐ５プロモーターを得た。 Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子の５’部分を同様にｐｓｕｂ２０１から得られるＢａｍ ＨＩ−ＳａｃＩフラグメント（５０４ｂｐ）からＰＣＲにより取り出した。Ｂａ ｍＨＩ ＰＣＲプライマーはｒｅｐ ｍＲＮＡと最初のｒｅｐ ＡＴＧの間に唯 一の部位を生じる。 Ｐ５プロモーター及びＲｅｐ／Ｃａｐ遺伝子フラグメントをｐＳＰ７２ベクタ ー（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｂａＩ−ＳａｃＩ部位にサブクローン化し、ｐ５．Ｒ ｅｐ／Ｃａｐを生じた。ＢａｍＨＩでの消化後にプラスミドｐＭＡ１９［Ｍ．Ａ ｎｔｏｎ及びＦ．Ｇｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：４６００−４６０６ （１９９５）］からスペーサーＤＮＡ、ＬｏｘＰ部位が両側に位置する１３００ ｂｐフラグメントを得た。このスペーサーＤＮＡをＰ５．Ｒｅｐ／Ｃａｐ構築物 の唯一のＢａｍＨＩ部位にクローン化し、Ｐ５．スペーサー．Ｒｅｐ／Ｃａｐ構 築物を生じた。 Ｐ５．スペーサー．Ｒｅｐ／ＣａｐプラスミドのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ部位に Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子の３’部分（ＳａｃＩ／平滑末端化フラグメント、３６８ ０ｂｐ）をサブクローン化することにより、プロモーター、スペーサー及びｒｅ ｐ／Ｃａｐ遺伝子を含有する完全なフラグメ ントを得た。（完全な野生型ＡＡＶゲノムを含有する）ＳＳＶ９プラスミドから ＳａｃＩ−平滑末端化フラグメントとしてＲｅｐ／Ｃａｐ遺伝子の３’部分を単 離した。これはＳＳＶ９をＸｂａＩで消化し、ＸｂａＩ部位をクレノウで埋め、 そしてＳａｃＩで消化することによりそのフラグメントを遊離することを伴った 。 Ｐ５プロモーター、スペーサー及びｒｅｐ／ｃａｐ配列を含有する完全なフラ グメントをｐＡｄ．ｌｉｎｋベクターのＢｇｌII部位にサブクローン化した。Ｐ ５．スペーサー．Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド構築物の５’末端にＢｇｌIIリンカ ーを付加し、そしてｐＳＰ７２のマルチプルクローニング部位の３’末端に位置 するＢｇｌIIを用いることによりこれを成し遂げた。 得られたプラスミド（１１２５０ｂｐ）はＡｄ５地図単位（ｍｕ）０−１、Ｐ ５プロモーター、ｌｏｘＰ部位が両側に位置するスペーサー配列、ｒｅｐ／ｃａ ｐ及びＡｄ５ｍｕ９−１６を含有する。このプラスミドをｐＡｄ．Ｐ５．スペー サー．Ｒｅｐ／Ｃａｐ［図４］と称する。 ｒｅｐ及びｃａｐを発現することができる組み換えアデノウイルスを生産する ために、まず、（ｃｒｅ組換え酵素により触媒される）ｌｏｘＰ部位間の組換え 後にスペーサーを取り除くことができるかどうかを決定するために、ｐＡｄ．Ｐ ５．スペーサー．Ｒｅｐ／Ｃａｐを用いてｃｒｅを発現するバクテリア株大腸菌 株ＢＮＮ１３２（ＡＴＣＣ受託番号４７０５９）を形質転換した。いくつかの形 質転換コロニーから単離したプラスミドＤＮＡのアガロースゲルでの分析から、 実際に、分析した構築物の大部分が形質転換後にスペーサーを失うことが示され た（データは示さない）。 また、プラスミドＰ５．スペーサー．Ｒｅｐ／ＣａｐをＨＥＫ２９３細胞にＡ ｄ ｄｌ３２７バックボーンと同時にトランスフェクトした。１０日後に、２０ 個のプラークを選択し、増やした。完全なＡＡＶゲノム及び１３００ｂｐ ＤＮ Ａスペーサーをプローブとして用いてサザンブロットによりウイルスの構造を分 析した。１個のプラーク（Ｐ３）が制限酵素ＢａｍＨＩでの消化後に予想される バンドパターンを示した（データは示さない）。 他の適当なスペーサーを用いて同様な構築物を作製することができる。例えば 、ヒト化されたＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドｐｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔプラス ミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から１６００ｂｐスペーサーを得た。ｐｈＧＦＰ−Ｓ ６５Ｔを制限酵素ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで切断した。５’末端にＢｇｌII リンカーを付加した後（ＢｇｌIIはＢａｍＨＩと合致する）、フラグメントの両 側にｌｏｘＰ部位を付加するために１．６ｋｂフラグメントをｆｌｏｘベクター ［Ｈ．Ｇｕ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５：１０３−１０６（１９９４）］のＢａ ｍＨＩ部位にサブクローン化した。次に、ｌｏｘＰ部位が両側に位置するＧＦＰ ＤＮＡフラグメントをＰｖｕＩ及びＳｍａＩで切断し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIクローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位にサブク ローン化した。得られたＧＦＰスペーサーを用いて上記のようなＰ５．スペーサ ー．Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドまたはアデノウイルスを構築することができる。実施例３−ｒＡＡＶの生産 実施例２に記述した研究から得られた（ウイルスを含有する）いくつかのプラ ークからの上清を、上の実施例１に記述したように構築された ｃｒｅタンパク質をコードするアデノウイルス及びｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺを含 む機能的アッセイにおいてＡＡＶを生産する能力に関して試験した。 プラスミドｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子がＣＭＶプロモ ーターからβ−ガラクトシダーゼを発現するミニ遺伝子で置き換えられているｒ ＡＡＶカセットである。ｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの直線配列は： （ａ）ｐＡＶ２［Ｃ．Ａ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ等、Ｇｅｎｅ、２３：６５−７３ （１９８３）］を鋳型として用いてＰＣＲにより得られた５’ＡＡＶ ＩＴＲ（ ｂｐ １−１７３）［配列番号１のヌクレオチド番号３６５−５３８］、 （ｂ）ＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーター［Ｂｏｓｈａｒｔ等、Ｃｅｌ ｌ 、４１：５２１−５３０（１９８５）；配列番号１のヌクレオチド番号５６３ −１１５７］、 （ｃ）ＳＶ４０イントロン（配列番号１のヌクレオチド番号１１７８−１１７ ９）、 （ｄ）大腸菌β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ（配列番号１のヌクレオチド番号 １３５６−４８２７）、 （ｅ）ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（初期及び後期転写単位の両方からの 開裂／ポリ−Ａシグナルを含有する２３７ ＢａｍＨＩ−Ｂｃ１Ｉ制限フラグメ ント；配列番号１のヌクレオチド番号４８３９−５０３７）及び （ｆ）ｐＡＶ２からＳｎａＢＩ−ＢｇｌIIフラグメントとして得られた３’Ａ ＡＶ ＩＴＲ（配列番号１のヌクレオチド番号５０５３−５２ ２１） を含む。 ｃｒｅウイルス及びＲｅｐ／Ｃａｐウイルスに２９３細胞を感染させ（感染多 重度（ＭＯＩ）１０）、続いて２時間後に５μｇのｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺでト ランスフェクションすることにより機能的アッセイを実施した。４８時間後に、 細胞を集め、凍結融解した。（ｒＡＡＶを含有する）上清の１／５を用いて２９ ３細胞に感染させた。２４時間後にＸ−ｇａｌアッセイを実施した。 プラーク＃３からのウイルスはこのアッセイにおいてβ−ガラクトシダーゼ形 質導入に関して陽性をもたらした。プラーク＃３からの上清を２回目の精製（プ ラーク増幅）に用いた。２０個のプラークを選択し、増やした。実施例４−Ｃｒｅを発現する細胞系の製造 ２９３細胞のトランスフェクションに用いるためにプラスミドベクター、ｐＧ ．ＣＭＶ．ｎｌｓ．ｃｒｅを以下のように構築した。ｎｌｓ−Ｃｒｅ ｃＤＮＡ を上の実施例１に記述したようにプラスミドｐｅｘＣＡＮＣＲＥ（Ｋａｎｅｇａ ｅ、上に引用）から単離した。次に、ｎｌｓ−Ｃｒｅフラグメントをベクターｐ ＧのＣＭＶプロモーターの下流のＸｂａＩ部位にサブクローン化した。このプラ スミドベクターは図３に示され、ｐＵＣ１９のバックボーン上にヒト成長ホルモ ン（ｈＧＨ）終結配列、ＳＶ４０ｏｒｉシグナル、ネオマイシン耐性マーカー、 ＳＶ４０ポリアデニル化部位、アンピシリンマーカーを含有する。 通常の技術を用いてこのプラスミドを２９３細胞中にトランスフェクトした。 Ｇ−４１８の存在下でネオマイシン耐性に関して細胞を選択し た。バクテリアのＬａｃＺ遺伝子が続く２個のｌｏｘＰ部位が両側に位置するネ オマイシンスペーサーＤＮＡによりβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターから隔 てられたバクテリアのＬａｃＺコーディング配列を含有するアデノウイルス、Ａ ｄ．ＣＡＧ．Ｓｐ．ＬａｃＺを異なるＭＯＩ（１ないし１００）で細胞に感染さ せることにより細胞を同定した。スペーサーフラグメントを取り除いてＬａｃＺ 遺伝子の発現を導く能力に基づいて細胞を選択した。Ｘ−ｇａｌ染色後に、６個 の細胞系が陽性であると分かった。これらの感染細胞からＤＮＡを単離し、スペ ーサーＤＮＡ（ＮＥＯ）をプローブとして用いてサザンブロットにより分析した 。結果を表１に関して図６Ａに示し、図６Ｂ−６Ｄは細胞系＃２が分析した他の ２９３／ｃｒｅ細胞系よりかなり優れた効能でＤＮＡスペーサーを取り除くこと ができることを示す。 実施例５−Ａｄ．ＧＦＰ Ｒｅｐ／Ｃａｐの作製 Ａｄ．Ｓｐ．Ｒｅｐ／Ｃａｐウイルスの構築に関して実施例２に記述したよう に、Ｐ５プロモーター、２個のｌｏｘＰ部位が両側に位置するＧＦＰスペーサー 並びにＲｅｐ及びＣａｐコーディング配列を含有するリンクプラスミドをＨＥＫ ２９３細胞中にＡｄ ｄ１３２７バックボーンと同時にトランスフェクトした。 １０日後に、２０個のプラークを選択し、増やした。この増殖中に、４７０−４ ９０ｎｍ帯域励起フィルタ ー（Ｎｉｋｏｎ）で水銀灯を用いて顕微鏡分析によりＧＦＰの発現に関してＨＥ Ｋ２９３細胞の単層をスクリーニングした。単層の一つ（プラーク＃１３から） はＧＦＰの発現に関して陽性の領域を示した。この領域をさらに増やし、さらに ２回のプラーク精製により精製した。記述したようなＧＦＰの発現により、そし て／または特異的モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いたウェスタンブロット分析によるＲｅｐ及 びＣａｐタンパク質の発現によりＡｄ．ＧＦＰ．Ｒｅｐ／Ｃａｐウイルスの存在 を調べた。２９３細胞に感染させるためにＡｄ．ＧＦＰ ｒｅｐ／ｃａｐを含有 する（１個の精製されたプラークからの）１つの細胞ライセートを用いた（ＨＥ Ｋ２９３細胞の４０ ｘ １５０ｍｍ皿を用いたアデノウイルス調製物）。精製 後に全部で６．８６ ｘ １０¹³粒子／ｍｌを得た。実施例３に記述したように 、ｒＡＡＶの生産に関してこのウイルスを現在試験している。実施例６−Ａｄ．ＴＲＥ．ＣＭＶ．ＧＦＰ．Ｒｅｐ／ｃａｐの構築 図７にＡｄ．ＴＲＥ．ＣＭＶ．Ｒｅｐ／Ｃａｐウイルスの最終構造を示す。Ａ ＡＶＰ５プロモーターをテトラサイクリン（Ｔｅｔ）誘導性プロモーター（Ｃｌ ｏｎｔｅｃｈ）で置き換えた。このプロモーターはテトラサイクリン応答配列（ ＴＲＥ）及びそれに続くＣＭＶエンハンサーを含まないＣＭＶ最小プロモーター を含む。ＧＰ１６転写活性化ドメインに融合されたｒＴｅｔＲ（逆Ｔｅｔリプレ ッサー）を発現する安定な遺伝子を含有する２９３／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞系（Ｃｌ ｏｎｔｅｃｈ）において抗生物質のドキシサクリン（Ｓｉｇｍａ）の存在下でこ のプロモーターは誘導できる。ここでの目的は細胞毒性のＲｅｐ遺伝子産物の 発現を制限するために２重誘導性発現系を構築することである。Ｒｅｐ及びＣａ ｐ遺伝子の発現を完全に誘導するためには、ウイルスは１−ｃｒｅ組換え酵素（ 先に記述したようにＧＦＰスペーサーを欠失させるために）及び２−Ｔｅｔ−Ｏ ｎ誘導性因子ドキシサクリン（ＤＯＸ）の存在下でなければならない。 上記の構築物を含有するリンクプラスミドを用いてＤＯＸ及び／または（ｎｌ ｓ−ｃｒｅを発現するアデノウイルスからの）ｃｒｅ組換え酵素の存在または非 存在下でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。細胞ホモジネートからのタ ンパク質をＲｅｐ抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。Ｒｅｐタン パク質はＤＯＸ及びｃｒｅ組み換え酵素の存在下のみで完全に誘導される。 ｐＡｄ．ＴＲＥ．ＣＭＶ．ｌｉｎｋ．１を構築するために、ｐＴＲＥプラスミ ド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ及びＥｃｏＲＩで切断 してＴＲＥ及び最小ＣＭＶプロモーターを単離した。Ｘｈｏ及びＥｃｏＲＩ部位 をクレノウで埋め、この４４８ｂｐフラグメントをｐＡｄｌｉｎｋ．１プラスミ ドのＥｃｏＲＶ部位に挿入した。続いて、ＧＦＰ．Ｒｅｐ／Ｃａｐフラグメント をＣｌａＩ及びＢｇｌIIIで切断し、ＣｌａＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＡｄ ．ＴＲＥ．ＣＭＶ．Ｌｉｎｋ．１に挿入した。 このリンク組み換えプラスミドをＨＥＫ２９３細胞中にＡｄ ｄｌ３２７バッ クボーンと同時にトランスフェクトした。１０日後に、２０個のプラークを選択 し、増やした。現在、ＧＦＰ並びにＲｅｐ及びＣａｐタンパク質の発現に関して これらのプラークを分析している。多量のｒｅｐタンパク質を発現する２個のア デノウイルスを同定した。現在、こ れらのウイルスを精製し、研究している。 本発明の多数の修正及び改変は上に同定される明細書中に含まれ、そして当業 者にとって明らかであると考えられる。本発明の方法に対するそのような修正及 び改変はここに付加される請求の範囲の中に包含されると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フアニユーフ，ダニエル アメリカ合衆国ペンシルベニア州19107フ イラデルフイア・チエスナツトストリート 834・アパートメント1032

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）取り除かれるとｒｅｐ及びｃａｐの活性化を導くｒｅｐ及びｃａ ｐ 遺伝子抑制配列をスプライシングして除くことを可能にするｃｒｅ導入遺伝子 、 （ｂ）５’にスペーサーを有するＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子で、 該スペーサーにはｌｏｘ部位が両側に位置する； （ｃ）ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が両側に位置する治療導入 遺伝子を含んでなるミニ遺伝子； を含んでなり且つ発現することができる宿主細胞を十分なヘルパーウイルス機能 の存在下で培養することを含んでなり、該導入遺伝子を発現することができる組 換えＡＡＶが生産される、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。 ２． （ａ）ｉ．ｃｒｅ組換え酵素の発現を可能にする配列の制御下にｃｒｅ 遺伝子を含んでなる第一ベクター； ｉｉ．５’から３’に向かって、選択したプロモーター、ｌｏｘ Ｐ 部位が両側に位置するスペーサー配列、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃ ａｐ 遺伝子を含んでなる第二ベクター； ｉｉｉ．５’から３’に向かって、本質的に５’ＡＡＶ逆方向末 端反復配列（ＩＴＲ）、選択したプロモーター、選択した導入遺伝子及び３’Ａ ＡＶ ＩＴＲからなるミニ遺伝子を含んでなる第三ベクター を選択した宿主細胞中に導入し、 （ｂ）ｃｒｅ組換え酵素の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養し 、そして （ｃ）該導入遺伝子の産物を発現することができる組み換えＡＡＶを回 収する ことをさらに含んでなる請求の範囲１の方法。 ３． 該ベクターの少なくとも１つが組換えアデノウイルスであり、そして宿 主細胞が２９３細胞である請求の範囲１の方法。 ４． 第一ベクターが組換えアデノウイルスであり、発現を可能にする配列が サイトメガロウイルスプロモーターを含んでなり、ベクターがｃｒｅ遺伝子に適 切に連結された核局在化シグナルをさらに含んでなる請求の範囲１の方法。 ５． 第二ベクターが組換えアデノウイルスであり、そして選択したプロモー ターがＡＡＶ Ｐ５を含んでなる請求の範囲１の方法。 ６． スペーサー配列が （ａ）翻訳開始及び終結配列を含有する１３００ｂｐフラグメント； （ｂ）ＧＦＰ ｃＤＮＡ、イントロン及びポリアデニル化シグナルを含有する １６００ｂｐフラグメント；並びに （ｃ）ネオマイシンコーディング配列及びポリアデニル化シグナルを含有する １０００ｂｐフラグメントよりなる群から選択される請求の範囲５の方法。 ７． （ａ）ｃｒｅを発現する宿主細胞を生ぜしめ； （ｂ）５’から３’に向かって、選択したプロモーター、ｌｏｘＰ部位 が両側に位置するスペーサー配列、並びにＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含 んでなる第一ベクター；並びに ５’から３’に向かって、本質的に５’ＡＡＶ逆方向末端反復配 列（ＩＴＲ）、選択したプロモーター、選択した導入遺伝子及 び３’ＡＡＶ ＩＴＲからなるミニ遺伝子を含んでなる第二ベクターを該宿主細 胞中に導入し； （ｃ）ｃｒｅ組換え酵素の発現並びに組換えＡＡＶの複製及びパッケー ジングを可能にする条件下で宿主細胞を培養し；そして （ｄ）導入遺伝子の産物を発現することができる組換えＡＡＶを回収す る ことを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生産方法。 ８． 第一及び第二ベクターが組換えアデノウイルスである請求の範囲７の方 法。 ９． スペーサー配列が （ａ）翻訳開始及び終結配列を含有する１３００ｂｐフラグメント； （ｂ）ＧＦＰ ｃＤＮＡ、イントロン及びポリアデニル化シグナルを含有する １６００ｂｐフラグメント；並びに （ｃ）ネオマイシンコーディング配列及びポリアデニル化シグナルを含有する １０００ｂｐフラグメントよりなる群から選択される請求の範囲８の方法。 １０． 請求の範囲１−９のいずれかの方法により生産される組み換えＡＡＶ 。