DE10159167A1

DE10159167A1 - Expressionssystem

Info

Publication number: DE10159167A1
Application number: DE10159167A
Authority: DE
Inventors: Guenter Cichon
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-12-03
Filing date: 2001-12-03
Publication date: 2003-10-02

Abstract

Es wird ein Expressionssystem angegeben, das einen Helfer-abhängigen Vektor und ein Helfer-Virus umfasst. Der Helfer-abhängige Vektor umfasst ein für eine Rekombinase codierendes Gen. Das Helfer-Viruas umfasst a) ein Paar Erkennungssequenzen zur Erkennung durch die vom Helfer-abhängigen Vektor codierte Rekombinase, wobei die Erkennungssequenzen einen durch die Rekombinase entfernbaren Abschnitt einschließen, b) ein für die Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus und des Helfer-abhängigen Vektors notwendiges Schaltergen und einen für die Expression des Schaltergens notwendigen Promoter, wobei das Paar Erkennungssequenzen so zwischen Promoter und Schaltergen angeordnet ist, dass das Schaltergen exprimierbar wird, wenn der entfernbare Abschnitt entfernt ist, und c) ein zur Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus notwendiges cis-wirkendes Element, angeordnet im entfernbaren Abschnitt. Ferner werden Anwendungen des Expressionssystems angegeben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Expressionssystem sowie als dessen Bestandteile einen Helfer-abhängigen Vektor und ein Helfer-Virus. Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zum Vermehren und/oder Verpacken eines Helfer-abhängigen Vektors in einem solchen Expressionssystem. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Exprimieren eines Zielgens in einem Zielorganismus sowie die Verwendung eines Expressionssystems zur Expression eines Zielgens in einem Zielorganismus, zum Vermehren und/oder Verpacken eines Helfer-abhängigen Vektors sowie zum Herstellen eines Arzneimittels. Die Erfindung betrifft zudem das Arzneimittel selbst sowie ein Arzneimittelsystem, das Arzneimittel umfassend.

Auf zahlreichen biotechnologischen Gebieten besteht das Problem, in eukaryontischen Zellen (Zielzellen) genetisches Material einzuführen und das (Gen-)Expressionsmuster der Zielzellen zu verändern. Dieses Problem tritt insbesondere in der somatischen Gentherapie, Keimbahntherapie und bei der Behandlung bösartiger Tumore auf. Um genetisches Material in Zielzellen einzuführen werden effiziente Vektoren benötigt, die eine ausreichend hohe Transduktions- und Transformationsrate ermöglichen. Wenn ein Patient mit solchen Vektoren behandelt werden soll, muss zudem sichergestellt sein, dass das Einführen des genetischen Materials und die - darauf zurückzuführende - Veränderung des Genexpressionsmusters für den Patienten keine schwerwiegenden Nachteile mit sich bringt.

Eines der effizientesten Transportmittel zum Einführen genetischen Materials in Säugerzellen sind Adenoviren bzw. von Adenoviren abgeleitete Vektoren. Adenoviren sind biochemisch und genetisch gut charakterisierte doppelsträngige DNA-Viren. Sie können viele der üblichen Versuchstiere wie Hunde, Mäuse, Rinder, Pferde und Affen, aber auch Menschen befallen und sich in ihnen vermehren. Sie vermögen es zudem, sowohl replizierende als auch nichtreplizierende Zellen zu infizieren und zu transduzieren. Dabei integrieren Adenoviren nicht in das Genom der infizierten Zelle. Adenoviren verfügen über eine hohe Produktionskapazität in vitro und über eine hohe Replikationsrate. Ein weiterer Vorteil von Adenoviren ist ihre Lagerbeständigkeit. Gegenwärtig werden auf Adenoviren basierende Vektoren vor allem eingesetzt zur Behandlung angeborener genetischer Erkrankungen wie Mukoviszidose, Ornithintranscarbamylasemangel oder Hämophilie, vergleiche hierzu beispielsweise West J, Rodman DM: Gene therapy for pulmonary diseases. Chest. 2001 Feb; 119 (2): 613-7; Batshaw ML, Wilson JM, Raper S, Yudkoff M, Robinson MB: Recombinant adenovirus gene transfer in adults with partial ornithine transcarbamylase deficiency (OTCD); Hum Gene Ther. 1999 Sep 20; 10 (14): 2419-37; Fallaux FJ, Hoeben RC: Gene therapy for the hemophilias. Curr Opin Hematol. 1996 Sep; 3 (5): 385-9, sowie zur Behandlung bösartiger Tumore, vergleiche beispielsweise Zhang WW: Development and application of adenoviral vectors for gene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 1999 Mar-Apr; 6 (2): 113-38; Suzuki K, Curiel DT: Viral therapy of cancer; Rev Invest Clin. 2001 Jul-Aug; 53 (4): 346-56.

Zur Behandlung werden Patienten oder Zellkulturen einer infektösen Dosis der adenoviralen Vektoren ausgesetzt und dabei infiziert. Dabei hat es sich als nachteilig herausgestellt, wenn diese Infektion im Körper des Patienten oder in der Zellkultur unkontrolliert fortschreiten kann. Das Bestreben geht dementsprechend dahin, Vektoren zu entwickeln, die nur noch in kontrollierbarer Weise vermehrungsfähig sind. Dabei haben insbesondere Systeme aus Helferabhängigen Vektoren und Helfer-Viren verstärkt Interesse geweckt. Der Helfer-abhängige Vektor ist im Idealfalle nur bei gleichzeitiger Anwesenheit des zugehörigen Helfer-Virus vermehrungs- und/oder verpackungsfähig. Wird ein Patient oder einer Zellkultur mit einem Helfer-abhängigen Vektor infiziert, so kann sich dieser Vektor in Ermangelung eines Helfer-Virus nicht mehr im Körper des Patienten bzw. in der Zellkultur vermehren, die Infektion bleibt somit auf den ursprünglichen Infektionsherd begrenzt. Bei der Herstellung des Helfer-abhängigen Vektors ist daher darauf zu achten, dass der hergestellte Vektor im wesentlichen frei von Helfer- Viren sein muss. In einem Medikament würde die Anwesenheit von Helfer-Viren dazu führen, dass der Helfer-abhängige Vektor unkontrolliert im Patienten vermehrungsfähig wäre.

Parks, R. J. et al. beschreiben in "A helper dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 13565-13570, ein Expressionssystem aus einem adenoviralen Helfer-abhängigen Vektor, einem adenoviralen Helfer-Virus und einer speziellen Produktionszellinie.

Der adenovirale Helfer-abhängige Vektor umfasst dabei zunächst das zu übertragende Gen. Ferner besitzt er alle zu seiner Vermehrung und Verpackung notwendigen cis-wirkenden Elemente. Das sind solche Nucleinsäure-Abschnitte, die es ermöglichen, auf ein bestimmtes Nucleinsäure-Molekül einzuwirken. Im Gegensatz hierzu ermöglichen es trans wirkende Elemente, auf eine Vielzahl von Nucleinsäure-Molekülen einzuwirken. Gewöhnlich handelt es sich bei trans-wirkenden Elementen um Gene, wobei die cis-wirkenden Elemente als Erkennungssequenzen für die Translationsprodukte dieser Gene dienen. Der von Parks et al. beschriebene Helfer-abhängigen Vektor umfasst als cis-wirkende Elemente adenovirale inverted terminal repeats (ITR-Sequenzen) und das adenovirale Verpackungssignal ψ, dazu unten mehr.

Dem Helfer-abhängigen Vektor fehlen jedoch die Gene (trans-wirkenden Elemente), die zu seiner Vermehrung und Verpackung notwendig sind. Der Helfer-abhängige Vektor ist daher nicht vermehrungsfähig, solange die Translationsprodukte (Genprodukte) dieser fehlenden Gene nicht auf andere Weise bereitgestellt (komplementiert) werden.

Die dem Helfer-abhängigen Vektor zu seiner Vermehrung und Verpackung fehlenden Genprodukte werden größtenteils von einem adenoviralen Helfer-Virus bereitgestellt. Das Helfer-Virus umfasst - mit Ausnahme der sogenannten E1-Gene - alle zu seiner Vermehrung und Verpackung notwendigen cis- und trans-wirkenden Elemente. Die Genprodukte der E1- Gene werden jedoch ebenfalls benötigt, um die übrigen zur Vermehrung und Verpackung der Adenoviren notwendigen Gene einzuschalten. Das Helfer-Virus ist daher als solches nicht vermehrungsfähig. Dadurch soll sichergestellt werden, dass Präparationen des Helferabhängigen Vektors keine Viren enthalten, die sich beispielsweise im Körper eines Patienten selbständig vermehren können.

Zur Produktion des Helfer-abhängigen Vektors werden spezielle Produktionszellen (293Cre- Zellen) verwendet, die gleichzeitig mit dem Helfer-abhängigen Vektor und mit dem Helfer-Virus infiziert werden. Die Produktionszellen stellen die Genprodukte der E1-Gene bereit. Dadurch können auch die übrigen Gene, die zur Vermehrung und Verpackung des Helfer-abhängigen Vektors benötigt und ggf. vom Helfer-Virus bereitgestellt werden, eingeschaltet werden.

Ein kennzeichnendes Merkmal des Helfer-Virus ist, dass sein cis-wirkendes Verpackungssignal ψ zwischen zwei Erkennungssequenzen (IoxP-Sequenzen) für eine Cre-Rekombinase angeordnet ist (sogenanntes "gefloxtes Verpackungssignal"). Diese Cre-Rekombinase wird ebenfalls von den Produktionszellen bereitgestellt. Unter Einwirkung der Cre-Rekombinase findet eine homologe Rekombination an den lox-Erkennungssequenzen des Helfer-Virus statt, so dass der Bereich zwischen den Erkennungssequenzen aus der DNA des Helfer-Virus herausgelöst wird (Invalidisierung). Nach Einwirkung der Rekombinase kann das Helfer-Virus nicht mehr verpackt werden, da ihm das dafür benötigte Verpackungssignal ψ fehlt. Der Helferabhängige Vektor kann jedoch, unter Einwirkung der vom Helfer-Virus und von der Produktionszelle bereitgestellten trans-wirkenden Genprodukte, weiterhin vermehrt und verpackt werden. Auf diese Weise wird die Kontaminationsrate der produzierten Helfer-abhängigen Vektoren mit Helfer-Viren verringert.

Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass die Herstellung der Helfer-abhängigen Vektoren nur in 293Cre-Zellen stattfinden kann. Dies schließt eine Herstellung der Helfer-abhängigen Vektoren im Patienten selbst, beispielsweise im Rahmen einer Tumor-Therapie, oder ex vivo in dem Patienten entnommenen Gewebe aus. Wenn, wie es im Rahmen eines Gentherapie-Verfahrens zu erwarten ist, der Titer der Helfer-abhängigen Viren im Körper des Patienten mit der Zeit abnimmt, ist eine weitere Behandlung des Patienten notwendig.

Hinzu kommt, dass die Helfer-Viren in aufwendigen Reinigungsschritten wie beispielsweise CsCl-Dichtezentrifugation von den Helfer-abhängigen Vektoren abgetrennt werden müssen. Die gewonnenen Helfer-Viren-Präparate können jedoch auch nach der Reinigung noch immer mit Helfer-Viren kontaminiert sein. Dabei ist insbesondere mit spontan auftretenden rekombinanten Viren zu rechnen, die gleichzeitig das nicht entfernbare Verpackungssignal des Helferabhängigen Vektors, die E1-Gene aus dem Genom der Produktionszelle und die übrigen adenoviralen Gene zur Vermehrung und Verpackung von Adenoviren umfassen, vergleiche beispielsweise Sandig et al., Optimization of the helper ependent adenovirus system for production and potency in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000), 1002-1007, insbesondere Seiten 1003-1004. Die rekombinanten Viren können sich im Körpergewebe eines Patienten, das natürlicherweise nicht über ein Gen für Cre-Rekombinase verfügt, unkontrolliert vermehren. Es besteht daher Bedarf an weiteren Maßnahmen, um die Sicherheit eines solchen Systems für den Einsatz in Therapieverfahren zu verbessern.

In anderen Verfahren wird versucht, die Vermehrung von Adenoviren an die Expression ausgewählter Wirtszellen-Gene zu koppeln. Beispielsweise sind Adenoviren, die eine Deletion im Bereich der EIB-Gene aufweisen, nur noch in p53-negativen Zellen vermehrungsfähig, vergleiche beispielsweise Mulvihill S. Warren R, Venook A, Adler A, Randlev B, Heise C, Kirn D: Safety and feasibility of injection with an E1B-55 kDa gene-deleted, replication-selective adenovirus (ONYX-015) into primary carcinomas of the pancreas: a phase I trial. Gene Ther. 2001 Feb; 8 (4): 308-1. Das p53-Protein fehlt in vielen Tumorzellen, so dass sich diese Adenoviren bevorzugt in solchen Tumorzellen vermehren und diese dabei zum Absterben bringen. In anderen Verfahren wiederum wird die Vermehrung von Adenoviren beispielsweise an die Expression tumorspezifischer Transkriptionsfaktoren gebunden, vergleiche beispielsweise Kirn D. Replication-selective oncolytic adenoviruses: virotherapy aimed at genetic targets in cancer. Oncogene. 2000 Dec 27; 19 (56): 6660-9. Nachteilig an diesen Verfahren ist, dass die Adenoviren nur in besonderen Wirtszellen mit passendem Genexpressionsmuster vermehrungsfähig sind. Daher muss grundsätzlich für jeden Typ einer zu transformierenden Zelle ein neuer, speziell angepasster Adenovirus hergestellt werden. Adenoviren dieser Art sind demnach nur sehr begrenzt zur Transformation unterschiedlicher Wirtszellen geeignet.

Rekombinante Adenoviren werden zudem auf ihre Eignung als Impfstoffe untersucht, vergleiche beispielsweise Ertl HC, Xiang Z: Novel vaccine approaches. J Immunol. 1996 May 15; 156 (10): 3579-82. Produkte adenoviraler Gene wie beispielsweise Kapsidproteine entfalten unmittelbar eine antigene Wirkung. Zellen, die mit Adenoviren bzw. adenoviralen Vektoren infiziert sind (Wirtszellen), werden dadurch häufig zum Ziel einer zellvermittelten Immunreaktion, siehe dazu auch Gahery-Segard H, Farace F, Godfrin D, Gaston J, Lengagne R, Tursz T, Boulanger P: Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. J Virol. 1998 Mar; 72 (3): 2388-97; McClane SJ, Chirmule N, Burke CV, Raper SE: Characterization of the immune response after local delivery of recombinant adenovirus in murine pancreas and successful strategies for readministration. Hum Gene Ther. 1997 Dec 10; 8 (18): 2207-16. Im Zuge der zellvermittelten Immunreaktion wird die mit Adenoviren bzw. adenoviralen Vektoren infizierte Wirtszelle getötet. Dabei werden sowohl adenovirale Genprodukte als auch die Produkte sonstiger Gene (Vakzinierungsgene), die ein adenoviraler Vektor trägt, freigesetzt. Die adenoviralen Genprodukte können in diesem Fall als Adjuvans zum Erzeugen einer Immunantwort gegen die freigesetzten Vakzinierungsgen-Produkte dienen. Nachteilig ist jedoch, dass die Expression der Vakzinierungsgene wegen der Zerstörung der Wirtszelle zum Erliegen kommt. Die Verwendung vermehrungsfähiger, rekombinanter adenoviraler Vektoren im Sinne einer Impfung mit einem Lebendvakzin würde die Adjuvans-Wirkung vermutlich erheblich steigern, wäre jedoch für einen Patienten mit einem hohen gesundheitlichen Risiko verbunden, da eine unkontrollierte Ausbreitung des Vektors im Körper des Patienten nicht ausgeschlossen werden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, den beschriebenen Nachteilen abzuhelfen oder sie zumindest zu lindern.

Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung daher einen Helfer-abhängigen Vektor zum Exprimieren eines Zielgens in einer Zielzelle bereit, wobei der Vektor umfasst:

a) ein für eine Rekombinase codierendes Gen,
b) das Zielgen.

Indem der Helfer-abhängige Vektor das zum Invalidisieren eines zugeordneten Helfer-Virus notwendige Rekombinase-Gen umfasst, kann dem Grundsatz nach jede Zelle zur Produktion des Helfer-abhängigen Vektors verwendet werden und damit zu einer Produktionzelle werden. Dadurch wird die Handhabung von Expressionssystemen aus Helfer-abhängigen Vektoren und Helfer-Viren erheblich vereinfacht. Das Anwendungsspektrum solcher Systeme wird auf eine Vielzahl weiterer Zellen ausgedehnt. Zudem wird mit dem erfindungsgemäßen Helferabhängigen Vektor auf vorteilhaft einfache Weise erreicht, dass ein Helfer-Virus nach Art der von Parks et al. beschriebenen Helfer-Viren vermehrungsinkompetent wird, wenn a) das Helfer- Virus eine Zelle infiziert, die einen erfindungsgemäßen Helfer-abhängigen Vektor umfasst, oder wenn b) ein erfindungsgemäßer Helfer-abhängiger Vektor eine Zelle infiziert, die ein solches Helfer-Virus umfasst. Daher bedeuten solche Helfer-abhängigen Vektoren einen erheblichen Sicherheitsgewinn in allen Verfahren, bei denen ein Helfer-abhängiger Vektor zur Transformation von Zellen eingesetzt wird.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Gen jeder Abschnitt eines Erbinformationsträgers wie beispielsweise DNA oder RNA, der zur Ausbildung eines bestimmten Phänotyps benötigt wird. Insbesondere sind Gene solche DNA-Abschnitte, die von einer Zelle transkribiert und translatiert werden können, um ein bestimmtes Protein zu bilden (exprimieren). Der Begriff umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jedoch auch regulatorisch wirkende Abschnitte eines Erbinformationsträgers wie beispielsweise Promotoren.

Mit "Rekombinase" wird im Rahmen dieser Erfindung ein Protein bezeichnet, dass zugeordnete Abschnitte (Erkennungssequenzen) eines Erbinformationsträgers, inbesondere DNA-Abschnitte, erkennt und miteinander kombiniert, so dass der Bereich zwischen den erkannten Abschnitten aus dem Erbinformationsträger entfernt wird.

Ein erfindungsgemäßer Helfer-abhängigen Vektor kann in eine Nucleinsäure beliebiger Art sein, vorausgesetzt, er kann in einer Produktionszelle unter Einwirkung trans-wirkender Elemente des Helfer-Virus vermehrt und/oder verpackt werden. In trans wirkende Elemente sind solche Gene des Helfer-Virus oder solche Transkriptions- bzw. Translationsprodukte (wie RNAs bzw. Peptide und Proteine) des Helfer-Virus, die nicht nur auf das Helfer-Virus selbst, sondern auch auf die Erbinformation des Helfer-abhängigen Vektors wirken können, beispielsweise um diese in infektiöse Partikel zu verpacken.

Der Helfer-abhängige Vektor kann insbesondere ein DNA- oder RNA-Molekül sein. Er kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Er kann ringförmig geschlossen oder linear sein. Bevorzugt sind Helfer-abhängigen Vektoren in Plasmidform oder in Form linearer DNA- Doppelstränge. Nucleinsäuren in solchen Formen können mit den in üblichen eukaryontischen Zellen vorhandenen Nucleinsäure-Replikationssystemen, gegebenenfalls unter Zuhilfenahme der von einem Helfer-Virus bereitgestellten trans-wirkenden Elemente, effektiv vervielfältigt werden. Diese Nucleinsäure-Formen können zudem auf vorteilhaft einfache Weise mit bekannten Verfahren zu infektiösen Partikeln verpackt werden, so dass eine hohe Transduktionsrate erzielt werden kann.

Zweckmäßigerweise wird der Helfer-abhängige Vektor in Plasmidform konstruiert. In dieser Form kann er in üblichen Bakterien wie beispielsweise in E. coli K12-abgeleiteten Stämmen kloniert und aufgereinigt werden. Die aufgereinigten Helfer-abhängigen Vektor-Moleküle können dann beispielsweise durch Sequenzieren oder Restriktionsendonuklease-Kartierung überprüft werden. Hierzu kann sich der Fachmann insbesondere der üblichen Methoden bedienen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Lab. Press, NY, 2. Auflage 1989, beschrieben sind.

Besonders bevorzugt sind Helfer-abhängige Vektoren, die

a) eine adenovirale linke inverted terminal repeat-(ITR)-Sequenz,
b) eine adenovirale Verpackungssequenz (ψ), und
c) eine adenovirale rechte ITR-Sequenz

umfassen.

Die genannten Sequenzen sind cis-wirkende Elemente, also Abschnitte eines Erbinformations- Moleküls, die von trans-wirkenden Elementen erkannt werden können und deren Fehlen die Vermehrung und/oder Verpackung der Vektor-Moleküle verhindert oder verlangsamt.

Die adenoviralen ITR-Sequenzen sind etwa 100 Basenpaare lange doppelsträngige DNA- Abschnitte und bilden die beiden Enden des linearen Adenovirus-Genoms. Sie bilden die Ansatzstellen für den zur Vermehrung der Viren erforderlichen Replikationskomplex. Eine planvolle und effiziente Vermehrung (Replikation) eines Adenovirus ist ohne die ITR-Sequenzen nicht möglich; vergleiche in soweit Stow, N. D., The infectivity of adenovirus genomes lacking DNA sequences from their left-hand termini, Nucl. Acids Res. 10 (1982), 5105-5109.

Das Verpackungssignal ψ ist ein etwa 160 Basenpaare langer Abschnitt, der sich bei Adenoviren der Serotypen 2 und 5 etwa zwischen den Positionen 190 bis 350 erstreckt. Durch Entfernen dieses Abschnitts aus einem Adenovirus-Genom können die während der Virus- Vermehrung neu entstehenden Virus-Moleküle nur noch mit einer erheblich geringeren Rate in vorgeformte Kapside verpackt werden, so dass die Ausbeute der entstehenden infektiösen Partikel pro infizierter Zelle und Zeiteinheit um den Faktor 10 oder stärker sinkt; vergleiche in soweit auch Hearing, P. et al., Identification of a repeated sequence element required for efficient encapsidation of the adenovirus type 5 chromosome, J. Virol. 61 (1987), 2555-2558.

Die genannten cis-wirkenden Elemente ermöglichen es, Helfer-abhängige Vektoren mit adenoviralen Helfer-Viren zu vermehren und/oder zu verpacken. Wie eingangs beschrieben bieten Adenoviren besondere Vorteile in Verfahren zur Änderung des Gen-Expressionsmusters von Säugerzellen, insbesondere in der Gentherapie. Zudem sind sie stark immunogen, so dass sie als Adjuvans in Vakzinierungs-Therapien eingesetzt werden können.

Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung adenoviraler cis-wirkender Elemente beschränkt, gleichwohl sind diese Elemente aus den genannten Gründen besonders bevorzugt. Anstelle adenoviraler cis-wirkender Elemente kann der Fachmann auch cis-wirkende Elemente anderer Viren oder Plasmide wählen. Insbesondere kann der Fachmann cis-wirkende Elemente verwenden, die ausgewählt sind aus den cis-wirkenden Elementen der Hepatitisviridae, Herpesviridae, Papillomaviridae, Retroviridae, Lentiviridae und der adeno-assoziierten Viren (AAVs). Diese Viren bzw. deren jeweilige cis-wirkende Elemente ermöglichen es, jeweils spezifische Vorteile zu nutzen. Beispielsweise können Retroviren in das Genom sich teilender Zellen integrieren und so eine dauerhafte Transformation der infizierten Zellen erreichen. Zweckmäßigerweise wird das dem Helfer-abhängigen Vektor zugeordnete Helfer-Virus aus der Gruppe derjenigen Viren ausgewählt bzw. von denjenigen Viren abgeleitet, die die den jeweiligen cis-wirkenden Elementen zugeordneten trans-wirkenden Elemente bereitstellen, um den Helfer-abhängigen Vektor in einer Produktionszelle zu vermehren und/oder zu verpacken.

Bevorzugt sind die cis-wirkenden Elemente der Adenoviren des Typs C, wobei die cis-wirkenden Elemente der Adenoviren der Serotypen 2 und/oder 5 besonders bevorzugt sind. Diese Adenoviren sind seit langem besonders gut untersucht, was ihre Handhabungs-Sicherheit erhöht. Sie sind zudem leicht erhältlich.

Ferner ist ein Helfer-abhängiger Vektor der beschriebenen Art bevorzugt, bei dem das Rekombinase-Gen für eine Rekombinase codiert, die ausgewählt ist aus Cre-Rekombinase und FLP-Rekombinase. Beide Rekombinasen erlauben das hochspezifische Erkennen zugeordneter Erkennungssequenzen, nämlich sogenannter lox-Sequenzen im Falle der Cre-Rekombinase, vergleiche beispielsweise Parks et al. supra und frt-Sequenzen im Falle der FLP-Rekombinase vergleiche beispielsweise Ng et al., development of a FLP/frt system for generating helperdependent adenoviral vectors, Mol. Ther. 3 (2001), 809-815. Mit beiden Rekombinasen konnten zumindest 80% der Helfer-Viren, die über entsprechende Erkennungssequenzen verfügen, rekombiniert werden. Im Falle der Cre-Rekombinase ist ferner vorteilhaft, dass bereits vorgefertigte "gefloxte" Helfer-Viren erhältlich sind, so dass die Handhabung eines Systems, umfassend die erfindungsgemäßen Helfer-abhängigen Vektoren und die vorhandenen Helfer- Viren, zusätzlich vereinfacht wird.

Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Helfer-Virus zum Vermehren und/oder Verpacken eines zugeordneten Helfer-abhängigen Vektors der zuvor beschriebenen Art bereit, wobei das Helfer-Virus umfasst:

a) ein Paar Erkennungssequenzen zur Erkennung durch die vom Helfer-abhängigen Vektor codierte Rekombinase, wobei die Erkennungssequenzen einen durch die Rekombinase entfernbaren Abschnitt einschließen,
b) ein für die Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus und des Helferabhängigen Vektors notwendiges Schaltergen und einen für die Expression des Schaltergens notwendigen Promoter,
wobei das Paar Erkennungssequenzen so zwischen Promoter und Schaltergen angeordnet ist, dass das Schaltergen exprimierbar wird, wenn der entfernbare Abschnitt entfernt ist, und
c) ein zur Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus notwendiges cis- wirkendes Element, angeordnet im entfernbaren Abschnitt.

Gegenüber herkömmlichen Helfer-Viren bieten die erfindungsgemäßen Helfer-Viren den Vorteil, dass die Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus erst dann erfolgen kann, wenn durch Entfernen des entfernbaren Abschnitts und damit auch durch Entfernen des notwendigen cis-wirkenden Elements sichergestellt ist, dass das Helfer-Virus selbst nicht vermehrt und/oder verpackt werden kann. Auf diese Weise wird die Handhabungs-Sicherheit der Helfer-Viren gegenüber herkömmlichen Helfer-Viren erhöht:
Infiziert ein noch nicht durch die vom Helfer-abhängigen Vektor bereitgestellte Rekombinase rekombinierter Helfer-Virus eine Zelle, so kann er in dieser Zelle nicht vermehrt und/oder verpackt werden, da das hierfür notwendige Schaltergen räumlich vom zugeordneten Promoter getrennt ist und somit nicht oder nur in unwesentlichem Ausmaß exprimiert wird. Erst bei Hinzutreten des Helfer-abhängigen Vektors und entsprechendem Bereitstellen der von diesem codierten Rekombinase kann der entfernbare Abschnitt entfernt werden, so dass das Schaltergen exprimierbar wird. Damit einhergehend verliert das Helfer-Virus jedoch das notwendige cis-wirkende Element, das im entfernbaren Abschnitt angeordnet ist, so dass das Helfer-Virus selbst nicht mehr vermehrt und/oder verpackt werden kann. Im Ergebnis kann das Helfer-Virus noch immer alle zur Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-abhängigen Vektors notwendigen trans-wirkenden Elemente bereitstellen, ohne jedoch selbst vermehrungs- und/oder verpackungsfähig zu sein.

Das Helfer-Virus könnte mit einem Helfer-abhängigen Vektor homolog rekombinieren, wie es von herkömmlichen Helfer-Viren und Helfer-abhängigen Vektoren berichtet wird; siehe oben. Dies kann insbesondere dann geschehen, wenn der Helfer-abhängige Vektor ein cis-wirkendes Element umfasst, das dem für die Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus notwendigen cis-wirkende Element hinreichend ähnlich (homolog) ist. In diesem Falle ist es bevorzugt, wenn der Helfer-abhängige Vektor in 5'-Richtung stromaufwärts vom rekombinierbaren cis-wirkenden Element keinen Promotor umfasst. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass das Helfer-Virus auch bei einer Rekombination homologer (einander entsprechender) cis-wirkender Elemente keinen die Expression des Schaltergens ermöglichenden Promoter erhält. Im Ergebnis wird so die Wahrscheinlichkeit, dass in Präparationen des Helfer-abhängigen Vektors noch vermehrungsfähige Helfer-Viren enthalten sein können, weiter verringert. Ferner ist es bevorzugt, wenn das im entfernbaren Abschnitt angeordnete cis-wirkende Element des Helfer-Virus eine andere Sequenz besitzt als das ihm funktional entsprechende cis-wirkende Element des Helfer-abhängigen Vektors. Auf diese Weise wird die Rate, mit der Helfer-Virus und Helfer-abhängiger Vektor miteinander rekombinieren, weiter vorteilhaft gesenkt.

Vorzugsweise ist das für die Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus notwendige cis- wirkende Element ausgewählt aus:

a) einer adenoviralen linken ITR-Sequenz,
b) einem adenoviralen Verpackungssignal ψ, und
c) einer adenoviralen rechten ITR-Sequenz.

In besonders bevorzugten Helfer-Viren ist das notwendige cis-wirkende Element ein adenovirales Verpackungssignal ψ. Das Entfernen dieses Verpackungssignals durch die vom Helfer-abhängigen Vektor bereitgestellte Rekombinase beeinträchtigt die Replikation des Helfer- Virus nicht oder zumindest nicht in nennenswertem Maße, das rekombinante Helfer-Virus kann jedoch nicht mehr in infektiöse Partikel verpackt werden. Dementsprechend können in einer Produktionszelle hohe Kopienzahlen sowohl des Helfer-abhängigen Vektors als auch des Helfer-Virus erreicht werden, wobei es vorteilhaft unwahrscheinlich ist, dass eine Präparation des Helfer-abhängigen Vektors mit autonom vermehrungsfähigen Helfer-Viren kontaminiert ist. Eine hohe Kopienzahl des Helfer-Virus ermöglicht eine starke Expression der für die Vektor- Vermehrung und/oder -Verpackung notwendigen Gene, so dass eine effiziente Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-abhängigen Vektors erreicht wird. Es ist wiederum besonders bevorzugt, wenn cis- und trans wirkende Elemente des Helfer-Virus den Adenoviren der Serotypen 2 und/oder 5 entnommen sind.

Ferner ist ein Helfer-Virus bevorzugt, bei dem das Schaltergen ein adenovirales E1-Gen ist. Die E1-Gene E1A und E1B machen einen etwa 3000 Basenpaare langen Abschnitt im 5'-Bereich des Adenovirus-Genoms aus. Sie kodieren für Proteine, die zur Einleitung der sogenannten frühen Vermehrungsphase des Adenovirus notwendig sind. Nach Entfernen der E1-Gene verliert ein Adenovirus die Fähigkeit, in gewöhnlichen Säugetier-Körperzellen vermehrt zu werden; vergleiche beispielsweise Hormritz, S. H, Adenoviruses, in: Fields, B. N. et at, Virology, Raven Press, NY, 2. Auflage 1990, 1723-1740, und Hitt, M. M., Graham, F. L., Adenovirus vectors to human gene therapy, Adv. Virus Res. 55 (2000), 479-505. Da das E1-Schaltergen nur dann in nennenswertem Ausmaße exprimiert wird, wenn der entfernbare Abschnitt des Helfer-Virus und damit das notwendige cis-wirkende Element - vorzugsweise die adenovirale Verpackungssequenz ψ - entfernt wurde, ist sichergestellt, dass das die Vermehrung des Helfer- Virus nicht beginnen kann, bevor eine zum Entfernen des cis-wirkenden Elements notwendige Rekombinase bereitgestellt wird, insbesondere durch einen zugeordneten Helfer-abhängigen Vektor.

Die Verwendung eines oder mehrerer E1-Gene als Schaltergen ermöglicht es zudem, Helfer- Viren zu konstruieren, die alle Gene des adenoviralen Vermehrungs- und Verpackungssystems umfassen, soweit diese notwendig sind, um Helfer-abhängige Vektoren zu vermehren und/oder zu verpacken. Dadurch wird die bisher bestehende Notwendigkeit umgangen, zur Gewinnung von Präparationen eines adenoviralen Helfer-abhängigen Vektors besonders vorbereitete Produktionszellen zu verwenden, die nach Art von 293-Zellen Gene der adenoviralen Vermehrungs- und Verpackungssystems (insbesondere E1-Gene) zusätzlich zu den Helfer- Viren bereitstellen müssen. Stattdessen werden durch die Infektion einer Zelle mit einem Helfer- Virus und einem zugeordneten Helfer-abhängigen Vektor alle cis- und trans-wirkenden Elemente bereitgestellt, die zur Vermehrung und/oder Verpackung zumindest des Helferanhängigen Vektors benötigt werden. Ebenso ist es möglich, das Helfer-Virus und den zugeordneten Helfer-abhängigen Vektor so aufeinander anzupassen, dass das Helfer-Virus und der Helfer-abhängige Vektor jeweils einen Teil der zur Vermehrung und/oder Verpackung notwendigen Gene umfasst, dazu unten mehr.

Selbstverständlich ist dieser Vorteil nicht auf von Adenoviren abgeleitete Helfer-abhängige Vektoren und Helfer-Viren beschränkt. Der Helfer-abhängige Vektor und/oder das Helfer-Virus können auch auf einem anderen Vermehrungs- und/oder Verpackungssystem als dem des Adenovirus basieren, insbesondere auf dem Vermehrungs- und/oder Verpackungssystem der Hepatitisviridae, Herpesviridae, Papillomaviridae, Retroviridae, Lentiviridae und/oder dem der adeno-assoziierten Viren (AAVs). In diesem Fall kann das Helfer-Virus alle Gene umfassen, die zum Vermehrungs- und/oder Verpackungssystem des zugrundeliegenden Virustyps gehören. Dabei kann optional auf solche Gene verzichtet werden, die zur Vermehrung und Verpackung des Helfer-abhängigen Vektors nicht notwendig sind.

Das Paar Erkennungssequenzen umfasst vorzugsweise ein Paar lox-Sequenzen oder ein Paar frt-Sequenzen. Sowohl lox-Sequenzen als auch frt-Sequenzen wurden oben im Zusammenhang mit der vom Helfer-abhängigen Vektor bereitgestellten Rekombinase diskutiert. Zweckmäßigerweise werden die Erkennungssequenzen des Helfer-Virus und das Rekombinase-Gen des Helfer-abhängigen Vektors so aufeinander abgestimmt, dass die vom Helfer-abhängigen Vektor codierte Rekombinase die Erkennungssequenzen des Helfer-Virus erkennt und den von den Erkennungssequenzen eingeschlossenen Abschnitt der Helfer-Virus- Nucleinsäure ausschneidet.

Besonders bevorzugt ist ein Helfer-Virus, das eine Sequenz gemäß SEQ ID NO 1 umfasst. Ein solches Virus ist vom humanen Adenovirus des Serotyps 2 abgeleitet und umfasst neben der als Schaltergen wirkenden adenoviralen E1-Genregion eine adenovirale linke ITR-Sequenz, einen p5-Promoter aus dem Genom des adeno-assoziierten Virus (AAV) Typ 2, sowie, eingeschlossen von zwei lox-Sequenzen als Erkennungssequenzen, ein adenovirales Verpackungssignal ψ sowie ein HS4-Silencer-Element, vergleiche in soweit Villemure, J. F. et al., Promoter Suppression in Cultured Mammalian Cells can be Blocked by the Chicken beta-Globin Chromatin Insulator 5'HS4 and Matrix/Scaffold Attachment Regions, J. Mol. Biol. 312 (2001), 963-974.

In der Sequenz SEQ ID NO 1 erstreckt sich die linke ITR-Sequenz vom linken 5'-Ende des Helfer-Virus bis zur Position 138. Der p5-Promoter des adeno-assoziierten Virus erstreckt sich von Position 145 bis 307. Die erste (linke) lox-Sequenz erstreckt sich von Position 341 bis 374. Das adenovirale Verpackungssignal ψ erstreckt sich von Position 414 bis 570. An dieses schließt das HS4-Silencer-Element an, das von Position 583 bis 1787 reicht. Die zweite (rechte) lox-Sequenz erstreckt sich von Position 1817 bis 1850 und wird gefolgt von der adenoviralen E1-Genregion, die von Position 1909 bis 4853 reicht.

Der p5-Promoter ist mit etwa 162 Basenpaaren Länge vorteilhaft kurz, so dass er zwischen der linken ITR-Sequenz und dem Verpackungssignal ψ, angeordnet werden kann. Ein längerer Promotor würde das Verpackungssignal ψ von der linken ITR-Sequenz in 3'-Richtung verschieben, was die Verpackungseffizienz des Helfer-Virus verringern würde. Zudem weist der Promoter nur eine geringe Grundtranskriptionsleistung (konstitutive Transkriptionsleistung) auf. Diese niedrige Grundtranskription kann durch das nachfolgende HS4-Silencer-Element abgebrochen werden, bevor die E1-Gene exprimiert werden. Besonders vorteilhaft ist ferner, dass die Transkriptionsleistung des p5-Promotors unter dem Einfluss einer zunehmenden E1- Genexpression um etwa eine Größenordnung steigt. Wenn daher die E1-Genregion - nach Einwirkung der Cre-Rekombinase - einmal exprimiert wird, verstärkt und stabilisiert sie im Helfer-Vektor ihre eigene Expressionsrate.

Das HS4-Silencer-Element dient zum einen dazu, den Abstand zwischen den beiden lox- Erkennungssequenzen so einzustellen, dass dieser für die Rekombination des Helfer-Virus durch die Cre-Rekombinase nahe am Optimum ist und eine hohe Rekombinationswahrscheinlichkeit in einer Produktionszelle erreicht wird. Zum anderen bewirkt der Silencer, dass vom p5-Promoter ausgehende Transkriptionsvorgänge mit hoher Wahrscheinlichkeit abgebrochen werden, bevor sie das Ende des Silencer-Elements erreichen. Auf diese Weise verringert der HS4-Silencer die Rate, mit der die E1-Schaltergene bzw. das E1- Schaltergen des Helfer-Virus vor der Rekombination durch die Cre-Rekombinase transkribiert werden. Dadurch ist sichergestellt, dass die konstitutive Expression der adenoviralen E1-Gene des Helfer-Virus in Abwesenheit des Helfer-abhängigen Vektors vernachlässigt werden kann; eine unbeabsichtigte Replikation des Helfer-Virus auf diesem Wege ist demzufolge nahezu ausgeschlossen.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Expressionssystem zum Exprimieren eines Zielgens in einer Zielzelle bereitgestellt, wobei das Expressionssystem

a) einen Helfer-abhängigen Vektor der beschriebenen Art und
b) ein zugeordnetes Helfer-Virus der beschriebenen Art

umfasst.

Ein solches Expressionssystem verwirklicht die mit den erfindungsgemäßen Vektoren und Helfer-Viren erzielbaren Vorteile. Insbesondere sind der erfindungsgemäße Helfer-abhängige Vektor und das erfindungsgemäße Helfer-Virus auf die beschriebene vorteilhafte Weise aneinander angepasst, so dass Kontaminationen von Präparationen des Helfer-abhängigen Vektors mit Helfer-Viren bereits ohne die bisher üblichen Virus-Abtrennungsverfahren wie CsCl- Dichtezentrifugation weitgehend vermieden werden können. Dementsprechend ist das erfindungsgemäße Expressionssytem besonders sicher und zur Anwendung in gentherapeutischen Verfahren an Mensch und Tier optimiert.

Die für die Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-abhängigen Vektors und des Helfer- Virus notwendigen trans-wirkenden Elemente mit Ausnahme des Schaltergens können dem Grunde nach beliebig auf Vektor und Helfer-Virus verteilt (aufgeteilt) sein oder sogar nebeneinander auf beiden vorliegen. Die Aufteilung der trans-wirkenden Elemente auf Vektor und Helfer-Virus kann insbesondere unabhängig von dem vom Helfer-abhängigen Vektor umfassten Zielgen erfolgen.

Für die meisten Anwendungen wird es vorteilhaft sein, wenn der Helfer-abhängige Vektor keines der zu seiner Vermehrung und/oder Verpackung benötigten trans-wirkenden Elemente umfasst. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn der Helfer-abhängige Vektor keines der für die Vermehrung und Verpackung von Adenoviren benötigten Gene umfasst, sondern lediglich die zur Vermehrung und Verpackung notwendigen cis-wirkenden Elemente wie ITR-Sequenzen und Verpackungssequenz ψ besitzt. Solche Helfer-abhängigen Vektoren codieren im einfachsten Fall nur für die Rekombinase und das zu übertragende Zielgen. Eine mit diesem Helferabhängigen Vektor infizierte Zelle exprimiert dementsprechend nur zwei zellfremde Gene. Sie besitzt daher ein lediglich geringes immunogenes Potential. Außerdem erlauben solche sogenannten "gutless"-Vektoren den Einbau langer Zielgene mit mehr als 10 kbp Länge in den Helfer-abhängigen Vektor. Dadurch wird die Auswahl möglicher Zielgene vorteilhaft erweitert. Wenn jedoch die stark immunogene Wirkung der adenoviralen Genprodukte ausgenutzt werden soll, ist es vorteilhaft, zwei oder mehr trans wirkende Elemente mit Ausnahme des Schaltergens vom Helfer-abhängigen Vektor codieren zu lassen.

Vorzugsweise umfassen sowohl der Helfer-abhängige Vektor als auch das Helfer-Virus ein für beide gleiches Suizid-Gen. Unter einem Suizidgen wird dabei ein Gen verstanden, das, wenn es in eine eukaryontische und insbesondere in eine Säugetier-Zelle eingeführt und darin exprimiert wird, dieser Zelle eine erhöhte Empfindlichkeit gegen einen oder mehrere zugeordnete Wirkstoffe verleiht. Durch die Expression des Suizidgens kann daher die exprimierende Zelle bei solchen Wirkstoff-Konzentrationen abgetötet werden, die das Suizidgen nicht exprimierende Zellen noch nicht abtöten; vergleiche hierzu auch Spencer, D. M., Developments in suicide genes for preclinical and clinical applications, Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (2000), 433-440. Ein bevorzugtes Suizidgen ist das Thymidin-Kinase-Gen aus Herpes simplex (HSV-Tk); der zugeordnete Wirkstoff, ein Nucleosid-Analogon, ist unter der Bezeichnung Ganciclovir bekannt. Sowohl das HSV-Tk-Gen als auch der Wirkstoff Ganciclovir sind seit langem untersucht, in ihrer Wirkungsweise beschrieben und zudem leicht erhältlich.

Das Suizidgen ermöglicht es auf vorteilhaft einfache Weise, Zellen gezielt abzutöten, die den Helfer-abhängigen Vektor und/oder das Helfer-Virus umfassen. Die Vermehrung des Helferabhängigen Vektors und des Helfer-Virus kann daher jederzeit beendet werden. Dies erhöht die mit der Verwendung des erfindungsgemäßen Expressionssystems verbundene Sicherheit.

Bei der Behandlung von Tumoren ermöglicht das Suizidgen des erfindungsgemäßen Expressionssystems, gezielt Tumorgewebe abzutöten, dessen Zellen mit dem Helferabhängigen Vektor und/oder dem Helfer-Virus infiziert sind. Eine gezielte Infektion des Tumorgewebes kann beispielsweise durch den Einbau von speziellen Zelloberflächen-Rezeptor- Genen in das Genom des Helfer-abhängigen Vektors und/oder des Helfer-Virus erreicht werden. Die Effektivität von Suizidgen-Behandlungen ist im Kontext eines replizierenden Virus bzw. des hoch vermehrten Helfer-abhängigen Vektors verstärkt.

Darüber hinaus ermöglicht es das Abtöten der vom Helfer-abhängigen Vektor und/oder vom Helfer-Virus infizierten Zellen und ihre nachfolgende Lyse, große Mengen potentiell immunogener Proteine aus den lysierten Zellen freizusetzen. Die freigesetzten Proteine umfassen sowohl Proteine, die von Helfer-abhängigen Vektor und/oder vom Helfer-Virus codiert werden, als auch zelleigene Proteine. Letztere können ebenfalls immunogen sein, insbesondere dann, wenn die lysierte Zelle zu einer Tumorzelle entartet war. Die freigesetzten, vom Vektor und/oder vom Helfer-Virus codierten Proteine wirken dann als Adjuvans für die Herstellung von Immunglobulinen gegen die von der Tumor-Zelle hergestellten Antigene bzw. immunogenen Proteine.

Besonders bevorzugt sind solche von Adenoviren abgeleiteten Helfer-abhängigen Vektoren und Helfer-Viren, denen die E3-Genregion fehlt (Deletion). Zweckmäßigerweise umfasst der Helferabhängige Vektor und/oder das Helfer-Virus anstelle einer E3-Genregion ein Suizidgen, insbesondere ein Gen für Herpes simplex-Thymidinkinase. E3-Region, die eine Expressionkasette mit der Herpes simplex Thymidinkinase Gen trägt. Die Lage der E3-Deletion entspricht dabei vorteilhafterweise der in typischen E1-E3 deletierten rekombinanten Adenoviren des Seroytp 5, siehe dazu auch Bett AJ, Haddara W, Prevec L, Graham FL. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Sep 13; 91 (19): 8802-6.

Gemäß einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Expressionssystem der beschriebenen Art zur Verwendung als therapeutischer und/oder immunologischer Wirkstoff bereitgestellt. Ein solches Expressionssystem ermöglicht es, die genannten Vorteile im Rahmen einer therapeutischen Behandlung auszunutzen, beispielsweise im Rahmen einer gentherapeutischen Behandlung.

Besonders bevorzugt ist ein Expressionssystem zur Erzeugung von Immunantworten, insbesondere gegen ein vom Zielgen codiertes Produkt. Das Expressionssystem erlaubt es, praktisch beliebige Vakzinierungsgene in einer Zielzelle zu exprimieren und stellt dementsprechend ein universell nutzbares virusbasiertes Trägersystem für Vakzinierungsgene dar. Somit ermöglicht ein erfindungsgemäßes Expressionssystem die Erzeugung von protektiven und/oder therapeutischen Immunzuständen im Sinne von Impfungen und Immuntherapien.

Besonders bevorzugt ist ein Expressionssystem zur Behandlung von Cervix-Carcinomen, siehe hierzu auch die Ausführungsbeispiele.

Gemäß einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Vermehren und Verpacken eines Helfer-abhängigen Vektors der beschriebenen erfindungsgemäßen Art angegeben, das gekennzeichnet ist durch das Bereitstellen einer Produktionszelle, die ein Expressionsystem der beschriebenen erfindungsgemäßen Art mit dem Helfer-abhängigen Vektor und einem zugeordneten Helfer-Virus umfasst.

Die Produktionszelle kann eine beliebige Zelle sein, in der der Helfer-abhängige Vektor unter Einwirkung der vom zugeordneten Helfer-Virus bereitgestellten trans-wirkenden Elemente vermehrt und/oder verpackt werden kann. Produktionszellen können insbesondere eukaryontische Zellen sein wie Zellen aus Hund, Maus, Ratte, Rind, Pferd, Ziege, Schaf, Primat und Mensch. Besonders bevorzugt als Produktionszellen sind Säugetier-Zellen, wenn Helfer- abhängiger Vektor und Helfer-Virus wie beschrieben die cis- und frans-wirkenden Elemente der Adenovirus-Replikation zu ihrer Vermehrung und/oder Verpackung umfassen.

Wie beschrieben führt die gleichzeitige Anwesenheit von Helfer-abhängigem Vektor und Helfer- Virus in einer Produktionszelle dazu, dass das Helfer-Virus unter Einwirkung der vom Helferabhängigen Vektor codierten Rekombinase rekombiniert wird und nicht mehr verpackt werden kann. Gleichzeitig mit dem Verlust der Verpackungsfähigkeit gelangt das Schaltergen in räumliche Nähe zu dem für seine Expression notwendigen Promoter, so dass das Helfer-Virus die zur Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-abhängigen Vektors notwendigen trans- wirkenden Proteine exprimiert. Der Helfer-abhängige Vektor wird dann vermehrt und/oder verpackt.

Ferner wird ein Verfahren zum Exprimieren eines Zielgens in einem Zielorganismus bereitgestellt, umfassend die Schritte:

a) Vermehren und/oder Verpacken eines das Zielgen umfassenden Helferabhängigen Vektors in einem Verfahren der soeben beschriebenen Art,
b) Aufnehmen des Helfer-abhängigen Vektors in eine Zelle im Zielorganismus, und
c) Exprimieren des Zielgens in der besagten Zelle.

Im Sinne dieser Erfindung wird unter einem Zielorganismus ein mehrzelliges Lebewesen verstanden, insbesondere ein Säugetier wie ein Hund, Maus, Ratte, Rind, Pferd, Ziege, Schaf, Primat und Mensch, aber auch Zellkulturen oder sonstige aus einem mehrzelligen Lebewesen gewonnenen Zellverbände, Gewebe und Organe.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht das Exprimieren eines Zielgens in einem solcherart verstandenen Zielorganismus unter Ausnutzung der beschriebenen Vorteile, die mit der Verwendung eines erfindungsgemäßen Expressionssystems verbunden sind.

Gemäß einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels bereitgestellt, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch das Mischen eines Helfer-abhängigen Vektors der zuvor beschriebenen Art, eines zugeordneten Helfer-Virus der zuvor beschriebenen Art oder eines Gemischs des Vektors und des Helfer-Virus mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Ebenfalls wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung die Verwendung eines Expressionssystems der beschriebenen Art zum Vermehren und/oder Verpacken eines vom Expressionssystem umfassten Helfer-abhängigen Vektors angegeben. Hinsichtlich der mit der Verwendung des Expressionssystems verbundenen Vorteile wird auf das zuvor gesagte verwiesen.

Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßes Expressionssystem verwendet zum Exprimieren eines Zielgens in einem Zielorganismus und/oder zum Herstellen eines Arzneimittels. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Expressionssystems zum Herstellen eines Arzneimittels zur Behandlung von Cervix-Carcinomen.

Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Arzneimittel, umfassend einen Helferabhängigen Vektor wie zuvor beschrieben, bereit.

Schließlich wird erfindungsgemäß ein Arzneimittelsystem bereitgestellt, wobei das Arzneimittelsystem umfasst:

a) einen Helfer-abhängigen Vektor der beschriebenen Art, wobei der Helferabhängige Vektor ein Suizidgen umfasst, und
b) eine Substanz, die mit einem Expressionsprodukt des Suizidgens zusammenwirkt, um eine den Helfer-abhängigen Vektor umfassende Zelle abzutöten.

Die mit der Verwendung eines im Helfer-abhängigen Vektor enthaltenen Suizidgens verbundenen Vorteile sind bereits oben beschrieben. Mit dem Arzneimittelsystem ist dem Benutzer vorteilhafterweise zugleich der Helfer-abhängige Vektor als auch der zugehörende zellabtötende Wirkstoff an die Hand gegeben, mit dem der Benutzer die beschriebenen Vorteile und Wirkungen auf einfache Weise erreichen kann. Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn das Arzneimittelsystem zusätzlich ein Helfer-Virus der beschriebenen Art umfasst, wobei das Helfer- Virus das gleiche Suizidgen umfasst wie der Helfer-abhängige Vektor. In diesem Fall lassen sich mit dem Arzneimittelsystem sowohl der Helfer-abhängige Vektor als auch das Helfer-Virus im Patienten einfach beseitigen. Dies kann nicht nur zum Abbrechen der Behandlung, sondern auch zum therapeutischen Zerstören ausgewählter, vom Vektor und/oder dem Helfer-Virus infizierter Zellen und/oder Gewebe genutzt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele und der beigefügten Figuren weiter beschrieben. Es zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Aufbaus eines erfindungsgemäßen Helferabhängigen Vektors,

Fig. 2 eine schematische Darstellung des Aufbaus eines erfindungsgemäßen Helfer-Virus,

Fig. 3 eine schematische Darstellung des Aufbaus eines rekombinanten Helfer-Virus, das vom Helfer-Virus gemäß Fig. 2 abgeleitet ist, und

Fig. 4 eine schematische Darstellung des Zusammenwirkens eines Helfer-abhängigen Vektors gemäß Fig. 1 und eines Helfer-Virus gemäß Fig. 2.

Beispiel 1 Schematischer Aufbau eines erfindungsgemäßen Helfer-abhängigen Vektors

In Fig. 1 ist schematisch ein erfindungsgemäßer Helfer-abhängiger Vektor 1 dargestellt. Der Vektor 1 ist vom Genom des Adenovirus (Serotyp 2) abgeleitet und besitzt ein Rückgrat 11 aus linearer doppelsträngiger DNA. Das Rückgrat verbindet die im Folgenden genannten Gene und Elemente des Vektors 1 miteinander und verleiht dem Vektor 1 eine für seine Verpackung in adenoviralen infektiösen Partikeln vorteilhaft angepasste Länge.

An den beiden Enden des Rückgrats 11 ist jeweils ein cis-wirkendes adenovirales Element angeordnet, indem das jeweilige Ende von einer adenoviralen ITR-Sequenz 12 bzw. 12' gebildet wird. Zwischen den ITR-Sequenzen 12 und 12' ist eine adenovirale Verpackungssequenz 14 (ψ) in der Nähe der linken ITR-Sequenz 12 angeordnet.

Ferner umfasst Vektor 1 ein für eine Cre-Rekombinase codierendes Gen 30. Dieses ersetzt die in Adenoviren allfällig vorhandene E1-Genregion. Der Helfer-abhängige Vektor ist daher replikationsinkompetent und zu seiner Vermehrung und Verpackung auf von außen bereitgestellte adenovirale trans wirkende Elemente angewiesen.

Der Helfer-abhängige Vektor umfasst ferner ein Zielgen 38. Das Zielgen 38 ist eingerichtet, um in Säugetier-Zellen, die mit dem Helfer-abhängigen Vektor 1 infiziert sind, exprimiert zu werden.

Als besonderes Sicherheitsmittel umfasst der Helfer-abhängige Vektor 1 ein Suizidgen 39, nämlich ein für Thymidin-Kinase codierendes Gen aus Herpes simplex (HSV-Tk). Dieses ermöglicht es, Zellen durch Verabreichung von Ganciclovir abzutöten, in denen das HSV-Tk- Gen 39 exprimiert wird. Das HSV-Tk-Gen 39 ersetzt die in Adenoviren vom Serotyp 2 allfällig vorhandene E3-Genregion.

Neben den cis-wirkenden Elementen 12, 12' und 14 und den genannten Genen 30, 38 und 39 kann das Rückgrat 11 weitere Gene und Sequenzen umfassen. Insbesondere kann Vektor 1 Gene enthalten, die für trans wirkende Proteine zum Vermehren und/oder Verpacken von adenoviralem genetischen Material benötigt werden, solange Vektor 1 weiterhin auf ein Helfer- Virus zu seinem Vermehren und/oder Verpacken angewiesen bleibt.

Beispiel 2 Schematischer Aufbau eines erfindungsgemäßen Helfer-Virus

In Fig. 2 ist schematisch der Aufbau eines erfindungsgemäßen Helfer-Virus 2 dargestellt. Das Helfer-Virus 2 ist, wie der Helfer-abhängige Vektor 1, vom Genom des Adenovirus (Serotyp 2) abgeleitet und besitzt ein Rückgrat 21 aus linearer doppelsträngiger DNA. Das Rückgrat verbindet die im Folgenden genannten Gene und Elemente des Virus 2 miteinander und verleiht dem Virus 2 eine für seine Verpackung in adenoviralen infektiösen Partikeln vorteilhaft angepasste Länge.

An den beiden Enden des Rückgrats 21 ist jeweils ein cis-wirkendes adenovirales Element angeordnet, indem das jeweilige Ende von einer adenoviralen ITR-Sequenz 12 bzw. 12' gebildet wird. Die linke ITR-Sequenz 12 erstreckt sich von Position 1 bis zur Position 138.

In 3'-Richtung hinter der linken ITR-Sequenz 12 ist ein p5-Promoter 22 aus dem Genom des adeno-assoziierten Virus (AAV) Typ 2 angeordnet. Der Promoter 22 erstreckt sich von Position 145 bis 307.

Hinter dem Promoter 22 ist erstreckt sich von Position 341 bis 374 eine erste lox-Sequenz 20. Eine zweite lox-Sequenz 20' erstreckt sich von Position 1817 bis 1850. Beide lox-Sequenzen 20, 20' können von einer Cre-Rekombinase erkannt und homolog rekombiniert werden, so dass der von ihnen eingeschlossene Bereich aus dem Helfer-Virus 2 herausgeschnitten werden kann.

An die erste lox-Sequenz 20 schließt sich an Position 414 bis 570 ein adenovirales Verpackungssignal 14 an.

Auf das Verpackungssignal 14 folgt an Position 583 bis 1787 ein HS4-Silencer-Element 24.

Auf die zweite lox-Sequenz 20' folgt an Position 1909 bis 4853 eine promotorlose adenovirale E1-Genregion 26 als Schaltergen.

Wie schon beim Helfer-abhängigen Vektor 1 ist die adenovirale E3-Genregion durch ein Suizidgen 39, nämlich einem Gen für Herpes simplex-virale Thymidin-Kinase (HSV-Tk) ersetzt.

Beispiel 3 Schematischer Aufbau eines erfindungsgemäßen rekombinanten Helfer- Virus

Fig. 3 zeigt schematisch den Aufbau eines erfindungsgemäßen rekombinanten Helfer-Virus 2'. Das rekombinante Helfer-Virus 2' kann aus dem Helfer-Virus 2 durch homologe Rekombination der lox-Sequenzen 20 und 20' gewonnen werden. Der Aufbau des rekombinanten Helfer-Virus 2' entspricht dem des nicht rekombinanten Helfer-Virus 2, unterscheidet sich jedoch von diesem darin, dass das adenovirale Verpackungssignal 14 und das HS4-Silencer-Element 24 fehlen. Durch Rekombination der lox-Sequenzen 20 und 20' miteinander wurde eine neue lox- Sequenz 20" erzeugt. Diese liegt zwischen dem p5-Promoter 22 und der E1-Genregion 26, die nunmehr im Unterschied zum nicht rekombinanten Helfer-Virus 2 in räumlicher Nähe zueinander angeordnet sind.

Beispiel 4 Schematische Darstellung des Zusammenwirkend eines Helfer-abhängigen Vektors gemäß Fig. 1 und eines Helfer-Virus gemäß Fig. 2

Fig. 4 zeigt in den Teilfiguren 4A bis 4E schematisch das Zusammenwirken eines Helferabhängigen Vektors gemäß Beispiel 1 und eines Helfer-Virus gemäß Beispiel 2 in einem erfindungsgemäßen Expressionssystem.

In Fig. 4A sind schematisch auf der linken Seite ein erfindungsgemäßer Helfer-abhängiger Vektor 1 gemäß Beispiel 1 und auf der rechten Seite ein erfindungsgemäßes Helfer-Virus 2 gemäß Beispiel 2 dargestellt. Bezugszeichen und Symbole entsprechen denen der Fig. 1 und 2. Vektor 1 und Virus 2 befinden sich in einer Produktionszelle (nicht dargestellt).

Der Helfer-abhängige Vektor 1 exprimiert eine Cre-Rekombinase 30'. Die Cre-Rekombinase 30' wird vom Rekombinase-Gen 30 codiert.

Die E1-Genregion 26 des Helfer-Virus 2 wird nicht exprimiert, wie durch eine gestrichelte Linie unterhalb von Virus 2 angedeutet ist. Eine vom Promoter 22 ausgehende Transkription bricht im Bereich des HS4-Silencer-Elements 24 ab, bevor die E1-Genregion 26 transkribiert wird.

Die Cre-Rekombinase 30' vermittelt eine homologe Rekombination zwischen den beiden lox- Sequenzen 20, 20' (dargestellt als schwarze Rechtecke) des Helfer-Virus 2, wie in Fig. 4B schematisch dargestellt. Dabei wird der von den lox-Sequenzen 20, 20' eingeschlossene Bereich ausgeschleift. Die Cre-Rekombinase 30' durchtrennt das Virus 2 innerhalb jeder der beiden lox-Sequenzen 20 und 20' und fügt die Bruchstücke so zusammen, dass der ausgeschleifte Bereich zu einem selbständigen ringförmigen DNA-Molekül wird, während der verbleibende Rest des Virus 2 zum rekombinanten Virus 2' zusammengefügt wird.

Im rekombinanten Helfer-Virus 2' befinden sich die E1-Genregion 26 und der Promoter 22 in räumlicher Nähe zueinander, wie in Fig. 4C schematisch dargestellt ist. Das Entfernen des von den lox-Sequenzen 20 und 20' eingeschlossenen Bereichs bewirkt, dass das rekombinante Virus 2' das HS4-Silencer-Element 24 verliert. Dies ermöglicht es, dass eine vom Promoter 22 ausgehende Transkription bis in die E1-Genregion 26 fortgesetzt werden kann, wie schematisch durch eine pfeilförmige gestrichelte Linie unterhalb des Virus 2' dargestellt ist. Die E1-Genregion kann daher im rekombinanten Virus 2' exprimiert werden, anders als im ursprünglichen, nicht rekombinanten Helfer-Virus 2. Die Expression der E1-Genregion 26 bewirkt die Expression auch der übrigen für die Verpackung von Adenoviren notwendigen Gene (nicht dargestellt), so dass die Produktionszelle infektiöse Virus-Partikel 40 herstellt. Die übrigen für die Verpackung notwendigen Gene sind auf dem Helfer-Virus 2 bzw. 2' angeordnet.

Fig. 4D zeigt schematisch die Verpackung des Helfer-abhängigen Vektors 1 in Virus- Partikel 40. Nucleinsäuren, die ein adenovirales Verpackungssignal 14 besitzten, können in die Partikel 40 verpackt werden. Da das rekombinante Helfer-Virus 2' über kein solches Verpackungssignal verfügt, wird es nicht verpackt. Die Bildung von infektiösen Helfer-Virus- Partikeln ist somit praktisch ausgeschlossen. Der Helfer-abhängige Vektor 1 verfügt jedoch über ein Verpackungssignal 14 und wird dementsprechend zu infektiösen Partikeln 40' verpackt, siehe dazu Fig. 4E.

Beispiel 5 Wirkungsweise eines erfindungsgemäßen Expressionssystems gemäß Beispiel 4

Die gemäß Beispiel 4 gebildeten infektiösen Partikel 40' werden aus der Produktionszelle ausgeschleust und können andere Zellen (Zielzellen) infizieren (nicht dargestellt). Die Zielzellen nehmen die infektiösen Partikel 40' auf und entpacken die in ihnen enthaltene DNA des Helferabhängigen Vektors 1. Der Helfer-abhängige Vektor 1 kann gegebenenfalls in den Zielzellen vermehrt werden. Er ermöglicht die Expression des Zielgens 38 in den Zielzellen. Da der Helferabhängige Vektor 1 nicht über das zu seiner Vermehrung und/oder Verpackung notwendige Schaltergen 26 verfügt, kann er in den Zielzellen nicht verpackt werden (vorausgesetzt, die Zielzellen enthalten kein Helfer-Virus 2). Im Ergebnis wird so erreicht, dass die Bildung infektiöser Partikel 40' auf die einmal infizierten Produktionszellen beschränkt bleibt. Die Vermehrung und Verpackung der Helfer-abhängigen Vektoren bleibt dadurch steuerbar und hängt maßgeblich von der ursprünglich applizierten Menge des Expressionssystems ab. Damit gleicht das erfindungsgemäße Expressionssystem einem attenuierten Lebendimpfstoff.

Beispiel 6 Herstellung eines Helfer-abhängigen Vektors gemäß Fig. 1 und eines Helfer- Virus gemäß Fig. 2

Der Helfer-abhängige Vektor 1 und das Helfer-Virus 2 werden jeweils in Plasmidform mittels üblicher Verfahren hergestellt, vergleiche in soweit Sambrook et al., a. a. O.

Das 5'-ITR-Element kann aus einem das 5' Ende des Adenovirus Seroyp 2 enthaltenden Plasmid wie pGVJ durch PCR mit den Primern SEQ ID NO 2 (5'-ITR Primer 1) und SEQ ID NO 3 (5'-ITR Primer 2) amplifiziert werden.

Der p5-Promoter kann aus einem das Genom des Adeno-assoziierten Virus Typ 2 enthaltenden Plasmit durch PCR mit den Primern SEQ ID NO 4 (p5-Promoter Primer 1) und SEQ ID NO 5 (p5-Promoter Primer 2) amplifiziert werden.

Das Verpackungssignal ψ kann aus einem dieses Verpackungssignal enthaltenden Plasmid durch PCR mit den Primern SEQ ID NO 6 (psi Primer 1) und SEQ ID NO 7 (psi Primer 2) amplifiziert werden.

Die Plasmidformen des Helfer-abhängigen Vektors 1 und des Helfer-Virus 2 werden durch Calciumphosphat-Kopräzipitation jeweils in 293-Zellen eingeführt. In den 293-Zellen werden Vektor 1 bzw. Helfer-Virus 2 linearisiert, vervielfältigt und in infektiöse Partikel verpackt. Die infektiösen Vektor- bzw. Virus-Partikel werden von den 293-Zellen abgetrennt und mittels herkömmlicher Verfahren aufgereinigt.

Beispiel 7

Verwendung eines Expressionssystems nach Beispiel 4 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Cervix-Carcinomen

Die wichtigste Ursache für die Entstehung von Cervix-Carcinomen sind Infektionen mit Warzenviren (Papillomaviren). Unter den über 100 verschiedenen Arten von humanen Papillomaviren (HPV) sind es insbesondere die Serotypen 16 und 18, die zur Entwicklung von Genitalinfektionen wie Cervix-Carcinomen führen. Notwendig für die Tumorgenese ist der Einbau von viralen E6- und E7-Genen in das Genom der infizierten Zelle. Die gegen die Expressionsprodukte der E6- und E7-Gene gerichtete Immunantwort ist zu schwach, um ein Abtöten der Tumorzellen sicherzustellen.

Es wird ein Helfer-abhängiger Vektor 1 nach Beispiel 6 hergestellt, der als Zielgen 38 ein E6- und/oder E7-Gen enthält. Der Helfer-abhängige Vektor 1 wird einem Patienten in einem Expressionssystem zusammen mit einem zugeordneten Helfer-Virus 2 verabreicht, vorzugsweise durch Injektion in das Unterhautgewebe. Nach der Injektion infizieren der Helferabhängige Vektor 1 und das Helfer-Virus 2 Körperzellen des Patienten.

In den Körperzellen, die mit dem Helfer-abhängigen Vektor 1 infiziert sind, wird der Vektor 1 vervielfältigt auf bis zu 100.000 Kopien pro infizierter Zelle. Gleichzeitig exprimiert jede Kopie des Vektors 1 das oder die Zielgene 38, nämlich ein E6- und/oder E7-Gen. Damit werden um Größenordnung mehr Zielgen-Produkte gebildet als in normalen Cervix-Carcinom-Zellen. Gegen die stark exprimierten Zielgen-Produkte wird eine starke Immunantwort erzeugt.

In den Körperzellen, die sowohl mit dem Helfer-abhängigen Vektor 1 als auch mit dem Helfer- Virus 2 infiziert sind (Produktionszellen), findet eine Replikation sowohl des Vektors 1 als auch des Helfer-Virus 2 statt. Gleichzeitig wirken Vektor 1 und Helfer-Virus 2 zusammen, um Kopien des Vektors 1 in infektiöse Partikel zu verpacken, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die infektiösen Partikel können weitere Körperzellen infizieren.

In den Produktionszellen werden sowohl das Zielgen 38 als auch die trans-wirkenden Gene zur Verpackung des Helfer-abhängigen Vektors 1 exprimiert. Die Produkte der trans-wirkenden Gene wirken als starke Adjuvanzien und verstärken die durch die Expression des Zielgens 38 ausgelöste Immunantwort. Zweckmäßigerweise umfasst auch der Helfer-abhängige Vektor 1 zumindest eines der trans-wirkenden Gene, um die Adjuvans-Wirkung auch in den Zellen zu erreichen, die keine Produktionszellen sind.

Zur Therapie von Cervix-Carcinomen kann das Expressionssystem in das Tumorgewebe selbst injiziert werden, so dass Tumorzellen zu Produktionszellen werden. Das Vermehren und Verpacken des Helfer-abhängigen Vektors 1 führt nach einiger Zeit zum Absterben der Produktionszelle und damit zum Absterben von Tumor-Gewebe. Durch den Bystander-Effekt wird erreicht, dass nicht nur die jeweils infizierte Tumorzelle selbst, sondern dass auch benachbarte Tumorzellen absterben.

Durch das Absterben der Produktionszellen werden große Mengen an Tumor-Antigenen und adenoviralen Proteinen freigesetzt. Letztere wirken wiederum als Adjuvans und stimulieren die Immunantwort gegen die Tumor-Antigene.

Helfer-Virus 2 und Helfer-abhängiger Vektor 1 umfassen jeweils eine Kopie des HSV-Tk- Gens 39, so dass mit dem Vektor 1 und/oder dem Helfer-Virus 2 infizierte Zellen durch Expression von HSV-Thymidin-Kinase 39 Ganciclovir-sensitiv sind. Etwa 6-8 Tage nach Verabreichung des erfindungsgemäßen Expressionssystems an den Patienten wird ihm Ganciclovir in ausreichender Menge verabreicht, um die vom Vektor 1 und/oder Helfer-Virus 2 infizierten Zellen abzutöten. Die dabei erfolgende Freisetzung adenoviraler trans-wirkender Genprodukte stimuliert vorteilhaft die Immunantwort gegen ebenfalls freigesetzte Tumor- Antigene. SEQUENCE LISTING

Claims

1. Helfer-abhängiger Vektor zum Exprimieren eines Zielgens in einer Zielzelle, umfassend:

a) ein für eine Rekombinase codierendes Gen,

b) das Zielgen.

2. Helfer-abhängiger Vektor nach Anspruch 1, ferner umfassend

a) eine adenovirale linke inverted terminal repeat-(ITR)-Sequenz,

b) eine adenovirale Verpackungssequenz (ψ), und

c) eine adenovirale rechte ITR-Sequenz

3. Helfer-abhängiger Vektor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rekombinase-Gen für eine Rekombinase codiert, die ausgewählt ist aus Cre-Rekombinase und FLP-Rekombinase.

4. Helfer-Virus zum Vermehren und/oder Verpacken eines zugeordneten Helfer-abhängigen Vektors nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend:

a) ein Paar Erkennungssequenzen zur Erkennung durch die vom Helfer-abhängigen Vektor codierte Rekombinase, wobei die Erkennungssequenzen einen durch die Rekombinase entfernbaren Abschnitt einschließen,

b) ein für die Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus und des Helferabhängigen Vektors notwendiges Schaltergen und einen für die Expression des Schaltergens notwendigen Promoter,
wobei das Paar Erkennungssequenzen so zwischen Promoter und Schaltergen angeordnet ist, dass das Schaltergen exprimierbar wird, wenn der entfernbare Abschnitt entfernt ist, und

c) ein zur Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus notwendiges ciswirkendes Element, angeordnet im entfernbaren Abschnitt.

5. Helfer-Virus nach Anspruch 4, wobei das für die Vermehrung und/oder Verpackung des Helfer-Virus notwendige cis-wirkende Element ausgewählt ist aus:

a) einer adenoviralen linken ITR-Sequenz,

b) einem adenoviralen Verpackungssignal W, und

c) einer adenoviralen rechten ITR-Sequenz.

6. Helfer-Virus nach einem der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Schaltergen ein adenovirales E1-Gen ist.

7. Helfer-Virus nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Paar Erkennungssequenzen ein Paar lox-Sequenzen und/oder ein Paar frt-Sequenzen umfasst.

8. Helfer-Virus nach einem der Ansprüche 4 bis 7, umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO 1.

9. Expressionssystem zum Exprimieren eines Zielgens in einer Zielzelle, umfassend

a) einen Helfer-abhängigen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und

b) ein zugeordnetes Helfer-Virus nach einem der Ansprüche 4 bis 8.

10. Expressionssystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl der Helferabhängige Vektor als auch das Helfer-Virus ein für beide gleiches Suizidgen umfassen.

11. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 9 bis 10 zur Verwendung als therapeutischer und/oder immunologischer Wirkstoff.

12. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Behandlung von Cervix- Carcinomen.

13. Verfahren zum Vermehren und Verpacken eines Helfer-abhängigen Vektors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das Bereitstellen einer Produktionszelle, die ein Expressionssystem nach einem der Ansprüche 9 bis 12 mit dem Helfer-abhängigen Vektor und einem Helfer-Virus nach einem der Ansprüche 4 bis 8 umfasst.

14. Verfahren zum Exprimieren eines Zielgens in einem Zielorganismus, umfassend die Schritte:

a) Vermehren und/oder Verpacken eines das Zielgen umfassenden Helferabhängigen Vektors in einem Verfahren nach Anspruch 13,

b) Aufnehmen des Helfer-abhängigen Vektors in einer Zelle im Zielorganismus, und

c) Exprimieren des Zielgens in der besagten Zelle.

15. Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels, gekennzeichnet durch das Mischen eines Helfer-abhängigen Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines zugeordneten Helfer-Virus nach einem der Ansprüche 4 bis 8 oder eines Gemischs des Vektors und des Helfer-Virus mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

16. Verwendung eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Vermehren und Verpacken eines im Expressionssystem enthaltenen Helfer-abhängigen Vektors.

17. Verwendung eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Exprimieren eines Zielgens in einem Zielorganismus.

18. Verwendung eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Herstellen eines Arzneimittels.

19. Verwendung eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Herstellen eines Arzneimittels zur Behandlung von Cervix-Carcinomen.

20. Arzneimittel, umfassend einen Helfer-abhängigen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

21. Arzneimittelsystem, umfassend:

a) einen Helfer-abhängigen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Helfer-abhängige Vektor ein Suizidgen umfasst, und

b) eine Substanz, die mit einem Expressionsprodukt des Suizidgens zusammenwirkt, um eine den Helfer-abhängigen Vektor umfassende Zelle abzutöten.