DE69834936T2

DE69834936T2 - Vektor zur gewebespezifischen replikation und expression

Info

Publication number: DE69834936T2
Application number: DE69834936T
Authority: DE
Inventors: Yung-Nien Cockeysville CHANG; L. Paul Gaithersburg HALLENBECK; M. Carl Damascus HAY; A. David Eldersburg STEWART
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1997-11-19
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2018-11-18
Also published as: ATE330019T1; IL136104A0; WO1999025860A1; US6638762B1; AU1755299A; EP1032696B1; JP2002507382A; CA2310563A1; EP1032696A1; US20040009588A1; NZ504367A; DE69834936D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein zellspezifische Expressionsvektoren. Sie betrifft insbesondere die gezielte Gentherapie unter Verwendung rekombinanter Expressionsvektoren und insbesondere von Adenovirusvektoren. Insbesondere betrifft die Erfindung modulierbare Replikations-konditionale Expressionsvektoren und Verfahren zu ihrer Verwendung. Solche Vektoren sind in der Lage, selektiv in einer Zielzelle oder einem Zielgewebe zu replizieren, um in einem Gewebe durch die Gegenwart des Vektors an sich oder eines oder mehrerer heterologer Genprodukte, die von dem Vektor exprimiert werden und überall in dem Gewebe verteilt sind, wobei die Vektoren so aufgebaut sind, dass Replikation und Genexpression aus dem Vektor moduliert werden können, einen therapeutischen Vorteil bereitzustellen.
In solchen Vektoren ist ein zur Replikation essentielles Gen unter der Kontrolle einer heterologen Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz angeordnet. Somit ist die Replikation durch die Gegenwart eines Faktors (von Faktoren), der die Transkription auslöst, oder der Abwesenheit eines Faktors (von Faktoren), der die Transkription des Gens mittels der transkriptionalen regulatorischen Sequenz hemmt, bedingt.
Bevorzugte Vektoren enthalten ein heterologes Gen, das ein Produkt produziert, das die virale Replikation steigert oder hemmt. Solche Gene sind zur Modulierung der viralen Replikation und somit auch zur Modulierung der Expression von Genen in dem Vektor geeignet. Mit diesen Vektoren kann darum der Vektor in einer erwünschten Zelle exprimiert werden, Zielgewebe kann selektiv behandelt werden, und die Replikation und Expression können moduliert werden.
Die Erfindung betrifft auch Zellen und/oder Verfahren zur Herstellung von diversen heterologen Genprodukten in hoher Menge aus im Wesentlichen einem Promotorelement.
Die Erfindung betrifft auch Zellen zur Produktion hoher Titer des rekombinanten Replikations-konditionalen Vektors und/oder hohe Titer eines aus dem Vektor exprimierten Genprodukts, das zur Herstellung klinisch relevanter Genprodukte oder Vektorpräparationen für die gezielte Gentherapie geeignet ist.
Technischer Hintergrund
Das Einbringen von exogenen Genen in Zellen in vitro oder in vivo, systemisch oder in situ war bisher für Zusammensetzungen, wobei es für die Zielzellen von Nachteil wäre, das exogene Gen aufzunehmen, von beschränkter Anwendung. Eine Strategie zur Behebung dieses Problems besteht in der Entwicklung von Verabreichungsvorgängen oder von Vektoren, die auf einen spezifischen Zelltyp gerichtet sind. Unter Verwendung einer systemischen Verabreichung wurden bereits Versuche unternommen, exogene Gene durch direkte Injektion von DNA auf Myocyten und Muskelzellen zu lenken, die exogene DNA unter Verwendung von DNA-Proteinkomplexen auf Hepatocyten und unter Verwendung von Liposomen auf Endothelzellen zu lenken.
Unter Verwendung der in situ Verabreichung wurden bereits retrovirale Replikationsfunktionen gegen Zielzellen verwendet, die aktiv replizieren.
Bisher war somit die Ausrichtungsfähigkeit auf Zellen beschränkt, allerdings aufgrund der mangelnden Zelltypspezifität und der geringen Gentransferwirksamkeiten. Die eingeschränkte Fähigkeit, ein exogenes Gen auf erkrankte Zellen in einem Organismus auszurichten, während die Aufnahme des Gens durch normale Nichtzielzellen vermieden (beseitigt) wird, war bisher ein besonderes Hindernis bei der Entwicklung von Therapien auf der Basis eines wirksamen Gentransfers für Krankheiten bei Tieren und Menschen.
Eine besonders schwierige Herausforderung ist das Targeting von Tumorzellen. Viele scheinbar viel versprechende Strategien für diese Zellen sind zudem auf einen oder einige Zelltypen beschränkt.
Die vorliegende Erfindung stellt bei einem Aspekt einen Weg bereit, ein exogenen Gens effizient, mit hoher Verteilung in einem Tumor und in kontrollierter Weise abzugeben.
Adenoviren sind unbehüllte, reguläre Ikosaeder. Die Proteinschicht (Capsid) besteht aus 252 Kapsomeren, wovon 240 Hexone und 12 Pentone sind. Der größte Teil der ausführlichen Strukturuntersuchungen der adenoviralen Polypeptide erfolgt für den Adenovirus Typ 2 und Typ 5. Die Virus-DNA ist 23,85 × 10⁶ Dalton für Adenovirus 2 und variiert in Abhängigkeit von dem Serotyp etwas in der Größe. Die DNA weist umgekehrte terminate Wiederholungseinheiten auf, und die Länge von diesen variiert mit dem Serotyp.
Der Replikationscyclus ist in frühe (E) und späte (L) Phasen eingeteilt. Die späte Phase definiert das Einsetzen der viralen DNA-Replikation. Die adenoviralen Strukturproteine werden im Allgemeinen während der späten Phase synthetisiert. Nach einer Adenovirusinfektion sind Wirts-DNA und Proteinsynthese in mit den meisten Serotypen infizierten Zellen gehemmt. Der adenovirale lytische Cyclus von Adenovirus 2 und Adenovirus 5 ist sehr effizient und führt zu ungefähr 10000 Virionen pro infizierte Zelle in Verbindung mit der Synthese von überschüssigem Virusprotein und DNA, die nicht in das Virus eingebaut wird. Die frühe adenovirale Transkription ist eine komplizierte Sequenz zusammenhängender biochemischer Ereignisse, aber sie hat im Wesentlichen die Synthese von viralen RNAs vor dem Einsetzen der viralen DNA-Replikation zur Folge.
Die Organisation des Adenovirusgenoms ist in sämtlichen Adenovirusgruppen ähnlich, und spezifische Funktionen liegen im Allgemeinen für jeden untersuchten Serotyp an identischen Stellen. Frühe cytoplasmatische Messenger-RNAs sind zu vier definierten nichtzusammenhängenden Regionen auf der viralen DNA komplementär. Diese Regionen werden als (E1-E4) bezeichnet. Die frühen Transkripte wurden in eine Anordnung von unmittelbar früh (E1a), verzögert früh (E1b, E2a, E2b, E3 und E4) und intermediäre (IVa2.IX) Regionen eingeteilt.
E1a ist ein Transaktivator von mehreren Genprodukten im Adenovirus durch die Aktivierung der E1b-, E2-, E3- und E4-Promotoren. Die E1a-Region ist an der transkriptionalen Transaktivierung von viralen und zellulären Genen sowie an der transkriptionalen Repression von anderen Sequenzen beteiligt. Das E1a-Gen übt eine wichtige Kontrollfunktion auf alle anderen frühen Adenovirus-Messenger-RNAs aus. In normalen Geweben, um die Regionen E1b, E2a, E2b, E3 oder E4 wirksam zu transkribieren, ist aktives E1a- Produkt erforderlich.
Die E1b-Region ist für den normalen Ablauf der viralen Ereignisse bei einer Infektion spät erforderlich. Das E1b-Produkt wirkt im Wirtsnukleus. Mutanten, die innerhalb der E1b-Sequenzen generiert werden, zeigen eine herabgesetzte späte virale mRNA-Akkumulation sowie eine Beeinträchtigung in der Hemmung des Wirtszellentransports, der normalerweise spät bei der Adenovirusinfektion festgestellt wurde (Berkner, K.L., Biotechniques 6: 616–629 (1988)). E1b ist für die Veränderung von Funktionen der Wirtszelle verantwortlich, derart, dass der Ablauf und der Transport zugunsten von viralen späten Genprodukten verschoben werden. Diese Produkte führen dann zur viralen Verpackung und Freisetzung von Virionen. E1b erzeugt ein 19 kD Protein, das die Apoptose verhindert. E1b erzeugt auch ein 55 kD Protein, das an p53 bindet.
Für eine vollständige Übersicht über Adenoviren und ihre Replikation siehe Horwitz, M. S., Virology 2. Ausg., Fields, B.N., Hrsg., Raven Press Limited, New York (1990), Kapitel 60, Ss. 1679–1721.
Adenovirus stellt als Vektor zur angemessenen Genabgabe aus folgenden Gründen Vorteile bereit. Es ist ein unbehülltes Virus mit doppelsträngiger DNA mit Tropismus für das menschliche Atmungssystem und den Magen-Darm-Trakt. Es verursacht eine milde grippeartige Erkrankung. Adenovirale Vektoren treten über Rezeptor-vermittelte Endocytose in die Zellen ein. Das große (36 Kilobasen) Genom erlaubt die Entfernung von Genen, die für die Replikation essentiell sind, und von nicht-essentiellen Regionen, so dass Fremd-DNA inseriert und aus dem viralen Genom exprimiert werden kann. Adenoviren infizieren eine breite Vielzahl von Zelltypen in vivo und in vitro. Adenoviren wurden bereits als Vektoren zur Gentherapie und zur Expression heterologer Gene verwendet. Die Expression von viralen oder fremden Genen aus dem Adenovirusgenom erfordert keine replizierende Zelle. Adenovirusvektoren integrieren sich selten in das Wirtschromosom; das Adenovirusgenom verbleibt als extrachromosomales Element in dem Zellnukleus. Es besteht kein Zusammenhang einer menschlichen Malignität mit einer Adenovirusinfektion; es wurden abgeschwächte Stämme entwickelt und bei Menschen als Lebendimpfstoffe verwendet.
Für eine ausführliche Diskussion der Verwendung von Adenovirusvektoren in der Gentherapie, siehe Berkner, K.L., Biotechniques 6: 616–629 (1988); Trapnell, B.C., Advanced Drug Delivery Reviews 12: 185–199 (1993).
Adenovirale Vektoren werden im Allgemeinen in der E1-Region des Virus deletiert. Die E1-Region kann sodann durch die DNA-Sequenzen von Interesse ersetzt werden. Es wurde in einem neueren Artikel über die menschliche Gentherapie jedoch aufgezeigt, dass „der Hauptnachteil der Verwendung von Adenovirus als Gentransfervektor darin besteht, dass der virale Vektor im Allgemeinen episomal bleibt und nicht repliziert und somit die Zellteilung zu dem möglichen Verlust des Vektors aus den Tochterzellen führt" (Morgan, R.A., et al., Annual Review of Biochemistry 62: 191–217 (1993)) (zusätzliche Betonung).
Die Nicht-Replikation des Vektors führt nicht nur zu dem möglichen Verlust des Vektors ohne Expression in den meisten oder in allen Zielzellen, sondern auch zu einer unzureichenden Expression in den Zellen, die den Vektor aufnehmen, da die Kopien des Gens, dessen Expression erwünscht ist, für eine maximale Wirkung unzureichend sind. Die unzureichende Genexpression ist eine allgemeine Einschränkung sämtlicher nichtreplizierender Abgabevektoren. Somit ist es erwünscht, einen Vektor vorzustellen, der mehrere Kopien eines Gens und daher größere Mengen des Produkts dieses Gens bereitstellen kann. Die vorliegende Erfindung behebt die vorstehend besprochenen Nachteile durch die Bereitstellung eines Gewebe-spezifischen und insbesondere eines Tumor-spezifischen replizierenden Vektors, mehrerer DNA-Kopien und somit erhöhter Mengen an Genprodukt.
Adenovirale Vektoren zur rekombinanten Genexpression wurden bereits in der menschlichen embryonalen Nierenzelllinie 293 produziert (Graham, F.L. et al., J. Gen. Virol. 36: 59–72 (1977)). Diese Zelllinie, ursprünglich mit menschlichem Adenovirus 5 transformiert, enthält nun das linke Ende des Adenovirus 5-Genoms und exprimiert E1. Darum sind diese Zellen für das Wachstum von Adenovirus 2- und Adenovirus 5-Mutanten, denen E1-Funktionen fehlen, erlaubt. Sie wurden breit eingesetzt für die Isolierung und Propagation von E1-Mutanten. Darum wurden 293 Zellen für das Helfer unabhängige Klonieren und für die Expression von Adenovirusvektoren in Säugerzellen verwendet. E1-Gene, die in die zelluläre DNA von 293 Zellen integriert sind, werden auf Niveaus exprimiert, die die Deletion dieser Gene aus dem viralen Vektorgenom erlauben. Die Deletion stellt eine nichtessentielle Region bereit, in die die DNA inseriert werden kann. Für eine Übersicht siehe Young, C. S. H., et al. in The Adenoviruses, Ginsberg, H.S., Hrsg., Plenum Press, New York und London (1984), Ss. 125–172.
Allerdings sind 293 Zellen Gegenstand massiver Einschränkungen als Producerzellen für die Adenovirusvektoren. Die Wachstumsraten sind gering. Die Titer sind beschränkt, insbesondere wenn der Vektor ein heterologes Genprodukt produziert, das sich für die Zellen als toxisch erweist. Die Rekombination mit der viralen E1-Sequenz in dem Genom kann zur Verunreinigung des rekombinanten defekten Virus mit einem unsicheren Wildtypvirus führen. Die Qualität von bestimmten viralen Präparationen ist schlecht, hinsichtlich des Verhältnisses von Viruspartikel zu Plaque-bildender Einheit. Außerdem unterstützt die Zelllinie nicht das Wachstum von höher deletierten Mutanten, da die Expression von E1 in Kombination mit anderen viralen Genen in dem zellulären Genom (erforderlich zur Vervollständigung der weiteren Deletion), wie E4, für die Zellen toxisch ist. Darum kann die Menge an heterologer DNA, die in das virale Genom inseriert werden kann, in diesen Zellen begrenzt sein. Es ist darum erwünscht, Adenovirusvektoren für die Gentherapie in einer Zelle herzustellen, die keine Wildtyprekombinanten produzieren und hohe Titer an hochqualitativem Virus erzeugen kann.
Es ist auch erwünscht, die Replikation eines therapeutischen Vektors durch andere als durch endogene zelluläre Faktoren, die in den zu behandelnden Zellen vorhanden sind, zu kontrollieren. Ein hoher Replikationsgrad könnte für den Patienten insofern von Nachteil sein, als Vektorpartikel in den Blutstrom abgegeben werden könnten. Dies könnte toxische Nebenwirkungen in Geweben, die für das Clearing des Virus zuständig sind, wie Nieren, Leber, Lunge und Milz, aufweisen, auch wenn sich der Vektor in dem nicht-behandelten Gewebe nicht repliziert. Obgleich die derzeitigen therapeutischen Vektoren bei schwacher Exposition gegenüber normalen Zellen keine Replikation gezeigt haben, kann eine hohe Exposition, wie sie potentiell von einem hohen Replikationsgrad und von der Freisetzung des Virus an der zu behandelnden Gewebestelle verursacht wird, zudem auch die auch Replikation in normalen Zellen bewirken. Beispielsweise replizieren Adenoviren, denen E1a fehlt und die in einer ausreichend hohen Dosis verabreicht werden, in normalen Zellen.
Demnach wäre es sehr zweckmäßig in der Lage zu sein, das Replikationsniveau durch Zugabe einer Verbindung zu kontrollieren, die die Replikation dämpfen könnte, wenn die Replikation zu stark wäre.
Ein weiteres Problem in der Technik ist die Bereitstellung von mehr als einem Genprodukt, das von einer heterologen regulatorischen Sequenz, beispielsweise einem Promotor, kontrolliert wird, auf einem viralen Vektor (wie Cytokine, TK oder andere cytotoxische Gene oder Hitzeschockproteine). Somit kann in einem speziellen Medium eine bestimmte Kombination von Genen therapeutische Vorteile bieten. Es wäre demnach wünschenswert, dass mehrere Gene in einem Vektor vorliegen, die in zu behandelnden Zellen spezifisch exprimiert werden, beispielsweise in einer Tumorzelle. Eine Einschränkung besteht allerdings darin, dass nicht mehrere Kopien des selben Promotors bereitgestellt werden können, um jedes Gen anzutreiben, da Raum verbraucht werden würde und die übermäßigen Nucleotidverlängerungen vielleicht nicht einmal von dem Virus aufgenommen werden würden. Außerdem könnte während des Klonierens und während der Replikation die homologe Rekombination Deletionen zwischen identischen Promotoren hervorrufen und darum den Vektor zerstören.
WO 97/01358 offenbart Wirtszellen-spezifische adenovirale Vektoren, wobei mindestens eine essentielle Replikationsfunktion und mindestens ein Transgen unter der Kontrolle eines Zielzellen-spezifischen Respons-Elements stehen.
WO 96/34969 offenbart adenovirale Vektoren, die in bestimmten Tumorzellen Replikations-kompetent sind, in denen mindestens ein Gen, das für die virale Replikation essentiell ist, unter der Kontrolle eines Gewebe-/Tumor-spezifischen regulatorischen Elements angeordnet ist, das weiterhin ein Transgen umfassen kann, welches ebenfalls durch das Gewebe-/Tumor-spezifische regulatorische Element reguliert werden kann.
WO 96/17053 offenbart adenovirale Vektoren, wobei mindestens ein Gen, das für die virale Replikation essentiell ist, unter der Kontrolle einer heterologen Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz angeordnet ist, die weiterhin ein Transgen umfassen kann, welches unter der Kontrolle eines Promotors steht, der anders ist als ein Gewebe-/Tumor-spezifisches regulatorisches Element.
Hallenbeck et al., Cancer Gene Therapy 3: Conf. Suppl. Ss. S19–S20 (1996) offenbaren Replikations-kompetente adenovirale Vektoren zum Abtöten von hepatischen Tumorzellen, wobei das E1a-Gen unter der Kontrolle eines modifizierten alpha-Fetoproteins angeordnet ist, welches hauptsächlich in Leberzellen exprimiert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Hinsichtlich der vorstehend besprochenen Einschränkungen besteht ein allgemeines Ziel der Erfindung in der Bereitstellung neuer Expressionsvektoren für die Gewebe-spezifische Vektorreplikation und Genexpression aus dem replizierenden Vektor.
Die Erfindung stellt einen Replikations-konditionalen adenoviralen Vektor bereit, umfassend

(a) eine heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz (TRS), die mit der Kodierungssequenz eines adenoviralen für die Replikation essentiellen Gens (GER) operabel verknüpft ist, und
(b) mindestens eine zusätzliche Kodierungssequenz, die ein heterologes Genprodukt kodiert, wobei die zusätzliche kodierende Sequenz mit einer homologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz (TRS) operabel verknüpft ist, die durch das Genprodukt des für die Replikation essentiellen adenoviralen Gens transaktiviert wird.

Weitere Aspekte der Erfindung sind in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt.
Demnach wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, wobei die Expression von mehreren Genen auf dem Vektor kontrolliert und durch die Expression eines Gens koordiniert werden kann, das für die Replikation essentiell ist, sodass die Expression von jedem der mehreren Gene bei der Vektorreplikation konditional ist, wobei die Replikation von der Gewebespezifischen Expression des Genprodukts abhängt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung Gewebespezifischer Behandlung von anormalem Gewebe. Somit besteht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur selektiven Verteilung eines Vektors in vivo in einem Zielgewebe derart, dass eine größere Anzahl von Zellen den Vektor enthält als es mit einem nicht-replizierenden Vektor der Fall wäre und das Ausbreiten des Vektors in Nichtzielgewebe vermieden oder wesentlich vermindert ist.
Darum wird hier ein Verfahren zur selektiven Verteilung eines Vektors in einem Zielgewebe durch Einbringen des erfindungsgemäßen Replikationskonditionalen Vektors in ein Zielgewebe, welches die modulierbare Replikation des Vektors erlaubt, offenbart.
Zur Bereitstellung einer Gewebe-spezifischen Behandlung besteht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung in der selektiven Verteilung eines Polynucleotids in einem Zielgewebe in vivo. Demnach wird hier ein Verfahren zur selektiven Verteilung eines Polynucleotids in einem Zielgewebe in vivo durch Einbringen der Replikations-konditionalen erfindungsgemäßen Vektoren, die das Polynucleotid enthalten, in das Zielgewebe, welches die modulierbare Replikation des Vektors erlaubt, offenbart. Das Polynucleotid umfasst den gesamten Vektor oder Teile davon, wie ein oder mehrere heterologe Gene.
Zur Bereitstellung von Gewebe-spezifischer Behandlung besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der selektiven Verteilung von einem oder mehreren heterologen Genprodukten in einem Zielgewebe.
Demnach sind die Replikations-konditionalen erfindungsgemäßen Vektoren so konstruiert, dass sie eine oder mehrere heterologe DNA-Sequenzen enthalten, die ein Genprodukt kodieren, das aus dem Vektor exprimiert wird. Wenn die Vektoren in dem Zielgewebe replizieren, werden auch wirksame Mengen des gewünschten Genprodukts in dem Zielgewebe produziert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung, insbesondere wobei Gewebespezifische Behandlung beteiligt ist, besteht darin in der Lage zu sein, die Vektorreplikation zu modulieren, d. h. das Vektorreplikationsniveau zu kontrollieren. Wenn die Vektorreplikation auf Niveaus, die unerwünscht sind, und insbesondere auf Niveaus, die die Behandlung beeinträchtigen können, abläuft, besteht ein Ziel der Erfindung darin, die Replikationsniveaus um ein gewünschtes Ausmaß zu dämpfen oder herabzusetzen. Wenn die Niveaus unter die gewünschte Menge fallen, besteht ein Gegenstand der Erfindung auch darin, in der Lage zu sein, die Replikation auf wünschenswerte Niveaus um gewünschte Ausmaße ansteigen zu lassen.
Demnach ist hier ein Verfahren zur Modulierung der Vektorreplikation während der Behandlung oder anderweitig (z.B. in Producerzellen) durch Bereitstellung eines Gens, das ein Genprodukt kodiert, das die Fähigkeit aufweist, in die Vektorreplikation einzugreifen, offenbart. Wenn die Replikation unerwünscht hoch ist, kann sie mittels dieses Genprodukts vermindert werden.
Somit betrifft die Erfindung weiterhin Vektoren, die außerdem ein Gen enthalten, das ein Genprodukt codiert, das zur Modulierung der Vektorreplikation eingesetzt werden kann.
Die Modulierung der Replikation moduliert auch die Expression von heterologen Genen, die in dem Vektor enthalten sind. Somit kann die Expression solcher Gene unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Vektoren ausgelöst, herabgesetzt, erhöht oder beseitigt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung anormalen Gewebes, das dann durch die erfindungsgemäßen Vektoren behandelt werden kann. Darum besteht ein weiterer Gegenstand der Erfindung in der Identifizierung eines Gewebes, in dem die Replikations-konditionalen erfindungsgemäßen Vektoren mittels der heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz, die auf dem Vektor enthalten ist, repliziert werden können, sodass das Gewebe anschließend mit dem Vektor behandelt wird, und in welchem Gewebe die Replikation moduliert werden kann. Demnach ist hier auch ein Verfahren offenbart, wobei die erfindungsgemäßen Replikations-konditionalen Vektoren gegenüber einem gegebenen anormalen Gewebe exponiert werden. Wenn das Gewebe die Replikation und Modulierung erlaubt, tritt die Replikation des Vektors ein und kann nachgewiesen werden. Nach der Identifikation eines solchen Gewebes kann die zielgerichtete Behandlung dieses Gewebes durch Gewebe-spezifische Transkription und die folgliche Vektorreplikation in diesem Gewebe in vivo durchgeführt werden.
Somit wird hier ein Verfahren zum Testen der Vektorbrauchbarkeit für die Gewebebehandlung offenbart, umfassend die Schritte der Entnahme einer Gewebebiopsie aus einem Patienten, Explantieren der Biopsie in Gewebekultur, Einbringen eines Replikations-konditionalen Vektors in die Zellen der Biopsie und Testen auf die modulierbare Vektor-Replikation in den Zellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Producerzelllinien für die Vektorproduktion. Vorzugsweise besitzen die Zelllinien eine oder mehrere der folgenden Merkmale: hohe Virustiterproduktion, Resistenz gegenüber toxischen Wirkungen aufgrund heterologer Genprodukte, die in dem Vektor exprimiert werden, fehlende Produktion des Wildtypvirus, der die Viruspräparation verunreinigt und aus der Rekombination zwischen integrierten viralen Sequenzen und Vektorsequenzen herrührt, Wachstum bis zu hoher Dichte und in Suspension, uneingeschränktes Durchgangspotential, hohe Wachstumsrate und Wachsenlassen von hoch deletierten Viren, die bezüglich viraler Funktionen beeinträchtigt und in der Lage sind, große Stücke von heterologer DNA aufzunehmen.
Demnach werden bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung Zelllinien bereitgestellt, die den erfindungsgemäßen Replikationskonditionalen Vektor enthalten, wovon die Zellen die modulierbare Replikation des Vektors erlauben, oder dem ein Transkriptions-hemmender Faktor (Transkriptions-hemmende Faktoren) fehlt, der (die) die Replikation des Vektors verhindert (verhindern).
Bei weiteren Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Zelllinien Nucleinsäurekopien des replizierten Vektors. Bei anderen Ausführungs formen enthalten die Zelllinien Virionen, die in der Zelle durch Replikation in der Zelle des Replikations-konditionalen Vektors produziert werden.
Bei weiteren Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Produktion eines Replikations-konditionalen Vektors oder Virions bereitgestellt, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Producerzelllinie, vorstehend beschrieben, und Gewinnen des Vektors oder Virions aus den Zellen.
Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Produktion von Replikationskonditionalen Virionen, die frei sind von Wildtypvironen, oder von viralen Vektoren, die frei sind von Wildtypvektoren, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Producerzelllinie, vorstehend beschrieben, und des Gewinnens der Replikations-defizienten Virionen oder Vektoren aus der Zelle.
Bei bevorzugten Verfahren zur Behandlung und Diagnose proliferiert das Gewebe anormal und ist insbesondere Tumorgewebe. Allerdings sind die Verfahren auch für anderes anormales Gewebe, wie hier beschrieben, relevant.
Der erfindungsgemäße Replikations-konditionale Vektor ist ein DNA-Tumorvirusvektor, insbesondere ein Adenovirusvektor.
Selbstverständlich ist aber potentiell jede beliebige Vektorquelle geeignet, wenn sie ein Gen enthält, das zur Replikation essentiell ist und das operabel mit einer Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verknüpft werden kann.
Bei weiteren Verfahren zur Behandlung und Diagnose wird der Vektor durch Infektion in die Zelle oder das Gewebe eingeführt.
Die Replikation kann eine Vektornucleinsäurereplikation allein sein oder kann auch die Virusreplikation (d. h. Virionproduktion) umfassen. Somit kann entweder DNA oder Virionen oder beides in dem Zielgewebe verteilt sein.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein Gen in der Adenovirus-E1-Region operabel mit der Gewebe-spezifischen heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verknüpft. Vorzugsweise ist das E1a-, E1b- oder E2a-Gen operabel mit der Gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verknüpft.
Der Vektor kodiert eine oder mehrere heterologe Genprodukte. Diese heterologen Genprodukte werden aus dem Vektor, der in das Zielgewebe repliziert, exprimiert. Das heterologe Genprodukt kann mit seinem eigenen Promotor operabel verknüpft sein oder kann mit einer transkriptionalen regulatorischen Sequenz aus einem anderen Gen operabel verknüpft sein. Ohne Rücksicht darauf kann die Expression des heterologen Genprodukts durch E1a oder einen anderen Transaktivator kontrolliert werden, welcher wiederum durch den gewünschten Tumor-spezifischen Promotor reguliert wird.
Die Expression von einem oder mehreren heterologen Genprodukten hängt von der Expression des für die Replikation essentiellen Gens ab, welches wiederum mit der Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz operabel verknüpft ist. Wenn demnach das für die Replikation essentielle Gen exprimiert wird, verursacht es die Expression von einem oder mehreren heterologen Genprodukten durch Transaktivierung. In dieser Konfiguration wird ein solches heterologes Gen nur aktiviert/induziert, wenn der Vektor repliziert. Der Grund hierfür besteht darin, dass die Aktivierung der Gewebe-spezifischen regulatorischen Sequenz die Expression des Genprodukts, das für die Replikation essentiell ist, verursacht, welches anschließend sowohl die Replikation als auch die Aktivierung der Expression des einen oder der mehreren heterologen Gene durch seine Transaktivierungsfunktion bewirkt. Demnach wird nicht nur die Expression des heterologen Gens aktiviert, sondern die Expression wird auch amplifiziert, da, wenn der Vektor repliziert, jede zusätzliche Kopie des Vektors auch eine Kopie des heterologen Gens enthält.
Bei einer sehr bevorzugten Ausführungsform kontrolliert das E1a-Gen, das operabel mit einer heterologen Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verknüpft ist, die Expression von einem oder mehreren heterologen Genen unter der Kontrolle von Promotoren, die durch das E1a-Genprodukt transaktiviert werden. Wenn somit das E1a-Gen exprimiert, erfolgt eine virale Replikation, und es tritt auch die Genexpression von einem oder mehreren heterologen Genen ein. Somit wird die Expression dieser Gene auf dem Replikations- und Transaktivierungsniveau so kontrolliert, dass eine Expressions-amplifizierende Wirkung erhalten wird.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist ein oder mehrere der heterologen Gene operabel mit einer Gewebe-spezifischen regulatorischen Sequenz, wie die gleiche transkriptionale regulatorische Sequenz, mit der das für die Replikation essentielle Gen operabel verknüpft ist, verknüpft. Demnach werden dann das eine oder die mehreren heterologen Gene nur in einem spezifischen Gewebe aktiviert. Wenn die Gewebe-spezifischen transkriptionale regulatorische Sequenz die gleiche ist wie diejenige, mit der das für die Replikation essentielle Gen operabel verknüpft ist, erfolgt die Aktivierung des einen oder der mehreren heterologen Gene nur, wenn der Vektor repliziert. Demnach wird, wie vorstehend, das eine oder die mehreren heterologen Gene sowohl aktiviert als auch amplifiziert.
Bei weiteren Ausführungsformen wird das eine oder die mehreren heterologen Gene amplifiziert, wenn der Vektor repliziert, wird allerdings nicht notwendigerweise aktiviert. Dies ist der Fall, wenn diese Gene unter der Kontrolle ihres eigenen oder anderer konstitutiver Promotoren stehen. In diesem Fall ist immer ein basales Expressionsniveau vorhanden, wenn der Vektor allerdings repliziert, wird diese Expression aufgrund der Expression aus jeder neuen Kopie des Vektors amplifiziert.
Im Zusammenhang mit der koordinativen Kontrolle (ein oder mehrere heterologe Gene unter der Kontrolle der gleichen transkriptionalen regulatorischen Sequenz) trifft das gleiche Szenario von Aktivierung und Amplifikation, wie vorstehend besprochen, zu.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird der Vektor nicht zur selektiven Zerstörung eines Zell- oder Gewebetyps, wie eines Tumors, verwendet, sondern wird zur Bereitstellung eines Genprodukts oder von Genprodukten auf spezifischen Niveaus, die physiologisch erwünscht sind, verwendet. Ein Beispiel für ein solches Genprodukt ist Insulin. Somit wird die Anwendung der Replikation zur Kontrolle der Genexpression, um eine sehr spezifische Menge der Genexpression zu erreichen, erfindungsgemäß bereitgestellt. Demnach kodiert der Vektor ein Genprodukt, welches das Ausmaß der Virusreplikation und daher die Genexpression von anderen Genprodukten reguliert, deren Mengen kontrolliert werden müssen. Ein Beispiel für ein solches Produkt ist eines, das die DNA-Polymerase oder die Nucleotidsynthese hemmen würde. Demnach reguliert ein Überschuss dieses Produkts die Vektorreplikation nach unten. Es sind auch Genprodukte mit eingeschlossen, die das Vektorreplikationsniveau erhöhen, wenn nicht genügend Genprodukt produziert wird.
Somit ist (sind) erfindungsgemäß ein oder mehrere der heterologen Genprodukte zur Modulierung der viralen Replikation geeignet. Es kann die virale Replikation direkt oder indirekt kontrollieren, wie beispielsweise im Falle der Thymidinkinase, wobei die virale Replikation negativ beeinflusst und durch die Zugabe von Ganciclovir moduliert wird.
Bezüglich der Modulierung der Genexpression stellt der Vektor die Modulierung der Expression von heterologen Genen in jeder beliebigen der vorstehend beschriebenen Konfigurationen durch Modulierung der Replikation des Vektors bereit. Dies erfolgt vorzugsweise über Thymidinkinase oder ein Genprodukt, das funktioniert wie die Thymidinkinase.
Bei einer sehr bevorzugten Ausführungsform ist die Thymidinkinasekodierende Region operabel mit dem E3-Promotor in einem adenoviralen Vektor verknüpft. Die E1a-kodierende Region steht unter der Kontrolle eines heterologen Gewebe-spezifischen Promotors. Wenn demnach der Gewebespezifische Promotor aktiviert wird, wird das E1a-Genprodukt produziert. Dieses Genprodukt transaktiviert dann den E3-Promotor, sodass das TK-Gen exprimiert wird. Da außerdem das E1a-Gen die virale Replikation aktiviert und das E3-Gen für die Replikation nicht essentiell ist, sind mehr Kopien des viralen Vektors vorhanden, um eine größere Expression des TK-Gens zu ermöglichen. Anschließend kann Ganciclovir zur Modulierung der Vektorreplikation zugesetzt werden. Wenn die Replikation nach Zugabe von Ganciclovir unter das gewünschte Niveau absinkt, kann die Menge an Ganciclovir vermindert werden, um eine Zunahme der Vektor-Replikation zu ermöglichen usw., sodass gewünschte Niveaus innerhalb jedes bestimmten Zeitrahmens erlaubt sind. Ein Beispiel für die erwünschte Modulierung besteht in der Verminderung der Vektor-Replikation in einer Nichtzielzelle.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein heterologes Genprodukt für das Zielgewebe toxisch.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wirkt das toxische heterologe Genprodukt auf ein nicht-toxisches Prodrug und wandelt das nicht-toxische Prodrug in eine Form um, die für das Zielgewebe toxisch ist. Vorzugsweise besitzt das Toxin Antitumoraktivität oder schaltet die Zellproliferation aus.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die transkriptionale regulatorische Sequenz ein Promotor. Bevorzugte Promotoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, CEA, DF3, α-Fetoprotein, Erb-B2, Tensid und insbesondere ein Lungentensid, ein Tyrosinase-Promotor und Endothelspezifische Promotoren. Allerdings kann jede genetische Kontrollregion, die die Transkription des essentiellen Gens kontrolliert, zur Aktivierung (oder zur Derepression) des Gens verwendet werden. Somit können weitere genetische Kontrollelemente, wie Enhancer, repressionsfähige Sequenzen und Silencer, zur Regulierung der Replikation des Vektors in der Zielzelle verwendet werden. Die einzige Anforderung besteht darin, dass das genetische Element aktiviert, derepressiert, verstärkt oder anderweitig genetisch durch Faktoren in der Wirtszelle und hinsichtlich der Behandlungsverfahren nicht in der Nichtzielzelle reguliert wird.
Bevorzugte Enhancer umfassen den DF3-Brustkrebs-spezifischen Enhancer und Enhancer aus Viren und aus der Steroidrezeptorfamilie. Weitere bevorzugte transkriptionale regulatorische Sequenzen umfassen NF1, SP1, AP1 und FOS/JUN.
Bei weiteren Ausführungsformen werden die Promotoren nicht notwendigerweise durch Faktoren in dem Zielgewebe aktiviert, sondern werden durch in dem Zielgewebe vorhandene Faktoren derepressiert. Somit wird in dem Zielgewebe die Unterdrückung aufgehoben.
Die transkriptionalen regulatorischen Faktoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, transaktivierende Faktoren, die durch endogene virale Sequenzen, wie von CMV, HIV, EBV, HSV, SV40 und von anderen solchen Viren, die in Säugern und insbesondere in Menschen pathogen sind, produziert werden.
Die Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren sind dem Fachmann gut bekannt. Die Technik lehrt in angemessener Weise die Konstruktion von rekombinanten Vektoren mit Deletionen oder Modifikationen in speziellen kodierenden Sequenzen und operabler Verknüpfung mit einer heterologen Transkriptionskontrollsequenz, derart, dass die Expression einer gewünschten kodierenden Region unter der Kontrolle der heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz steht. Viele virale Sequenzen wurden bereits angemessen kartiert, sodass es Routine ist, ein Gen der Wahl zu benennen und entsprechende gut bekannte Techniken (wie homologe Rekombination des Virus mit deletierten oder anderweitig modifizierten Plasmiden oder Ligation der beiden) anzuwenden, um die Vektoren für die Gewebe-spezifische Replikation und Expression zu konstruieren.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 A. Klonierung von pAVE1a02i.
1B. Diagramm von pAF(AB)2(S)6CAT. Die Karte zeigt die Enhancerregionen (AB) in entgegengesetzter Orientierung.
1C. Diagramm von pAvE1a04i, wie aus einer Plasmidkarte vorhergesagt, und die Sequenzinformation, die pAF(AB)2(S)6CAT beschreibt, und von pAvE1a06i, wie durch Restriktionsverdau-Mapping und Sequenzierung als korrekte Struktur bestimmt.
2A. Diagramm des Clal-Verdaus von Av1LacZ.
2B. Diagram der Kotransfektion von 293 Zellen mit pAvE1a06i und Av1LacZClal-Verdau (30.884 bp), um AvE1a06i zu produzieren.
2C. Amplifikation des AvE1a06i-Virus auf S8-Zellen, wobei ein direkter Enhancer (AB) aus dem Promotor deletiert wurde. Das neue Konstrukt wird als AvE1a04i bezeichnet.
3A. Klonieren des Plasmids pREpacTK.
3B. Klonieren des Plasmids pREpacTKm.
3C. Konstruktion von AV5E1aTK01i.
4A. Verdau von Av1E1a04i.
4B. Verdau von Av5E1aTK01i.
4C. Konstruktion von Av15E1aTK04i unter Verwendung der Verdauprodukte der 4A und 4B.
5. Cytopathische Wirkung von Av15E1aTK04i.
6. GCV-Hemmung der Av5E1aTk01i-Repliation in vitro. A549 Zellen wurden entweder mit AddI327 oder AddI327Tk0Ii transduziert. Die Zellen wurden anschließend mit 10 µm GCV 5 Tage lang behandelt. Nach fünftägiger Inkubation wurden die Zellen geerntet, in HBSS gewaschen und anschließend zur Herstellung eines Virus-Rohlysats tiefgefroren/aufgetaut. Anschließend wurden die Titer durch Standard-TCID50-Tests mit 293 Zellen durchgeführt, um den Virus-Titer zu bestimmen. Das Experiment wurde dreimal wiederholt. Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl GCV keine Wirkung auf ein Adenovirus, das nicht das HSV-TK-Gen trug, besaß, es einen um mehr als 4 Größenordnungen größeren Abfall im Titer eines Vektors, der das HSV-TK-Gen trägt, verursachte.
7. Diagramm möglicher Konfigurationen von heterologen Genen in Expressionsvektoren.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Der Begriff "anormal proliferierend" soll eine Zelle mit einem höheren mitiotischen Index als ihr normal funktionierendes Gegenstück bezeichnen, derart, dass eine anormale Akkumulation von solchen Zellen vorliegt.
Der Begriff "Antitumoraktivität" soll jede Aktivität bezeichnen, die das Wachstum eines Tumors hemmt, verhindert oder zerstört.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "cytotoxisches Gen" auf ein Gen, das ein Protein kodiert, welches entweder allein oder in Kombination mit anderen Mitteln für die Zelllebensfähigkeit letal ist. Beispiele für cytotoxische Gene, die allein letal sind, umfassen Toxine, wie das Pertussistoxin, Diphtherietoxin und dergleichen.
Beispiele für cytotoxische Gene, die in Kombination mit anderen Mitteln verwendet werden, um Zellletalität zu erreichen, umfassen beispielsweise Herpes Simplex-1-Thymidinkinase und Cytosindeaminase. Anschließend wird dem Individuum eine wirksame Menge eines therapeutischen Mittels verabreicht, das in Gegenwart des cytotoxischen Gens für die Zelle toxisch ist. Im Spezialfall der Thymidinkinase ist das therapeutische Mittel ein Thymidinkinasesubstrat, wie Ganciclovir (GCV), 6-Methoxypurinarabinonucleosid (araM) oder ein funktionelles Äquivalent davon. Sowohl das Thymidinkinase-Gen als auch der Thymidinkinasemetabolismus müssen gleichzeitig verwendet werden, um für die Wirtszelle toxisch zu sein. Allerdings wird in seiner Gegenwart GCV phosphoryliert und wird zu einem potenten Inhibitor der DNA-Synthese, wohingegen araM in den cytotoxischen Anaboliten araATP übergeführt wird. Andere Gene können ebenso in Kombination mit dem entsprechenden therapeutischen Mittel verwendet werden. Solche Kombinationen aus einem anderen Gen und therapeutischem Mittel sind dem Fachmann bekannt. Ein weiteres Beispiel wäre der erfindungsgemäße Vektor, der das Enzym Cytosindeaminase exprimiert. Ein solcher Vektor würde in Verbindung mit der Verabreichung des Arzneimittels 5-Fluoruracil (Austin und Huber, 1993) verwendet werden, oder das unlängst beschriebene E. coli DeoΔ-Gen würde in Kombination mit 6-Methyl-purin-2'deosribonucleosid verwendet werden (Sorscher et al., 1994).
Der Begriff "verteilen" soll das Ausbreiten eines Vektors und seines dazugehörigen heterologen Gens (Produkt) (wenn auf dem Vektor vorhanden) überall in einem Zielgewebe und insbesondere überall in anormal proliferierendem Gewebe (nicht-bösartig oder bösartig) bedeuten. Das Ziel der Verteilung besteht darin, den Vektor, das Genprodukt oder die Wirkungen des Genprodukts zu verteilen (wie beispielsweise durch einen bystander Effekt) an im Wesentlichen alle oder an eine nennenswerte Anzahl von Zellen des Zielgewebes, sodass im Wesentlichen das gesamte Zielgewebe behandelt wird.
Der Begriff "Enhancer" wird demnach in seiner technisch anerkannten Bedeutung verwendet. Er soll eine Sequenz bezeichnen, die in Eukaryoten und bestimmten eukaryotischen Viren vorkommt, die die Transkription von einem Gen verstärken können, wenn sie (in einer von beiden Orientierungen) bis zu mehreren Kilobasen von dem Gen, das untersucht wird, angeordnet sind. Diese Sequenzen wirken in der Regel als Enhancer, wenn sie sich auf der 5'-Seite (stromaufwärts) des in Frage kommenden Gens befinden. Allerdings sind einige Enhancer aktiv, wenn sie auf der 3'-Seite (stromabwärts) des Gens angeordnet sind. In einigen Fällen können Enhancerelemente die Transkription aus einem Gen ohne (bekannten) Promotor aktivieren.
Der Begriff "funktionelle Inaktivierung" soll eine genetische Läsion bezeichnen, die die normale Aktivität eines Genprodukts verhindert. Somit könnte eine funktionelle Inaktivierung von einer Mutation in dem Gen, das das Genprodukt kodiert, herrühren. Eine solche Läsion umfasst Insertionen, Deletionen und Baseveränderungen. Alternativ kann die funktionelle Inaktivierung durch die anormale Wechselwirkung des normalen Genprodukts mit einem oder mehreren anderen zellulären Genprodukten, die an das Genprodukt binden oder die funktionelle Aktivität des Genprodukts anderweitig verhindern, auftreten. Somit kann das Genprodukt ein Protein sein, das von einem normalen Gen produziert worden ist, das jedoch nicht seine gewöhnliche und normale Funktion aufgrund einer Wechselwirkung mit einem zweiten Faktor ausüben kann.
Der Begriff "Gen, das für die Replikation essentiell ist" bezieht sich auf eine genetische Sequenz, deren Transkription für den Vektor zur Replikation in der Zielzelle erforderlich ist.
Der Begriff "Genprodukt" soll DNA, RNA, Protein, Peptide oder virale Partikel bedeuten. Somit ist es, für die Zwecke der Erfindung, auf eines dieser Komponenten verteilt.
Der Begriff "heterolog" bedeutet eine DNA-Sequenz, die nicht in dem nativen Vektorgenom vorkommt. Wenn der Vektor beispielsweise auf dem Adenovirusgenom beruht, sind somit die heterologen DNA-Sequenzen diejenigen, die nicht in dem nativen Adenovirusgenom festgestellt werden. Bezüglich einer "heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz" bezeichnet "heterolog", dass die transkriptionale regulatorische Sequenz nicht natürlicherweise mit der DNA-Sequenz, des Gens ligiert ist, die für die Replikation des Vektors essentiell ist.
Der Begriff "Promotor" wird nach seiner technisch anerkannten Bedeutung verwendet. Er soll die DNA-Region bezeichnen, in der Regel stromaufwärts von der kodierenden Sequenz eines Gens oder Operons, welche RNA-Polymerase bindet und das Enzym an die korrekte Transkriptionsstartstelle lenkt.
Der Begriff "Replikation" bedeutet Duplikation eines Vektors. Diese Duplikation kann im Falle von Viren auf dem Niveau von Nucleinsäure oder auf dem Niveau von infektiösen viralen Partikeln erfolgen. Im Falle von DNA-Viren ist die Replikation auf Nucleinsäureniveau eine DNA-Replikation. Im Falle von RNA-Viren ist die Nucleinsäurereplikation eine Replikation zu Plus oder Minus eines Stranges (oder beides). Im Falle von Retroviren umfasst die Replikation auf Nucleinsäureniveau die Produktion von cDNA sowie die weitere Produktion von RNA-Virusgenomen. Das essentielle Merkmal sind Nucleinsäurekopien des ursprünglichen viralen Vektors. Replikation umfasst allerdings auch die Bildung von infektiösen DNA- oder RNA-Viruspartikeln. Solche Partikel können erfolgreich Zellen in einem gegebenen Zielgewebe infizieren und somit den Vektor überall oder an nennenswerten Teilen des Zielgewebes verteilen.
Der Begriff "Replikations-konditionaler Vektor" bezieht sich auf einen Vektor, der beim Einbringen in ein Gewebe nicht repliziert, es sei denn eine transkriptionale regulatorische Sequenz in diesem Vektor wird aktiviert oder in diesem Gewebe derepressiert. D. h. die Replikation hängt von der Transkription mittels dieser transkriptionalen regulatorischen Sequenz ab. Ein solcher Vektor ist, wie beschrieben, Replikations-konditional, da er auf folgende Weise modifiziert worden ist. Ein Gen, das für die Replikation essentiell ist, wurde durch Ersatz der transkriptionalen regulatorischen Sequenz, von der die Transkription dieses Gens normalerweise abhängt, mit einer heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz modifiziert. Diese transkriptionale regulatorische Sequenz hängt von der Gegenwart von transkriptionalen regulatorischen Faktoren oder von der Abwesenheit von transkriptionalen regulatorischen Inhibitoren ab. Die Gegenwart dieser Faktoren in einem gegebenen Gewebe oder die Abwesenheit solcher Inhibitoren in einem gegebenen Gewebe stellt die Replikations-Konditionalität bereit. Demnach kann die native transkriptionale regulatorische Sequenz mit der heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz ersetzt werden. Alternativ kann die native transkriptionale regulatorische Sequenz durch teilweise Entfernung (Deletion) oder eine andere Mutation (eine oder mehrere Basenänderungen, -insertionen, -inversionen, etc.) beeinträchtigt oder disfunktionell gemacht werden.
Die Gensequenz kann eine kodierende Sequenz sein. Sie kann ein oder mehrere offene Leserahmen sowie Intronsequenzen enthalten. Allerdings ist eine solche Sequenz nicht auf eine kodierende Sequenz beschränkt, sondern umfasst Sequenzen, die zu RNA transkribiert werden, wobei die RNA selbst für die Vektorreplikation essentiell ist. Das essentielle Merkmal besteht darin, dass die Transkription der Gensequenzen nicht von den nativen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen abhängt.
Der Begriff "Silencer", der in seiner technisch anerkannten Bedeutung verwendet wird, bedeutet eine in eukaryotischen Viren und Eukaryoten vorkommende Sequenz, die die Transkription eines Gens herabsetzen oder zum Erliegen bringen kann, wenn sie innerhalb mehrerer Kilobasen von diesem Gen angeordnet ist.
Der Begriff "Gewebe-spezifisch" soll bedeuten, dass die transkriptionale regulatorische Sequenz, mit der das für die Replikation essentielle Gen operabel verknüpft ist, spezifisch in diesem Gewebe funktioniert, sodass die Replikation in diesem Gewebe abläuft. Dies kann durch die Gegenwart in diesem Gewebe und die Abwesenheit in Nichtzielgeweben von positiven Transkriptionsfaktoren, die die transkriptionale regulatorische Sequenz aktivieren, erfolgen. Sie kann auch durch die Abwesenheit von Transkriptionshemmfaktoren erfolgen, die normalerweise in Nichtzielgeweben auftreten und die Transkription als Ergebnis der Transkriptions-regulatorischen Sequenz verhindern. Wenn also die Transkription erfolgt, läuft sie in dem Gen ab, das für die Replikation essentiell ist, derart, dass in diesem Zielgewebe die Replikation des Vektors und seiner beigefügten Funktionen auftritt.
Wie hier beschrieben, ist die Gewebespezifität besonders bei der Behandlung des anormalen Gegenstücks eines normalen Gewebes relevant. Solche Gegenstücke umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Lebergewebe und Leberkrebs, Brustgewebe und Brustkrebs, Melanom und normales Hautgewebe. Gewebespezifität umfasst auch die Gegenwart eines anormalen Gewebetyps, vermischt mit normalem Gewebe eines unterschiedlichen Gewebetyps, wie beispielsweise im Falle von Metastasen von Darmkrebs, Brustkrebs und dergleichen, in einem Gewebe, wie Leber. In diesem Fall ist das Zielgewebe das anormale Gewebe und die Gewebespezifität spiegelt die Restriktion der Vektorreplikation auf das anormale Gewebe zwischen dem normalen Gewebe wider. Es ist selbstverständlich, dass Gewebespezifität im Zusammenhang der Behandlung in vivo besonders relevant ist. Wie hier beschrieben, fallen allerdings auch die ex vivo Behandlung und der Gewebeersatz in das Konzept erfindungsgemäßer Gewebespezifität.
Der Begriff "transkriptionale regulatorische Funktion" oder "transkriptionaler regulatorischer Faktor" soll jede Zellfunktion bedeuten, deren Gegenwart die heterologe transkriptionale hier beschriebene regulatorische Sequenz aktiviert oder reprimiert oder deren Abwesenheit die Transkription als Ergebnis der hier beschriebenen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen ermöglicht. Es ist selbstverständlich, dass dies in dem gegebenen Zielgewebe ein Gewebe, dem "der transkriptionale regulatorische Faktor fehlt" oder das bezüglich des transkriptionalen regulatorischen Faktors "defizient" ist, entweder auf der Abwesenheit des Faktors oder der funktionellen Inaktivierung des Faktors in dem Zielgewebe beruht.
Der Begriff "transkriptionale regulatorische Sequenz" wird nach seiner in der Technik anerkannten Bedeutung verwendet. Er soll jede DNA-Sequenz bezeichnen, die aufgrund ihrer Sequenz dazu führt, dass das verknüpfte Gen in einer bestimmten Zelle entweder auf- oder abreguliert ist. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die native transkriptionale regulatorische Sequenz vollständig aus dem Vektor deletiert und durch eine heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz ersetzt. Die transkriptionale regulatorische Sequenz kann neben der kodierenden Region für das Gen, die für die Replikation essentiell ist, liegen oder kann von ihr beabstandet sein. Demnach liegt im Falle eines Promotors der Promotor im Allgemeinen unmittelbar neben der kodierenden Region. Im Falle eines Enhancers kann ein Enhancer allerdings in einigem Abstand von der kodierenden Region festgestellt werden, derart, dass eine zwischen dem Enhancer und der kodierenden Region dazwischenliegende DNA-Sequenz vorhanden ist. In einigen Fällen verbleibt die native transkriptionale regulatorische Sequenz auf dem Vektor, allerdings ist sie bezüglich der Transkription des für die Replikation essentiellen Gens nicht funktionell.
In einem Vektor können verschiedene Kombinationen von transkriptionalen regulatorischen Sequenzen eingeschlossen sein. Eine oder mehrere können heterolog sein. Außerdem kann eine oder mehrere eine Gewebespezifität aufweisen. Beispielsweise könnte eine einzige transkriptionale regulatorische Sequenz zum Anzeigen der Replikation durch mehr als ein für die Replikation essentielles Gen verwendet werden. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn das Genprodukt von einem der Gene die Transkription des weiteren Gens (Gene) antreibt. Ein Beispiel ist ein heterologer Promotor, der mit einer Kassette verknüpft ist, die eine E1a-kodierende Sequenz (E1a-Promotor) deletiert und das gesamte E1b-Gen enthält. In einer solchen Kaskade kann nur eine heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz notwendig sein. Somit kann eine einzige transkriptionale regulatorische Sequenz die Transkription des (der) weiteren Gens (Gene) als eine mRNA antreiben, da die Gene durch eine "internal ribosome entry site" (IRES) verknüpft sind. Wenn Gene individuell (getrennt) kontrolliert werden, kann allerdings mehr als eine transkriptionale regulatorische Sequenz verwendet werden, wenn mehr als ein solches Gen zur Kontrolle der Replikation erwünscht ist.
Die erfindungsgemäßen Vektoren umfassen darum auch transkriptionale regulatorische Sequenzkombinationen, wobei mehr als eine heterologe transkriptionale regulatorische Sequenz vorhanden ist, wobei allerdings eine oder mehrere von diesen nicht Gewebe-spezifisch sind. Beispielsweise kann eine transkriptionale regulatorische Sequenz eine konstitutive transkriptionale regulatorische Sequenz auf basalem Niveau sein. Beispielsweise kann ein Gewebe-spezifischer Enhancer mit einem konstitutiven Promotor auf basalem Niveau kombiniert werden.
Der Begriff "Gewebe-spezifische Gen-regulatorische Region" oder "Gewebespezifische regulatorische Region" oder "Gewebe-spezifischer Promotor" oder "Gewebe-spezifischer Promotor/Enhancer" bezieht sich auf die Transkriptions- und/oder Translations-regulatorischen Regionen, die selektiv oder präferentiell in einem speziellen Zelltyp funktionieren. Eine selektive oder präferentielle Funktion verleiht der Gentherapiebehandlung Spezifität, da das therapeutische Gen hauptsächlich in einem gezielten oder spezifischen Zelltyp exprimiert wird. Spezifische regulatorische Regionen umfassen transkriptionale Signale, mRNA-Maturationssignale und translationale regulatorische Regionen, die Zelltyp-spezifisch sind. Die transkriptionalen regulatorischen Regionen für Tumoren umfassen beispielsweise Promotoren, Enhancer, Silencer oder künstliche Kontrollelemente, die dem Vektor hinzugefügt sind. Beispiele sind Steroidhormonrezeptor und/oder Responseelemente, die von Steroidhormonen kontrolliert werden. Spezielle Beispiele für solche transkriptionalen regulatorischen Regionen für Tumore umfassen die Promotor-/Enhancerelemente für alpha-Fetoprotein, das karzinoembryonale Antigen und das Prostata-spezifisches Antigen. RNA-Processing-Signale umfassen beispielsweise Gewebe-spezifische Intron-Splice-Signale, wohingegen translationale und regulatorische Signale beispielsweise mRNA-Stabilitätssignale und Translationsstartsignale einschließen können. Somit umfassen spezielle regulatorische Regionen sämtliche Elemente, die für die Produktion eines reifen Genprodukts in einem spezifischen Zelltyp essentiell sind.
Die Erfindung betrifft insbesondere neoplastische Zellen. Der neoplastische Phänotyp ist durch eine geänderte Morphologie, schnellere Wachstumsgeschwindigkeiten, höhere Sättigungsdichte, Wachstum in weichem Agar und Tumorigenizität gekennzeichnet. Die therapeutischen hier beschriebenen Gene kodieren Proteine, die diese Aktivität zeigen. "Tumorigenizität" soll das Verfügen über die Fähigkeit zur Bildung von Tumoren oder das in der Lage sein, die Tumorbildung herbeizuführen bedeuten und ist synonym zu neoplastischem Wachstum. "Malignität" soll eine tumorigene Zelle mit der Fähigkeit zur Metastasierung und der Gefahr für das Leben des Wirtsorganismus beschreiben. "Hyperproliferativer Phänotyp" soll ein Zellwachstum und ein Teilen mit einer Geschwindigkeit über die normalen Grenzen des Wachstums hinaus für diesen Zelltyp beschreiben. "Neoplastisch" soll auch Zellen einschließen, denen das endogene funktionelle Tumorsuppressorprotein oder die Fähigkeit der Zelle zur Exprimierung von endogener Nucleinsäure, die ein funktionelles Tumorsuppressorgen kodiert, fehlt.
Die Erfindung kann Tumor-spezifische Replikations-kompetente Vektoren bereitstellen, wobei die Gene regulatorischen Regionen einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf alpha-Fetoprotein-Promotor/-Enhancer, den karzinoembryonalen Antigen-Promotor/-Enhancer, den Tyrosinase-Promotor/-Enhancer und den Prostata-spezifischen Antigen-Promotor/-Enhancer. Es ist selbstverständlich, dass jede regulatorische oder Tumorspezifische Sequenz eingesetzt werden kann. Für andere Krankheiten, wie entzündliche Zustände, könnte der Inducer TNF-α und das ansprechende regulatorische Element der Interleukin-6-(IL-6)-Promotor sein. Das therapeutische Gen kann Interleukin-10 (IL-10) oder ein anderes entzündungshemmendes Cytokin kodieren.
Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Vektoren können in speziellen Tumorzellen spezifisch replizieren. Die Tumorspezifiät ergibt sich aus dem Einbringen von Tumor-spezifischen Gen-regulatorischen Regionen, die die Expression von einem oder mehreren für die Replikation essentiellen Genen antreiben. Solche Elemente umfassen beispielsweise den alpha-Fetoprotein-Promotor/-Enhancer, den karzinoembryonalen Antigen-Promotor/-Enhancer, den Tyrosin-Promotor/-Enhancer und den Prostata-spezifischen Antigen-Promotor/-Enhancer. Jede dieser Gen-regulatorischen Regionen funktioniert präferentiell in speziellen Tumorzelltypen. Beispielsweise funktioniert der alpha-Fetoprotein-Promotor/-Enhancer präferentiell in hepatozellulären Karzinomtumorzellen. Der karzinoembryonale Antigen-Promotor/Enhancer funktioniert präferentiell in Darmkrebs- und Brustkrebstumorzellen. Der Prostata-spezifische Antigen-Promotor/Enhancer funktioniert in Prostatatumorzellen. Der Tyrosin-Promotor/Enhancer funktioniert präferentiell in Melanomtumorzellen. Somit stellt die Erfindung die Behandlung von Krebserkrankungen, einschließlich beispielsweise Brustkrebs, Kolorektalkrebs, Leberzellenkarzinom und Melanomkrebs, bereit.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, ein oder mehrere heterologe Gene zu modulieren und Gewebespezifisch zu exprimieren, wobei eine erste kodierende Sequenz, die sich von einem für die Vektorreplikation essentiellen Gen ableitet, operabel mit einer Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verknüpft ist und wobei der Vektor eine oder mehrere zusätzliche heterologe kodierende Sequenzen enthält.
Die erste kodierende Sequenz für ein Genprodukt, das für die Replikation und die Gewebe-spezifische transkriptionale regulatorische Sequenz essentiell ist, stammt nicht aus dem gleichen Gen (d. h. sie sind zueinander heterolog). Mit anderen Worten entstammt die Gewebe-spezifische transkriptionale regulatorische Sequenz nicht aus nativen Vektorsequenzen.
Wenn beispielsweise der Vektor ein Adenovirusvektor ist, stammt die Gewebe-spezifische transkriptionale regulatorische Sequenz nicht von einem Adenovirus.
Die zusätzlichen heterologen kodierenden Sequenzen können von verschiedenen Stellen auf dem Vektor exprimiert werden. Beispielsweise könnte die kodierende Sequenz mit der ersten kodierenden Sequenz verknüpft werden, so dass die Expression direkt von der Transkription dieser regulatorischen Sequenz von der ersten kodierenden Sequenz und anschließend der zusätzlichen kodierenden Sequenz abhängt. Alternativ könnte die zusätzliche kodierende Sequenz dadurch exprimiert werden, dass sie mit einer getrennten transkriptionalen regulatorischen Sequenz operabel verknüpft wird, die durch das Genprodukt der ersten kodierenden Sequenz aktiviert wird (wie beispielsweise bei einer Transaktivierung). Als weitere Alternative könnte die zusätzliche kodierende Sequenz unter der Kontrolle einer getrennten Kopie der Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz angeordnet werden, mit der die erste kodierende Sequenz verknüpft ist, obwohl sie nicht in der Nähe der der ersten kodierenden Sequenz angeordnet ist. Schließlich könnte die zusätzliche kodierende Sequenz in einigen Zellen aus ihrer nativen transkriptionalen regulatorischen Sequenz (z.B. Promotor) oder aus einer anderen verschiedenen transkriptionalen Sequenz, die von derjenigen verschieden ist, mit der die erste kodierende Sequenz operabel verknüpft ist, und die nicht durch das Genprodukt aus der ersten kodierenden Sequenz aktiviert wird, transkribiert werden.
Werden mehrere heterologe Gene exprimiert, könnte der Vektor verschiedene Permutationen der obigen Anordnung enthalten. Beispielsweise könnte in dem Fall, wobei nur ein zusätzliches Gen vorliegt, sich dieses Gen unter der Kontrolle der selben transkriptionalen regulatorischen Sequenz, die die erste kodierende Sequenz kontrolliert, unter der Kontrolle einer transaktivierbaren transkriptionalen regulatorischen Sequenz befinden oder könnte transkriptional mit der ersten kodierenden Sequenz verknüpft sein, so dass sie als Einheit von der Gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz, die die erste kodierende Sequenz kodiert, transkribiert werden, oder es könnte sich schließlich unter der Kontrolle einer anderen transkriptionalen regulatorischen Sequenz befinden, beispielsweise seiner eigenen nativen transkriptionalen regulatorischen Sequenz oder einer anderen konstitutiven transkriptionalen regulatorischen Sequenz. Wenn ein zweites zusätzliches heterologes Gen aus dem Vektor exprimiert wird, erhöhen sich die Permutationen, allerdings folgen sie derselben allgemeinen Strategie. Beispielsweise können alle drei kodierenden Sequenzen aus der gleichen Einheit, die mit einer einzigen Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz verknüpft ist, transkribiert werden. Alternativ können zwei von diesen aus der Einheit transkribiert werden, und ein drittes kann aus der gleichen transkriptionalen regulatorischen Sequenz, allerdings angeordnet in einer unterschiedlichen Nachbarschaft, transkribiert werden. Alternativ kann die erste kodierende Sequenz getrennt von den beiden zweiten Sequenzen, aber beide von der gleichen Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz, transkribiert werden etc. Alternativ kann die erste kodierende Sequenz zur Transaktivierung der zweiten und dritten Gene verwendet werden, die unter der Kontrolle von einer transkriptionalen regulatorischen Sequenz oder unter getrennten transaktivierbaren transkriptionalen regulatorischen Sequenzen verknüpft werden können. 7 erläutert einige der möglichen Permutationen, die in der vorliegenden Erfindung mitumfasst sind. Der Fachmann kennt die möglichen Permutationen, auch wenn sie hier nicht ausdrücklich beschrieben sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform können mehrere Gene auf dem Vektor durch einen Transaktivator kontrolliert werden. Wo demnach die erste kodierende Sequenz Transaktivatorfunktion aufweist, führt die Aktivierung der Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz zur Expression dieser Funktion und somit zur Transaktivierung aller Gene, die unter der Kontrolle von transaktivierbaren transkriptionalen regulatorischen Sequenzen an einer oder mehreren Stellen in dem Vektor angeordnet sind. Beispielsweise stellt die Erfindung in einem Vektor auf Adenovirusbasis durch Verknüpfen eines heterologen regulatorischen Elements mit dem E1a-Gen in einem anderweitig Replikations-kompetenten adenoviralen Vektor die Fähigkeit bereit, Gene unter andere transkriptionale regulatorische Sequenzen anzuordnen, wie die durch E1a transaktivierten E3-, E4-, E1-Regionen oder mehrere Kopien dieser Promotoren, wie zwei oder mehrere E3-Promotoren. Der Aufbau hängt von der beabsichtigten Verwendung ab. Beispielsweise wäre für die Krebstherapie eine Tumor-spezifische transkriptionale regulatorische Sequenz wünschenswert, um die E1a-Expression anzutreiben, während therapeutische Gene mit transkriptionalen regulatorischen Sequenzen, die durch E1a transaktiviert werden, wie ein oder mehrere E3-Promotoren, ein oder mehrere E4-Promotoren, E1-Promotoren oder Kombinationen davon, die Gene enthalten, wie HSV-TK, GM-CSF und IL-2, angeordnet sein können.
Bei sehr bevorzugten Ausführungsformen sind die Vektoren dazu ausgelegt, ein heterologes Gen, das für die virale Replikation toxisch ist, zu exprimieren. Durch dieses Gen besteht die Möglichkeit, die Menge an Replikation und somit die Expression von anderen heterologen Genprodukten therapeutisch oder anderweitig zum maximalen Vorteil und zur maximalen Spezifität zu modifizieren. Beispielsweise könnte in adenoviralen Vektoren mit einer E1akodierenden Sequenz, die mit einem Gewebe-spezifischen Promotor verknüpft ist und das HSV-TK-Gen unter der Kontrolle des E3-Promotors aufweist, die Replikation durch Zugabe von Ganciclovir kontrolliert werden.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Vektoren sind adenovirale Vektoren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält ein Adenovirusvektor eine Gewebe-spezifische transkriptionale regulatorische Sequenz, die mit einem Gen in der E1-Region verknüpft ist.
Bei einer Ausführungsform sind sowohl E1a als auch E1b operabel mit heterologen Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen verknüpft. Bei einer alternativen Ausführungsform ist nur E1a verknüpft; E1 b bleibt intakt. Bei wieder einer anderen Ausführungsform ist E1b verknüpft, und E1a bleibt intakt oder ist deletiert. In jedem Fall gestattet ein oder mehrere Gewebe-spezifische und Promotor-spezifische zelluläre transkriptionale regulatorische Faktoren die Virusreplikation unter fortgeführter Transkribierung des mit dem Promotor funktionell verknüpften E1a- und/oder E1b-Gens. Außerdem können entweder eine oder beide der E1b-Funktionen mit der transkriptionalen regulatorischen Sequenz verknüpft sein.
Bei alternativen Ausführungsformen sind Adenovirusvektoren, wobei eines der anderen für die Replikation essentiellen Gene, wie E2-E4, die sich unter Kontrolle einer heterologen transkriptionalen regulatorischen Sequenz befinden, vorgesehen.
Die Erfindung führt weiterhin die Verwendung von Plasmiden und Vektoren aus, wobei nur die essentiellen Regionen des Adenovirus zur Replikation benötigt werden, wobei entweder das E1a-, E1b-19kDa-Gen oder das E1b-55kDa-Gen oder eine Kombination davon modifiziert ist. Ein solches Plasmid, dem sämtliche Strukturgene fehlen, wäre in der Lage, eine DNA-Replikation zu durchlaufen. Demnach können die erfindungsgemäßen Vektoren im Wesentlichen aus den transkriptionalen regulatorischen Sequenzen und aus einem oder mehreren Genen, die für die Replikation des Vektors essentiell sind, bestehen. Im Falle von viralen Vektoren können die Vektoren im Wesentlichen aus der transkriptionalen regulatorischen Sequenz und dem Gen oder den Genen, die für die Replikation oder für die Lebenscyclusfunktionen des Virus essentiell sind, bestehen. Es ist auch selbstverständlich, dass diese Vektoren auch weiterhin im Wesentlichen aus einer DNA-Sequenz bestehen können, die eine oder mehrere toxische heterologe Genprodukte kodieren, wenn solche Vektoren als Expressionsvektoren zur Behandlung beabsichtigt sind.
Vektoren, wie hier offenbart, können auch aus anderen DNA-Tumorviren stammen. Solche Viren umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Herpesviren (wie Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus, Herpes zoster und Herpes simplex), Papillomaviren, Papovaviren (wie Polyoma und SV40) und Hepatitisviren, Parvoviren und Picornaviren.
Die alternativen Viren werden vorzugsweise aus einer Gruppe von Viren ausgewählt, wobei sich die essentiellen Gene zur Replikation des Virus unter der Kontrolle einer Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz befinden können. Sämtliche Serotypen sind eingeschlossen. Die einzige gemeinsame Eigenschaft solcher Viren ist darum, dass sie in das Zielgewebe transduzierbar sind, genetisch manipulierbar sind und bei Nicht-Replikation nicht toxisch sind.
Das relevante (die relevanten) viralen Gen(e) sind diejenigen, die zur Replikation des viralen Vektors oder des Virus essentiell sind. Beispiele für Gene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die E6- und E7-Regionen des humanen Papillomavirus, 16 und 18, das T-Antigen von SV40 und die CMV-unmittelbar frühen Gene, die Polymerasen aus Retroviren und dergleichen. Im Wesentlichen umfassen diese jedes Gen, das für den Lebenscyclus des Virus notwendig ist.
Vektoren, wie hier offenbart, können sich auch von einem RNA-Virus oder von einem Retrovirus ableiten. Es ist allerdings selbstverständlich, dass potentiell jeder replizierende Vektor hergestellt und nach dem wesentlichen hier offenbarten Aufbau verwendet werden kann.
Die hier beschriebenen Vektoren können unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken konstruiert werden. Die Standardtechniken zur Konstruktion solcher Vektoren sind der Fachwelt gut bekannt und können in Artikeln, wie Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989) oder in einer der Vielzahl von Laborhandbüchern über DNA-Rekombinationstechnik, die breit verfügbar sind, gefunden werden. Eine Vielzahl von Strategien steht zur Ligation von DNA-Fragmenten zur Verfügung, deren Wahl von der Natur der Termini der DNA-Fragmente abhängt und leicht durch den Fachmann bestimmt werden kann.
Ein Adenovirusvektor wird bei einer bevorzugten Ausführungsform konstruiert, indem zunächst nach den Standardtechniken ein Shuttleplasmid konstruiert wird, das, beginnend am 5'-Ende, die "kritischen linken Endelemente" enthält, die ein adenovirales 5'-ITR, ein adenovirales Encapsidationssignal und eine E1a-Enhancersequenz; einen Promotor (der ein adenoviraler Promotor oder ein Fremdpromotor sein kann); eine dreiteilige Leadersequenz, eine Mehrfach-Klonierungsstelle (die wie hier beschrieben sein kann); ein poly-A-Signal; und ein DNA-Segment, das einem Segment des adenoviralen Genoms entspricht, umfassen. Ein solches DNA-Segment dient als Substrat zur homologen Rekombination mit einem modifizierten oder mutierten Adenovirus. Das Plasmid kann auch einen selektierbaren Marker und einen Replikationsursprung umfassen. Der Replikationsursprung kann ein bakterieller Replikationsursprung sein. Repräsentative Beispiele für Shuttleplasmide umfassen pAVS6, wie hier diskutiert und siehe Trapnell, B. et al., Adv. Drug Deliv. Rev 12: 185–189 (1994). Eine gewünschte DNA-Sequenz, die ein heterologes Gen enthält, kann anschließend in die Mehrfach-Klonierungsstelle inseriert werden, um einen Plasmidvektor herzustellen.
Dieses Konstrukt wird anschließend zur Produktion eines adenoviralen Vektors verwendet. Die homologe Rekombination wird anschließend mit einem modifizierten oder mutierten Adenovirus durchgeführt, wobei eine oder mehrere der nativen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen deletiert und mit der gewünschten transkriptionalen regulatorischen Sequenz ersetzt wurden. Eine solche homologe Rekombination kann über Cotransfektion des Plasmidvektors und des modifizierten Adenovirus in eine Helferzelllinie durch CaPO₄-Präzipitation bewirkt werden.
Durch solche homologe Rekombination wird ein Vektor gebildet, der adenovirale DNA, frei von einer oder mehreren der nativen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen, einschließt. Dieser Vektor kann anschließend zur viralen Replikation und zur Generierung infektiöser viraler Partikel in eine Helferzelllinie transfiziert werden. Die Transfektionen erfolgen durch Elektroporation, Calcium-Phosphat-Präzipitation, Mikroinjektion oder durch Proteoliposomen.
Der Vektor kann eine Mehrfach-Klonierungsstelle einschließen, um die Insertion von DNA-Sequenz(en), die das heterologe Gen enthalten, in den klonierenden Vektor zu erleichtern. Im Allgemeinen umfasst die Mehrfach-Klonierungsstelle "seltene" Restriktionsenzymschnittstellen, d. h. Stellen, die in eukaryotischen Genen mit einer Frequenz von etwa eins pro 10000 bis etwa eins in jeweils 100000 Basenpaaren vorkommen. Ein entsprechender Vektor wird somit durch Schneiden des Klonierungsvektors durch Standardtechniken an entsprechenden Restriktionsschnittstellen in der Mehrfach-Klonierungsstelle und anschließende Ligation der DNA-Sequenz, die das heterologe Gen enthält, in dem Klonierungsvektor gebildet.
Die kodierende Sequenz, deren Genprodukt für die Vektorreplikation essentiell ist, steht unter der Kontrolle einer geeigneten Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz, die ein Promotor oder ein Enhancer sein kann. Ein Gewebe-spezifischer Promotor kann AFP, PSA, CEA, DE3, α-Fetoprotein, Erb-B2, Tensid und der Tyrosinase-Promotor sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Ein Gewebe-spezifischer Enhancer kann ein DF3-Brustkrebs-spezifischer Enhancer, ein Enhancer aus Viren und aus der Steroidrezeptorfamilie sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Geeignete Promotoren zur Expression der DNA-Sequenz, die das heterologe Genprodukt kodiert, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, virale Promotoren, wie der späte Adenovirus-Hauptpromotor, der Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor, der Rous sarcoma-Virus-Promotor, induzierbare Promotoren, wie der MMTV-Promotor, der Metallothionein-Promotor, Hitzeschock-Promotoren, der Albumin-Promotor, der ApoE-Promotor und der ApoAl-Promotor. Es ist allerdings selbstverständlich, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf spezielle heterologe Gene oder Promotoren beschränkt ist.
Geeignete native Promotoren (bereits auf dem Virusvektor angeordnet) umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Adenovirus E2, E3 und E4. Weiterhin kann, wie besprochen, die Gewebe-spezifische transkriptionale regulatorische Sequenz, die zur Aktivierung der Vektorreplikation verwendet wird, auch zur Kontrolle der Transkription von einem oder mehreren heterologen Genen an Stellen, die von der ersten kodierenden Sequenz in dem Vektorgenom getrennt sind, verwendet werden.
Bei einer Ausführungsform kann das Adenovirus unter Verwendung eines künstlichen Hefechromosoms (oder YAC), das ein adenovirales Genom enthält, nach dem Verfahren, das bei Ketner, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 6186–6190 (1994) beschrieben ist, in Verbindung mit den hier enthaltenen Lehren konstruiert werden. Bei dieser Ausführungsform wird das Adenovirus-Hefe-künstliche Chromosom durch homologe Rekombination in vivo zwischen adenoviraler DNA und künstlichen Hefechromosomplasmidvektoren, die Segmente der adenoviralen linken und rechten genomischen Termini tragen, produziert. Eine DNA-Sequenz, die das heterologe Gen enthält, kann dann in die adenovirale DNA kloniert werden. Das modifizierte adenovirale Genom wird dann aus dem künstlichen Adenovirus-Hefechromosom ausgeschnitten, um zur Generierung infektiöser adenoviraler Partikel verwendet zu werden.
Die infektiösen viralen Partikel können anschließend in vivo an einen Wirt verabreicht werden. Der Wirt kann ein Wirtstier, einschließlich Säuger, ein nicht-humaner Primat und menschliche Wirte, sein.
Die viralen Partikel können in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden, der zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist. Der Träger kann ein flüssiger Träger (beispielsweise eine Salzlösung) oder ein fester Träger, wie beispielsweise Mikroträgerkügelchen, sein.
Für die hier beschriebenen Verfahren und insbesondere Behandlungsverfahren ist die Modulierung der Menge an Vektorreplikation ein sehr bevorzugter Aspekt der Erfindung. Dies stellt kontrollierte Mengen eines heterologen Genprodukts bereit.
Die Vektoren hier stellen ein Verfahren zur Amplifikation der Expression des heterologen Gens bereit. Zusätzlich zur Bereitstellung einer konstitutiven Expression eines heterologen Gens (wie aus einem nativen Promotor oder einer anderen transkriptionalen regulatorischen Sequenz oder aus einem Gewebe-spezifischen Promotor in dem Zielgewebe) via Replikation stellt der Vektor außerdem Kopien von dem heterologen Gen zur amplifizierten Expression bereit. Das Einschließen eines toxischen Gens auf dem Vektor stellt einen Weg zur Kontrolle oder Modulierung der Amplifikation und somit der Expression bereit.
Die Expression eines Gens, insbesondere eines toxischen Gens, kann uneingeschränkt kontrolliert werden, indem die Transkription des Gens vollständig durch die Replikation konditioniert wird. Dies ist der Fall, wenn die Expression eines solchen Gens von der Transaktivierung durch ein Genprodukt, das von einer kodierenden Sequenz eines Gens produziert worden ist, das für die Replikation essentiell ist, das mit einer Gewebe spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz operabel verknüpft ist, abhängt.
Vektoren, die Genprodukte exprimieren, wie HSV-TK, gestatten die Kontrolle der Replikation durch Arzneimittel, wie Ganciclovir. Diese Expression in Verbindung mit einer Gewebe-spezifischen Kontrolle der Expression eines für die Replikation essentiellen Gens gestattet die Kontrolle der Replikation durch Verabreichung eines externen Arzneimittels. Beispielsweise können Tumorzellen mit einem Vektor, der E1a Gewebe-spezifisch exprimiert, transduziert werden, welcher Vektor das HSV-TK-Gen enthält. Bei der Replikation wird HSV-TK entweder exprimiert, oder die Expression wird durch Replikation des Vektors amplifiziert. Wenn im Laufe der Überwachung der Vektorreplikation eine unerwünschte Ausbreitung über die Tumorränder hinaus in umgebendes normales Gewebe erfolgt oder die Freisetzung in den Blutstrom, der überwacht werden kann, erfolgt, kann die virale Replikation durch Zugabe von Ganciclovir gedämpft werden, um die normalen Zellen zu schützen. In hohen Dosen von Ganciclovir (beispielsweise 10–50 µM) kann die Replikation vollständig ausgeschaltet werden. Bei niedrigeren Dosen kann die Replikation gedämpft werden. Da die E1A-Expression von Gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen abhängig ist, würde zudem in normalen Zellen die E1a-Expression verhindert werden. Darum würde die TK-Expression auch vermindert werden. Zudem sollte bei denjenigen Ausführungsformen, wobei die TK-kodierende Sequenz entweder mit dem Gewebe-spezifischen Promotor oder einem Promotor, der von der E1a-Transaktivierung abhängig ist, operabel verknüpft ist, die TK-Expression vollständig zum Erliegen kommen.
Da sich die meisten normalen Zellen nicht aktiv teilen, sollte die Zugabe von Ganciclovir auch die virale Replikation zum Erliegen bringen, allerdings sollte sie Zellen nicht schädigen, die dieses Analog nicht in die zelluläre DNA einbauen. Auch wenn die Zelle sich teilen würde, würde die Ausschaltung der TK-Expression zudem die Phosphorylierung von Ganciclovir verhindern, und somit sollte sich für die Zelle kein Nachteil ergeben.
Bei einigen Ausführungsformen braucht das Gen, wie TK, nicht aus dem Vektor selbst exprimiert zu werden, sondern kann von einer unverknüpften Stelle exprimiert werden, wie ein getrennter Vektor oder ein zelluläres Genom.
Es sollte davon ausgegangen werden, dass die Fähigkeit zur Modulierung der viralen Replikation die vorübergehende Expression eines gegebenen Gens und insbesondere eines cytotoxischen Gens erlaubt. Dies ist beispielsweise bei einem Behandlungszusammenhang geeignet, bei dem die temporäre Expression eines Gens zur Bereitstellung einer Gentherapie notwendig ist. Ein Gen kann auf einem bestimmten Niveau exprimiert, auf diesem Niveau gehalten und die Expression erhöht und die Zelle beseitigt werden.
Außerdem kann die Beseitigung einer Zelle nicht wünschenswert sein, sondern es kann lediglich erwünscht sein, ein Gen zu exprimieren. In diesem Fall ist die Expression eines Gens auf bestimmten Niveaus erwünscht. Die Kontrolle der Genexpression könnte somit durch eine Kombination beispielsweise von E1a, TK und GCV durchgeführt werden.
Die Expression von heterologen Genen und/oder die Behandlung dadurch sind unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren möglich. Darum werden hier Verfahren zur Replikation der hier beschriebenen Vektoren offenbart.
Bei bevorzugten Ausführungsformen richten sich die Verfahren speziell auf das Einbringen in ein Zielgewebe eines Replikations-konditionalen adenoviralen Vektors. Dieser Vektor repliziert sich selektiv in den Zellen des Zielgewebes. Die Replikation ist durch die Funktion einer transkriptionalen regulatorischen Sequenz bedingt, mit der ein virales Gen operabel verknüpft ist, wobei das Gen zur Vektorreplikation notwendig ist. Somit kann in dem Zielgewebe die Replikation erfolgen, da eine der Zellfunktionen in dem Zielgewebe die Transkription ermöglicht. Alternativ besteht in dem Zielgewebe ein Mangel an einer zellulären Funktion, die normalerweise die Transkription verhindert oder hemmt. Die Gegenwart oder Abwesenheit von solchen Funktionen stellt die Selektivität bereit, die die Behandlung eines speziellen Gewebes mit möglichst geringer Wirkung auf das (die) umgebenden Gewebe erlaubt.
Somit sind hier Verfahren zur selektiven Verteilung eines Polynucleotids in einem gegebenen Gewebe in vivo offenbart, die signifikant die Verteilung in Nicht-Zielgewebe verringern oder vermeiden. Das Polynucleotid wird in dem Replikations-konditionalen Vektor bereitgestellt, der selektiv in dem gegebenen Gewebe verteilt ist.
Auch Verfahren zur selektiven Expression eines Genprodukts in einem gegebenen Gewebe, wobei die Expression in Nicht-Ziel- oder Nicht-Tumorgewebe vermieden oder signifikant herabgesetzt wird, werden hier offenbart. Bei bevorzugten Verfahren ist das aus dem Vektor exprimierte Gen ein Gen, das das Potential besitzt, cytotoxisch für die Wirtszelle und/oder toxisch für die virale Replikation in der Zelle zu sein. Somit besteht die Möglichkeit der Beseitigung der Zelle, in der sich das Virus repliziert, oder einfach der Verminderung oder Ausschaltung der viralen Replikation und der Vermeidung der Zellabtötung. Dementsprechend wird hier ein Verfahren zur Expression solcher Gene, beispielsweise Thymidinkinase, in einer Zelle offenbart. Dies stellt die Möglichkeit der Behandlung von Krankheiten bereit, wobei die Gewebe-spezifische virale Replikation und Genexpression erwünscht ist. Somit wird hier auch ein Verfahren zur Abtötung einer Zelle im Falle von Bedingungen offenbart, bei denen die Zellabtötung erwünscht ist, wie Krebs und andere Erkrankungen, die eine anormale Zellproliferation umfassen, wie Restenose.
Die Erfindung gestattet die Verteilung der oben erwähnten Vektoren auf eine größere Anzahl von Zielzellen, als es unter Verwendung eines nichtreplizierenden Vektors erreicht werden würde. Die schrittweise Infektion stellt einen "Dominoeffekt" bereit, so dass alle oder im Wesentlichen alle Zellen in dem Zielgewebe erreicht werden. Somit werden Zellen, zusätzlich zu denjenigen, die zuerst gegenüber dem Poylnucleotid, dem Vektor oder dem Genprodukt ausgesetzt waren, somit potentiell durch die Verfahren erreicht.
Eine solche Behandlung ist besonders in Fällen notwendig, in denen ein operativer Eingriff nicht durchführbar ist. Beispielsweise bei Patienten mit anormalem Gewebe, das eng mit Nervengewebe verbunden ist, kann eine Operation ausgeschlossen oder äußerst gefährlich sein. Außerdem ist eine Operation im Falle von multiplen Metastasen oder mikroskopischen Metastasen nicht durchführbar.
In dem Zielgewebe kann allein die DNA-Replikation allein stattfinden. Späte virale Funktionen, die zum Verpacken der Vektor-DNA in Virionen führen, können ebenfalls auftreten.
Der Vektor kann in das Zielgewebe als nackte DNA oder mittels Encapsidation (als infektiöses Viruspartikel oder Virion) eingebracht werden. Im letzteren Fall wird die Verteilung durch schrittweise Infektionen von Zellen in dem Gewebe durch das Virus erreicht, derart, dass im Wesentlichen alle oder eine nennenswerte Anzahl der Tochterzellen infiziert werden.
Die Gewebespezifität ist besonders bezüglich der Ausrichtung auf ein anormales Gegenstück eines bestimmten Gewebetyps relevant, wobei das normale Gegenstück des Gewebes oder das umgebende Gewebe eines zum anormalen Gewebe unterschiedlichen Typs während der Behandlung des anormalen Gewebes vermieden wird. Beispielsweise sind die erfindungsgemäßen Vektoren zur Behandlung von Metastasen der Leber geeignet. Ein spezielles Beispiel ist Darmkrebs, der oft in die Leber metastasiert. Es wurde festgestellt, dass auch wenn Darmkrebs in die Leber metastasiert, der CEA-Promotor in den Zellen der Metastasen aktiv ist, allerdings nicht in den normalen Leberzellen. Demnach sollte eine normale menschliche Leber eines Erwachsenen die Replikation eines Virus, der virale Gene aufweist, die für die Replikation essentiell sind, die mit dem Darmkrebs-CEA-spezifischen Promotor verknüpft sind, nicht unterstützen. Die Replikation sollte in den primären Krebszellen auftreten. Ein weiteres Beispiel ist Brustkrebs, der ebenfalls in die Leber metastasiert. In diesem Falle ist der DF3-Mucin-Enhancer mit einem für die Replikation essentiellen Gen, wie sowohl E1a als auch E2a, verknüpft. Die Replikation sollte im Brustkrebs, jedoch nicht in der normalen Leber erfolgen. Ein weiteres Beispiel ist der α-Fetoprotein-Promotor, der im Leberzellenkarzinom aktiv ist. Dieser Promotor ist mit einem für die Replikation essentiellen Gen verknüpft. Es wurde festgestellt, dass der Promotor nur in dem Leberzellenkarzinom aktiv ist. Demnach wird ein Virus verwendet, das ein Gen aufweist, das für die Replikation essentiell ist, die mit diesem Promotor verknüpft ist. Die Replikation sollte auf das Leberzellenkarzinom beschränkt sein. Ein weiteres Beispiel ist der Tyrosinase-Promotor. Dieser Promotor ist mit einem für die Replikation essentiellen Gen verknüpft. Die Replikation sollte im Melanom und nicht in der normalen Haut stattfinden. In jedem Fall wird erwartet, dass die Replikation in den anormalen, jedoch nicht in den normalen Zellen erfolgt.
Der erfindungsgemäße Vektor kodiert ein heterologes Genprodukt, das von dem Vektor in den Gewebezellen exprimiert wird. Das heterologe Genprodukt kann für die Zellen in dem Zielgewebe toxisch sein oder eine andere gewünschte Eigenschaft übertragen.
Ein von dem Vektor produziertes Genprodukt kann überall im Gewebe verteilt sein, da der Vektor selbst überall im Gewebe verteilt ist. Alternativ kann, obwohl die Expression des Genprodukts lokal begrenzt sein kann, seine Wirkung durch einen "Standby-Effekt" oder durch die Produktion von Molekülen, die weitreichende Wirkungen aufweisen, wie Chemokine, weitreichender sein. Das Genprodukt kann RNA sein, wie Antisense-RNA oder Ribozym, oder Protein. Beispiele für toxische Produkte umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Thymidinkinase in Verbindung mit Ganciclovir.
Ein breiter Bereich von toxischen Wirkungen ist möglich. Toxische Wirkungen können direkt oder indirekt sein. Indirekte Wirkungen können aus der Konversion eines Prodrugs in ein direkt toxisches Arzneimittel herrühren. Beispielsweise phosphoryliert Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase Ganciclovir unter Produktion des Nucleotidtoxins Ganciclovirphosphat. Diese Verbindung funktioniert als Kettenterminator und DNA-Polymerase-Inhibitor, verhindert die DNA-Synthese und ist somit cytotoxisch. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von Cytosindeaminase zur Überführung von 5-Fluorcytosin in das krebshemmende Arzneimittel 5-Fluoruracil. Für eine Diskussion solcher "Suicid"-Gene siehe Blaese, R.M. et al., Eur. J. Cancer 30A: 1190–1193 (1994).
Direkte Toxine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das Diphtherietoxin (Brietman et al., Mol. Cell Biol. 10: 474–479 (1990)), Pseudomonastoxin, Cytokine (Blankenstein, T., et al., J. Exp. Med. 173: 1047–1052 (1991), Colombo, M.P., et al., J. Exp. Med. 173: 889–897 (1991), Leone, A., et al., Cell 65: 25–35 (1991)), Antisense-mRNAs und Ribozyme (Zaia, J.A. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 95–106 (1992)), Tumorimpfstoffgene und DNA, die Ribozyme kodiert.
Erfindungsgemäß kann das Mittel, welches in der Lage ist, die Inhibition, Prävention oder Zerstörung des Wachstums des Zielgewebes oder der Tumorzellen bereitzustellen, bei Expression eines solchen Mittels ein negativer selektiver Marker sein, d. h. ein Material, das in Kombination mit einem chemotherapeutischen oder Interaktionsmittel das Wachstum der Zielzellen hemmt, verhindert oder zerstört.
Somit wird beim Einbringen des negativen selektiven Markers in die Zellen ein Interaktionsmittel an den Wirt verabreicht. Das Interaktionsmittel wechselwirkt mit dem negativen selektiven Marker, um das Wachstum der Zielzellen zu verhindern, zu hemmen oder zu zerstören.
Negative selektive Marker, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Thymidinkinase und Cytosindeaminase. Bei einer Ausführungsform ist der negative selektive Marker eine virale Thymidinkinase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Herpes simplex Virus-Thymidinkinase, Cytomegalovirus-Thymidinkinase und Varicella-Zoster Virus-Thymidinkinase. Werden virale Thymidinkinasen eingesetzt, ist das Interaktionsmittel oder das chemotherapeutische Mittel vorzugsweise ein Nucleosid-Analog, beispielsweise eines, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ganciclovir, Acyclovir und 1,2-Deoxy-2-fluor-β-D-arabinofuranosil-5-ioduracil (FIAU). Solche Interaktionsmittel werden von den viralen Thymidinkinasen wirksam als Substrat verwendet, und somit werden solche Interaktionsmittel in die DNA der Tumorzellen, die die viralen Thymidinkinasen exprimieren, letal eingebaut, wodurch es zum Tod der Zielzellen kommt.
Wenn Cytosindeaminase der negative selektive Marker ist, ist ein bevorzugtes Interaktionsmittel 5-Fluorcytosin. Cytosindeaminase wandelt 5-Fluorcytosin in 5-Fluoruracil um, welches hoch cytotoxisch ist. Somit wandeln die Zielzellen, die das Cytosindeaminasegen exprimieren, das 5-Fluorcytosin in 5-Fluoruracil um und werden getötet.
Das Interaktionsmittel wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um das Wachstum der Zielzellen zu hemmen, zu verhindern oder zu zerstören. Beispielsweise wird das Interaktionsmittel in einer Menge, bezogen auf das Körpergewicht und die Gesamttoxizität für einen Patienten, verabreicht. Das Interaktionsmittel wird vorzugsweise systemisch verabreicht, wie beispielsweise durch intravenöse Verabreichung, parenterale Verabreichung, durch intraperitoneale Verabreichung oder durch intramuskuläre Verabreichung.
Wenn die erfindungsgemäßen Vektoren einen negativen selektiven Marker induzieren und an ein Gewebe oder einen Tumor in vivo verabreicht werden, kann sich ein "Standby-Effekt" ergeben, d. h. Zellen, die nicht ursprünglich mit der Nucleinsäuresequenz transduziert wurden, die den negativen selektiven Marker kodiert, können bei Verabreichung des Interaktionsmittels abgetötet werden. Obwohl der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf eine theoretische Begründung festgelegt werden soll, können die transduzierten Zellen als die fundierbare Form des negativen selektiven Markers produziert werden, der entweder extrazellulär auf das Interaktionsmittel wirkt oder durch benachbarte Nicht-Zielzellen aufgenommen wird, die dann gegenüber der Wirkung des Interaktionsmittels empfindlich werden. Es ist auch möglich, dass einer oder beide negativen selektiven Marker und das Interaktionsmittel zwischen den Zielzellen kommunizieren.
Bei einer Ausführungsform ist das Mittel, welches die Inhibition, Prävention oder Zerstörung des Wachstums der Tumorzellen bereitstellt, ein Cytokin. Bei einer Ausführungsform ist das Cytokin ein Interleukin. Weitere Cytokine, die eingesetzt werden können, umfassen Interferone und Koloniestimulierende Faktoren, wie GM-CSF. Interleukine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Interleukin-1, Interleukin-1β und Interleukine-2-15. Bei einer Ausführungsform ist das Interleukin Interleukin-2.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Zielgewebe anormal proliferierend und ist vorzugsweise Tumorgewebe. Der Vektor oder das Virus ist überall im Gewebe oder der Tumormasse verteilt.
Sämtliche Tumoren sind potentiell der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich. Die Tumortypen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, hämatopoietisch, pankreatisch, neurologisch, hepatisch, den Gastrointestinaltrakt, endokrin, den Gallentrakt, sinopulmonal, Kopf und Nacken, Weichgewebesarkom und Karzinom, dermatologisch, Geschlechtsorgane und dergleichen. Zur Behandlung bevorzugte Tumore sind diejenigen mit einem hohen methodischen Index relativ zu dem normalen Gewebe. Bevorzugte Tumoren sind solide Tumore und insbesondere Tumore des Gehirns, besonders bevorzugt Gliom.
Die Verfahren können auch für andere anormale Zellen als Ziel verwendet werden, beispielsweise alle Zellen, die in vivo schädlich oder anderweitig unerwünscht sind. Allgemeine Beispiele umfassen Zellen, die Autoimmunerkrankung, Restenose, Grindgewebebildung, anormale Angiogenese, PRD, Arthritis, chronische Diabetes und ARMD hervorrufen.
Außerdem kann die Behandlung ex vivo erfolgen. Die ex vivo Transduktion von Tumorzellen würde viele der Probleme mit den derzeitigen viralen Abgabesystemen beheben. Gewebe wird unter Sterilbedingungen geerntet, mechanisch und/oder enzymatisch dissoziiert und unter Sterilbedingungen in entsprechenden Medien kultiviert. Vektorpräparationen, die sich als frei von Endotoxinen und bakterieller Verunreinigung gezeigt haben, werden zur Transduktion von Zellen unter Sterilbedingungen in vitro unter Anwendung von Standardprotokollen verwendet. Die Zugänglichkeit des Virus zu den Zellen in Kultur ist derzeit besser als bei der in vivo Injektion und gestattet das Einbringen von Vektorvirussequenzen in im Wesentlichen alle Zellen. Nach der Entfernung von Virus-enthaltenden Medien werden die Zellen sofort wieder in den Patienten gebracht oder werden mehrere Tage lang in Kultur gehalten, während die Testung auf Funktion oder Sterilität vorgenommen wird.
Beispielsweise wurden Patienten mit Hypercholesterinämie durch Entfernen von Teilen der Leber, Explantieren der Hepatocyten in Kultur, ihr genetisches Modifizieren durch Exposition gegenüber Retrovirus und Reinfundieren der korrigierten Zellen in die Leber erfolgreich behandelt (Grossman et al., Nature Genetics 6: 335–341 (1994)).
Die virale Transduktion hat auch potentielle Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der experimentellen Medizin. Die vorübergehende Expression von biologischen Modifizierern der Immunsystemfunktion, wie IL-2, IFN-γ, GM-CSF oder des B7-costimulatorischen Proteins, wurde als potentielles Mittel des Auslösens von Antitumorantworten in Krebspatienten vorgeschlagen.
Vektoren, wie hier offenbart, können sich auch von einem anderen DNA-Tumorvirus ableiten. Solche Viren umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Herpesviren (wie Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus, Herpes zoster und Herpes simplex), Papillomaviren, Papovaviren (wie Polyom und SV40) und Hepatitisviren.
Das (die) relevante(n) virale(n) Gen(e) sind diejenigen, die für die Replikation des viralen Vektors oder des Virus essentiell sind. Beispiele für Gene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die E6- und E7-Regionen des humanen Papillomavirus, 16 und 18, das T-Antigen von SV40 und die CMV-unmittelbar frühen Gene, Polymerasen aus Retroviren und dergleichen. Im Wesentlichen umfassen diese jedes Gen, das für den Lebenscyclus des Virus notwendig ist.
Vektoren, wie hier offenbart, können sich auch von einem RNA-Virus oder von einem Retrovirus ableiten. Es ist jedoch selbstverständlich, dass potentiell jeder replizierende Vektor hergestellt und nach dem essentiellen hier offenbarten Aufbau verwendet werden kann.
Es ist wichtig zu wissen, ob die erfindungsgemäßen Vektoren in einem spezifischen Gewebe eines Patienten replizieren. Wenn sich die Vektorreplikation für die Therapie als günstig erweist, wird ein Screening für diejenigen Patienten bereitgestellt, die am besten gegenüber der hier offenbarten Therapie ansprechen. Wenn eine Beeinträchtigung festgestellt wird, erfolgt ein Screening auf Prävention der Behandlung von Patienten, die eine unerwünschte Antwort auf die Behandlung zeigen. Derzeit sind die einzigen nicht-biologischen Tests, die üblicherweise angewandt werden, Expressionsscreening, PCR und Sequenzieren. Diese führen oft zu falsch negativen Ergebnissen, sind zeitraubend, teuer und ergeben, in dem besten der Fälle, nur Informationen über den Status der Gene und nicht über ihre biologische Funktion.
Demgemäß wird ein Verfahren zur Identifizierung eines anormalen Gewebes offenbart, dessen Zellen einen Transkriptionsfaktor enthalten, der die Replikation eines Replikations-konditionalen Vektors erlaubt, oder denen ein inhibitorischer Faktor für die Transkription fehlt.
Bei diesem Verfahren wird eine Gewebebiopsie explantiert, ein Replikationskonditionaler Vektor wird in die Zellen der Biopsie eingebracht, und die Vektor-DNA-Replikation in den Zellen wird quantifiziert. Demnach wird ein Verfahren zum Screening von Gewebe auf das Vorliegen von Faktoren, die die Vektorreplikation erlauben, oder auf einen Mangel eines Faktors, der die Transkription hemmt, offenbart. Ein solches Screening ist unter anderem zur Identifizierung von Gewebe, welches der Behandlung mit einem bestimmten in dem Gewebe zu replizierenden Vektor zugänglich ist, vor der Behandlung geeignet.
Darum wird ein Verfahren zur Testung der Vektorbrauchbarkeit für die Behandlung durch Entnahme einer Gewebebiopsie aus einem Patienten, Explantieren der Biopsie in Gewebekultur, Einbringen des Replikationskonditionalen Vektors in die Biopsie und Testung der Vektorreplikation in den Zellen der Biopsie offenbart.
Die Testung oder das Screening von Geweben umfasst einen Test auf die Vektor-Nucleinsäurereplikation oder auf die Virusreplikation, wenn der Vektor in der Lage ist, infektiöse Virionen zu bilden.
Somit wird ein Verfahren zum Screening eines Tumors auf transkriptionale regulatorische Funktionen, welche die Vektorreplikation zulassen, oder auf die Abwesenheit dieser Funktionen, die normalerweise die Replikation eines Virusvektors verhindern würden, offenbart.
Allerdings kann jedes anormale Gewebe auf die vorstehend beschriebenen Funktionen durch einen Test auf Nucleinsäure oder auf Virusreplikation gescreent werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Zelle bereitgestellt, die ein Virion enthält, das in der Zelle durch Replikation in der Zelle der erfindungsgemäßen Replikations-konditionalen Vektoren produziert worden ist. Somit stellt die Erfindung "Producerzellen" zur wirksamen und sicheren Produktion rekombinanter Replikations-konditionaler Vektoren zur weiteren Verwendung für die gerichtete Gentherapie in vivo bereit.
Eines der Hauptprobleme bei den derzeit verfügbaren Producerzellen besteht darin, dass solche Zellen in dem Genom virale Sequenzen enthalten, die Komplement-Funktionen für den replizierenden Vektor bereitstellen. Da die Zelle solche Sequenzen enthält, kann zwischen der viralen Sequenz in dem Genom und den viralen Vektorsequenzen eine homologe Rekombination auftreten. Eine solche Rekombination kann rekombinante Wildtypviren regenerieren, die die in der Producerzelle produzierte Vektor- oder Viruspräparation verunreinigen. Eine solche Verunreinigung ist unerwünscht, da die Wildtypviren oder -vektoren anschließend in Nicht-Zielgewebe replizieren können und dadurch Nicht-Zielzellen abtöten oder beeinträchtigen können. Darum besteht eines der Hauptvorteile der erfindungsgemäßen Producerzellen darin, dass sie keine endogenen viralen Sequenzen enthalten, die homolog zu Sequenzen sind, die in dem Vektor festgestellt werden, der in den Zellen repliziert werfen soll. Die Abwesenheit solcher Sequenzen vermeidet die homologe Rekombination und die Produktion von viralen Wildtyprekombinanten, die Nicht-Zielgewebe beeinflussen können.
Demgemäß führt die Erfindung auch Methoden zur Konstruktion und Produktion Replikations-konditionaler Virionen in einer Zelle aus, umfassend das Einbringen des erfindungsgemäßen Replikations-konditionalen Vektors in die Zelle, wobei das Genom der Zelle an Vektorsequenzen verarmt ist, Replizieren des Vektors in der Zelle, Bilden des Virions und Reinigen des Virions aus der Zelle. Das Virion ist ein adenovirales Virion, und der Vektor ist ein adenoviraler Vektor. Bei anderen Ausführungsformen der Erfindung ist die Zelle eine Tumorzelle.
Der Vektor kodiert ein heterologes Genprodukt derart, dass das Virion ebenfalls das Genprodukt kodiert, und wenn der Vektor oder das Virion zur Gentherapie verwendet wird, wird die Therapie durch Expression des heterologen Genprodukts erleichtert. Alternativ kann die Producerzelle zur Produktion eines heterologen Genproduktes per se, das von dem Vektor kodiert wird, verwendet werden. Wenn der Vektor in der Producerzelle repliziert, wird das Genprodukt aus den Mehrfachkopien des Gens, das das Genprodukt kodiert, exprimiert. Nach der Expression kann das Genprodukt aus der Producerzelle durch herkömmliche Lyseprozeduren gereinigt oder aus der Producerzelle durch entsprechende Sekretionssignale, die mit dem heterologen Gen zusammenhängen, durch bekannte Verfahren sezerniert werden. Die Transduktion von Zellen durch adenovirale Vektoren wurde bereits beschrieben. Die Transfektion von Plasmid-DNA in Zellen durch Calciumphosphat (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166: 577 (1983)), Lipofektion (Feigner et al., PNAS 84: 7413 (1987)) oder Electroporation (Seed, B., Nature 329:840 ()) wurden bereits beschrieben. DNA-, RNA- und Virusreinigungsverfahren sind beschrieben (Graham et al., J.Gen. Virol. 36: 59–72 (1977).
Bevorzugte Wirte für Producerzelllinien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, HuH7, SW480, BIGF10, HepG2, MCF-7 und SK-MEL2. Primäre Tumore, aus denen Zelllinien abgeleitet werden können, oder existierende Zelllinien können auf die Fähigkeit getestet werden, die Replikation mittels der Gewebe-spezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz zu ermöglichen. Jeder primäre Tumor könnte explantiert und in Producerzellen für die erfindungsgemäßen Vektoren entwickelt werden. Solange die Zelle keinen endogenen Vektor oder virale Sequenzen enthält, die mit dem Vektor oder Virus rekombinieren, um Wildtypvektor oder -virus zu produzieren, ist die Zelle potentiell als Wirt brauchbar. Selbstverständlich ist jede Zelle, nicht nur Tumorzellen, pontentiell geeignet ist.
Das letzte Ziel für eine Producerzelllinie und insbesondere eine adenovirale Producerzelllinie besteht darin, die höchste Vektor-Ausbeute mit der geringsten Möglichkeit einer Verunreinigung durch Wildtypvektor zu produzieren. Die Ausbeute hängt von der Anzahl der infizierten Zellen ab. Je mehr Zellen somit zu züchten und zu infizieren möglich sind, desto mehr Virus ist zu generieren möglich. Demnach würden Kandidatenzellen eine hohe Wachstumsrate aufweisen und zu einer hohen Dichte wachsen. Die Zelle sollte auch eine hohe Menge an viralem Rezeptor aufweisen, so dass das Virus die Zelle leicht infizieren kann. Ein weiteres Merkmal ist die Qualität des produzierten Vektors (d. h. die Präparation sollte keine hohe Menge an nicht-infektiösen viralen Partikeln einschließen). Demnach würden die Kandidatenproducerzellen einen geringen Anteil von Partikel-zu-Plaquebildender Einheit aufweisen. Somit sind diese Zellen ein bevorzugter Zelltyp zur Ableitung einer Producerzelllinie. Primäre Explantate oder die bekannten Zelllinien können verwendet werden.
Somit können solche verfügbaren Zellen als Producerzellen für rekombinante Replikations-konditionale Vektoren, Viren und Genprodukte dienen.
Eine Vielzahl von Wegen wurde bereits zum Einbringen von Vektoren in Zellkulturen und in Zellen und Geweben von einem tierischen oder einem menschlichen Patienten entwickelt. Verfahren zum Einbringen von Vektoren in Säuger- und andere tierische Zellen umfassen Calciumphosphattransfektion, die DEAE-Dextrantechnik, Mikroinjektion, Liposomen-vermittelte Techniken, kationische Techniken auf Lipidbasis, Transfektion unter Verwendung von Polybren, Protoplastenfusionstechniken, Elektroporation und andere. Diese Techniken sind den Fachleuten gut bekannt und in vielen leicht verfügbaren Veröffentlichungen beschrieben und wurden bereits intensiv besprochen. Einige der Techniken sind in Transcription and Translation, A Practical Approach, Hames, B.D. und Higgins, S.J., Hrsg., IRL Press, Oxford (1984) und Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Maniais et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), besprochen.
Mehrere dieser Techniken wurden bereits zum Einbringen von Vektoren in Gewebe und Zellen in Tieren und menschlichen Patienten verwendet. Die Haupttechnik davon war die systemische Verabreichung und direkte Injektion in die Stellen in situ. In Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg und dem Vektor wurden die Techniken zum Einbringen nackter DNA, DNA-komplexiert mit kationischem Lipid, viralen Vektoren und Vektorproducerzelllinien in normale und anormale Zellen und Geweben im Allgemeinen durch direkte Injektion in eine Zielstelle verwendet.
Die zuvor genannten Techniken zum Einbringen von Polynucleotid, viralen und anderen Vektoren in Zellen in Kultur, in Tieren und in Patienten können zur Entwicklung, zum Testen und zur Produktion von erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden. Beispielsweise können Zellen, die einen Vektor enthalten, der durch diese Verfahren eingebracht worden ist, zur Produktion des Vektors verwendet werden. Zusätzlich können Zellen, die einen Vektor enthalten, als Producerzellen verwendet und in Zellen oder Gewebe eines Tiers eingebracht werden, um den Vektor in situ zu produzieren.
Die Replikation eines Polynucleotids, eines viralen oder eines anderen Vektors kann durch gut bekannte Techniken getestet werden. Tests auf Replikation eines Vektors in einer Zelle umfassen im Allgemeinen den Nachweis eine Polynucleotids, Virions oder eines infektiösen Virus. Eine Vielzahl von gut bekannten Verfahren, die für diesen Zweck verwendet werden können, umfassen die Bestimmung der Menge eines markierten Substrats, das in ein Polynucleotid während eines gegebenen Zeitraums in einer Zelle eingebracht wurde.
Wenn die Replikation DNA-Polynucleotide umfasst, wird 3H-Thymidin oft als markiertes Substrat verwendet. In diesem Fall wird die Menge der Replikation durch Abtrennung der Vektor-DNA von dem Großteil zellulärer DNA und Messung der Menge an spezifisch in die Vektor-DNA eingebautem Tritium bestimmt.
Weitere Verfahren zum Testen der Replikation umfassen allerdings, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hexonimmunhistochemie und weitere späte Gen-Immuntests, die mit DNA oder der viralen Replikation zusammenhängen.
Die Replikation eines Polynucleotidvektors kann auch durch Lyse oder Permeieren von Zellen zur Freisetzung des Polynucleotids und anschließendes Isolieren des Polynucleotids und direkte Quantifizierung der DNA oder der RNA, die gewonnen wird, nachgewiesen werden. Die Polynucleotidreplikation kann auch durch quantitative PCR unter Verwendung von Primern, die auf das Testpolynucleotid spezifisch sind, nachgewiesen werden.
Virionen können durch EM-Zähltechniken, die aus der Technik gut bekannt sind, durch Isolieren der Virionen und Bestimmen des Protein- und Nucleinsäuregehalts und durch Markieren viraler genomischer Polynucleotide oder von Virionproteinen und Bestimmen der Menge an Virion aus der Menge an Polynucleotid oder Protein getestet werden.
Es ist gut bekannt, dass Virionen nicht alle überlebensfähig sind und wo Infektiosität von Bedeutung ist, kann der Infektionstiter durch cytopathische Wirkung oder Plaquetest bestimmt werden.
Jede dieser gut bekannten Techniken können unter anderem zur Bewertung der Replikation eines Vektors in einer Zelle oder einem Gewebe erfindungsgemäß verwendet werden. Es wird davon ausgegangen, dass verschiedene Techniken für einige Vektoren als für andere und für einige Zellen oder Gewebe als für andere besser geeignet sind.
Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung werden im Folgenden nicht-einschränkende Beispiele zur Erläuterung der Erfindung dargelegt.
Beispiel 1
Der Hepatom-spezifische Promotor, alpha-Fetoprotein-Promotor, der mit E1a verknüpft ist
Es wurde bereits gezeigt, dass der alpha-Fetoprotein-(AFP)-Promotor in Hepatomzellen hoch aktiv und in adulten Hepatocyten und anderen adulten Geweben stumm ist. Ein 4,9 kb alpha-Fetoprotein-Promotor-enthaltendes Konstrukt wurde zur Ableitung des Promotors verwendet. Alternativ könnte der Promotor auch auf der Grundlage von verfügbaren Literaturschriften hergestellt werden.
pAVE1a02i (1A), welcher die E1a/E1b-Gene unter die Kontrolle des alpha-Fetoprotein-Promotors in einem Adenovirus-Shuttleplasmid stellt, wurde durch Reinigen eines Restriktionsfragmentes, welches nur die E1a-kodierende Region und sämtliche E1b-Gene enthält, durch Spalten des Plasmids 380-280E1 (1A) mit SpeI und MunI und dieses Ligieren zu pAVSAFP.TK1 (1A), gespalten mit MunI und NheI, kloniert.
Das Adenovirus-Shuttleplasmid pAVSAFP.TK1 (1A), wobei sich das TK-Gen unter der Kontrolle des nativen 4,9 kb alpha-Fetoprotein-Promotors befindet, wurde exakt so hergestellt, wie in den 11 und 12 der US-Patentanmeldung 08/444,284, Chiang et al., "Gene therapy of hepatocellular karzinoma through cancer-specific gene expression", eingereicht am 18. Mai 1995, beschrieben, die hier als Referenz für ihre relevanten Lehren mitumfasst ist. Dieses Shuttleplasmid enthält das linke ITR-Verpackungssignal, den nativen AFP-Promotor, das HSV-TK-Gen und ein homologes Rekombinationsfragment. Der Abbau dieses Plasmids mit NunI und NheI entfernt das TK-Gen und einen Teil des E1a-Gens. Als Rest bleibt ein 10667 Basenpaar-Fragment. Dieses Fragment wird den offenen E1a- und E1b-Leserastern aus Plasmid 380-280E1 (siehe nachstehend) zugefügt.
Plasmid 380-280E1 enthält den E1a-ORF und alles vib E1b. Ein SpeI/MunI-Restriktionsfragment von 3397 Basenpaaren, wie in 1A beschrieben, auf Plasmid 380-280E1 wurde zur Ligation an das MunI/NheI-Fragment von pAVSAFP.TK1 verwendet, um pAVE1aO2i zu konstruieren. Das SpeI/MunI-Fragment von 380-280E1 kann unter Bezugnahme von Plasmid SE280-E1 gefunden werden, welches das gleiche Fragment wie in 380-280E1 gefunden, enthält; SE280-E1 kann in der US-Patentanmeldung 08/458,403 gefunden werden, die hier als Referenz aufgrund ihrer relevanten Lehre mitumfasst ist.
Das Shuttleplasmid pAVE1a04i (1C) wurde direkt durch Abbau von pAVE1a02i (1A) mit Ascl und anschließendes Auffüllen des 3'-ausgesparten Endes durch das große DNA-Polymerase-I-Fragment (Klenow) kloniert. Das linearisierte pAVE1a02i wurde anschließend mit SpeI (1A) verdaut und das resultierende 9104 Basenpaar-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Diese Verfahrensweise entfernt den AFP-Promotor, so dass das 9104 Basenpaar-Fragment die oben erwähnten Komponenten, jedoch keinen Promotor, enthält.
Das Plasmid pAF(AB)2(S)6-CAT (1A, 1B) wurde mit XbaI verdaut, gefolgt vom Klenow-Auffüllen der ausgesparten 3'-Enden, pAF(AB)2(S)6-CAT enthält einen verkürzten AFP-Promotor mit sechs Silencerelementen und zwei Enhancerregionen, AB2, die für die Verstärkung der Aktivität in Hepatomzellen und die Repression der Aktivität in adulten Leberzellen verantwortlich sind.
pAF(AB)2(S)6-CAT wurde durch Anordnen von sechs Kopien des distalen Silencers unmittelbar stromaufwärts von dem basalen 200 Basenpaar-AFP-Promotor konstruiert. Zwei Kopien der Enhancer-AB-Region, von denen ursprünglich angenommen wurde, dass sie in entgegengesetzter Orientierung vorhanden sind, wurden unmittelbar stromaufwärts von den Silencerelementen angeordnet. Das distale Silencerelement, der basale Promotor und die Enhancerelemente sind bei Nakabayashi et al. (Moloc. & Cell. Biol. 11: 5885–5893 (1991)) beschrieben.
Das linearisierte pAF(AB)2(S)6-CAT wurde sodann mit SpeI (1A) verdaut, und das 1986 Basenpaarfragment, das den verkürzten AFP-Promotor enthielt, wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Das 9104 Basenpaar-Fragment von pAvE1a02i und das 1986 Basenpaarfragment von pAF(AB)2(S)6-CAT, welche den verkürzten synthetischen AFP-Promotor enthielten, wurden zur Herstellung des Plasmids pAvE1a04i (1C) ligiert, welches das Adenovirus-E1a-Gen unter die Kontrolle der verkürzten AFP-Promotors bringt.
Es wurde berichtet, dass das pAF(AB)2(S)6-CAT zwei Kopien der Enhancer-AB-Region in entgegengesetzter Orientierung aufweist, allerdings wurde von den Erfindern bestimmt, dass es die Enhancerregion als Tandem-Wiederholungseinheit aufweist. Die Plasmidkarte von pAvE1a04i zeigt die Enhancer-(AB)-Region des AFP-Promotors als invertierte Wiederholungseinheit (1A). Allerdings wurde die Karte später korrigiert, um die echte Orientierung der Enhancerregionen zu zeigen. Die korrigierte Plasmidkarte wurde als pAvE1a06i bezeichnet.
Konstruktion eines Virus mit dem Hepatom-spezifischen AFP-Promotor, der operabel mit dem E1a-Gen verknüpft ist
Das Adenovirus AvE1a04i (2C) wurde durch homologe Rekombination des Shuttleplasmids pAvE1a06i (siehe 1C und 2B) mit dem großen (Cla1) Fragment von Av1lacZ DNA (2a) in 293 Zellen konstruiert. Das resultierende rekombinante Virus, das den AFP-Promotor mit den beiden direkten Wiederholungsenhancern enthielt, wurde isoliert und ursprünglich als AvE1a06i (2C, Seitenanfang) bezeichnet. Bei dem Verfahren der Plaquereinigung wurde das rekombinante Virus, eine Einzelenhancer- Deletionsmutante, isoliert und als AvE1a04i (2C, Seitenende) bezeichnet.
Es wurde gezeigt, dass AvE1a04i spezifisch in Zelllinien repliziert, wie in der PCT-Anmeldung Nr. US 95/15455 (US 08/849,117) beschrieben.
Beispiel 2
AV5E1aTK01i-Konstruktion
pAVS10TK1 (US Anmeldung Nr. 08/444,284) (die Quelle des TK-Gens in Av15EKa04i, nachstehend) wurde mit XbaI und SpeI verdaut, und das resultierende 1230 bp Fragment, das das offene HSV-TK-Leseraster enthielt, wurde in die partiell verdaute XbaI-Schnittstelle an der Basenpaarposition 6162 von Prepac (3A) (beschrieben in der US-Patentanmeldung 08/852,924) ligiert. Dieses Shuttleplasmid enthält mindestens 8886 Basenpaare von 25171 bis 34057 des AddI327-Genoms (Thimmapaya, Cell 31: 543 (1983)), kloniert in pBluescript SKII(+) (Stratagene). Prepac (3A) ist ein großes Plasmid, das die adenovirale genomische DNA von der rechten ITR bis zur E3-Region enthält. Das TK-Gen, das sich von pAVS10TKI ableitet, wurde in die XbaI-Schnittstelle in Prepac inseriert, wobei dieses Gen unter die Kontrolle des E3-Promotors gebracht wurde. Die resultierende ligierte Plasmid-DNA wurde in E. coli STBL2-Zellen (Life Technologies) transformiert und als PrepacTK markiert. Die Plasmid-PrepacTK wurde anschließend zur Herstellung der Plasmid-PrepacTKbnI (3B) durch Ligation der folgenden beiden annelierten Oligonucleotide (5'-GGCCGCATGCATGTTTAAACG-3' und 5'-GATCCGTTTAAACATGCATGC-3') in die mit BamHI und NotI verdauten Schnittstellen von PrepacTK (3A, 3B) verwendet. Die Ligation dieses Oligonucleotids erzeugt eine weitere BamHI-Schnittstelle ohne Zerstörung des offenen Leserasters.
Das Plasmid PrepacTKm wurde anschließend durch Verdau von PrepacTKbnI mit BamHI und SpeI und Isolieren des resultierenden 11148 Basenpaarfragments kloniert (3B). Dieses entfernt einen Teil des E2a-Gens und gestattet, dass es mit einem modifizierten E2a-Gen versetzt wird, das eine Mutation enthält, die die Replikation in Affenzellen (aus pG1MBS, siehe nachstehend) erlaubt. Dieses 11198 Basenpaarfragment wurde mit dem 5520 Basenpaarfragment, erhalten durch Verdau des Plasmids pG1MBS mit BamHI und SpeI (3B), erhalten. Das Endplasmid wird als prepacTKm bezeichnet. Dieses Plasmid weist das TK-Gen in der E3-Region auf und enthält auch die E2a-Mutation, wie nachstehend erklärt.
Das Plasmid pG1MBS enthält die adenovirale Typ 5 (Ad5)-Region zwischen der BamHI-Schnittstelle und der SpeI-Schnittstelle (Ad5-Genom-Basenpaarpositionen 21562 bis 27082, 3B). Plasmid pG1MBS besitzt eine Punktmutation in den adenoviralen Sequenzen bei Basenpaar 11670, welches die verstärkte adenovirale Replikation in Affen (wie beschrieben von Kruijen, Nucl. Acids Res. 9: 4439 (1981) erlaubt.
Zur Herstellung des adenoviralen Vektors Av5E1aTK01i wurde das Plasmid pREpacTKm (3C) mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdaut, und das 13748 Basenpaarfragment wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Die Adenovirus AddI327-DNA wurde durch Verdau des durch Cäsiumdichtegradientenzentrifugation gereinigten Virus mit Proteinase K hergestellt. Anschließend wurde die durch Proteinase K verdaute AddI327-Virus-DNA zuerst mit Phenol/Chloroform und dann mit Chloroform extrahiert und schließlich mit Puffer-gesättigtem Ether extrahiert. Die DNA wurde nach Äquilibrieren in Wasser unter Verwendung einer Amicon Centricon 100 Einheit gewonnen. Die gereinigte AddI327-DNA wurde anschließend mit BamHI verdaut, und das 21562 Basenpaarfragment wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Sodann wurden das 13748 Basenpaar-BamHI/SalI-Fragment aus pREpacTKm und das 21562 Basenpaar-BamHI-Fragment aus AddI327 miteinander ligiert. Die resultierenden ligierten Fragmente wurden anschließend unter Verwendung von Lipofectamin (Life Technologies Inc.) in A549.A30.S8-Zellen transfiziert und bei 37 °C in einem 5% CO₂ befeuchteten Inkubator inkubiert, bis cytopathische Wirkungen (CPE) festgestellt wurden. Das resultierende rekombinante Av5E1aTK01i (3C) Virus wurde sodann auf A549.A30.S8-Zellen Plaque-gereinigt. Av5E1aTK01i-Plaques wurden durch PCR auf das Vorliegen von HSV-TK-Sequenzen unter Verwendung der folgenden Primer: (LMC11: 5'-AGCAAGAAGCCACGG AAGTC-3' und LMC12: 5'-AGGTCGCAGATCGTCGGTAT-3') gescreent.
Av15E1a04i-Konstruktion
Av1E1a04i wurde vollständig mit SrfI (4A) verdaut, der Verdau auf 1% Agarosegel in 1 × TAE bestätigt, organischer Verdau mit gepuffertem Phenol, gepuffertem Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und Chloroform extrahiert und sodann 1/10 Volumen 3M NaOAc und 2,5 Volumen 95% EtOH zur Präzipitation zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch 20-minütige Zentrifugation bei 12000 g pelletisiert, 1 × mit 70% EtOH gewaschen und sodann 30 min luftgetrocknet. Das Pellet wurde in dH₂O resuspendiert und mit BamHI verdaut. Der vollständige Verdau wurde bestätigt und wie zuvor gereinigt.
293 Zellen wurden mit 2,5 µg Av5E1aTk01i (verdaut mit Bst 1107 und ClaI (4B) und 2,5 µg Av1E1a04i (verdaut mit BamHI und SrfI, 4A) unter Verwendung des Promega CaCl2 Transfektions-Testsatzes cotransfiziert (4C). Die Transfektionen wurden 1 × mit Richters-Medium, angereichert mit 10% FBS (R10), gewaschen und dann mit 1 MEM/10% FBS/0,5% Pen-Strep/1% Fungizon überschichtet. Die Plaques wurden durch mikroskopische Überprüfung identifiziert und mit einer 1000-µl-Pipettenspitze in 500 µl R5-Medium pipettiert. Die Plaques wurden durch Gefrieren-Auftauen (4×) lysiert und sodann in S8-Zellen, stimuliert mit 0,3 µm Dexamethason, infiziert. Wenn das frühe CPE offensichtlich war, wurden die Zellen 1 × mit PBS gewaschen, mit 200 µl 1N NaOH lysiert und mit 30 µl 7,5 M Ammoniumacetat neutralisiert. Die CVL wurde 1:50 in dH₂O verdünnt und 5 µl des verdünnten Lysats wurden in einer 50 µl-PCR-Reaktion unter Verwendung der BMB-Mastermixreagenzien verdünnt.
Das E1a-Promotorprimerpaar weist sowohl Av15E1aTk04i (1653 bp) asl auch AddI327 (405 bp) CH12 5'-GACCGTTTACGTGGAGACTCGC-3' bp 367 in ITR CH13 5'-ACCGCCAACATTACAGAGTCG-3' bp 772 oder bp 2020 in E1a-Gen von AddI327 beziehungsweise Av15E1aTk04i auf.
HSV-TK-Primerpaar 990 bp Produkt entweder in Av15E1aTk04i oderAv5E1aTk01i LMC11 5'-AGCAAGAAGCCACGGAAGTC-3' bp 100 von HSV-Tk ORF LMC12 5'-AGGTCGCAGATCGTCGGTAT-3' bp 1090 von HSV-Tk ORF.
Drei primäre Plaques wurden für eine zusätzliche Plaquereinigung auf S8-Zellen unter Verwendung der gleichen PCR von CVL identifiziert, um positive Plaques zu identifizieren. Eine Plaque wurde anschließend dreimal durch Plaquereinigung auf S8-Zellen gereinigt. Eine Massenpräparation der tertiären Plaques für Av15E1aTk04i besitzt einen Titer von 9 × 10¹⁰ Teilchen/ml, Verhältnis 26.
Av15E1aTk04i (4C) besitzt die AFP-Promotor-kontrollierende E1a-Expression und somit werden nur AFP-positive Zellen zur Vektorreplikation zugelassen. Av15E1aTk04i besitzt auch eine E2a-Mutation (hr404), was Affenzellen zur Replikation permissiv macht, wobei der Bereich von permissiven Spezies auf zusätzliche eingeschränkte Spezies ausgeweitet wird. Schließlich ist bei Av15E1aTk04i HSV-TK unter der Kontrolle des E3-Promotors, der durch E1a positiv reguliert wird; darum sollte in Abwesenheit von E1a, der nur in AFP-positiven Zellen vorhanden ist, keine Expression erfolgen. Als Sicherheitsmerkmal in dem Fall, dass die Replikation in Nichtzielzellen eintritt, würden nur die Nichtziel- und Zielzellen, die replizierende Vektoren sind, gegenüber der GCV-Behandlung empfindlich sein. Alle infizierten Nichtzielzellen, die kein replizierender Vektor sind, werden GCV gegenüber unempfindlich.
Beispiel 3
Av15E1aTk04i sollte das gleiche Gewebe-spezifische Replikationsbeschränkte adenovirale Profil wie Av1E1a04i aufweisen, insbesondere Replikation nur in AFP-positiven Zellen (wie in PCT-Anmeldung Nr. US 95/15455 (US 08/849,117) beschrieben). Die Infektion von Hep3B und HepG2 (AFP-positive hepatozelluläre Karzinomzelllinien) und S8 (E1a-positive Zelllinie) mit AddI327, Av1E1a04i oder Av15E1aTk04i führt zur sichtbaren CPE bei Infektionen von 0,5, 5 und 50 Partikeln pro Zelle (5). Die Av1nBg02v-(E1-deletiertes Virus)-Infektion mit demselben Input an Partikelmenge zeigt mit Ausnahme der S8-Zellen keine sichtbare CPE. Umgekehrt zeigen Chang und HeLa (AFP-negative Zelllinien) sichtbare CPE nur bei Infektion mit AddI327 (Wildtyp) bei Infektion mit demselben Input an Partikeln. Av1E1a0ei, Av15E1aTk04i und Av1nBg02v manifestieren keine CPE bei Infektionen mit 0,5, 5 und 50 Partikeln pro Zelle in Chang- und HeLa-Zellen (5). Dies zeigt, dass AV15E1aTK04i auch in AFP-positiven Zelllinien spezifisch repliziert. Darum muss das E1a-Genprodukt, das den E3-Promotor kontrolliert, auch spezifisch in AFP-positiven Zelllinien induziert werden. Darum wird auch HSV-TK, welches durch den E3-Promotor kontrolliert wird, spezifisch in AFP-positiven Zelllinien induziert.
Beispiel 4
Ersatz von weiteren therapeutisch toxischen Genen in den Tumorspezifischen Replikations-kompetenten Vektoren
Gene, wie TK, Cytokine oder jedes beliebige therapeutische Gen, können in der E3-Region des Vektorgrundgerüsts durch Standard-Plasmidkonstruktion und homologe Rekombination angeordnet werden. Diese Gene können unter die Kontrolle eines E1a-abhängigen Promotors oder eines konstitutiven Promotors, wie RSV oder CMV, gestellt werden.
In vitro Kontrolle der Replikation durch Einschluss von HSV-TK in die E3-Region (6)
HSV-TK wurde in die E3-Region von AddI327 angeordnet, um Av5E1aTK01i zu bilden. A549-Zellen wurden entweder mit AddI327 oder Av5E1aTK01i transduziert. Anschließend wurden die Zellen mit 10 µM GCV 5 Tage behandelt. Nach der 5-tägigen Inkubation wurden die Zellen geerntet, in HBSS gewaschen und anschließend zur Herstellung eines Virus-Rohlysats tiefgefroren/aufgetaut. Sodann wurden die Titer durch Standard-TCID50-Tests an 293 Zellen zur Bestimmung des viralen Titers durchgeführt. Das Experiment wurde dreimal wiederholt. Die Ergebnisse zeigen, dass, obgleich GCV keine Auswirkung auf einen Adenovirus aufweist, der nicht das HSV-TK-Gen trägt, es einen Abfall von mehr als 4 Größenordnungen im Titer eines Vektors, der das HSV-TK-Gen trägt, verursachte.
In vivo Kontrolle der Replikation durch Einschluss von HSV-TK in die E3-Region
Subkutane Tumore wurden durch Injektion von 1 × 10⁷ A549-Zellen in den subkutanen Raum der rechten Flanke von Nacktmäusen gebildet. Nach der Bildung von Tumoren wurden 1 × 10⁹ pfu Av5E1aTK01i in mehrere Tiere, die Tumore enthielten, injiziert. Nach 5 Tagen erhielt die Hälfte der Tiere 5 Tage ip. eine GCV-Behandlung bei 75 mg/kg einmal am Tag. Am Ende dieses Zeitrahmens wurden sämtliche Tiere getötet. Die Immunhistochemie wurde an sämtlichen Proben auf HSV-TK-Expression und Hexonexpression durchgeführt, wovon letzteres nur exprimiert ist, wenn der Vektor replizierend ist. Die Ergebnisse zeigen, dass nur Hexon gravierend vermindert ist, wenn die Tiere mit GCV behandelt wurden.
Beispiel 5
GCV-Hemmung der Av5E1aTk01i-Replikation in vivo
Subkutane Tumore wurden durch Injektion von 1 × 10⁷ A549-Zellen in den subkutanen Raum der rechten Flanke von Nacktmäusen gebildet. Nach dem Bilden der Tumore wurden 1 × 10⁹ pfu AddI327Tk0Ii in mehrere Tiere, die Tumore enthielten, injiziert. Nach 5 Tagen erhielt die Hälfte der Tiere 5 Tage lang die IP-GCV-Behandlung bei 75 mg/kg einmal am Tag. Am Ende dieses Zeitrahmens wurden sämtliche Tiere getötet. Die Immunhistochemie wurde an sämtlichen Proben auf die HSV-TK-Expression und die Hexonexpression durchgeführt, wovon letztere nur exprimiert ist, wenn der Vektor replizierend ist. Die Ergebnisse zeigen, dass nur das Hexon gravierend reduziert ist, wenn die Tiere mit GCV behandelt wurden.
TABELLE 1: Oligonucleotidprimer zur Konstruktion gewebespezifscher Promotoren
Sequenzprotokoll

Claims

Replikations-bedingter adenoviraler Vektor, umfassend: (a) eine heterologe regulatorische Transkriptionssequenz (TRS), die mit der Kodierungssequenz eines adenoviralen, für die Replikation essentiellen Gens (GER) operabel verknüpft ist, und (b) mindestens eine zusätzliche Kodierungssequenz, die ein heterologes Genprodukt kodiert, wobei die zusätzliche kodierende Sequenz mit einer homologen regulatorischen Transkriptionssequenz (TRS) operabel verknüpft ist, die durch das Genprodukt des für die Replikation essentiellen adenoviralen Gens transaktiviert wird.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei das für die Replikation essentielle adenovirale Gen (GER) ein adenovirales E1a-Gen ist.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 2, wobei die heterologe TRS Gewebe-spezifisch ist.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 2 oder 3, der außerdem eine zweite zusätzliche Kodierungssequenz umfasst, die mit einer getrennten heterologen Gewebe-spezifischen regulatorischen Transkriptionssequenz operabel verknüpft ist.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 2 oder 3, wobei die homologe TRS aus der Gruppe, bestehend aus einem adenoviralen E1-, E2-, E3- und E4-Promotor, ausgewählt ist und durch das Genprodukt des adenoviralen E1a-Gens transaktiviert wird.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 5, wobei die homologe TRS ein adenoviraler E3-Promotor ist.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen ein Cytokin-Gen ist.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 7, wobei das Cytokin-Gen Granulocyten-Macrophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) oder Interleukin-2 (IL-2) ist.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei das Expressionsprodukt des heterologen Gens für das Zielgewebe toxisch ist.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 9, wobei das heterologe Gen Thymidinkinase oder Cytosindeaminase ist.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 5, wobei ein Herpes Simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK)-, ein GM-CSF- oder ein IL-2-Gen unter der Kontrolle eines E3-Promotors exprimiert wird.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 5, wobei ein HSV-TK-, ein GM-CSF- oder ein IL-2-Gen unter der Kontrolle eines E4-Promotors exprimiert wird.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 5, wobei ein HSV-TK-, ein GM-CSF- oder ein IL-2-Gen unter der Kontrolle eines E1-Promotors exprimiert wird.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 11, wobei das GM-CSF-Gen unter der Kontrolle eines E3-Promotors exprimiert wird.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 11, wobei das IL-2-Gen unter der Kontrolle eines E3-Promotors exprimiert wird.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 11, wobei das HSV-TK-Gen unter der Kontrolle eines E3-Promotors exprimiert wird.
Adenoviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei das adenovirale E1a-Gen und ein adenovirales E1b-Gen aus einer einzigen heterologen regulatorischen Transkriptionssequenz transkribiert werden.
Adenoviraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die heterologe TRS einen Promotor oder einen Enhancer umfasst.
Zelle, die den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 18 enthält.
Zelle nach Anspruch 19, wobei die Zelle eine Tumorzelle oder eine anormal proliferierende Zelle ist.
Virion, das den adenoviralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 18 enthält.
Zelle, die das Virion nach Anspruch 21 enthält, wobei die Zelle eine Producerzelle für das Virion ist.
Zelle, die das Virion nach Anspruch 21 enthält, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
Zelle, die das Virion nach Anspruch 23 enthält, wobei das heterologe Genprodukt in der Tumorzelle Antiturnoraktivität bereitstellt.
Verfahren zur Herstellung des adenoviralen Vektors nach Anspruch 1, das das Kultivieren der Zelle nach Anspruch 19 und das Gewinnen des Vektors aus der Zelle umfasst.
Verfahren zur Herstellung des Virions nach Anspruch 21, das das Kultivieren der Zelle nach Anspruch 22 und das Gewinnen des Virions aus der Zelle umfasst.