DE69615650T2

DE69615650T2 - Virale vektoren für die gentherapie

Info

Publication number: DE69615650T2
Application number: DE69615650T
Authority: DE
Inventors: Monika Lusky; Majid Mehtali; Karola Rittner
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1995-07-24
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2016-07-25
Also published as: ATE206463T1; US20030203488A1; PT784693E; EP0784693B1; WO1997004119A1; EP1096018A1; ES2164260T3; CA2200696A1; FR2737222A1; EP0784693A1; AU712951B2; AU6663096A; DE69615650D1; JP2008017849A; JPH10506542A; FR2737222B1; DK0784693T3; US6204060B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Virusvektoren, welche die Übertragung interessierender Gene in eine Zelle oder einen Wirtsorganismus und deren Expression darin ermöglichen, wobei die Expression der Virusgene derart geregelt ist, daß sie in einer Komplementationszelle funktionsfähig und in der Zelle oder dem Wirtsmechanismus nicht funktionsfähig ist. Sie betrifft auch die Zellen, die diese neuen Vektoren enthalten, sowie ein Verfahren zur Herstellung von infektiösen Viruspartikeln, die für eine therapeutische Verwendung bestimmt sind. Die Erfindung ist ganz besonders unter dem Gesichtpunkt der Gentherapie, insbesondere beim Menschen, von großem Interesse.
Die Möglichkeit der Behandlung der Krankheiten des Menschen durch Gentherapie ist innerhalb einiger Jahre vom Stadium der theoretischen Überlegungen in jenes der klinischen Anwendung übergegangen. Das erste Protokoll, das beim Menschen angewandt wurde, wurde in den Vereinigten Staaten im September 1990 an einem Patienten angewandt, der ein genetisches Immundefizit aufgrund einer Mutation aufwies, die das für die Adenin-Desaminase (ADA) codierende Gen betraf. Der relative Erfolg dieses ersten Versuchs ermutigte die Entwicklung neuer Protokolle der Gentherapie für verschiedene genetisch bedingte oder erworbene Krankheiten (Infektions- und insbesondere Viruserkrankungen, wie AIDS oder Krebs). Die überwiegende Mehrheit der bisher beschriebenen · Protokolle setzt Virusvektoren ein, um das therapeutische Gen in die zu behandelnden Zellen zu transferieren und darin zu exprimieren.
Bis heute sind die Retrovirusvektoren aufgrund der Einfachheit ihres Genoms unter den am meisten verwendeten. Jedoch weisen sie außer ihrer eingeschränkten Klonierungsfähigkeit zwei große Nachteile auf, die ihre systematische Verwendung begrenzen: einerseits infizieren sie mehrheitlich die in Teilung befindlichen Zellen, und andererseits ist aufgrund ihrer zufälligen Integration in das Genom der Wirtszelle die Gefahr der Insertions-Mutagenese nicht zu vernachlässigen. Deshalb sind zahlreiche Wissenschaftlerteams dabei, andere Vektortypen zu entwickeln, unter denen jene genannt werden können, die von den Adenoviren, den Adenoviren-assoziierten Viren (AAV), den Cytomegaloviren, Pockenviren und Herpesviren abstammen. Ganz allgemein sind ihre Organisation und ihr Infektionszyklus in der dem Fachmann zugänglichen Literatur breit beschrieben.
In dieser Hinsicht stellte sich die Verwendung der Adenovirusvektoren als vielversprechende Alternative heraus. Die Adenoviren wurden in zahlreichen Tierarten nachgewiesen, besitzen ein breites Wirtsspektrum, sind wenig pathogen und weisen nicht die Nachteile auf, die mit den Retroviren verbunden sind, da sie nicht integrativ sind und sich auch in ruhenden Zellen replizieren. Beispielsweise ist ihr Genom aus einem Molekül linearer und doppelkettiger DNA von ungefähr 36 kB gebildet, die mehr als etwa dreißig Gene umfaßt, sowohl für die Virusreplikation erforderliche frühe Gene, als auch späte Strukturgene (siehe Fig. 1).
Die frühen Gene sind in 4 Regionen verteilt, die in dem Adenovirusgenom verstreut sind (E1 bis E4: E für early, was früh im Englischen bedeutet). Sie umfassen 6 Transkriptionseinheiten, die ihre eigenen Promotoren besitzen. Die späten Gene (L1 bis L5: L für late, was spät im Englischen bedeutet) bedecken zum Teil die frühen Transkriptionseinheiten und werden zum Großteil von dem späten Hauptpromotor MLP (für Major Late Promoter auf Englisch) transkribiert.
Derzeit fehlt den Adenovirusvektoren, die in den Protokollen der Gentherapie verwendet werden, der größte Teil der Region E1, die für die Replikation wesentlich ist, um ihre Ausschüttung in die Umgebung und den Wirtsorganismus zu vermeiden. Manche umfassen zusätzliche Deletionen, insbesondere in der nicht wesentlichen Region E3, wodurch es möglich wird, ihre Klonierungsfähigkeit zu erhöhen. Die interessierenden Gene werden an Stelle der einen oder der anderen deletierten Region in die Virus-DNA eingeführt. Die Deletion der Region E1 macht das Virusgenom replikationsdefizient. Jedoch können die Viren E1&supmin; in einer Komplementationszellinie vermehrt werden, die in trans die deletierten Virusfunktionen liefert, um ein infektiöses Viruspartikel zu erzeugen. Üblicherweise wird derzeit die Linie 293 verwendet, die ausgehend von menschlichen embryonalen Nierenzellen erstellt wird und wirksam die Funktion E1 komplementiert (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). Die Region E3 ist nicht wesentlich und braucht nicht komplementiert zu werden.
Wenn die Durchführbarkeit der Genübertragung durch Verwendung dieser Vektoren der ersten Generation nun auch gut etabliert ist, bleibt dennoch die Frage bezüglich deren Unschädlichkeit bestehen. Außer den Sicherheitsaspekten (Gefahr der Erzeugung von RCA, d.h. von replikationskompetenten Partikeln) stellt sich das Problem ihrer Toxizität. Die ersten klinischen Tests zeigten nämlich die Induktion entzündlicher Reaktionen auf, die mit der Expression der Virusgene beim Wirt verbunden ist.
Adenovirusvektoren der zweiten Generation wurden vor kurzem in der Literatur vorgeschlagen. Sie konservieren die Regionen in cis, die für die Replikation des Virus in der infizierten Zelle erforderlich sind (ITRs und Enkapsidationssequenzen) und umfassen große innere Deletionen, die das Wesentliche der Virusgene unterdrücken sollen, deren Expression in vivo nicht wünschenswert ist. Jedoch weisen diese Vektoren des Standes der Technik gewisse Nachteile auf, die ihre Verwendung auf industrieller Ebene begrenzen. Es ist nämlich erforderlich, über neue Linien zu verfügen, die die Gesamtheit der deletierten Funktionen komplementieren und die Erzeugung von Viruspartikeln mit hohem Titer ermöglichen. Nun ist eine solche Linie, um im Hinblick auf die Wachstumsfähigkeit und die Viruspartikel- Ausbeute optimal zu sein, aufgrund der Cytotoxizität der Adenovirusgene besonders schwierig zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, diese Nachteile zu überwinden. Es wurde nun einerseits eine neue Linie, die von der Linie 293 abgeleitet wurde und die Adenovirusfunktionen E1 und E2 oder E4 komplementiert, zur Amplifikation von herkömmlichen Adenovirusvektoren der zweiten Generation konstruiert, in welcher die Expression der Regionen E2 oder E4 von einem Promotor gesteuert wird, der an seinem 5'-Ende mit sogenannten "Operator"-Sequenzen des Tetracyclin-Bakterienoperons versehen ist, die nachstehend als tet O bezeichnet werden. Die Synthese der entsprechenden Expressionsprodukte wird nur in Anwesenheit eines Induktors aktiviert, der von dem Adenovirusvektor oder der Linie selbst erzeugt werden kann. Ebenso kann ein Repressor dem Kulturmedium hinzugefügt werden, wenn die Komplementation nicht mehr gewünscht wird.
Andererseits wurden nun neue Adenovirusvektoren erzeugt, bei denen der Hauptteil der Regionen E1 und E3 deletiert ist und in denen die Transkriptionseinheiten der verbleibenden Virusregionen (E2, E4 und/oder L1-L5) regulierbar sind, um ihre Expression zu ermöglichen, wenn es darum geht, die infektiösen Viruspartikel zu erzeugen, und sie in der Wirtszelle zu inhibieren. In den nachfolgenden Beispielen wird die Regulierung durch die Sequenzen tet O gewährleistet. Ihre Insertion in 5' der TATA-Box erzeugt einen Promotor, ab dem das Grund-Transkriptionsniveau gering ist, aber in Anwesenheit des oben erwähnten Induktors stark stimuliert werden kann. So wird die Erzeugung der Virusproteine in einer Linie 293 aktiviert, die den Induktor exprimiert, wodurch es möglich wird, die infektiösen Viruspartikel zu bilden. Sie wird hingegen in der infizierten Wirtszelle deutlich verringert, die den Induktor bakteriellen Ursprungs nicht natürlich erzeugt. Die Regulierung der Virusgene ist ohne Konsequenz für die Expression der exogenen Nukleotidsequenz, die unter die Abhängigkeit eines Promotors gestellt ist, der auf Tetracyclin nicht anspricht.
Als Beispiel beschreibt die WO-A-95 02697 sehr wohl Adenovirusvektoren, die nicht funktionsfähige Gene E1 und E2 oder E4 umfassen. Es wird insbesondere angeführt, daß diese "Nicht- Funktionsfähigkeit" durch Weglassen, Ersatz, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Basen, auch in der Promotorregion dieser Gene, erhalten werden kann. Jedoch wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform darauf hingewiesen, daß der Nicht-Funktionsfähigkeits-Charakter perfekt stabil, segregierend und/oder nicht reversibel ist.
Die Adenovirusvektoren der vorliegenden Erfindung schlagen eine vorteilhafte Lösung für die Nachteile vor, die sich bei der Verwendung der Vektoren des Standes der Technik ergeben, da sie Sicherheit im Einsatz und Einfachheit der Erzeugung kombinieren. Einerseits können sie in einer konventionellen Komplementationszellinie mit einem hohen Titer vermehrt werden, welcher mit den industriellen Bedürfnissen vereinbar ist, und andererseits ermöglichen sie es, eine exogene Nukleotidsequenz in vivo zu transferieren, diese auf stabile Weise zu exprimieren, wobei die schädlichen Auswirkungen begrenzt werden (entzündliche Reaktionen beim Wirt). Sie sind insbesondere an die Gentherapie beim Menschen angepaßt.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung einen Virusvektor, der eine Expressionseinheit umfaßt, die in einer Komplementationszelle funktionsfähig ist und in einer Wirtszelle nicht funktionsfähig ist und die Expression eines oder mehrerer Virusgene steuert, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit eine oder mehrere Regulationssequenzen umfaßt, die es ermöglichen, die Expression der Virusgene in Anwesenheit eines Induktors zu aktivieren und die Expression in Anwesenheit eines Repressors zu inhibieren.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein "Virusvektor" ausgehend von einem Stammvirus erhalten, dessen Genom modifiziert wurde. Diese Modifikationen können unterschiedlicher Natur sein (Deletion, Mutation und/oder Addition eines oder mehrerer Nukleotide) und in den codierenden Regionen des Virusgenoms oder außerhalb derselben angeordnet sein, beispielsweise in den Promotorregionen. Als Beispiel können gewisse Virussequenzen deletiert, nicht funktionsfähig gemacht oder durch andere Sequenzen ersetzt sein, insbesondere eine exogene Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Wirtszelle angestrebt wird.
Ein erfindungsgemäßer Virusvektor kann von sehr unterschiedlichen Viren abstammen, wie den Herpesviren, dem Cytomegalovirus, AAV (Adenovirus-assoziiertem Virus), Pockenvirus und insbesondere dem Kuhpocken-, Geflügelpocken- oder Kanarienpockenvirus. Solche Vektoren sowie die Techniken ihrer Herstellung sind dem Fachmann bekannt.
Jedoch ist ein besonders gut an die vorliegende Erfindung angepaßter Vektor ist ein Adenovirusvektor. Er kann von einem Adenovirus menschlichen, Hunde-, Vogel-, Rinder-, Mäuse-, Schafs-, Schweine- oder Affen-Ursprungs oder auch von einem Hybrid abstammen, das Fragmente des Adenovirusgenoms verschiedener Ursprünge umfaßt. Insbesondere können die Adenoviren CAV-1 oder CAV-2 der Hunde, DAV der Vögel oder auch Bad des Typs 3 der Rinder genannt werden (Zakharchuk et al. 1993, Arch. Virol., 128, 171-176; Spibey und Cavanagh, 1989, J. Gen. Virol., 70, 165-172; Jouvenne et al., 1987, Gene, 60, 21-28; Mittal et al., 1995 J. Gen. Virol. 76, 93-102). Jedoch wird ein Adenovirusvektor bevorzugt, der von einem menschlichen Adenovirus abstammt, vorzugsweise des Serotyps C und auf besonders bevorzugte Weise des Typs 2 oder 5 (Graham und Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Band 7, Seiten 109-128; Ed: E.J. Murey, The Human Press Inc.).
Eine vorteilhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem replikationsdefekten Vektor, in dem ein oder mehrere für die Replikation erforderliche Virusgene deletiert sind und nicht funktionsfähig gemacht wurden. Ein solcher Vektor, der nicht zu einer autonomen Replikation fähig ist, wird in einer Komplementationszelle vermehrt. Der Ausdruck "Komplementationszelle" bezeichnet eine Zelle, die in der Lage ist, in trans die Funktion(en) zu liefern, bezüglich welcher der erfindungsgemäße Vektor defekt ist. Mit anderen Worten ist sie in der Lage, das oder die für die Replikation und Enkapsidation dieses Vektors erforderliche(n) Protein(e), frühe und/oder späte Proteine, zu erzeugen, die er selbst nicht erzeugen kann und die für die Bildung eines infektiösen Viruspartikels erforderlich sind. Da zum Beispiel einem gemäß der Erfindung bevorzugter Adenovirusvektor der Großteil der Region E1 fehlt, wird auf eine Komplementationszelle wie die Linie 293 zurückgegriffen, die in der Lage ist, in trans die Gesamtheit der von der Region E1 codierten Proteine zu liefern, die der Vektor nicht erzeugen kann. Unter "infektiösem Viruspartikel" ist ein Viruspartikel zu verstehen, das die Fähigkeit besitzt, eine Wirtszelle zu infizieren und das Virusgenom in diese eindringen zu lassen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßer Virusvektor rekombinant. So umfaßt er eine exogene Nukleotidsequenz, die unter die Kontrolle der für seine Expression in einer Wirtszelle erforderlichen Elemente gestellt wird. "Exogene Nukleotidsequenz" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die beliebigen Ursprungs sein kann und normalerweise im Genom eines Stammvirus, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, nicht vorhanden ist, oder, wenn sie vorhanden ist, in einem anderen genomischen Kontext vorliegt. Im Rahmen der Erfindung kann die exogene Nukleotidsequenz aus einem oder mehreren Genen und insbesondere aus (einem) Gen(en) von therapeutischem Interesse zusammengesetzt sein.
Ganz allgemein kann die exogene Nukleotidsequenz für eine Antisinn-RNA und/oder eine mRNA codieren, die dann in ein bestimmtes Protein translatiert wird. Sie kann vom genomischen Typ, vom Typ der komplementären DNA (cDNA) oder vom gemischten Typ (Minigen, bei dem mindestens ein Intron deletiert ist) sein. Sie kann für ein reifes Protein oder einen Vorläufer eines reifen Proteins codieren, insbesondere einen Vorläufer, der dazu bestimmt ist, sekretiert zu werden, und der ein Signalpeptid umfaßt. Überdies kann es sich um das Ganze oder einen Teil eines Proteins handeln, wie es in der Natur zu finden ist (natürliches oder gekürztes Protein), oder auch um ein chimäres Protein, das aus der Fusion von Sequenzen verschiedener Ursprünge abstammt, oder auch um ein mutiertes Protein, das verbesserte und/oder modifizierte biologische Eigenschaften aufweist. Solche Proteine können durch die konventionellen Techniken der Molekularbiologie erhalten werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es vorteilhaft sein, die für die folgenden Polypeptide codierenden Gene zu verwenden:
- Cytokine oder Lymphokine (Interferone, α, β und γ, Interleukine und insbesondere IL-2, IL-6, IL-10 oder IL-12, Tumornekrosefaktoren (TNF), Koloniestimulationsfaktoren (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...);
- Zell- oder Zellkernrezeptoren (Rezeptoren, die von pathogenen Organismen erkannt werden (Viren, Bakterien oder Parasiten), und vorzugsweise von dem Virus HIV (humanes Immunodefizienzvirus), oder deren Liganden);
- Proteine, die an einer genetische Krankheit beteiligt sind (Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Dystrophin oder Minidystrophin, Insulin, Protein CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), Wachstumshormone (HGF);
- Enzyme (Urease, Renin, Thrombin...);
- Enzyminhibitoren (α-1-Antitrypsin, Antithrombin III, Inhibitoren der Virusproteasen...);
- Polypeptide mit Antitumor-Wirkung, die in der Lage sind, zumindest teilweise die Initiierung oder die Progression von Tumoren oder Krebsen zu hemmen (Antisinn-RNA, Antikörper, Inhibitoren, die auf dem Niveau der Zellteilung oder der Transduktionssignale wirken, Expressionsprodukte der Tumorsuppressorgene, beispielsweise p53 oder Rb, Proteine, die das Immunsystem stimulieren, ...);
- Proteine des Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexes der Klassen I oder II oder Regulatorproteine, die auf die Expression der entsprechenden Gene einwirken;
- Polypeptide, die in der Lage sind, eine Virus-, Bakterien- oder Parasiteninfektion und/oder deren Entwicklung zu hemmen (Antigen-Polypeptide, die immunogene Eigenschaften besitzen, Antigenepitope, Antikörper, transdominante Varianten, die in der Lage sind, die Wirkung eines nativen Proteins durch Kompetition zu hemmen...);
- Toxine (Thymidin-Kinase des Herpes-Simplex-Virus 1 (TK-HSV-1), Ricin, Cholera-, Diphterietoxin...) oder Immuntoxine; und
- Marker (β-Galaktosidase, Luciferase...).
Es ist anzumerken, daß diese Liste nicht einschränkend ist und daß andere Gene ebenfalls verwendet werden können.
Überdies kann eine exogene Nukleotidsequenz, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ferner ein Selektionsgen umfassen, das es ermöglicht, die transfizierten Zellen zu selektieren oder zu identifizieren. Es können die Gene neo (die für die Neomycin-Phosphotransferase codieren), die eine Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleihen, dhfr (Dihydrofolat-Reduktase), CAT (Chloramphenicol-Acetyltransferase), pac (Puromycin-Acetyltransferase) oder gpt (Xanthinguanin- Phosphoribosyltransferase) genannt werden. Ganz allgemein sind die Selektionsgene dem Fachmann bekannt.
Unter für die Expression einer exogenen Nukleotidsequenz in einer Wirtszelle erforderlichen Elementen ist die Gesamtheit der Elemente zu verstehen, die deren Transkription in RNA (Antisinn-RNA oder mRNA) und die Translation einer mRNA in Protein ermöglichen. Unter diesen nimmt der Promotor eine besondere Bedeutung ein. Er kann aus einem beliebigen Gen eukaryontischen oder auch viralen Ursprungs isoliert werden und konstitutiv oder regulierbar sein. Alternativ kann es sich um einen natürlichen Promotor des betreffenden Gens handeln. Es wird bevorzugt, einen anderen Promotor als jenen zu verwenden, der in der Expressionseinheit der Virusgene (nachstehend definiert) eingeschlossen ist. Überdies kann er derart modifiziert werden, daß die Promotoraktivität verbessert wird, eine die Transkription inhibierende Region weggelassen wird, ein konstitutiver Promotor regulierbar gemacht wird oder umgekehrt, eine Restriktionsstelle eingeführt wird... Man kann als Beispiele die Promotoren der Gene TK-HSV-1, PGK (Phosphoglycerat-Kinase) der Maus oder des Menschen, α-1-Antitrypsin (Leberspezifisch), Immunglobuline (Lymphozyten-spezifisch), der frühe Promotor des Virus SV40 (Simian Virus 40), ein retrovirales LTR oder auch der Adenoviruspromotor MLP, insbesondere des menschlichen Adenovirus des Typs 2, erwähnen.
Natürlich kann eine exogene Nukleotidsequenz, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ferner zusätzliche Elemente umfassen, die für die Expression (Intronsequenz, Signalsequenz, Sequenz der Zellkernanordnung, Transkriptionsterminationssequenz, Initiationsstelle der Tanslation des IHRES-Typs oder dergleichen...) oder auch für ihre Aufrechterhaltung in der Wirtszelle erforderlich sind. Solche Elemente sind dem Fachmann bekannt.
Wie vorstehend angeführt, umfaßt ein erfindungsgemäßer Virusvektor eine Expressionseinheit, die ein oder mehrere Virusgene umfaßt und das interessante Merkmal aufweist, daß sie in einer Komplementationszelle funktionsfähig und in einer Wirtszelle nicht funktionsfähig ist. Unter "funktionsfähig" ist eine Expression der Virusgene in ausreichender Menge und während einer ausreichend langen Zeit zu verstehen, damit die Bildung eines infektiösen Viruspartikels ermöglicht wird. Unter "nicht funktionsfähig" ist eine verringerte Expression der Virusgene (vorzugsweise um mindestens einen Faktor 10, wenn nicht sogar 0) im Vergleich mit ihrem Expressionsniveau in dem Stammvirus zu verstehen. Das Funktionsfähigkeits-Merkmal manifestiert sich durch die Erzeugung der Produkte der in der Expressionseinheit eingeschlossenen Virusgene, wobei diese durch die herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie, der Immunologie, der Biochemie oder Enzymologie nachgewiesen werden können. Das Nicht-Funktionsfähigkeits-Merkmal zeigt sich durch das Fehlen einer Erzeugung oder auch die Erzeugung der Virusprodukte in abgeschwächtem Maß.
So umfaßt die Expressionseinheit eine oder mehrere heterologe Regulationssequenz(en), die in der viralen Stamm-DNA nicht vorhanden ist (sind). Es kann auf Sequenzen zurückgegriffen werden, die auf einen Regulator des Repressor-Typs, der negativ auf die Expression einwirkt, oder vorzugsweise auf einen Regulator des Induktor-Typs ansprechen, der eine positive Wirkung ausübt. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Regulationssequenz kann beliebigen viralen, prokaryontischen oder auch eukaryontischen Ursprungs sein. Ganz allgemein sind die Regulationssequenzen in der dem Fachmann zugänglichen Literatur beschrieben. Es kann sich auch um ein Homolog handeln, dessen Sequenz in bezug auf die native Sequenz modifiziert ist, die jedoch eine ähnliche oder verbesserte Regulationsfunktion ausübt. Diese Modifikationen können sich aus der Addition, der Deletion und/oder dem Ersatz eines oder mehrerer Nukleotide ergeben.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine Regulationssequenz in der Lage, die Expression der Virusgene auf verschiedenen Niveaus zu modulieren: Transkription, Elongation, Transport, Stabilität der mRNA oder auch Translation. Sie kann an verschiedenen Stellen der Expressionseinheit vorliegen, beispielsweise in dem Promotor, insbesondere wenn sich ihre Wirkung auf dem Niveau der Transkription (vorzugsweise stromaufwärts der TATA-Box bis zu mehreren Hundert Basenpaaren von derselben) befindet, oder in den transkribierten (und, falls möglich, nicht-codierenden) Sequenzen, wenn sich ihre Wirkung in einem späteren Schritt der Transkription auswirkt. Es können 1 bis 25 Regulationssequenzen, vorteilhaft 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 und besonders bevorzugt 1 bis 7 eingesetzt werden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Induktor" ein Molekül, das die Fähigkeit besitzt, die Expression der Virusgene zu initiieren zu oder aktivieren, welche unter die Abhängigkeit einer Regulationssequenz gestellt sind, entweder direkt durch Verbindung mit der Regulationssequenz oder indirekt mit Hilfe anderer Zell- oder Virusfaktoren. Es kann auch die Wirkung eines Repressors verhindern. Im Gegenteil dazu hat ein "Repressor" die Fähigkeit, die Expression der Virusgene unter der Abhängigkeit einer Regulationssequenz, auf die er einwirkt, entweder direkt oder indirekt zu inhibieren oder zu blockieren.
Diese Definitionen können durch das Beispiel des Lactose-Operons (lac) veranschaulicht werden. Das Gen lacl codiert für einen Repressor, der sich an eine kurze Regulationssequenz, als "Operator" bezeichnet, anheftet und somit die Transkription der Strukturgene, die für die Enzyme der metabolischen Kette der Lactose codieren, verhindert. In Anwesenheit des Induktors heftet sich dieser an den Repressor und wandelt diesen in eine inaktive Form um, welche sich nicht mehr mit dem Operator verbinden kann, wodurch die Transkription abgewickelt werden kann.
Es ist auch möglich, Abschnitte oder Analoga dieser Regulatoren zu verwenden, um deren Wirksamkeit zu verbessern oder deren Spezifität zu modifizieren (beispielsweise Anhydrotetracyclin, das zehnmal wirksamer ist als Tetracyclin, um die Transkription ausgehend von einem Promotor zu inhibieren, welcher die Regulationssequenzen umfaßt, die von dem Tetracyclin-Operon oder dem reversen Transaktivator abstammen, der vor kurzem von Gossen et al., 1995, Science, 268, 1766-1769 beschrieben wurde). Überdies kann ein Regulator, der bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ein Hybridprotein sein, das aus der Fusion von Polypeptiden verschiedener Ursprünge abstammt. Eine bevorzugte Kombination besteht aus einem Polypeptid, das in der Lage ist, eine Regulationssequenz zu erkennen oder zu binden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, (beispielsweise abgeleitet von dem Tetracyclin-Repressor (tet R) oder Östrogen ER) und einem Polypeptid, das in der Lage ist, die Expression zu aktivieren (beispielsweise der Aktivierungsbereich der Proteine Gal4 oder VP16, die mit den Transkriptionsfaktoren wechselwirken können).
Die nachfolgende Tabelle 1 nennt einige der Regulationssequenzen und Regulatoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können:
*Die Insertionsstelle hat nur hinweisenden und nicht einschränkenden Charakter.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Regulationssequenzen verwendet, die von dem Tetracyclin-Bakterienoperon abgeleitet sind und in der Literatur als "Operator" (tet O) bezeichnet werden. Ganz allgemein wird das Operon der Resistenz gegen Tetracyclin durch das Transposon Tn10 codiert (Hillen et al., 1984, J. Mol. Biol. 172, 185-201). Die Regulation wird durch eine kurze Nukleotidsequenz, die als "Operator" (tet O) bezeichnet wird, gewährleistet, die eine Fixierungsstelle für verschiedene Regulatoren bildet. So verringert die Fixierung des Tetracyclin-Repressors (tet R) oder des Tetracyclin-Antibiotikums wesentlich das Transkriptionsniveau. Hingegen wird ein Aktivierungseffekt erzielt, wenn ein Protein eingesetzt wird, das in der Literatur als "Tetracyclin-Transaktivator" (tTA) bezeichnet wird und aus der Fusion zwischen dem tet R und den 130 C-terminalen Aminosäuren des Aktivierungsbereichs des Proteins VP16 des Herpes-Simplex-Virus resultiert. Gossen und Boujard (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551) zeigten vor kurzem auf, daß dieses Regulationssystem in den eukaryontischen Zellen funktionsfähig ist. Die Expression eines Reportergens, das unter die Kontrolle mehrerer Kopien von tet O stromaufwärts von Basensequenzen der Transkription gestellt ist (TATA-Box, Initiationsstelle der Transkription..), ist durch Co-Expression des tTA nachweisbar und wird durch Zugabe von Tetracyclin inhibiert. Was die Gruppe von Kim (1995, J. Virol. 69, 2565-2573) betrifft, so verwendet sie die Sequenzen tet O, die stromaufwärts der TATA-Box eines Promotors angeordnet sind, und in diesem Fall wird die Transkription durch Wirkung von tet R inhibiert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ganz besonders die Kombination "tet O - Minimalpromotor" (in Richtung 5' nach 3') bevorzugt, die zu einem Promotor führt, dessen Basisniveau der Transkription von Natur aus sehr gering, aber durch den Induktor tTA aktivierbar und durch Tetracyclin unterdrückbar ist. Jedoch es ist auch möglich, einen Promotor zu verwenden, bei dem die Sequenzen tet O in 3' der "TATA-Box" oder auch beiderseits derselben angeordnet sind und der durch einen Repressor unterdrückbar ist, der die Sequenzen von tet R umfaßt, welche tet O erkennen.
Wenn es sich um die bevorzugte Variante handelt, wird der erfindungsgemäße Adenovirusvektor vorzugsweise aus dem Genom eines Adenovirus zusammengesetzt, bei dem die gesamte oder ein Teil der Region E1 und alternativ die gesamte oder ein Teil der Region E3 fehlt. Vorteilhaft wird die Konservierung eines Teils der Region E3 und insbesondere des Teils bevorzugt, der dem für gp19k codierenden Gen entspricht (Gooding und Wold, 1990, Criticai Reviews of Immunology 10, 53-71), wobei dieser Teil nicht in einer Expressionseinheit eingeschlossen ist, wie vorstehend definiert, sondern unter die Kontrolle eines konventionellen homologen (E3) oder heterologen Promotors gestellt ist. Es versteht sich, daß andere Modifikationen vorgenommen werden können, insbesondere des Virusgenoms in der Region E4 oder E2. Es kann interessant sein, zusätzliche Deletionen oder Mutationen einzuführen. Um diesen Punkt zu erläutern, kann die thermoempfindliche Mutation genannt werden, die das Gen DBP (für DNA Binding Protein auf Englisch) der Region E2A betrifft (Ensinger und Ginsberg, 1972, J. Virol. 10, 328-339).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßer Adenovirusvektor eine Expressionseinheit, die ein oder mehrere Virusgene der Regionen E2, E4 oder L1-L5 umfaßt. Eine interessante Variante besteht darin, von der Region E4 nur die Sequenzen beizubehalten, die für die ORFs 3, 6 und/oder 7 codieren (diese begrenzten Deletionen der Region E4 erfordern keine Komplementation der Funktion E4; Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048).
Es kann auch interessant sein, über einen Adenovirusvektor zu verfügen, der mehrere Expressionseinheiten umfaßt, wobei alle Kombinationen vorstellbar sind (E2 und E4, E2 und L1-L5, E4 und L1-L5 oder E2, E4 und L1-L5). Es werden dann Regulationssequenzen gewählt, die auf die gleiche Weise wirken, vorzugsweise positiv (beispielsweise TAR, RRE, tet O...). Aus Gründen der einfacheren Durchführung wird der Fall bevorzugt, in dem die Einheiten identische Regulationssequenzen tragen, die es ermöglichen, den Adenovirusvektor in einer Komplementationslinie zu vermehren, die nur einen einzigen Induktor umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch ein infektiöses Viruspartikel sowie eine eukaryontische Wirtszelle, die einen erfindungsgemäßen Adenovirusvektor umfaßt. Diese Wirtszelle ist vorteilhaft eine Säugerzelle und vorzugsweise eine menschliche Zelle und kann den Vektor in in das Genom integrierter oder nicht integrierter Form (Episom) umfassen. Es kann sich um eine Primär- oder Tumorzelle hämatopoietischen Ursprungs (totipotente Stammzelle, Leukozyt, Lymphozyt, Monozyt oder Makrophage...), muskulären, pulmonalen, hepatischen, epithelialen oder fibroblastischen Ursprungs handeln.
Überdies entwickelten die Erfinder eine Komplementationszelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie einen Induktor und/oder einen Repressor (Regulator) umfaßt. Je nach Bedarf kann dieser dem Kulturmedium zugesetzt oder von der Zelle selbst auf stabile oder vorübergehende Weise erzeugt werden. Diese Komplementationszelle kann durch Einführung eines DNA-Fragments, das für diesen Regulator codiert, modifiziert werden. Alle Standardmittel zur Einführung einer Nukleinsäure (synthetischer Vektor, Virusvektor, Plasmid, reine DNA...) in eine Zelle können verwendet werden, wie beispielsweise die Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion, Adsorption und Fusion von Protoplasten. Im Rahmen der Erfindung kann es interessant sein, eine Komplementationszelle zu erzeugen, die nur einen einzigen Regulator und insbesondere einen Induktor erzeugt. Allerdings kann es auch vorteilhaft sein, über Zellen zu verfügen, die mehrere Induktoren erzeugen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist eine solche Komplementationszelle in der Lage, in trans einen erfindungsgemäßen Virusvektor und insbesondere einen Adenovirusvektor zu komplementieren. In diesem Zusammenhang wird vorzugsweise eine Komplementationszelle für die Funktion E1 und/oder E4 gewählt. Deshalb kann angenommen werden, daß dieser Zelltyp für die Komplementation eines Adenovirusvektors der zweiten Generation bestimmt ist, welcher bezüglich der Funktion E1 und einer weiteren Adenovirusfunktion (spät oder früh) defekt ist. Eine solche Zelle umfaßt die gesamte oder einen Teil der Region E1 eines Adenovirus, deren Expression durch einen beliebigen Promotor kontrolliert wird, und die gesamte oder einen Teil einer Adenovirus-Region, die von der Region E1 verschieden ist und unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist, der mit Regulationssequenzen versehen ist, beispielsweise an seinem 5'-Ende mit mindestens einer und vorzugsweise einer bis 20 Sequenz(en) tet O, die durch den Transaktivator tTa aktivierbar ist (sind). Eine interessante Variante besteht in einem Minimalpromotor, der von dem Virus CMV (Cytomegalovirus) abgeleitet ist, wobei sich stromabwärts desselben7 Sequenzen tet O in einer Kopf-Schwanz-Orientierung befinden. Der Induktor kann in die Komplementationszelle, wie oben beschrieben, vor, gleichzeitig oder nach den Adenovirussequenzen eingeführt werden, die unter die Kontrolle der Sequenzen tet O gestellt sind, oder er kann, wie oben angeführt, dem Kulturmedium zugesetzt werden. Es kann auch daran gedacht werden, den Induktor (beispielsweise tTA) in der Komplementationszelle zu exprimieren und den Repressor (beispielsweise Tetracyclin) dem Kulturmedium zuzusetzen, wenn die Expression der Adenovirusgene nicht mehr gewünscht wird.
Als bevorzugte Beispiele wird die Adenovirusregion mit Ausnahme der Region E1 gebildet aus:
(i) der gesamten oder einem Teil der Region E4 und insbesondere den Sequenzen, die für die offenen Leserraster 6 und 7 (ORFs 6/7) dieser letztgenannten codieren, oder auch
(ii) der gesamten oder einem Teil der Region E2 und insbesondere den Sequenzen, die für das Protein DBP (DNA Binding Protein) oder eine thermoempfindliche Mutante dieses letztgenannten codieren.
Natürlich kann eine solche Komplementationszelle ferner eine dritte Adenovirusregion umfassen, deren Expression unter die Kontrolle der entsprechenden Elemente gestellt ist. In dieser Hinsicht ist eine bevorzugte Zelle zur Komplementation eines Adenovirusvektors vorgesehen, der bezüglich aller frühen Funktionen, die für die Replikation erforderlich sind, defekt ist und die gesamten oder einen Teil der Regionen E1, E2 und E4 umfaßt, wobei die eine oder andere dieser beiden letztgenannten Regionen oder beide unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist (sind), der mit (einer) Regulationssequenz(en), wie oben definiert, versehen ist.
Einer der Vorteile dieser Komplementationszelle besteht darin, daß sie die Erzeugung eines hohen Titers von infektiösen Viruspartikeln aus einem konventionellen oder erfindungsgemäßen Virusvektor ermöglicht. Der Virustiter des Endpräparats (nach der Reinigung) ist vorzugsweise höher als 5 · 10&sup8; pfu/ml, vorzugsweise höher als 5 · 10&sup9; pfu/ml und auf besonders bevorzugte Weise höher als 5 · 10¹&sup0; pfu/ml. Unter pfu ist ein Partikel zu verstehen, das in der Lage ist, eine Plaque durch Infektion von permissiven Zellen zu bilden. Die Techniken zur Auswertung der pfu-Zahl sind konventionell und dem Fachmann bekannt. Es kann die Agar-Technik genannt werden (Graham und Prevec, 1991, oben). Im allgemeinen ist der Virustiter in pfu/ml gleich oder kleiner als die tatsächliche Anzahl von infektiösen Viruspartikeln, die in der Lage sind, ihre Genüberfragungsfunktion zu erfüllen. Ein gewisser Prozentsatz ist nämlich nicht in der Lage, sich wirksam zu vermehren und somit Lyseplaques auf permissiven Zellen zu erzeugen. Der Titer an infektiösen Viruspartikeln, der durch die oben erwähnte Komplementationszelle erzeugt wird, ist vorzugsweise höher als 5 · 10&sup9; ifu/ml, vorteilhaft höher als 1 · 10¹&sup0; ifu/ml und auf besonders bevorzugte Weise höher als 5 · 10¹&sup0; ifu/ml und auf noch mehr bevorzugte Weise höher als 5 · 10¹¹ ifu/ml. Unter ifu ist ein infektiöses Partikel zu verstehen, das in der Lage ist, eine nicht permissive Zielzelle zu infizieren und sein Genom zu transferieren und die Expression der Gene, die von letztgenanntem getragen werden, zu ermöglichen. Die ifu-Zahl wird durch die Anzahl von Zielzellen bestimmt, die das interessierende Gen oder ein Virusgen exprimieren. Der Fachmann kennt die Techniken, die für den Nachweis ihrer Expression einzusetzen sind: Immunfluoreszenz, Western-Blot oder auch Anfärbung... Wenn beispielsweise das interessierende Gen von dem Gen LacZ gebildet wird, kann das Protein β-Galaktosidase durch Anfärbung mit X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-Dgalaktopyranosid) sichtbar gemacht werden, und es wird die Anzahl von blauen Zellen gezählt. Wenn das therapeutische Gen CFTR verwendet wird, kann das Expressionsprodukt durch Western-Blot sichtbar gemacht werden. Es können mit Hilfe spezifischer Antikörper auch die Zellen gesucht werden, die die Adenovirusproteine DBP-Penton oder -Faser exprimieren.
Eine Komplementationszelle, wie oben definiert, kann aus verschiedenen Zellinien durch Transfektion von geeigneten Abschnitten des Adenovirusgenoms und eines DNA-Fragments, das für einen Regulator codiert, erzeugt werden. Unter den möglichen Zellinien können die Nierenzellinien Vero (Affe), BHK (Hamster), MDCK (Hund), MBDK (Rind), die Linie CHO (Hamster) oder auch die menschlichen Zellinien (HeLa, A549, MRCS, WI38...) genannt werden, die in den Sammlungen, wie beispielsweise ATCC (Rockville, USA), verfügbar sind. Jedoch ist eine besonders gut geeignete Zelle die Linie 293. Es kann auch die Verwendung von Primärlinien in Betracht gezogen werden, wie beispielsweise Primärzellen der menschlichen Netzhaut.
Ein erfindungsgemäßes infektiöses Viruspartikel kann gemäß jeder konventionellen Technik dieses Fachgebiets hergestellt werden (Graham und Prevect, 1991, oben), beispielsweise durch Co- Transfektion eines Vektors und eines Adenovirusfragments in eine geeignete Zelle oder auch mit Hilfe eines Hilfsvirus, das in trans die nicht funktionsfähigen Virusfunktionen liefert. Es ist auch denkbar, den Virusvektor in vitro in Escherichia coli (E. colr) durch Ligation oder auch durch homologe Rekombination zu erzeugen (siehe beispielsweise die französische Patentanmeldung 2 727 689 (94 14470)).
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen Viruspartikels, das einen erfindungsgemäßen Virusvektor umfaßt, gemäß welchem:
(i) der Virusvektor in eine Komplementationszelle eingeführt wird, die in der Lage ist, diesen Vektor in trans zu komplementieren, um eine transfizierte Komplementationszelle zu erhalten,
(ii) die transfizierte Komplementationszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, um die Expression der Virusgene und die Erzeugung des infektiösen Viruspartikels zu ermöglichen, und
(iii) das infektiöse Viruspartikel in der Zellkultur gewonnen wird.
Natürlich kann das infektiöse Viruspartikel aus dem Kulturüberstand gewonnen werden, aber auch aus den Zellen. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform werden ein Adenovirusvektor und eine Komplementationszelle, wie vorstehend beschrieben, verwendet. Nach einer weiteren Variante kann auf eine konventionelle Komplementationszelle zurückgegriffen werden. Es kann erforderlich sein, dem Kulturmedium einen Induktor zuzusetzen, falls die Expressionseinheit aktivierbare Regulationssequenzen umfaßt. Die zu verwendende Menge hängt von der Art des Induktors selbst ab. Der Fachmann kann natürlich die optimale Konzentration in Abhängigkeit von den spezifischen Gegebenheiten anpassen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen Viruspartikels, das einen konventionellen Virusvektor umfaßt, der die oben erwähnte Komplementationszelle verwendet. Als Beispiel ermöglicht es die Einführung eines Virusvektors, der bezüglich der Funktionen E1 und E4 (E1- E4-) defekt ist, in eine Zelle 293, welche (i) die ORFs 6/7 der Region E4 unter der Kontrolle eines Minimalpromotors, der an seinem 5'-Ende mit 7 Sequenzen tet O versehen ist, und (ii) den Transaktivator tTA exprimiert, der von demselben Promotor gesteuert wird, Viruspartikel zu erzeugen, die replikationsdefizient, aber gegenüber einer Wirtszelle infektiös sind.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als therapeutischen oder prophylaktischen Wirkstoff einen Virusvektor, ein infektiöses Viruspartikel, eine Komplementationszelle oder eine eukaryontische Wirtszelle gemäß der Erfindung in Verbindung mit einem unter pharmazeutischen Gesichtspunkten annehmbaren Träger umfaßt. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist insbesondere für die Präventiv- oder Kurativbehandlung von Krankheiten bestimmt, wie beispielsweise:
- genetischen Erkrankungen (Hämophilie, Mucoviszidose, Diabetes oder Myopathie, Duchenne- und Becker-Form),
- Krebsen, wie jenen, die durch Onkogene oder Viren induziert werden,
- Viruserkrankungen, wie beispielsweise die Hepatitis B oder C und AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom nach Infektion mit HIV), und
- wiederkehrenden Viruserkrankungen, wie die durch das Herpesvirus hervorgerufenen Virusinfektionen.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf konventionelle Weise hergestellt werden. Insbesondere wird eine therapeutisch wirksame Menge eines therapeutischen oder prophylaktischen Wirkstoffes mit einem Träger, wie beispielsweise einem Verdünnunsmittel, verbunden. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf lokalem, systemischem Weg oder durch Aerosol verabreicht werden, insbesondere auf intragastrischem, subkutanem, intrakardialem, intramuskulärem, intravenösem, intraperitonealem, intratumoralem, intrapulmonalem, intranasalem oder intratrachealem Weg. Die Verabreichung kann in einer Einzeldosis oder in ein- oder mehrmals wiederholten Dosen nach einem gewissen Zeitabstand erfolgen. Die geeignete Art der Verabreichung und der Dosierung variieren in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern, beispielsweise dem zu behandelnden Individuum oder der zu behandelnden Krankheit oder auch von dem bzw. den zu transferierenden jeweiligen Gen(en). Insbesondere können die erfindungsgemäßen Viruspartikel in Form von Dosen zwischen 10&sup4; und 10¹&sup4; ufp (Plaque-bildenden Einheiten), vorteilhaft zwischen 10&sup5; und 10¹³ ufp und vorzugsweise zwischen 10&sup6; und 10¹¹ ufp formuliert werden. Die Formulierung kann auch ein Adjuvans oder einen Träger einschließen, der unter pharmazeutischen Gesichtspunkten annehmbar ist.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die therapeutische oder prophylaktische Verwendung eines Virusvektors, eines infektiösen Viruspartikels, einer Komplementationszelle oder einer eukaryontischen Wirtszelle gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers vorzugsweise durch Gentherapie bestimmt ist. Gemäß einer ersten Möglichkeit kann das Medikament direkt in vivo verabreicht werden (beispielsweise durch intravenöse Injektion, Injektion in einen zugänglichen Tumor, durch Aerosol in die Lungen...). Es kann auch der ex vivo Zugang gewählt werden, der darin besteht, Zellen des Patienten zu entnehmen (Stammzellen des Knochenmarks, Lymphozyten des peripheren Blutes, Muskelzellen...), diese gemäß den bekannten Techniken in vitro zu transfizieren oder zu infizieren und dem Patienten wieder zu verabreichen. Falls eine Expressionseinheit Regulationssequenzen umfaßt, die auf einen Repressor ansprechen, kann die Verabreichung des Repressors in Betracht gezogen werden, um die Expression der Virusgene zu blockieren oder zu begrenzen (vorherige, begleitende oder spätere Verabreichung des Repressors oder Co-Expression über konventionellen Vektoren).
Die Erfindung erstreckt sich auch auf eine Behandlungsmethode, nach der eine therapeutisch wirksame Menge eines Virusvektors, eines Viruspartikels, einer eukaryontischen Wirtszelle oder einer erfindungsgemäßen Komplementationszelle einem Patienten verabreicht wird, der eine solche Behandlung benötigt.
Die vorliegende Erfindung wird vollständiger unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und mit Hilfe der folgenden Beispiele beschrieben.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Genoms des menschlichen Adenovirus des Typs 5 (in willkürlichen Einheiten von 0 bis 100 dargestellt), welche die Anordnung der verschiedenen Gene zeigt.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG4673, der die konstitutive Expression des tTA, der von dem Promotor CMV (pCMV) gesteuert wird, und des Selektionsgens pac (Resistenz gegen Puromycin) unter der Kontrolle des Promotors SV40 ermöglicht.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung des Adenovirusvektors pTG4696, der eine Expressionskassette der ORFs 6 und 7 der durch den tTA aktivierbaren Region E4 umfaßt.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG8343, der einen Teil des 5'-Endes des Genoms des Adenovirus 5 umfaßt.
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG4662, eines rekombinanten Adenovirusvektors der ersten Generation, bei dem das Wesentliche der Regionen E1 und E3 deletiert ist. Die rekombinante Kassette ist aus dem Adenoviruspromotor MLP (Ad2), gefolgt von dem Bakteriengen LacZ, das für β-Galaktosidase codiert, und dem Polyadenylierungssignal (pA) des Virus SV40 aufgebaut.
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG4682, eines Adenovirusvektors, bei dem das Wesentliche der Regionen E1 und E3 deletiert ist und der eine Kassette der konstitutiven Expression des tTA umfaßt.
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG4683, eines Adenovirusvektors, bei dem das Wesentliche der Regionen E1, E3 und E4 deletiert ist und der eine Kassette der konstitutiven Expressions des tTA umfaßt.
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG4675, der die Expression des tTA auf induzierbare Weise ermöglicht (unter der Kontrolle des Minimalpromotors CMV (-53 bis +1), dem 7 Kopien der Sequenz tet O vorangehen, in der Figur als tet O - CMVi angezeigt).
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG4684, eines Adenovirusvektors, bei dem das Wesentliche der Regionen E1 und E3 deletiert ist und der eine Kassette der induzierbaren Expression des tTA umfaßt.
Fig. 10 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG4685, eines Adenovirusvektors, bei dem das Wesentliche der Regionen E1, E3 und E4 deletiert ist und der eine Kassette der induzierbaren Expression des tTA umfaßt.
Fig. 11 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG5606, der die Expression der ORFs 6/7 der Adenovirusregion E4 und des tTA unter der Kontrolle des Minimalpromotors CMV ermöglicht, dem 7 Kopien der Sequenzen tet O und das Selektionsgen pac vorangestellt sind, das die Resistenz gegen Puromycin verleiht.
Fig. 12 ist eine Analyse nach Western-Blot der Expression des Proteins DBP in den Zellen 293, die vorübergehend mit dem Vektor pTG9579 transfiziert und in Anwesenheit (+) und Abwesenheit(-) von Tetracyclin kultiviert wurden.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele veranschaulichen nur eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die nachstehend beschriebenen Konstruktionen werden gemäß den allgemeinen Techniken der Gentechnik und des molekularen Klonierens, die in Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) im Detail angeführt sind, oder gemäß den Herstellerempfehlungen durchgeführt, wenn ein handelsübliches Kit verwendet wird. Die Schritte des Klonierens, die Bakterienplasmide verwenden, werden im Stamm E coli 5K (Hubacek und Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50, 111-127) oder BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) durchgeführt. Dieser letztgenannte Stamm wird vorzugsweise für die Schritte der homologen Rekombination verwendet. Die Amplifikationstechniken durch PCR sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise PCR Protocols - A guide to methods and applications. 1990, herausgegeben von Inis, Gelfand, Sninsky und White, Academic Press Inc.). Wenn es um die Reparatur der Restriktionsstellen geht, besteht die verwendete Technik in einer Auffüllung der hervorstehenden 5'-Enden mit Hilfe des großen Fragments der DNA Polymerase I von E. coli (Klenow).
Was die Zellbiologie betrifft, werden die Zellen gemäß den dem Fachmann gut bekannten Standardtechniken transfiziert. Es kann die Technik mit Calciumphosphat (Maniatis et al., oben) erwähnt werden, jedoch kann jedes andere Protokoll ebenfalls verwendet werden, wie beispielsweise die Technik mit DEAE-Dextran, die Elektroporation, die Methoden, die auf osmotischen Schocks basieren, die Mikroinjektion oder die Methoden, die auf, der Verwendung von Liposomen basieren. Was die Kulturbedingungen betrifft, so sind sie herkömmlich.
In den nachfolgenden Beispielen wird auf die folgenden Zellinien zurückgegriffen:
Linie 293, die von menschlicher embryonaler Niere abgeleitet ist (Graham et al., 1977, oben) und aus der Integration des 5'-Endes des Genoms von Ad5 in ihre Chromosomen resultiert, (ITR5', Enkapsidationsregion und Region E1) (verfügbar bei ATCC unter der Referenz CRL1573).
Linie TG1653 (beschrieben in der internationalen Anmeldung WO94/28152, Beispiel 8), die von der Linie 293 abstammt, welche auf stabile Weise durch das Plasmid pTG1653 transformiert wurde, das die Region E4 von Ad5 (Nt 32800 bis 35826) und die Expressionskassette des Selektionsgens pac trägt.
Es versteht sich, daß andere Zellinien verwendet werden können.
Im übrigen sind die Fragmente des Adenovirusgenoms, die bei den verschiedenen nachstehend beschriebenen Konstruktionen verwendet werden, genau nach ihrer Position in der Nukleotidsequenz des Genoms von Ad5 angegeben, wie es in der Datenbank Genebank unter der Referenz M73260 angeführt ist.

BEISPIEL 1: Komplementationslinie, die einen Induktor exprimiert, der in der Lage ist, die Expression der Adenovirusgene zu aktivieren

Dieses Beispiel beschreibt die Bildung (1) einer Komplementationslinie, die von der Linie 293 abstammt und in der Lage ist, auf konstitutive Weise das trans-aktivierende Protein tTA zu exprimieren, und (2) eines Adenovirusvektors, bei dem gewisse Virusgene der Region E4 unter die Kontrolle der Sequenzen tet O, die auf tTA ansprechen, gestellt wurden. Auf die Transfektion des Vektors in die Linie folgt die Bildung von Viruspartikeln, da die Funktionen E1 und E4 durch die Hinzufügung der Expressionsprodukte der Adenovirusregion E1 und des tTA trans-komplementiert werden. In den infizierten Wirtszellen, die das chimäre Protein tTA nicht natürlich produzieren, ist die Expression von E4 und folglich auch der späten Proteine (Expression abhängig von E4) beträchtlich verringert, wodurch die Probleme der Zellimmunität und der Entzündung begrenzt werden.

1. Bildung einer Komplementationslinie, die den Transaktivator fTA exprimiert

Zuerst wird der Vektor pTG6529 konstruiert, der die Selektion der transformierten Zellen durch Puromycin ermöglicht. Der Vektor resultiert aus der Klonierung einer Expressionskassette, die aus dem Promotor SV40, dem Gen pac, gefolgt vom polyA-Signal des Virus SV40, zusammengesetzt ist, in ppolyIII-I* (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). Eine solche Konstruktion liegt im Aufgabenbereich des Fachmannes auf Basis der in der Literatur beschriebenen entsprechenden Sequenzen (Morgenstern und Land, 1990, Nucleic Acid Res. 18, 3587-3596; Genebank Referenz J02400).
Parallel dazu wird der Vektor pUHD1 5-1 (Gossen und Bujard, 1992,oben) von den Enzymen Sspl und Hpal verdaut. Das Fragment, das die für tTA codierenden Sequenzen umfaßt, denen der Promotor CMV vorangeht, wird zwischen die gleichen Stellen des pTG6529 kloniert, was pTG4673 zu ergibt (Fig. 2).
Der Vektor pTG4673 wird auf konventionelle Weise in die Zellen 293 transfiziert. Natürlich hätte man auch einene Expressionsvektor des tTA und ein Selektionsvektor (beispielsweise puHD15-1 und pTG6529) transfizieren können. Nach der Transfektion werden die Zellen in einem selektiven Medium (1 ug/ml Puromycin) kultiviert. 80 resistente Klone wurden isoliert, und unter ihnen wurden 35 auf ihre Fähigkeit getestet, ein Markergen zu trans-aktivieren, dessen Expression von den Sequenzen tet O kontrolliert wird. Aus Gründen der einfacheren Durchführung und der Dosierungsempfindlichkeit fiel die Wahl auf das Luciferase-Gen.
Man verwendet den Reporter-Vektor pUHC13-3 (Gossen und Bujard, 1992, oben), in dem die für die Luciferase codierenden Sequenzen unter die Kontrolle des Minimalpromotors CMV gestellt sind, dem 7 Kopien von tet O vorangehen. Der Test erfolgt durch vorübergehende Transfektion in die zu testenden Klone. Zwei Tage später wird die Luciferase-Aktivität der Zellextrakte bewertet, indem ein von Promega vertriebenes Kit ("Luciferase Assay System") und für die Messung der Proben ein Szintillationszähler (LS 50000 TD, Beckmann) verwendet werden. Die Dosierung stellt sich für 10 der ausgewerteten Klone als positiv heraus, was bedeutet, daß sie ein funktionsfähiges tTA-Produkt erzeugen, das in der Lage ist, die Sequenzen tet O zu erkennen und die Expression der unter deren Kontrolle gestellten Gene zu aktivieren.

2. Aufbau eines Adenovirus, dessen Expression der Gene E4 durch tTA induzierbar ist

Wie vorstehend erwähnt, ist die Expression der für die ORFs 6 und 7 der Region E4 codierenden Gene ausreichend, um die Virusreplikation ohne Notwendigkeit der Komplementation zu gewährleisten. Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Adenovirusvektors, bei dem die Regionen E1 und E3 und einen Teil von E4 deletiert sind, mit Ausnahme der für die ORFs 6 und 7 codierenden Sequenzen, deren Expression unter die Kontrolle von tet O gestellt wurde und aus diesem Grund in Anwesenheit des tTA stimuliert wird.
Der Vektor pUHD10-3 geht aus der Klonierung eines Fragments XhoI-EcoRI, das 7 Kopien tet O und den Minimalpromotor CMV trägt (Position -53 in bezug auf die Initiationsstelle der Transkription: siehe Gossen und Bujard, 1992, oben) in das Plasmid pBR322 hervor. Nach der Verdauung mit BamHI (Stelle, die sich stromabwärts der Promotorregion befindet) wird das BglII-BamHI-Fragment insertiert, das aus pTG1653 erhalten wurde und die für die ORFs 6 und 7 codierenden Sequenzen trägt, was pTG4658 ergibt.
Der Vektor pTG4664 resultiert aus der Klonierung des Adenovirusfragments KpnI-HpaI (Nukleotide 25 838 bis 32 004) zwischen die KpnI-SmaI-Stellen von ppoly II (Lathe et al., 1987, oben), in dem vorher der Stelle BgAI beseitigt wurde. Sodann erfolgt die Deletion eines Großteils von E3 (Nukleotide 27871 bis 30748) durch Enzymverdauung (Hpal-HincIlll).
Das Fragment Xhol-Hpal, das die Kassette der regulierten Expression der ORFs 6 und 7 trägt, wird aus pTG4658 isoliert und nach Klenow-Einwirkung in den Vektor pTG4664 insertiert, der mit BgAI verdaut und nach Klenow behandelt wurde, was pTG4668 und pTG4669, je nach Orientierung der Kassette, ergibt. Diese wird durch homologe Rekombination in einen Adenovirusvektor eingeführt. Zu diesem Zweck wird der rekombinante Vektor pTG4663 verwendet, der von einem Vektor der zweiten Generation abstammt (bei dem die Regionen E1 und E4, die für die Replikation erforderlich sind, und die nicht wesentliche Region E3 deletiert sind (Deletion der Nukleotide 27 871 bis 30 748); beschrieben im Bespiel 4 der internationalen Patentanmeldung WO 94/28152), in den die Expressionskassette "Promotor MLP-Gen LacZ pA SV40" an Stelle der Region E1 kloniert wurde. E. coli-Zellen werden durch pTG4668 oder pTG4669, durch HindIII gespalten, und den Virusvektor pTG4663 co-transformiert, der mit Spel linearisiert wurde, um pTG4696 (Fig. 3) und pTG4697 zu erzeugen.
Weitere Adenovirusvektoren ähnlichen Typs können erzeugt werden. Beispielsweise kann man ins Auge fassen, die Gene der Region E2 unter die Kontrolle der Sequenzen tet O zu stellen. Der Fachmann kennt die Techniken der Molekularbiologie, die es ermöglichen, den Promotor E2 durch einen regulierbaren Promotor zu ersetzen, wie beispielsweise jenen, der aus dem Vektor pUHD1 0-3 isoliert wird, oder die Sequenzen stromaufwärts der TATA-Box des Promotors E2 zu beseitigen und an ihrer Stelle eine oder mehrere Kopien (vorzugsweise 7) der Sequenzen tet O einzuführen. Es ist auch möglich, regulierte Vektoren mit mehreren Niveaus zu konstruieren, beispielsweise durch Insertion von tet O stromaufwärts der TATA-Box der Promotoren, die die Expression der Virusgene von E2, E4 und/oder MLP steuern.

3. Erzeugung von Viruspartikeln

Der Virusvektor pTG4696 oder pTG4697 wird in einen der 10 Klone des Beispiels 1, die tTA erzeugen, transfiziert. Die Zellen sind in der Lage, die Funktion E1 zu komplementieren und tTA zu erzeugen, der die Expression der ORFs 6 und 7 aktiviert, was die Bildung von Viruspartikeln ermöglicht. Es wird ein Vorrat gebildet, der es sodann ermöglicht, die Zielzellen mit einer festgelegten m.o.i. (Multiplizität der Infektion) zu infizieren, die von 0,1 bis 100 variieren kann.

BEISPIEL 2: Aufbau der Komplementationszellinie 4677 für die Funktionen E1 und E4, wobei die Expression von E4 durch tTA induzierbar ist

Dieses Beispiel betrifft eine Komplementationslinie, die durch Transfektion der Zellen 293 durch einen Expressionsvektor der ORFs 6 und 7 von E4 erzeugt wurde, die unter die Kontrolle eines Minimalpromotors gestellt sind, welchem 7 Kopien von tet O vorangestellt sind. Die transfizierten Zellen sind in der Lage, die Funktionen E1 auf konstitutive Weise und E4 auf induzierbare Weise durch den tTA zu komplementieren. Dieser kann von einem defekten Adenovirusvektor oder einem herkömmlichen Expressionsvektor getragen werden.

1. Aufbau der Komplementationslinie

Das XhoI-BamHI-Fragment von pTG4658 (das die Kassette "tet O - Minimalpromotor CMV - ORFs 6 und 7" trägt) wird zwischen die Stellen SaA und BglII des Selektionsvektors pTG6529 insertiert, was pTG4677 ergibt, 60 resistente Klone wurden nach Transfektion in die Linie 293 und Selektion durch Puromycin erzeugt. Es können auf verschiedene Weisen Klone bestimmt werden, die eine optimale Komplementationsfähigkeit aufweisen.
Eine erste Methode besteht darin, auf vorübergehende Weise das Plasmid pUHD1 5-1 zu transfizieren, das den tTA auf konstitutive Weise exprimiert. Eine Analyse der Zellextrakte mit Hilfe von geeigneten Antikörpern durch Western-Blot ermöglicht es, die Menge an ORFs 6- und/oder 7- Polypeptiden auszuwerten, die in diesen Klonen erzeugt wurden, und somit ihre Fähigkeit, die Adenovirusfunktion E4 zu trans-komplementieren. Gemäß einer weiteren Methode kann ein defektes Adenovirus, das den tTA exprimiert, eingesetzt werden. Diese Methode wird nachstehend im Detail beschrieben.

2. Aufbau eines defekten Adenovirus, das den tTA auf konstitutive Weise exprimiert

Zwei Konstruktionslinien wurden ausgeführt: pTG4682 entsprechend dem Adenovirusgenom, bei dem das Wesentliche der Regionen E1 und E3 deletiert ist und das an Stelle der Region E1 eine Kassette zur konstitutiven Expression des tTA (Promotors CMV) umfaßt; bei pTG4683 ist ferner die Region E4 deletiert.
Es wird von dem Vektor pTG8343 ausgegangen, der aus der Insertion eines Teils des 5'-Endes des Adenovirusgenoms, nämlich der Sequenzen, die sich von den Nukleotiden 1 bis 458 und 3328 bis 5788 erstrecken (Fig. 4), in ppoly II hervorgeht (Lathe et al., 1987, oben). Nach Verdauung von pTG8343 mit BglII und Behandlung mit Klenow wird dieser mit dem SspI-HpaI-Fragment von pUHD 15-1 ligiert, das den Promotor CMV, gefolgt von den tTA-Sequenzen, trägt. Man erhält pTG4674, der dazu bestimmt ist, die Insertion der Kassette des tTA durch homologe Rekombination mit einem Adenovirusvektor zu ermöglichen, der homologe Sequenzen umfaßt. Zu diesem Zweck wird der Vektor pTG4662 (Fig. 5) ausgewählt, der ITR 5' und die Enkapsidationsssequenzen von Ad5 umfaßt (Nt 1 bis 458), eine Expressionskassette des Gens LacZ an Stelle der Region E1 und die restlichen Adenovirussequenzen umfaßt, bei denen die Region E3 deletiert ist (Nukleotide 3329 bis 27870 und 30749 bis 35935).
Der Stamm E. coli BJ wird mit den Vektoren pTG4662, linearisiert durch ClaI, und pTG4674, gespalten durch SgrAl und BstEII, co-transformiert, wodurch man pTG4682 erhält (Fig. 6). Dieses homologe Rekombinationsereignis ermöglicht einen Austausch der Kassette LacZ von pTG4662 gegen jene des tTA, die von dem Fragment getragen wird, das aus pTG4674 hervorgeht.
Der Vektor pTG4683 (Fig. 7) wird gemäß derselben Technologie durch homologe Rekombination in vitro zwischen pTG4663, gespalten durch ClaI, und pTG4674, verdaut von SgrAI und BstEII, erhalten. Der Vektor pTG4663 ist pTG4662 ähnlich, mit dem Unterschied, daß bei ihm das Wesentliche der Region E4 (Nukleotide 32994 bis 34998) deletiert ist.

3. Aufbau eines defekten Adenovirus, das tTA auf induzierbare Weise exprimiert

Um die Expression der Sequenzen tTA zu steuern, wird auf den Minimalpromotor CMV zurückgegriffen, der in 5' 7 Kopien der Sequenzen tet O umfaßt, was das System autoinduzierbar macht. Die Erzeugung einiger Moleküle von tTA aus dem nicht induzierten Promotor ermöglicht nämlich die Aktivierung des Systems. Wie vorher werden zwei Adenovirusvektoren pTG4684 und pTG4685 erzeugt, bei denen die Region E4 deletiert ist oder nicht.
Der Promotor CMV von pUHD15-1 wird gegen sein regulierbares, aus pUHDIO-3 in Form eines XhoI-EcoRI-Fragments isoliertes Homolog ausgetauscht. Man erhält pTG4659. Die Kassette wird aus diesem letztgenannten durch Verdauung mit Sspl und HpaI isoliert und in den Vektor pTG8343 kloniert, der mit BglII linearisiert und mit Klenow behandelt worden ist, was pTG4675 ergibt (Fig. 8). Der Stamm E. coli BJ wird dann durch den vorangehenden Vektor, behandelt mit SgrAl und BstEII, und pTG4662 oder pTG4663, linearisiert mit dem Enzym ClaI, co-transformiert, um durch homologe Rekombination die Virusvektoren pTG4684 (Fig. 9) und pTG4685 (Fig. 10) zu erzeugen.
Die Viruspartikel können durch einfache Transfektion einer geeigneten Zellinie, wie jener des Beispiels 2.1, in Abwesenheit von Tetracyclin erhalten werden (wobei die Zugabe des Antibiotikums in das Kulturmedium eine hemmende Wirkung auf die Transkription des tTA und der ORFs 6 und 7 hat, welche durch die Sequenzen tet O reguliert wird).

4. Funktionstests der Mikroinfektion und Mikrotitration

Die Experimente wurden parallel an den Zellen 293, welche die Funktion E1 komplementieren, und den Zellen 1653, welche die Funktionen E1 und E4 komplementieren, durchgeführt. Die Zellen werden in einer Kulturplatte in einem Verhältnis von etwa 5 · 10&sup4; Zellen pro Vertiefung verteilt. Sie werden sodann mit den zu testenden Vektoren pTG4682 bis 4685 transfiziert. Es wird ihre Fähigkeit, Plaques in den beiden Zelltypen (je nach Geschwindigkeit ihres Erscheinens) zu bilden, sowie ihre Größe bewertet. Als Kontrollgruppen werden die rekombinanten Vektoren pTG4662 und pTG4663 verwendet, die Adenovirusvektoren der ersten Generation (Deletion von E1 und E3) bzw. der zweiten Generation (zusätzliche Deletion von E4) entsprechen und tTA nicht exprimieren.
Die Erzeugung von Viruspartikeln ausgehend von der Konstruktion pTG4662 ist leicht nachweisbar, und zwar in beiden Zellinien (Bildung großer Plaques, die rasch erscheinen). Was pTG4663 betrifft, so kann er nur in den Zellen 1653 vermehrt werden, die E1 und E4 komplementieren, und ergibt kleine Plaques, die spät erscheinen.
Was die Vektoren pTG4682 und pTG4684 betrifft, so folgt auf ihre Transfektion in die Zellen 293 und 1653 rasch die Bildung großer, leicht zu ermittelnder Plaques (Verhalten ähnlich dem Kontrollvektor pTG4662). Die Vektoren pTG4683 und pTG4685, bei denen die Region E4 deletiert iat, verhalten sich auf mit pTG4663 vergleichbare Weise: in der Linie 1653 erscheinen die Viruspartikel langsam, indem Plauqes geringer Größe gebildet werden, während in der Linie 293 keine Plaques zu finden sind. Diese Gegebenheiten scheinen anzuzeigen, daß die Expression des tTA weder für die Virusvermehrung abträglich noch für das Zellwachstum toxisch ist.
Wie vorstehend angeführt, kann diese Technologie bei der Linie des Beispiels I (293/pTG4673) und den Vektoren pTG4696 und pTG4697 angewandt werden.

BEISPIEL 3: Aufbau der Komplementationslinie 5606 für die Funktionen E1 und E4, bei der die Expression von E4 durch den von der Linie erzeugten tTA induzierbar ist

Dieses Beispiel beschreibt eine Komplementationszellinie, welche die Vermehrung eines defizienten Adenovirus EV und E4 ermöglicht und durch Transfektion der Zellen 293 durch den Vektor pTG5606 erhalten wurde, der ferner das Selektionsgen pac, die für die ORFs 6/7 und für den tTA codierenden Sequenzen trägt, die unter die Kontrolle des Promotors gestellt sind, der nachstehend mit pCMV* bezeichnet wird und dem Minimalpromotor CMV entspricht (Position -53 in bezug auf die Initiationsstelle der Transkription), der in 5' mit 7 aufeinanderfolgenden Sequenzen tet O versehen ist. Dieses autoinduzierbare System ermöglicht zuerst die Erzeugung einiger tTA-Moleküle ausgehend von dem Minimalpromotor CMV, die positiv auf die Sequenzen tet O einwirken und ihre eigene Synthese und jene der Produkte der ORFs 6/7 in ausreichender Menge für eine wirksame Komplementation der defekten Vektoren amplifizieren können.

1. Bildung des Plasmids pTG5606

Man beginnt, indem man den Vektor pTG4688 konstruiert, der aus der Klonierung der Kassette (Promotor/Enhancer CMV-tTA), gereinigt aus pTG4673 (Beispiel 1.1), gespalten mit Hpal und Pval, in den Vektor pTG4677 (Beispiel 2.1), verdaut von denselben Enzymen, resultiert. Der Vektor pTG5606 wird aus dem vorhergehenden Vektor durch Ersatz des Promotors/Enhancers CMV durch den regulierbaren Promotor pCMV* erhalten. Dazu wird pTG4688 durch die Enzyme ScaI-XbaI linearisiert, bevor das ScaI-XbaI-Fragment, das pCMV* trägt und aus pTG4659 isoliert ist, insertiert wird. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid pTG5606 (Fig. 11) umfaßt die folgenden drei Expressionskassetten: eine erste Kassette, die sich aus dem Promotor pCMV*, den für den Transaktivator tTA codierenden Sequenzen und den polyA-Sequenzen des Virus SV40 zusammensetzt;
eine zweite Kassette, die sich aus dem Resistenzgen gegen Puromycin (Gen pac) unter der Kontrolle des frühen Promotors und den pA-Sequenzen des Virus SV40 zusammensetzt, und eine dritte Kassette, die sich aus dem Promotor CMV*, gefolgt von den für die ORFs 6/7 des Adenovirus 5 codierenden Sequenzen, die mit ihrem eigenen polyA-Signal versehen sind, zusammensetzt.

2. Erzeugung der Komplementationslinie 5606

4 · 10&sup6; Zellen 293 (ATCC CRL 1573) werden in DMEM-Medium (Dubelco's modified Eagle's medium) in Anwesenheit von 10% FCS kultiviert. Bei ungefähr 70 bis 80% Konfluenz werden sie in mehrere Schalen verteilt und sodann mit 10 ug oder 20 ug des Plasmids pTG5606 transfiziert (Transfektionskit Gibco-BRL; Ref.: 530-8120SA). Nach 48 Stunden werden die Zellen in einem selektiven Medium (Puromycin, 0,7 ug/ml während der ersten Woche und anschließend 1 ug/ml) kultiviert. Die resistenten Klone werden in dem vorangehenden selektiven Medium gegebenenfalls in Anwesenheit von Tetracyclin amplifiziert. Das letztgenanntes übt eine Repressorwirkung auf die Sequenzen tet O aus, und seine Zugabe soll die Synthese der Expressionsprodukte der ORFs 6/7 verringern, die sich als cytotoxisch herausstellen und zum Zelltod führen könnten. So wurden drei Sätze gemäß der im Medium enthaltenen Tetracyclin-Konzentration gebildet, 0 ug/ml, 1 ug/ml bzw. 5 ug/ml. Zahlreiche Klone traten auf, unabhängig von den Mengen an transfizierter DNA und den Kulturbedingungen.
Die Klone, welche die Gene E1 und E4 co-exprimieren, wurden durch eine Mikroinfektions- und Mikrotitrationstechnik durchmustert. Ungefähr hundert Klone 5606 wurden mit einer geringen m.o.i. (Multiplizität der Infektion) durch einen defekten Adenovirusvektor E1- E4- infiziert (siehe beispielsweise die internationale Patentanmeldung WO 94/28152). 48 bis 72 h nach Infektion war bei 10 bis 16% von ihnen, je nach dem Satz, aus dem sie hervorgingen, eine Cytopathie zu beobachten. Die Cytopathie zeugt von der Multiplikation der doppelt defekten Viren und spiegelt die Trans-Komplementations- Fähigkeit des Klons wider. Der Titer an infektiösen Viruspartikeln wird durch eine Titriertechnik in Mikromulden bei einer permissiven Zelle bewertet. Dazu werden die Viruspartikel aus den infizierten Kulturen durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen gewonnen, und die zu titrierenden Virusüberstände werden treppenatig zu 100 ul pro Vertiefung verdünnt und mit 4 · 10&sup4; Zeilen 1653 in Verbindung gebracht. Der Virustiter wird grob durch Beobachtung der Cytopathie bei den verschiedenen Verdünnungen bewertet. Die Klone 5606, die am meisten produzieren (Cytopathie bei hohen Verdünnungen) werden für eine genauere Untersuchung der Ausbeute in pfu/ml und ifu/ml behalten.
Die ausgewählten Klone 5606 werden kultiviert (5 · 105 Zellen) und wieder durch einen Adenovirusvektor E1- E4- infiziert. Es können beispielsweise die Vektoren AdTG8595 und AdTG4651 verwendet werden, bei denen die Regionen E1, E3 (Nt 28592 bis 30470) und E4 (Nt 32994 bis 34998) deletiert sind und die an Stelle von E1 die Expressionskassette des interessierenden Gens, den Promotor MPL-LacZ bzw. den Promotor MLP-Gen CFTR umfassen. Wie vorher werden die Virusüberstände gewonnen, und der Titer in pfu/ml wird durch Infektion einer permissiven Linie (Linie 1653 oder der produzierende Klon 5606) durch geeignete Verdünnungen der Virusüberstände und Zählen der Lyseplaques in Agar bestimmt. Zwei Klone, die als #5-19/l und #5-38 bezeichnet werden, ergeben Titer, die von 1 bis 5 · 10&sup9; pfu/ml (Titration durchgeführt auf ihnen selbst) variieren. Die Ausbeute an infektiösen Partikeln (ifu/ml) wird bewertet, indem die infizierten Zellen, die das interessierende Gen exprimieren, gezählt werden. So werden die Virusüberstände, die aus den mit AdTG8595 infizierten Klonen 5606 erhalten wurden, auf ihnen selbst titriert, und 48 Stunden nach der Infektion werden die anhaftenden Zellen fixiert (PBS-Puffer, der 2% Formaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd enthält), und die Erzeugung von β-Galaktosidase wird durch den Farbstoff X-Gal nachgewiesen (1 mg/ml in einem PBS- Puffer, dem 5mM K-Ferricyanid, 5mM K-Ferrocyanid und 2mM MgCl&sub2; zugesetzt wurden). Die erhaltenen Titer liegen zwischen 10¹&sup0; und 10¹¹ ifu/ml.
Schließlich verifiziert man, daß die Expression der späten Gene nicht verändert ist, was zu einer Störung des Zusammenbaus der Viruspartikel führen könnte. Die Erzeugung von Faser und Penton wird durch Western-Blot an den infizierten Zellbodensätzen bestimmt, die nach den Gefrier- und Auftauzyklen gewonnen wurden. Die Analyse erfolgt gemäß Standardtechniken bei einer Zellextraktaliquote, die 3 ug an Proteinen entspricht, mit Hilfe von Antikörpern, die gegen die Faser (Henry et al., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246) oder die Penton-Base (Boulanger et al., 1973, Eur. J. Biochem. 39, 37-42) gerichtet sind, dann von Anti-Kaninchen-Antikörpern, die mit Peroxidase markiert sind (Amersham, NA 934). Der Nachweis erfolgt durch Verwendung des Nachweiskits ECL (Amersham, RPN 2106). Die Ergebnisse zeigen an, daß die Adenoviren E1- E4-, die aus den beiden Klonen 5606 erzeugt wurden, in der Lage sind, die späten Proteine mit einer Konzentration zu erzeugen, die sich jener annähert, die in den Zellen 293 erhalten wird, welche mit einem Virus E1- infiziert sind.
Als Schlußfolgerung stellen die Klone 5606 #5-19/l und #5-38 Komplementationslinien E1 und E4 dar, die in der Lage sind, die doppelt defekten Vektoren zu einem Titer zu amplifizieren, der 1 · 10&sup9; pfu/ml übersteigt, ein Titer, der mit einer Produktion in großem Maßstab vereinbar ist.

BEISPIEL 4: Aufbau der Komplementationslinie 9579 für die Funktionen E1 und E2A, in der die Exoression von E2A durch den tTA der von der Linie erzeugt wird, induzierbar ist

Dieses Beispiel beschreibt eine Komplementationszellinie, welche die Vermehrungvon defizienten Adenoviren E1&supmin; und E2A&supmin; ermöglicht und durch Transfektion der Zellen 293 mit dem Vektor pTG9579 erhalten wurde, der eine autoinduzierbare Expression des Proteins DBP gemäß demselben Prinzip wie in dem vorangehenden Beispiel ermöglicht.

1. Konstruktion des Vektors pTG9579

Der Vektor pTG9579 wird folgendermaßen konstruiert:
Das 3'-Ende des Genoms des Adenovirus 5 wird aus einem genomischen DNA-Präparat isoliert, das von DraI-BsmBI verdaut wurde. Das entsprechende Fragment wird in die Stelle SmaI des Vektors pUCl9 (Gibco BRL) subkloniert, um den Zwischenvektor pTG9568 zu ergeben. Es wird angeführt, daß das STOP-Codon der Sequenz DBP durch die Spaltung mit Dral zerstört wird. Dieses wird durch Einführung eines Fragments zwischen die Stellen EcoRV und BamHI von pTG9568 wiederhergestellt, welches die korrekte Sequenz umfaßt, die durch PCR-Amplifikation aus der Genommatrize und den entsprechenden Promotoren erhalten wurde. Man erhält pTG9571.
Darüber hinaus wird der Vektor pUHD-10-3 mit HindIII linearisiert, nach Klenow behandelt, und man insertiert die Expressionskassette des Gens neo (Colbere-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150, 1- 14), die von dem frühen Promotor und dem pA-Signal von SV40 gesteuert wird. Der auf diese Weise erhaltene Vektor pTG9555 wird mit XbaI linearisiert, dann der Einwirkung nach Klenow unterzogen, bevor das Fragment kloniert wird, welches die Sequenz DBP trägt, die aus pTG9571 nach der Spaltung mit Xhol und EcoRI und der Behandlung nach Klenow isoliert wurde. Schließlich wird in die Stelle Xhol, die nach Klenow behandelt wurde, des Vektors pTG9577, der im vorangehenden Schritt erzeugt wurde, das Fragment HpaII-XhoI (Klenow) eingeführt, das aus pTG4659 isoliert wurde und die Expressionskassette des Gens tTA trägt, was pTG9579 ergibt. Zusammenfassend umfaßt dieser:
eine erste Kassette, die sich aus dem Promotor pCMV*, gefolgt von den für den Transaktivator tTA codierenden Sequenzen und den polyA-Sequenzen des Virus SV40 zusammensetzt;
eine zweite Kassette, die sich aus dem Gen neo mit Resistenz gegen das Antibiotikum G418 unter der Kontrolle des frühen Promotors und den pA-Sequenzen des Virus SV40 zusammensetzt, und
eine dritte Kassette, die sich aus den für das Protein DBP des Adenovirus 5 codierenden Sequenzen unter der Kontrolle des Promotors pCMV* und den pA-Sequenzen des Virus SV40 zusammensetzt.
Die Erzeugung eines funktionsfähigen Proteins DBP durch pTG9579 kann durch vorübergehende Transfektion in die Zellen 293 verifiziert werden. Kurz gesagt werden die 1 · 10&sup6; Zellen durch 5 ug Vektor durch die Calciumphosphat-Methode transfiziert und dann in Anwesenheit (1 ug/ml) oder in Abwesenheit von Tetracyclin kultiviert. 4 Tage nach der Transfektion werden die Zellen wiedergewonnen, und der Zellbodensatz wird mit 100 ug Lysepuffer behandelt (50 mM Tris-HCL, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM EDTA, 5 mM KCl, 150 mM NaCl und 1% Triton X-100), um die Proteine zu lösen. 7 ul Proteinextrakt werden in einem Tris-Glycin-Beladungspuffer, der 5% β-Mercaptoethanol enthält, aufgenommen und einer Elektrophorese PAGE 8-16% unter denaturierenden Bedingungen unterzogen. Nach der Übertragung auf eine Nitrocellulosemembran wird das Protein DBP durch Western-Blot mit Hilfe eines für das Adenovirusprotein DBP spezifischen Antikörpers (Reich et al., 1983, Virology 128, 480-484; beispielsweise der monoklonale Maus-Antikörper α72KB 6-8) und eines Anti-Maus-Immunglobulin- Schafs-Antikörpers, der mit Peroxydase markiert ist (Amersham; NA 931), nachgewiesen. Der Nachweis erfolgt mit dem Kit ECL (Amersham, RPN 2106). Die Ergebnisse, die in Fig. 12 dargestellt sind, zeigen, daß das Protein DBP in den Zellen 293 erzeugt wird, die vorübergehend durch den Vektor pTG9579 transfiziert wurden, und dies auf regulierte Weise, da die Expression in Anwesenheit von Tetracyclin verringert ist.

2. Erzeugung der Komplementationszellinie 9579

Es werden 20 ug Plasmid pTG9579 verwendet, um 3 · 10&sup6; Zellen 293 zu transfizieren (Transfektionskit Gibco BRL; Ref. 530-8120SA). Die Klone werden in Anwesenheit von 600 ug/ml G418 und 1 ug/ml Tetracyclin selektiert und auf ihre Fähigkeit zur Erzeugung des Proteins DBP durch die vorher beschriebene Western-Blot-Technik getestet. 20% von ihnen, von denen zwei als #7-44 und #7-32 bezeichnet wurden, exprimieren nachweisbare Mengen von DBP auf einem Niveau nahe jenem, das in der Linie gmDBPt in Anwesenheit von Dexamethason erhalten wurde. Die letztgenannte stellt die Referenzlinie für die Komplementation der Funktion E2A dar (Brough et al., 1992, Virol. 190, 624-634). Sie stammt von HeLa-Zellen ab, die durch eine Expressionskassette transfiziert wurden, welche die für DBP codierenden Sequenzen umfaßt, die von dem Promotor MMTV gesteuert werden, der durch Dexamethason induzierbar ist.
Die positiven DBP-Klone werden kultiviert und mit einer m.o.i. von ≥1 mit dem Adenovirus H5d1802, das bezüglich der Funktion E2A defekt ist, infiziert (Rice und Klessig, 1985, J. Virol. 56, 767- 778). Zwei Tage nach der Infektion werden die Virusüberstände nach der Lyse der Zellen durch aufeinanderfolgende Gefrier- und Auftauzyklen gesammelt, treppenartig verdünnt und auf der permissiven Linie gmDBP6 titriert. Das Vorhandensein von Viruspartikeln wird in den Virusüberständen beobachtet, die aus den Klonen #7-44 und #7-32 hervorgehen, und zeigt deren Fähigkeit zur Komplementation der Funktion E2A an. Die gleiche Art von Experiment wird mit dem Vektor pTG9542 (E1&supmin; (LacZ) E2A&supmin; und E3&supmin;) durchgeführt. Infektiöse Partikel werden erzeugt, was zeigt, daß diese beiden Klone in der Lage sind, doppelt defekte Vektor zu vermehren und zu amplifizieren. Ferner können diese nicht auf der Linie 293 vermehrt werden, was den Phänotyp E2A&supmin; und dis Abwesenheit von Revertanten bestätigt.
Amplifikationsexperimente, die mit dem Klon #7-44, der mit dem Virus AdTG9542 infiziert war, durchgeführt wurden, zeigten einen Amplifikationsfaktor von ungefähr 125, wenn die Titration 4 Tage nach Infektion durchgeführt wird.

Claims

1. Viraler Vektor, umfassend eine in Komplementationszellen funktionelle und in einer Wirtszelle, welche die Expression eines oder mehrerer viraler Gene kontrolliert, nicht funktionelle Expressionseinheit, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit eine oder mehrere Regulationssequenzen umfaßt, welche die Aktivierung der Expression der viralen Gene in Anwesenheit eines Induktors und die Inhibierung der Expression in Gegenwart eines Repressors gestatten.

2. Viraler Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit eine oder mehrere Regulationssequenzen umfaßt, die von einem Bakterien-Operon abstammen.

3. Viraler Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit eine oder mehrere Regulationssequenzen umfaßt, die vom Tetracyclin-Operon abstammen.

4. Viraler Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetracyclin-Operon durch das Transposon Tn 10 codiert ist.

5. Viraler Vektor nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulationssequenz die Sequenz tet O ist.

6. Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulationssequenz stromaufwärts bezüglich der TATA-Box des Promotors der Expressionseinheit angeordnet ist.

7. Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulationssequenz stromabwärts bezüglich der TATA-Box des Promotors der Expressionseinheit angeordnet ist.

8. Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionseinheit 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 und ganz besonders bevorzugt 1 bis 7 Regulationssequenzen umfaßt, welche die Aktivierung der Expression der viralen Gene in Anwesenheit eines Induktors und die Inhibierung der Expression in Gegenwart eines Repressors gestatten.

9. Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein minimaler Promotor des Virus CMV ist.

10. Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß:

i) der Repressor, der die Inhibierung der Expression gestattet, ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus dem Antibiotikum Tetracyclin, Anhydrotetracyclin und dem Tetracyclin-Repressor tet R besteht, und

ii) der Induktor, welche die Aktivierung der Expression gestattet, aus einem Protein besteht, das aus der Fusion zwischen tet R und den 130 C-terminalen Aminosäuren der Aktivierungsdomäne des Proteins VP16 des Herpes simplex-Virus (tTA) resultiert.

11. Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, der von einem Virus abstammt, das aus dem Herpes-Virus, dem Cytomegalovirus, AAV (Adenovirus-assoziiertem Virus), dem Pockenvirus und dem Adenovirus ausgewählt ist.

12. Adenoviraler Vektor nach Anspruch 11, abstammend von einem Adenovirus menschlichen, Hunde-, Vogel-, Rinder-, Maus-, Schafs-, Schweine- oder Affen-Ursprungs oder auch von einem Hybrid, das Fragmente des adenoviralen Genoms aus unterschiedlichen Ursprüngen umfaßt.

13. Viraler Vektor nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß replikationsdefizient ist.

14. Adenoviraler Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ihm mindestens die ganze oder ein Teil der Region E1 und fakultativ die ganze oder ein Teil der Region E3 fehlt.

15. Adenoviraler Vektor nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß er eine oder mehrere Expressionseinheit(en) umfaßt, welche ein oder mehrere adenovirale(s) Gen(e) der Regionen E2, E4 oder L1-L5 umfaßt.

16. Adenoviraler Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Expressionseinheit umfaßt, die eine oder mehrere Regulationssequenz(en), die vom Tetracyclin-Operon abstammen, stromaufwärts bezüglich der TATA-Box des Promotors und die offenen Leseraster (ORFs) 6 und 7 der Region E4 auf solche Weise umfaßt, daß die Expression der Leseraster durch einen Induktor vom Typ trans- Tetracyclin-Aktivator (tTA) aktivierbar ist und durch Tetracyclin reprimierbar ist.

17. Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß er eine zweite Expressionseinheit umfaßt, welche aus einer exogenen Nukleotidsequenz besteht, die unter der Kontrolle der Elemente angeordnet ist, die für ihre Expression in der Wirtszelle notwendig sind.

18. Viraler Vektor nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die exogene Nukleotidsequenz aus Genen ausgewählt ist, die für ein Cytokin, einen zellulären oder Kern-Rezeptor, einen Liganden, einen Koagulationsfaktor, das Protein CFTR, Insulin, Dystrophin, ein Wachstumshormon, ein Enzym, einen Inhibitor von Enzymen, ein Polypeptid mit Anti-Tumorwirkung, ein Polypeptid, das eine bakterielle, parasitäre oder virale und insbesondere die HIV-Infektion hemmen kann, einen Antikörper, ein Toxin, ein Immunotoxin und einen Marker codieren.

19. Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Expression der exogenen Nukleotidsequenz notwendigen Elemente einen Promotor einschließen, der von demjenigen verschieden ist, der in der Expressionseinheit eingeschlossen ist, welche die Expression des oder der viralen Gene kontrolliert.

20. Infektiöses virales Teilchen, das einen viralen Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 umfaßt.

21. Eukaryontische Wirtszelle, umfassend einen viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder ein infektiöses virales Teilchen nach Anspruch 20.

22. Verfahren zur Herstellung eines infektiösen viralen Teilchens gemäß Anspruch 20, gemäß dem man:

i) einen viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 19 in eine Komplementationszelle einführt, welche in der Lage ist, den viralen Vektor in trans zu komplementieren, um eine transfizierte Komplementationszelle zu erhalten;

ii) die transfizierte Komplementationszelle unter Bedingungen kultiviert, die geeignet sind, um die Expression der viralen Gene und die Produktion des infektiösen viralen Teilchens zu gestatten, und

iii) das infektiöse virale Teilchen in der Zellkultur gewinnt.

23. Kombinationsprodukt, umfassend:

i) einen viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 19, ein infektiöses virales Teilchen nach Anspruch 20 oder erhalten gemäß dem Verfahren von Anspruch 22 oder eine eukaryontische Wirtszelle nach Anspruch 21,

ii) einen Repressor, der die Expression der viralen Gene inhibieren kann.

24. Kombinationsprodukt nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Repressor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Antibiotikum Tetracyclin, Anhydrotetracyclin und dem Tetracyclin- Repressor tet R besteht.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 19, ein infektiöses virales Teilchen nach Anspruch 20 oder erhalten nach dem Verfahren von Anspruch 22, eine eukaryontische Wirtszelle nach Anspruch 21 oder ein Kombinationsprodukt nach Anspruch 23 oder 24 in Verbindung mit einem unter pharmazeutischem Gesichtspunkt annehmbaren Träger.

26. Verwendung eines viralen Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 19, eines infektiösen viralen Teilchens nach Anspruch 20 oder erhalten gemäß dem Verfahren von Anspruch 22, einer eukaryontischen Wirtszelle nach Anspruch 21, eines Kombinationsprodukts nach Anspruch 23 oder 24 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 25 für die Herstellung eines Medikaments, welches dazu bestimmt ist, eine Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Gentherapie zu bewirken.

27. Verwendung nach Anspruch 26 in Verbindung mit einem Repressor.

28. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Repressor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Antibiotikum Tetracyclin, Anhydrotetracyclin und dem Tetracyclin-Repressor tet R besteht.