PT784693E - Vectores virais para terapia genetica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

VECTORES VIRAIS PARA TERAPIA GENÉTICA A presente invenção está relacionada com novos vectores virais que permitem a transferência e a expressão de genes de interesse numa célula ou organismo hospedeiro, estando a expressão dos genes virais regulada de forma a ser funcional numa célula de complementação e não funcional na célula ou organismo hospedeiro. Ela tem também como objecto as células que contêm estes novos vectores, assim como um método para preparar partículas virais infecciosas destinadas a uma utilização terapêutica. A invenção tem um interesse muito particular em termos das perspectivas da terapia genética, especial mente no homem. A possibilidade de tratar doenças humanas através de terapia genética passou, nalguns anos, do estado das considerações teóricas ao das aplicações clínicas. O primeiro protocolo aplicado ao homem iniciou-se nos Estados Unidos, em Setembro de 1990, num paciente geneticamente imunodeficiente devido a uma mutação que afecta o gene que codifica a adenina desaminase (ADA). O relativo sucesso desta primeira experiência encorajou o desenvolvimento de novos protocolos de terapia genética para diversas doenças genéticas ou adquiridas (doenças infecciosas, particularmente virais como a SIDA, ou cancros). A grande maioria dos protocolos descritos até ao momento utiliza vectores virais para transferir e expressar o gene terapêutico nas células a tratar.

Actuaimente, os vectores retrovirais estão entre os mais utilizados devido à simplicidade do seu genoma. No entanto, além da sua capacidade limitada de clonagem, eles apresentam dois inconvenientes principais que limitam a sua utilização sistemática: por um lado, eles infectam maioritariamente as células em divisão; por outro lado, devido à sua integração aleatória no genoma da célula hospedeira, o risco de mutagénese de inserção não é desprezável. É por isso que várias equipas científicas se dedicaram ao desenvolvimento de outros tipos de vectores, entre os quais se podem citar os vectores provenientes de adenovírus, vírus associados aos adenovírus (AAV), citomegalovírus, vírus pustular e vírus do herpes. De uma maneira geral, a sua organização e o seu ciclo de infecção estão amplamente descritos na literatura acessível ao perito. 1

Sob esta perspectiva, a utilização de vectores adenovirais surgiu como uma alternativa promissora. Os adenovírus foram postos em evidência em numerosas espécies animais, possuem um largo espectro de hospedeiros, sâo pouco patogénicos e não apresentam os inconvenientes ligados aos retrovírus, uma vez que são não integracionistas e replicam-se igualmente nas células quiescentes. A título indicativo, o seu genoma é constituído por uma molécula de ADN linear e bicatenária com cerca de 36 kb que transporta mais de cerca de 30 genes: tanto genes precoces necessários à replicação virai, como genes tardios de estrutura (consultar a Figura 1).

Os genes precoces estão repartidos por 4 regiões dispersas no genoma adenovirai (E1 a E4: E de “early” que significa precoce em inglês). Elas compreendem 6 unidades de transcrição que possuem os seus próprios promotores. Os genes tardios (L1 a L5: L de “late” que significa tardio em inglês) sobrepõem-se, em parte, às unidades de transcrição precoces e são, na sua maioria, transcritos a partir do promotor principal tardio MLP (de Major Late Promotor em inglês).

No momento actual, todos os vectores adenovirais utilizados nos protocolos de terapia genética são desprovidos da maior parte da região E1 essencial para a replicação, a fim de evitar a sua disseminação no ambiente e no organismo hospedeiro. Alguns compreendem deleções suplementares, especialmente na região E3 não essencial, o que permite aumentar a sua capacidade de clonagem. Os genes de interesse são introduzidos no ADN virai no lugar de uma ou outra região eliminada. A deleção da região E1 torna o genoma virai deficiente em termos da replicação. No entanto, os vírus ΕΓ podem propagar-se numa linha celular de complementação, que fornece em trans as funções virais eliminadas para gerar uma partícula virai infecciosa. Utiliza-se habitualmente a linha 293, estabelecida a partir de células de rim embrionário humano, que complementa eficazmente a função E1 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). A região E3 não é essencial e não necessita de ser complementada.

Embora a praticabilidade da transferência de genes utilizando estes vectores de primeira geração esteja actualmente bem estabelecida, a questão da sua inocuidade continua em aberto. Além dos aspectos de segurança (risco de gerar RCA, isto é, partículas competentes em termos da replicação), coloca-se o problema da sua toxicidade. Na verdade, os primeiros ensaios clínicos puseram em evidência a indução de respostas inflamatórias ligadas à expressão de genes virais no hospedeiro. 2

Recentemente, foram propostos na literatura vectores adenovirais de segunda geração. Eles conservam as regiões em cis necessárias para a replicação do vírus na célula infectada (ITRs e sequências de encapsidação) e compreendem deleções internas importantes que visam suprimir o essencial dos genes virais cuja expressão in vivo não é desejável. Contudo, estes vectores da técnica anterior apresentam determinados inconvenientes que limitam a sua exploração a um nível industrial. De facto, é necessário dispor de novas linhas que complementem o conjunto das funções eliminadas e permitam a produção de partículas virais numa quantidade elevada. Ora, para ser óptima em termos de capacidade de crescimento e rendimento em partículas virais, uma tal linha é particularmente difícil de produzir devido à citotoxicidade dos genes adenovirais. A presente invenção permite evitar estes inconvenientes. Presentemente, construiu-se, por um lado, uma nova linha derivada da linha 293, que complementa as funções adenovirais E1 e E2 ou E4, para a amplificação de vectores adenovirais convencionais de segunda geração, na qual a expressão das regiões E2 ou E4 é controlada por um promotor munido, na sua extremidade 5’, de sequências ditas “operadores” do operão bacteriano da tetraciclina, designadas a seguir por tet O. A síntese dos produtos de expressão correspondentes só será activada na presença de um indutor, que pode ser produzido pelo vector adenoviral ou pela própria linha. Da mesma forma, pode adicionar-se um repressor ao meio de cultura quando a complementação deixa de ser desejada.

Por outro lado, produziram-se agora novos vectores adenovirais com deleções da maioria das regiões E1 e E3, nos quais as unidades de transcrição das restantes regiões virais (E2, E4 e/ou L1-L5) são reguláveis a fim de permitir a sua expressão quando se trata de produzir as partículas virais infecciosas e de as inibir na célula hospedeira. Nos exemplos que se seguem, a regulação é assegurada pelas sequências tet O. A sua inserção em 5’ da TATA box gera um promotor a partir do qual o nível de transcrição basal é mínimo, mas que pode ser fortemente estimulado na presença do indutor acima referido. Desta forma, a produção das proteínas virais é activada numa linha 293 que expressa o indutor, o que permitirá constituir as partículas virais infecciosas. Em contrapartida, ela é consideravelmente reduzida na célula hospedeira infectada que não produz naturalmente o indutor de origem bacteriana. A regulação dos genes virais não tem consequências sobre a expressão da sequência nucleotídica exógena colocada sob a dependência de um promotor que não responde à tetraciclina.

Como exemplo, a WO-A-95 02697 descreve amplamente vectores adenovirais que compreendem genes E1 e E2 ou E4 não funcionais. Nela é particularmente referido que esta “não funcionalidade” pode ser obtida por supressão, substituição, deleção ou adição de uma ou várias bases, compreendida na região promotora destes genes. Contudo, de acordo com um modo de realização preferido, indica-se que o carácter não funcional é perfeitamente estável, segregacional e/ou não reversível.

Os vectores adenovirais da presente invenção propõem uma solução vantajosa para os inconvenientes inerentes à utilização dos vectores da arte anterior, já que combinam a segurança de utilização e a facilidade de produção. Por um lado, eles podem ser propagados numa linha de complementação convencional numa quantidade elevada, o que é compatível com as necessidades industriais; por outro lado, permitem transferir uma sequência nucleotídica exógena in vivo e expressá-la de forma estável, limitando os efeitos nocivos (respostas inflamatórias no hospedeiro). Muito particularmente, eles são adaptados para a terapia genética humana. É por isso que a presente invenção tem como objecto um vector virai que compreende uma unidade de expressão funcional numa célula de complementação e não funcional numa célula hospedeira, que controla a expressão de um ou vários genes virais, caracterizado pela referida unidade de expressão compreender uma ou várias sequências de regulação que permitem activar a expressão dos referidos genes virais na presença de um indutor e inibir a referida expressão na presença de um repressor.

De acordo com a presente invenção, um “vector virai” é obtido a partir de um vírus parental cujo genoma foi modificado. Estas modificações podem ser várias (deleção, mutação e/ou adição de um ou vários nucleótidos) e estar localizadas nas regiões codificantes do genoma virai ou fora destas, por exemplo nas regiões promotoras. A título indicativo, determinadas sequências virais podem ser eliminadas, tomadas não funcionais ou substituídas por outras sequências, especialmente por uma sequência nucleotídica exógena cuja expressão é pretendida numa célula hospedeira.

Um vector virai de acordo com a invenção pode ser derivado de vírus muito diferentes, como sejam os vírus do herpes, citomegalovírus, AAV (vírus associado ao adenovírus) e vírus pustulares, particularmente o vírus da vacínia, fowlpox ou canarypox. Estes vectores, assim como as suas técnicas de preparação, são conhecidos do perito.

Todavia, um vector particularmente adaptado para a presente invenção é um vector adenoviral. Ele pode derivar de um adenovírus de origem humana, canina, aviária, bovina, murina, ovina, suína ou símia ou ainda de um híbrido compreendendo fragmentos de genoma adenoviral de diferentes origens. Podem citar-se mais particularmente os adenovírus CAV-1 ou CAV-2 de origem canina, DAV de origem aviária ou ainda Bad de tipo 3 de origem bovina (Zakharchuck et al., 1993, Arch. Virol., 128, 171-176; Spibey & Cavanagh, 1989, J. Gen. Virol., 70, 165-172: Jouvenne et al., 1987, Gene, 60, 21-28; Mittal et al., 1995, J. Gen. Virol., 76, 93-102). No entanto, prefere-se um vector adenoviral derivado de um adenovírus humano, de preferência de tipo serológico C, e de forma especialmente preferida de tipo 2 ou 5 (Graham & Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, vol. 7, p. 109-128; Ed.; E.J. Murey, The Human Press Inc.).

Um modo de realização vantajoso da presente invenção consiste num vector defectivo em termos da replicação, no qual um ou vários genes virais necessários para a replicação são eliminados ou tornados não funcionais. Um vector assim, incapaz de replicação autónoma, será propagado numa célula de complementação. O termo “célula de complementação” designa uma célula capaz de fornecer em trans a(s) função(ões) para a(s) qual(ais) um vector de acordo com a invenção é defectivo. Por outras palavras, ela é capaz de produzir a(s) proteína(s) necessária(s) para a replicação e a encapsidação do referido vector - proteínas precoces e/ou tardias - que ele próprio não pode produzir e que são necessárias à constituição de uma partícula virai infecciosa. A título ilustrativo, um vector adenoviral preferido de acordo com a invenção, sendo desprovido da maioria da região E1, recorrerá a uma célula de complementação como a linha 293 capaz de fornecer em trans o conjunto das proteínas codificadas pela região E1 que o vector não pode produzir. Por “partícula virai infecciosa”, entende-se uma partícula virai que tem a capacidade de infectar uma célula hospedeira e de fazer penetrar nela o genoma virai.

De acordo com um modo de realização preferido, um vector virai de acordo com a invenção é recombinante. Desta forma, ele compreenderá uma sequência nucleotídica exógena colocada sob o controlo dos elementos necessários à sua expressão numa célula hospedeira. “Sequência nucleotídica exógena” refere-se a um ácido nucleico de uma origem qualquer que normalmente não está presente no genoma de um vírus parental em utilização na presente invenção ou, se presente, é num contexto genómíco diferente. No contexto da invenção, a sequência nucleotídica exógena pode ser constituída por um ou vários genes, em particular por gene(s) de interesse terapêutico.

De uma forma geral, a sequência nucleotídica exógena pode codificar um ARN anti-senso e/ou um ARNm que será, em seguida, traduzido na proteína de interesse. Ela pode ser de tipo genómlco, de tipo ADN complementar (ADNc) ou de tipo misto (minigéne, no qual pelo menos um intrão foi eliminado). Ela pode codificar uma proteína madura ou um precursor de uma proteína madura, especialmente um precursor destinado a ser segregado e que compreende um péptido de sinal. Por outro lado, pode tratar-se de toda ou parte de uma proteína tal como encontrada na natureza (proteína nativa ou truncada), também de uma proteína quimérica proveniente da fusão de sequências de diferentes origens ou ainda de uma proteína mutada que apresenta propriedades biológicas melhoradas e/ou modificadas. Tais proteínas podem ser obtidas por meio de técnicas convencionais de biologia molecular.

No quadro da presente invenção, pode ser vantajoso utilizar os genes que codificam os seguintes polipéptidos: - citocinas ou linfocinas (interferões α, β e γ; interleucinas e especialmente a IL-2, a IL-6, a IL-10 ou a IL-12; factores de necrose tumoral (TNF); factores estimuladores de colónias (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...); - receptores celulares ou nucleares (receptores reconhecidos por organismos patogénicos (vírus, bactérias ou parasitas), de preferência pelo vírus VIH (Vírus da imunodeficiência Humana) ou seus ligandos); - proteínas implicadas numa doença genética (factor VII, factor VIII, factor IX, distrofina ou minidistrofina, insulina, proteína CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormonas de crescimento (HGF)); - enzimas (urease, renina, trombina...); - inibidores de enzimas (α-1-antitipsina, antitrombina III, inibidores de proteases virais...); - polipéptidos com efeito antitumor, capazes de inibir pelo menos parcialmente a iniciação ou a progressão de tumores ou cancros (ARN anti-senso, anticorpos, inibidores que actuam ao nível da divisão celular ou dos sinais de transdução, produtos da expressão 6 dos genes supressores de tumores, por exemplo p53 ou Rb, proteínas que estimulam o sistema imunitário...); - proteínas do complexo major de histocompatibilidade das classes I ou II ou proteínas reguladoras que actuam ao nível da expressão dos genes correspondentes; - polipéptidos capazes de inibir uma infecção virai, bacteriana ou parasitária e/ou o seu desenvolvimento (polipéptidos antigénicos que possuem propriedades imunogénicas, epitopos antigénicos, anticorpos, variantes transdominantes susceptíveis de inibir a acção de uma proteína nativa através de competição...); - toxinas (timidina-cinase do vírus simplex do herpes 1 (TK-HSV-1), ricina, toxina colérica, diftérica...) ou imunotoxinas; e - marcadores (β-galactosidase, luciferase...). É de assinalar que esta lista não é restritiva e que se podem igualmente utilizar outros genes.

Por outro lado, uma sequência nucleotídica exógena utilizada na presente invenção pode, além disso, compreender um gene de selecção que permite seleccionar ou identificar as células transfectadas. Podem citar-se os genes neo (que codificam a neomicina-fosfotransferase) conferindo resistência ao antibiótico G418, dhfr (dihidrofolato-redutase), CAT (cloranfenicol-acetiltransferase), pac (puromicina-acetiltransferase) ou ainda gpt (xantina-guanina-fosforribosiltransferase). De uma forma geral, os genes de selecção são conhecidos do perito.

Por elementos necessários à expressão de uma sequência nucleotídica exógena numa célula hospedeira, entende-se o conjunto dos elementos que permitem a sua transcrição em ARN (ARN anti-senso ou ARNm) e a tradução de um ARNm em proteína. Entre estes, o promotor reveste-se de uma importância particular. Ele pode ser isolado de um qualquer gene de origem eucariota ou mesmo virai e pode ser constitutivo ou regulável. Em alternativa, pode tratar-se do promotor natural do gene em questão. É preferível utilizar um promotor diferente daquele incluído na unidade de expressão dos genes virais (definido a seguir). Por outro lado, ele pode ser modificado de forma a melhorar a actividade promotora, suprimir uma região inibidora da transcrição, tomar um promotor constitutivo regulável ou vice-versa, introduzir um local de restrição... Podem mencionar-se, a título de exemplos, os promotores dos genes TK-HSV-1, PGK (fosfoglicerato-cinase) murina ou humana, α-1-antitripsÍna (específica do fígado), imunoglobulinas (específicas dos linfócitos), o promotor precoce do vírus SV40 (Simian Virus 40), um LTR retroviral ou ainda o promotor adenoviral MLP, particularmente do adenovírus humano de tipo 2.

Claro que uma sequência nucleotídica exógena utilizada na presente invenção pode, além disso, compreender elementos adicionais necessários à expressão (sequência intrónica, sequência de sinal, sequência de localização nuclear, sequência de terminação da transcrição, local de iniciação da tradução de tipo IRES ou outra) ou ainda à sua manutenção na célula hospedeira. Estes elementos são conhecidos do perito.

Como indicado anteriormente, um vector virai de acordo com a presente invenção compreende uma unidade de expressão que engloba um ou vários genes virais e possui a característica interessante de ser funcional numa célula de complementação e não funcional numa célula hospedeira. Por “funcional”, entende-se uma expressão dos genes virais em quantidade suficiente e durante um período suficientemente longo para permitir a constituição de uma partícula virai infecciosa. Por “não funcional”, entende-se uma expressão reduzida dos genes virais (de preferência de pelo menos um factor 10 e até mesmo nula) em relação ao seu nível de expressão no vírus parental. O carácter funcional manifesta-se através da produção dos produtos dos genes virais incluídos na unidade de expressão, podendo estes ser colocados em evidência por meio das técnicas clássicas de biologia molecular, de imunologia, de bioquímica ou de enzimologia. O carácter não funcional manifesta-se através da ausência de produção ou ainda através da produção dos produtos virais num grau atenuado.

Desta forma, a referida unidade de expressão compreende uma ou várias sequências de regulação heterólogas que não estão presentes no ADN virai parenteral. Pode recorrer-se a sequências que respondem a um regulador do tipo repressor, que actua de forma negativa sobre a expressão, ou, de preferência, a um regulador do tipo indutor, que exerce uma acção positiva. A origem de uma sequência de regulação utilizada no quadro da presente invenção pode ser qualquer: virai, procariota ou ainda eucariota. De uma maneira geral, as sequências de regulação estão descritas na literatura acessível ao perito. Pode igualmente tratar-se de um homólogo cuja sequência é modificada relativamente à sequência nativa, mas exercendo uma função de regulação semelhante ou melhorada. Estas modificações podem resultar da adição, da deleção e/ou da substituição de um ou vários nucleótidos.

No quadro da presente invenção, uma sequência de regulação é susceptível de modular a expressão dos genes virais a diferentes níveis - transcrição, elongação, transporte, estabilidade dos ARNm ou ainda tradução. Ela pode estar presente em diferentes locais da referida unidade de expressão; por exemplo, no promotor, sobretudo quando o seu efeito se faz sentir ao nível da transcrição (de preferência a montante da TATA box até várias centenas de pares de bases dela), ou nas sequências transcritas (e, se possível, não codificantes) quando a sua acção se exerce numa etapa posterior à transcrição. Podem utilizar-se 1 a 25 sequências de regulação, vantajosamente 1 a 20, de preferência 1 a 10, e de forma especialmente preferida 1 a 7.

No contexto da presente invenção, o termo “indutor” designa uma molécula que tem a capacidade de iniciar ou de activar a expressão dos genes virais colocados sob a dependência de uma sequência de regulação, quer directamente por ligação à referida sequência de regulação quer indirectamente por intermédio de outros factores celulares ou virais. Ele pode também impedir a acção de um repressor. Pelo contrário, um “repressor” tem a capacidade de inibir ou de bloquear a expressão dos genes virais colocados sob a dependência de uma sequência de regulação sobre a qual actua, e isto quer directa quer indirectamente.

Podem ilustrar-se estas definições através do exemplo do operão da lactose (lac). O gene lad codifica um repressor que se liga a uma curta sequência de regulação denominada “operador", impedindo, assim, a transcrição dos genes estruturais que codificam as enzimas da cadeia metabólica da lactose. Na presença do indutor, este liga-se ao repressor e transforma-o na forma inactiva que deixa de se poder ligar ao operador, permitindo desta forma que a transcrição aconteça. É igualmente desejável utilizar porções ou análogos destes reguladores para melhorar a sua eficácia ou modificar a sua especificidade (por exemplo, a tetraciclina anidra dez vezes mais eficaz do que a tetraciclina para inibir a transcrição a partir de um promotor que compreende as sequências de regulação derivadas do operão da tetraciclina ou o transactivador reverso descrito recentemente por Gossen et al., 1995, Science, 268,1766- 1769). Por outro lado, um regulador utilizado na presente invenção pode ser uma proteína híbrida proveniente da fusão de polipéptidos de diferentes origens. Uma combinação preferida consiste num polipéptido capaz de reconhecer ou ligar uma sequência de regulação utilizada na presente invenção (por exemplo, derivado do repressor tetraciclina (tet R) ou estrogénio ER) e num polipéptido capaz de activar a expressão (por exemplo, o domínio de activação das proteínas Gal4 ou VP16 capaz de interagir com os factores de transcrição). A tabela 1 seguinte refere algumas das sequências de regulação e reguladores utilizáveis no quadro da presente invenção:

co ο § D) Ο -9 lo cg o c « Φ **— Φ o: o ico £> φ co

Φ Ό "cõ O O

O CO CO Φ Q. Φ X

3 Ό C co fi o Ό Φ 3 O) Φ i_ co ÇO ’o c <<3) 3 σ· Φ co co (0 ΌE Φ O) LO O LO i Tf O LO £ví CVJ CO Φ X co <C o ‘o o 3 2 'tf σ> 05 00 CO CO CO I r^ iO CO O)" CO Φ X co 12 <C o 00 O)

σ> c 'C Q. CO 2 o O CO c o λ— Φ Q. O O) 00 < CO 3 CO "8 <?

cO

O O

CO T5 UJ 0 > 1 04 cr> o> CO rs. LO Cvi IO CD LO 04 o> co $ i Φ > CD X cõ o õ) o o15p δ § '> CD CC "cõ o o> o o 1q o V— o <35 CO ΙΛ 05 05 O CO 2 LU CO 05 (0 <0

I cO CO 60 Ή c CO > % *c N Φ CC o3 o CO λ· o jQ C0

< l·- LO < £

<0 o o 58 "δE co Φ iO o c co o D. c ΦE φ UJ 1 *60 C O Q. cO Φ S LU X 2

O cg "SE φ c φCD Φ

O 40 w CO X

C0 'S* CQ οδ c Φ <0 60 O CD to io LO i r- 3 LO 05 05 E 2

CO cO CO 05 C O CO cg 55 I O) c o <* 8 έ' ^ φ CO §> 5 «a g ê· *5* ® £ 55 5 c <0£ <♦— 3 CO o3 1 3 CO Tf CO Φ fc φE φ c2C3 s I 05 CO c\T L<5 Φo co CO 05 CO o J— i CO LO o <o Φo CD CO 05 CO ω GQ. CO Q. X I ç ξ ff < in já Φ c Φ 05 o o 2 3 Ό s O. X Φ *7 co T» Q. > <0 c ©2 O- o c co 'o Q.

O Ό O ICO Φ Q. O já o Ό CO Φ α ο ο Ό 2 φ α. ο ξ co co ϋ c «Φ 3 cr Φ co o c «Φ 3 σ* Φ co

;£ LO

< H LO |2 ο Ό C0 k. Φ CL Ο I 60 C ο Q. C0 Φ X c ο φ > 8 I C0 C C0

C ο Ο)φ X

CφΕ φ LUI co C ο ο. C0φ X > U1 CC LU X X o

1 co c ο α. co φ X 2 "ο ο ‘e Ο ο Ο ο 2 CD UL1 X c φ Ε φο ui

O "c SD 05 2 co UJ

C0 C ο ο. 60φ X C0φ σ> ο

c φΕ φ LU D) C 1 1Iφ Ο. 3 C0CD co < 3

φ ο Cφ ^ 3 ^ Φ C0CO CD

φΕ φ LU

co C ο Q. C0 Φ X Cφ Ο) 2 to LU UJ X UJ O local de inserção é apenas fornecido a título indicativo, não restritivo. 11

De acordo com um modo de realização particular da presente invenção, utilizam-se sequências de regulação que derivam do operão bacteriano da tetraciclina e que são designadas na literatura por “operador” (tet O). De uma forma geral, o operão de resistência à tetraciclina é codificado pelo transposão Tn10 (Hillen et al., 1984, J. Mol. Biol. 172, 185-201). A regulação é assegurada por uma curta sequência nucleotídica dita “operador” (tet O), que constitui um local de fixação de diferentes reguladores. Assim, a fixação do repressor tetraciclina (tet R) ou do antibiótico tetraciclina diminui consideravelmente o nível de transcrição. Pelo contrário, obtém-se um efeito de activação utilizando uma proteína, designada na literatura por “transactivador tetraciclina (tTA)”, que resulta da fusão entre o tet R e os 130 aminoácidos C-terminais do domínio de activação da proteína VP16 do vírus simplex do herpes. Gossen e Boujard (1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 5547-5551) mostraram recentemente que este sistema de regulação é funcional nas células eucariotas. A expressão de um gene repórter colocado sob o controlo de várias cópias de tet O a montante de sequências de base da transcrição (TATA box, local de iniciação da transcrição) ó detectável por co-expressão de tTa e inibida por adição de tetraciclina. Quanto ao grupo de Kim (1995, J. Virol. 69, 2565-2573), ele utiliza as sequências tet O posicionadas a jusante da TATA box de um promotor e, neste caso, a transcrição é inibida por acção de tet R.

No quadro da presente invenção, prefere-se muito particularmente a combinação “tet O -promotor mínimo” (no sentido 5’ para 3’) que dá lugar a um promotor cujo nível basal da transcrição é naturalmente muito fraco, mas que pode ser activado pelo indutor tTA e reprimido pela tetraciclina. Contudo, é igualmente possível utilizar um promotor no qual as sequências tet O são colocadas em 3’ da TATA box” ou ainda de um e do outro lado desta, que é reprimível por um repressor compreendendo as sequências do tet R que reconhecem tet O.

Tratando-se da variante preferida, um vector adenoviral de acordo com a invenção é de preferência constituído peio genoma de um adenovírus desprovido de toda ou parte da região E1 e, de forma alternativa, de toda ou parte da região E3. Vantajosamente, prefere-se conservar uma parte da região E3, particularmente a parte correspondente ao gene que codifica a gp19k (Gooding & Wold, 1990, Criticai Reviews of Immunology 10, 53-71), não estando a referida parte incluída numa unidade de expressão tal como definida atrás, mas colocada sob o controlo de um promotor homólogo (E3) ou heterólogo convencional. É evidente que é possível proceder a outras modificações do genoma virai, especialmente 12 na região E4 ou E2. Pode ser interessante introduzir deleções suplementares ou mutações. Para ilustrar este ponto, pode citar-se a mutação termosensível que afecta o gene DBP (de DNA Binding Protein em inglês) da região E2A (Enslnger & Ginsberg, 1972, J. Virol. 10, 328-339).

Segundo um modo de realização preferencial, um vector adenoviral de acordo com a invenção compreende uma unidade de expressão que é composta por um ou vários genes virais das regiões E2, E4 ou L1-L5. Uma variante interessante consiste em reter da região E4 apenas as sequências que codificam as ORFs 3, 6 e/ou 7 (estas deleções limitadas da região E4 não necessitam de complementação da função E4; Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048).

Pode também ser interessante dispor de um vector adenoviral compreendendo várias unidades de expressão, sendo consideradas todas as combinações (E2 e E4, E2 e L1-L5, E4 e L1-L5 ou E2, E4 e L1-L5). Seleccionar-se-ão então sequências de regulação que actuam de uma mesma maneira e, de preferência, positivamente (por exemplo, TAR, RRE, tet O ...). Por razões de simplicidade de execução, o caso em que as unidades transportam sequências de regulação idênticas que permitem propagar o vector adenoviral numa linha de complementação compreendendo um único indutor é preferido. A invenção está iguaimente relacionada com uma partícula virai infecciosa, assim como com uma célula hospedeira eucariota que compreende um vector virai de acordo com a invenção. A referida célula hospedeira é de forma vantajosa uma célula de mamífero, de preferência uma célula humana, e pode compreender o referido vector numa forma integrada no genoma ou não integrada (epissoma). Pode tratar-se de uma célula primária ou tumoral de origem hematopoética (célula progenitora totipotente, leucócito, linfócito, monócito ou macrófago...), muscular, pulmonar, hepática, epitelial ou fibroblasto.

Por outro lado, os inventores aperfeiçoaram uma célula de complementação caracterizada por compreender um indutor e/ou um repressor (regulador). De acordo com as necessidades, este pode ser adicionado ao meio de cultura ou produzido pela própria célula de uma forma estável ou transitória. Esta célula de complementação pode ser modificada por introdução de um fragmento de ADN que codifica o referido regulador. É possível utilizar qualquer meio Standard de introdução de um ácido nucleico (vector sintético, virai, plasmídeo, ADN nu...) numa célula, como seja, por exemplo, a transfecção, 13 a electroporação, a microinjecção, a lipofecção, a adsorção e a fusão de protoplastos. No contexto da invenção, pode ser interessante criar uma célula de complementação que produz apenas um único regulador, particularmente um Indutor. Contudo, também pode ser vantajoso dispor de células que produzem vários indutores.

De acordo com um modo de realização vantajoso, esta célula de complementação é capaz de complementar em trans um vector virai de acordo com a invenção e, em particular, um vector adenoviral. Sob esta perspectiva, seleccionar-se-á vantajosamente uma célula de complementação para a função E1 e/ou E4. É por isso que se pode considerar que este tipo de célula se destina à complementação de um vector adenoviral de segunda geração defectivo em termos da função E1 e de uma outra função adenoviral (tardia ou precoce). Uma tal célula compreende toda ou parte da região E1 de um adenovírus, cuja expressão é controlada por um qualquer promotor, e toda ou parte de uma região de um adenovírus diferente da região E1, colocada sob o controlo de um promotor munido de sequências de regulação, por exemplo na sua extremidade 5’, pelo menos uma, de preferência uma a 20 sequências tet O actíváveis pelo transactivador tTA. Uma variante interessante consiste num promotor mínimo derivado do vírus CMV (citomegalovírus), a montante do qual se situam 7 sequências tet O numa orientação de cima para baixo. O indutor pode ser introduzido na célula de complementação como descrita acima de forma prévia, concomitante ou posterior às sequências adenovirais colocadas sob o controlo das sequências tet O ou, como indicado mais acima, pode ser adicionado ao meio de cultura. Pode também considerar-se expressar o indutor (por exemplo, tTA) na célula de complementação e adicionar o repressor (por exemplo, a tetraciclina) ao meio de cultura quando a expressão dos genes adenovirais deixa de ser desejada. A título de exemplos preferidos, a região adenoviral diferente da região E1 é constituída por: (i) toda ou parte da região E4, especialmente as sequências que codificam as grelhas de leitura aberta 6 e 7 (ORFs 6/7) desta última, ou ainda (ii) toda ou parte da região E2, especialmente as sequências que codificam a proteína DBP (DNA Binding Protein) ou um mutante termosensível desta última.

Claro que esta célula de complementação pode, além disso, compreender uma terceira região adenoviral cuja expressão é colocada sob o controlo dos elementos adequados. Sob esta perspectiva, uma célula preferida destina-se à complementação de um vector adenoviral defectivo em termos do conjunto das funções precoces essenciais para a replicação e compreende toda ou parte das regiões Ε1, E2 e E4, sendo uma ou a outra destas duas últimas regiões, ou as duas, colocada sob o controlo de um promotor munido de sequência(s) de regulação tal como definidas acima.

Uma das vantagens desta célula de complementação é permitir a produção em quantidade elevada de partículas virais infecciosas a partir de um vector virai convencional ou de acordo com a invenção. O título virai da preparação final (após purificação) é vantajosamente superior a 5 x 108 pfu/ml, de preferência superior a 1 x 109 pfu/ml, mais preferencialmente superior a 5 x 109 pfu/ml, ainda mais preferencialmente superior a 5 x 101° pfu/ml. Por pfu, entende-se uma partícula capaz de formar uma placa por infecção de células permissivas. As técnicas para avaliar o número de pfu são convencionais e conhecidas do perito. Pode citar-se a técnica em agar (Graham & Prevec, 1991, supra). Geralmente, o título virai em pfu é igual ou inferior ao número real de partículas virais infecciosas susceptíveis de cumprir a sua função de transferência de genes. Na verdade, uma determinada percentagem é incapaz de se propagar eficazmente e, portanto, gerar placas de lise nas células permissivas. O título em partículas virais infecciosas produzido pela supracitada célula de complementação é vantajosamente superior a 5 x 109 ifu/ml, de preferência superior a 1 x 101° ifu/ml, mais preferencialmente superior a 5 x 101° ifu/ml, ainda mais preferencialmente superior a 5 x 1011 ifu/ml. Por ifu, entende-se uma partícula infecciosa capaz de infectar uma célula-alvo não permissiva, transferir o seu genoma e permitir a expressão dos genes transportados por este último. O número de ifu é estimado através do número de células-alvo que expressam o gene de interesse ou um gene virai. O perito conhece as técnicas a utilizar para detectar a sua expressão: imunofluorescência, Western blot ou ainda coloração... Por exemplo, quando o gene de interesse é constituído pelo gene LacZ, a proteína β-galactosidase pode ser visualizada por coloração com X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-galactopiranósido), contabilizando-se o número de células azuis. Quando se utiliza o gene terapêutico CFTR, o produto de expressão pode ser visualizado por Western blot. Podem também pesquisar-se as células que expressam as proteínas adenovirais OBP penton ou fibra com a ajuda de anticorpos específicos. 15

Uma célula de complementação tal como definida acima pode ser produzida a partir de diferentes linhas celulares, por transfecção de porções apropriadas do genoma adenoviral e de um fragmento de ADN que codifica um regulador. Entre as linhas consideradas, podem citar-se as linhas de rim Vero (macaco), BHK (hamster), MDCK (cão), MBDK (bovino), a linha CHO (hamster) ou ainda as linhas humanas (HeLa, A549, MRC5, W138...) disponíveis em colecções como a ATCC (Rockville, USA). No entanto, uma célula particularmente adaptada é a linha 293. Pode também considerar-se a utilização de linhas primárias, como sejam as células primárias da retina humana.

Uma partícula virai infecciosa de acordo com a invenção pode ser preparada de acordo com qualquer procedimento convencional no domínio da técnica (Graham & Prevect, 1991, supra); por exemplo, por co-transfecção de um vector e de um fragmento adenoviral numa célula apropriada ou ainda por meio de um vírus auxiliar que forneça em trans as funções virais não funcionais. É também de considerar a produção in vitro do vector virai em Escherichia coli (E. coli), por ligação ou ainda recombinação homóloga (consultar, por exemplo, o pedido francês n.9 2727689 (9414470)). A invenção está também relacionada com um processo de preparação de uma partícula virai infecciosa que compreende um vector virai de acordo com a invenção, de acordo com o qual: (i) introduz-se o referido vector virai numa célula de complementação capaz de complementar em trans o referido vector, de forma a obter uma célula de complementação transfectada, (ii) cresce-se a referida célula de complementação transfectada em condições apropriadas para permitir a expressão dos genes virais e a produção da referida partícula virai infecciosa, e (iii) recupera-se a referida partícula virai infecciosa a partir da cultura celular.

Obviamente, a partícula virai infecciosa pode ser recuperada do sobrenadante da cultura, mas também das células. De acordo com um modo de realização vantajoso, utiliza-se um vector adenoviral e uma célula de complementação tal como anteriormente descrita. De acordo com uma outra variante, é possível recorrer a uma célula de complementação convencional. Pode ser necessário adicionar um indutor ao meio de cultura no caso em que a unidade de expressão compreende sequências de regulação activáveis. A quantidade a Utilizar depende da própria natureza do indutor. O perito saberá adaptar a concentração óptima em função dos elementos específicos. A invenção está igualmente relacionada com um processo de preparação de uma partícula virai infecciosa que compreende um vector virai convencional, utilizando a supracitada célula de complementação. Como exemplo, a introdução de um vector virai defectivo em termos das funções E1 e E4 (E1-E4-) numa célula 293 expressando (i) as ORFs 6/7 da região E4 sob o controlo de um promotor mínimo munido, na sua extremidade 5’, de 7 sequências tet O e (ii) o transactivador tTa dirigido pelo mesmo promotor permitirá produzir partículas virais deficientes em termos da replicação, mas infecciosas no que diz respeito a uma célula hospedeira. A invenção tem também como objecto uma composição farmacêutica que compreende, como agente terapêutico ou profiláctico, um vector virai, uma partícula virai infecciosa, uma célula de complementação ou uma célula hospedeira eucariota de acordo com a invenção, em associação com um suporte aceitável de um ponto de vista farmacêutico. A composição de acordo com a invenção destina-se, em particular, ao tratamento preventivo ou curativo de doenças tais como: - doenças genéticas (hemofilia, mucoviscidose, diabetes ou miopatia, de Duchêne e de Becker...). - cancros como aqueles induzidos por oncogenes ou vírus. - doenças virais como a hepatite B ou C e a SIDA (síndrome da imunodeficiência adquirida resultante da infecção pelo VIH) e - doenças virais recorrentes como as infecções virais provocadas pelo vírus do herpes.

Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser fabricada de forma convencional. Em particular, associa-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico ou profiláctico a um suporte como seja um diluente. Uma composição de acordo com a invenção pode ser administrada por via local, sistémica ou por aerossol, 17 em particular por via intragástrica, subcutânea, intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intrapuimonar, intranasal ou intratraqueal. A administração pode ter lugar numa dose única ou ser repetida uma ou várias vezes após um certo tempo de intervalo. A via de administração e a dosagem apropriadas variam em função de diferentes parâmetros, por exemplo, do indivíduo ou da doença a tratar ou ainda do(s) gene(s) de interesse a transferir. Em particular, as partículas virais de acordo com a invenção podem ser formuladas sob a forma de doses compreendidas entre 104 e 1014 ufp (unidades formadoras de placas), vantajosamente entre 105 e 1013 ufp, de preferência entre 106 e 1011 ufp. A formulação pode também incluir um adjuvante ou um excipiente aceitável de um ponto de vista farmacêutico.

Finalmente, a presente invenção está relacionada com a utilização terapêutica ou profiláctica de um vector virai, de uma partícula virai infecciosa, de uma célula de complementação ou de uma célula hospedeira eucariota de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento do corpo humano ou animal, de preferência por terapia genética. De acordo com uma primeira possibilidade, o medicamento pode ser administrado directamente in vivo (por exemplo, por injecção intravenosa num tumor acessível, por aerossol nos pulmões...). É possível também adoptar a abordagem ex vivo, que consiste em recolher células do paciente (células progenitoras da medula óssea, linfócitos do sangue periférico, células musculares...), transfectá-las ou infectá-las in vitro segundo meios da técnica e readministrá-las ao paciente. No caso em que a unidade de expressão compreende sequências de regulação que respondem a um repressor, pode considerar-se a administração do repressor para bloquear ou limitar a expressão dos genes virais (administração prévia, concomitante ou posterior do repressor ou co-expressão através de vectores convencionais). A invenção estende-se igualmente a um método de tratamento, de acordo com o qual se administra uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vector virai, de uma partícula virai, de uma célula hospedeira eucariota ou de uma célula de complementação de acordo com a invenção a um paciente que tenha necessidade de tal tratamento. A presente invenção fica mais inteiramente descrita através da referência ãs Figuras que se seguem e com a ajuda dos exemplos seguintes. 18 A Figura 1 é uma representação esquemática do genoma do adenovírus humano de tipo 5 (representado em unidades arbitrárias de 0 a 100), indicando a localização dos diferentes genes. A Figura 2 é uma representação esquemática do vector pTG4673, que permite a expressão constitutiva de tTA dirigida pelo promotor CMV (pCMV) e do gene de selecção pac (resistência à puromicina) sob o controlo do promotor SV40. A Figura 3 é uma representação esquemática do vector adenoviral pTG4696, que compreende uma cassete de expressão das ORFs 6 e 7 da região E4 activável por tTA. A Figura 4 é uma representação esquemática do vector pTG8343, que compreende uma parte da extremidade 5’ do genoma do adenovírus 5. A Figura 5 é uma representação esquemática do vector pTG4662, vector adenoviral recombinante de primeira geração no qual foi eliminado o essencial das regiões E1 e E3. A cassete recombinante é constituída pelo promotor adenoviral MLP (Ad2), seguido do gene bacteriano LacZ que codifica a β-galactosidase e do sinal de poliadenilação (pA) do vírus SV40. A Figura 6 é uma representação esquemática do vector pTG4682, vector adenoviral no qual foi eliminado o essencial das regiões E1 e E3 e que compreende uma cassete de expressão constitutiva de tTA. A Figura 7 é uma representação esquemática do vector pTG4683, vector adenoviral no qual foi eliminado o essencial das regiões Ε1, E3 e E4 e que compreende uma cassete de expressão constitutiva de tTA. A Figura 8 é uma representação esquemática do vector pTG4675, que permite a expressão de tTA de forma indutível (sob o controlo do promotor mínimo CMV (-53 a +1) precedido de 7 cópias de sequências tet O, indicado na figura por tet O - CMVi). A Figura 9 é uma representação esquemática do vector pTG4684, vector adenoviral no qual foi eliminado o essencial das regiões E1 e E3 e que compreende uma cassete de expressão indutível de tTA. 19 A Figura 10 é uma representação esquemática do vector pTG4685, vector adenoviral no qual foi eliminado o essencial das regiões Ε1, E3 e E4 e que compreende uma cassete de expressão indutível de tTA. A Figura 11 é uma representação esquemática do vector pTG5606, que permite a expressão das ORFs ffl da região adenoviral E4 e de tTA sob o controlo do promotor mínimo CMV precedido de 7 cópias de sequências tet O, e do gene de selecção pac que confere resistência à puromicina. A Figura 12 é uma análise por Western blot da expressão da proteína DBP nas células 293 transfectadas de forma transitória com o vector pTG9579 e crescidas na presença (+) e na ausência (-) de tetraciclina.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem ilustram apenas um modo de realização da presente invenção.

As construções descritas abaixo são realizadas de acordo com as técnicas gerais de engenharia genética e de clonagem molecular especificadas em Maniatis et al. (1939, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou de acordo com as recomendações do fabricante quando se utiliza um kit comercial. As etapas de clonagem que utilizam plasmídeos bacterianos são efectuadas na estirpe E. coli 5K (Hubacek & Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50, 111-127) ou BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). Utiliza-se de preferência esta última estirpe para as etapas de recombinação homóloga. As técnicas de amplificação por PCR são conhecidas do perito (consultar, por exemplo, PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990, editado por Innis, Gelfand, Sninsky & White, Academic Press Inc). Tratando-se da reparação de locais de restrição, a técnica utilizada consiste num preenchimento das extremidades 5’ protuberantes com a ajuda do fragmento grande da ADN polimerase I de E. coli (Klenow).

No que diz respeito à biologia celular, as células são transfectadas de acordo com as técnicas Standard bem conhecidas do perito. Pode citar-se a técnica do fosfato de cálcio (Maniatis et al., supra), mas também se pode utilizar qualquer outro protocolo como seja a técnica do DEAE dextrano, a electroporação, os métodos baseados nos choques osmóticos, a microinjecção ou os métodos baseados no uso de lipossomas. Quanto às condições de cultura, elas são as clássicas.

Nos exemplos que se seguem, recorre-se às seguintes linhas celulares:

Linha 293 derivada de rim embrionário humano (Graham et al., 1977, supra), que resulta da integração nos seus cromossomas da extremidade 5’ do genoma do Ad5 (ITR5’, sequência de encapsidação e região E1) (disponível na ATCC sob a referência CRL1573).

Linha TG1653 (descrita no pedido internacional W094/28152, exemplo 8), que deriva da linha 293 transformada de forma estável com o plasmídeo pTG1653 que transporta a região E4 do Ad5 (nt 32 800 a 35 826) e a cassete de expressão do gene de selecção pac.

Compreende-se que podem ser utilizadas outras linhas celulares.

Por outro lado, os fragmentos de genoma adenoviral utilizados nas diferentes construções descritas a seguir são indicados de forma precisa de acordo com a sua posição na sequência nucleotídica do genoma do Ad5, tal como divulgada no banco de dados Genebank sob a referência M73260. EXEMPLO 1: linha de complementacão que expressa um indutor capaz de activar a expressão dos genes adenovirais

Este exemplo descreve a constituição (1) de uma linha de complementação derivada da linha 293 que é capaz de expressar de forma constitutiva a proteína transactivadora tTA e (2) de um vector adenoviral no qual determinados genes virais da região E4 foram colocados sob o controlo de sequências tet O que respondem a tTa. A transfecção do vector na linha é seguida da formação de partículas virais, já que as funções E1 e E4 são trans-complementadas através da participação dos produtos de expressão da região adenoviral E1 e de tTa. Nas células hospedeiras infectadas que não produzem naturalmente a proteína quimérica tTA, a expressão de E4 e, consequentemente, das proteínas tardias (expressão dependente de E4) será consideravelmente reduzida, limitando assim os problemas de imunidade celular e de inflamação. 1. Constituição de uma linha de complementação que expressa o transactivador tTA.

Constrói-se inicialmente o vector pTG6529 que permite a selecção das células transformadas através da puromicina. O vector resulta da clonagem num p polylll-Γ (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) de uma cassete de expressão composta pelo promotor SV40 e pelo gene pac seguido do sinal polyA do vírus SV40. Esta construção está ao alcance do perito a partir das sequências correspondentes descritas na literatura (Morgenstern & Land, 1990, Nucleic Acids Res, 18, 3587-3596; Genebank referência J02400).

Em paralelo, o vèctor pUHD15-1 (Gossen & Bujard, 1992, supra) é digerido com as enzimas Sspl e Hpal. O fragmento que compreende as sequências que codificam a proteína tTA, precedidas do promotor CMV, é clonado entre os mesmos locais de pTG6529 para originar pTG4673 (Figura 2). O vector pTG4673 é transfectado de forma convencional nas células 293. Claro que também se poderia ter transfectado um vector de expressão de tTA e um vector de selecção (por exemplo, pUHD15-1 e pTG6529). Após a transfecção, as células são crescidas em meio selectivo (1 pg/ml de puromicina). Isolaram-se 80 clones resistentes e, dentre estes, testaram-se 35 quanto à capacidade de transactivar um gene marcador cuja expressão é controlada pelas sequências tet O. Por razões de simplicidade de execução e de sensibilidade de dosagem, a escolha assentou no gene luciferase.

Utiliza-se o vector repórter pUHC13-3 (Gossen & Bujard, 1992, supra) no qual as sequências que codificam a luciferase estão sob o controlo do promotor mínimo CMV precedido de 7 cópias de tet O. O teste é efectuado através de transfecção transitória nos clones a testar. Dois dias mais tarde, avalia-se a actividade de luciferase nos extractos celulares utilizando um kit comercializado por Proméga (“Luciferase Assay System”) e, para a medição das amostras, um contador de cintilações (LS 50000 TD, Beckman). A dosagem revela-se positiva para 10 dos clones avaliados, o que indica que eles produzem um produto tTA funcional capaz de reconhecer as sequências tet O e de activar a expressão de genes colocados sob o seu controlo. 22 2. Constituição de um adenovírus no qual a expressão dos genes E4 é indutível por tTA.

Como mencionado anteriormente, a expressão dos genes que codificam as ORFs 6 e 7 da região E4 é suficiente para assegurar a replicação virai sem necessidade de complementação. Este exemplo descreve a construção de um vector adenoviral com deleções ao nível das regiões E1 e E3 e de uma parte de E4, à excepção das sequências que codificam as ORFs 6 e 7 cuja expressão é colocada sob o controlo de tet O e, devido a isto, estimulada na presença de tTA. O vector pUHD10-3 provem da clonagem no plasmídeo pBR322 de um fragmento XhcA-EcoRI que transporta 7 cópias tet O e o promotor mínimo CMV (posição -53 relativamente ao local de iniciação da transcrição: ver Gossen & Bujard, 1992, supra). Após a digestão com BamH\ (local situado a jusante da região promotora), insere-se o fragmento BgAI-BamHl, que foi obtido de pTG1653 e transporta as sequências que codificam as ORFs 6 e 7, para originar pTG4658. O vector pTG4664 resulta da clonagem do fragmento adenoviral Kpnl-Hpal (nucleótidos 25 838 a 32 004) entre os locais Kpn\-Sma\ de um p poly II (Lathe et al., 1987, supra), no qual se havia previamente suprimido o local Bg&\. Em seguida, efectua-se a deleção de uma grande parte de E3 (nucleótidos 27 871 a 30 748) por digestão enzimática (Hpa\-HindlU). O fragmento Xho\-Hpa\, que transporta a cassete de expressão regulada das ORFs 6 e 7, é isolado de pTG4658 e inserido, após a acção de Klenow, no vector pTG4664 digerido com BgH\ e tratado com Klenow para originar pTG4668 e pTG4669, de acordo com a orientação da cassete. Esta é introduzida num vector adenoviral por recombinação homóloga. Utiliza-se para tal o vector recombinante pTG4663, que deriva de um vector de segunda geração (com deleções das regiões E1 e E4 essenciais para a replicação e da região E3 não essencial (deleção dos nucleótidos 27 871 a 30 748); descrito no exemplo 4 do pedido internacional W094/28152) no qual se clonou a cassete de expressão “promotor MLP-gene LacZ pa SV40” no lugar da região E1. As células de E. coli são co-transformadas com pTG4668 ou pTG4669, clivado com HindíW, e com o vector virai pTG4663, linearizado com Spel, para gerar pTG4696 (Figura 3) e pTG4697. 23

Podem produzir-se outros vectores adenovirais de tipo semelhante. Pode, por exemplo, considerar-se colocar os genes da região E2 sob o controlo das sequências tet O. O perito conhece as técnicas de biologia molecular que permitem substituir o promotor E2 por um promotor regulável, como seja aquele isolado do vector pUHD10-3, ou eliminar as sequências a montante da TATA box do promotor E2 e introduzir no seu lugar uma ou várias cópias (de preferência 7) de sequências tet O. Também é possível construir vectores regulados a vários níveis, por exemplo, por inserção de tet O a montante da TATA box de promotores que controlam a expressão dos genes virais de E2, E4 e/ou MLP. 3. Criação de partículas virais. O vector virai pTG4696 ou pTG4697 é transfectado num dos 10 clones produtores de tTA do exemplo 1.1. As células são capazes de complementar a função E1 e de produzir o tTA que activa a expressão das ORFs 6 e 7, o que permite a formação de partículas virais. Constitui-se um stock que permite, em seguida, infectar as células-alvo a uma m.o.i (multiplicidade de infecção) determinada susceptível de variar entre 0,1 e 100. EXEMPLO 2: Constituição da linha de comolementacão 4677 para as funções E1 e E4. sendo a expressão de E4 indutível oor tTA.

Este exemplo está relacionado com uma linha de complementação gerada por transfecção das células 293 com um vector de expressão das ORFs 6 e 7 de E4, colocadas sob o controlo de um promotor mínimo precedido de 7 cópias de tet O. As células transfectadas são capazes de complementar as funções E1 de forma constitutiva e E4 de forma indutível por tTA. Este pode ser suportado por um vector adenoviral defectivo ou por um vector de expressão clássico. 1. Constituição da linha de complementação O fragmento Xhci-BamH\ de pTG4658 (que transporta a cassete “tet O - promotor mínimo CMV - ORFs 6 e Τ’) é inserido entre os locais SalI e BghI do vector de selecção pTG6529 para originar pTG4677. Produziram-se 60 clones resistentes após transfecção na linha 293 e selecção através de puromicina. É possível determinar quais os clones que apresentam uma capacidade óptima de complementação de diferentes formas. 24

Um primeiro método consiste em transfectar de forma transitória o plasmídeo pUHD15-1, que expressa de forma constitutiva o tTA. Uma análise por Western blot dos extractos celulares com a ajuda de anticorpos apropriados permitirá avaliar a quantidade de polipéptidos ORFs 6 e/ou 7 produzidos nestes clones e, consequentemente, a sua capacidade para trans-complementar a função adenoviral E4. De acordo com um outro método, pode utilizar-se um adenovírus defectivo que expressa o tTA. Este método é exposto a seguir. 2. Constituição de um adenovírus defectivo que expressa o tTA de uma forma constitutiva

Efectuaram-se duas séries de construções. pTG4682, que corresponde ao genoma adenoviral com deleções do essencial das regiões E1 e E3 e compreende no lugar da região E1 uma cassete de expressão constitutiva de tTA (promotor CMV). O vector pTG4683 apresenta, além disso, uma deleção da região E4.

Parte-se do vector pTG8343, o qual provém da inserção em p poly II (Lathe et al., 1987, supra) de uma porção da extremidade 5’ do genoma adenoviral, a saber, as sequências que se estendem dos nucleótidos 1 a 458 e 3 328 a 5 788 (Figura 4). Após a digestão de pTG8343 com Bgl\\ e tratamento com Klenow, o vector é ligado ao fragmento Sspi-Hpal de pUHD15-1 que transporta o promotor CMV seguido das sequências tTA. Obtém-se o vector pTG4674, que se destina a permitir a inserção da cassete de tTA por recombinação homóloga com um vector adenoviral que compreende sequências homólogas. Para tal, selecciona-se o vector pTG4662 (Figura 5), que compreende o ITR5’ e as sequências de encapsidação do Ad5 (nt 1 a 458), uma cassete de expressão do gene LacZ no lugar da região E1 e as restantes sequências adenovirais eliminadas ao nível da região E3 (nucleótidos 3 329 a 27 870 e 30 749 a 35 935). A estirpe E. coli BJ é co-transformada com os vectores pTG4662, linearizado com Ciai, e pTG4674, clivado com SgrAI e SsíEII, para obter pTG4682 (Figura 6). Este evento de recombinação homóloga permite uma troca da cassete LacZ de pTG4662 contra a cassete de tTA contida no fragmento proveniente de pTG4674. O vector pTG4683 (Figura 7) obtém-se segundo a mesma tecnologia, por recombinação homóloga in vitro entre o vector pTG4663 clivado com Ciai e o vector pTG4674 digerido 25 com SgrM e BsEW. O vector pTG4663 é semelhante a pTG4662, com a diferença de apresentar uma deleção do essencial da região E4 (nucleótidos 32 994 a 34 998). 3. Constituição de um adenovírus defectivo que expressa o tTA de uma forma indutível

Para controlar a expressão das sequências tTA, recorre-se ao promotor mínimo CMV que compreende, em 5’, 7 cópias de sequências tet O, o que torna o sistema auto-indutível. Com efeito, a produção de algumas moléculas de tTA a partir do promotor não induzido vai permitir activar o sistema. Como anteriormente, produzem-se dois vectores adenovirais, pTG4684 e pTG4685, apresentando ou não deleção da região E4. O promotor CMV de pUHD15-1 é permutado com o seu homólogo regulável isolado de pUHD10-3 sob a forma de um fragmento XhoU-EcoRU Obtém-se pTG4659. A cassete é isolada deste último por digestão com Sspl e HpaI e clonada no vector pTG8343, linearizado com BglU e tratado com Klenow, para originar o vector pTG4675 (Figura 8). A estirpe E. coli BJ é, em seguida, co-transformada com o vector anterior, tratado com SgrA\ e Ss/EII, e com pTG4662 ou pTG4663, linearizado com a enzima C/al, a fim de gerar, por recombinação homóloga, os vectores virais pTG4684 (Figura 9) e pTG4685 (Figura 10).

As partículas virais podem ser obtidas por simples transfecção de uma linha celular apropriada, como seja aquela do exemplo 2.1, na ausência de tetracidina (a adição do antibiótico ao meio de cultura tendo um efeito inibidor sobre a transcrição de tTA e das ORFs 6 e 7 reguladas pelas sequências tet O). 4. Testes funcionais de microinfecção e de microtitulação

As experiências são efectuadas em paralelo nas células 293, que complementam a função E1, e nas células 1653, que complementam as funções E1 e E4. As células são distribuídas numa placa de cultura à razão de cerca de 5 x 104 células por poço. Elas são, em seguida, transfectadas com os vectores a testar, pTG4682 a 4685. Avalia-se a sua capacidade de formar placas nos dois tipos celulares (seguindo a sua velocidade de aparecimento), assim como o seu tamanho. Como controlo, utilizam-se os vectores recombinantes pTG4662 e pTG4663, que correspondem, respectivamente, a vectores adenovirais de primeira geração (deleção de E1 e E3) e de segunda geração (deleção suplementar de E4) que não expressam tTA. 26 A geração de partículas virais a partir da construção pTG4662 é facilmente detectável e isto nas duas linhas celulares (formação de grandes placas que aparecem rapidamente). Quanto a pTG4663, ele apenas se pode propagar nas células 1653 que complementam E1 e E4 e origina pequenas placas que surgem tardiamente.

No que diz respeito aos vectores pTG4682 e pTG4684, a sua transfecção nas células 293 e 1653 é rapidamente seguida da formação de grandes placas facilmente referenciáveis (comportamento semelhante ao controlo pTG4662). Os vectores pTG4683 e pTG4685 com deteções da região E4 comportam-se de uma forma comparável a pTG4663: na linha 1653, as partículas virais surgem lentamente formando placas de tamanho reduzido, enquanto na linha 293 não se detectam placas. Estes resultados parecem indicar que a expressão de tTA não é prejudicial para a propagação virai nem tóxica para o crescimento celular.

Como indicado anteriormente, é possível aplicar esta tecnologia à linha do exemplo 1 (293/pTG4673) e aos vectores pTG4696 e pTG4697. EXEMPLO 3: Constituição da linha de complementacão 5606 para as funções E1 e E4. na qual a expressão de E4 é indutível pelo tTA produzido pela linha

Este exemplo descreve uma linha celular de complementação que permite a propagação de adenovírus deficiente E1' e E4', obtida por transfecção das células 293 com o vector pTG5606 que transporta, além do gene de selecção pac, as sequências que codificam as ORFs 6/7 e o tTA colocadas sob o controlo do promotor designado a seguir por pCMV*, o qual corresponde ao promotor mínimo CMV (posição -53 em relação ao local de iniciação da transcrição) munido em 5’ de 7 sequências consecutivas tet O. Este sistema auto-indutível permite, em primeiro lugar, a produção de algumas moléculas de tTA a partir do promotor CMV mínimo, as quais poderão actuar positivamente sobre as sequências tet O e amplificar a sua própria síntese e a dos produtos ORF 6/7 em quantidade suficiente para uma complementação eficaz dos vectores defectivos. 1. Construção do píasmídeo pTG5606

Começa-se por construir o vector pTG4688, que resulta da clonagem da cassete (promotor/enhancer CMV - tTA) purificada de pTG4673 (exemplo 1.1) clivado com Hpa\ e

PvlA no vector pTG4677 (exemplo 2.1) digerido com estas mesmas enzimas. O vector pTG5606 é obtido a partir do vector anterior, por substituição do promotor/enhancer CMV pelo promotor regulável pCMV*. Para fazer isto, o vector pTG4688 é linearizado com as enzimas Sca\-Xba\, antes de inserir o fragmento Sca\-Xba\ transportando o pCMV* isolado de pTG4659. O plasmídeo pTG5606 assim gerado (Figura 11) compreende as três cassetes de expressão seguintes: uma primeira cassete composta pelo promotor pCMV*, por sequências que codificam o transactivador tTA e por sequências polyA do vírus SV40; uma segunda cassete composta pelo gene de resistência à puromicina (gene pac), sob o controlo do promotor precoce, e por sequências pA do vírus SV40; e uma terceira cassete composta pelo promotor pCMV*, seguido das sequências que codificam as ORFs 6/7 do adenovírus 5 munidas do seu próprio sinal polyA. 2. Criação da linha de complementação 5606.

Crescem-se 4 x 106 células 293 (ATCC CRL1573) em meio DMEM (Dubelco’s modified Eagle’s médium) na presença de FCS a 10%. A cerca de 70 a 80% de confluência, as células são distribuídas por várias caixas e depois são transfectadas com 10 pg de plasmídeo pTG5606 (kit de transfecção Gibco-BRL; ref 530-8120SA). Após 48 horas, as células são crescidas em meio selectivo (puromicina 0,7 pg/ml durante a primeira semana e, em seguida, 1 pg/ml). Os clones resistentes são amplificados no meio selectivo anterior, eventualmente na presença de tetraciclina. Esta última exerce um efeito repressor sobre as sequências tet O, e a sua adição tem como objectivo reduzir a síntese dos produtos de expressão das ORFs 6/7, a qual se poderia revelar citotóxica e conduzir à morte celular. Desta forma, constituíram-se três lotes de acordo com a concentração de tetraciclina contida no meio: respectivamente, 0 pg/ml, 1 μg/ml e 5 pg/ml. Surgem vários clones, quaisquer que sejam as quantidades de ADN transfectado e as condições de cultura.

Os clones que co-expressam os genes E1 e E4 foram calibrados através de uma técnica de microinfecção e mlcrotitulação. Uma centena de clones 5606 é infectada a uma moi (multiplicidade de infecção) fraca com um vector adenovirai defectivo ΕΓ E4' (consultar, por exemplo, o pedido internacional WO 94/28152). 48 a 72 h após a infecção, observa -se uma citopatia para 10 a 16% dentre eles, de acordo com o lote do qual provêm. A citopatia demonstra a multiplicação dos vírus duplamente defectivos e reflecte a capacidade de trans-complementação do clone. O título em partículas virais infecciosas é estimado por meio de uma técnica de titulação em micropoços em células permissivas. Para realizar isto, recuperam-se as partículas virais das culturas infectadas através de três ciclos de congelação-descongelação, diluem-se em série os sobrenadantes virais a titular, à razão de 100 μΙ por poço, e colocam-se em presença de 4 x 104 células 1653. O título virai é avaliado grosseiramente por observação da citopatia às diferentes diluições. Os clones 5606 mais produtores (citopatia às diluições elevadas) são conservados para um estudo mais preciso do rendimento em pfu/ml e em ifu/ml.

Os clones 5606 seleccionados são crescidos (5 x 105 células) e infectados de novo com um vector adenoviral E1' E4\ Podem utilizar-se, por exemplo, os vectores AdTG8595 e AdTG4651 com deleções das regiões Ε1, E3 (nt 28 592 a 30 470) e E4 (nt 32 994 a 34 998) e que compreendem, no lugar de E1, a cassete de expressão do gene de interesse, respectivamente, promotor MPL-LacZ e promotor MLP-gene CFTR. Como anteriormente, recuperam-se os sobrenadantes virais e determina-se o título em pfu/ml por infecção de uma linha permissiva (linha 1653 ou o clone produtor 5606), diluições apropriadas do sobrenadante virai e contagem das placas de lise em agar. Dois clones designados #5-19/1 e #5-38 fornecem títulos que variam entre 1 e 5 x 109 pfu/ml (titulação efectuada sobre eles mesmos). O rendimento em partículas infecciosas (ifu/ml) é avaliado através da enumeração das células infectadas que expressam o gene de interesse. Assim, os sobrenadantes virais obtidos dos clones 5606 infectados com AdTG8595 são titulados sobre eles próprios e, 48 horas após a infecção, as células aderentes são fixadas (tampão PBS contendo 2% de formaldeído e 0,2% de glutaraldeído) e a produção de β-galactosidase revelada por meio do corante X-Gal (1 mg/ml em tampão PBS ao qual foi adicionado K-ferricianeto 5 mM, K-ferrocianeto 5 mM e MgCI2 2 mM). Os títulos obtidos estão compreendidos entre 101° e 1011 ifu/ml.

Finalmente, verifica-se que a expressão dos genes virais tardios não é alterada, o que poderia conduzir a uma anomalia de constituição das partículas virais. A produção de fibra e de penton é determinada por Western blot dos resíduos de células infectadas recuperados após os ciclos de congelação-descongelação. A análise é efectuada de acordo com as técnicas Standard, numa alíquota de extracto celular correspondente a 3 μς de proteínas, com a ajuda de anticorpos dirigidos contra a fibra (Henry et ai., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246) ou o penton-base (Boulanger et ai., 1973, Eur. J. Biochem. 39, 37-42), e depois de anticorpos anticoelho marcados com peroxidase (Amersham, NA 934). A revelação tem lugar utilizando o kit de detecção ECL (Amersham, RPN 2106). Os dados indicam que os adenovírus ΕΓ E4‘ gerados a partir dos dois clones 5606 são capazes de produzir as proteínas tardias a um nível que se aproxima daquele obtido nas células 293 infectadas com um vírus E1\

Em conclusão, os clones 5606 #5-19/1 e #5-38 constituem linhas de complementação E1 e E4 capazes de amplificar os vectores duplamente defectivos com um título que ultrapassa 1 x 109 pfu/ml, título este compatível com uma produção em grande escala. EXEMPLO 4: Constituição da linha de complementacão 9579 para as funções E1 e E2A. na aual a expressão de E2A é indutível por tTA, sendo este produzido pela linha.

Este exemplo descreve uma linha celular de complementação que permite a propagação de adenovírus deficientes E1' e E2A\ obtida por transfecção das células 293 com o vector pTG9579 que permite uma expressão auto-indutível da proteína DBP, segundo o mesmo princípio que no exemplo anterior. 1. Construção do vector pTG9579 O vector pTG9579 é construído da seguinte forma:

Isola-se a extremidade 3’ do genoma do adenovírus 5 a partir de uma preparação de ADN genómico digerida com Dra\-BsirB\. O fragmento correspondente é subclonado no local Smal do vector pUC19 (Gibco BRL) para originar o vector intermediário pTG9568. Assinala-se que o codão STOP da sequência DBP é destruído pela clivagem com Dral. Este é restaurado por introdução, entre os locais EcoRV e BamHi do vector pTG9568, de um fragmento que compreende a sequência correcta obtida por amplificação por PCR a partir da matriz genómica e de iniciadores adequados. Obtém-se pTG9571.

Por outro lado, o vector pUHD-10-3 é linearizado com HindlW e tratado com Klenow, inserindo-se a cassete de expressão do gene neo (Colbère-Garapin et ai., 1981, J. Mol. Biol. 150,1-14) controlada pelo promotor precoce e o sinal pA de SV40. O vector obtido desta forma, pTG9555, é linearizado com Xba\ e depois submetido à acção de Klenow, antes de se clonar o fragmento que transporta a sequência DBP, isolada de pTG9571 após clivagem com Xhol e EcoRI e tratamento com Klenow. Finalmente, introduz-se no local XhoI tratado com Klenow do vector pTG9577, que foi produzido na etapa anterior, o fragmento Hpa\-Xhd (Klenow) isolado de pTG4659 portador da cassete de expressão do gene tTA para originar pTG9579. Em resumo, este compreende: uma primeira cassete composta pelo promotor pCMV*, seguido das sequências que codificam o transactivador tTA e das sequências polyA do vírus SV40; uma segunda cassete composta pelo gene neo de resistência ao antibiótico G418, sob o controlo do promotor precoce, e por sequências pA do vírus SV40; e uma terceira cassete composta por sequências que codificam a proteína DBP do adenovírus 5, sob o controlo do promotor pCMV*, e por sequências pA do vírus SV40. A produção de uma proteína DBP funcional por pTG9579 pode ser verificada por meio de transfecção transitória nas células 293. Resumidamente, transfectam-se 1 x 106 células com 5 pg de vector através do método do fosfato de cálcio e, em seguida, crescem-se estas células na presença (1 pg/ml) ou na ausência de tetraciclina. 4 dias após a transfecção, recuperam-se as células e trata-se o resíduo celular com 100 μΙ de tampão de lise (Tris-HCI 50 mM, MgCI21 mM, EDTA 1 mM, KCI 5 mM, NaCI 150 mM e Triton X-100 a 1%) para solubilizar as proteínas. Recuperam-se 7 μΙ de extracto proteico num tampão de carga Tris Glicina contendo 5% de β-mercaptoetanol e submete-se o extracto a uma electroforese PAGE 8-16% em condições desnaturantes. Após a transferência para uma membrana de nitrocelulose, a proteína DBP é revelada por Western blot com a ajuda de um anticorpo específico para a proteína DBP adenoviral (Reich et al., 1983, Virology 128,480-484; por exemplo, o anticorpo monoclonal de rato a72KB 6-8) e de um anticorpo de carneiro anti-imunoglobulina de rato marcado com peroxidase (Amersham; NA 931). A revelação é efectuada com o kit ECL (Amersham, RPN 2106). Os resultados apresentados na Figura 12 mostram que a proteína DBP é produzida nas células 293, transfectadas de forma transitória com o vector pTG9579, de uma forma regulada, uma vez que a expressão é reduzida na presença de tetraciclina. * 2. Criação da Unha celular de complementação 9579

Utilizam-se 20 μρ de plasmídeo pTG9579 para transfectar 3x10® células 293 (kit de transfecção Gibco BRL; ref 530-8120SA). Os clones são seleccionados na presença de 600 με|/ΓηΙ de G418 e de 1 μς/ΓηΙ de tetracicllna e são testados, através da técnica de Western blot descrita anteriormente, quanto à sua capacidade para produzir a proteína DBP. 20% dentre ele3 expressam quantidades detectáveis de DBP, entre os quais dois, designados #7-44 e #7-32, a um nível próximo daquele obtido na linha gmDBP6 na presença de dexametasona. Esta última constitui a linha de referência para a complementação da função E2A (Brough et al., 1992, Virol. 190, 624-634). Ela deriva de células HeLa transfectadas com uma cassete de expressão que compreende as sequências que codificam a DBP, controladas pelo promotor MMTV indutível pela dexametasona.

Os clones DBP positivos são crescidos e infectados a uma moi > 1 com o adenovírus H5dl802 defectivo em termos da função E2A (Rice & Klessig, 1985, J. Virol. 36, 767-778). Dois dias após a infecção, recolhem-se os sobrenadantes virais após lise das células por ciclos consecutivos de congelação-descongelação, diluem-se em série e titulam-se na linha permissiva gmDBP6. A presença de partículas virais é observada nos sobrenadantes provenientes dos clones #7-44 e #7-32, mostrando a sua capacidade para complementar a função E2A. Realiza-se o mesmo tipo de experiência com o vector pTG9542 (E1' (LacZ) E2A‘ e E3‘). Produzem-se partículas infecciosas, mostrando que estes dois clones estão aptos a propagar e amplificar vectores duplamente defectivos. Além disso, elas não se podem propagar na linha 293, confirmando o fenótipo E2A' e a ausência de revertentes.

Experiências de amplificação conduzidas com o clone #7-44 infectado com o vírus AdTG9542 mostraram um factor de amplificação de cerca de 125 quando a titulação é efectuada 4 dias após a infecção.

Lisboa, >2 0 DEZ. 2001 Por TRANSGENE S.A.

32

Claims (28)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vector virai que compreende uma unidade de expressão funcional em células de complementação e não funcional numa célula hospedeira, que controla a expressão de um ou vários genes virais, caracterizado pela referida unidade de expressão compreender uma ou várias sequências de regulação que permitem activar a expressão dos referidos genes virais na presença de um indutor e inibir a referida expressão na presença de um repressor.
2. 2. Vector virai de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida unidade de expressão compreender uma ou várias sequências de regulação que derivam de um operão bacteriano.
3. 3. Vector virai de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela referida unidade de expressão compreender uma ou várias sequências de regulação que derivam do operão da tetraciclina.
4. 4. Vector virai de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo referido operão da tetraciclina ser codificado pelo transposão Tn10.
5. 5. Vector virai de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pela referida sequência de regulação ser a sequência tet O.
6. 6. Vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela referida sequência de regulação ser colocada a montante da TATA box do promotor da referida unidade de expressão.
7. 7. Vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela referida sequência de regulação ser colocada a jusante da TATA box do promotor da referida unidade de expressão.
8. 8. Vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela referida unidade de expressão compreender entre 1 e 20, de preferência entre 1 e 10, de forma especialmente preferida entre 1 e 7, sequências de regulação que permitem activar 1 a expressão dos referidos genes virais na presença de um indutor e inibir a referida expressão na presença de um repressor.
9. 9. Vector virai de acordo com uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo referido promotor ser um promotor mínimo do vírus CMV.
10. 10. Vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo: (i) referido repressor que permite inibir a referida expressão ser seleccionado entre o grupo que consiste no antibiótico tetraciclina, na tetraciclina anidra e no repressor tetraciclina tet R e (ii) pelo referido indutor que permite activar a referida expressão consistir numa proteína resultante da fusão entre o tet R e os 130 aminoácidos C-terminais do domínio de activação da proteína VP16 do vírus simplex do herpes (tTA).
11. 11. Vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, derivado de um vírus seleccionado entre o vírus do herpes, o citomegalovírus, o AAV (vírus associado ao adenovírus), o vírus pustular e o adenovírus.
12. 12. Vector virai de acordo com a reivindicação 11, derivado de um adenovírus de origem humana, canina, aviária, bovina, murina, ovina, suína ou símia ou ainda de um híbrido compreendendo fragmentos de genoma adenoviral de diferentes origens.
13. 13. Vector virai de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado por ser defectivo em termos da replicação.
14. 14. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser pelo menos desprovido de toda ou parte da região E1 e, opcionalmente, de toda ou parte da região E3.
15. 15. Vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado por compreender uma ou várias unidades de expressão que compreendem um ou vários genes adenovirais das regiões E2, E4 ou L1-L5. <
16. 16. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender uma unidade de expressão composta por uma ou várias sequências de regulação que derivam do operão da tetraciclina, colocada(s) a montante da TATA box do promotor e das grelhas de leitura aberta (ORFs) 6 e 7 da região E4, de forma a que a expressão das referidas grelhas de leitura seja activável por um indutor do tipo transactivador tetraciclina (tTA) e reprimível pela tetraciclina.
17. 17. Vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por compreender uma segunda unidade de expressão que consiste numa sequência nucleotídica exógena colocada sob o controlo dos elementos necessários à sua expressão na célula hospedeira.
18. 18. Vector virai de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela sequência nucleotídica exógena ser seleccionada entre os genes que codificam uma citocina, um receptor celular ou nuclear, um ligando, um factor de coagulação, a proteína CFTR, a insulina, a distrofina, uma hormona de crescimento, uma enzima, um inibidor de enzimas, um polipéptido com efeito antitumoral, um polipéptido capaz de inibir uma infecção bacteriana, parasitária ou virai, particularmente o VIH, um anticorpo, uma toxina, uma imunotoxina e um marcador.
19. 19. Vector virai de acordo com uma das reivindicações 17 e 18, caracterizado pelos elementos necessários à expressão da referida sequência nucleotídica exógena compreenderem um promotor diferente daquele incluído na unidade de expressão que controla a expressão do ou dos referidos genes virais.
20. 20. Partícula virai infecciosa que compreende um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 19.
21. 21. Célula hospedeira eucariota que compreende um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 19 ou uma partícula virai infecciosa de acordo com a reivindicação 20.
22. 22. Processo de preparação de uma partícula virai infecciosa de acordo com a reivindicação 20, de acordo com o qual: 3 (i) introduz-se um vector vira! de acordo com uma da reivindicações 1 a 19 numa célula de complementação capaz de complementar em trans o referido vector virai, de forma a obter uma célula de complementação transfectada, (ii) cresce-se a referida célula de complementação transfectada em condições apropriadas para permitir a expressão dos genes virais e a produção da referida partícula virai infecciosa, e (iii) recupera-se a referida partícula virai infecciosa a partir da cultura celular.
23. 23. Produto de combinação que compreende: (i) um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 19, uma partícula virai infecciosa de acordo com a reivindicação 20 ou obtida de acordo com o processo da reivindicação 22, ou uma célula hospedeira eucariota de acordo com a reivindicação 21, (ii) um repressor capaz de inibir a expressão dos referidos genes virais.
24. 24. Produto de combinação de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo referido repressor ser seleccionado entre o grupo que consiste no antibiótico tetraciclina, na tetraciclina anidra e no repressor tetraciclina tet R.
25. 25. Composição farmacêutica que compreende um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 19, uma partícula virai infecciosa de acordo com a reivindicação 20 ou obtida de acordo com o processo da reivindicação 22, uma célula hospedeira eucariota de acordo com a reivindicação 21 ou um produto de combinação de acordo com a reivindicação 23 ou 24, em associação com um suporte aceitável de um ponto de vista farmacêutico.
26. 26. Utilização de um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 19, de uma partícula virai infecciosa de acordo com a reivindicação 20 ou obtida de acordo com o processo da reivindicação 22, de uma célula hospedeira eucariota de acordo com a reivindicação 21, de um produto de combinação de acordo com a reivindicação 23 ou 24 ou de uma composição de acordo com a reivindicação 25 para a preparação de um medicamento destinado a efectuar um tratamento do corpo humano ou animal por terapia genética.
27. 27. Utilização de acordo com a reivindicação 26 em associação com um repressor.
28. 28. Utilização de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo referido repressor ser seleccionado entre o grupo que consiste no antibiótico tetraciclina, na tetraciclina anidra e no repressor tetraciclina tet R.

    Lisboa, >2 0 BEZ. ?l)01 Por TRANSGENE S.A.

    5