ES2239841T3 - Vectores adenovirales quimericos. - Google Patents

Abstract

Vector adenoviral que deriva de un genoma adenoviral, caracterizado porque comprende una región esencial para la encapsidación de origen adenoviral y heteróloga en relación con dicho genoma adenoviral.

Description

Vectores adenovirales quiméricos.

La presente invención se refiere a unos nuevos vectores adenovirales que presentan la característica de contener una región esencial en la encapsidación heteróloga en relación con el genoma adenoviral del que derivan. Dichos vectores se pueden utilizar a modo de vectores auxiliares o recombinantes, permitiendo los primeros la propagación de los segundos. La invención tiene asimismo por objeto un procedimiento para la preparación de una preparación viral que contiene dichos vectores adenovirales, una célula, una composición farmacéutica o de una materia que los comprende así como su utilización para unos fines terapéuticos o profilácticos. Por último, la presente invención tiene asimismo por objeto un genoma adenoviral de origen animal que presenta unas capacidades de encapsidación atenuadas en relación con el genoma nativo del que deriva. La invención presenta un interés particular por unas perspectivas de terapia génica, principalmente en humanos.

La terapia génica se define como la transferencia de la información genética en una célula o un organismo huésped. El primer protocolo aplicado a los humanos se inició en los Estados Unidos en Septiembre de 1990 en un paciente genéticamente inmunodeficiente a razón de una mutación que afecta el gen codificante para la Adenina Desaminasa (ADA). El éxito relativo de dicho primer experimento ha animado el desarrollo de dicha tecnología para diversas enfermedades tanto genéticas (con el fin de corregir una disfunción de un gen defectuoso) como adquiridas (cánceres, enfermedades infecciosas como el SIDA). La mayoría de las estrategias actuales utilizan unos vectores para vehiculizar el gen terapéutico hacia la diana celular. Se ha desarrollado numerosos vectores tanto virales cono sintéticos a lo largo de los últimos años y han sido el objeto de numerosas publicaciones accesibles para el experto en la materia.

El interés de los adenovirus a título de vectores de terapia génica ha sido evocado con anterioridad en numerosos documentos de la técnica anterior. Infectan numerosos tipos celulares, tanto unas células en división como células quiescentes, son no integrativos y poco patógenos. Además, presentan un tropismo natural por las vías respiratorias. Dichas propiedades particulares hacen de los adenovirus unos vectores de elección para numerosas aplicaciones terapéuticas e incluso de vacunas. A título indicativo, su genoma está constituido por una molécula de ADN lineal y bicatenaria de aproximadamente 36 kb que presenta una treintena de genes que intervienen en el ciclo viral. Los genes precoces (E1 a E4; E para early en inglés) se reparten en 4 regiones dispersas en el genoma. Las regiones E1, E2 y E4 son esenciales para la replicación viral mientras que la región E3 implicada en la modulación de la respuesta inmunitaria anti-adenovirus en el huésped no lo es. Los genes tardíos (L1 a L5; L para late que significa tardío en inglés) codifican mayoritariamente para las proteínas de estructura y recubren en parte las unidades de transcripción precoces. Para la mayoría están transcritos a partir del promotor mayor tardío MLP (para Major Late Promoter en inglés). Además, el genoma adenoviral presenta en sus extremos unas regiones que actúan en cis esenciales para la encapsidación constituidas por secuencias terminales inversas (ITR) situadas en los extremos 5' y 3' y de una región de encapsidación que sigue al ITR 5'.

Los vectores adenovirales actualmente utilizados en los protocolos de terapia génica están desprovistos de la mayor parte de la región E1 con el fin de evitar su diseminación en el entorno y el organismo huésped. Unas delecciones adicionales en la región E3 permiten incrementar las capacidades de clonación. Los genes de interés se introducen en el ADN viral en lugar de una o otra región deleccionada. Si la realización de la transferencia de genes utilizando dichos vectores denominados de primera generación está actualmente bien establecida, la cuestión de su inocuidad permanece sin resolver. Además del riesgo de generar unas partículas competentes para la replicación, la inmunogenicidad potencial de las proteínas virales que aún se expresan puede en determinadas aplicaciones particulares oponerse a la persistencia de las células traducidas y a la expresión estable del transgen. Dichos inconvenientes han justificado la construcción de vectores de nuevas generaciones. Conservan las regiones en cis (ITRs y secuencias de encapsidación) esenciales para la encapsidación pero presentan unas modificaciones genéticas adicionales que apuntan a la supresión de la expresión in vivo del esencial de los genes virales (ver por ejemplo la solicitud internacional WO94/28152). A este respecto, un vector denominado mínimo, deficiente para el conjunto de funciones adenovirales representa una alternativa de elección.

Las técnicas de preparación de los vectores adenovirales están ampliamente descritas en la bibliografía. En un primer momento, el genoma está constituido por recombianción homóloga de la línea 293 (ver principalmente Graham y Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocols; Ed. E.J. Murray, The Human Press Inc., Clinton, NJ) o en Escherichia coli (ver por ejemplo la solicitud internacional WO96/17070). A continuación es necesario propagar el vector con el fin de constituir un depósito de partículas virales que lo contengan. Dicha etapa de producción es crítica y debe permitir alcanzar unos títulos elevados de partículas infecciosas para poder prever un desarrollo a gran escala en vista a la preparación de lotes clínicos. Se utilizan a dicho efecto unas líneas de complementación que proporcionan en trans los productos de expresión virales para los que el vector es defectuoso. Por ejemplo, los virus deleccionados de E1 se pueden propagar en la línea 293, establecida a partir de las células de riñón embrionario humano (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). En lo que se refiere a los vectores de segunda generación, se puede recurrir a unas líneas que complementan dos funciones virales esenciales, tales como las descritas por Yeh et al. (1996, J. Virol. 70, 559-565); Krougliak y Graham (1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586), Wang et al. (1995 Gene Therapy 2, 775-783), Lusky et al. (1998, J. Virol. 72, 2022-2033) y en las solicitudes internacionales WO94/28152 y WO97/04119. Del hecho de la toxicidad potencial de los productos de expresión virales, dichas líneas necesitan ser optimizadas en término de capacidad de crecimiento y rendimiento en partículas virales, antes de prever su utilización en un procedimiento industrial. Además, una línea que complementa el conjunto de las funciones adenovirales adaptada a la propagación de los vectores mínimos todavía no está disponible en la actualidad.

Otra alternativa reside en el empleo de un elemento viral suplementario denominado "virus auxiliar" para complementar por lo menos en parte las funciones defectuosas de un vector adenoviral recombinante. Los virus auxiliares de la técnica anterior consisten en un genoma adenoviral, eventualmente deleccionado de una región esencial para la que el vector recombinante no necesita complementación. A título de ejemplo, la co-transfección en la línea 293 de un virus auxiliar E1 y de un vector recombinante E1'E4' lleva a la formación de partículas virales de vector recombinante. La función E1 está proporcionada por la línea 293 y la función E4 para el virus auxiliar.

Sin embargo, un inconveniente mayor de dicho método es que las células producen una población mixta de partículas virales, unas presentan el vector recombinante y las otras el vector auxiliar. En la práctica, las preparaciones contienen mayoritariamente unas partículas virales auxiliares, las que presentan una ventaja selectiva, de modo que la contaminación puede alcanzar e incluso sobrepasar el 90%. La presencia del virus auxiliar no es deseable en el ámbito de una terapia aplicada a humanos y, de hecho, necesita la utilización de técnicas físicas de separación, tales como la ultracentrifugación.

La presente invención se propone explotar las propiedades de crecimiento respectivas de los adenovirus humanos y animales. Ahora se ha puesto de manifiesto la incapacidad de los adenovirus bovinos BAV3 para propagarse en una línea humana mientras que el Ad5 puede propagarse en unas células bovinas. En efecto, la infección de adenovirus BAV3 solos o en presencia de Ad5 en la línea humana 293 no conduce a la formación de partículas virales infecciosas BAV3. Por el contrario unos viriones Ad5 se obtienen por infección de una línea bovina. Además, no hay expresión de las proteínas virales BAV3 en las células humanas.

Sobre la base de dichas observaciones, la presente invención propone principalmente un sistema de encapsidación que se desarrolla en dos etapas y que utiliza unos adenovirus quiméricos entre Ad5 y BAV3. Se ha construido ahora (i) un vector auxiliar derivado de un genoma Ad5 en el que la región de encapsidación nativa está sustituida por la del adenovirus bovino BAV3 y (ii) un vector adenoviral defectuoso recombinante que deriva de un Ad5 y que comprende dos regiones de encapsidación, la primera de origen Ad5 (autóloga) y la segunda de origen BAV3 (heteróloga). La transfección de los dos vectores en una línea celular bovina infectada por un adenovirus BAV3 conduce a la amplificación de los tres genomas virales y a la producción de partículas virales de los tres tipos. A lo largo de dicha primera etapa de amplificación, el genoma BAV3 proporciona los factores que actúan en trans que permiten la encapsidación de los vectores recombinante y auxiliar y dicho último complementa por lo menos en parte las funciones defectivas del vector recombinante. La mezcla de los tres tipos de virus se recupera en unas células bovinas y se utiliza para infectar unas células humanas 293. El genoma BAV3 y el vector auxiliar que presentan únicamente una región de encapsidación derivada de BAV3 no se pueden propagar en la línea humana incluso en presencia de Ad5 debido a la ausencia de los factores de encapsidación que reconocen las secuencias BAV3, lo que excluye la formación de partículas virales correspondientes. Sin embargo, el vector auxiliar puede producir en trans los factores necesarios para la encapsidación del vector recombinante mediada por la señal de encapsidación de origen Ad5 y complementar, en asociación con las células 293, las funciones precoces y tardías defectivas, con el fin de generar de forma mayoritaria unos viriones que contienen el vector recombinante. La presente invención responde a dichos objetivos de seguridad reduciendo considerablemente la contaminación de las preparaciones adenovirales por los vectores auxiliares y evita de este modo la utilización de técnicas de separación largas, costosas y de eficacia variable.

Por ello, la presente invención tiene por objeto un vector adenoviral que deriva de un genoma adenoviral caracterizada porque comprende una región esencial para la encapsidación de origen adenoviral heteróloga en relación con el genoma viral del que deriva.

En el sentido de la presente invención, un vector adenoviral se obtiene a partir de un adenovirus parental cuyo genoma se ha modificado. Una modificación mínima es la inserción de una región esencial para la encapsidación de un origen diferente (heteróloga). Entendiendo que se pueden prever igualmente otras modificaciones. Dichas modificaciones pueden ser diversas (delección, adición, sustitución de uno o diversos nucleótidos) y están localizadas en el núcleo de las regiones codificantes del genoma adenoviral o fuera de las mismas (regiones implicadas en la expresión de los genes virales, en la encapsidación ...) y tocando tanto las regiones precoces como las tardías. Con este respecto, un vector adenoviral particularmente adaptado para la presente invención es defectuoso, es decir es incapaz de propagarse de forma autónoma en una célula huésped en ausencia de complementación. Dichos genes pueden estar deleccionados (en totalidad o en parte), convertidos en no funcionales (por ejemplo por mutación) o sustituidos por otras secuencias (principalmente por un gen de interés del que se busca la expresión en una célula o un organismo huésped).

El vector adenoviral de la presente invención puede derivar de un adenovirus humano o animal y de un serotipo cualquiera. Los adenovirus humanos del subgrupo C y principalmente los adenovirus 2 (Ad2) y 5 (Ad5) convienen particularmente para la utilización de la invención. De entre los adenovirus animales utilizables en el ámbito de la presente invención, se pueden citan los adenovirus caninos, aviarios, bovinos, murinos, ovino porcinos, simios etc.... A título ilustrativo, se pueden emplear los adenovirus murinos Mav1 (Beard et al., 1990, Virology 175, 81-90); caninos CAV-1 o CAV-2 (Spibey y Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70, 165-172; Linné, 1992, Virus Research 23, 119-133; Shibata et al., 1989, Virol. 172, 460-467; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60, 21-28), aviarias DAV (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128, 171-176) o incluso bovinos BAV3 (Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76, 93-102). De una forma general, los adenovirus citados anteriormente están disponibles en las colecciones y principalmente en la ATCC y snn el objeto de numerosos estudios publicados en la técnica anterior. En cuanto a los adenovirus 5 (Ad5), conviene resaltar que la secuencia completa de su genoma está disponible en el Genbank bajo el número de acceso M73260. Dicha secuencia está integralmente incorporada por referencia en la presente memoria.

En la presente invención, deberá entenderse por "región esencial para la encapsidación", una región que actúa en cis para asegurar, en colaboración con unos factores proteicos principalmente virales, la encapsidación de un genoma de vector viral en una cápsida viral. Tales regiones consisten principalmente en el caso del genoma adenoviral, en los ITR 5' y 3', y la región de encapsidación. Dichos términos son bien conocidos en el ámbito de la técnica considerada.

La característica del vector adenoviral según la invención es que presenta una región esencial para la encapsidación heteróloga, es decir de un origen diferente en relación con el adenovirus parental. De forma preferida, según la presente invención, dicha región esencial para la encapsidación heteróloga consiste en una secuencia de encapsidación y eventualmente en por lo menos unos ITR 5' y 3'.

Según el origen del adenovirus, las regiones esenciales para la encapsidación pueden variar un poco. Sin embargo, se pueden identificar en base a los datos de la secuencia disponibles o por analogía con los adenovirus humanos. Los ITR se localizan naturalmente en los extremos 5' y 3' del genoma adenoviral y están implicados en las etapas de replicación y de encapsidación de dicho genoma. Generalmente, los ITR presentan entre 100 y 200 pares de bases. En la bibliografía se han propuesto numerosas secuencias de ITR, citamos a modo de ejemplo Hearing et al., 1987, J. Virol, 61, 2555-2558 para Ad5 o el documento WO 95/16048 para BAV3. La región de encapsidación (indicada \Psi) está localizada después del ITR 5' del genoma adenoviral y presenta unos grupos redundantes que participan en la encapsidación. Por ejemplo, la de Ad5 presenta 7 grupos indicados como AI a AVII de secuencia consenso 5' A/T AN A/T TTTG 3' (en la que N representa un nucleótido cualquiera) y situadas en las posiciones 241-248, 262-269, 304-311, 314-321 y 339-346 del genoma viral (Grable y Hearing, 1990, J. Virol. 64, 2047-2056, Schmid y Hearing, 1998, J. Virol. 72, 6339-6347). Las regiones de encapsidación de diversos adenovirus están descritas en la bibliografía (ver por ejemplo Hammarskjold y Winberg, 1980, Cell 20, 787-795 para el Ad16; Hearing et al., 1987, J. Virol. 61, 2555-2558 para el Ad5; Robinson et Tibbets, 1984, Virology 137, 276-286 para el Ad3; Shibata et al., 1989, Virology 172, 460-467 para CAV2; el documento WO95/16048 para BAV3). A título puramente ilustrativo, se indica que la región de encapsidación de Ad5 se extiende por lo menos en los nucleótidos (nt) 240 a 350. En cuanto a la de BAV3, está comprendida en el seno de un fragmento de 0,3 Kb entre las posiciones aproximadamente 185 a aproximadamente 514. Sin embargo, los límites de la región de encapsidación pueden variar y convienen igualmente unas regiones más cortas o más largas. El experto en la materia es capaz de aislar un fragmento del extremo 5' de un genoma adenoviral, de insertarlo en un vector adecuado y de comprobar sus capacidades de encapsidación en una línea adecuada, por ejemplo determinando el título viral o la expresión de un gen marcador.

Las secuencias que presentan la parte esencial para la encapsidación heteróloga pueden estar aisladas de un genoma viral por unos medios convencionales (digestión por enzima de restricción, PCR,...) o producidas por síntesis química. Eventualmente, en el ámbito de la presente invención, pueden comprender unas mutaciones (delecciones, sustitución y/o adición de uno o diversos nucleótidos) en relación con las secuencias nativas. Es asimismo posible incluir otras secuencias exógenas (sitios de restricción, etc...). Se pueden insertar en el vector adenoviral según la invención en sus de la región autóloga o en sustitución de dicha última. La inserción puede darse en 5' o en 3' de la región autóloga, en su sitio o en un lugar diferente (por ejemplo en el extremo 3' justo antes del ITR 3').

Ventajosamente, el vector adenoviral según la invención es originario de un adenovirus de origen humano y la región esencial para la encapsidación heteróloga de un adenovirus de origen animal. A este respecto, un vector particularmente conveniente para la presente invención deriva de un adenovirus humano del subgrupo C y, principalmente de un adenovirus 2 (ad2) o 5 (Ad5). En cuanto a la región esencial para la encapsidación heteróloga, deriva preferentemente de un adenovirus animal seleccionado de entre los citados anteriormente.

Según una forma de realización preferida, el vector adenoviral según la invención deriva de un Ad5 y la región esencial para la encapsidación heteróloga de un adenovirus bovino, principalmente de un BAV3.

Se indica que las formas de realización citadas anteriormente son preferidas pero que se pueden utilizar otras combinaciones en el ámbito de la presente invención. Se puede por ejemplo prever un vector adenoviral que deriva de un Ad5 y que comprende una región esencial para la encapsidación heteróloga obtenido de un adenovirus humano de serotipo diferente (Ad3, Ad7, etc...). Alternativamente, el esqueleto adenoviral puede ser de origen animal y la región esencial para la encapsidación derivada de un adenovirus humano.

Tal como se ha indicado anteriormente, el vector adenoviral según la invención es preferentemente defectuoso por lo menos para función E1. Tal diferencia puede obtenerse por delección total o parcial de la región correspondiente. Se han descrito numerosos vectores E1 en la técnica anterior y se pueden utilizar en el ámbito de la presente de la presente invención. Además, puede comprender unas mutaciones/delecciones adicionales que afectan uno o diversos otros genes virales, principalmente en el seno de las regiones E2, E4 y/o L1-L5. Se pueden prever todas las combinaciones (E1 E2, E1 E4, E1 E2 E4...) Tales vectores están descritos ampliamente en la solicitud internacional WO94/28152. Para ilustrar dichas formas de realización, se puede citar la mutación termosensible que afecta al gen DBP (para DAN Binding Protein en inglés) de la región EA2 (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339). Se puede prever igualmente una delección parcial de la región E4 a excepción de las secuencias que codifican para los marcos de lectura abiertos (ORF) 6 y 7 ( Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048) Otra posibilidad es la delección total de la unidad trasncripcional E4. Por otra parte, el vector adenoviral según la invención puede estar desprovisto de toda o parte de la región no esencial E3. Según dicha alternativa, puede resultar interesante conservar por lo menos las secuencias E3 que codifican para los polipéptidos permitiendo el escape del sistema inmunitario del huésped, principalmente la glicoproteína gp19K (Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71). En determinadas aplicaciones (vector recombinante), se prefiere la no funcionalidad del conjunto de los genes virales.

Según una primera variante, el vector adenoviral según la invención se puede utilizar a modo de vector viral auxiliar para complementar todas o parte de las funciones defectuosas de un vector adenoviral recombinante. Según una forma de realización ventajosa, es defectuoso por lo menos para la función E1. Eventualmente, puede ser defectuoso para unas funciones adicionales tales como E2. Un experto en la materia es apto para definir las deficiencias requeridas en función del vector recombinante que se busca complementar y de la línea celular seleccionada. Se indica que la función E4 puede estar asegurada por el ORF 6 y 7 únicamente. La presencia de toda o parte de la región E3 es facultativa. Según una forma de realización particular, comprende las secuencias ITR5' y 3' y las secuencias que codifican para las funciones E2, E4 y/o L1 - L5 que derivan de un adenovirus humano, principalmente de un Ad5 y una región de encapsidación heteróloga que deriva de un adenovirus bovino, principalmente de un BAV3. Según otra forma de realización, el vector viral auxiliar comprende las secuencias que codifican para las funciones E2, E4 y/o L1-L5 que derivan de un adenovirus humano, principalmente de un Ad5 y de las secuencias ITR 5' y ITR 3' y la región esencial de encapsidación heterólogas de un adenovirus bovino, principalmente de un BAV3.

Se obtiene un vector adenoviral auxiliar según la invención para la inserción en un genoma adenoviral tal como se define a continuación de por lo menos una región esencial para la encapsidación heteróloga. Una forma de realización preferida es sustituir la región esencial para la encaspidación autóloga por la heteróloga. El experto en la materia es apto para realizar tal construcción aplicando las técnicas habituales de biología molecular.

Según una segunda variante, el vector adenoviral según la invención es un vector adenoviral recombinante y comprende por lo menos un gen de interés situado bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en una célula o un organismo huésped.

El gen de interés utilizado en la presente invención, puede obtenerse de un organismo eucariota, de un procariota de un parásito o de un virus diferente de un adenovirus. Se puede aislar mediante cualquier técnica convencional en el ámbito de la técnica, por ejemplo por clonación, PCR o síntesis química. Puede ser de tipo genómico (que presenta todo o parte del conjunto de los intrones), de tipo ADN complementario (ADNc, desprovisto del intrón) o de tipo mixto (minigen). Por otra parte, puede codificar para un ARN antisentido y/o un ARN mensajero (ARNm) que se traducirá a continuación en polipéptido de interés que puede ser (i) intracelular, (ii) incorporado en la membrana de la célula huésped o (iii) secretado. Se puede tratar de un polipéptido tal como se encuentra en la naturaleza (nativo), de una porción del mismo (truncado), de un mutante que presenta principalmente usan propiedades biológicas mejoradas o modificadas o incluso de un polipéptido quimérico que proviene de la fusión de secuencias de orígenes
diversos.

En el ámbito de la presente invención, se puede utilizar ventajosamente un gen de interés que codifica para una citoquina (interferón \alpha, \beta o \gamma, interleuquina (IL), principalmente la IL-2, la IL-6, la IL-10 o incluso la IL-12, un factor necrosante de tumores (TNF), un factor estimulador de colonias (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), un receptor celular (principalmente reconocido por el virus VIH), un ligando de receptor, un factor de coagulación, un factor de crecimiento (FGF para Fibroblast Growth Factor, VEGF para Vascular Endothelial Growth Factor), un enzima (ureasa, renina, trombina, metaloproteinasa, óxido nítrico oxidasa NOS, SOD, catalasa...) un inhibidor de enzima (\alpha1-antitripsina, antitrombina III, inhibidor de proteasa viral, PAI-1 para plasminogen activato inhibitor), un antígeno del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o II o un polipéptido que actúan sobre la expresión de los genes correspondientes, un polipéptido capaz de inhibir una infección viral, bacteriana o parasitaria o su desarrollo, un polipéptido que actúa positivamente o negativamente sobre la apoptosis (Bax, Bcl2, BclX ...) un agente citostático (p21, p16, Rb), una apolipoproteína (ApoA1, ApoAIV, ApoE...) un inhibidor de angiogénesis (angiostatina, endostatina...), un marcador (\beta-galactosidasa, luciferaza...) o cualquier otro gen de interés que tenga un efecto terapéutico para la afección diana. Más precisamente, con le fin de tratar una disfunción hereditaria, se utilizará una copia funcional del gen defectuoso, por ejemplo un gen que codifica para el factor VIII o IX en el marco de la hemofilia A p B, la distrofina en el marco de las miopatías de Duchenne y Becker, la insulina en el marco de la Diabetes, la proteína CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) en el marco de la mucoviscidosis. Al tratarse de iniciación o progresión de tumores o cánceres, se utilizará preferentemente un gen de interés que codifica para un ARN anti-sentido, un ribozoma, un producto citotóxico (timidina quinasa del virus simples del herpes 1 (TK-HSV-1), ricino, toxina colérica, diftérica, producto de los genes de levadura FCY1 y FUR1 que codifica para la Uracilo fosforibosil transferasa y la citosina desaminasa .....), un anticuerpo, un inhibidor de la división celular o de las señales de transducción, un producto de expresión de un gen supresor de tumor (p53, Rb, p73...), un polipéptido estimulador del sistema inmunitario, un antígeno asociado a un tumor (MUC-1, BRCA-1, antígenos precoces o tardíos (E6, E7, L1, L2 ...) de un virus de papiloma HPV) eventualmente en combinación con un gen de citoquina. Por último, en marco de uan terapia anti-VIH, se puede recurrir aun gen que codifica para un polipéptido inmunoprotector, un epítopo antigénico, un anticuerpo (2F5; Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195), el ámbito extracelular del receptor CD4 (sCD4, Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86), una inmunoadesina (por ejemplo un híbrido CD4-inmunoglobulina IgG, Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531; Byrn et al., 1990, Nature 344, 667-670), una inmunotoxina (por ejemplo fusión del anticuerpo 2F5 o de la inmunoadesina CD4-2F5 a la angiogenina, Kurachi et al., 1985 Biochemistry 24, 5494-5499) una variante trans-dominante (documentos EP 0614980, WO95/16780), un producto citotóxico tal como uno de los mencionados anteriormente o incluso un IFN\alpha o \beta.

Por otra parte, uno de los genes de interés puede ser igualmente un gen de selección que permite seleccionar o identificar las células transfectadas o traducidas. Se pueden citar los genes neo (que codifican para la neomicina fosfotransferasa) que confieren una resistencia al antibiótico G418, dhfr (Dihidrofolato Reductasa), CAT (Cloranfenicol Acetil Transferasa), pac (Puromicina Acetil-Transferasa) o incluso gpt (Xantina Guanina Fosforibosil Transferasa). De una forma general, los genes de selección son conocidos por el experto en la técnica.

La expresión "elementos necesarios para la expresión" indica los elementos genéticos que permiten la transcripción de un gen de interés en ARN y la traducción de un ARNm en polipéptido. Entre ellos, el promotor reviste una importancia particular. Se puede aislar de un gen cualquiera de origen eucariota o incluso viral y puede ser constitutivo o regulable. Alternativamente, se puede tratar del promotor natural del gen en cuestión. Por otra parte, se puede modificar de forma que se mejora la actividad promotora, se suprime la región inhibidora de la transcripción, se convierte un promotor constitutivo en regulable o viceversa, se introduce un sitio de restricción... Se puede mencionar, a título de ejemplos, los promotores eucariotas de los genes PGK (Fosfo Glicerato Kinasa), MT (Metalotioneina , Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 838-848) \alpha -1 antitripsina, CFTR, surfactante, inmunoglobulina, \beta-actina (Tabin et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2, 426-436), SR\alpha (Takebe et al, 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 466-472), el promotor precoz del virus SV40 (Simian Virus), el LTR del RSV (Rous Sarcoma Virus), el promotor TK-HSV-1, el promotor precoz del virus CMV (citomegalovirus) y los promotores adenovirales EIA y MLP. Se puede tratar igualmente de un promotor estimulante de la expresión en una célula tumoral o cancerosa. Se pueden citar principalmente los promotores de los genes MUC-1 sobreexpresados en los cánceres de mama y de próstata (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (para el carcinoma embryonic antigen) sobreexpresado en los cánceres de colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), tirosinosa sobreexpresada en los melanomas (Vile et al. 1993, Cancer Res., 53, 3860-3864), ERB-2 sobreexpresado en los cánceres de mama y de páncreas (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175) y \alpha-fetoproteína sobreexpresada en los cánceres de hígado (Kanai et al., 1997, Cancer Res., 57, 461-465). Se prefiere particularmente el promotor precoz de Citomegalovirus (CMV).

Los elementos necesarios para la expresión pueden, además, incluir unos elementos adicionales que mejoran la expresión del gen de interés o su mantenimiento en la célula huésped. Se pueden citar principalmente las secuencias intrónicas, secuencias señal de secreción, secuencias de localización nuclear, sitios internos de reiniciación de la traducción tipo IRES, secuencias poli A de terminación de la transcripción, leaders tripartitos y orígenes de replicación. Dichos elementos son conocidos por el experto en la materia.

Cuando el vector adenoviral recombinante según la invención presenta diversos genes de interés, estos pueden estar colocados bajo el control de los mimos elementos genéticos (casete policistrónico que utiliza un sitio interno de iniciación de la traducción de tipo IRES para reiniciar la traducción del segundo cistrón) o de elementos independientes.

Una forma de realización particularmente ventajosa consiste en un vector adenoviral recombinante que comprende una segunda región esencial para la encapsidación autóloga en relación con el genoma adenoviral del que deriva. En otros términos, presenta dos regiones de encapsidación una autóloga y la otra heteróloga. Su posición en el vector adenoviral puede ser cualquiera. Puede estar situadas principalmente en una de las extremidades o separadas en cada una de las extremidades de dicho vector. Ventajosamente, la región heteróloga está situada en 3' de la región
autóloga.

En el sector de la presente invención, un vector adenoviral recombinante según la invención es defectuoso para la función E1 y para por lo menos una de las funciones E2, E4 y/o L1-L5. Un ejemplo preferido es proporcionado por el vector defectuoso para el conjunto de las funciones adenovirales (vector mínimo) que comprende además el/los gen(es)
de interés por lo menos los ITRs 5' y 3' y una región esencial para la encapsidación autóloga que deriva de un adenovirus humano, principalmente de un Ad5 y una región esencial para la encapsidación heteróloga que deriva de un adenovirus bovino, principalmente de un BAV3.

Está dentro del alcance del experto de la materia generar un vector adenoviral recombinante según la invención con las técnicas de biología molecular. Sabrá evidentemente adaptar adecuadamente la tecnología en función de los datos específicos (tipo de vector, gen de interés...).

La presente invención se refiere asimismo a la utilización de un vector adenoviral auxiliar según la invención para complementar todas o parte de las funciones defectuosas de un vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación, principalmente de un vector adenoviral recombinante según la invención, dichos vectores auxiliar y recombinante que derivan ambos de un mismo adenovirus y, en particular de un Ad5 y dichas regiones esenciales para la encapsidación heterólogas aportadas por el vector auxiliar y, eventualmente, el vector recombinante que deriva del mismo adenovirus diferente del anterior, y en particular de un BAV3.

La presente invención se refiere asimismo a una composición que comprende:

a)

un vector adenoviral auxiliar según la invención,

b)

un vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación principalmente de un vector adenoviral recombinante según la invención, y

c)

de forma opcional, un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus animal del mismo origen que las regiones esenciales para la encapsidación heterologas aportadas por los vectores auxiliar y recombinante a) y eventualmente b).

La presente invención se refiere asimismo a un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus animal, principalmente de un adenovirus bovino y, en particular, de un BAV3 caracterizado porque presenta una capacidad de encapsidación atenuada en relación con el adenovirus del que deriva. La atenuación tiene como fin reducir la propagación del genoma viral para el provecho de un genoma que presenta una región nativa (vector adenoviral auxiliar y recombinante según la invención), Se puede obtener por delección parcial de la región de encapsidación o por mutación de uno o diversos grupos que controlan el proceso de encapsidación. En la solicitud internacional WO94/28152 y en Imler et al. (1995, Human Gene Therapy 6, 711-721) se proporciona un ejemplo de atenuación. El experto en la técnica conoce las técnicas que permiten comprobar la atenuación, por ejemplo determinando el título viral (Graham y Prevec, 1991, supra) o la expresión de un gen marcador en relación con un virus equivalente que aporta una región esencial para la encapsidación nativa. Una región esencial para la encapsidación atenuada presenta una eficacia de encapsidación reducida de un factor de 2 a 1000, ventajosamente de 3 a 100, y de forma preferente de 5 a
50.

El genoma adenoviral animal según la invención puede ser competente para la replicación o comprender unas modificaciones que afectan uno o diversos genes virales, tales como las citadas anteriormente. En particular, la delección total o parcial de la región E1 de dicho gen puede resultar ventajosa en el ámbito de la presente invención. Se indica que el genoma y/o vectores pueden estar en forma de ADN o de virus.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento para la preparación de una preparación viral que comprende un vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación, principalmente un vector adenoviral recombinante según la invención, según el cual:

a)

se introduce en una primera línea celular

(i)

un vector adenoviral auxiliar según la invención,

(ii)

un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus animal, y

(iii)

dicho vector adenoviral recombinante

presentando dicho genoma adenoviral (ii) el mismo origen que las regiones esenciales para la encapsidación heterólogas aportadas por el vector (i) y eventualmente (iii) y dicho genoma adenoviral (ii) y los vectores (i) y (iii) son capaces de replicarse en dicha primera línea celular,

b)

se cultiva dicha primera línea celular en las condiciones adecuadas para permitir la producción de partículas virales que presentan los vectores (i) y (iii) y el genoma adenoviral (ii),

c)

se recuperan dichas partículas virales obtenidas en la etapa b) en el cultivo celular,

d)

se infecta una segunda línea celular con dichas partículas virales recuperadas en la etapa c), dicho vector auxiliar (i) y dicho genoma adenoviral (ii) que presenta una capacidad de encapsidación y/o de replicación nula o reducida en dicha segunda línea celular,

e)

se cultiva dicha segunda línea celular en unas condiciones adecuadas para permitir la encapsidación de dicho vector adenoviral recombinante (iii) y producir dicha preparación viral, y

f)

se recupera dicha preparación viral obtenida en la etapa e) en el cultivo celular.

En la presente invención, los vectores y genomas adenovirales se pueden introducir mediante todos los medios de la técnica en la primera línea celular, principalmente por transfección y/o infección. Es posible transfectar los vectores en una línea que está infectada por unas partículas de genoma adenoviral animal (previamente, posteriormente o de forma concomitante a la transfección). Los virus que contiene los diferentes elementos (i) (ii) ó (iii) pueden estar constituidos según los métodos de la técnica. Por otra parte, dicho vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación puede consistir en un vector tal como el descrito en los documentos WO 94/28152, WO 94/08026, WO 93/19191 o WO 94/12649.

Por otra parte, el genoma (ii) puede ser salvaje, según la invención (atenuado) y/o comprender una o diversas modificaciones que afectan la funcionalidad de uno o diversos genes virales.

Según una forma de realización ventajosa, la primera célula comprende

(i) un vector adenoviral auxiliar defectuoso por lo menos para la función E1, que deriva de un adenovirus humano (principalmente de un Ad5) y que presenta una región esencial para la encapsidación heteróloga que deriva de un adenovirus bovino (principalmente de un BAV3),

(ii) un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus bovino (principalmente de un BAV3), eventualmente según la invención, y

(iii) vector adenoviral recombinante defectuoso para la función E1 y por lo menos para una de las funciones E2, E4 y/o L1-L5 y que presenta una segunda región de encapsidación autóloga tal como se ha definido anteriormente, que deriva de un adenovirus humano (principalmente de un Ad5) y que presenta una región esencial para la encapsidación heteróloga que deriva de un adenovirus bovino (principalmente de un BAV3),

dicha línea celular es de origen bovino.

Según una forma de realización absolutamente ventajosa, el vector adenoviral auxiliar defectuoso del que se trata en (i) de los procedimientos descritos anteriormente comprende una región esencial para la encapsidación heteróloga que deriva de un adenovirus bovino (principalmente de un BAV3) que presenta los ITR 5' y 3', y la región de encapsidación.

Alternativamente, se puede recurrir a un genoma adenoviral (ii) defectuoso para la función E1. Tratándose de la variante preferida, se describe en la solicitud internacional WO 95/16048 un genoma BAV3 defectuoso para la función E1. En dicho caso, se recurrirá a una primera línea celular capaz de complementar la función E1 de dicho genoma adenoviral de origen animal. Se empleará preferentemente una línea celular del mismo origen animal que dicho genoma adenoviral (ii). Se puede tratar de una línea establecida o de una línea primaria.

El término célula de complementación es clásico en el campo de la técnica. En el ámbito de la presente invención, se refiere a una célula eucariota capaz de proporcionar en trans por lo menos una parte de las funciones defectuosas de un vector o genoma viral según la invención. De forma general, una célula de complementación de una función adenoviral se puede obtener por transfección de los genes virales correspondientes en una línea celular adecuada. Se pueden emplear todos los medios estándar para introducir un ADN en una célula (transfección con fosfato cálcico, electropración, microinyección, lipofección, fusión de protoplastos....). Por otra parte, los genes virales son transportados por los vectores convencionales (vectores sintéticos, virales, plásmidos...) y situados bajo el control de elementos que permiten su expresión constitutiva o regulada en dicha célula de complementación. Las líneas de complementación adaptadas a los vectores adenovirales son conocidas por el experto en la materia (ver por ejemplo la solicitud internacional WO 94/28152, WO 97/04119 y Graham et al., J. Gen. Virol., 1977, 36 :59-72).

Una línea bovina particularmente conveniente deriva de una línea MDBK (ATCC CCL-22 o CRL-6071) o de células primarias, principalmente de retina o de riñon fetal y comprende las secuencias que codifican para la región E1 de un adenovirus bovino y, en particular de un BAV3 situados bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en dicha línea celular.

Según una forma de realización preferida, la segunda línea celular es una célula de complementación para la función E1 de un adenovirus humano, principalmente de un Ad5. Se recurrirá preferentemente a la línea 293. Pero se pueden emplear igualmente otras líneas tales como las descritas en el documento EO 94/28152.

Las partículas virales de la etapa c) y la preparación viral se pueden recuperar del sobrenadante del cultivo pero también de las células. Uno de los métodos utilizado habitualmente consiste en lisar las células mediante unos ciclos consecutivos de congelación/descongelación para recuperar los viriones en el sobrenadante de lisis. A continuación, estos se pueden amplificar y purificar según los métodos de la técnica (procedimiento cromatográfico, ultracentrifugación principalmente a través de un gradiente de cloruro de cesio...).

La presente invención se refiere asimismo a la preparación viral obtenida según el procedimiento según la invención. Según una forma de realización ventajosa, presenta por lo menos el 30% de partículas virales infecciosas que contiene el vector adenoviral recombinante según la invención. Ventajosamente, presenta por lo menos el 50%, preferentemente, por lo menos el 70% y, de forma completamente preferida, por lo menos el 80% de dichas partículas.

La presente invención se refiere asimismo a una célula huésped que comprende el vector adenoviral según la invención o infectado por una preparación viral según la invención. Conviene particularmente una célula de mamífero y principalmente humana. Puede comprender dicho vector en forma integrada en el genoma o no (episoma). Se puede tratar de una célula primaria o tumoral de un orgen hematopoiético (célula madre pluripotente, leucocito, linfocito, monócito o macrófago...), muscular (célula satélite, miocito, mioblasto...), cardiaca, pulmonar, traqueal, hepática, epitelial o fibroblasto.

La presente invención se refiere asimismo a una célula que comprende:

(i)

un vector adenoviral auxiliar según la invención,

(ii)

un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus animal, y

(iii)

un vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación, principalmente de un vector adenoviral recombinante según la invención.

Dicha célula es preferentemente una célula de complementación de una función adenoviral y, en particular de la función E1 de un adenovirus animal o humano. Presenta las características definidas anteriormente.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que presente a título de agente terapéutico o profiláctico, un vector adenoviral, una preparación viral o una célula huésped según la invención en asociación con un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico. La composición según la invención está destinada más particularmente al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades por terapia génica y se indica tanto para las enfermedades genéticas (hemofilia, diabetes, miopatía de Duchenne o de Becker, enfermedades auto inmunes) como para las adquiridas (cánceres, tumores, cardiovasculares, enfermedades de origen infeccioso como la hepatitis B o C, el SIDA...).

Una composición farmacéutica según la invención se puede preparar de forma convencional en vista a una administración por vía local, parenteral o digestiva. En particular, se asocia una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico o profiláctico a un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Las vías de administración previsibles son múltiples. Se puede citar por ejemplo la vía intragástrica, sub-cutánea, intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar o intratraqueal. Para las tres últimas formas de realización, resulta ventajosa una administración por aerosol o instilación. La administración puede tener lugar en una dosis única o repetida uno o varias veces después de un determinado intervalo de tiempo. La vía de administración y la dosificación adecuadas varían en función de diversos parámetros, por ejemplo, del individuo o de la enfermedad a tratar o incluso del o de los gene(s) de interés a transferir. La preparación viral según la invención se puede formular en forma de dosis comprendidas entre 10^{4} y 10^{14} ufc (unidades formadoras de colonias), ventajosamente 10^{5} y 10^{13} ufc y, preferentemente, 10^{6} y 10^{12} ufc. En lo referente al vector adenoviral recombinante según la invención, se prevén unas dosis que comprenden de 0,01 a 100 mg de ADN, preferentemente 0,05 a 10 mg y, de forma completamente preferida. 0,5 a 5 mg. La formulación puede asimismo incluir un diluyente, un adyuvante o un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Se puede presentar en forma líquida o seca (liofilizado etc...)

El vector o la preparación viral según la invención se puede asociar eventualmente a una o diversas sustancias que mejoran la eficacia de la transfección y/o la estabilidad. Dichas sustancias están ampliamente documentadas en la bibliografía accesible para el experto en la materia (ver por ejemplo Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson y Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). A título ilustrativo pero no limitativo, se puede tratar de polímeros, de lípidos principalmente catiónicos, de liposomas, de proteínas nucleares o incluso de lípidos neutros. Dichas sustancias se pueden utilizar solas o en combinación.

Por último, la presente invención se refiere a la utilización de un vector adenoviral, de una preparación viral o de una célula huésped según la invención para la transferencia y la expresión de un gen de interés en una célula o un organismo huésped. Una utilización preferida consiste en el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia génica o inmunoterapia. Según una primera posibilidad, el medicamento se puede administrar directamente in vivo (por ejemplo por inyección intravenosa, en un tumor accesible, en los pulmones por aerosol...). Se puede asimismo adoptar el enfoque ex vivo que consiste en extraer unas células del paciente (células madre de la médula ósea, linfocitos de la sangre periférica, células musculares..) transfectarlas o infectar in vitro según los métodos de la técnica y de readministrarlas al paciente. La utilización preferida es para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las enfermedades por terapia génica o inmunoterapia.

La invención se extiende asimismo a un método de tratamiento según el cual se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector adenoviral recombinante, de una preparación viral o de una célula huésped según la invención a un paciente que necesita dicho tratamiento.

Ejemplos

La presente invención se ilustra, sin limitarse a los mismos, a través de los ejemplos siguientes.

Las construcciones descritas a continuación se preparan según las técnicas generales de ingeniería genética y de clonación molecular, detalladas en Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o según las recomendaciones del fabricante cuando se utiliza un kit comercial. Las etapas de recombinación homóloga se realizan preferentemente en la cepa E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.. 166, 557-580). Al tratarse de la reparación de unos sitios de restricción, la técnica utilizada consiste en un relleno de los extremos 5' protuberantes con la ayuda del fragmento grande de la ADN polimerasa I de E. coli (Klenow). Por otra parte, los fragmentos de genoma adenoviral utilizados en las diferentes construcciones descritas a continuación, se indican precisamente, según su posición en la secuencia nucleotídica del genoma de Ad5 y de BAV3 tal como se divulga en la base de datos Genebank bajo la referencia M73260 y AFO30154 respectivamente.

En cuanto a la biología celular, las células se transfectan o transducen y cultivan según las técnicas estándar bien conocidas por el experto en la materia. En los ejemplos siguientes, se recurre a las líneas celulares 293 (Graham et al., 1977, supra; disponible en la ATCC bajo la referencia CRL1573) y MDBK (ATCC CRL 6071 o CCL-22). Se entiende que se pueden utilizar otras líneas celulares.

Ejemplo 1 Ausencia de multiplicación de los virus BAV3 en las líneas humanas

Se infectan la línea humana MDBK y las líneas humanas A549 (ATCC CCL-185), HeLa (ATCC CCL-2) y 293 (ATCC CRL-1573) con un virus salvaje BAV3 a diferentes MOI (1, 2 y 10). Las células se recogen 3 días después de la infección y se determinan los títulos virales sobre las células permisivas MDBK. El factor de multiplicación es inferior a 1 en el caso de la infección de las células humanas mientras que está comprendido entre 50 y 100 para la línea bovina. Dichos resultados indican la incapacidad del vector BAV3 para propagarse en las líneas humanas.

La expresión de los genes virales de BAV3 se comprueba mediante PCR inversa después de la infección con el virus BAV3 en unas líneas humanas establecidas (A549, HeLa, 293, MRC5, RPMI) o primarias (línea primaria de músculo PHM)l La línea control está constituida por la línea MDBK. Se recogen las células y se aísla su ARN poliA+ según las técnicas convencionales. La transcripción inversa se realiza con un cebador antisentido específico para la región E1 y seguida de una amplificación por PCR con el mismo cebador y un cebador sentido específico para E1. Los productos de la PCR se someten a un análisis por Southern Blot y se detectan mediante una sonda específica para E1 que permite detectar una banda de 626 pb correspondiente al ADN genómico y de 519 pb derivada del ARNm poliA+. En las células MDBK, se observa una expresión del gen viral E1 que es máxima 16 horas después de la infección. E1 se expresa también en la línea 293. Por el contrario no se puede detectar ninguna expresión de ARNm E1 en ninguna de las líneas humanas ensayadas.

Dichos resultados muestran que las células humanas están infectadas por el virus BAV3 pero que este no se puede replicar en ellas.

Ejemplo 2 Construcción de vectores adenovirales quiméricos Ad5/BAV3

Primero se construye un vector que comprende un casete de expresión del gen bacteriano LacZ que codifica para la \beta-galactosidasa. Para ello, se clona el fragmento XhoI - SalI de pTG8595 (Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2033) que presenta las secuencias que codifican para LacZ en el sitio XhoI del plásmido pCI (Promega).Este último es un vector de expresión eucariota que comprende el promotor CMV, unas secuencias de ligación, unos sitios múltiples de clonación y la secuencia poliA de SV40. El casete de expresión del gen LacZ flanqueado por los elementos de regulación citados anteriormente se aísla en forma de un fragmento BglII-BamHI y se introduce en el sitio BglII del vector de transferencia pTG8343, para proporcionar pTG6452. A título indicativo, el vector de transferencia presenta el extremo 5' del Ad5 deleccionado de la mayoría de las secuencias E1 (nt 1 a 458 y 3329 a 5788) insertado en un plásmido ppoliII (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). El genoma adenoviral está constituido por recombinación homóloga entre el fragmento PacI-NsiI obtenido de pTG6452 y el vector pTG3652 que presenta el genoma Ad5 deleccionado de la región E3 anclado por el enzima ClaI. El vector obtenido de este modo, denominado pTG6481, contiene las secuencias Ad5 desprovistas de las regiones E1 (nt 459 a 3328) y E3 (nt 28249 a 30758) y el casete pCMV-LacZ-pA SV40 clonado en el lugar de la región E1. La región de encapsidación es de origen Ad5.

La etapa siguiente es insertar la región de encapsidación de BAV3 en el vector anterior. Se han ensayado dos sitios de inserción: el primero antes de la región de encapsidación nativa, a nivel del sitio AflIII en posición 151 del genoma Ad5 y la otra después de ésta a nivel del sitio SalI (en posición 451 del Ad5). La primera construcción pTG6466 se genera por digestión AfIIII de pTG6452, tratamiento con Klenow e introducción del fragmento HaeII - PvuII de 844 pb que recubre las posiciones 141 a 984 del genoma BAV3, dicho fragmento se ha sometido previamente a la acción de Klenow. EL vector pTG6467 se genera según el mismo protocolo excepto que pTG6452 se lineariza con SalI. De este modo los vectores pTG6466 y pTG6467 contienen dos regiones de encapsidación, una de origen Ad5 y la otra de origen BAV3 (aproximadamente 0,8 Kb).

Se utilizado asimismo una región de encapsidación BAV3 reducida obtenida de la anterior por digestión ThaI o BstuI (posiciones 185 a 514 del genoma BAV3). Tal como se ha descrito anteriormente, la región BAV3 de aproximadamente 0,3 Kb se inserta en los vectores recombinantes Ad5 ya sea a nivel del sitio AflIII (en 5' de la región psi autóloga) o a nivel del sitio SalI (en 3' de la región psi autóloga), En este último caso, se genera el vector de transferencia pTG6458 y el genoma adenoviral se reconstituye por recombinación homóloga tal como se ha descrito anteriormente para proporcionar pTG6482.

Después se genera una construcción en al que la región de encapsidación de Ad5 se sustituye por su homóloga BAV3. El vector pTG6452 se digiere por AflIII (nt 151) y SalI (nt 451) y después se trata con la polimerasa Klenow. El fragmento de 300 pb que presenta la región de encapsidación Ad5 se sustituye por el fragmento HaeII-PvuII (844 pb) aislado de BAV3 y convertido en franco mediante la acción de la Klenow. Se obtiene pTG6468 que presenta la única región de encapsidación de BAV3 en un contexto de Ad5. Una construcción idéntica utiliza la región de encapsidación BAV de 0,3 kb.

Las regiones modificadas se reintroducen en el genoma adenoviral por recombinación homóloga tal como se ha indicado anteriormente.

De forma idéntica, se ha construido un vector adenoviral auxiliar derivado del genoma de Ad5 que presenta la región de encapsidación y los ITR 5' y 3' de BAV3. Para ello, se construye el vector PTG13373 que deriva del genoma Ad5 deleccionado de las regiones E1 y E3, que presenta el ITR 5' y la región de encapsidación de 0,3 kb del genoma de BAV3.

El vector pTG13373 se obtiene por sustitución del ITR 5' y de la región de encapsidación de Ad5 presentes en pTG 8343, por el ITR 5' y la región de encapsidación de BAV 3 presentes en pTG 5431; a título indicativo, pTG 5431 está constituido por el extremo 5' (nucleótidos 1 a 8217) del genoma BAV3. Para ello, se digiere pTG 8343 con BgIII, se somete a la acción de Klenow, y después se digiere con Pac I, y pTG 5431 se digiere con Acc I, se trata con Klenow, y se digiere con Pac I. Los fragmentos obtenidos de este modo se ligan para proporcionar pTG 13372. Finalmente, se obtiene pTG 13373 por recombinación homóloga entre los fragmentos obtenidos de pTG 13372 digerido con Bgl I y de pTG 6401 digerido con Pac I.

El vector pTG 14310 derivado del genoma de Ad5 deleccionado de las regiones E1 y E3 y que comprende los ITR 5' y 3' así como la región de encapsidación de BAV3 se obtiene después de la forma siguiente.

Se procede a la sustitución del ITR 3' de Ad5 en el vector pTG 13384 (constituido por el extremo 3' (nucleótidos 32800 a 35935) del genoma del Ad5; un casete de clonación que se ha insertado entre los nucleótidos 35826 y 35827) por el ITR 3' de BAV3. Para ello, se digiere pTG 13384 con XbaI, se somete a la acción de la Klenow, después de digiere con Pac I. Por otra parte, pTG 5451 se digiere con ApoI, se trata con la Klenow, y se digiere con Pac I. A título indicativo, el vector pTG 5451 comprende los extremos 5' (nucleótidos 1 a 1651 deleccionados del fragmento 829-1077) y 3' de BAV 3 (nucleótidos 33232 a 34446) separados por un sitio de restricción único Hind III. Los fragmentos obtenidos de este modo se ligan para proporcionar pTG 14261.

Por otra parte, la recircularización de pTG 14261 después de la digestión con XbaI y Bam HI y la acción de la Klenow permite la eliminación del sitio de anclaje Hind III antes del ITR bovino de pTG 14261. Se obtiene de este modo el vector pTG 14262.

Paralelamente, se procede a la recircularización de pTG 13373 digerido con Hind III para obtener pTG 14263 que contiene el ITR 5' y la secuencia de encapsidación de 0,3 Kb de BAV 3 así como el ITR 3' del Ad5.

A continuación se procede a la sustitución del ITR 3' del Ad5 en el vector pTG 14263 por el ITR 3' de BAV 3 de pTG 14262. Para ello, se digieren pTG 14263 y pTG 14262 con Hind III y Pac I. Los fragmentos obtenidos de este modo se ligan para proporcionar pTG 14266.

Por último, se reconstituye el genoma adenoviral por recombinación homóloga entre pTG 14266 linealizado con Hind III y pTG 13373 digerido con Pac I. El vector obtenido denominado pTG 14310 deriva del genoma de Ad5 deleccionado de las regiones E1 y E3 y contiene los ITR 5' y 3' así como la región de encapsidación de
BAV3.

Asimismo, se ha obtenido un genoma adenoviral similar al de pTG 14310 pero que presenta una región de encapsidación de BAV3 de 0,8 kb. Para ello se ha procedido a la sustitución del ITR 5' y de la región de encapsidación de Ad5 presentes en pTG 8343 por el ITR 5' y la región de encapsidación de 0,8 kb de BAV 3 presentes en pTG 5431. Para ello, se digiere pTG 8343 con Bgl II, se somete a la acción de la Klenow, después de digiere con Pac I. Por otra parte, pTG 5431 se digiere con Pvu II y Pac I. Los fragmentos obtenidos de este modo se ligan para proporcionar pTG 14313.

A continuación se procede a la sustitución del ITR 5' y de la región de encapsidación de 0,3 kb de BAV 3 presentes en pTG 14266 por el ITR 5' y la región de encapsidación de 0,8 kb de BAV 3 presentes en pTG 14313. Para ello, se procede a una recombinación homóloga entre los fragmentos Ssp I / Mfe I obtenido de pTG 14266 y Sca I/Nsi I obtenido de pTG 14313. El vector así obtenido se denomina pTG 14315.

Finalmente, se reconstituye el genoma adenoviral por recombinación homóloga entre los fragmentos Hind III obtenido de pTG 14315 y Pac I obtenido de pTG 6401. El vector obtenido de este modo, denominado pTG 14316, deriva del genoma de Ad 5 y presenta los ITR 5' y 3' así como la región de encapsidación de 0,8 Kb de BAV 3.

Un ejemplo adicional de vector según la invención consiste en un vector derivado del genoma de Ad5 deelccionado de las regiones E1 y E3 y que contiene los ITR 5' y 3' así como la región de de encapsidación de 0,3 Kb de BAV 3, en el que la región de encapsidación se ha insertado justo antes del ITR 3'.

Para construir tal vector, se procede primero a la delección de la región de encapsidación de BAV 3 en pTG 13372 y en pTG 14266. Para ello, se digiere pTG 13372 con Afl III, se somete a la acción de la Klenow, después se digiere con Pac I y pTG 14262 se digiere con Pvu II y Pac I. Los fragmentos obtenidos de este modo se ligan para proporcionar pTG 14311.

La delección de la región de encapsidación bovina de pTG 14266 se obtiene por recombinación homóloga entre el fragmento Xmn I/ Dra III obtenido de pTG 14266 y el fragmento Pvu I / Sph I obtenido de pTG 14311. Entonces se obtiene el vector pTG 14328.

A continuación se procede a la sustitución del ITR 3' de Ad5 en pTG 13384 por el ITR 3' y la región de encapsidación de 0,3 kb de BAV 3 presentes en pTG 5431. Para ello, se digiere pTG 13384 con Bam HI, se somete a la acción de la Klenow, después se digiere con Pac I. Por otra parte, se digiere pTG 5431 con Afl III, se trata con Klenow, y se digiere con Pac I. Los fragmentos obtenidos de este modo se ligan para proporcionar pTG 14271.

La introducción de la secuencia de encapsidación BAV 3 justo antes del ITR 3' se lleva a cabo por ligación de los fragmentos Eco RI / Hind III obtenidos de pTG 14328 y de pTG 14271. El vector obtenido de este modo se denomina pTG 14330.

El genoma adenoviral se reconstituye a continuación por recombinación homóloga entre los fragmentos Hind III de pTG 14330 y Pac I de pTG 6401. Entonces se obtiene el vector pTG prod 11 que deriva del genoma de Ad5 deleccionado de las regiones E1 y E3 y contiene los ITR 5' y 3' así como la región de encapsidación de 0,3 Kb de BAV 3 insertada justo antes del ITR 3'.

Ejemplo 3 Producción de partículas virales

Los genomas virales pTG6468 (auxiliar) y pTG6467 o pTG6466 (recombinante) se tranfectan en unas células bovinas de la línea MBDK. Después, las células transfectadas se infectan con un genoma BAV3 salvaje o atenuado. Ya que el Ad5 puede propagarse en las células bovinas en presencia de un virus BAV3 y que los tres elementos virales contienen una región de encapsidación de BAV3, se pueden empaquetar en las cápsidas virales y generar unas partículas virales infecciosas. La mezcla se recupera y eventualmente se procede a una etapa de amplificación por ciclos de infección sucesivos de las células MBDK con el fin de constituir un depósito viral de los tres tipos de virus. Cuando se produce dicha primera etapa en las células bovinas, el genoma BAV3 produce los factores que actúan en trans para la encapsidación del vector auxiliar que proporciona las funciones virales necesarias para la propagación del vector recombinante. La encapsidación de este último se puede mediar por unos factores adenovirales de origen BAV3 y Ad5 en el medida en que presente las regiones de encapsidación de los dos orígenes y las cápsidas pueden contener unas proteínas estructurales BAV3 o Ad5.

La mezcla viral generada en la línea bovina se utiliza para infectar unas células humanas 293. En dichas células, el virus BAV3 no puede propagarse incluso en presencia de Ad5. Sin embargo, el vector auxiliar de origen Ad5 puede replicar su genoma viral y expresar el conjunto de los genes virales precoces y tardíos que presenta. Por el contrario, no se puede encapsidar debido a que está provisto de una sola región de encapsidación BAV3. Por el contrario, el vector recombinante puede ser el intermediario de la región de encapsidación de origen Ad5 y de los factores de encapsidación proporcionados por el vector auxiliar. Las partículas virales generadas se recuperan y se pueden utilizar con fines terapéuticos.

Claims (37)

1. Vector adenoviral que deriva de un genoma adenoviral, caracterizado porque comprende una región esencial para la encapsidación de origen adenoviral y heteróloga en relación con dicho genoma adenoviral.

2. Vector adenoviral según la reivindicación 1, caracterizado porque deriva de un adenovirus de origen humano y porque dicha región esencial para la encapsidación heteróloga deriva de un adenovirus de origen animal.

3. Vector adenoviral según la reivindicación 2, caracterizado porque deriva de un adenovirus humano del subgrupo C y principalmente de un adenovirus 2 (Ad2) ó 5 (Ad5).

4. Vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha región esencial para la encapsidación heteróloga deriva de un adenovirus animal seleccionado de entre los adenovirus caninos, aviarios, bovinos, murinos, ovinos, porcinos y simios.

5. Vector adenoviral según la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque deriva de un Ad5 y porque dicha región esencial para la encapsidación heteróloga deriva de un adenovirus bovino.

6. Vector adenoviral según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho adenovirus bovino es BAV3.

7. Vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicha región esencial para la encapsidación heteróloga comprende la región de encapsidación.

8. Vector adenoviral según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha región esencial para la encapsidación heteróloga comprende además los ITR 5' y 3'.

9. Vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es defectuoso por lo menos para la función E1.

10. Vector adenoviral según la reivindicación 9, caracterizado porque además es defectuoso para por lo menos una de las funciones seleccionadas de entre las funciones E2, E3, E4 y L1 - L5.

11. Vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se trata de un vector auxiliar que permite complementar todas o parte de las funciones defectuosas de un vector adenoviral recombinante.

12. Vector adenoviral auxiliar según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende las secuencias ITR 5' y 3' y las secuencias que codifican para las funciones E2, E4 y/o L1-L5 que derivan de un adenovirus humano, y una región de encapsidación heteróloga que deriva de un adenovirus bovino.

13. Vector adenoviral auxiliar según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende las secuencias que codifican para las funciones E2, E4 y/o L1-L5 que derivan de un adenovirus humano, y las secuencias ITR 5' y 3' y una región de encapsidación heteróloga que deriva de un adenovirus bovino.

14. Vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque es recombinante y comprende por lo menos un gen de interés situado bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en una célula o un organismo huésped.

15. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho gen de interés se selecciona de entre los genes que codifican para un ARN antisentido, una citoquina, un receptor celular o nuclear, un ligando, un factor de coagulación, la proteína CFTR, la insulina, la distrofina, un factor de crecimiento, un enzima, un inhibidor de enzima, un polipéptido de efecto anti-tumoral, un polipéptido capaz de inhibir una infección bacteriana, parasitaria o viral, y principalmente el VIH, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina, un inhibidor de la angiogénesis y un marcador.

16. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 14 ó 15, caracterizado porque comprende además una segunda región de encapsidación autóloga en relación con el genoma adenoviral del que deriva.

17. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 16, caracterizado porque es defectuoso para el conjunto de funciones adenovirales y comprende además dicho gen de interés, por lo menos los ITRs 5' y 3' y derivándose dicha región de encapsidación autóloga de un adenovirus humano, y dicha región de encapsidación heteróloga que deriva de un adenovirus bovino.

18. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque la región de encapsidación heteróloga se inserta en 3' de la región de encapsidación autóloga.

19. Utilización de un vector adenoviral auxiliar según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para complementar todas o parte de las funciones defectuosas de un vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación, derivándose dichos vectores auxiliar y recombinante de un mismo primer adenovirus y, en particular de un Ad5, y derivándose dichas regiones esenciales para la encapsidación heterólogas aportadas por el vector auxiliar de un segundo adenovirus diferente del primero, y en particular de un BAV3.

20. Utilización según la reivindicación 19 caracterizada porque el vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación es un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 18, derivándose dichos vectores auxiliar y recombinante de un mismo primer adenovirus y derivándose dichas regiones esenciales para la encapsidación heterólogas aportadas por el vector auxiliar y dicho vector recombinante de un segundo adenovirus diferente del primero.

21. Composición que comprende:

(a) un vector adenoviral auxiliar según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13,

(b) un vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación, y

(c) de forma opcional un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus animal del mismo origen que las regiones esenciales para la encapsidación heterólogas aportadas por el vector a).

22. Composición según la reivindicación 21, caracterizada porque dicho vector recombinante adenoviral defectuoso para la replicación (b) es un vector adenoviral recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 18 y porque se encuentra presente en (c) de forma opcional, un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus animal del mismo origen que las regiones esenciales para la encapsidación heterólogas aportadas por los vectores a) y b).

23. Procedimiento para la preparación de una preparación viral que comprende un vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación, según el cual:

(a) se introduce en una primera línea celular

(i)

un vector adenoviral auxiliar según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13,

(ii)

un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus animal, y

(iii)

dicho vector adenoviral recombinante, presentando dicho genoma adenoviral (ii) el mismo origen que las regiones esenciales para la encapsidación heterólogas aportadas por el vector (i) y siendo dicho genoma adenoviral (ii) y los vectores (i) y (iii) capaces de replicarse en dicha primera línea celular,

(b) se cultiva dicha primera línea celular en las condiciones adecuadas para permitir la producción de partículas virales que presentan los vectores (i) y (iii) y el genoma adenoviral (ii),

(c) se recuperan dichas partículas virales obtenidas en la etapa b) en el cultivo celular,

(d) se infecta una segunda línea celular con dichas partículas virales recuperadas en la etapa c), dicho vector auxiliar (i) y dicho genoma adenoviral (ii) que presenta una capacidad de encapsidación y/o de replicación nula o reducida en dicha segunda línea celular,

(e) se cultiva dicha segunda línea celular en unas condiciones adecuadas para permitir la encapsidación de dicho vector adenoviral recombinante (iii) y producir dicha preparación viral, y

(f) se recupera dicha preparación viral obtenida en la etapa e) en el cultivo celular.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizada porque dicho vector adenoviral recombinante defectuoso para la replicación es un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 18 y porque dicho genoma adenoviral (ii) es del mismo origen que las regiones esenciales para la encapsidación heterólogas aportadas por los vectores (i) y (iii) y dicho genoma adenoviral (ii) y los vectores (i) y (iii) son capaces de replicarse en dicha primera línea celular.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que se introduce en dicha primera línea celular:

(i) un vector adenoviral auxiliar según cualquiera de las reivindicaciones 11 - 13 defectuoso por lo menos para la función E1,

(ii) un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus bovino, principalmente de un BAV3, que eventualmente presenta una capacidad de encapsidación atenuada en relación con el adenovirus del que deriva, y

(iii) un vector adenoviral recombinante defectuoso para la función E1 y por lo menos para una de las funciones E2, E4 y/o L1-L5, principalmente un vector según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18,

siendo dicha primera línea celular de origen bovino.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que dicho genoma (ii) es defectuoso para la función E1 y dicha primera línea celular es una célula de complementación de la función E1 de dicho genoma adenoviral (ii).

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha primera línea celular deriva de una línea MDBK o de células primarias bovinas de retina o de riñón fetal y comprende las secuencias que codifican para la región E1 de un adenovirus bovino y en particular de un BAV3 situados bajo el control de los elementos necesarios para su expresión.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que dicha segunda línea celular es una célula de complementación de la función E1 de un adenovirus humano, principalmente de un Ad5.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que dicha segunda línea celular es la línea 293.

30. Preparación viral susceptible de ser obtenida mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29.

31. Preparación viral según la reivindicación 30, que comprende por lo menos el 30% de las partículas virales infecciosas que contienen un vector adenoviral recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 18.

32. Célula huésped que comprende un vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o que está infectada por una preparación viral según la reivindicación 30 ó 31.

33. Célula que comprende:

(i) un vector adenoviral auxiliar según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, y

(ii) un genoma adenoviral que deriva de un adenovirus animal.

34. Célula según la reivindicación 33, que contiene además (iii) un vector adenoviral recombinante defectuoso, y principalmente un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 18.

35. Composición farmacéutica que comprende, a título de agente terapéutico o profiláctico, un vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 18, una preparación viral según la reivindicación 30 ó 31 o una célula huésped según la reivindicación 32.

36. Utilización de un vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 18, de una preparación viral según la reivindicación 30 ó 31 o de una célula huésped según la reivindicación 32, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades genéticas tales como la hemofilia, la diabetes, la mucoviscidosis, la miopatía de Duchenne o de Becker, de enfermedades auto-inmunes o de enfermedades adquiridas tales como los cánceres, los tumores, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades de origen infeccioso como la hepatitis B o C y el SIDA mediante la transferencia y expresión de un gen de interés en una célula o un organismo huésped.

37. Utilización de un vector adenoviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 18, de una preparación viral según la reivindicación 30 ó 31 o de una célula huésped según la reivindicación 33, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades mediante terapia génica o inmunoterapia.