ES2230820T3 - Procedimiento de inactivacion de virus envueltos en una preparacion virica de adenovirus. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de inactivación de virus envueltos que contaminan una preparación vírica que contiene en su mayor parte adenovirus, en el que: - se introduce en dicha preparación vírica una cantidad suficiente de disolvente tri-n butil fosfato (TNBP), comprendida entre el 0,05% y el 1% (volumen/volumen) - se permite que dicho TNPB ejerza su acción a una temperatura comprendida entre +4 y +37ºC, a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5, durante un tiempo suficientemente largo para reducir de manera significativa la cantidad de virus envueltos que contaminan dicha preparación vírica, conservando dicho procedimiento de inactivación el poder infeccioso de dichos adenovirus.

Description

Procedimiento de inactivación de virus envueltos en una preparación vírica de adenovirus.

La presente invención se refiere a un procedimiento de inactivación de virus envueltos, susceptibles de contaminar una preparación vírica con virus no envueltos. La invención tiene igualmente por objeto una preparación vírica esencialmente desprovista de virus envueltos y una composición farmacéutica que comprende dicha preparación vírica, así como sus utilizaciones con fines terapéuticos o profilácticos. La invención presenta un interés muy particular respecto a perspectivas de terapia génica, especialmente en el hombre.

La terapia génica se define como la transferencia de información genética a una célula o a un organismo huésped. El primer protocolo que se aplicó al hombre se inició en los Estados Unidos en septiembre de 1990 en un paciente genéticamente inmunodeficiente, debido a una mutación que afectaba el gen que codifica la Adenina Desaminasa (ADA). Se trataba de corregir o reemplazar el gen defectuoso cuyo mal funcionamiento está en el origen de una enfermedad genética, por un gen funcional. El éxito relativo de este primer experimento animó al desarrollo de esta tecnología, que se ha extendido después al tratamiento de otras enfermedades tanto genéticas como adquiridas (cánceres, enfermedades infecciosas como el SIDA...), con el fin de suministrar in situ genes terapéuticos que mejoren la patología. La mayor parte de las estrategias utilizan vectores para vehicular el gen terapéutico hacia su diana celular. Numerosos vectores tanto víricos como sintéticos se han desarrollado durante estos últimos años y han constituido el objeto de numerosas publicaciones accesibles al experto en la técnica.

El interés de los adenovirus como vectores de terapia génica se ha indicado ya en la técnica anterior. Infectan numerosos tipos celulares, tanto células en división como en reposo, no se integran y son poco patógenos. Además, poseen un tropismo natural por las vías respiratorias. Estas propiedades particulares hacen de los adenovirus los vectores de elección para numerosas aplicaciones terapéuticas e incluso vacunales.

El ciclo infeccioso de los adenovirus se lleva a cabo en 2 etapas. La fase precoz antecede a la iniciación de la replicación, y permite producir proteínas precoces que regulan la replicación y la transcripción del ADN vírico. La replicación del genoma es seguida por la fase tardía durante la cual se sintetizan las proteínas estructurales que constituyen las partículas víricas. El ensamblaje de los nuevos viriones se realiza en el núcleo. En un primer tiempo, las proteínas víricas se reúnen, de manera que forman cápsidas de estructura icosaédrica, vacías, en las que el genoma está encapsidado. Los adenovirus que se liberan son susceptibles de infectar otras células opcionales.

Como información, se puede indicar que su genoma está constituido por una molécula de ADN lineal y bicatenaria de alrededor de 36 kb, que porta una treintena de genes que intervienen en el ciclo vírico. Los genes precoces (E1 a E4; E por "early" en inglés) se reparten en 4 regiones dispersas en el genoma. las regiones E1, E2 y E4 son esenciales para la replicación vírica, mientras que la región E3, que está implicada en la modulación de la respuesta inmunitaria anti-adenovírica en el huésped, no lo es. Los genes tardíos (L1 a L5; L por "late" en inglés) codifican en su mayor parte proteínas estructurales y recubren en parte las unidades precoces de transcripción. En su mayor parte, se transcriben a partir del promotor tardío más importante MLP (por "Major Late Promoter", en inglés). Además, el genoma adenovírico lleva en sus extremos regiones que actúan en cis esenciales para la formación de la cápsida, constituidos por secuencias terminales inversas (ITR) situadas en los extremos 5' y 3' de una región de encapsidación que sigue a la ITR5'.

Los vectores adenovíricos que se utilizan actualmente en los protocolos de terapia génica están desprovistos de la mayor parte de la región E1, con el fin de evitar su diseminación en el entorno y en el organismo huésped. Deleciones suplementarias en la región E3 permiten incrementar las capacidades de clonación. Vectores denominados de segunda generación están igualmente disponibles. Conservan las regiones en cis (ITRs y secuencias de encapsidación) esenciales para ésta, pero comportan modificaciones genéricas suplementarias que pretenden reducir la expresión in vivo de ciertos genes víricos que son susceptibles de perjudicar la persistencia de las células transducidas y la expresión estable del transgen (véanse, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO94/28152 y WO97/04119). A este respecto, un vector mínimo, defectuoso para el conjunto de las funciones adenovíricas, representa una alternativa de elección.

Por razones evidentes de seguridad, es importante obtener preparaciones víricas desprovistas de contaminantes potencialmente nocivos. Los adenovirus recombinantes se producen habitualmente en una progenie celular que complementa las funciones defectuosas. Después del cultivo, las células infectadas se recuperan, se lisan y las partículas víricas se purifican a partir del lisado celular. La mayoría de los equipos que trabajan en este ámbito, se han interesado por reducir los contaminantes molecular (proteínas, ADN, minerales, toxinas) poniendo a punto técnicas de ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio o de cromatografía. Sin embargo, la contaminación potencial por otros tipos de virus no está resuelta hasta la fecha. A este respecto, los riesgos patológicos asociados a los virus envueltos tienen consecuencias, ya que pueden conducir a cánceres, hepatitis, SIDA...etc. Es pues, crucial que las preparaciones de virus recombinantes destinadas a uso humano estén desprovistas de virus infecciosos envueltos.

Ahora bien, las fuentes de contaminación son numerosas durante todo el procedimiento que lleva a la preparación de los virus de interés. Además, la contaminación accidental, las progenies celulares que se utilizan para propagar los virus de interés pueden incluir, integrados en sus cromosomas, cierto número de genomas retrovíricos (provirus). Éstos pueden activarse en respuesta a ciertas condiciones de cultivo para generar virus infecciosos envueltos. Además, los medios de cultivo contienen frecuentemente suero de origen animal que es una fuente importante de virus envueltos. Además, los operadores, el entorno y el material de utilización múltiples (fermentador, homogenizador, columna cromatográfica...), pueden contribuir igualmente a la contaminación. Estos contaminantes se denominan agentes extraños y se refieren a los virus envueltos, pero también a las bacterias y a las células.

Un procedimiento de inactivación de los virus envueltos, mediante una mezcla de tri(n-butil) fosfato (TNPB), se ha puesto ya en marcha para la preparación de proteínas y derivados sanguíneos (concentrados plaquetarios, crioprecipitados, productos de fraccionamiento...), en los que la contaminación por los virus de la hepatitis B constituye un problema importante de salud pública. Tal procedimiento no se ha aplicado nunca a una preparación de virus no envueltos en la que la contaminación por los virus envueltos se opone a la seguridad de los lotes clíni-
cos.

Al revés que en el procedimiento de la técnica anterior, aplicable a las composiciones proteicas, se plantea el problema particular de la co-existencia de los dos tipos víricos en la misma preparación, por una parte, los virus no envueltos que se desea preservar y los virus envueltos, que se busca inactivar. Un procedimiento según la invención, debe conciliar estas dos cuestiones. De forma general, los virus presentan una arquitectura estructural compleja y la integridad de la partícula vírica es esencial para la infecciosidad y la penetración en las células huésped. A este respecto, los adenovirus están compuestos de una molécula de ADN asociada a proteínas y rodeada por una cápsida icosaédrica. La cápsida está formada por capsómeros que incluyen 720 hexágonos y 60 pentágonos a los que se asocian monómeros de los polipéptidos IIIa, VI y IX, que estabilizan la estructura. Ligada a la subunidad pentágono y saliendo al exterior de la cápsida, se encuentra la fibra trimérica que permite la unión inicial del virus a su célula diana. Una cápsida adenovírica ligeramente alterada puede tener un efecto nefasto sobre la infecciosidad vírica. Se puede ilustrar la fragilidad de los adenovirus, mencionando el hecho de que una exposición prolongada a una temperatura superior a 37ºC es suficiente a menudo para reducir el poder infeccioso varios logaritmos.

Se ha puesto ahora a punto un procedimiento de inactivación de virus envueltos en una preparación que contiene adenovirus recombinantes como principios activos, que utiliza el disolvente tri-n-butil fosfato (TNPB). Además, se ha estudiado el efecto de distintas variables, con el fin de definir las condiciones experimentales que más se adaptan para preservar la infecciosidad de los adenovirus recombinantes y para integrarse en un procedimiento de purificación global. Los ejemplos que siguen muestran que la acción de 0,1 a 0,6% de TNPB y de 1% a 2% de Tween 80 durante 4 horas, a temperatura ambiente, permite reducir de forma significativa la cantidad de virus envueltos (reducción de por lo menos un factor 4 logaritmos), respetando la integridad de las partículas adenovíricas (rendimiento de por lo menos el 80%, incluso superior a 100%). Se ha evidenciado igualmente el efecto beneficioso del procedimiento según la invención para reducir los agregados que se forman espontáneamente entre los virus y perjudican a la infecciosidad vírica.

Es por lo que la presente invención tiene como objeto un procedimiento de inactivación de los virus envueltos que contaminan una preparación vírica que contiene en su mayor parte adenovirus, en el que:

- se introduce en dicha preparación vírica una cantidad suficiente de disolvente tri-n butil fosfato (TNBP), comprendida entre el 0,05% y el 1%

- se deja que dicho TNPB ejerza su acción a una temperatura comprendida entre +4º y +39ºC, a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5, durante un tiempo suficientemente largo que permita que la cantidad de virus con envoltura que contaminan dicha preparación vírica, se reduzca de manera significativa, conservando dicho procedimiento de inactivación el poder infeccioso de dichos adenovirus.

Los "virus envueltos" y "no envueltos" se definen ampliamente en las obras básicas de virología. Brevemente, los virus envueltos presentan en su superficie una envuelta compuesta por una capa o bicapa lipídica y de proteínas asociadas. Su composición se debe al hecho de que se forma cuando los virus experimentan gemación a través de la membrana celular. El término membrana celular incluye la membrana plasmática y las de los otras orgánulos celulares, tales como el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi y el núcleo. Contrariamente a esto, un virus no envuelto no posee lípidos en su superficie y está rodeado por una cápsida proteica.

Una "preparación vírica" contiene preferentemente uno o varios virus no envuelto(s) en un medio acuoso (medio de cultivo, medio tamponado, solución de formulación, etc...). El término "virus" incluye los virus salvajes, mutantes y recombinantes (que incluyen por lo menos un gen de interés). Una preparación vírica se produce habitualmente introduciendo el ADN del virus no envuelto llevado por uno o varios fragmentos en una progenie celular apropiada o mediante infección de la progenie por un "prealmacenado" vírico. A continuación, la progenie transfectada infectada, se cultiva y se recuperan partículas víricas producidas por las células productoras y/o a partir del sobrenadante del cultivo.

Se indica que en el ámbito de la presente invención, la preparación vírica puede igualmente someterse a una o varias etapas de purifican que pretenden alcanzar niveles de pureza compatibles con la calidad farmacéutica requerida del producto vírico (eliminación por lo menos en parte, de los contaminantes de tipo proteínas, toxinas, ácidos nucleicos...). La purificación puede llevarse a cabo mediante técnicas de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio o de cromatografía, como las que se han detallado más abajo.

Una forma de realización ventajosa de la presente invención consiste en el establecimiento de un adenovirus defectuoso para la replicación en el cual una o varias funciones víricas esenciales se vuelven no funcionales mediante mutación (adición, deleción y/o sustitución de uno o varios nucleótidos continuos o no).

El procedimiento de inactivación según la invención pretende reducir o eliminar los virus envueltos susceptibles de contaminar una preparación vírica que comprende uno o varios adenovirus de interés.

El término "inactivación" puede definirse como una reducción significativa o total de la infecciosidad del (o de los) virus envueltos (s) contaminante (s) de la preparación vírica de interés. Para los fines de la presente invención, la infecciosidad se reduce factorialmente por lo menos en 2 logaritmos, ventajosamente por lo menos en 3 logaritmos, preferentemente, por lo menos en 4 logaritmos, y de una forma completamente preferida por lo menos en 7 logaritmos. La inactivación de los virus envueltos puede evaluarse según los procedimientos de la técnica, por ejemplo, mediante microscopía electrónica, HPLC, métodos de biología molecular (PCR), métodos de determinación del título vírico, fluorescencia, métodos inmunológicos (ELISA, RIA), métodos inmunoenzimáticos que permiten la detección de uno o varios polipéptidos víricos (Western....), medida de la actividad transcriptasa inversa, principalmente para los retrovirus.....

Para los fines de la presente invención, el disolvente puede ser introducido en la preparación vírica inmediatamente después de la recuperación de los virus no envueltos (preparación vírica no purificada) o en una etapa cualquiera de su purificación.

En el ámbito de la presente invención, el término "disolvente" designa cualquier sustancia, solución o composición capaz de solubilizar un lípido o disociar un constituyente que incluya uno o varios lípidos. En este caso, un disolvente que se utilice en el procedimiento según la invención está destinado más particularmente a disociar una envuelta vírica. Aunque cualquier disolvente pueda ser considerado, se prefiere sin embargo poner en práctica el Hecameg (referencia UP785480 de Interchim), el éter o aún un alquil fosfato, solo o combinado. La combinación puede asociar disolventes de la misma familia química (por ejemplo, dos alquil-fosfatos) o de familias distintas (éter y alquil fosfato). En el ámbito de la presente invención, el disolvente se selecciona más particularmente entre el grupo constituido por los di-alquil fosfatos y los tri-alquil fosfatos. Ventajosamente, cada uno de los grupos alquilos del di-alquil o tri-alquil fosfato comprende de forma independiente de 1 a 10 átomos de carbono. Se indica que el o los grupos alquil pueden ser lineales o ramificados (isoalquil) y pueden eventualmente ser sustituidos. Se trata preferentemente de un tri-alquil fosfato, en el que cada uno de los 3 grupos alquilos comprende de forma independiente de 2 a 8 átomos de carbono y, de forma completamente preferida, de 3 a 5. Como ejemplo puramente ilustrativo, se puede citar el tri-(n-butil) fosfato (TNBP), el tri-(t-butil)fosfato, el tri-(n-hexil) fosfato, el tri-(2-etilhexil)fosfato, el tri-(n-decil)fosfato. Un disolvente particularmente preferido es el tri-n-butil fosfato.

La cantidad del disolvente que va a utilizarse en el procedimiento según la invención debe ser suficiente para reducir de forma significativa los virus envueltos que contaminan la preparación vírica de interés. Por supuesto, dicha cantidad puede variar en función de ciertos parámetros del procedimiento según la invención (volumen de la preparación vírica, tasa de contaminación, tipo de virus envueltos, estado de purificación de la preparación vírica,....etc). El experto en la materia está en condiciones de adaptar la cantidad de disolvente necesario a las condiciones experimentales precisas. Ventajosamente, el disolvente se utiliza a una concentración final comprendida entre 0,001% y 10% (correspondiendo 1% a 1 ml de una solución madre de disolvente de una pureza superior al 99%, ó a 1 g de disolvente puro para un volumen total de 100 ml). Según un modo de realización preferido, el disolvente introducido en dicha preparación vírica es del tri-(n-butil) fosfato y en una cantidad comprendida entre 0,05% y 1%, preferentemente, de entre 0,1% y 0,6% y, de forma completamente óptima, del 0,3%.

Según una forma de realización opcional pero sin embargo ventajosa, el procedimiento de inactivación de los virus envueltos según la invención, se lleva a cabo en presencia de un detergente, surfactante o molécula amfífila, de preferencia no iónica. Estos términos reagrupados más abajo con la denominación de agente de solubilización, designan cualquier sustancia, solución o composición que facilite la solubilidad de otra sustancia, solución o composición, en un medio en el que esta última no sea soluble o lo sea poco, o facilite todavía su accesibilidad a los virus envueltos. De conformidad con los objetivos que se pretenden para la presente invención, el agente de solubilización está destinado a mejorar la solubilidad o la accesibilidad del disolvente respecto a los virus envueltos que se encuentran en la preparación vírica de interés, con la finalidad de aumentar la eficacia del procedimiento según la invención. Por supuesto, el disolvente y el agente de solubilización pueden introducirse individualmente en la preparación vírica (el agente de solubilización previamente o después del disolvente) o aún, de forma simultánea. Especialmente, cuando el procedimiento de inactivación, según la invención, se pone en práctica en una preparación vírica que se está purificando, puede ser ventajoso introducir el agente de solubilización a partir de las primeras etapas de purificación, introduciendo seguidamente el disolvente, cuando se lleve a cabo el procedimiento según la invención. Eventualmente, las etapas subsiguientes de purificación podrán perfeccionar la pureza de la preparación vírica, eliminando particularmente el disolvente del producto final y, llegado el caso, el agente de solubilización utilizado.

Aunque la elección del agente de solubilización no esté limitada, se pueden citar en particular los derivados polioxietilénicos de ácidos grasos o de sus ésteres. Los agentes de solubilización preferidos incluyen el Tween (particularmente el Tween 20 ó 80), el Tritón (particularmente X-100), el PEG (particularmente el PEG 400), el colato sódico, el desoxicolato sódico, el octil \beta-D glucopiranósido y el N dodecil N, N dimetil 2-amonio 1-etano sulfonato. El Tween 80 es completamente preferido. La combinación TNBP y Tween 80 es preferida en el ámbito de la invención.

En el caso en el que esta forma de realización es conservada, la concentración final del agente de solubilización que va a utilizarse, puede variar en una amplia gama. Como ejemplo, puede estar comprendida entre 0,001% y 10%, en particular entre 0,01% y 5% y, preferentemente, entre 0,1% y 2%. Tratándose del Tween 80, la concentración óptima está comprendida entre 0,5% y 2%. Las combinaciones TNPB 0,6% y Tween 80 2%, así como TNPB 0,3% y Tween 80 1%, se prefieren particularmente.

Además, el procedimiento según la invención puede llevarse a cabo igualmente en presencia de una o algunas otras sustancias que mejoran la eficacia del disolvente respecto a los virus envueltos, su estabilidad o su solubilidad, o reduciendo las actividades que interfieren y que son susceptibles de dañar la inactivación de los virus envueltos y/o la infectibilidad de los virus no envueltos. A este respecto, se pueden citar especialmente las anti-proteasas. Esta forma de realización es particularmente apropiada para poner en práctica un procedimiento que utilice el Hecameg como disolvente.

La temperatura a la que el procedimiento según la invención se pone en práctica está comprendida entre -5 y + 50ºC. Sin embargo, con el fin de garantizar la infecciosidad de los virus no envueltos de la preparación vírica, se prefiere una temperatura comprendida entre + 4ºC y + 37ºC, más particularmente, entre + 15ºC y + 25ºC, siendo totalmente apropiada la temperatura ambiente.

El procedimiento según la invención se realiza a un pH comprendido entre 5 y 9 aproximadamente. Sin embargo, se preferirá operar a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5 y, preferentemente, a un pH de 8,5. El experto en la técnica está en condiciones de ajustar el pH utilizando soluciones, tamponadas o añadiendo bases o ácidos para aumentar o reducir respectivamente el pH según las necesidades.

En el ámbito del procedimiento según la invención, el tiempo de reacción entre el disolvente en presencia, eventualmente, del agente de solubilización, y la preparación vírica, puede variar en función de distintos parámetros (volumen de la preparación vírica, tipos de virus envueltos, temperatura de reacción...etc). El tiempo de reacción apropiado a las condiciones experimentales puede determinarse fácilmente por el experto en la materia mediante simples ensayos comparativos. Por ejemplo, el tiempo de reacción está comprendido entre 15 min y 24 horas, ventajosamente entre 30 minutos y 12 horas y, preferentemente, entre 1h y 5 horas. La prolongación del tiempo de reacción puede considerarse para volúmenes de preparación vírica particularmente importantes o para una temperatura de reacción baja. Además, en el caso en el que se busque una reducción del tiempo de reacción, el experto en la materia es capaz de determinar el aumento apropiado de la temperatura de reacción.

Preferentemente, el procedimiento según la invención se lleva a cabo bajo agitación. Efectivamente, se ha observado que el rendimiento en virus no envueltos aumentó en estas condiciones. Aunque la elección de la velocidad de agitación sea muy amplia, es preferible operar a una velocidad de agitación comprendida entre 50 aproximadamente y 5000 vueltas/min, ventajosamente entre 100 aproximadamente y 2000 vueltas/minuto, y preferentemente, entre alrededor de 150 y 500 vueltas/minuto. Se puede recurrir a un agitador magnético o a cualquier otro dispositivo apropiado (por ejemplo, una cubeta provista de agitadores a hélices o de paletas).

En fin, es preferible llevar a cabo el procedimiento de la invención en las condiciones de conductividad comprendidas entre 5 y 500 mS/cm, entre 10 y 200 mS/cm ventajosamente y, preferentemente entre 10 y 100 mS/cm. Estas condiciones son ventajosas para conservar la infecciosidad de interés de los virus no envueltos.

Además, el procedimiento según la invención se puede referir a uno o varios tipos de virus con envoltura procedentes de fuentes variadas, como por ejemplo, la materia prima, la materia biológica, el entorno o los operadores que intervienen durante la preparación y la purificación de los virus de interés sin envoltura. Preferentemente, el procedimiento de la invención es particularmente útil para inactivar los virus con envoltura patógenos para el hombre. Entre éstos, se pueden citar los virus de la hepatitis, los retrovirus, el virus Epstein Barr, los citomegalovirus, los virus del herpes, los rabdovirus, los mixovirus, los paramixovirus, los ortomixovirus, los arenavirus y los coronavirus. En el cuadro de la presente invención, el procedimiento de la invención se refiere más particularmente a los retrovirus y a los virus de la hepatitis. La validación del procedimiento según la invención puede llevarse a cabo introduciendo en una preparación vírica de interés una cantidad conocida de virus envueltos particularmente estables contra la inactivación, como por ejemplo el BVD (diarrea vírica bovina), el PRV (virus de la parálisis bulbar infecciosa en animales), el VSV (virus de la estomatitis vesicular), los retrovirus o el HSV (virus del herpes simple). El procedimiento de inactivación de la invención se valida cuando la concentración y/o la infecciosidad de los virus "prueba" envueltos se reduce de manera significativa, es decir por lo menos en 4 logaritmos. Además, en la medida en que el procedimiento de inactivación de la invención se integra en un procedimiento global de preparación de una preparación vírica, es igualmente posible prever una validación global que permita cuantificar la inactivación que resulta en conjunto de las etapas del procedimiento de preparación. Un ejemplo de validación de la etapa de inactivación se proporciona seguidamente.

El procedimiento de inactivación según la invención se aplica a una preparación vírica que comprende adenovirus de interés. El procedimiento de la invención se adapta muy particularmente a la preparación de adenovirus recombinantes que son defectuosos para la replicación. "Recombinante" se refiere a la presencia de uno o varios gen(s) de interés situado(s) bajo el control de los elementos apropiados para su (de ellos) expresión en una célula huésped. "Defectuosos para la replicación" significa que son incapaces de replicación autónoma en una célula huésped (en ausencia de complementación).

Ventajosamente, el gen de interés codifica un ARN anti-sentido, un ribozima, o aún, un polipéptido de interés. Puede provenir de un organismo eucariota, de un procariota, de un parásito o de un virus distinto del adenovirus. Puede aislarse mediante cualquier procedimiento convencional en el ámbito de la técnica (clonación, PCR, síntesis química...). Puede ser de tipo genómico (incluyendo la totalidad o parte del conjunto de los intrones), de tipo ADN complementario (ADNs, desprovisto de intrón), o de tipo mixto (minigen). Además, el polipéptido para el cual codifica puede ser (i) intracelular, (ii), que se incorpore a la membrana de la célula huésped o (iii) secretado. Puede tratarse de un polipéptido tal que se encuentre en la naturaleza (original), de una parte de éste (troncado), de un mutante que presente especialmente propiedades biológicas mejoradas o modificadas o, aún, de un polipéptido quimera que provenga de la fusión de secuencias de orígenes diversos.

Entre los polipéptidos de interés, utilizables, se pueden citar más particularmente las quimioquinas (MIP-1\alpha, MIP-1\beta, RANTES, CD-CK1, MDC, MCP1 (proteína de quimioatracción de los monocitos), IP10...), las citoquinas (interferón \alpha, \beta ó \gamma, interleuquina (IL)principalmente la IL-2, la IL-6, la IL-10 ó aún la IL-12, el factor estimulante colonial (GM-CSF, C-CSF, M-CSF)..), los receptores celulares (reconocidos particularmente por el virus HIV), los ligandos del receptor, los factores de coagulación (Factor VIII, Factor IX, trombina, proteína C), los factores de crecimiento, los factores proangiogénicos (FGF para Fibroblast Growth Factor, VEGF para Vascular Endothelial Growth Factor, SH/HGF para scatter factor/Hepatocyte growth factor, TGF para transforming growth factor, TNF para factor necrosante de tumores, angiopoyetina), los enzimas (ureasa, renina, metaloproteinasa, óxido nítrico sintetasa NOS, SOD, catalasa, lecitina colesterol acetil transferasa (LCAT...), los inhibidores de enzima (\alpha1-antitripsina, antitrombina III, inhibidor de la proteasa vírica, PAI-1 para plasminogen activator inhibitor), los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II o II, o los polipéptidos que actúan sobre la expresión de los genes correspondientes, los antígenos (o péptidos antigénicos) capaces de generar una respuesta inmunitaria, los polipéptidos capaces de inhibir una infección vírica, bacteriana o parasitaria o su desarrollo, los polipéptidos de efecto antitumoral (productos de expresión de genes supresores de tumores, antígenos asociados a los tumores,...), los polipéptidos que actúan positiva o negativamente sobre la apoptosis (Bax, Bcl2, BclX...), los agentes citostáticos (p21, p16, Rb), las inmunoglobulinas en total o en parte (Fab, ScFv...), las toxinas, las inmunotoxinas, las apolipoproteínas (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), los productos citotóxicos, los factores anti-angiogénicos (angioestateina, endostatina, PF-4....), los marcadores (\beta-galactosidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde) o cualquier otro polipéptido que tenga un efecto terapéutico para la afección convertida en diana.

Más precisamente, con la finalidad de tratar una disfunción hereditaria, se utilizará una copia funcional del gen defectuoso, por ejemplo, un gen que codifique el factor VIII o IX en el ámbito de la hemofilia A o B, la distrofina (o minidistrofina) en el ámbito de las miopatías de Duchenne y Becker, la insulina en el ámbito de la diabetes, la proteína CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) en el ámbito de la mucoviscidosis. Tratándose de inhibir el inicio o la progresión de tumores o cánceres, se utilizará preferentemente un gen de interés que codifique un ARN anti-sentido, un ribozima, un producto citotóxico, (timidina quinasa del virus simplex del herpes 1 (TK-HSV-1), ricina, toxina colérica, diftérica, producto de los genes de la levadura FCY1 y FUR1 que codifican la uracil fosforibosil transferasa y la citosina desaminasa....), una inmunoglobulina, un inhibidor de la división celular o de las señales de transducción, un producto de expresión de un gen supresor de tumor (p53, Rb, p73, DCC....), un polipéptido estimulador del sistema inmunitario, un antígeno asociado a un tumor (MUC-1, BRCA-1, antígenos precoces o tardíos de un virus del papiloma), en combinación, eventualmente, con un gen de citoquina. En fin, en el ámbito de una terapia anti-HIV, se puede recurrir a un gen que codifique un polipéptido inmunoprotector, un epítopo antigénico, un anticuerpo (2F5; Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195), el dominio extracelular del receptor CD4 (sCD4; Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86), una inmunoadhesina (por ejemplo un híbrido CD4-inmunoglobulina IgG; Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531: Byrn et al, 1990, Nature 344, 667-670), una inmunotoxina (por ejemplo fusión del anticuerpo 2F5 o de la inmunoadhesina CD4-2F5 con la angiogenina; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499), un variante trans-dominante (EP 0614980, WO95/16780), un producto citotóxico tal como uno de los mencionados anteriormente, o todavía un IFN\alpha ó \beta.

Uno de los genes de interés puede igualmente ser un gen de selección que permite seleccionar o identificar las células transfectadas o transducidas. Se pueden citar los genes neo (que codifican la neomicina fosfotransferasa) que confieren una resistencia al antibiótico G418, dhfr (Dihidrofolato reductasa), CAT (Cloramfenicol acetil transferasa), pac (Puromicina acetil transferasa) o aún gpt (Xantina guanina fosforibosil transferasa). De forma general, los genes de selección son conocidos por el experto en la materia.

Generalmente, el o los genes de interés se someten al control de los elementos de regulación que permiten su expresión en la célula o en el organismo huésped. Se trata del conjunto de elementos genéticos que permiten la transcripción de un gen de interés en ARN y la traducción de un ARNm en polipéptido. Entre éstos, el promotor reviste una importancia particular. Puede aislarse de un gen cualquiera de origen eucariota o incluso vírico, y puede ser constitutivo o regulable. Alternativamente, puede tratarse del promotor natural del gen en cuestión. Además, puede ser modificado de forma que mejore la actividad promotora, suprima una región inhibitoria de la transcripción, haga que un promotor constitutivo se convierta en regulable, o vice versa, introduzca un sitio de restricción. Se pueden mencionar, como ejemplos, los promotores eucariotas de los genes PGK (Phospho Glicerato Quinasa), MT (metalotioneína; Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, (838-848), SR\alpha (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol 8, 466-472), el promotor precoz del virus SV40 (Virus Simiano), el LTR del RSV (Virus del Sarcoma de Rous), el promotor TK-HSV-1, el promotor precoz del virus CMV (Citomegalovirus) y los promotores adenovíricos E1A y MLP.

Un promotor que se utilice en la presente invención puede estimular igualmente la expresión en una célula tumoral o cancerosa. Se pueden citar particularmente los promotores de los genes MUC-1 que se sobreexpresa en los cánceres de mama y de la próstata (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (por carcinoma embryonic antigen), que se sobreexpresa en los cánceres de colon (Schrewe et al., 1990, Mol., Cell. Biol. 10, 2738-2748), tirosinasa que se sobreexpresa en los melanomas (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864), ERB-2 que se sobreexpresa en los cánceres de mama y del páncreas (Harris et al., 1994, Gene Therapy, 1, 170-175) y la \alpha-fetoproteína que se sobreexpresa en los cánceres de hígado (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465). Se puede considerar igualmente un promotor regulable por sustancias hormonales o exógenas (hormonas esteroideas, tetraciclina...etc) (Saez et al., 1997, Current Opinion in Biotechnology, 8, 608-616).

También se puede recurrir a un promotor histo-específico. Como ejemplo, se pueden citar los promotores hepato-específicos (de los genes \alpha-1 antitripsina, albúmina, FIX, ApoAI...), específicos pulmonares (de los genes CFTR, surfactante), específicos de los linfocitos (inmunoglobulina) y musculo-específicos (\beta-actina, Tabin et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2, 426-436; SM22; Moessler et al., 1996, Development 122, 2415-2425 y desmina, Li et al., 1989, Gene 78, 243-254).

Por otra parte, los elementos de regulación pueden, además, incluir elementos adicionales que mejoran la expresión o la conservación en la célula huésped del gen de interés (origen de replicación, elementos de integración en el genoma celular, secuencias intrónicas, secuencias poli A de finalización de la transcripción, secuencias conductoras tripartitas....). Estos elementos son conocidos por el experto en la materia. Además, el gen de interés puede igualmente incluir por encima de la región codificante, una secuencia que codifique un péptido señal que permite su secreción de la célula huésped. El péptido señal puede ser el del gen en cuestión, o heterólogo (procedente de un gen cualquier secretado o sintético).

El gen de interés puede insertarse en un lugar cualquiera del genoma del virus no envueltos, reemplazando ventajosamente a la región E1 o E3 cuando se trata de un adenovirus. Cuando el vector adenovírico recombinante comporta varios genes de interés, éstos pueden situarse bajo el control de los mismos elementos genéticos (casette policistrónico que utiliza un sitio interno de iniciación de la traducción del tipo IRES para volver a iniciar la traducción del segundo cistrón) o de elementos independientes. En este caso, pueden insertarse en una misma región vírica (por ejemplo reemplazando a E1) o en regiones distintas (por ejemplo, reemplazando a E1 y a otra región suprimida).

Un virus defectuoso puede obtenerse mediante una mutación no funcional o mediante una deleción total o parcial de una región esencial para la replicación del virus. Se recurrirá preferentemente a un vector adenovírico desprovisto de la totalidad o de parte por lo menos de una región esencial para la replicación, seleccionada entre las regiones E1, E2, E4 y L1 a L5, con el fin de evitar su propagación en el seno del organismo huésped o del entorno. Se prefiere una deleción de la mayoría de la región E1. Ventajosamente, abarca los nucleótidos (nt) 454 a 3328, pero puede igualmente englobar secuencias adicionales en 5' y/o en 3', con la condición de no interferir con la función de encapsidación. Preferentemente, el gen pIX no se incluye en la deleción de E1. Una deleción que se extiende hasta el nucleótido 3510 responde a estos criterios.

Además, la deleción de E1 puede combinarse con otras modificaciones que afectan particularmente a las regiones E2, E4, L1, L2, L3, L4 y/o L5, en la medida en que las funciones esenciales defectuosas se complementan en trans mediante una progenie de complementación y/o mediante un virus auxiliar. A este respecto, se puede recurrir a los vectores de segunda generación que son defectuosos para las funciones E1 y E4 o E1 y E2 (véanse por ejemplo las solicitudes de patente internacional WO94/28152 y WO97/04119). Para ilustrar esta forma de realización, se puede citar un vector que combina una deleción en el seno de la región E1 y una mutación termosensible que afecta al gen DBP (por DNA Bindig Protein, en inglés) de la región E2A (Ensinger et al., 1972, J. Virol 10, 328-339) o una deleción de esta última. En lo que respecta a la región E4, puede experimentar la deleción en su totalidad o en parte. Una deleción parcial de la región E4, con excepción de las secuencias que codifican los marcos de lectura abiertos (ORF) 3 y/o 6/7, es ventajosa, en la medida en que no requiere complementación de la función E4 (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). Otra alternativa consiste en conservar en la estructura adenovírica las secuencias de E4 que codifican los ORFs-3 y 4 o los ORFs 3, 6 y 7, que tienen un efecto benéfico para la expresión del gen de interés.

Con el fin de aumentar las capacidades de clonación, el vector adenovírico recombinante puede además ser desprovisto de la totalidad o parte de la región no esencial E3. Según esta alternativa, puede ser interesante conservar, sin embargo, las secuencias E3 que codifican los polipéptidos que permiten el escape al sistema inmunitario del huésped, particularmente la glucoproteína gp19k (Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology, 10, 53-71). Según otra alternativa, se puede utilizar un vector adenovírico mínimo que retiene esencialmente las ITRs (Repeticiones terminales Inversas) 5' y 3' y la región de encapsidación, y que es defectuoso para el conjunto de las funciones víricas.

Además, el origen del vector adenovírico puede también variar tanto desde el punto de vista de la especie como del serotipo. Puede derivar del genoma de un adenovirus humano o animal (canino, aviar, bovino, murino, ovino, porcino, simiano...) o aún, de un híbrido que incluya fragmentos de genoma adenovírico de por lo menos dos orígenes distintos. Se pueden citar más particularmente los adenovirus caninos CAV-1 y CAV-2, el aviar DAV o aún, el bovino Bad (particularmente del tipo 3) (Zakharchuk et al, Arch. Virol., 1993, 128:171-176; Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70:165-172; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60:21-28; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76:93-102). Sin embargo, se preferirá un vector adenovírico de origen humano que derive de un adenovirus de serotipo C, particularmente de tipo 2 ó 5.

La invención tiene igualmente como objeto un procedimiento de preparación de una preparación vírica que contiene en su mayoría virus no envueltos, comprendiendo dicho procedimiento por lo menos una etapa de inactivación de virus envueltos según el procedimiento de la invención.

Ventajosamente, el procedimiento de preparación según la invención comprende por lo menos:

(a) una etapa de producción de dicha preparación vírica en una progenie celular apropiada,

(b) una etapa de recuperación de la preparación vírica producida en la etapa (a), a partir de la progenie celular productora y/o del sobrenadante del cultivo,

(c) opcionalmente, una etapa de depuración,

(e) una etapa de inactivación de los virus envueltos, tal como la que se ha descrito anteriormente,

(f) opcionalmente, una etapa de purificación.

Por supuesto, el orden de las etapas puede variar, respecto, particularmente, a la etapa de inactivación (e), que puede situarse inmediatamente después de la recuperación de los virus (etapa b), después de las etapas opcionales c) o d), o aún, puede incluirse en la etapa de purificación f).

Como se ha indicado anteriormente, la etapa (a) puede resultar de la transfección del genoma del virus de interés, virus no envueltos, en una progenie celular apropiada. El ADN vírico introducido puede ser el genoma vírico, construido eventualmente en una bacteria (WO96/17070), en una levadura (WO95/03400) o en una célula. La construcción se lleva a cabo mediante técnicas de biología molecular o de recombinación homóloga intermolecular clásicas en el campo de la técnica. El ADN puede igualmente introducirse en la progenie celular bajo forma de fragmentos que incluyen una parte del genoma vírico y que presentan una región de homología que permite la reconstitución del genoma completo mediante recombinación entre las secuencias homólogas transportadas por cada uno de los fragmentos (Graham et Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, p 109-128, Ed Murey, The Human Press Inc). Otra alternativa consiste en infectar la progenie celular mediante un "pre-almacenamiento" vírico. Las condiciones de la infección pueden definirse por el experto en la materia. Como ejemplo, las células se infectan con el virus no envueltos con una multiplicidad de infección definida (MOI) (alrededor de 1 a 10, tratándose de un adenovirus defectuoso).

Después de transfección o infección, se prosigue el cultivo, preferentemente a 37ºC durante un tiempo lo suficiente largo para que permita la amplificación de los virus. Según la cantidad de virus que vayan a producirse, esta etapa se lleva a cabo en recipientes de cultivo, en fermentador o en cualquier otro sistema apropiado de cultivo. Generalmente, la recuperación de los virus no envueltos se realiza entre 24 h y 1 semana después de la infección o transfección. El tiempo de recuperación puede determinarse mediante varios criterios: título vírico óptimo, observación de una citopatía (redondeo de las células productoras) y/o reducción del consumo de oxígeno. Se prefiere una recuperación a las 48 ó a las 72 horas. Los virus se recuperan, bien a partir de las células productoras, bien a partir del sobrenadante del cultivo, o, aún, a partir del conjunto de células y sobrenadante.

En el primer caso, las células productoras se recuperan. Es preferible proceder a una etapa de rotura celular, generalmente después de la resuspensión de la biomasa celular, con el fin de liberar los virus producidos de forma intracelular. En el ámbito de la invención, pueden practicarse todos los medios clásicos, particularmente los medios químicos y/o mecánicos. Se puede proceder, por ejemplo, a ciclos de congelación-descongelación que hacen que las membranas celulares se vuelvan frágiles para llevar a cabo una lisis enzimática (utilización de enzimas que degradan dichas membranas) o química (empleo de detergente, choque de pH, choque osmótico...). Los medios mecánicos pueden provenir del empleo de ultrasonidos, de atrición (esferas de vidrio DynoMill, BeadMill), de fuerzas de presión y de cizallamiento (homogenizador de alta presión French Press), de microfluídos (Microfluidics, Newton, MA), o aún, de la acción mecánica de dos cilindros que generan fuerzas de cizallamiento hidráulicas y mecánicas (homogenizador Silverson).

Cuando la preparación vírica se ha recuperado directamente del medio de cultivo, no es necesario llevar a cabo la etapa de rotura, pudiéndose depurar directamente el sobrenadante del cultivo para eliminar los desechos celulares, mediante, por ejemplo, centrifugación a baja velocidad o filtración en cascada. En este caso, el cultivo puede proseguirse durante más tiempo, con el fin de garantizar un rendimiento vírico máximo.

Según una tercera opción, se puede recuperar el sobrenadante y las células. En este caso, conviene llevar a cabo la etapa de rotura, con el fin de liberar los virus intracelulares y en la etapa de depuración.

La etapa de depuración tiene como objeto eliminar los elementos insolubles (desechos celulares, floculados de macromaléculas ..., etc). Puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica convencional de filtración (filtración en profundidad, microfiltración tangencial...) o centrifugación (en continuo...). Cuando la preparación vírica está muy concentrada, puede ser particularmente acertado eliminar la mayoría de los productos insolubles, en primer lugar mediante centrifugación y seguidamente, proseguir la depuración mediante filtración en profundidad. Pueden utilizarse numerosos filtros en el ámbito de la presente invención, a condición, sin embargo, de que presenten una porosidad que permita que pase el virus de interés no envueltos, reteniendo los productos insolubles. Se indica que el adenovirus tiene un tamaño de alrededor de 0,07 a 0,1 \mum, necesitando utilizar filtros de porosidad superior. Además, los filtros pueden estar compuestos por materiales sintéticos (nylon), orgánicos (celulosa) o no orgánicos (zirconio). Según una forma de realización ventajosa, se llevan a cabo filtraciones sucesivas sobre filtros de porosidad decreciente, por ejemplo, en primer lugar, sobre un filtro con poros de 8 \mum de tamaño, (Sartorius 5591301P5--00), y después sobre un filtro con poros de 5 \mum (Sartorius 5591342P5-00), seguidamente sobre un filtro con poros de un tamaño comprendido entre 3 y 0,8 \mum (Sartorius, cápsula Sartoclean CA 5621304E9-00-A), y entonces sobre un filtro con poros de tamaño comprendido entre 0,8 y 0,65 \mum (Sartorius, cápsula Sartoclean CA 5621305G9-00-A). Según otra variante, la filtración puede realizarse mediante microfiltración tangencial sobre membranas planas o fibras huecas de porosidad superior al tamaño del adenovirus. A este respecto, pueden utilizarse las membranas Durapore (Millipore) y Omega (Pall).

La etapa de purificación puede llevarse a cabo mediante técnicas clásicas anteriores, por ejemplo, mediante ultracentrifugación (en gradiente de cloruro de cesio u otro) o mediante cromatografía.

Según una forma de realización ventajosa, la etapa de purificación del procedimiento de preparación según la invención, comprende una etapa de cromatografía, particularmente de intercambio iónico. Opcionalmente, puede combinarse con una cromatografía de un tipo distinto, particularmente mediante filtración en gel, con objeto de completar la purificación de los virus no envueltos. Las dos cromatografías pueden llevarse a cabo en un orden cualquiera, pero, sin embargo, se prefiere proceder en primer lugar a la cromatografía de intercambio iónico, y seguidamente a la de filtración en gel.

Para la cromatografía de intercambio iónico, pueden utilizarse distintos tipos de soporte, tales como los soportes a base de celulosa, agarosa (geles Sepharose o Macro-Prep), de dextrano (geles Sephadex). de acrilamida (geles Sephacryl, Trisacryl), de sílice (geles TSK, SW), de poli(estireno-divinilbenceno) (geles Source o Poros), de copolímeros etilén glicol-metacrilato (geles Toyopearl HW, TSK, PW, fractogel EMD), o mezclas, particularmente de agarosa y de dextrano (gel Superdex). Se reservarán más particularmente los soportes aceptados para utilización humana o veterinaria por las autoridades competentes americanas (FDA, por Food and Drug administration) o las agencias de la Unión Europea. Además, el soporte reservado debe unirse, preferentemente mediante enlace covalente, con uno o varios tipos de agrupamientos susceptibles de interactuar con el virus no envueltos que va a purificarse (al soporte se le denomina funcionalizado). Se preferirá un agrupamiento que permita un intercambio iónico, constituido particularmente por una amina terciaria o cuaternaria. Entre los soportes funcinalizados por aminas terciarias, se pueden citar las resinas Fractogel-DEAE (dietilaminoetil), Factogel DMAE (dimetilaminoetil) y las Toyopearl-DEAE. Entre los soportes funcionalizados por aminas cuaternarias, se pueden citar las resinas Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ y QE, Streamline QXL (solicitud francesa 99 02167), las resinas de tipo Fractogel TMAE y Toyopearl super Q. La resina Poros PI constituye un ejemplo apropiado de soporte funcionalizado con la polietileneimina. El soporte Fractogel-DEAE se prefiere en el ámbito de la presente invención. La columna se equilibra inicialmente en condiciones salinas que permiten la fijación de los virus no envueltos de interés sobre los agrupamientos funcionales cargados positivamente. Ventajosamente, se utiliza un tampón que comprende NaCl a una concentración final aproximada de 250 mM. Pero, por supuesto, las condiciones cromatográficas pueden adaptarse en función de distintos parámetros, particularmente del volumen de la columna, del soporte elegido, del virus escogido y de la concentración vírica. La elución del virus retenido en los grupos aminos se lleva a cabo aumentando progresivamente la concentración salina, preferentemente hasta una concentración final de 300 a 400 mM de NaCl y, preferentemente del todo entre 300 y 350 mM de NaCl, y las fracciones que comprenden el virus no envueltos de interés, pueden determinarse mediante todos los procedimientos de la técnica (medición espectrofotométrica de la absorbancia a 260 y 280 nm, visualización de péptidos o genomas víricos...). Es igualmente posible conectar la columna a un detector provisto de un filtro, para la detección en linea de las fracciones víricas. Se indica que la fracción vírica (compuesta de ADN y de proteínas) presenta una absorbancia característica a 260 y 280 nm, mientras que los contaminantes proteicos no se detectan mas que a 280 nm y los ácidos nucleicos libres a 260 nm.

En lo que respecta a la cromatografía de filtración en gel, el virus se purifica sobre un soporte que presenta un diámetro de las esferas comprendido entre 3 y 160 \mum, ventajosamente entre 5 y 105 \mum, preferentemente entre 10 y 80 \mum. Preferentemente, el soporte presenta una porosidad cercana al tamaño del virus, con el fin de que éste no penetre en las esferas. Contrariamente a esto, todas las moléculas de tamaño inferior van a penetrar en las esferas y a retrasarse. Pueden utilizarse distintos tipos de soportes, tales como las matrices a base de agarosa (Sépharose), de dextrano (gel Séphadex), de acrilamida (geles Séphacryl y Trisacryl), de sílice (geles TSK y SW), de copolímeros etilen glicol metacrilato (geles Toyopearl HW, TSK y PW) y de mezclas, particularmente de agarosa y de dextrano (gel Superdex). Los soportes mencionados se utilizan preferentemente sin agrupamientos de funcionalización. Los soportes que son particularmente apropiados para la puesta en práctica del procedimiento de preparación según la invención, son los siguientes:

- matrices de alil dextran-metileno bis acrilamida (Séphacryl S300 HR, con un diámetro de las esferas comprendido entre 25 y 75 \mum, Séphacryl S400 HR, con un diámetro de las esferas comprendido entre 25 y 75 \mum, Séphacryl S500 HR con un diámetro de las esferas comprendido entre 25 y 75 \mum y Séphacryl S1000 SF con un diámetro de las esferas comprendido entre 40 y 105 \mum; Pharmacia),

- matrices de etilen glicol-metacrilato (Toyopearl HW 55, Toyopearl HW 65 y Toyopearl HW 75, con un diámetro de las esferas que varía entre 20 y 60 \mum; Tosohaas),

- matrices de N acril amino hidroxil propanediol (Trisacryl con un diámetro de las esferas comprendido entre 80 y 160 \mum; Biosépra), y

- matriz de agarosa (Macro-Prep SE con un diámetro de las esferas comprendido entre 20 y 80 \mum; Biorad).

Por ejemplo, se prefiere el soporte de tipo Toyopearl HW65F o HW65S (poros de 1000 amstrongs) o de Séphacryl S400HR. La columna se equilibra en un tampón que presenta condiciones salinas y un pH que limita las interacciones hidrófobas entre el soporte y el virus. Ventajosamente, se utiliza un tampón Tris-HCl 50 mM, MgCl_{2} 2mM, sacarosa 2% a un pH de 8,5. Los virus no envueltos de interés pasan a través de las esferas sin ser retenidos y salen antes que los contaminantes de pesos moleculares inferiores. Las fracción que los contienen pueden determinarse mediante los procedimientos habituales (absorbancia a 260 y 280 nm, técnicas de electroforesis, de PCR...). Se tendrá en cuenta que una ventaja del procedimiento de preparación según la invención, consiste en la eliminación durante esta etapa (f) del disolvente y del agente de solubilización que se utiliza en el procedimiento de inactivación según la invención. Según una forma opcional de realización, las fracciones víricas obtenidas después de la etapa de purificación, pueden reunirse y concentrarse eventualmente según las técnicas habituales. Se pueden citar la ultrafiltración tangencial y la filtración. Los cassettes BioMAx PES (Millipore, referencia PXB300C50 o PXB01MC50) y PLCMK (Millipore, referencia PXC300C50) convienen especialmente.

Además, el procedimiento de preparación según la invención puede incluir etapas suplementarias y particularmente, una etapa de degradación de los ácidos nucleicos (principalmente de origen celular) que se encuentran en cantidades importantes después de la rotura de las células. Con este fin, pueden utilizarse todos los enzimas de restricción no específicos de tipo endo o exonucleasas. Pero el procedimiento preferido consiste en un tratamiento con la benzonasa. Como ejemplo, se utilizan alrededor de 5 a 50 U/ml de benzonasa, pero las condiciones óptimas pueden adaptarse por el experto en la técnica, según el volumen a tratar y la viscosidad de la preparación vírica. La acción de la benzonasa puede apreciarse por la reducción de la concentración en ácidos nucleicos, aplicando la metodología que se encuentra en la literatura. Aunque las etapas puedan cambiarse, se prefiere llevar a cabo dicha etapa de tratamiento con la benzonasa entre las etapas de rotura (c) y de depuración (d) de dicho procedimiento de preparación. Otra alternativa consiste en llevar a cabo la etapa de tratamiento con la benzonasa y la etapa de inactivación, de forma concomitante después de las etapas de rotura y de depuración. Además, la benzonasa puede utilizarse en presencia eventualmente de la \beta ciclodextrina. Esta última ayuda a precipitar los lípidos y puede añadirse a una concentración final de 0,1 al 10% y, particularmente, de 1,5%.

El procedimiento de preparación según la invención puede igualmente incluir una etapa de filtración esterilizante, la cual se lleva a cabo preferentemente después de la etapa (f) de dicho procedimiento de preparación. Se recurrirá ventajosamente a filtros de 0,22 \mum, con una superficie adaptada al volumen que va a tratarse. Se pueden citar, por ejemplo, las unidades de filtración de tipo Minisart (Sartorius, referencia SM16534), Sartolab P20 (Sartorius, referencia 18053D), Millex GF (Millipore, referencia SLGS025BS), Millex GV (Millipore, referencia SLGVO25BS), Millex GP (Millipore, referencia SLGPR25LS), o aún, Spirale Cap (Version Super CQS 92 HS o HP; Gelman Sciences), Criticap 50 (12995, Gelman Sciences) o Millipak (Millipore ref. MPGL04SK2 o MPGL02SH2). Después, el filtrado puede acondicionarse en dosis ajustadas a una concentración dada.

La calidad, es decir, el grado de pureza de la preparación vírica, puede controlarse durante el procedimiento de preparación según la invención, determinando la concentración residual de los contaminantes y la funcionalidad del virus de interés, no envueltos. En el primer caso y tratándose de la forma de realización preferida, la desaparición del Tween 80 (o del polisorbato 80) después de la etapa (f), puede apreciarse mediante el procedimiento preconizado en la farmacopea europea (1997, p1372-1373), con la ayuda del tiocianato de potasio y el cloroformo. La cantidad de TNPB presente en la preparación vírica puede titularse mediante la técnica de cromatografía en fase gaseosa tal como la dada a conocer en Horowitz et al (1985, Transfusión 25, 516-522). La concentración residual por las proteínas puede medirse mediante cualquier técnica de dosificación de las proteínas. Una técnica adecuada es la del BCA (ácido bicinconínico) (kit Micro BCA Protein Assay Reagent Kit; Pierce ref 23235). En lo que respecta al principio activo vírico, el número de partículas totales se determina mediante espectrometría con una longitud de onda de 260 mm en presencia de SDS (véase Shabram et al., 1997, Human Gene Therapy 8, 453-465). La funcionalidad del virus no envueltos se determina generalmente por su capacidad infecciosa, por ejemplo, mediante titulación del número de unidades infecciosas (véase Lusky et al, 1998, J. Virol. 72, 2022-2032). Cuando se trata de un virus recombinante, se puede igualmente evaluar la expresión del gen recombinante después de la infección de una célula diana, mediante fluorescencia, métodos inmunológicos (ELISA, RIA), métodos inmuno-enzimáticos (Western...), técnicas de coloración o luminiscencia...etc.

El procedimiento de preparación según la invención se refiere a los adenovirus. Preferentemente, éstos presentan las características definidas anteriormente.

La elección de las distintas progenies celulares apropiadas para la puesta en práctica del procedimiento según la invención, es amplia y al alcance del experto en la técnica. Se elegirá una progenie adaptada al virus no envueltos retenido. Tratándose de la forma de realización preferida (adenovirus recombinante defectuoso para replicación), se utilizará una progenie de complementación adaptada a las deficiencias del adenovirus, tales como las descritas en la literatura. Se trata ventajosamente de una progenie que complementa a la función E1, como por ejemplo la progenie 293 que procede de células embrionarias de riñón humano y que incluye, integrada en su genoma, el extremo 5' del genoma del Ad5 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). otras progenies que complementan E1 están igualmente disponibles (Imler et al., 1996, Gene Therapy, 3, 75-84; Fallaux et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 215-222; Fallaux et al,.1998, Human Gene Therapy 9, 1909-1917). Cuando las deficiencias del virus conciernen igualmente a las regiones E2 o E4, se puede recurrir a las progenies de complementación descritas en Brough et al (1992, Virology 190, 624), Wang et al (1995 Gene Therapy 2, 775-783), Yeh et al (1996, J. Virol. 70 559-565), Kougliak et Graham (1996, Human Gene Therapy 6, 1575-1586) y Lusky et al (1998, J. Virol 72, 2022-2032) y en las solicitudes internacionales WO94/28152 y WO97/04119. Otra alternativa se basa en la utilización de un elemento vírico suplementario, denominado "virus auxiliar", para complementar por lo menos en parte, las funciones defectuosas del virus no envueltos de interés. Los virus auxiliares de la técnica anterior consisten en un genoma vírico, en el que se ha suprimido eventualmente una región esencial para la que el virus de interés no requiere complementación o que es provista por la progenie. De manera general, una progenie de complementación puede generarse mediante transfección de las secuencias víricas que restauran la o las funciones defectuosas del virus, situadas bajo el control de elementos necesarios para su expresión en una progenie celular apropiada. A este respecto, puede originarse a partir de una progenie celular establecida de origen humano o animal, y, preferentemente, aceptable desde un punto de vista farmacéutico (utilizable para la producción a escala industrial de productos destinados a consumo humano y que no tienen carácter patógeno conocido). Se pueden citar entre otras las células KB, HeLa, Vero (ATCC CCL-81), BHK (ATCC CCL-10), A 549 (ATCC CCL-185), MRC5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), CHO, MDCK y MDBK. Una progenie apropiada en el ámbito de la presente invención puede igualmente derivarse de una célula primaria y en particular, de células de la retina o renales obtenidas a partir de un embrión humano. Se recurre preferentemente a una progenie que se deriva de una célula embrionaria del riñón humano, de una célula retinoica (particularmente de retina embrionaria humana HER) o de un carcinoma humano (A549).

La presente invención se refiere igualmente a una preparación vírica obtenida según el procedimiento de preparación de la invención, así como a una célula eucariota infectada por una preparación vírica según la invención. Se trata preferentemente de una célula de mamífero y particularmente humana. Puede ser primaria o tumoral y de un origen cualquiera, especialmente hematopoyético (célula madre totipotente, leucocito, linfocito, monocito o macrófago...), muscular (célula satélite, miocito, mioblasto, músculo liso..), cardíaca, pulmonar, traqueal, hepática, epitelial o fibroblasto. Se indica que la preparación de la invención se distingue de las de la técnica anterior en que está esencialmente desprovista de virus envueltos, infecciosos.

La presente invención se refiere igualmente a una composición que incluye una preparación vírica o una célula huésped según la invención. Como se dijo anteriormente, dicha preparación vírica puede incluir uno o varios virus no envueltos de interés, preparado (s) según el procedimiento de la invención. Éstos pueden ser de la misma familia (adenovirus que portan un gen recombinante distinto) o no. Dicha composición es preferentemente una composición farmacéutica que contenga por lo menos un transportador aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

Una composición según la invención puede fabricarse de manera convencional con miras a administrarla por vía local, parenteral o digestiva. Las vías de administración que pueden considerarse, son múltiples. Se puede citar, por ejemplo, la vía intragástrica, subcutánea, intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intra-vascular, intra peritoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar o intratraqueal. Para estas tres últimas formas de realización, es ventajosa una administración mediante aerosol o instilación. La administración puede llevarse a cabo en dosis única o repetida una o varias veces después de cierto retraso de intervalo. La vía de administración y las dosis de virus apropiadas varían en función de diversos parámetros, por ejemplo, del individuo, de la patología, del gen de interés que vaya a transferirse, de la vía de administración. Como ejemplo, las preparaciones basadas en partículas adenovíricas, pueden formularse bajo forma de dosis comprendidas entre 10^{4} y 10^{14} ufp (unidades formadoras de las calvas), 10^{5} y 10^{13} ufp y, preferentemente, 10^{6} y 10^{12} ufp.

La formulación puede incluir igualmente un diluyente, un adyuvante o un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico, lo mismo que agentes de solubilización, estabilización y de conservación. Una composición preferida está bajo forma inyectable. Puede formularse en solución acuosa, salina (fosfato, monosódica, disódica, magnesio, potasio...) o isotónica. Conviene muy particularmente el tampón de formulación descrito en la solicitud internacional WO98/02522. Puede ser presentada en dosis única o en multidosis bajo forma líquida o seca (polvos, liofilizado...) y ser susceptible de reconstituirse de forma extemporánea mediante un diluyente apropiado.

Una composición según la invención se destina más particularmente al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades mediante terapia génica (incluyendo la inmunoterapia) y está dirigida más particulamente a las enfermedades proliferativas (cánceres, tumores,displasias...etc), a las enfermedades infecciosas y particularmente víricas (inducidas por los virus de la hepatitis B ó C, el HIV, el herpes, los retrovirus...etc), a las enfermedades genéticas (mucoviscidosis, distrofina, hemofilia, diabetes) y a las enfermedades cardiovasculares (restenosis, isquemia, dislipide-
mia...).

La presente invención se refiere igualmente a la utilización terapéutica o profiláctica de una preparación vírica de una célula huésped, de una composición o de una composición farmacéutica según la invención, para la preparación de un medicamento destinado a la transferencia y a la expresión de un gen de interés en una célula o un organismo huésped. El medicamento se destina más particularmente al tratamiento de enfermedades mediante la terapia génica. Según una primera posibilidad, puede ser administrado directamente in vivo (por ejemplo, mediante inyección intravenosa en un tumor accesible, en los pulmones mediante aerosol, en el sistema vascular mediante una sonda apropiada...). Se puede igualmente adoptar el planteamiento ex vivo que consiste en extraer células del paciente (células troncales de la médula ósea, linfocitos de la sangre periférica, células musculares...), transfectarlas o infectarlas in vitro según los procedimientos de la técnica y volver a administrarlas al paciente después de una etapa de eventual amplificación. Pueden considerarse la prevención y el tratamiento de numerosas patologías. Una utilización preferida consiste en tratar o prevenir los cánceres, tumores y enfermedades resultantes de una proliferación celular no deseada. Entre las aplicaciones que pueden considerarse, se pueden citar los cánceres de mama, de útero (particularmente los inducidos por los papilomavirus), de próstata, de pulmón, de vejiga, de hígado, de colon, de páncreas, de estómago, de esófago, de laringe, del sistema nervioso central y de la sangre (linfomas, leucemia, etc...). Ella es igualmente útil en el ámbito de las enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, para inhibir o retardar la proliferación de las células musculares lisas de la pared vascular (restenosis). Enfin, en lo que respecta a las enfermedades infecciosas, puede considerarse la aplicación al SIDA.

La invención abarca igualmente un procedimiento para el tratamiento de enfermedades mediante terapia génica, caracterizado porque se administra a un organismo o a una célula huésped que tenga necesidad de tal tratamiento, una preparación vírica, una célula huésped o una composición según la invención.

Ejemplos

La presente invención se ilustra en los ejemplos siguientes, sin estar limitada sin embargo por los mismos.

Los adenovirus recombinantes se construyeron mediante la técnica de recombinación homóloga descrita en Chartier et al (1996, J. Virol 70, 4805-4810). Los constructos que se establecieron se llevaron a cabo según las técnicas generales de ingeniería genética y de clonación molecular, detallados en Maniatis et al (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY o una edición más reciente) o según las recomendaciones del fabricante cuando se utiliza un equipo comercial. Las etapas de clonación utilizan la cepa E.coli 5K (hsdR, mcrA), DH5\alpha[(recA1, endA1, hodR17 (r-m-), supE44thi-l, gyrA(nalr)] o NM522 (supE, thi, \Delta(lac-proAB), hsd5, (r-m-), (F=proAB, lacI^{q},Z\DeltaM15) y las de la recombinación homóloga la cepa E.coli BJ5183 (Hanahan, 1983, J.Mol. Biol. 166, 557-580). Tratándose de la reparación de sitios de restricción, la técnica utilizada consiste en llenar los extremos 5' protuberantes mediante el gran fragmento de la ADN polimerasa I de E.coli (Klenow, Boehringer Mannheim). Los fragmentos del ADN se purificaron mediante el equipo de purificación de ADN, GeneCleanil^{R} (Bio101INc.) Además, los fragmentos de genoma adenovírico utilizados en los distintos constructos, se indican precisamente según su posición en la secuencia nucleotídica del genoma de Ald5, tal como se ha dado a conocer en el banco de datos Genebank bajo la referencia M73260.

En lo que se refiere a la biología celular, las células son transfectadas o transducidas y cultivadas según las técnicas estándar bien conocidas por el experto en la materia. Se recurre a las progenies celulares 293 (ATCC CRL-1573), A549E1+ (WO94/28152) y 293-E4ORF6+7 (Lusky et al., 1998, J. Virol 72, 2022-2032). Queda entendido que pueden utilizarse otras progenies celulares. Las células se conservan en cultivo a 37ºC en una atmósfera húmeda enriquecida con CO_{2} al 5%, en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco BRL) complementado con 1 nM de glutamina, 1% de ácidos aminos (Gibco BRL), 40 \mug/l de gentamicina y 10% de suero fetal bovino (SVF, Gibco BRL). Las células pueden obtenerse igualmente en un reactor de cultivo celular. Las células son transfectadas según los procedimientos de la técnica (precipitación con fosfato de calcio,,,). El título en unidades infecciosas (iu) o partículas víricas totales, se determina según los procedimientos de la técnica (Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2032).

Los ejemplos que siguen a continuación se han constituido mediante adenovirus recombinantes que expresan un gen marcador o un gen terapéutico. Derivan del serotipo Ad5 y tienen la estructura siguiente:

- AdTG6297 es un vector adenovírico de primera generación, defectuoso respecto a las funciones E1 (deleción de los nucleótidos 459 a 3328) y E3 (deleción del fragmento XbaI que abarca desde el nucleótido 28592 al 30470), en el genoma del cual se inserta, reemplazando a la región E1, un cassette de expresión del gen marcador que codifica la proteína GFP (por "green fluorescent protein"). Ésta reacciona a la excitación luminosa (485 nm) emitiendo una luz fluorescente, cuya intensidad se mide mediante un filtro (535 nm). De modo más preciso, el casette está compuesto por el promotor CMV seguido de un intrón quimera, de la secuencia que codifica la proteína GFP y del poliA del virus SV40. Las secuencias intrónicas se aislan del plásmido pCl (Promega Corp, pCl mammalian expression vector E1731) e incluyen el sitio donante del empalme del intrón l del gen de la \beta-globina humana, así como el punto de conexión y el sitio aceptor del empalme del gen de una inmunoglobulina de ratón. Las partículas víricas son producidas mediante transfección del vector AdTG6297 en una progenie de complementación de E1 (293 o A549E1+) y son amplificadas mediante pases sucesivos sobre una progenie opcional (que complementa E1).

- El vector AdTG5643 es un vector de segunda generación, que ha experimentado la deleción de las regiones E1 (nucleótidos 459 a 3328), E3 (nucleótidos 28592 a 30470) y E4 (nucleótidos 32994 a 34998) y que expresa el gen terapéutico CFTR humano. El casette de expresión está constituido por el promotor precoz CMV, ADNc CFTR y del poli A del gen \beta-globina de conejo, insertándose en lugar de las secuencias E1 suprimidas. Las partículas víricas son producidas mediante transfección del vector AdTG5643 en una progenie de complementación de E1 y E4 (293-E4ORF6+7) y un stock vírico constituido por pases sucesivos sobre una progenie opcional (que complementa E1 y E4).

- El vector AdTG13383 es un vector que ha experimentado la deleción de las regiones E1 (nucleótidos 459 a 3511) y E3 (nucleótidos 28539 a 30470) y que expresa el gen terapéutico IL2 humano. El casette de expresión inserto en lugar de las secuencias E1, está constituido por el promotor precoz CMV, el ADNc que codifica la IIL2 humana, el intrón sintético aislado del plásmido pCI y del poli A SV40. Las partículas víricas son producidas mediante transfección del vector pTG13383 en una progenie de complementación de E1 y un stock vírico constituido por pases sucesivos sobre una progenie opcional (que complementa E1).

Ejemplo 1 Preparación de virus a partir de células de complementación

Las células A549-E1+ se cultivan en placas de cultivo, hasta alcanzar una densidad celular de 2,5.10^{5} células/cm^{2}, infectándose seguidamente con un prestock de AdTG6297, a razón de una MOI de alrededor de 3. Las células infectadas se recuperan a las 72 horas después de la infección y se centrifugan a baja velocidad. El sedimento se disuelve otra vez en alrededor de 600 ml de medio de cultivo sin suero. La preparación vírica así obtenida corresponde a un volumen de 20 l aproximadamente.

El virus intracelular se libera después de romper las células sometidas a acción mecánica durante 7 a 10 minutos en un homogenizador Silverson (L4R-Silverson), regulado a una velocidad de rotación de 4200 vueltas/min.

En este estado, la preparación vírica es muy viscosa, debido a la liberación del ADN genómico después de la fragmentación celular. Se añade a la preparación vírica un volumen de un tampón que permite una acción óptima de la benzonasa, tampón constituido por Tris 100 mM, MgCl_{2} 4 mM, sacarosa al 4%, pH 8,5, a los que se ha añadido el agente de solubilización Tween 80 (referencia Merck 8-22187-1000) a una concentración del 2%. La mezcla se agita a temperatura ambiente antes de añadir la benzonasa, a razón de 50 U/ml (referencia Merck 101697), dejando que prosiga la reacción durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente y con agitación.

La preparación vírica que se ha tratado de esta forma, es depurada a continuación mediante filtración en profundidad en cuatro etapas sucesivas. La primera filtración se lleva a cabo a través de filtros de 8 \mum (Sartorius 5591301P5--00), después sobre filtros de 5 \mum (Sartorius 5591342P5-00), seguidamente sobre filtros de 3 a 0,8 \mum (cápsula Sartoclean CA 5621304E9-00-A), y seguido por una cuarta filtración a través de filtros de 0,8 y 0,65 \mum (cápsula Sartoclean CA 5621305G9-00-A).

La etapa de inactivación de los virus envueltos se lleva a cabo mediante acción del TNBP a una concentración final de 0,3%. Para realizarlo, el filtrado se diluye volumen a volumen en una solución tampón de Tris 50 mM, MgCl_{2} 2mM. sacarosa 2%, NaCl 350 mM y TNBP al 0,6% (Aldrich 24-049-4), pH 8,5. Es igualmente posible añadir a la preparación vírica filtrada 9 volúmenes de un tampón más concentrado (Tris 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa 2%, naCl 1,82 M y TNBP 3%, pH 8,5). Hay que darse cuenta de que las condiciones salinas utilizadas (NaCl 250 mM final) corresponden a las condiciones de equilibrio de la cromatografía por intercambio iónico. Se permite que la acción del TNBP/Tween 80 prosiga con agitación (500 rpm) a temperatura ambiente durante 3 horas, o a 4ºC durante 4 horas.

Para la etapa de cromatografía por intercambio iónico, la preparación vírica inactivada se carga sobre una columna que contiene fractogel EMD DEAE (Merck, referencia 1.16883), equilibrada previamente con tampón Tris 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa 2%, NaCl 250 mM, pH 8,5. Después de enjuague con el tampón de equilibración, los constituyentes adsorbidos sobre el soporte, se eluyen con el tampón precedente en presencia de concentraciones crecientes de sal (NaCl 300 mM, 350 mM,400 mM...etc). Se aplica un caudal de 30 a 100 cm/h y, preferentemente, 50 cm/h. Las distintas fracciones eluídas se visualizan midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm. Generalmente, las proteínas (detectadas a 280 nm únicamente), se eluyen mediante el tampón que contiene 300 mM en NaCl. El segundo pico de elución (detectado a 260 y 280 nm), contiene los adenovirus de interés que son eluidos a una concentración salina de 350 mM. la columna se regenera en presencia de NaCl 1,5M. El fractogel se somete regularmente a control sanitario haciendo pasar NaOH 0,5 N.

La fracción vírica se carga seguidamente en una columna que contiene gel Toyopearl HW-65F (Tosohaas, referencia 43304 o 07465) o 65S (Tosohaas, referencia 43354 o 07467) o Séphacryl S400HR (Pharmacia, referencia 17-0609-10), equilibrada previamente con tampón Tris 25 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa 2%, pH 8,5. Generalmente, el volumen de preparación vírica inyectado corresponde a un volumen del 5 al 20% del de la columna de filtración en gel, variando el caudal aplicado entre 5 y 100 cm/h con preferencia por 10 a 50 cm/h. El perfil de elución seguido por la medición de la absorbancia a 280 nm, muestra que el pico del adenovirus es el primer pico obtenido a la salida de la columna.

La etapa siguiente consiste en filtrar la preparación vírica con el fin de poder condicionarla en el tampón de formulación. Con este objeto, las fracciones víricas se reúnen y se mide el título en partículas víricas totales y las unidades infecciosas sobre una alícuota. Si el título vírico es suficiente, los virus se diluyen en el tampón de formulación, se someten a una filtración esterilizante en filtro de 0,22 m (Sartolab, P20, referencia Sartorius 18053D) y se reparten en dosis. Si el título es demasiado débil, la preparación vírica puede ser concentrada previamente mediante ultrafiltración tangencial y/o filtración mediante, por ejemplo, casettes BiMax PES (MIllipore referencia PXB300C50) y PLCMK (Millipore PXC300C50)

En una experiencia representativa llevada a cabo a partir de una preparación vírica de AdTG6297 que expresa el marcador GFP, el balance en títulos víricos es el siguiente:

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Etapas	ui totales x 10^{11}	Rendimiento (%)
Inicio	35	100
Benzonasa	81,6	233
Filtración	48,2	138
Inactivación t0	110	314
Inactivación t 4h	154	440
Flujo a través del Cromato fractogel-DEAE	14,8
Elución NaCl 350 mM	30	85

- ui representa el número de unidades infecciosas

- el "flujo a través" representa el material que no es retenido en la columna y que es eluído, pues, directamente.

El aumento de los títulos en adenovirus en un factor 3 a 4 al llevarse a cabo la etapa de inactivación, puede explicarse por una desagregación de los virus en presencia del disolvente.

Ejemplo 2 Preparación de virus a partir del cultivo celular

Se reproduce el ejemplo 1, con la diferencia de que, a las 72 horas después de la infección, se recuperan las células y el sobrenadante del cultivo (volumen de 20 l aproximadamente), sometiéndose directamente el conjunto a la etapa de fragmentación.

Ejemplo 3 Inactivación de los virus envueltos 3.1 Validación en una preparación de retrovirus

La eficacia del procedimiento de inactivación propuesto en la presente invención se evaluó sobre retrovirus recombinantes que expresaban el gen marcador LacZ que codifica en enzima \beta-galactosidasa. Se preparó un cultivo de 20 F500 de células 293. Después de centrifugación 8 minutos a 3000 rpm, las células se volvieron a depositar en el medio sin suero. La preparación contiene 3 x 10^{7} células/ml en un volumen de 25 ml. Las células se fragmentaron en un homogeneizador Silverson, y se centrifugaron después durante 10 minutos a 3500 rpm para eliminar los desechos. La preparación se separa entonces en 2, diluyéndose una primera mitad volumen a volumen en el tampón benzonasa (Tris 100 mM, MgCl_{2} 4 mM, sacarosa 4%, pH 8,5) en ausencia de \beta-ciclodextrina cuando la segunda mitad se trata de forma similar pero en presencia de 3% de \beta-ciclodextrina (1,5% final). Las muestras se depuraron mediante filtración en cascada sobre filtros Minisart (Sartorius) de 5 \mum (referencia 17594Q), de 1,2 \mum (referencia 17593Q) y 0,8 \mum (referencia 17592Q). Cada muestra se trata entonces con un volumen de Tris 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa 2%, NaCl 450 mM, TNBP 0,6% y Tween 80 2%, pH 8,5. Se introducen las partículas retrovíricas a una concentración final de 1,5 x 10^{6} partículas infecciosas/ml. El título en partículas retrovíricas se determina después de 15 segundos, 20 minutos, 1 hora, 2 horas y 4 horas de incubación, bien a 4ºC, bien a temperatura ambiente. La titulación se realiza realizando el contaje de las células azules según la metodología estándar (véase por ejemplo, US 5.747.323).

Los resultados se resumen a continuación:

antes de titulación: 1,5 x 10^{6} partículas de retrovirus/ml

temperatura ambiente, + \beta-ciclodextrina, 15 segundos de incubación: < 1 x 10^{3}/ml

temperatura ambiente, - \beta-ciclodextrina, 15 segundos de incubación: 1 x 10^{4}/ml

4ºC, + \beta-ciclodextrina, 15 segundos de incubación:<1x10^{3}/ml

Más allá de los 15 segundos de incubación, los títulos de partículas retrovíricas son inferiores al umbral de detección (10^{3} partículas infecciosas/ml). Los resultados muestran que el procedimiento de inactivación de la invención permite una reducción de la infecciosidad de los retrovirus de 2 logaritmos en 15 segundos. La presencia de \beta-ciclodextrina es ventajosa, pues ella mejora con un factor suplementario de 10 la inactivación retrovírica.

3.2 Validación de una preparación de adenovirus contaminada por el virus BVD

Se prepara una preparación adenovírica a pequeña escala (18 ml) según el protocolo utilizado en el ejemplo 1. Después de purificación mediante filtración en profundidad en 4 etapas sucesivas, se introducen 2 ml de una solución de partículas de BVD. Seguidamente, se procede a la etapa de inactivación en presencia de una concentración final de TNBP al 0,3% y Tween 80 al 1%. El título en partículas BVD y adenovíricas infecciosas se determina a partir de 0, 15, 60 y 120 minutos de incubación a temperatura ambiente.

Obtenemos así una cinética de inactivación del virus BVD:

Tiempo	Título (log_{10} TCID50)
T0	5,88
T 5 seg.	5,27
T 15 min.	3,87
T 60 min.	<2,57
T 120 min.	1,18

Es decir, una reducción de 4,7 Log_{10} después de 2 horas de inactivación.

Ejemplo 4 Preparación de virus a partir de células de complementación

Las células de complementación para la función adenovírica E1 se cultivan en un bioreactor en medio Excell 525 (JRH Biosciences) hasta que se alcanza una concentración de 1 x 10^{6} células/ml, infectándose seguidamente con un volumen equivalente a un pre-stock de AdTG13383 a razón de una MOI de alrededor de 10. Las células infectadas se recuperan a las 72 horas después de la infección. El sobrenadante del cultivo (volumen de alrededor de 20 l) y el conjunto se someten directamente a la etapa de fragmentación, para obtener la preparación vírica en bruto que va a purificarse.

Las partículas víricas intracelulares se liberan después de la fragmentación de las células, que se someten a la acción mecánica durante 7 a 10 minutos de un homogeneizador Silverson (275 UHLS), regulado a una velocidad rotatoria de 50 Hz (velocidad de 8,1).

La etapa de depuración se lleva a cabo mediante filtraciones sucesivas sobre filtros de porosidad decreciente, en primer lugar sobre un filtro de una porosidad de 8 \mum (Sartopure 300PP2 5592501), después sobre un filtro de porosidad 5 \mum (Sartopure 300 PP3 5592542), y finalmente sobre un filtro de porosidad comprendida entre 3 y 0,8 \mum (Sartorius, Sartoclean CA cápsula 5621304E9-00-A).

Se añade a la preparación vírica depurada un volumen de un tampón que permite una acción óptima de la benzonasa y que está constituido por Tris-HCl 100mM, MgCl_{2} 4 mM, sacarosa al 4%, pH 8,5, que comprende además Tween 80 (referencia Merck 8-22187-1000) a una concentración del 2%. La mezcla se somete a agitación a temperatura ambiente, antes de añadir la benzonasa a razón de 10U/ml (referencia merck 101697), dejando que la reacción prosiga durante 2 h a temperatura ambiente y con agitación (500 vueltas/min). Se puede igualmente someter la preparación vírica depurada a la acción concomitante de la benzonasa (etapa de degradación del ADN) y del TNBP /Tween 80 (inactivación de los virus envueltos). Para llevar esto a cabo, se añade el TNPB (Aldrich 24-049-40) a la preparación precedente, a una concentración final del 0,3%. La acción del TNPB/Tween 80 prosigue bajo agitación (500 vueltas/min) durante 2 horas a temperatura ambiente. El título en unidades infecciosas, determinado después de cada etapa importante del procedimiento, se resume en la tabla siguiente:

Etapas	Rendimiento UI-%(global)	Rendimiento UI-%(etapa)
Fragmentación de las células	100	-
Depuración	96	96
Dnasa/ Inactivación	130	135

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El aumento de los títulos en adenovirus en un factor de 1,3, al llevar a cabo la etapa de inactivación, puede explicarse por una desagregación de los virus en presencia del disolvente.

Ejemplo 5 Validación de una preparación de adenovirus contaminada por el virus VSV

Se prepara una preparación adenovírica a pequeña escala según el protocolo utilizado en el ejemplo 4. Después de fragmentación y purificación mediante filtración en profundidad, se introduce en la preparación adenovírica (2,5 x 10^{10} ui) una solución de partículas de VSV (ATCC VR-158; 9,9 log_{10} TCTID50). Seguidamente, se procede a la etapa de inactivación en presencia de una concentración final de TNBP al 0,3% y Tween 80 al 1% al mismo tiempo que la etapa de degradación de los ácidos nucleicos en presencia de 10 U/ml de Benzonasa (referencia Merck 101697). El título en partículas VSV y adenovíricas infecciosas se determina sobre células VERO según los procedimientos de la técnica (Virology Methods Manual 1996, pp. 35-40, Ed. Mahy y Kangro, Academic Press Ltd, London) a partir de 0, 30, 60 y 120 minutos de incubación a temperatura ambiente.

Tiempo	Título (log_{10} TCID 50/ml)
T0	9,2
T 15 min	6,8
T 60 min	5,3
T 120min	1,7

Es decir, una reducción de 7,5 Log_{10} después de 2 horas de inactivación.

En su conjunto, los datos muestran que el procedimiento de la invención permite inactivar los virus envueltos de una preparación de adenovirus recombinantes, sin dañar su infecciosidad y con un rendimiento global superior al 100%.

Claims (22)

1. Procedimiento de inactivación de virus envueltos que contaminan una preparación vírica que contiene en su mayor parte adenovirus, en el que:

- se introduce en dicha preparación vírica una cantidad suficiente de disolvente tri-n butil fosfato (TNBP), comprendida entre el 0,05% y el 1% (volumen/volumen)

- se permite que dicho TNPB ejerza su acción a una temperatura comprendida entre +4º y +37ºC, a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5, durante un tiempo suficientemente largo para reducir de manera significativa la cantidad de virus envueltos que contaminan dicha preparación vírica,

conservando dicho procedimiento de inactivación el poder infeccioso de dichos adenovirus.

2. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según la reivindicación 1, en el que el TNBP se introduce en dicha preparación vírica en una cantidad comprendida entre el 0,1% y el 0,6% (volumen/volumen).

3. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según la reivindicación 2, en el que el TNBP se introduce en dicha preparación vírica en una cantidad de 0,3% (volumen/volumen).

4. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se lleva a cabo en presencia de un agente de solubilización, siendo éste un detergente, a una concentración comprendida entre el 0,01% y el 5% (volumen/volumen).

5. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según la reivindicación 4, en el que dicho detergente es un detergente no iónico.

6. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según la reivindicación 5, en el que dicho detergente no iónico es un Tween.

7. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según la reivindicación 6, en el que dicho Tween es el Tween 80.

8. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que la cantidad de detergente que se introduce en dicha preparación vírica está comprendida entre el 0,1% y el 2% (volumen/volumen).

9. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se deja que dicho TNPB actúe eventualmente en presencia de dicho detergente, a una temperatura comprendida entre +15ºC y 25ºC.

10. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se deja que dicho TNPB actúe eventualmente en presencia de dicho detergente, a un pH de 8,5.

11. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se deja que dicho TNPB actúe eventualmente en presencia de dicho detergente durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 5 horas.

12. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que se lleva a cabo bajo agitación.

13. Procedimiento de inactivación de virus envueltos, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que:

- se introduce en dicha preparación vírica TNBP a una concentración final comprendida entre 0,1% y 0,6% (volumen/volumen) y Tween 80 a una concentración final comprendida entre 0,5% y 2% (volumen/volumen),

- se deja actuar dicho TNPB y dicho Tween 80 a la temperatura ambiente,

- a un pH de 8,5, y

- durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 5 horas.

14. Procedimiento de inactivación de virus envueltos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, realizado en condiciones de conductividad comprendidas entre 5 y 500 mS/cm.

15. Procedimiento de inactivación de virus envueltos según la reivindicación 14, en el que las condiciones de conductividad están comprendidas entre 10 y 100 mS/cm.

16. Procedimiento de inactivación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho adenovirus es recombinante.

17. Procedimiento de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho adenovirus es defectuoso para la replicación.

18. Procedimiento para la preparación de una preparación vírica que contiene en su mayor parte adenovirus, que comprende por lo menos una etapa de inactivación de virus envueltos, según el procedimiento previsto en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Procedimiento de preparación según la reivindicación 18, que comprende por lo menos:

(a) una etapa de producción de dicha preparación vírica en una progenie celular apropiada,

(b) una etapa de recuperación de la preparación vírica producida en la etapa (a) a partir de la progenie celular productora y/o del sobrenadante del cultivo, y

(c) opcionalmente, una etapa de fragmentación de las células de la progenie celular productora.

20. Procedimiento de preparación según la reivindicación 19, que comprende por lo menos:

(a) una etapa de producción de dicha preparación vírica en una progenie celular apropiada,

(b) una etapa de recuperación de la preparación vírica introducida en la etapa (a) a partir de la progenie celular productora y/o del sobrenadante del cultivo,

(c) opcionalmente, una etapa de fragmentación de las células de la progenie celular productora,

(d) opcionalmente, una etapa de depuración,

(e) una etapa de inactivación de virus envueltos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, y

(f) opcionalmente, una etapa de purificación.

21. Procedimiento de preparación según la reivindicación 20, en el que la etapa de purificación comprende una etapa cromatográfica.

22. Procedimiento de preparación según la reivindicación 21, en el que la etapa cromatográfica incluye una cromatografía de intercambio de iones y a continuación una cromatografía de filtración en gel.