JPWO2003014338A1 - 不活性化ウイルスエンベロープの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、不活性化されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）のエンベロープを工業的に有利に製造する方法に関する。この課題は、ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化することを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法を提供する。本発明の不活性化ＨＶＪエンベロープから調製される遺伝子など生体高分子導入ベクターは、遺伝子機能解析や遺伝子治療を行うために使用できる。本発明は詳細には、（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、（ｂ）該ウイルスまたは不活性化された該ウイルスの濃縮液を得る工程、並びに（ｃ）該ウイルスまたは該不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、を含む。本発明は、本発明の方法を用いて得られたエンベロープを利用した組成物および医薬をも提供する。
Description
技術分野
本発明は、ウイルス（以下、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪとも称する））を不活性化し、不活性化ウイルスエンベロープを得る工業的製造方法に関する。不活性化ウイルスエンベロープは、遺伝子等、生体高分子を導入するベクターを調製するための試薬として使用される。
背景技術
遺伝子機能解析、遺伝子治療などのために、培養細胞や生体組織に対して遺伝子を導入する目的で、多くのウイルス法および非ウイルス法が開発されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、９２６〜９３２、１９９３年およびＬｅｄｌｅｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、１１２９〜１１４４、１９９５年）。一般に細胞へ遺伝子を送達するためには、ウイルス法がより効果的である。しかしウイルスベクターは、親ウイルス由来の親遺伝子必須遺伝子要素の同時導入、ウイルス遺伝子の発現、免疫原性などのため問題を生じ得る。一方、非ウイルス法の一つであるリポソーム法は細胞傷害性および免疫原性はウイルス法より少ないが、生体組織内への遺伝子導入効率においてはウイルスベクターに比し劣る傾向にある。
ＨＶＪはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され（岡田、微研ジャーナル、１、１０３−１１０、１９５８年）、細胞膜融合活性（以下融合活性とする）の解明が進められると共に遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきたウイルスである。一方、ＨＶＪは免疫原性が高く、特にＮＰタンパク質が大量に生産されるとＣＴＬを誘導することが知られており（Ｃｏｌｅ Ｇ．Ａ．らＪｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８、４３０１〜４３０９、１９９７年）、さらに宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。そこで遺伝子やタンパク質を封入したリポソームと予め紫外線照射により不活性化しておいたＨＶＪとを融合することで融合粒子（ＨＶＪ−リポソーム）を作製する方法が考案され、これにより培養細胞や生体への非侵襲の遺伝子導入が可能となった（米国特許第５，６３１，２３７号、Ｄｚａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１１４２１〜１１４２５、１９９６年および金田ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、５、２９８〜３０３、１９９９年）。しかしながら、リポソームとウイルスエンベロープという２つの異なるベシクルを調製する必要があり煩雑であること、また融合活性においても、リポソームとの融合により平均粒子径がＨＶＪの１．３倍に増大する融合粒子は、ＨＶＪのそれの１／１０以下に低下するなどの欠点を有していることが判明している。さらに、従来のＨＶＪに基づくベクターでは、遺伝子導入が不可能な組織や極めて低効率である組織も存在した。
本発明者は、遺伝子やオリゴヌクレオチドを培養細胞や生体に導入するための種々の新規な不活性化ウイルスエンベロープベクターを提供している（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ０１／００７８２）。即ち、ＨＶＪをはじめ種々のエンベロープウイルスのゲノムを不活性化したウイルスエンベロープ中に遺伝子などを封入することにより、培養細胞や生体組織に対して簡便かつ高効率で遺伝子などを導入することが可能で、細胞に対する毒性が低いベクターが調製される。以上のような背景から、経済的に安価で、有効且つ一定品質を保証できる不活性化ウイルスエンベロープの工業的製法の開発が望まれる。
（発明が解決しようとする課題）
不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープベクターでは、その使用目的からそのベクターが高度に精製されていることおよびウイルス（例えば、ＨＶＪ）のもつ融合活性が十分に維持されていることが重要である。ウイルス（例えば、ＨＶＪ）粒子の大量生産において、精製および融合活性の維持の両立は常に困難さを伴っている。また、不活性化工程においても同様に、不活性化処理後に融合活性が維持されることが解決されるべき課題である。
種々のワクチンの製法においてウイルスを不活性化する方法が知られているが、エンベロープベクターとして利用するために、エンベロープウイルスの不活性化方法としてそのまま利用することは困難である。ワクチン製造においては、その抗原性が維持されれば良く、ベクターベシクルとして特に有用な、エンベロープウイルスの融合活性の損傷は必ずしも問題とはないからである。上記米国特許第５，６３１，２３７号には、紫外線照射によるＨＶＪの不活性化が開示されているが、照射線量の制御と照射ムラの防止が困難であり、不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）、即ち不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの大量生産に適した方法であると言えない。そこで、本発明の目的は、不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの工業的製法を提供することにある。
本発明者らは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの工業的製造方法を確立するために鋭意検討を重ね、本発明を完成した。
発明の開示
本発明は、ウイルス（例えば、ＨＶＪ）をアルキル化剤で処理して不活性化することを特徴とする不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの製造方法に関する。また本発明の別の局面では、（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）をアルキル化剤で処理して不活性化する工程、（ｂ）ウイルスまたは不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、並びに（ｃ）ウイルスまたは不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程を含むことを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法に関する。この工程は、適時、順序を入れ替えて使用することができる。
従って、本発明の種々の実施形態において、本発明は以下を提供する。
１．ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化することを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
２．以下の工程：
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、
（ｂ）上記ウイルスまたは不活性化された上記ウイルスの濃縮液を得る工程、並びに
（ｃ）上記ウイルスまたは上記不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を含むことを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
３．以下の工程：
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された上記ウイルスの濃縮液を得る工程、さらに、
（ｃ）濃縮された上記不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を順次含む、項目２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
４．以下の工程：
（ｂ）ウイルスの濃縮液を得る工程、次いで、
（ａ）濃縮された上記ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、さらに
（ｃ）上記不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を順次含む、項目２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
５．以下の工程：
（ｃ）ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、次いで、
（ａ）精製されたウイルスをアルキル化剤で処理することで不活性化する工程、さらに
（ｂ）不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、
を順次含む、項目２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
６．ウイルスの濃縮液を得る上記工程または不活性化されたウイルスの濃縮液を得る上記工程が遠心分離を用いる工程を包含する、項目２、３，４または５のいずれかの製造方法。
７．ウイルスの濃縮液を得る上記工程または不活性化されたウイルスの濃縮液を得る上記工程が限外濾過を用いる工程を包含する、項目２、３，４または５のいずれかの製造方法。
８．上記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、項目１または２に記載の製造方法。
９．上記ウイルスは、センダイウイルスである、項目１または２に記載の製造方法。
１０．ウイルスエンベロープを含む組成物を製造する方法であって、上記方法は、
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された上記ウイルスの濃縮液を得る工程、および
（ｃ）濃縮された上記不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
をいずれかの順序で包含し、その後
（ｄ）精製された不活性化ウイルスと上記不活性化ウイルスにより導入されるべき物質とを混合する工程、
を包含する、方法。
１１．上記物質は、生体高分子である、項目１０に記載の方法。
１２．上記物質は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される、項目１０に記載の方法。
１３．上記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、項目１０に記載の製造方法。
１４．上記ウイルスは、センダイウイルスである、項目１０に記載の製造方法。
１５．ウイルスエンベロープを含む医薬を製造する方法であって、上記方法は
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された上記ウイルスの濃縮液を得る工程、および
（ｃ）濃縮された上記不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
をいずれかの順序で包含し、その後
（ｄ）精製された不活性化ウイルスと上記不活性化ウイルスにより導入されるべき医薬成分とを混合する工程、
を包含する、方法。
１６．上記医薬成分は、生体高分子である、項目１５に記載の方法。
１７．上記医薬成分は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
１８．上記医薬成分は、導入される宿主において発現されるポリペプチドをコードする核酸である、項目１５に記載の方法。
１９．上記医薬は、ワクチン形態である、項目１５に記載の方法。
２０．上記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、項目１５に記載の方法。
２１．上記ウイルスは、センダイウイルスである、項目１５に記載の方法。
２２．項目１０〜１４のいずれか１項に記載の方法によって得られる、組成物。
２３．項目１５〜２１のいずれか１項に記載の方法によって得られる、医薬。
発 明 の 実 施 の 形 態
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
以下に、本明細書において特に使用される用語を説明する。
本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において好ましくは、使用されるウイルスは、オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスであり得る。本明細書においてより好ましくは、使用されるウイルスは、センダイウイルスである。
本明細書において「センダイウイルス」または「ＨＶＪ」（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ）とは、互換的に用いられ、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する、細胞融合作用を有するウイルスをいう。Ｍ．Ｋｕｒｏｙａら（１９５３）がセンダイウイルスとして報告した。ゲノムは，約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。センダイウイルスのウイルス粒子にはエンベロープがあり、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す。センダイウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼを有する。熱に不安定で，ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、溶血性も示す。発育鶏卵および／または各種動物の腎臓由来培養細胞の細胞質中で増殖する。センダイウイルスは、株細胞に感染させた場合は持続感染を起こしやすい。種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のヘテロカリオン形成、雑種細胞の作製などの細胞融合に広く利用されている。
本明細書において「（ウイルス）エンベロープ」とは、センダイウイルスなどの特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。エンベロープは、通常、細胞から出芽によって成熟するウイルスにみられる。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイクタンパク質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質とからなる。
本明細書において「アルキル化」とは、有機化合物の水素原子をアルキル基で置換する作用を有すことをいい、「アルキル化剤」（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）とは、アルキル基を与える化合物をいう。アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アルキル，硫酸ジアルキル、スルホン酸アルキル、アルキル亜鉛などの有機金属化合物が挙げられる。好ましいアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「不活性化」とは、ウイルス（例えば、センダイウイルス）について言及されるとき、ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製欠損である。不活性化は、本明細書において記載される方法によって達成される。
本明細書において「カラムクロマトグラフィー」とは、不溶性の固定相を充填したカラムを用いる液体クロマトグラフィーをいう。固定相および移動相を適宜選択することにより、分子またはイオンの大きさ、極性、電荷などの差により溶質を分離し、それらを溶離（分け取ること）が可能である。カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水結合クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましいカラムクロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。
本明細書において「限外濾過」とは、分子レベルの濾過をいい、大きな溶質分子と小さい溶質分子とを、または溶質分子と溶媒分子とを分別する場合などに用いられ得る。限外濾過としては、例えば、ゲル濾過、半透膜濾過が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、限外濾過は、タンジェンシャル限外濾過であり得るが、それに限定されない。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ウイルス、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が転写因子である場合、転写活性を調節する活性を包含する。ある因子がウイルスである場合、その生物学的活性は、そのウイルスが持つ感染活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）をいう。ヌクレオチドとは、部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド（ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド）がある。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
本明細書において、核酸分子の「断片（フラグメント）」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、［オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。本明細書において、遺伝子の発現の「調節」には、遺伝子発現の増強、減少、誘導、消失、遅延化、早期化などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において処置の対象とされる遺伝子としては、例えば、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク質、免疫系に影響を与えるポリペプチド、免疫調節因子、抗体などをコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。具体的には、これらの遺伝子は、例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターロイキン２、腫瘍壊死因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、表皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、カルシトニン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球マクロファージ（ＧＭＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などをコードする遺伝子があげられるがそれらに限定されない。これら遺伝子は、本発明の医薬において、核酸形態またはポリペプチドの形態で存在し得る。
本明細書において医薬として利用され得るワクチンとしては、例えば、癌、後天性免疫不全症候群、麻疹、単純疱疹などためのワクチンが挙げられるがそれらに限定されない。これらワクチンは、本発明の医薬において、核酸形態またはペプチドの形態で存在し得る。
本発明は、上記のエンベロープを単独で、または安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分または薬剤のような他の薬剤と組み合わせて含む薬学的組成物および医薬を提供する。好ましくは、本発明は、ワクチン形態、遺伝子治療に適した形態であり得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、エンベロープが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリアー（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアーと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明のある実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。
本発明の薬学的組成物および医薬の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頚動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。
エンベロープに加えて、これらの薬学的組成物および医薬は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、エンベロープのプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最終版に記載されている。
経口投与のための薬学的組成物は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
経口使用のための薬学的組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、以下を含むが、それらに限定されない：ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量（すなわち用量）を特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
経口で使用され得る薬学的製剤は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）よりなるソフト封着カプセルを含む。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、エンベロープは、安定化剤とともにまたはともなわずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
非経口投与用の薬学的製剤は活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式と同様の様式（例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、または凍結乾燥の手段によって）で製造され得る。
本発明の薬学的組成物は、本発明のエンベロープが意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するエンベロープの量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、エンベロープの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するエンベロープの種類等により適宜選択される。
ヒトに本発明のエンベロープベクターを投与する場合、１被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当のエンベロープベクターが投与され得る。投与されるエンベロープ中に含まれる外来遺伝子の量は、１被験体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇであり得る。
本明細書において「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいう。１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ４，２０９−２１３、１９６１）。上記の量は、例えば、１日１回から数回投与することができる。
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
本発明の組成物および医薬はまた、生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
１つの実施形態において、本発明の組成物および医薬は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
本発明の組成物および医薬は、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
本発明はまた、好ましくは、ワクチン形態で提供され得る。ワクチンとは、ある種の疾患（例えば、伝染病、感染症など）の予防（または治療）のため使用される抗原の諸形態（例えば、タンパク質、ＤＮＡ）をいう。感染、伝播、流行などの諸形式にしたがい、生きた弱毒病原体（生ワクチンｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ）、不活化病原体（またはその一部）、病原体代謝物（毒素、毒素の不活化物すなわちトキソイドなど）、ＤＮＡワクチンなどが使用される．ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）により生物（ヒト・家畜・媒介動物）の体内に能動的につくられる免疫（体液性免疫、細胞性免疫、または両者）が病原体の感染、伝播、流行などを阻止する。
本発明に係るワクチンの剤形は特に問わず、また、その製造も当該分野で用いられている自体公知の方法に従ってよい。また、本発明に係るワクチンは、種々のアジュバントを含む乳濁液としてもよい。アジュバントは、含まない形態を投与した場合よりも、少ない量のワクチンを用いて、少ない投与量で、持続する高レベルの免疫性を持続させるのを助けるものである。アジュバントの例には、フロインドのアジュバント（完全または不完全）、アジュバント６５（落下生油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む）、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。ヒトおよび食用動物のためのワクチンには、アジュバント６５を用いるのが好ましい。また、商業的動物用ワクチンには、鉱物ゲルを用いるのが好ましい。
本発明に係るワクチンには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
本発明に係るワクチンの投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
本発明に係るワクチンの１回の投与量は、投与の目的により、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。再感染により惹起される病気の治療を目的とする場合、本発明に係るワクチンの投与量は、体重１ｋｇあたり約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１ｎｇ〜１ｍｇ程度であり得る。
本発明に係るワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なるので、一概には言えないが、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与するのが好ましい。中でも、約２〜４週間程度の間隔で、数回、好ましくは約１〜２回程度投与するのが好ましい。疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により疾患の状態をモニターしながら投与回数（投与時間）を決定するのがより好ましい。
本明細書において、病因因子（例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど）または細菌）を処置または予防するための組成物（例えば、ワクチン）が提供される。そのような組成物は、例えば、その病因因子の遺伝子またはタンパク質を少なくとも１つ含む。含まれる外来遺伝子は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。エピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
本明細書において「中和抗体」とは、酵素、毒素、細菌またはウイルスなど抗原の生物学的活性を中和する、中和反応に関与する抗体をいう。中和抗体は。ウイルスが結合すると活性が失われる。中和反応とは、抗原が中和抗体と結合すると、それらの活性が消失あるいは低下する反応をいう。ワクチンを投与すると、中和抗体ができ、その中和抗体の働きにより、病因を駆逐する働きが達成される。
本明細書において「遺伝子治療」または「遺伝子療法」とは、遺伝子の傷害（または欠陥）に起因する疾患を、患者に健全な核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することによ、または改変された核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することにより治療しようとする方法をいう。遺伝子治療には、裸で核酸を注入する工程を利用する方法もあるが、何らかのベクターを利用することが多く、本発明のエンベロープもそのようなベクターとして使用され得る。
別の局面において、本発明は、組成物および医薬を含むキットを提供する。このキットは、本発明の組成物および医薬；ならびにこの組成物および医薬を投与する指針を与える指示書を備える。ここで、上記指示書は、組成物および医薬の適切な投与方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明の方法において使用される組成物および医薬の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明の組成物および医薬は、宿主に導入されるべき物質または医薬成分を含む。そのような物質または医薬成分は、生体高分子であり得る。好ましくは、生体高分子は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される。好ましくは、医薬成分は、導入される宿主において発現されるポリペプチドをコードする核酸であり得る。
本発明の組成物および医薬は、１つ以上のさらなる医薬成分を含み得る。そのような成分としては、例えば、さらなる医薬成分として、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない成分がその薬学的組成物に含有され得る：
中枢神経系用薬（例えば、全身麻酔剤、催眠鎮静剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、覚せい剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、総合感冒剤、その他の中枢神経系用薬など）；
末梢神経用剤（例えば、局所麻酔剤、骨格筋弛緩剤、自律神経剤、鎮けい剤など）；
感覚器官用薬（例えば、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤など）；
循環器官用薬（例えば、、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、高脂血症用剤、その他の循環器官用薬など）；
呼吸器官用薬（例えば、呼吸促進剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、含嗽剤など）；
消化器官用薬（例えば、止瀉剤、整腸剤、消化性潰瘍用剤、健胃消化剤、制酸剤、下剤、浣腸剤、利胆剤、その他の消化器官用薬など）；
ホルモン剤（例えば、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺、副甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎ホルモン剤、男性ホルモン剤、卵胞、．黄体ホルモン剤、混合ホルモン剤、その他のホルモン剤など）；
泌尿生殖器官および肛門用薬（例えば、泌尿器官用剤、生殖器官用剤、子宮収縮剤、痔疾用剤、他の泌尿生殖器管、肛門用薬など）；
外皮用薬（例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用剤、鎮痛．鎮痒．収斂．消炎剤、寄生性皮膚疾患用剤、皮膚軟化剤、毛髪用剤、その他の外皮用剤など）；
歯科口腔用剤；
その他の個々の器官系用薬；
ビタミン剤（例えば、ビタミンＡ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤、混合ビタミン剤、その他のビタミン剤など）；
滋養強壮薬（例えば、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤、乳幼児用剤、その他の滋養強壮剤など）；
血液および体液用薬（例えば、血液代用剤、止血剤、血液凝固阻止剤、その他の血液．体液用剤など）；
人工透析用薬（例えば、人工腎臓透析用剤、腹膜透析用剤など）；
その他の代謝性医薬品（例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など）；
細胞賦活用剤（例えば、クロロフィル製剤、色素製剤、その他の細胞賦活用剤など）；
腫瘍用薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤、その他の腫瘍用剤など）；
放射性医薬品；
アレルギー用薬（例えば、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、非特異性免疫原製剤、その他のアレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、生薬、漢方製剤、その他の生薬漢方処方に基づく製剤など）；
抗生物質製剤（例えば、グラム陽性菌に作用する、グラム陰性菌に作用する、グラム陽、．陰性菌に作用、グラム陽性菌マイコプラズマ作用、グラム陽性陰性．リケッチアに作用、抗酸菌に作用するもの、カビに作用するもの、その他の抗生物質製剤など）；
化学療法剤（例えば、サルファ剤、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウィルス剤、その他の化学療法剤など）；
生物学的製剤（例えば、ワクチン類、毒素．トキソイド類、抗毒素．抗レプトスピラ血清、血液製剤類、生物学的試験用製剤類、その他の生物学的製剤、抗原虫剤、駆虫剤など）；
調剤用薬（例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味．矯臭．着色剤、その他の調剤用剤など）；
診断用薬（例えば、Ｘ線造影剤、機能検査用試薬、その他の診断用薬）；
公衆衛生用薬（例えば、防腐剤）；
体外診断用医薬品（例えば、細菌学的検査用薬など）；
分類されない治療を主目的としない薬剤；ならびに
麻薬（例えば、あへんアルカロイド系麻薬、コカアルカロイド系製剤、合成麻薬など）。
本発明の組成物および医薬は、ヒト用途でも使用され得るが、その他の宿主を対象として使用されてもよい。
従って、本発明の組成物が、農薬として使用される場合は、以下のような農薬活性成分もまた同時に含有され得る：
（除草剤）ピラゾレート、ダイムロン、ブロモブチド、メフェナセット、ＭＣＰ、ＭＣＰＢ、トリクロピル、ナプロアニリド、ＣＮＰ、クロメトキシニル、ビフェノックス、ＭＣＣ、ピリブチカルブ、ＤＣＰＡ、ナプロパミド、ジフェナミド、ピロピザミド、アシュラム、ＤＣＭＵ、リニュロン、メチルダイムロン、テブチウロン、ベンスルフロンメチル、シマジン、アトラジン、シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、メトリブジン、ベンタゾン、オキサジアゾン、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、グリホサート、ビアラホス、アロキシジム、イマゾスルフロン、アジムスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、シノスルフロン；
（殺虫・殺ダニ剤）ダイアジノン、フェンチオン、イソキサチオン、ピリダフェンチオン、フェニトロチオン、ジメトエート、ＰＭＰ、ジメチルビンホス、アセフェート、ＤＥＰ、ＮＡＣ、ＭＴＭＣ、ＭＩＰＣ、ＰＨＣ、ＭＰＭＣ、ＸＭＣ、ＢＰＭＣ、ベンダイオカルブ、ピリミカルブ、メソミル、オキサミル、チオジカルブ、シペルメトリン、カルタップ塩酸塩、チオシクラム、ベンスルタップ、ピリプロキシフェン、フェノキシカルブ、メトプレン、ジフルベンズロン、テフルベンズロン、クロルフルアズロン、ブプロフェジン、ヘキシチアゾクス、ピリダベン、クロフェンテジン、ニテンピラム；
（殺菌剤）プロベナゾール、イソプロチオラン、ピロキロン、フルトラニル、メトミノストロビン、ジラム、チウラム、キャプタン、ＴＰＮ、フサライド、トルクロホスメチル、ホセチル、チオファネートメチル、ベノミル、カルベンタゾール、チアベンタゾール、ジエトフェンカルブ、イプロジオン、ビンクロゾリン、プロシミドン、フルオルイミド、オキシカルボキシン、メプロニル、フルトラニル、ペンシクロン、メタラキシル、オキサジキシル、トリアジメホン、ヘキサコナゾール、トリホリン、ブラストサイジンＳ、カスガマイシン、ポリオキシン、バリダマイシンＡ、ミルディオマイシン、ＰＣＮＢ、ヒドロキシイソキサゾール、ダゾメット、ジメチリモール、ジクロメジン、トリアジン、フェリムゾン、トリシクラゾール、オキソリニックなどが例示されるが、好ましくはメトミノストロビンなどのストロビルリン系化合物である。
本発明の組成物は、農薬として使用される場合、その組成物には、例えば、殺ダニ剤（例、クロルベンジレートなど）、植物成長調整剤（例、パクロブトラゾールなど）、殺線虫剤（例、ベノミルなど）、共力剤（例、ピペロニルブトキサイドなど）、誘引剤（例、オイゲノールなど）、忌避剤（例、クレオソートなど）、色素（例、食用青色１号など）、肥料（例、尿素など）などもまた必要に応じて混合され得る。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
ウイルス（例えば、ＨＶＪ）はニワトリの受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織への持続感染系（培養液中にトリプシンなどの加水分解酵素を添加する）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたものおよびこれらの変異株のすべてが本発明で使用可能である。また、他の方法で入手可能なウイルス（例えば、ＨＶＪ）も使用することが可能である。組換え型ＨＶＪ（Ｈａｓａｎ Ｍ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７８、２８１３〜２８３０、１９９７年またはＹｏｎｅｍｉｔｓｕ Ｙ．ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８、９７０〜９７３、２０００年）なども使用可能である。ＨＶＪとして何れのものでも良いが、Ｚ株（例えば、寄託番号ＡＴＣＣ ＶＡ ２３８８またはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＳＰＡＦＡＳから販売されているものが使用できる）またはＣａｎｔｅｌｌ株（例えば、Ｍ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、５６、１７５〜１８４、１９８１年に記載されたものまたはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＳＰＡＦＡＳから販売されているものが使用できる）がより望ましい。
（ａ）ＨＶＪをアルキル化剤で処理して不活性化する工程では、０．００４％〜０．０１０％、より望ましくは０．００６％〜０．００８％の濃度になるようにアルキル化剤を、ＨＶＪを含む培養液または漿尿液並びにＨＶＪの濃縮液に添加した後、０〜２５℃で３０分〜２時間、望ましくは常温で１時間インキュベーションし、次いで温度を約３７℃に保ち１〜３時間インキュベートする工程を含む。この工程ではアルキル化剤自体の不活性化も行われる。次の工程を行うまで、低温で数日間保持することができる。この不活性化工程は、ウイルスの種々の構造組成（例えば、脂質、タンパク質、核酸など）をアルキル化することにより、ウイルスの増殖力を化学的に不活性化するものであるが、ＨＶＪのエンベロープの持つ融合活性は保持される。
なお、この明細書においては特に言及しない限り、好ましい実施形態として、アルキル化剤、カラムクロマトグラフィーおよび限外濾過としては、それぞれ例えばβ−プロピオラクトン、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびタンジェンシャル限外濾過が使用されるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。したがって、他のアルキル化剤、カラムクロマトグラフィーおよび限外濾過もまた、使用され得る。不活性化ＨＶＪ、不活性化されたＨＶＪ並びに不活性化ＨＶＪエンベロープは互いに同じものを意味する。しかし、他の限外濾過方法も使用可能である。
ＨＶＪの不活性化の評価は、ＨＶＪの培養細胞に対する感染の有無で行った。不活性化処理の後、サル腎細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞へ３７℃で一時間感染を行った。ＨＶＪの一段増殖が感染後１２〜１８時間に起こるので、細胞を３７℃で、炭酸ガス存在下で１８〜２４時間インキュベートした後にアセトン／メタノール固定してＨＶＪ感染によって細胞に発現されるＨＶＪのＦタンパク質の有無をＦタンパク質に対する抗体を用いて免疫染色を行った。即ち、ＨＶＪを界面活性剤ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）によって可溶化し、遠心によって膜成分を分離した後、得られた膜成分ををイオン交換クロマトグラフィーにかけることによりＦタンパク質を得た（Ｙｏｓｈｉｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８１年、および Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２０００年によった）。次にこのＦ蛋白をフロイントアジュバンドとともにウサギに４度免疫して、Ｆ蛋白に対する抗血清（ウサギの抗Ｆタンパク質ポリクローナル抗体：一次抗体）を得た。固定化した細胞をこの一次抗体で一時間処理した後、ＦＩＴＣで標識したブタの抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（二次抗体）で一時間処理した。この二次抗体処理後、蛍光顕微鏡下で検鏡し、ＨＶＪの不活性化を評価した。
不活性化処理のウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの膜機能に及ぼす影響については不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープのＨＡ活性を指標とすることができる。ＨＡ活性は通常の方法で測定できる。不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液を９６ウェルプレート（丸底）の３つのウェルに対して、それぞれ５０、４０、３０μｌ添加した後、ＰＢＳ（−）（Ｍｇイオン、Ｃａイオンを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）で２段階希釈することでサンプルの希釈系列を作製する。そこにＰＢＳ（−）で０．５％ニワトリ赤血球溶液を添加して２℃〜６℃で２時間インキュベーション後、凝集反応の有無を検定する。凝集反応が失われるサンプル系列のサンプル量とそのウェルの希釈倍率の逆数からＨＡ活性を求める。
また、不活性化処理の遺伝子導入効率に及ぼす影響の評価は、遺伝子導入の標的となった細胞群の内、遺伝子の導入された細胞の割合を求める方法または標的となった細胞群全体に導入された遺伝子の総量を求める方法によって行うことができる。
前者としては蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Ｍｏｓｓｅｒ，ＤＤ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７年に記載）遺伝子を導入することにより評価できる。手短には、不活性化処理後、界面活性剤と硫酸プロタミン処理を行って蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Ｍｏｓｓｅｒ，ＤＤ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７年に記載）遺伝子の発現プラスミド（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入できる）を封入し、ハムスター腎細胞株ＢＨＫ−２１細胞への導入を行うことで評価できる。ＥＧＦＰ発現プラスミド導入後、細胞を３７℃、炭酸ガス存在下で２４時間培養してから、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの発現を観察した後、トリプシン／ＥＤＴＡ処理により細胞を浮遊化してＥＧＦＰの発現の有無と発現量とをフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ）により解析し導入効率を評価することができる。
後者としてはルシフェラーゼ遺伝子を導入することで評価できる。上記方法と同様に、ハムスター腎細胞株ＢＨＫ−２１細胞に対してルシフェラーゼ遺伝子の発現プラスミド（ｐＧＬ３）を導入し、炭酸ガス存在下で２０〜２４時間培養後、ルシフェラーゼ発現量を測定キット（Ｐａｃｋａｒｄ社製、ＬｕｃＬｉｔｅ）を用いて測定することができる。発光量の測定はルミノメータ（Ｔｕｒｎｅｒ社製、ＴＤ−２０ｅ）にて測定できる。
（ｂ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程では、増殖させたウイルス（例えば、ＨＶＪ）を含む細胞培養液または漿尿液に、限外濾過、遠心分離などの方法を適用することができる。限外濾過ではウイルスの濃縮の他に、それらの第一段階の精製および調製物の緩衝液をその後工程に合わせることができる。好ましい実施態様としては限外濾過を行う。限外濾過を実施するためには、スパイラルメンブラン、平板膜又は中空繊維の種々のシステムを使用することができる。好ましくはカットオフ閾値はウィルス粒子径より小さいものが使用できる。他の濃縮方法もまた、適宜使用することが可能である。
遠心分離によるウイルスの濃縮は、高速遠心による方法、密度勾配を利用した超遠心による方法またはこれらを組合せた方法によって行われる。これらの遠心分離処理の過程では、ウイルスの濃縮だけでなく、その後の工程に合わせて調製物の緩衝液を交換することができる。高速遠心は、１５，０００〜３０，０００×ｇで行うことができる。密度勾配超遠心は５０，０００〜１００，０００×ｇで行うことができる。いずれも低温下で実施することが望ましい。２℃〜６℃で実施するのがより望ましい。高速遠心と超遠心は各１回から数回、組み合わせて遠心分離を行うことができる。密度勾配を利用した超遠心としては、ショ糖密度勾配遠心分離法、シュウ化カリウム密度勾配遠心分離法、塩化セシウム密度勾配遠心分離法、あるいは他の分離法を使用することができる。ショ糖密度勾配遠心分離法を使用する場合には、ショ糖溶液（３０〜６０％ｗ／ｖ）にウイルス懸濁液を重層し遠心（５０，０００〜１００，０００×ｇ）を行い、ショ糖溶液層上に見られるバンドを回収する。大容量のショ糖密度勾配遠心はゾーナルローターを用いることで効率的に実施できる。不活性化されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程は、上記のウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程と同様に限外濾過、遠心分離を適用することができるが、限外濾過がより望ましい。
以上のウイルス（例えば、ＨＶＪ）または不活性化されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程（限外濾過または遠心分離による）に先立って、必要に応じて、これらを含む培養液または漿尿液中の組織片などの残渣を取り除く前処理を行っても良い。この前処理については、フィルター濾過法または低速遠心（２０００ｒｐｍ〜４０００ｒｐｍの回転数で１０分〜２０分）による方法が挙げられる。ＨＶＪまたは不活性化されたＨＶＪを含む液が大容量の場合は、フィルター濾過法がより望ましい。このフィルター濾過はＨＶＪ粒子を通過させるために十分に大きく且つ残渣を保持するため十分小さい細孔径をもつ膜を用いて濾過する。漸減細孔径をもつディープフィルター、平膜または中空糸で精密濾過で行う方法がある。より具体的にはポリガードＣＲ、ライフガード、ポリガードＣＮ（何れもＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）が利用できるが、孔径がウィルス粒子径より大きいフィルターが望ましい。
（ｃ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）または不活性化されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）は、カラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。カラムクロマトグラフィーとして弱陰イオン交換体（第３級アミンであるＤＥＡＥなどの交換基が結合）または強陰イオン交換体（第４級アミンであるＱＡＥなどが交換基として結合）のいずれも使用できる。さらにゲル濾過担体を用いたカラムクロマトグラフィーも使用できる。
約３ベッド容量の緩衝液（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で予めカラムを平衡化する。ＨＶＪまたは不活性化されたＨＶＪを含む溶液のｐＨをｐＨ７．５としフィードする。約２ベッド容量の緩衝液（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）および約５ベッド容量の緩衝液（ｐＨ７．５、３５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄する。次いで吸着したＨＶＪまたは不活性化されたＨＶＪを約５ベッド容量の緩衝液（ｐＨ７．５、６５０ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出し、２８０ｎｍに吸収のあるピークを回収する。これらの緩衝液は種々のものが使用できる。溶出画分は、限外濾過により４倍〜５０倍に濃縮される。
本発明の方法においては、必要により、各工程の前後に、メンブランフィルター（孔径、０．２２〜１．０μｍ）を用いてＨＶＪまたは不活性化されたＨＶＪを含む溶液の濾過をすることができる。
本発明によって製造される不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープは、遺伝子導入ベクターを調製するための試薬として有用である。不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープにより調製された遺伝子導入ベクターは、遺伝子機能解析や、遺伝子治療を行うために使用できる。
好ましい実施形態の説明
本発明は、次のように実施することができる。
（１）ウイルス液を濃縮せず不活性化する場合
（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の不活性化工程：ニワトリ受精卵にウイルスを接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収し、ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する。次に、不活性化されたウイルスを含有する漿尿液をフィルター濾過する。
（ｂ）不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程：濾液を限外濾過法により濃縮する。
（ｃ）精製工程：不活性化ウイルスの濃縮液をカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。必要に応じて更に限外濾過法により所定の不活性化ウイルスエンベロープ濃度となるように調節することができる。
（２）高速遠心でウイルスを濃縮してから不活性化する場合
（ｂ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程：ニワトリ受精卵にウイルスを接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収する。次に、前処理としてウイルスを含有する漿尿液を低速遠心し、卵の組織片を除去する。さらに高速遠心し、上清を除き、沈殿に緩衝液を加えて沈殿を懸濁し、ウイルス濃縮液とする。２℃〜６℃で保存する。
（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の不活性化工程：ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する。
（ｃ）不活性化されたウイルスの精製工程：不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。必要に応じて更に限外濾過法により所定の不活性ウイルス）エンベロープ濃度となるように調節することができる。
（３）密度勾配遠心でウイルスを濃縮してから不活性化する場合
（ｂ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程：ニワトリ受精卵にウイルスを接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収する。次に、ウイルスを含有する漿尿液を低速遠心し、卵の組織片を除去する。さらにショ糖密度勾配を利用した超遠心を行い、ショ糖溶液層上のウイルスを回収する。透析によりショ糖を除き、凍結保存（−４０℃または−８０℃にて）する。
（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の不活性化工程：ウイルス凍結保存液を解凍し、ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する。
（ｃ）不活性化ウイルスの精製工程：不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。必要に応じて更に限外濾過法により所定の不活性ウイルスエンベロープ濃度となるように調節することができる。
（４）限外濾過でウイルスを濃縮してから不活性化する場合
（ｂ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程：ニワトリ受精卵にウイルスを接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収する。次に、ウイルスを含有する漿尿液をフィルター濾過により前処理し、限外濾過で濃縮を行いウイルス濃縮液を得る。
（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の不活性化工程：得られたウイルス濃縮液をアルキル化剤で処理してウイルスを不活性化する。
（ｃ）不活性化ウイルスの精製工程：不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。必要に応じて更に限外濾過法により所定の不活性ウイルスエンベロープ濃度となるように調節することができる。
（５）カラムクロマトグラフィー次いで限外濾過でウイルスを精製後、不活性化する場合
（ｃ）精製工程：ニワトリ受精卵にウイルス（例えば、ＨＶＪ）を接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収する。次に、ウイルスを含有する漿尿液をフィルター濾過した後、カラムクロマトグラフィー次いで限外濾過によりウイルスを精製する。
（ａ）不活性化工程：精製されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）をアルキル化剤で処理して不活性化する。
（ｂ）不活性化ウイルスの濃縮液を工程：不活性化されたウイルスを限外濾過法に濃縮する。
（６）インフルエンザウイルスの場合
本発明方法の好ましい具体例では、使用するインフルエンザウィルスは例えば哺乳類細胞すなわちサル、ハムスターまたは豚の腎臓細胞またはフェレットあるいはマウスの細胞、あるいは胚由来の細胞、人間の肺組織またはひよこの胚の繊維芽細胞由来の細胞等の感受性宿主細胞上での培養で得られる。
工業的なワクチン製造で最も一般的な系は孵化鶏卵であり、この系を採用するのが好ましい。従って、本発明の他の対象は孵化鶏卵で培養してインフルエンザウィルスを得る上記方法にある。
受精卵の選択は注意深く行わなければならず、専用に確保された健全な農場より入手したものでなければならない。それらを３７．８℃（１００°Ｆ）の培養器に９〜１２日間入れ、尿嚢にインフルエンザウィルスを接種する前に、卵をろうそくの光に透かして胚の成長および胚の生存を確認する。
その後、最適条件でウィルスに感染させるために、温度および湿度を制御した培養インキュベータ中で２〜３日間卵を培養する。これらの条件はインフルエンザの株と使用したウィルス種に依存する。５±３℃に急冷して培養を停止する。その後、感染した卵から多量のウィルス粒子を含む尿嚢液を取り出す。
こうして得られたインフルエンザウィルスを含む尿嚢液は迅速に精製して不純物、例えばオバルブミンを含むタンパク質、レシチン、バクテリア等を除去しなければならない。そのためには回収した材料を遠心分離して上澄液を取り、限外濾過で２０倍まで濃縮してからウィルスの精製を行う。
インフルエンザウィルス精製操作は当業者に周知で、濾過、超遠心分離またはアフィニティークロマトグラフィー等の分離法を使用することかできる。これらの操作でインフルエンザウィルスは濃縮される。
上記のように調製したエンベロープを用いて、種々の組成物、医薬、農薬などに処方する方法は、当該分野において周知であり、本明細書において引用される文献などにも詳述されている。従って、当業者は、本明細書の開示に基づいて、当該分野で慣用される方法を用いることによって、本発明で企図される種々の形態の組成物を調製することができる。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
実 施 例
以下の実施例は、例示であって、本発明を限定しないことが意図される。
（実施例１：ＨＶＪ濃縮液の調製）
（１）ＨＶＪの増殖
ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。
受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）に入れ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室内で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存および気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％ＮａＣｌを混合し、１ＭＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、２℃〜６℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素から取り出したもの）を５００倍に希釈し、２℃〜６℃に置いた。卵をイソジンおよびアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．１ｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターに入れ、３４〜３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩２℃〜６℃に置いた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中に入れて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、２℃〜６℃に保存した。
（２）ＨＶＪの濃縮
上記実施例１（１）工程で得たＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め２℃〜６℃にて保存）の約１００ｍｌを広口の駒込ピペットで約５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、２℃〜６℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。
遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ；オートクレーブし、２℃〜６℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま２℃〜６℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。
上清を除き、沈殿にＢＳＳを約１０ｍｌ加え、同様に２℃〜６℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、２℃〜６℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ、ＨＶＪ濃縮液として２℃〜６℃で保存した。
このＨＶＪ濃縮液０．１ｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸光度を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸光度１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。
（実施例２：ＨＶＪ濃縮液の調製）
さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、実施例１で得られたＨＶＪ懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（滅菌済み）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上に見られるバンドを回収する。回収したＨＶＪ懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として２℃〜６℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合はＨＶＪ懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロールと０．５Ｍ ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ ＤＭＳＯでも可能）。
（実施例３：ＨＶＪのアルキル化剤処理による不活性化）
使用直前に、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ中に０．０１％ β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温に保ち素早く作業を行った。
上記実施例１で得たＨＶＪ濃縮液にβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間インキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ、１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存した。
（実施例４：不活性化ＨＶＪのカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過による精製）
上記実施例１の（１）工程で得られた漿尿液を採取した後、８０μｍ〜１０μｍのナイロンメッシュフィルターにて濾過した。０．００６〜０．００８％β−プロピオラクトン（最終濃度）を漿尿液に加え（２℃〜６℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化した。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、β−プロピオラクトンを不活性化した。
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた限外濾過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２％マンニトール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いた。ＨＡアッセイにより、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果が得られた。
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）ｂｕｆｆｅｒ、０．２〜１Ｍ ＮａＣｌ））でＨＶＪを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた限外濾過法によりＨＶＪを濃縮した。
（実施例５：ＨＶＪのアルキル化剤処理による不活性化）
実施例１の場合とほぼ同様の方法により得られたＨＶＪの濃縮凍結品３００ｍＬを３４〜３５℃にて解凍し、抗生物質を添加した。２２℃の水浴に３０分浸した後β−プロピオラクトン２４μＬ（純度９０％以上、シグマ社製）を加え、２２℃の水浴に１時間、３７℃の水浴に２時間浸して不活性化処理を完了し、不活性化ＨＶＪ濃縮液を得た。
（実施例６：不活性化ＨＶＪのカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過による精製）
（１）カラムクロマトグラフィーによる精製
予め１５Ｌの緩衝液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（直径２０ｃｍ、ベッド高さ１５ｃｍ、ベッド容量４７１０ｍｌ）に実施例５で得られた不活性化ＨＶＪ濃縮液を５０ｍＬ／分の流速でフィードした。次に１０Ｌの緩衝液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、２５Ｌの緩衝液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５０ｍＭ ＮａＣｌ）を順にカラムに通じた。不活性化ＨＶＪは濃縮液フィード時にカラム樹脂に吸着し、一方、不活性化ＨＶＪ濃縮液中の不純物の大部分は緩衝液１，２によって樹脂から洗い出される。２５Ｌの緩衝液３（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６５０ｍＭ ＮａＣｌ）を通じるとほぼ同時にＨＶＪが樹脂から溶出するので、カラム画分の採取を始めた。ＵＶ吸収チャート（λ＝２８０ｎｍ）上に不活性化ＨＶＪのピークが現れ、ベースラインに復帰するまでの間に７８２９ｍＬの画分を得た。この画分に抗生物質を添加した。画分の分取完了後も緩衝液の通液を継続し、最後に２０Ｌの緩衝液４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ）をカラムに通じた。
（２）限外濾過による精製
上記実施例６（１）の工程で得られたカラム画分を１０Ｌボトルに入れ、給液用チューブと循環用チューブを取り付けたキャップを締めた。給液用チューブはペリスタポンプを経由してＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−５Ａ限外濾過モジュール入口へ、循環用チューブは循環量調整バルブ経由でモジュール出口へ、それぞれ接続した。ポンプを運転し、モジュールの出口側圧力を４０〜８０ｋＰａに保ちながら循環量調整バルブを絞って濃縮を行い、６０〜７０ｍＬ／分の排液を排出した。
循環液量約６００ｍＬとなった後、ボトルを５００ｍＬボトルに、モジュールをＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−４Ａに交換して濃縮を継続した。上記と同様に約１０ｍＬ／分の排液を排出して循環液量約６０ｍＬとなった後で６０ｍＬの緩衝液５（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２％ マンニトール）を添加し、更に濃縮を継続して循環液量を約６０ｍＬとした（Ｂｕｆｆｅｒ交換）。更にＢｕｆｆｅｒ交換を２回行った後、循環液量は７９ｍＬであった。５ｍＬディスポシリンジに循環液を採り、シリンジ先端にディスクフィルタ（ＣＯＲＮＩＮＧ製Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、φ＝２６ｍｍ、０．４５μｍ）を取付け、手動にて滅菌濾過を実施した。最終的に得られた不活性化ＨＶＪエンベロープは６５ｍＬであった。
（実施例７：ＨＶＪ含有漿尿液からの不活性化ＨＶＪエンベロープの製造）
（１）ＨＶＪのアルキル化剤処理による不活性化
実施例１（１）の場合と同様にして得られたＨＶＪの漿尿液６１５０ｍＬに抗生物質を添加した後、２２℃の水浴に３０分浸しβ−プロピオラクトン（純度９０％以上、シグマ社製）４９２μＬを加え、２２℃の水浴に１時間、３７℃の水浴に２時間浸して不活性化処理を完了し、不活性化ＨＶＪ含有漿尿液を得た。
（２）前処理（フィルター濾過）
上記実施例７（１）で得られた不活性化ＨＶＪ含有漿尿液６１５０ｍＬをペリスタポンプ経由カートリッジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ポリガードＣＲカートリッジフィルタ、５μｍ）に給液し濾過を実施した。濾過後、３００ｍＬの緩衝液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２％ マンニトール）を添加し配管内やフィルターの洗浄を行った。最終的な濾過済漿尿液の液量は６５００ｍＬであった。
（３）限外濾過による濃縮
上記実施例７（２）で得られた濾過済漿尿液６５００ｍＬを１０Ｌボトルに入れ、給液用チューブと循環用チューブを取り付けたキャップを締めた。給液用チューブはペリスタポンプを経由してモジュールＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−６Ａ入口へ、循環用チューブは循環量調整バルブ経由でモジュール出口へ、それぞれ接続した。ポンプを運転し、モジュールの出口側圧力を４０〜１００ｋＰａに保ちながら循環量調整バルブを絞って濃縮を行い、８０〜２００ｍＬ／分の排液を排出した。循環液量が目視で約６５０ｍＬとなった後で６５０ｍＬの上記実施例７（１）に記載の緩衝液１を添加し、更に濃縮を継続して循環液量を約６５０ｍＬとした（Ｂｕｆｆｅｒ交換）。更にＢｕｆｆｅｒ交換を２回行った後、濃縮液としての循環液量は７８０ｍＬであった。
（４）カラムクロマトグラフィーによる精製
予め１５Ｌの緩衝液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（直径２０ｃｍ、ベッド高さ１５ｃｍ、ベッド容量４７１０ｍｌ）に、上記実施例７（３）で得られた濃縮液を５０ｍＬ／分の流速でフィードした。次に１０Ｌの緩衝液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、２５Ｌの緩衝液３（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５０ｍＭ ＮａＣｌ）を順にカラムに通じた。ＨＶＪは濃縮液フィード時にカラム樹脂に吸着し、一方、濃縮液中の不純物の大部分は緩衝液２，３によって樹脂から洗い出される。２５Ｌの緩衝液４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６５０ｍＭ ＮａＣｌ）を通じると同時にカラム画分の採取を始めた。ＵＶ吸収チャート（λ＝２８０ｎｍ）上にＨＶＪのピークが現れ、ベースラインに復帰するまでの間に１０８００ｍＬの画分を得た。この画分に抗生物質を添加した。画分の分取完了後も緩衝液の通液を継続し、最後に２０Ｌの緩衝液５（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ）をカラムに通じた。
（５）限外濾過による精製
上記実施例７（４）で得られたカラム画分を１０Ｌボトルに入れ、給液用チューブと循環用チューブを取り付けたキャップを締めた。給液用チューブはペリスタポンプを経由してモジュール（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−４Ａ、）２本を直列に接続したものの入口へ、循環用チューブは循環量調整バルブ経由で上記モジュールの出口へ、それぞれ接続した。ポンプを運転し、モジュールの出口側圧力を４０〜８０ｋＰａに保ちながら循環量調整バルブを絞って濃縮を行い、４０〜６０ｍＬ／分の排液を排出した。循環液量約７００ｍＬとなった後、ボトルを１Ｌボトルに交換して濃縮を継続した。
循環液量約２００ｍＬとなった後で３００ｍＬの上記実施例７（２）に記載の緩衝液１を添加し、更に濃縮を継続して循環液量を約２００ｍＬとした（Ｂｕｆｆｅｒ交換）。更にＢｕｆｆｅｒ交換を２回行った後、循環液量は３００ｍＬであった（不活性化ＨＶＪエンベロープ）。
（実施例８：ルシフェラーゼ遺伝子を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープによる遺伝子導入量の測定）
ＢＨＫ−２１（シリアンハムスター仔腎臓細胞）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１０、大日本製薬より購入）を２．５×１０４細胞／０．５ｍＬ／ウェル（２４ウェルプラスチックプレート）となるよう１０％牛胎仔血清、１０％含有トリプトーズリン酸ブロス液（大日本製薬、Ｎｏ．１６−８２１−４９）のＢａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｂ−１５２２）培養液で懸濁し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。２０〜２４時間培養後、不活性化ＨＶＪエンベロープによる遺伝子導入量を以下の方法により測定した。
上記実施例７の場合と同様の方法で得られた不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液２０μＬに２ｍｇ／ｍＬ硫酸プロタミン溶液（ＰＢＳ）を５μＬ添加、混合し、氷上で５分間静置した。続いて、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミッドＤＮＡ（ｐＧＬ３）溶液５μＬ（１０μｇ）を添加、混合し、更に２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＰＢＳ（−））を３μＬ添加、混合後、１５０００回転／分（１９５００×Ｇ）、２℃〜６℃にて１０分〜１５分間遠心した。
上清を除去した後、沈澱を３０μＬのＰＢＳ（−）で懸濁した。この懸濁液に１ｍｇ／ｍＬ硫酸プロタミン溶液（ＰＢＳ）５μＬを添加、混合した。この混合液８μＬ（ウェル当り）を前もって準備（培養）しておいたＢＨＫ−２１細胞に添加した。
添加２０〜２４時間後、ルシフェラーゼ発現量をルシフェラーゼ測定キット（Ｐａｃｋａｒｄ社製、ＬｕｃＬｉｔｅ、Ｎｏ．６０１６９１１）を用いて測定した。発光量の測定は、ルミノメータ（Ｔｕｒｎｅｒ社製、ＴＤ−２０ｅ ＬＵＭＩＮＯＭＥＴＥＲ）にて測定した。ここで、ＰＢＳはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｄ−８６６２である。
その結果、ＨＶＪエンベロープを用いて、遺伝子のような生体高分子を導入することができることが実証された。
（実施例９ インフルエンザウイルスを用いた場合の例）
（１）インフルエンザウイルスの調製：
オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスを、原則的にＷＯ９６／０５２９４に記載されるように、孵化鶏卵から得、増殖させた。簡潔には以下のとおりである。受精卵の選択は注意深く行わなければならず、専用に確保された健全な農場より入手したものでなければならない。受精卵を３７．８℃の培養器に９〜１２日間入れ、尿嚢にインフルエンザウィルスを接種する前に、卵をろうそくの光に透かして胚の成長および胚の生存を確認した。
その後、最適条件でウィルスに感染させるために、温度および湿度を制御した培養インキュベータ中で２〜３日間卵を培養した。これらの条件はインフルエンザの株と使用したウィルス種に依存していた。５±３℃に急冷して培養を停止した。その後、感染した卵から多量のウィルス粒子を含む尿嚢液を取り出す。こうして得られたウィルスを含む尿嚢液を、迅速に精製して不純物（例えばオバルブミンを含むタンパク質、レシチン、バクテリア等）を除去するために、回収した材料を遠心分離して上澄液を取り、限外濾過で２０倍まで濃縮してからウィルスの精製を行った。
（アルキル化処理）
実施例３に記載に倣い、上述のように調製したインフルエンザウイルスを不活性化させ、実施例４に記載のように限外濾過した。
次に、実施例５に記載のようにインフルエンザウイルスを不活性化した。次に、実施例６に記載のように、このインフルエンザウイルスを限外濾過した。
さらに、実施例７に記載のように、インフルエンザウイルス含有漿尿液からの不活性化インフルエンザウイルスエンベロープを製造した。
（実施例１０：ルシフェラーゼ遺伝子を用いる不活性化インフルエンザウイルスエンベロープによる遺伝子導入量の測定）
実施例９において得られた不活性化インフルエンザウイルスエンベロープ懸濁液を用いて、実施例８に記載されるのと同様のプロトコルを用いて遺伝子導入量の測定を行った。すると、ルシフェラーゼ遺伝子はＨＶＪの場合と同様に導入されていることがわかった。
従って、本発明は、インフルエンザウイルスを用いた場合でも、安全な生体分子導入ベクターとして使用することができることが実証された。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、従来方法に比較して均一に且つ効率的にウイルス（例えば、ＨＶＪ）を不活性化するすることができ、しかもその不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）はウイルスの増殖力が不活性化される一方、ウイルス（例えば、ＨＶＪ）のエンベロープのもつ融合活性は保持されるので、適切な不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープを工業的に有利に製造することができる。
本発明は、ウイルス（以下、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪとも称する））を不活性化し、不活性化ウイルスエンベロープを得る工業的製造方法に関する。不活性化ウイルスエンベロープは、遺伝子等、生体高分子を導入するベクターを調製するための試薬として使用される。
背景技術
遺伝子機能解析、遺伝子治療などのために、培養細胞や生体組織に対して遺伝子を導入する目的で、多くのウイルス法および非ウイルス法が開発されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、９２６〜９３２、１９９３年およびＬｅｄｌｅｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、１１２９〜１１４４、１９９５年）。一般に細胞へ遺伝子を送達するためには、ウイルス法がより効果的である。しかしウイルスベクターは、親ウイルス由来の親遺伝子必須遺伝子要素の同時導入、ウイルス遺伝子の発現、免疫原性などのため問題を生じ得る。一方、非ウイルス法の一つであるリポソーム法は細胞傷害性および免疫原性はウイルス法より少ないが、生体組織内への遺伝子導入効率においてはウイルスベクターに比し劣る傾向にある。
ＨＶＪはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され（岡田、微研ジャーナル、１、１０３−１１０、１９５８年）、細胞膜融合活性（以下融合活性とする）の解明が進められると共に遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきたウイルスである。一方、ＨＶＪは免疫原性が高く、特にＮＰタンパク質が大量に生産されるとＣＴＬを誘導することが知られており（Ｃｏｌｅ Ｇ．Ａ．らＪｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８、４３０１〜４３０９、１９９７年）、さらに宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。そこで遺伝子やタンパク質を封入したリポソームと予め紫外線照射により不活性化しておいたＨＶＪとを融合することで融合粒子（ＨＶＪ−リポソーム）を作製する方法が考案され、これにより培養細胞や生体への非侵襲の遺伝子導入が可能となった（米国特許第５，６３１，２３７号、Ｄｚａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１１４２１〜１１４２５、１９９６年および金田ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、５、２９８〜３０３、１９９９年）。しかしながら、リポソームとウイルスエンベロープという２つの異なるベシクルを調製する必要があり煩雑であること、また融合活性においても、リポソームとの融合により平均粒子径がＨＶＪの１．３倍に増大する融合粒子は、ＨＶＪのそれの１／１０以下に低下するなどの欠点を有していることが判明している。さらに、従来のＨＶＪに基づくベクターでは、遺伝子導入が不可能な組織や極めて低効率である組織も存在した。
本発明者は、遺伝子やオリゴヌクレオチドを培養細胞や生体に導入するための種々の新規な不活性化ウイルスエンベロープベクターを提供している（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ０１／００７８２）。即ち、ＨＶＪをはじめ種々のエンベロープウイルスのゲノムを不活性化したウイルスエンベロープ中に遺伝子などを封入することにより、培養細胞や生体組織に対して簡便かつ高効率で遺伝子などを導入することが可能で、細胞に対する毒性が低いベクターが調製される。以上のような背景から、経済的に安価で、有効且つ一定品質を保証できる不活性化ウイルスエンベロープの工業的製法の開発が望まれる。
（発明が解決しようとする課題）
不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープベクターでは、その使用目的からそのベクターが高度に精製されていることおよびウイルス（例えば、ＨＶＪ）のもつ融合活性が十分に維持されていることが重要である。ウイルス（例えば、ＨＶＪ）粒子の大量生産において、精製および融合活性の維持の両立は常に困難さを伴っている。また、不活性化工程においても同様に、不活性化処理後に融合活性が維持されることが解決されるべき課題である。
種々のワクチンの製法においてウイルスを不活性化する方法が知られているが、エンベロープベクターとして利用するために、エンベロープウイルスの不活性化方法としてそのまま利用することは困難である。ワクチン製造においては、その抗原性が維持されれば良く、ベクターベシクルとして特に有用な、エンベロープウイルスの融合活性の損傷は必ずしも問題とはないからである。上記米国特許第５，６３１，２３７号には、紫外線照射によるＨＶＪの不活性化が開示されているが、照射線量の制御と照射ムラの防止が困難であり、不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）、即ち不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの大量生産に適した方法であると言えない。そこで、本発明の目的は、不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの工業的製法を提供することにある。
本発明者らは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの工業的製造方法を確立するために鋭意検討を重ね、本発明を完成した。
発明の開示
本発明は、ウイルス（例えば、ＨＶＪ）をアルキル化剤で処理して不活性化することを特徴とする不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの製造方法に関する。また本発明の別の局面では、（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）をアルキル化剤で処理して不活性化する工程、（ｂ）ウイルスまたは不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、並びに（ｃ）ウイルスまたは不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程を含むことを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法に関する。この工程は、適時、順序を入れ替えて使用することができる。
従って、本発明の種々の実施形態において、本発明は以下を提供する。
１．ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化することを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
２．以下の工程：
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、
（ｂ）上記ウイルスまたは不活性化された上記ウイルスの濃縮液を得る工程、並びに
（ｃ）上記ウイルスまたは上記不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を含むことを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
３．以下の工程：
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された上記ウイルスの濃縮液を得る工程、さらに、
（ｃ）濃縮された上記不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を順次含む、項目２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
４．以下の工程：
（ｂ）ウイルスの濃縮液を得る工程、次いで、
（ａ）濃縮された上記ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、さらに
（ｃ）上記不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を順次含む、項目２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
５．以下の工程：
（ｃ）ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、次いで、
（ａ）精製されたウイルスをアルキル化剤で処理することで不活性化する工程、さらに
（ｂ）不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、
を順次含む、項目２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
６．ウイルスの濃縮液を得る上記工程または不活性化されたウイルスの濃縮液を得る上記工程が遠心分離を用いる工程を包含する、項目２、３，４または５のいずれかの製造方法。
７．ウイルスの濃縮液を得る上記工程または不活性化されたウイルスの濃縮液を得る上記工程が限外濾過を用いる工程を包含する、項目２、３，４または５のいずれかの製造方法。
８．上記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、項目１または２に記載の製造方法。
９．上記ウイルスは、センダイウイルスである、項目１または２に記載の製造方法。
１０．ウイルスエンベロープを含む組成物を製造する方法であって、上記方法は、
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された上記ウイルスの濃縮液を得る工程、および
（ｃ）濃縮された上記不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
をいずれかの順序で包含し、その後
（ｄ）精製された不活性化ウイルスと上記不活性化ウイルスにより導入されるべき物質とを混合する工程、
を包含する、方法。
１１．上記物質は、生体高分子である、項目１０に記載の方法。
１２．上記物質は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される、項目１０に記載の方法。
１３．上記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、項目１０に記載の製造方法。
１４．上記ウイルスは、センダイウイルスである、項目１０に記載の製造方法。
１５．ウイルスエンベロープを含む医薬を製造する方法であって、上記方法は
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された上記ウイルスの濃縮液を得る工程、および
（ｃ）濃縮された上記不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
をいずれかの順序で包含し、その後
（ｄ）精製された不活性化ウイルスと上記不活性化ウイルスにより導入されるべき医薬成分とを混合する工程、
を包含する、方法。
１６．上記医薬成分は、生体高分子である、項目１５に記載の方法。
１７．上記医薬成分は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
１８．上記医薬成分は、導入される宿主において発現されるポリペプチドをコードする核酸である、項目１５に記載の方法。
１９．上記医薬は、ワクチン形態である、項目１５に記載の方法。
２０．上記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、項目１５に記載の方法。
２１．上記ウイルスは、センダイウイルスである、項目１５に記載の方法。
２２．項目１０〜１４のいずれか１項に記載の方法によって得られる、組成物。
２３．項目１５〜２１のいずれか１項に記載の方法によって得られる、医薬。
発 明 の 実 施 の 形 態
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
以下に、本明細書において特に使用される用語を説明する。
本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において好ましくは、使用されるウイルスは、オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスであり得る。本明細書においてより好ましくは、使用されるウイルスは、センダイウイルスである。
本明細書において「センダイウイルス」または「ＨＶＪ」（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ）とは、互換的に用いられ、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する、細胞融合作用を有するウイルスをいう。Ｍ．Ｋｕｒｏｙａら（１９５３）がセンダイウイルスとして報告した。ゲノムは，約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。センダイウイルスのウイルス粒子にはエンベロープがあり、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す。センダイウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼを有する。熱に不安定で，ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、溶血性も示す。発育鶏卵および／または各種動物の腎臓由来培養細胞の細胞質中で増殖する。センダイウイルスは、株細胞に感染させた場合は持続感染を起こしやすい。種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のヘテロカリオン形成、雑種細胞の作製などの細胞融合に広く利用されている。
本明細書において「（ウイルス）エンベロープ」とは、センダイウイルスなどの特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。エンベロープは、通常、細胞から出芽によって成熟するウイルスにみられる。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイクタンパク質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質とからなる。
本明細書において「アルキル化」とは、有機化合物の水素原子をアルキル基で置換する作用を有すことをいい、「アルキル化剤」（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）とは、アルキル基を与える化合物をいう。アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アルキル，硫酸ジアルキル、スルホン酸アルキル、アルキル亜鉛などの有機金属化合物が挙げられる。好ましいアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「不活性化」とは、ウイルス（例えば、センダイウイルス）について言及されるとき、ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製欠損である。不活性化は、本明細書において記載される方法によって達成される。
本明細書において「カラムクロマトグラフィー」とは、不溶性の固定相を充填したカラムを用いる液体クロマトグラフィーをいう。固定相および移動相を適宜選択することにより、分子またはイオンの大きさ、極性、電荷などの差により溶質を分離し、それらを溶離（分け取ること）が可能である。カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水結合クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましいカラムクロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。
本明細書において「限外濾過」とは、分子レベルの濾過をいい、大きな溶質分子と小さい溶質分子とを、または溶質分子と溶媒分子とを分別する場合などに用いられ得る。限外濾過としては、例えば、ゲル濾過、半透膜濾過が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、限外濾過は、タンジェンシャル限外濾過であり得るが、それに限定されない。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ウイルス、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が転写因子である場合、転写活性を調節する活性を包含する。ある因子がウイルスである場合、その生物学的活性は、そのウイルスが持つ感染活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）をいう。ヌクレオチドとは、部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド（ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド）がある。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
本明細書において、核酸分子の「断片（フラグメント）」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、［オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。本明細書において、遺伝子の発現の「調節」には、遺伝子発現の増強、減少、誘導、消失、遅延化、早期化などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において処置の対象とされる遺伝子としては、例えば、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク質、免疫系に影響を与えるポリペプチド、免疫調節因子、抗体などをコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。具体的には、これらの遺伝子は、例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターロイキン２、腫瘍壊死因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、表皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、カルシトニン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球マクロファージ（ＧＭＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などをコードする遺伝子があげられるがそれらに限定されない。これら遺伝子は、本発明の医薬において、核酸形態またはポリペプチドの形態で存在し得る。
本明細書において医薬として利用され得るワクチンとしては、例えば、癌、後天性免疫不全症候群、麻疹、単純疱疹などためのワクチンが挙げられるがそれらに限定されない。これらワクチンは、本発明の医薬において、核酸形態またはペプチドの形態で存在し得る。
本発明は、上記のエンベロープを単独で、または安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分または薬剤のような他の薬剤と組み合わせて含む薬学的組成物および医薬を提供する。好ましくは、本発明は、ワクチン形態、遺伝子治療に適した形態であり得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、エンベロープが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリアー（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアーと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明のある実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。
本発明の薬学的組成物および医薬の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頚動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。
エンベロープに加えて、これらの薬学的組成物および医薬は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、エンベロープのプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最終版に記載されている。
経口投与のための薬学的組成物は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
経口使用のための薬学的組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、以下を含むが、それらに限定されない：ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量（すなわち用量）を特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
経口で使用され得る薬学的製剤は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）よりなるソフト封着カプセルを含む。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、エンベロープは、安定化剤とともにまたはともなわずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
非経口投与用の薬学的製剤は活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式と同様の様式（例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、または凍結乾燥の手段によって）で製造され得る。
本発明の薬学的組成物は、本発明のエンベロープが意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するエンベロープの量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、エンベロープの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するエンベロープの種類等により適宜選択される。
ヒトに本発明のエンベロープベクターを投与する場合、１被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当のエンベロープベクターが投与され得る。投与されるエンベロープ中に含まれる外来遺伝子の量は、１被験体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇであり得る。
本明細書において「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいう。１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ４，２０９−２１３、１９６１）。上記の量は、例えば、１日１回から数回投与することができる。
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
本発明の組成物および医薬はまた、生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
１つの実施形態において、本発明の組成物および医薬は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
本発明の組成物および医薬は、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
本発明はまた、好ましくは、ワクチン形態で提供され得る。ワクチンとは、ある種の疾患（例えば、伝染病、感染症など）の予防（または治療）のため使用される抗原の諸形態（例えば、タンパク質、ＤＮＡ）をいう。感染、伝播、流行などの諸形式にしたがい、生きた弱毒病原体（生ワクチンｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ）、不活化病原体（またはその一部）、病原体代謝物（毒素、毒素の不活化物すなわちトキソイドなど）、ＤＮＡワクチンなどが使用される．ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）により生物（ヒト・家畜・媒介動物）の体内に能動的につくられる免疫（体液性免疫、細胞性免疫、または両者）が病原体の感染、伝播、流行などを阻止する。
本発明に係るワクチンの剤形は特に問わず、また、その製造も当該分野で用いられている自体公知の方法に従ってよい。また、本発明に係るワクチンは、種々のアジュバントを含む乳濁液としてもよい。アジュバントは、含まない形態を投与した場合よりも、少ない量のワクチンを用いて、少ない投与量で、持続する高レベルの免疫性を持続させるのを助けるものである。アジュバントの例には、フロインドのアジュバント（完全または不完全）、アジュバント６５（落下生油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む）、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。ヒトおよび食用動物のためのワクチンには、アジュバント６５を用いるのが好ましい。また、商業的動物用ワクチンには、鉱物ゲルを用いるのが好ましい。
本発明に係るワクチンには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
本発明に係るワクチンの投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
本発明に係るワクチンの１回の投与量は、投与の目的により、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。再感染により惹起される病気の治療を目的とする場合、本発明に係るワクチンの投与量は、体重１ｋｇあたり約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１ｎｇ〜１ｍｇ程度であり得る。
本発明に係るワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なるので、一概には言えないが、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与するのが好ましい。中でも、約２〜４週間程度の間隔で、数回、好ましくは約１〜２回程度投与するのが好ましい。疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により疾患の状態をモニターしながら投与回数（投与時間）を決定するのがより好ましい。
本明細書において、病因因子（例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど）または細菌）を処置または予防するための組成物（例えば、ワクチン）が提供される。そのような組成物は、例えば、その病因因子の遺伝子またはタンパク質を少なくとも１つ含む。含まれる外来遺伝子は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。エピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
本明細書において「中和抗体」とは、酵素、毒素、細菌またはウイルスなど抗原の生物学的活性を中和する、中和反応に関与する抗体をいう。中和抗体は。ウイルスが結合すると活性が失われる。中和反応とは、抗原が中和抗体と結合すると、それらの活性が消失あるいは低下する反応をいう。ワクチンを投与すると、中和抗体ができ、その中和抗体の働きにより、病因を駆逐する働きが達成される。
本明細書において「遺伝子治療」または「遺伝子療法」とは、遺伝子の傷害（または欠陥）に起因する疾患を、患者に健全な核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することによ、または改変された核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することにより治療しようとする方法をいう。遺伝子治療には、裸で核酸を注入する工程を利用する方法もあるが、何らかのベクターを利用することが多く、本発明のエンベロープもそのようなベクターとして使用され得る。
別の局面において、本発明は、組成物および医薬を含むキットを提供する。このキットは、本発明の組成物および医薬；ならびにこの組成物および医薬を投与する指針を与える指示書を備える。ここで、上記指示書は、組成物および医薬の適切な投与方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明の方法において使用される組成物および医薬の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明の組成物および医薬は、宿主に導入されるべき物質または医薬成分を含む。そのような物質または医薬成分は、生体高分子であり得る。好ましくは、生体高分子は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される。好ましくは、医薬成分は、導入される宿主において発現されるポリペプチドをコードする核酸であり得る。
本発明の組成物および医薬は、１つ以上のさらなる医薬成分を含み得る。そのような成分としては、例えば、さらなる医薬成分として、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない成分がその薬学的組成物に含有され得る：
中枢神経系用薬（例えば、全身麻酔剤、催眠鎮静剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、覚せい剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、総合感冒剤、その他の中枢神経系用薬など）；
末梢神経用剤（例えば、局所麻酔剤、骨格筋弛緩剤、自律神経剤、鎮けい剤など）；
感覚器官用薬（例えば、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤など）；
循環器官用薬（例えば、、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、高脂血症用剤、その他の循環器官用薬など）；
呼吸器官用薬（例えば、呼吸促進剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、含嗽剤など）；
消化器官用薬（例えば、止瀉剤、整腸剤、消化性潰瘍用剤、健胃消化剤、制酸剤、下剤、浣腸剤、利胆剤、その他の消化器官用薬など）；
ホルモン剤（例えば、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺、副甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎ホルモン剤、男性ホルモン剤、卵胞、．黄体ホルモン剤、混合ホルモン剤、その他のホルモン剤など）；
泌尿生殖器官および肛門用薬（例えば、泌尿器官用剤、生殖器官用剤、子宮収縮剤、痔疾用剤、他の泌尿生殖器管、肛門用薬など）；
外皮用薬（例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用剤、鎮痛．鎮痒．収斂．消炎剤、寄生性皮膚疾患用剤、皮膚軟化剤、毛髪用剤、その他の外皮用剤など）；
歯科口腔用剤；
その他の個々の器官系用薬；
ビタミン剤（例えば、ビタミンＡ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤、混合ビタミン剤、その他のビタミン剤など）；
滋養強壮薬（例えば、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤、乳幼児用剤、その他の滋養強壮剤など）；
血液および体液用薬（例えば、血液代用剤、止血剤、血液凝固阻止剤、その他の血液．体液用剤など）；
人工透析用薬（例えば、人工腎臓透析用剤、腹膜透析用剤など）；
その他の代謝性医薬品（例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など）；
細胞賦活用剤（例えば、クロロフィル製剤、色素製剤、その他の細胞賦活用剤など）；
腫瘍用薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤、その他の腫瘍用剤など）；
放射性医薬品；
アレルギー用薬（例えば、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、非特異性免疫原製剤、その他のアレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、生薬、漢方製剤、その他の生薬漢方処方に基づく製剤など）；
抗生物質製剤（例えば、グラム陽性菌に作用する、グラム陰性菌に作用する、グラム陽、．陰性菌に作用、グラム陽性菌マイコプラズマ作用、グラム陽性陰性．リケッチアに作用、抗酸菌に作用するもの、カビに作用するもの、その他の抗生物質製剤など）；
化学療法剤（例えば、サルファ剤、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウィルス剤、その他の化学療法剤など）；
生物学的製剤（例えば、ワクチン類、毒素．トキソイド類、抗毒素．抗レプトスピラ血清、血液製剤類、生物学的試験用製剤類、その他の生物学的製剤、抗原虫剤、駆虫剤など）；
調剤用薬（例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味．矯臭．着色剤、その他の調剤用剤など）；
診断用薬（例えば、Ｘ線造影剤、機能検査用試薬、その他の診断用薬）；
公衆衛生用薬（例えば、防腐剤）；
体外診断用医薬品（例えば、細菌学的検査用薬など）；
分類されない治療を主目的としない薬剤；ならびに
麻薬（例えば、あへんアルカロイド系麻薬、コカアルカロイド系製剤、合成麻薬など）。
本発明の組成物および医薬は、ヒト用途でも使用され得るが、その他の宿主を対象として使用されてもよい。
従って、本発明の組成物が、農薬として使用される場合は、以下のような農薬活性成分もまた同時に含有され得る：
（除草剤）ピラゾレート、ダイムロン、ブロモブチド、メフェナセット、ＭＣＰ、ＭＣＰＢ、トリクロピル、ナプロアニリド、ＣＮＰ、クロメトキシニル、ビフェノックス、ＭＣＣ、ピリブチカルブ、ＤＣＰＡ、ナプロパミド、ジフェナミド、ピロピザミド、アシュラム、ＤＣＭＵ、リニュロン、メチルダイムロン、テブチウロン、ベンスルフロンメチル、シマジン、アトラジン、シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、メトリブジン、ベンタゾン、オキサジアゾン、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、グリホサート、ビアラホス、アロキシジム、イマゾスルフロン、アジムスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、シノスルフロン；
（殺虫・殺ダニ剤）ダイアジノン、フェンチオン、イソキサチオン、ピリダフェンチオン、フェニトロチオン、ジメトエート、ＰＭＰ、ジメチルビンホス、アセフェート、ＤＥＰ、ＮＡＣ、ＭＴＭＣ、ＭＩＰＣ、ＰＨＣ、ＭＰＭＣ、ＸＭＣ、ＢＰＭＣ、ベンダイオカルブ、ピリミカルブ、メソミル、オキサミル、チオジカルブ、シペルメトリン、カルタップ塩酸塩、チオシクラム、ベンスルタップ、ピリプロキシフェン、フェノキシカルブ、メトプレン、ジフルベンズロン、テフルベンズロン、クロルフルアズロン、ブプロフェジン、ヘキシチアゾクス、ピリダベン、クロフェンテジン、ニテンピラム；
（殺菌剤）プロベナゾール、イソプロチオラン、ピロキロン、フルトラニル、メトミノストロビン、ジラム、チウラム、キャプタン、ＴＰＮ、フサライド、トルクロホスメチル、ホセチル、チオファネートメチル、ベノミル、カルベンタゾール、チアベンタゾール、ジエトフェンカルブ、イプロジオン、ビンクロゾリン、プロシミドン、フルオルイミド、オキシカルボキシン、メプロニル、フルトラニル、ペンシクロン、メタラキシル、オキサジキシル、トリアジメホン、ヘキサコナゾール、トリホリン、ブラストサイジンＳ、カスガマイシン、ポリオキシン、バリダマイシンＡ、ミルディオマイシン、ＰＣＮＢ、ヒドロキシイソキサゾール、ダゾメット、ジメチリモール、ジクロメジン、トリアジン、フェリムゾン、トリシクラゾール、オキソリニックなどが例示されるが、好ましくはメトミノストロビンなどのストロビルリン系化合物である。
本発明の組成物は、農薬として使用される場合、その組成物には、例えば、殺ダニ剤（例、クロルベンジレートなど）、植物成長調整剤（例、パクロブトラゾールなど）、殺線虫剤（例、ベノミルなど）、共力剤（例、ピペロニルブトキサイドなど）、誘引剤（例、オイゲノールなど）、忌避剤（例、クレオソートなど）、色素（例、食用青色１号など）、肥料（例、尿素など）などもまた必要に応じて混合され得る。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
ウイルス（例えば、ＨＶＪ）はニワトリの受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織への持続感染系（培養液中にトリプシンなどの加水分解酵素を添加する）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたものおよびこれらの変異株のすべてが本発明で使用可能である。また、他の方法で入手可能なウイルス（例えば、ＨＶＪ）も使用することが可能である。組換え型ＨＶＪ（Ｈａｓａｎ Ｍ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７８、２８１３〜２８３０、１９９７年またはＹｏｎｅｍｉｔｓｕ Ｙ．ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８、９７０〜９７３、２０００年）なども使用可能である。ＨＶＪとして何れのものでも良いが、Ｚ株（例えば、寄託番号ＡＴＣＣ ＶＡ ２３８８またはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＳＰＡＦＡＳから販売されているものが使用できる）またはＣａｎｔｅｌｌ株（例えば、Ｍ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、５６、１７５〜１８４、１９８１年に記載されたものまたはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＳＰＡＦＡＳから販売されているものが使用できる）がより望ましい。
（ａ）ＨＶＪをアルキル化剤で処理して不活性化する工程では、０．００４％〜０．０１０％、より望ましくは０．００６％〜０．００８％の濃度になるようにアルキル化剤を、ＨＶＪを含む培養液または漿尿液並びにＨＶＪの濃縮液に添加した後、０〜２５℃で３０分〜２時間、望ましくは常温で１時間インキュベーションし、次いで温度を約３７℃に保ち１〜３時間インキュベートする工程を含む。この工程ではアルキル化剤自体の不活性化も行われる。次の工程を行うまで、低温で数日間保持することができる。この不活性化工程は、ウイルスの種々の構造組成（例えば、脂質、タンパク質、核酸など）をアルキル化することにより、ウイルスの増殖力を化学的に不活性化するものであるが、ＨＶＪのエンベロープの持つ融合活性は保持される。
なお、この明細書においては特に言及しない限り、好ましい実施形態として、アルキル化剤、カラムクロマトグラフィーおよび限外濾過としては、それぞれ例えばβ−プロピオラクトン、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびタンジェンシャル限外濾過が使用されるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。したがって、他のアルキル化剤、カラムクロマトグラフィーおよび限外濾過もまた、使用され得る。不活性化ＨＶＪ、不活性化されたＨＶＪ並びに不活性化ＨＶＪエンベロープは互いに同じものを意味する。しかし、他の限外濾過方法も使用可能である。
ＨＶＪの不活性化の評価は、ＨＶＪの培養細胞に対する感染の有無で行った。不活性化処理の後、サル腎細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞へ３７℃で一時間感染を行った。ＨＶＪの一段増殖が感染後１２〜１８時間に起こるので、細胞を３７℃で、炭酸ガス存在下で１８〜２４時間インキュベートした後にアセトン／メタノール固定してＨＶＪ感染によって細胞に発現されるＨＶＪのＦタンパク質の有無をＦタンパク質に対する抗体を用いて免疫染色を行った。即ち、ＨＶＪを界面活性剤ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）によって可溶化し、遠心によって膜成分を分離した後、得られた膜成分ををイオン交換クロマトグラフィーにかけることによりＦタンパク質を得た（Ｙｏｓｈｉｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８１年、および Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２０００年によった）。次にこのＦ蛋白をフロイントアジュバンドとともにウサギに４度免疫して、Ｆ蛋白に対する抗血清（ウサギの抗Ｆタンパク質ポリクローナル抗体：一次抗体）を得た。固定化した細胞をこの一次抗体で一時間処理した後、ＦＩＴＣで標識したブタの抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（二次抗体）で一時間処理した。この二次抗体処理後、蛍光顕微鏡下で検鏡し、ＨＶＪの不活性化を評価した。
不活性化処理のウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープの膜機能に及ぼす影響については不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープのＨＡ活性を指標とすることができる。ＨＡ活性は通常の方法で測定できる。不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液を９６ウェルプレート（丸底）の３つのウェルに対して、それぞれ５０、４０、３０μｌ添加した後、ＰＢＳ（−）（Ｍｇイオン、Ｃａイオンを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）で２段階希釈することでサンプルの希釈系列を作製する。そこにＰＢＳ（−）で０．５％ニワトリ赤血球溶液を添加して２℃〜６℃で２時間インキュベーション後、凝集反応の有無を検定する。凝集反応が失われるサンプル系列のサンプル量とそのウェルの希釈倍率の逆数からＨＡ活性を求める。
また、不活性化処理の遺伝子導入効率に及ぼす影響の評価は、遺伝子導入の標的となった細胞群の内、遺伝子の導入された細胞の割合を求める方法または標的となった細胞群全体に導入された遺伝子の総量を求める方法によって行うことができる。
前者としては蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Ｍｏｓｓｅｒ，ＤＤ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７年に記載）遺伝子を導入することにより評価できる。手短には、不活性化処理後、界面活性剤と硫酸プロタミン処理を行って蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Ｍｏｓｓｅｒ，ＤＤ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７年に記載）遺伝子の発現プラスミド（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入できる）を封入し、ハムスター腎細胞株ＢＨＫ−２１細胞への導入を行うことで評価できる。ＥＧＦＰ発現プラスミド導入後、細胞を３７℃、炭酸ガス存在下で２４時間培養してから、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの発現を観察した後、トリプシン／ＥＤＴＡ処理により細胞を浮遊化してＥＧＦＰの発現の有無と発現量とをフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ）により解析し導入効率を評価することができる。
後者としてはルシフェラーゼ遺伝子を導入することで評価できる。上記方法と同様に、ハムスター腎細胞株ＢＨＫ−２１細胞に対してルシフェラーゼ遺伝子の発現プラスミド（ｐＧＬ３）を導入し、炭酸ガス存在下で２０〜２４時間培養後、ルシフェラーゼ発現量を測定キット（Ｐａｃｋａｒｄ社製、ＬｕｃＬｉｔｅ）を用いて測定することができる。発光量の測定はルミノメータ（Ｔｕｒｎｅｒ社製、ＴＤ−２０ｅ）にて測定できる。
（ｂ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程では、増殖させたウイルス（例えば、ＨＶＪ）を含む細胞培養液または漿尿液に、限外濾過、遠心分離などの方法を適用することができる。限外濾過ではウイルスの濃縮の他に、それらの第一段階の精製および調製物の緩衝液をその後工程に合わせることができる。好ましい実施態様としては限外濾過を行う。限外濾過を実施するためには、スパイラルメンブラン、平板膜又は中空繊維の種々のシステムを使用することができる。好ましくはカットオフ閾値はウィルス粒子径より小さいものが使用できる。他の濃縮方法もまた、適宜使用することが可能である。
遠心分離によるウイルスの濃縮は、高速遠心による方法、密度勾配を利用した超遠心による方法またはこれらを組合せた方法によって行われる。これらの遠心分離処理の過程では、ウイルスの濃縮だけでなく、その後の工程に合わせて調製物の緩衝液を交換することができる。高速遠心は、１５，０００〜３０，０００×ｇで行うことができる。密度勾配超遠心は５０，０００〜１００，０００×ｇで行うことができる。いずれも低温下で実施することが望ましい。２℃〜６℃で実施するのがより望ましい。高速遠心と超遠心は各１回から数回、組み合わせて遠心分離を行うことができる。密度勾配を利用した超遠心としては、ショ糖密度勾配遠心分離法、シュウ化カリウム密度勾配遠心分離法、塩化セシウム密度勾配遠心分離法、あるいは他の分離法を使用することができる。ショ糖密度勾配遠心分離法を使用する場合には、ショ糖溶液（３０〜６０％ｗ／ｖ）にウイルス懸濁液を重層し遠心（５０，０００〜１００，０００×ｇ）を行い、ショ糖溶液層上に見られるバンドを回収する。大容量のショ糖密度勾配遠心はゾーナルローターを用いることで効率的に実施できる。不活性化されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程は、上記のウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程と同様に限外濾過、遠心分離を適用することができるが、限外濾過がより望ましい。
以上のウイルス（例えば、ＨＶＪ）または不活性化されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程（限外濾過または遠心分離による）に先立って、必要に応じて、これらを含む培養液または漿尿液中の組織片などの残渣を取り除く前処理を行っても良い。この前処理については、フィルター濾過法または低速遠心（２０００ｒｐｍ〜４０００ｒｐｍの回転数で１０分〜２０分）による方法が挙げられる。ＨＶＪまたは不活性化されたＨＶＪを含む液が大容量の場合は、フィルター濾過法がより望ましい。このフィルター濾過はＨＶＪ粒子を通過させるために十分に大きく且つ残渣を保持するため十分小さい細孔径をもつ膜を用いて濾過する。漸減細孔径をもつディープフィルター、平膜または中空糸で精密濾過で行う方法がある。より具体的にはポリガードＣＲ、ライフガード、ポリガードＣＮ（何れもＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）が利用できるが、孔径がウィルス粒子径より大きいフィルターが望ましい。
（ｃ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）または不活性化されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）は、カラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。カラムクロマトグラフィーとして弱陰イオン交換体（第３級アミンであるＤＥＡＥなどの交換基が結合）または強陰イオン交換体（第４級アミンであるＱＡＥなどが交換基として結合）のいずれも使用できる。さらにゲル濾過担体を用いたカラムクロマトグラフィーも使用できる。
約３ベッド容量の緩衝液（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で予めカラムを平衡化する。ＨＶＪまたは不活性化されたＨＶＪを含む溶液のｐＨをｐＨ７．５としフィードする。約２ベッド容量の緩衝液（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）および約５ベッド容量の緩衝液（ｐＨ７．５、３５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄する。次いで吸着したＨＶＪまたは不活性化されたＨＶＪを約５ベッド容量の緩衝液（ｐＨ７．５、６５０ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出し、２８０ｎｍに吸収のあるピークを回収する。これらの緩衝液は種々のものが使用できる。溶出画分は、限外濾過により４倍〜５０倍に濃縮される。
本発明の方法においては、必要により、各工程の前後に、メンブランフィルター（孔径、０．２２〜１．０μｍ）を用いてＨＶＪまたは不活性化されたＨＶＪを含む溶液の濾過をすることができる。
本発明によって製造される不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープは、遺伝子導入ベクターを調製するための試薬として有用である。不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープにより調製された遺伝子導入ベクターは、遺伝子機能解析や、遺伝子治療を行うために使用できる。
好ましい実施形態の説明
本発明は、次のように実施することができる。
（１）ウイルス液を濃縮せず不活性化する場合
（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の不活性化工程：ニワトリ受精卵にウイルスを接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収し、ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する。次に、不活性化されたウイルスを含有する漿尿液をフィルター濾過する。
（ｂ）不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程：濾液を限外濾過法により濃縮する。
（ｃ）精製工程：不活性化ウイルスの濃縮液をカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。必要に応じて更に限外濾過法により所定の不活性化ウイルスエンベロープ濃度となるように調節することができる。
（２）高速遠心でウイルスを濃縮してから不活性化する場合
（ｂ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程：ニワトリ受精卵にウイルスを接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収する。次に、前処理としてウイルスを含有する漿尿液を低速遠心し、卵の組織片を除去する。さらに高速遠心し、上清を除き、沈殿に緩衝液を加えて沈殿を懸濁し、ウイルス濃縮液とする。２℃〜６℃で保存する。
（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の不活性化工程：ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する。
（ｃ）不活性化されたウイルスの精製工程：不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。必要に応じて更に限外濾過法により所定の不活性ウイルス）エンベロープ濃度となるように調節することができる。
（３）密度勾配遠心でウイルスを濃縮してから不活性化する場合
（ｂ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程：ニワトリ受精卵にウイルスを接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収する。次に、ウイルスを含有する漿尿液を低速遠心し、卵の組織片を除去する。さらにショ糖密度勾配を利用した超遠心を行い、ショ糖溶液層上のウイルスを回収する。透析によりショ糖を除き、凍結保存（−４０℃または−８０℃にて）する。
（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の不活性化工程：ウイルス凍結保存液を解凍し、ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する。
（ｃ）不活性化ウイルスの精製工程：不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。必要に応じて更に限外濾過法により所定の不活性ウイルスエンベロープ濃度となるように調節することができる。
（４）限外濾過でウイルスを濃縮してから不活性化する場合
（ｂ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の濃縮液を得る工程：ニワトリ受精卵にウイルスを接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収する。次に、ウイルスを含有する漿尿液をフィルター濾過により前処理し、限外濾過で濃縮を行いウイルス濃縮液を得る。
（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）の不活性化工程：得られたウイルス濃縮液をアルキル化剤で処理してウイルスを不活性化する。
（ｃ）不活性化ウイルスの精製工程：不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する。必要に応じて更に限外濾過法により所定の不活性ウイルスエンベロープ濃度となるように調節することができる。
（５）カラムクロマトグラフィー次いで限外濾過でウイルスを精製後、不活性化する場合
（ｃ）精製工程：ニワトリ受精卵にウイルス（例えば、ＨＶＪ）を接種して、ウイルスを増殖させ、漿尿液を回収する。次に、ウイルスを含有する漿尿液をフィルター濾過した後、カラムクロマトグラフィー次いで限外濾過によりウイルスを精製する。
（ａ）不活性化工程：精製されたウイルス（例えば、ＨＶＪ）をアルキル化剤で処理して不活性化する。
（ｂ）不活性化ウイルスの濃縮液を工程：不活性化されたウイルスを限外濾過法に濃縮する。
（６）インフルエンザウイルスの場合
本発明方法の好ましい具体例では、使用するインフルエンザウィルスは例えば哺乳類細胞すなわちサル、ハムスターまたは豚の腎臓細胞またはフェレットあるいはマウスの細胞、あるいは胚由来の細胞、人間の肺組織またはひよこの胚の繊維芽細胞由来の細胞等の感受性宿主細胞上での培養で得られる。
工業的なワクチン製造で最も一般的な系は孵化鶏卵であり、この系を採用するのが好ましい。従って、本発明の他の対象は孵化鶏卵で培養してインフルエンザウィルスを得る上記方法にある。
受精卵の選択は注意深く行わなければならず、専用に確保された健全な農場より入手したものでなければならない。それらを３７．８℃（１００°Ｆ）の培養器に９〜１２日間入れ、尿嚢にインフルエンザウィルスを接種する前に、卵をろうそくの光に透かして胚の成長および胚の生存を確認する。
その後、最適条件でウィルスに感染させるために、温度および湿度を制御した培養インキュベータ中で２〜３日間卵を培養する。これらの条件はインフルエンザの株と使用したウィルス種に依存する。５±３℃に急冷して培養を停止する。その後、感染した卵から多量のウィルス粒子を含む尿嚢液を取り出す。
こうして得られたインフルエンザウィルスを含む尿嚢液は迅速に精製して不純物、例えばオバルブミンを含むタンパク質、レシチン、バクテリア等を除去しなければならない。そのためには回収した材料を遠心分離して上澄液を取り、限外濾過で２０倍まで濃縮してからウィルスの精製を行う。
インフルエンザウィルス精製操作は当業者に周知で、濾過、超遠心分離またはアフィニティークロマトグラフィー等の分離法を使用することかできる。これらの操作でインフルエンザウィルスは濃縮される。
上記のように調製したエンベロープを用いて、種々の組成物、医薬、農薬などに処方する方法は、当該分野において周知であり、本明細書において引用される文献などにも詳述されている。従って、当業者は、本明細書の開示に基づいて、当該分野で慣用される方法を用いることによって、本発明で企図される種々の形態の組成物を調製することができる。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
実 施 例
以下の実施例は、例示であって、本発明を限定しないことが意図される。
（実施例１：ＨＶＪ濃縮液の調製）
（１）ＨＶＪの増殖
ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。
受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）に入れ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室内で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存および気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％ＮａＣｌを混合し、１ＭＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、２℃〜６℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素から取り出したもの）を５００倍に希釈し、２℃〜６℃に置いた。卵をイソジンおよびアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．１ｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターに入れ、３４〜３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩２℃〜６℃に置いた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中に入れて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、２℃〜６℃に保存した。
（２）ＨＶＪの濃縮
上記実施例１（１）工程で得たＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め２℃〜６℃にて保存）の約１００ｍｌを広口の駒込ピペットで約５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、２℃〜６℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。
遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ；オートクレーブし、２℃〜６℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま２℃〜６℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。
上清を除き、沈殿にＢＳＳを約１０ｍｌ加え、同様に２℃〜６℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、２℃〜６℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ、ＨＶＪ濃縮液として２℃〜６℃で保存した。
このＨＶＪ濃縮液０．１ｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸光度を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸光度１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。
（実施例２：ＨＶＪ濃縮液の調製）
さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、実施例１で得られたＨＶＪ懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（滅菌済み）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上に見られるバンドを回収する。回収したＨＶＪ懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として２℃〜６℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合はＨＶＪ懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロールと０．５Ｍ ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ ＤＭＳＯでも可能）。
（実施例３：ＨＶＪのアルキル化剤処理による不活性化）
使用直前に、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ中に０．０１％ β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温に保ち素早く作業を行った。
上記実施例１で得たＨＶＪ濃縮液にβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間インキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ、１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存した。
（実施例４：不活性化ＨＶＪのカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過による精製）
上記実施例１の（１）工程で得られた漿尿液を採取した後、８０μｍ〜１０μｍのナイロンメッシュフィルターにて濾過した。０．００６〜０．００８％β−プロピオラクトン（最終濃度）を漿尿液に加え（２℃〜６℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化した。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、β−プロピオラクトンを不活性化した。
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた限外濾過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２％マンニトール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いた。ＨＡアッセイにより、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果が得られた。
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）ｂｕｆｆｅｒ、０．２〜１Ｍ ＮａＣｌ））でＨＶＪを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた限外濾過法によりＨＶＪを濃縮した。
（実施例５：ＨＶＪのアルキル化剤処理による不活性化）
実施例１の場合とほぼ同様の方法により得られたＨＶＪの濃縮凍結品３００ｍＬを３４〜３５℃にて解凍し、抗生物質を添加した。２２℃の水浴に３０分浸した後β−プロピオラクトン２４μＬ（純度９０％以上、シグマ社製）を加え、２２℃の水浴に１時間、３７℃の水浴に２時間浸して不活性化処理を完了し、不活性化ＨＶＪ濃縮液を得た。
（実施例６：不活性化ＨＶＪのカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過による精製）
（１）カラムクロマトグラフィーによる精製
予め１５Ｌの緩衝液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（直径２０ｃｍ、ベッド高さ１５ｃｍ、ベッド容量４７１０ｍｌ）に実施例５で得られた不活性化ＨＶＪ濃縮液を５０ｍＬ／分の流速でフィードした。次に１０Ｌの緩衝液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、２５Ｌの緩衝液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５０ｍＭ ＮａＣｌ）を順にカラムに通じた。不活性化ＨＶＪは濃縮液フィード時にカラム樹脂に吸着し、一方、不活性化ＨＶＪ濃縮液中の不純物の大部分は緩衝液１，２によって樹脂から洗い出される。２５Ｌの緩衝液３（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６５０ｍＭ ＮａＣｌ）を通じるとほぼ同時にＨＶＪが樹脂から溶出するので、カラム画分の採取を始めた。ＵＶ吸収チャート（λ＝２８０ｎｍ）上に不活性化ＨＶＪのピークが現れ、ベースラインに復帰するまでの間に７８２９ｍＬの画分を得た。この画分に抗生物質を添加した。画分の分取完了後も緩衝液の通液を継続し、最後に２０Ｌの緩衝液４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ）をカラムに通じた。
（２）限外濾過による精製
上記実施例６（１）の工程で得られたカラム画分を１０Ｌボトルに入れ、給液用チューブと循環用チューブを取り付けたキャップを締めた。給液用チューブはペリスタポンプを経由してＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−５Ａ限外濾過モジュール入口へ、循環用チューブは循環量調整バルブ経由でモジュール出口へ、それぞれ接続した。ポンプを運転し、モジュールの出口側圧力を４０〜８０ｋＰａに保ちながら循環量調整バルブを絞って濃縮を行い、６０〜７０ｍＬ／分の排液を排出した。
循環液量約６００ｍＬとなった後、ボトルを５００ｍＬボトルに、モジュールをＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−４Ａに交換して濃縮を継続した。上記と同様に約１０ｍＬ／分の排液を排出して循環液量約６０ｍＬとなった後で６０ｍＬの緩衝液５（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２％ マンニトール）を添加し、更に濃縮を継続して循環液量を約６０ｍＬとした（Ｂｕｆｆｅｒ交換）。更にＢｕｆｆｅｒ交換を２回行った後、循環液量は７９ｍＬであった。５ｍＬディスポシリンジに循環液を採り、シリンジ先端にディスクフィルタ（ＣＯＲＮＩＮＧ製Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、φ＝２６ｍｍ、０．４５μｍ）を取付け、手動にて滅菌濾過を実施した。最終的に得られた不活性化ＨＶＪエンベロープは６５ｍＬであった。
（実施例７：ＨＶＪ含有漿尿液からの不活性化ＨＶＪエンベロープの製造）
（１）ＨＶＪのアルキル化剤処理による不活性化
実施例１（１）の場合と同様にして得られたＨＶＪの漿尿液６１５０ｍＬに抗生物質を添加した後、２２℃の水浴に３０分浸しβ−プロピオラクトン（純度９０％以上、シグマ社製）４９２μＬを加え、２２℃の水浴に１時間、３７℃の水浴に２時間浸して不活性化処理を完了し、不活性化ＨＶＪ含有漿尿液を得た。
（２）前処理（フィルター濾過）
上記実施例７（１）で得られた不活性化ＨＶＪ含有漿尿液６１５０ｍＬをペリスタポンプ経由カートリッジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ポリガードＣＲカートリッジフィルタ、５μｍ）に給液し濾過を実施した。濾過後、３００ｍＬの緩衝液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２％ マンニトール）を添加し配管内やフィルターの洗浄を行った。最終的な濾過済漿尿液の液量は６５００ｍＬであった。
（３）限外濾過による濃縮
上記実施例７（２）で得られた濾過済漿尿液６５００ｍＬを１０Ｌボトルに入れ、給液用チューブと循環用チューブを取り付けたキャップを締めた。給液用チューブはペリスタポンプを経由してモジュールＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−６Ａ入口へ、循環用チューブは循環量調整バルブ経由でモジュール出口へ、それぞれ接続した。ポンプを運転し、モジュールの出口側圧力を４０〜１００ｋＰａに保ちながら循環量調整バルブを絞って濃縮を行い、８０〜２００ｍＬ／分の排液を排出した。循環液量が目視で約６５０ｍＬとなった後で６５０ｍＬの上記実施例７（１）に記載の緩衝液１を添加し、更に濃縮を継続して循環液量を約６５０ｍＬとした（Ｂｕｆｆｅｒ交換）。更にＢｕｆｆｅｒ交換を２回行った後、濃縮液としての循環液量は７８０ｍＬであった。
（４）カラムクロマトグラフィーによる精製
予め１５Ｌの緩衝液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（直径２０ｃｍ、ベッド高さ１５ｃｍ、ベッド容量４７１０ｍｌ）に、上記実施例７（３）で得られた濃縮液を５０ｍＬ／分の流速でフィードした。次に１０Ｌの緩衝液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、２５Ｌの緩衝液３（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３５０ｍＭ ＮａＣｌ）を順にカラムに通じた。ＨＶＪは濃縮液フィード時にカラム樹脂に吸着し、一方、濃縮液中の不純物の大部分は緩衝液２，３によって樹脂から洗い出される。２５Ｌの緩衝液４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６５０ｍＭ ＮａＣｌ）を通じると同時にカラム画分の採取を始めた。ＵＶ吸収チャート（λ＝２８０ｎｍ）上にＨＶＪのピークが現れ、ベースラインに復帰するまでの間に１０８００ｍＬの画分を得た。この画分に抗生物質を添加した。画分の分取完了後も緩衝液の通液を継続し、最後に２０Ｌの緩衝液５（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ）をカラムに通じた。
（５）限外濾過による精製
上記実施例７（４）で得られたカラム画分を１０Ｌボトルに入れ、給液用チューブと循環用チューブを取り付けたキャップを締めた。給液用チューブはペリスタポンプを経由してモジュール（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製 ＵＦＰ−５００−Ｅ−４Ａ、）２本を直列に接続したものの入口へ、循環用チューブは循環量調整バルブ経由で上記モジュールの出口へ、それぞれ接続した。ポンプを運転し、モジュールの出口側圧力を４０〜８０ｋＰａに保ちながら循環量調整バルブを絞って濃縮を行い、４０〜６０ｍＬ／分の排液を排出した。循環液量約７００ｍＬとなった後、ボトルを１Ｌボトルに交換して濃縮を継続した。
循環液量約２００ｍＬとなった後で３００ｍＬの上記実施例７（２）に記載の緩衝液１を添加し、更に濃縮を継続して循環液量を約２００ｍＬとした（Ｂｕｆｆｅｒ交換）。更にＢｕｆｆｅｒ交換を２回行った後、循環液量は３００ｍＬであった（不活性化ＨＶＪエンベロープ）。
（実施例８：ルシフェラーゼ遺伝子を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープによる遺伝子導入量の測定）
ＢＨＫ−２１（シリアンハムスター仔腎臓細胞）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１０、大日本製薬より購入）を２．５×１０４細胞／０．５ｍＬ／ウェル（２４ウェルプラスチックプレート）となるよう１０％牛胎仔血清、１０％含有トリプトーズリン酸ブロス液（大日本製薬、Ｎｏ．１６−８２１−４９）のＢａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｂ−１５２２）培養液で懸濁し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。２０〜２４時間培養後、不活性化ＨＶＪエンベロープによる遺伝子導入量を以下の方法により測定した。
上記実施例７の場合と同様の方法で得られた不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液２０μＬに２ｍｇ／ｍＬ硫酸プロタミン溶液（ＰＢＳ）を５μＬ添加、混合し、氷上で５分間静置した。続いて、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミッドＤＮＡ（ｐＧＬ３）溶液５μＬ（１０μｇ）を添加、混合し、更に２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＰＢＳ（−））を３μＬ添加、混合後、１５０００回転／分（１９５００×Ｇ）、２℃〜６℃にて１０分〜１５分間遠心した。
上清を除去した後、沈澱を３０μＬのＰＢＳ（−）で懸濁した。この懸濁液に１ｍｇ／ｍＬ硫酸プロタミン溶液（ＰＢＳ）５μＬを添加、混合した。この混合液８μＬ（ウェル当り）を前もって準備（培養）しておいたＢＨＫ−２１細胞に添加した。
添加２０〜２４時間後、ルシフェラーゼ発現量をルシフェラーゼ測定キット（Ｐａｃｋａｒｄ社製、ＬｕｃＬｉｔｅ、Ｎｏ．６０１６９１１）を用いて測定した。発光量の測定は、ルミノメータ（Ｔｕｒｎｅｒ社製、ＴＤ−２０ｅ ＬＵＭＩＮＯＭＥＴＥＲ）にて測定した。ここで、ＰＢＳはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｄ−８６６２である。
その結果、ＨＶＪエンベロープを用いて、遺伝子のような生体高分子を導入することができることが実証された。
（実施例９ インフルエンザウイルスを用いた場合の例）
（１）インフルエンザウイルスの調製：
オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスを、原則的にＷＯ９６／０５２９４に記載されるように、孵化鶏卵から得、増殖させた。簡潔には以下のとおりである。受精卵の選択は注意深く行わなければならず、専用に確保された健全な農場より入手したものでなければならない。受精卵を３７．８℃の培養器に９〜１２日間入れ、尿嚢にインフルエンザウィルスを接種する前に、卵をろうそくの光に透かして胚の成長および胚の生存を確認した。
その後、最適条件でウィルスに感染させるために、温度および湿度を制御した培養インキュベータ中で２〜３日間卵を培養した。これらの条件はインフルエンザの株と使用したウィルス種に依存していた。５±３℃に急冷して培養を停止した。その後、感染した卵から多量のウィルス粒子を含む尿嚢液を取り出す。こうして得られたウィルスを含む尿嚢液を、迅速に精製して不純物（例えばオバルブミンを含むタンパク質、レシチン、バクテリア等）を除去するために、回収した材料を遠心分離して上澄液を取り、限外濾過で２０倍まで濃縮してからウィルスの精製を行った。
（アルキル化処理）
実施例３に記載に倣い、上述のように調製したインフルエンザウイルスを不活性化させ、実施例４に記載のように限外濾過した。
次に、実施例５に記載のようにインフルエンザウイルスを不活性化した。次に、実施例６に記載のように、このインフルエンザウイルスを限外濾過した。
さらに、実施例７に記載のように、インフルエンザウイルス含有漿尿液からの不活性化インフルエンザウイルスエンベロープを製造した。
（実施例１０：ルシフェラーゼ遺伝子を用いる不活性化インフルエンザウイルスエンベロープによる遺伝子導入量の測定）
実施例９において得られた不活性化インフルエンザウイルスエンベロープ懸濁液を用いて、実施例８に記載されるのと同様のプロトコルを用いて遺伝子導入量の測定を行った。すると、ルシフェラーゼ遺伝子はＨＶＪの場合と同様に導入されていることがわかった。
従って、本発明は、インフルエンザウイルスを用いた場合でも、安全な生体分子導入ベクターとして使用することができることが実証された。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、従来方法に比較して均一に且つ効率的にウイルス（例えば、ＨＶＪ）を不活性化するすることができ、しかもその不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）はウイルスの増殖力が不活性化される一方、ウイルス（例えば、ＨＶＪ）のエンベロープのもつ融合活性は保持されるので、適切な不活性化ウイルス（例えば、ＨＶＪ）エンベロープを工業的に有利に製造することができる。
Claims (23)
- ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化することを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。
- 以下の工程：
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、
（ｂ）該ウイルスまたは不活性化された該ウイルスの濃縮液を得る工程、並びに
（ｃ）該ウイルスまたは該不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を含むことを特徴とする不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。 - 以下の工程：
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された該ウイルスの濃縮液を得る工程、さらに、
（ｃ）濃縮された該不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を順次含む、請求項２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。 - 以下の工程：
（ｂ）ウイルスの濃縮液を得る工程、次いで、
（ａ）濃縮された該ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、さらに
（ｃ）該不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
を順次含む、請求項２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。 - 以下の工程：
（ｃ）ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、次いで、
（ａ）精製されたウイルスをアルキル化剤で処理することで不活性化する工程、さらに
（ｂ）不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、
を順次含む、請求項２に記載の不活性化ウイルスエンベロープの製造方法。 - ウイルスの濃縮液を得る前記工程または不活性化されたウイルスの濃縮液を得る前記工程が遠心分離を用いる工程を包含する、請求項２、３，４または５のいずれかの製造方法。
- ウイルスの濃縮液を得る前記工程または不活性化されたウイルスの濃縮液を得る前記工程が限外濾過を用いる工程を包含する、請求項２、３，４または５のいずれかの製造方法。
- 前記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、請求項１または２に記載の製造方法。
- 前記ウイルスは、センダイウイルスである、請求項１または２に記載の製造方法。
- ウイルスエンベロープを含む組成物を製造する方法であって、該方法は
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された該ウイルスの濃縮液を得る工程、および
（ｃ）濃縮された該不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
をいずれかの順序で包含し、その後
（ｄ）精製された不活性化ウイルスと該不活性化ウイルスにより導入されるべき物質とを混合する工程、
を包含する、方法。 - 前記物質は、生体高分子である、請求項１０に記載の方法。
- 前記物質は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
- 前記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、請求項１０に記載の製造方法。
- 前記ウイルスは、センダイウイルスである、請求項１０に記載の製造方法。
- ウイルスエンベロープを含む医薬を製造する方法であって、該方法は、
（ａ）ウイルスをアルキル化剤で処理して不活性化する工程、次いで
（ｂ）不活性化された該ウイルスの濃縮液を得る工程、および
（ｃ）濃縮された該不活性化ウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程、
をいずれかの順序で包含し、その後
（ｄ）精製された不活性化ウイルスと該不活性化ウイルスにより導入されるべき医薬成分とを混合する工程、
を包含する、方法。 - 前記医薬成分は、生体高分子である、請求項１５に記載の方法。
- 前記医薬成分は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
- 前記医薬成分は、導入される宿主において発現されるポリペプチドをコードする核酸である、請求項１５に記載の方法。
- 前記医薬は、ワクチン形態である、請求項１５に記載の方法。
- 前記ウイルスは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスである、請求項１５に記載の方法。
- 前記ウイルスは、センダイウイルスである、請求項１５に記載の方法。
- 請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法によって得られる、組成物。
- 請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法によって得られる、医薬。
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