CN105555306B - 免疫原性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组合物和方法 - Google Patents

免疫原性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105555306B
CN105555306B CN201480051512.9A CN201480051512A CN105555306B CN 105555306 B CN105555306 B CN 105555306B CN 201480051512 A CN201480051512 A CN 201480051512A CN 105555306 B CN105555306 B CN 105555306B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mers
cov
nano particle
antibody
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480051512.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105555306A (zh
Inventor
G·史密斯
Y·刘
M·马萨尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novarax Co Ltd
Original Assignee
Novarax Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novarax Co Ltd filed Critical Novarax Co Ltd
Publication of CN105555306A publication Critical patent/CN105555306A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105555306B publication Critical patent/CN105555306B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本文中公开了含有处于多聚体结构的MERS病毒蛋白的纳米颗粒，和为了以免疫原性组合物施用而配制的含有该纳米颗粒的组合物。本文中还提供了编码该蛋白的载体构建体，和含有该载体构建体的宿主细胞。公开内容还包括生成该纳米颗粒和对脊椎动物施用它们的方法，包括诱导针对MERS的免疫应答的方法，所述免疫应答降低或防止受病毒的感染。

Description

免疫原性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组合物和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2013年9月19日提交的美国临时申请No.61/880,111的权益，通过提及将其完整收入本文用于所有目的。
电子提交的文本文件的描述
通过提及将与本文一起电子提交的文本文件的内容完整收入本文：序列表的计算机可读形式拷贝(文件名：NOVV-056/01WO_Seqlist.txt，记录日期：2014年9月18日，文件大小：17,384兆字节)。
发明背景
冠状病毒能在动物(诸如人)中引起疾病。SARS(重度急性呼吸综合征)是此类疾病的一个例子。最近，已经出现了一种新的冠状病毒，即中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，它与人死亡有关。MERS-CoV已经被世界卫生组织(WHO)鉴定为“威胁全球健康”，并且已经在中东和欧洲的21个国家得到报告。MERS-CoV是一种高致病性呼吸系统病毒，其在受感染的个体中引起重度呼吸窘迫和潜在的肾衰竭[1,2]。
冠状病毒经由其在病毒体表面上的刺突(S)糖蛋白与其在宿主细胞上的关联受体(例如二肽基肽酶4(DPP4)，其在多种人细胞上找到，包括肺和肾细胞)的相互作用附着于细胞膜。S糖蛋白由含有受体结合域(RBD)的N端S1域和负责病毒-细胞融合的S2域组成。MERS-CoV RBD由核心域组成，所述核心域已经与人DPP4蛋白共结晶，这显示了它与DPP4的叶片(blade)4和5相互作用[11]。在其它冠状病毒(包括SARS-CoV)中，针对RBD的抗体能够在体外中和病毒并抑制病毒的生长[12-14]。在SARS-CoV的小鼠模型中，已经证明了疫苗诱导并被动转移的中和性抗体有效抑制肺发病和死亡[15]。然而，已经报告了在体外人免疫细胞中对SARS CoV的抗体依赖性增强(ADE)，尽管其在体内的临床意义是未知的。
已经使用人康复期血浆和/或免疫球蛋白来有效预防和治疗许多病毒传染原[16]。英格兰公共卫生部门(Public Health England)和国际重度急性呼吸系统和新兴感染协会(International Severe Acute Respiratory&Emerging Infection Consortium)(ISARIC)将中和性抗体(包括康复期血浆)的被动免疫疗法鉴定为保证优先研究的MERS-CoV治疗方法。然而，生成具有高亲和力和亲合力抗体的大量抗病原体人血浆和/或免疫球蛋白目前需要康复期患者的捐献，这会出于许多文化、基础设施和后勤原因而限制这些人衍生产品的广泛利用度。需要快速生成特异性人多克隆免疫球蛋白以预防和治疗传染原(包括MERS-CoV)的备选手段。
发明概述
本文中公开了用于刺激针对冠状病毒(CoV)感染的免疫应答的组合物和方法，所述冠状病毒(CoV)引起中东呼吸综合征(MERS-CoV)。本公开内容提供了免疫原性并且针对MERS-CoV感染提供保护的组合物。有利地，组合物诱导针对MERS-CoV的中和性抗体，并且可以作为疫苗使用。
本公开内容还提供了在对MERS-CoV易感的动物中诱导针对病毒感染的实质性免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的包含MERS-CoV纳米颗粒的疫苗。在一个实施方案中，所述方法包括对动物口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用所述纳米颗粒。
在各方面中，纳米颗粒仅含有一类MERS-CoV蛋白。在具体的方面中，唯一的蛋白是刺突(S)蛋白。
在一个方面中，本公开内容提供了包含MERS-CoV纳米颗粒的免疫原性组合物，其中纳米颗粒包含刺突多肽的至少一个三聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含所述刺突多肽的至少约5个三聚体至约30个三聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含所述刺突多肽的至少约10个三聚体至约20个三聚体。在一个实施方案中，纳米颗粒的浓度是至少约20μg/mL至约60μg/mL。在另一个实施方案中，纳米颗粒的浓度是至少约30μg/mL至约50μg/mL。在又一个实施方案中，刺突多肽包含SEQ ID NO:2。在还有又一个实施方案中，刺突多肽由SEQ ID NO:2组成。
在另一个方面中，本公开内容提供了生成高亲和力抗体的方法，其包括对动物施用包含MERS-CoV纳米颗粒的免疫原性组合物，其中所述纳米颗粒包含刺突多肽的至少一个三聚体，自所述动物收集血清和/或血浆，并自所述血清和/或血浆纯化抗体。在一个实施方案中，所述方法进一步包括施用佐剂。在又一个实施方案中，佐剂选自下组：Montanide ISA206、Quil A、明矾、弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、和氢氧化铝佐剂。在一个实施方案中，动物是牛或马。在又一个实施方案中，牛或马动物是转基因动物。
在一个实施方案中，通过用纳米颗粒免疫动物生成的抗体具有介于10-8和10-15之间的KD。在又一个实施方案中，抗体具有介于约10-12和10-14之间或介于约10-13和10-14之间的KD。
在还有另一个方面中，本公开内容包括对人受试者进一步施用经过纯化的通过所述方法生成的高亲和力抗体。
附图简述
图1显示了冠状病毒结构。
图2显示了通过实施本文中公开的方法获得的疫苗颗粒。
图3显示了抗MERS抗体和抗SARS抗体分别对本文中公开的MERS CoV纳米颗粒VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP的抗体结合。
图4显示了本文中公开的MERS CoV纳米颗粒VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP的电子显微照片。
图5显示了在不同时间段，不同剂量，且在有和没有佐剂的情况中本文中公开的MERS CoV纳米颗粒VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP的免疫方案。
图6显示了通过实施本文中公开的方法获得的疫苗颗粒。显示了26nm蛋白质-蛋白质胶束的三聚体中装配的MERS刺突蛋白。
图7显示了在将本文中公开的MERS CoV VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP免疫入小鼠中后的中和结果。基质M佐剂是尤其有效的。
图8显示了经密码子优化的MERS CoV刺突核苷酸序列。
图9显示了MERS CoV刺突氨基酸序列。
图10A-C显示了MERS刺突蛋白特异性抗体生成和ELISA滴度。小图A显示了疫苗接种策略(v记录疫苗接种编号；例如v1是第一次疫苗接种，v2是第二次疫苗接种等)。小图B显示了在免疫期里来自个别Tc动物的血清样品中的针对重组MERS-CoV刺突蛋白的抗体滴度，如通过ELISA测量的。滴度数值(单位/ml)定义为OD450读数比空白高2.5倍时血清样品的最高稀释度。小图C显示了SAB-300和SAB-301中的针对重组MRS-CoV刺突蛋白的抗体滴度。滴度活性数值(单位/mg)定义为OD450读数比空白高2.5倍时1mg抗体的最高稀释度。
图11A-B显示了来自荧光降低中和测定法的结果。小图A显示了通过FRNT50测定法对接种疫苗的牛血清测试中和。对于每份样品，将检出的MERS-CoV的50％抑制需要的血清质量(μg)制图。在用血清的稀释液预处理MERS-CoV后量化感染。在感染后，固定细胞，并用抗刺突抗体标记以量化与假血清相比仅50％细胞被感染的水平。小图B显示了SAB-300和SAB-301的FRNT50测定法结果，对SAB-300和SAB-301测定其在Vero细胞中抑制MERS-CoV感染的能力。在这些FRNT50测定法中使用抗原亲和纯化的家兔抗刺突抗体作为阳性对照。统计学：非配对T检验及Welch氏校正，假设高斯分布。未发现显著性。棒是95％CI。
图12A-B显示了MERS-CoV中和测定法。小图A显示了通过以病毒滴度与阴性对照经过纯化的hIgG相比的百分比绘图的TCID50测定法对SAB-300和SAB-301测试其中和MERS-CoV的能力。较高的百分比意味着较小的感染抑制。小图B显示了SAB-300和SAB-301对MERS-CoV的抗体依赖性增强。对感染后48小时来自与SAB-300和SAB-301预温育的MERS-CoV的RNA测定MERS-CoV特异性转录物的量，并且以与假样品相比的倍数变化绘图。n.s.意指不显著的。
图13A-B显示了在体内对MERS-CoV复制的抑制。在MERS-CoV感染前12小时将SAB-300(A)或SAB-301(B)腹膜内转移入经Ad5-hDPP4转导的BALB/c小鼠(6周，雌性)中。然后，用1×105PFU MERS-CoV鼻内感染小鼠。在指定的时间点时测量肺中的病毒滴度。滴度以PFU/g组织表示。n＝3只小鼠/组/时间点。*与无处理组相比P<0.05；与对照抗体组相比P<0.05。
图14显示了MERS-CoV S蛋白与牛Tc衍生的人IgG的结合动力学。
发明详述
应当理解，为了方便，贯穿本申请使用单数形式，诸如“一个”、“一种”和“该/所述”，然而，除了在上下文或明确叙述另有指示的情况外，单数形式意图包括复数。此外，应当理解，在此通过提及完整并且为了所有目的收录本文中提及的每篇期刊文章、专利、专利申请、出版物、等等。所有数字范围应当理解为包括该数字范围内的每个和每一个数字点，并且应当解读为个别叙述每个和每一个数字点。涉及组分或特性的所有范围包括相同端点在内，并且意图是可独立组合的。
“约”包括与参照数值具有基本上相同的效果，或者提供基本上相同的结果的所有数值。如此，由术语“约”涵盖的范围会随使用该术语的上下文(例如参照数值关联的参数)而变化。如此，根据上下文，“约”可以意指例如±15％、±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或±小于1％。重要地，前面有术语“约”的参照数值的所有叙述意图也是仅参照数值的叙述。
如本文中使用的，术语“杆状病毒”，又称为杆状病毒科，指节肢动物中的有包膜DNA病毒的科，其成员可以作为用于在昆虫细胞培养物中生成重组蛋白的表达载体使用。病毒体含有一个或多个杆状核壳，其含有一分子的环状超螺旋双链DNA(Mr 54×106-154×106)。作为载体使用的病毒一般是苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(NVP)。引入基因的表达在强启动子的控制下，所述强启动子在正常情况下调节较大的核包涵体的多角体蛋白组分的表达，在所述核包涵体中病毒包埋于受感染的细胞中。
如本文中使用的，术语“自……衍生”指起源或来源，并且可以包括天然发生的、重组的、未经纯化的、或经过纯化的分子。
如本文中使用的，术语“大分子蛋白质结构”指一个或多个蛋白质的构建或排列。
如本文中使用的，术语“疫苗”指用于诱导形成针对病原体的抗体或免疫力的死亡的或减弱的病原体的，或衍生的抗原决定簇的制备物。给予疫苗以提供针对疾病的免疫力，例如由MERS CoV病毒引起的MERS或由SARS CoV病毒引起的SARS。本公开内容提供了疫苗组合物，其是免疫原性的，并且提供保护。另外，术语“疫苗”也指对脊椎动物施用以产生保护性免疫力(即降低与感染有关的疾病的严重性的免疫力)的免疫原(例如纳米颗粒VLP)的悬浮液或溶液。
如本文中使用的，术语“实质性免疫力”指如下免疫应答，其中在对脊椎动物施用纳米颗粒时，在所述脊椎动物中有免疫系统的诱导，这在所述脊椎动物中导致感染的防止、感染的改善或至少一种与病毒感染相关的症状的减轻。
如本文中使用的，术语“佐剂”指在配制剂中与特定免疫原(例如纳米颗粒VLP)组合使用时加强或以其它方式改变或修饰所致免疫应答的化合物。免疫应答的修饰包括加强或加宽抗体和细胞免疫应答任一或两者的特异性。免疫应答的修饰也可以意指降低或阻抑某些抗原特异性免疫应答。
如本文中使用的，术语“免疫刺激物”指经由身体的自身化学信使(细胞因子)增强免疫应答的化合物。这些分子包括具有免疫刺激性、免疫加强性和促炎性活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；和其它免疫刺激性分子，诸如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1、B7.2，等等。免疫刺激物分子可以与纳米颗粒VLP在同一配制剂中施用，或者可以分开施用。可以施用蛋白质或编码蛋白质的表达载体任一以产生免疫刺激效果。
如本文中使用的，“有效剂量”一般指足以诱导免疫力，防止和/或改善病毒感染或减轻感染的至少一种症状和/或增强另一剂纳米颗粒的功效的纳米颗粒量。有效剂量可以指足以将感染的发作延迟或最小化的纳米颗粒量。有效剂量也可以指在治疗或管理感染中提供治疗益处的纳米颗粒量。此外，有效剂量是就单独或与其它疗法组合的纳米颗粒而言在治疗或管理病毒感染中提供治疗益处的量。有效剂量也可以是足以增强受试者(例如人)自身针对随后暴露于病毒的免疫应答的量。可以例如通过测量中和性分泌性和/或血清抗体的量来监测免疫力水平，例如通过噬斑中和、补体结合、酶联免疫吸附、或微中和测定法进行。在疫苗的情况中，“有效剂量”是预防疾病或降低症状严重性的剂量。
如本文中使用的，术语“实质上保护性抗体应答”指由脊椎动物(例如人)展现的，防止或改善感染或者减轻其至少一种症状的由针对病毒的抗体介导的免疫应答。纳米颗粒能刺激抗体的生成，例如中和性抗体，其阻断病毒进入细胞，通过结合病毒来阻断所述病毒的复制，和/或保护宿主细胞免于感染和破坏。
如本文中使用的，术语“实质上保护性细胞应答”指由脊椎动物(例如人)展现的，防止或改善感染或者降低其至少一种症状的由针对病毒的T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面牵涉溶细胞性T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对与由主要组织相容性复合物(MHC)编码并且在细胞表面上表达的蛋白质联合呈递的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进胞内微生物的破坏，或者感染有此类微生物的细胞的裂解。细胞免疫的另一个方面牵涉辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞作用为帮助刺激非特异性效应细胞的功能并且聚焦非特异性效应细胞的活性来针对在其表面上展示与MHC分子联合的肽抗原的细胞。“细胞免疫应答”也指由活化的T细胞和/或其它白细胞(包括那些自CD4+和CD8+T细胞衍生的)生成细胞因子、趋化因子和其它此类分子的生成。
如本文中使用的，术语“以全群体为基础的实质性免疫力”指由于对群体中的个体施用纳米颗粒所致的免疫力。所述群体中的所述个体中的免疫力导致预防、改善感染，或者减轻与所述个体中的病毒感染相关的至少一种症状，并且防止所述病毒扩散至群体中的其他个体。术语群体定义为个体(例如学龄儿童、老年人、健康个体、等)的组，并且可以包括地理地区(例如特定的城市、学校、社区、工作场所、国家、州、等)。
如本文中使用的，术语“抗原配制剂”或“抗原组合物”指在对脊椎动物(尤其是哺乳动物)施用时会诱导免疫应答的制备物。
如本文中使用的，术语“脊椎动物”或“受试者”或“患者”指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如黑猩猩和其它猿和猴物种。牲畜，诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，诸如犬和猫；实验动物，包括啮齿类，诸如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家禽、野禽和猎禽，诸如鸡、火鸡和其它鹑鸡类禽、鸭、鹅、等等也是非限制性例子。此定义中包括术语“哺乳动物”和“动物”。意图覆盖成年和新生个体两者。
纳米颗粒VLP
疫苗开发的目的之一是生成针对病原体刺激免疫系统，但是自身不是感染性的疫苗。这已经引导不要在疫苗中使用全病毒体，而是朝向更加最低限度的组合物。然而，这些最低限度组合物呈现其自身的障碍，并且特别地经常展现降低的免疫原性，其需要使用加强免疫应答的系统和佐剂。包含天然病毒蛋白的纳米颗粒提供驾驭病毒进入细胞并且刺激免疫应答的天然能力的免疫手段。
如本文中公开的，纳米颗粒是特定类型的病毒样颗粒(VLP)。纳米颗粒含有病毒蛋白，但是不含任何病毒遗传材料，并且因此它们自身不是感染性的。纳米颗粒通过重组生成的病毒蛋白的自我装配来形成，并且刺激尤其有用的免疫应答。不限于理论，认为大小、重复结构和颗粒性质促成有力的免疫应答。值得注意地，即使在缺乏佐剂的情况下可以获得有力的免疫应答。
纳米颗粒结构
纳米颗粒含有以多聚体形式排列的病毒蛋白，诸如病毒壳体或外壳蛋白。通常，多聚体至少是病毒蛋白的三聚体。在其它方面中，多聚体可以含有病毒蛋白的超过三个单体。例如，多聚体可以含有4、5、6、7、8、9或10个单体单位(称为4聚体、5聚体、6聚体、等等)。在具体的方面中，可以将多聚体装配成更高等级的结构。如此，例如，纳米颗粒可以含有至少约3个多聚体、至少约5个多聚体、至少约10个多聚体、至少约15个多聚体、至少约20个多聚体、或至少约30个多聚体。在具体的方面中，纳米颗粒含有介于约5和15个之间的多聚体、介于约5和20个之间的多聚体、或介于约5和30个之间的多聚体。在又一些方面中，纳米颗粒含有介于约5和200个之间的多聚体、介于约10和200个之间的多聚体或介于约10和50个之间的多聚体。如此，在具体的例子中，纳米颗粒可以含有约5至约20个三聚体。
一般地，可以通过增加蛋白质浓度来获得更加复杂的较高等级的结构。在一个例子中，较低蛋白质浓度产生包含约5个多聚体的纳米颗粒，而较高蛋白质浓度(例如30-50μg/mL)产生包含约10至20个多聚体的纳米颗粒。在一个非限制性例子中，纳米颗粒的浓度是至少约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约40μg/mL、约50μg/mL、约60μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、或约500μg/mL。具体地，纳米颗粒的浓度可以介于约10μg/mL至约1mg/mL之间，或者介于约20μg/mL至约500μg/mL之间，或者介于约30μg/mL至约100μg/mL之间，或者介于约30μg/mL至约50μg/mL之间。
纳米颗粒蛋白
本文中公开的纳米颗粒可以包含任何MERS-CoV蛋白，包括但不限于刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白、核壳体(N)蛋白、和包膜(E)蛋白或其组合。所述蛋白可以自任何MERS-CoV株、进化枝或种获得或衍生。纳米颗粒可以包含来自一种或多种MERS-CoV隔离群、株、进化枝和/或种的一种或多种蛋白。在一个实施方案中，自MERS-CoV的Jordan-N3/2012株(GenBankKC776174.1)获得或衍生蛋白。在另一个实施方案中，自MERS-CoV的Munich_2013株获得或衍生蛋白。在另一个实施方案中，自MERS-CoV的Al-Hasa_1_2013株获得或衍生蛋白。也可以自多种其它来源衍生或获得构成纳米颗粒的蛋白，包括但不限于Hafr-Al-batin_1_2013株、Bisha_1_2012株、Qatar_3_2013株、Camel_Egypt_2013株、MERS-CoV进化枝A病毒、MERS-CoV进化枝B病毒、紧密相关HKU4和HKU5蝙蝠冠状病毒株、和/或其它紧密相关冠状病毒。也可以在体外合成或重组生成MERS-CoV蛋白。在一个实施方案中，在昆虫细胞(诸如Sf9细胞)中重组生成蛋白。
在一个实施方案中，多聚体可以包含一种或多种不同类型的MERS-CoV蛋白。在又一个实施方案中，多聚体包含单一类型的MERS-CoV蛋白。在一个优选的实施方案中，多聚体仅包含刺突蛋白。在另一个实施方案中，多聚体中的蛋白质由刺突蛋白组成。在又一个实施方案中，纳米颗粒不含膜或核壳蛋白。在又一个实施方案中，纳米颗粒不含任何病毒核酸序列。
在一个实施方案中，纳米颗粒包含刺突蛋白或其片段。在又一个实施方案中，纳米颗粒包含刺突蛋白或其片段的三聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含由SEQ ID NO:1编码的刺突蛋白的至少一个多聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含包含SEQ ID NO:2的刺突蛋白的至少一个多聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含由SEQ ID NO:2组成的刺突蛋白的至少一个多聚体。在又一个实施方案中，纳米颗粒包含刺突蛋白受体结合域(RBD)的至少一个多聚体。
可以如本领域中描述的那样制备纳米颗粒(例如如2010年9月23日公布的US20100239617所述，为了所有目的收入本文)。描述适用于本公开内容的分子生物学技术(诸如克隆、突变、细胞培养、等等)的通用教科书包括Berger and Kimmel,Guide toMolecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger)；Sambrook et al.,Molecular Cloning--ALaboratoryManual(3rd Ed.),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,2000(“Sambrook”)；和Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel etal.,eds.,Current Protocols,Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.的一项联合投资(“Ausubel”)。这些教科书描述了诱变，使用载体，启动子和与蛋白质克隆和突变相关的许多其它相关主题。如此，本公开内容还涵盖使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法来改善或改变纳米颗粒之上或之中表达的蛋白质的特征。它们包括但不限于定点、随机点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸指导的诱变、经硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用有缺口的双链体DNA的诱变、等等。别的合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主株的诱变、限制-选择和限制-纯化、删除诱变、通过完全基因合成的诱变、双链断裂修复、等等。本公开内容中还包括例如牵涉嵌合构建体的诱变。在一个实施方案中，可以通过天然发生分子或改变或突变的天然发生分子的已知信息(例如序列、序列比较、物理特性、晶体结构、等等)来指导诱变。
MERS刺突蛋白
自MERS-CoV隔离群、株、进化枝、和/或序列获得或衍生合适的刺突蛋白或其片段。或者，它们可以重组或合成生成。例如，在Genbank登录号AGN70962中披露了一种合适的MERS-CoV氨基酸序列(图9，SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，自Al-Hasa MERS-CoV株获得刺突蛋白或其片段。
本公开内容提供了MERS-CoV蛋白的变体。变体可以含有组成性蛋白质的氨基酸序列中的变化。就多肽而言，术语“变体”指就参照序列而言改变一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有“保守”变化，其中替代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替换亮氨酸。或者，变体可以具有“非保守”变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的微小变异还可以包括氨基酸删除或插入，或者这两者。可以使用本领域公知的计算机程序(例如DNASTAR软件)找到确定哪些氨基酸残基可以在不消除生物学或免疫学活性的情况中被替代、插入或删除的指导。
天然变体可以由于抗原性漂移而发生。抗原性漂移是病毒蛋白中随时间连续发生的小变化。如此，感染有特定MERS-CoV病毒株的人形成针对该病毒的抗体，随着较新的病毒株出现，针对较老的株的抗体不再识别较新的病毒，并且可以发生再感染。可以使用这些天然发生的MERS-CoV蛋白和RBD变体来生成本文所述纳米颗粒。
在一些实施方案中，突变含有如下变化，所述变化产生沉默替代、添加、或删除，但是不改变编码的蛋白质的特性或活性或者蛋白质怎样生成。可以出于多种原因生成核苷酸变体，例如为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成昆虫细胞诸如Sf9细胞优选的那些)。参见美国专利公开文本2005/0118191，通过提及将其完整收入本文用于所有目的。在一个具体的方面中，优选的蛋白质由经密码子优化的核苷酸序列(诸如图8中所示，SEQ ID NO:1)编码。核酸和多肽可以与图8和9中所示序列(SEQ ID NO:1和2)至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
另外，可以对核苷酸测序以确保正确的编码区得到克隆，并且不含任何不想要的突变。可以将核苷酸亚克隆入表达载体(例如杆状病毒)中以在任何细胞中表达。上文仅是可以如何克隆病毒蛋白的一个例子。本领域技术人员理解别的方法是可用的并且是可能的。
本公开内容还提供了会提高纳米颗粒生成的效率的构建体和方法。例如，自蛋白质除去切割位点以增加蛋白质表达。其它方法包括添加前导序列以实现更加有效的转运。例如，可以将异源信号序列与MERS蛋白融合。在一个实施方案中，可以自昆虫细胞的基因衍生信号序列。在另一个实施方案中，信号肽是壳多糖酶信号序列，其在杆状病毒表达系统中有效运转。在其它实施方案中，在蛋白质间互换前导序列能提供更好的蛋白质转运。
可以使用编码MERS-CoV蛋白或其片段的合适载体。例如，载体可以是噬菌体、质粒、病毒、或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是重组杆状病毒载体。编码基因的构建体和/或载体应当与合适的启动子可操作连接，诸如AcMNPV多角体蛋白启动子(或其它杆状病毒)、噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子、和逆转录病毒LTR的启动子是非限制性例子。根据宿主细胞和/或期望的表达速率，其它合适的启动子会是熟练技术人员知道的。表达构建体会进一步含有用于转录起始，终止的位点，和转录区中用于翻译的核糖体结合位点。优选地，由构建体表达的转录物的编码部分会包括开始处的翻译起始密码子和适当位于要翻译的多肽末尾处的终止密码子。
优选地，表达载体会包括至少一个选择标志。此类标志包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性和用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。优选的载体中有病毒载体，诸如杆状病毒、痘病毒(例如痘苗病毒、鸟痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒、等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、疱疹病毒、和逆转录病毒。也可以使用细菌载体。例示性的细菌载体包括pQE70、pQE60和pQE-9、pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体中有pFastBac1、pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、和pSVL。其它合适的载体会是熟练技术人员容易显而易见的。
可以依照本领域公知的方法将载体(例如包含MERS-CoV多核苷酸的载体)转染入宿主细胞中。例如，可以通过磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染、和采用多胺转染试剂的转染将核酸导入真核细胞中。在一个实施方案中，所述载体是重组杆状病毒。
重组载体(诸如上文公开的那些)可以用于转染、感染或转化真核细胞和/或原核细胞，并且可以在真核细胞和/或原核细胞中表达蛋白质。真核宿主细胞中有酵母、昆虫、鸟类、植物、秀丽隐杆线虫(C.elegans)(或线虫)和哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的非限制性例子是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)细胞，例如Sf9、Sf21、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，例如High Five细胞，和果蝇(Drosophila)S2细胞。真菌(包括酵母)宿主细胞的例子有酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis，K.lactis)、假丝酵母属(Candida)物种(包括白色假丝酵母(C.albicans)和光滑假丝酵母(C.glabrata))、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe，S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。哺乳动物细胞的例子有COS细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、和非洲绿猴细胞、CV1细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、Vero和Hep-2细胞。也可以使用光滑爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞，或两栖类起源的其它细胞。原核宿主细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和分枝杆菌。
培养工程化改造为生成纳米颗粒的细胞的方法包括但不限于分批、分批-补料、连续和灌注细胞培养技术。细胞培养意指细胞在生物反应器(发酵室)中的生长和增殖，其中细胞增殖并表达蛋白质(例如重组蛋白)以进行纯化和分离。通常，在生物反应器中在无菌受控温度和气氛条件下实施细胞培养。生物反应器是用于培养细胞的室，其中可以监测环境条件，诸如温度、气氛、搅拌和/或pH。在一个实施方案中，所述生物反应器是不锈钢室。在另一个实施方案中，所述生物反应器是预先灭菌的塑料袋(例如Wave Biotech,Bridgewater,NJ)。在其它实施方案中，所述预先灭菌的塑料袋是约50L至1000L袋。
然后，纳米颗粒可以使用保留其完整性的方法，诸如通过梯度离心，例如氯化铯、蔗糖和碘克沙醇(iodixanol)，以及标准纯化技术(包括例如离子交换和凝胶过滤层析)来分离。
下文是可以如何生成、分离和纯化纳米颗粒的例子。通常，自工程化改造为创建纳米颗粒的重组细胞系当在细胞培养中培养所述细胞时生成纳米颗粒。
例如，纳米颗粒的生成可以如下开始，即将Sf9细胞(未感染的)接种入摇瓶中，容许细胞扩充，并且随细胞生长和繁殖而放大(例如从125ml烧瓶至50L Wave袋)。对合适的细胞系配制用于培养细胞的培养基(优选无血清培养基，例如昆虫培养基ExCell-420，JRH)。接着，以最有效的感染复数(例如每个细胞约1至约3个噬斑形成单位)用重组杆状病毒感染所述细胞。一旦发生了感染，蛋白质自病毒基因组表达，该蛋白质自我装配成纳米颗粒VLP，并且在感染后大约24至72小时自细胞分泌。通常，当细胞处于对数生长期中期(4-8×106个细胞/ml)并且是至少约90％存活时，感染是最有效的。
或者，例如，可以通过用如下重组杆状病毒感染宿主细胞(例如Sf9细胞)来生成纳米颗粒，所述重组杆状病毒包含编码一种或多种感兴趣MERS-CoV蛋白的核苷酸序列。温育并收获经感染的细胞。用去污剂自细胞膜提取MERS-CoV蛋白(例如刺突蛋白)。然后，容许蛋白质天然装配以形成结构(例如三聚体)，然后纯化该结构。在纯化期间除去去污剂容许蛋白质形成较高等级的结构，诸如包含多重结构的纳米颗粒(例如包含蛋白质三聚体的蛋白质-蛋白质胶束纳米颗粒)。一般地，纳米颗粒中的结构的数目受到蛋白质浓度影响，较高的蛋白质浓度产生包含较大数目的结构(例如三聚体)的纳米颗粒。
可以在感染后大约48至96小时，在细胞培养液中纳米颗粒VLP的水平接近最大值时，但是在广泛细胞裂解前收获纳米颗粒。收获时的Sf9细胞密度和存活力可以是约0.5×106个细胞/ml至约1.5×106个细胞/ml及至少约20％存活力，如通过染料排除测定法显示的。接着，取出并澄清培养液。可以对培养液添加NaCl至浓度为约0.4至约1.0M，优选至约0.5M，以避免不想要的聚集。可以通过用一次性使用的预先灭菌的中空纤维0.5或1.00μm滤器筒或类似装置的切向流过滤(TFF)实现自含有纳米颗粒的细胞培养液除去细胞和细胞碎片。
接着，可以通过使用抛弃型预先灭菌的500,000分子量截留中空纤维筒的超滤来浓缩澄清的培养液中的纳米颗粒。可以针对10个体积的含有0.5MNaCl的pH 7.0至8.0的磷酸盐缓冲盐水(PBS)渗滤浓缩的纳米颗粒以除去残留的培养基成分。
可以通过于约4℃至约10℃以6,500×g离心18小时在具有0.5M NaCl的pH 7.2PBS缓冲液中的20％至60％不连续蔗糖梯度上进一步纯化经过浓缩、渗滤的纳米颗粒。通常，纳米颗粒VLP会在约30％至约40％蔗糖之间或者在界面处(在20％和60％步式梯度中)形成独特可见条带，可以自梯度收集并贮存该条带。可以稀释此产物以包含200mM NaCl，为纯化工艺中的下一步做准备。此产物含有纳米颗粒VLP，并且可以含有完整的杆状病毒颗粒。
可以通过阴离子交换层析，或者44％等密度蔗糖垫离心来实现纳米颗粒的进一步纯化。在阴离子交换层析中，将来自蔗糖梯度的样品(见上文)加载入含有具有阴离子的介质(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱中，并且经由盐梯度(自约0.2M至约1.0M NaCl)洗脱，所述盐梯度能分开纳米颗粒与其它污染物(例如杆状病毒和DNA/RNA)。在蔗糖垫方法中，将包含纳米颗粒的样品添加至44％蔗糖垫，并且以30,000g离心约18小时。纳米颗粒在44％蔗糖的顶部形成条带，而杆状病毒在底部沉淀，并且其它污染性蛋白质保留于顶部的0％蔗糖层中。收集纳米颗粒峰或条带。
若想要的话，可以灭活完整的杆状病毒。可以通过化学方法，例如福尔马林或β-丙内酯(BPL)实现灭活。也可以通过使用本领域已知的选择性沉淀和层析方法在很大程度上实现完整杆状病毒的除去和/或灭活，如上文例示的。灭活方法包括将在0.2％BPL中含有纳米颗粒的样品于约25℃至约27℃温育3小时。也可以通过将以0.05％BPL含有纳米颗粒的样品于4℃温育3天，然后于37℃温育1小时来灭活杆状病毒。
在灭活/除去步骤后，可以经由另一个渗滤步骤运行包含纳米颗粒的产物以除去来自灭活步骤的任何试剂和/或任何残留蔗糖，并且将纳米颗粒放入期望的缓冲液(例如PBS)中。可以通过本领域已知的方法(例如无菌过滤)将包含纳米颗粒的溶液灭菌，并在冰箱或冷冻器中贮存该溶液。
可以在多个规模间实施上述技术。例如，T-烧瓶、摇瓶、转瓶、直至工业大小的生物反应器。生物反应器可以包含不锈钢罐或预先灭菌的塑料袋(例如由Wave Biotech,Bridgewater,NJ出售的系统)。本领域技术人员会知道什么是对于他们的目的最想要的。
药物或疫苗配制剂和施用
在本文中有用的药物组合物含有药学可接受载剂，包括任何合适的稀释剂或赋形剂，其包括任何下述药剂，该药剂自身不诱导产生对接受组合物的脊椎动物有害的免疫应答，并且可以在没有过度毒性的情况中与纳米颗粒一起施用。如本文中使用的，术语“药学可接受”意指得到联邦或州政府的管理结构批准或在美国药典、欧洲药典或其它公认的药典中列出用于脊椎动物，且更特别地用于人。
一般地，以有效量或数量(如上文定义的)施用纳米颗粒，所述有效量或数量足以刺激针对MERS CoV病毒的一种或多种株的免疫应答。可以作为疫苗和/或抗原性组合物使用这些组合物以在脊椎动物中诱导保护性免疫应答。组合物可以含有具有不同多聚体类型的纳米颗粒。例如，组合物可以主要含有三聚体，剩余部分由不同多聚体构成。在一个实施方案中，以有效量施用以刺激针对MERS CoV病毒的一种或多种株的免疫应答的纳米颗粒包含MERS-CoV蛋白的至少约5至100个三聚体、至少约10至90个三聚体、至少约20至50个三聚体、至少约10至30个三聚体、或至少约10至20个三聚体。在又一个组合物实施方案中，施用的纳米颗粒包含刺突蛋白或其片段(诸如RBD)的至少约5至100个三聚体、至少约10至90个三聚体、至少约20至50个三聚体、至少约10至30个三聚体、或至少约10至20个三聚体。
在一个非限制性实施方案中，纳米颗粒的浓度是至少约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约40μg/mL、约50μg/mL、约60μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、或约500μg/mL。在具体的方面中，纳米颗粒的浓度介于约10μg/mL至约1mg/mL之间，或介于约20μg/mL至约500μg/mL之间，或介于约30μg/mL至约100μg/mL之间，或介于约30μg/mL至约50μg/mL之间。
在其它例子中，组合物可以包含较高等级的纳米颗粒，诸如5聚体至6聚体。在具体的方面中，组合物含有至少70％5聚体至6聚体、至少80％5聚体至6聚体、或至少90％5聚体至6聚体。在其它方面中，组合物含有至少70％5聚体至6聚体、至少80％5聚体至6聚体、或至少90％5聚体至6聚体。
在一个实施方案中，本文中公开的药物配制剂包含如下纳米颗粒和药学可接受载剂或赋形剂，所述纳米颗粒包含MERS-CoV蛋白，经常是刺突蛋白。
在其它实施方案中，组合物可以含有如下纳米颗粒，所述纳米颗粒含有来自不同MERS株的MERS-CoV蛋白，或变体诸如RBD变体。可以施用此类组合物以提供针对多种不同株的免疫力。在一个方面中，组合物可以含有纳米颗粒以提供针对第一株、第二株、第三株的免疫应答。在另一个方面中，纳米颗粒可以提供针对4、5或6种株的免疫应答。在另一个实施方案中，药物配制剂包含经过纯化的在施用纳米颗粒的动物中生成的高亲和力抗体。
药学可接受载剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等张水性缓冲液、及其组合。药学可接受载剂、稀释剂和其它赋形剂的全面讨论呈现于Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.，当前版本)。配制剂应当适合施用模式。在一个优选的实施方案中，配制剂适合于对人施用，优选是无菌、无颗粒和/或无热原的。
若想要的话，组合物也可以含有少量湿润或乳化剂、或pH缓冲剂。组合物可以是固体形式，诸如适合于重建的冻干粉末、液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放配制剂、或粉剂。口服配制剂可以包含标准载剂，诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、等。
本公开内容还提供了药用包装或试剂盒，其包含装有免疫原性疫苗配制剂的一种或多种成分的一个或多个容器。在一个优选的实施方案中，试剂盒包含两个容器，一个含有纳米颗粒而另一个含有佐剂。与此类容器联合的可以是管理制造、使用或销售药物或生物产品的政府机构规定的形式的通告，该通告反映该机构批准制造、使用或销售用于人施用。
可以在密封容器(诸如安瓿或小袋(sachette))中包装配制剂，指示组合物的数量。在密封容器中，在一个实施方案中，以液体，在另一个实施方案中，以干燥灭菌冻干粉或无水浓缩物供应组合物，并且可以例如用水或盐水重建至适合于对受试者施用的浓度。优选地，以优选约1μg、约5μg、约10μg、约20μg、约25μg、约30μg、约50μg、约100μg、约125μg、约150μg、或约200μg的单位剂量在密封容器中以干燥无菌冻干粉供应组合物。或者，组合物的单位剂量小于约1μg(例如约0.08μg、约0.04μg、约0.2μg、约0.4μg、约0.8μg、约0.5μg或更小、约0.25μg或更小、或约0.1μg或更小)，或大于约125μg(例如约150μg或更多、约250μg或更多、或约500μg或更多)。可以以总纳米颗粒或以μg MERS-CoV蛋白(例如刺突蛋白或其片段)测量这些剂量。应当在自冻干粉重建后约12小时内，优选约6小时内，约5小时内，约3小时内，或约1小时内施用纳米颗粒组合物。
在一个备选的实施方案中，在密封容器中以液体形式供应纳米颗粒组合物，指示纳米颗粒组合物的数量和浓度。优选地，以至少约50μg/ml，更优选至少约100μg/ml，至少约200μg/ml，至少500μg/ml，或至少1mg/ml在密封容器中供应液体形式的纳米颗粒组合物。
可以对动物施用纳米颗粒以引发针对MERS-CoV的免疫应答。在一个实施方案中，动物对MERS-CoV感染易感。在一个实施方案中，动物是人。优选地，纳米颗粒的施用引发针对至少一种MERS-CoV株、隔离群、进化枝、和/或物种的实质性免疫力。在一个实施方案中，纳米颗粒的施用引发针对至少2种或更多种MERS-CoV株、隔离群、进化枝、和/或物种的实质性免疫力。在又一个实施方案中，纳米颗粒的施用引发针对另一种冠状病毒的实质性免疫力。通常，可以根据例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、施用时间、和其它临床因素，在此范围内调节剂量。
如此，本文中公开了配制对受试者诱导针对病毒感染或其至少一种症状的实质性免疫力的疫苗或抗原性组合物的方法，其包括对所述配制剂添加有效剂量的纳米颗粒。
虽然用单剂刺激实质性免疫力是优选的，但是可以通过相同或不同路径施用额外剂量以实现期望的效果。例如，在新生儿和婴儿中可能需要多次施用以引发足够水平的免疫力。在维持足够水平的针对感染的保护必要时，施用可以贯穿整个童年以某种间隔继续。类似地，对重复或严重感染特别易感的成年人，诸如例如健康护理工作人员、日间护理工作人员、幼儿的家庭成员、老年人、和具有受损的心肺功能的个体，可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答。例如，可以通过测量中和性分泌性和血清抗体的量来监测诱导的免疫力的水平，并且在必要时调节剂量或重复疫苗接种以引发和维持期望水平的保护。
如此，在一个实施方案中，在受试者中诱导针对病毒感染或其至少一种症状的实质性免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的纳米颗粒，其中纳米颗粒包含至少一个包含MERS CoV刺突蛋白或其片段的三聚体。在其它方面中，纳米颗粒包含至少一个基本上由MERS CoV刺突蛋白或其片段组成的三聚体。实际上，刺突蛋白可以是三聚体和/或纳米颗粒中的唯一蛋白质。
施用包含纳米颗粒的组合物(疫苗和/或抗原性配制剂)的方法包括但不限于胃肠外施用(例如皮内、肌肉内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如鼻内和口服或肺路径或者通过栓剂)。在一个具体的实施方案中，肌肉内、静脉内、皮下、经皮或皮内施用本公开内容的组合物。可以通过任何方便的路径，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱和肠粘膜、等)吸收来施用组合物，并且组合物可以与其它生物学活性剂一起施用。在一些实施方案中，包含纳米颗粒的组合物的鼻内或其它粘膜路径施用可以诱导实质性高于其它施用路径的抗体或其它免疫应答。在另一个实施方案中，包含纳米颗粒的组合物的鼻内或其它粘膜路径施用可以诱导如下抗体或其它免疫应答，该抗体或其它免疫应答会诱导针对病毒的其它株的交叉保护。施用可以是系统的或局部的。系统性施用防范性疫苗配制剂，例如通过使用针和注射器或无针注射装置的皮下或肌肉内注射进行。或者，鼻内施用疫苗配制剂，通过滴剂、大颗粒气雾剂(大于约10微米)，或者进入上呼吸道的喷雾剂进行。虽然任何上述投递路径导致免疫应答，但是鼻内施用在病毒进入部位处赋予引发粘膜免疫的附加益处。
在又一个实施方案中，以下述方式施用疫苗和/或抗原性配制剂，使得靶向粘膜组织，以便在免疫接种部位处引发免疫应答。例如，可以通过使用含有具有特定粘膜靶向特性的佐剂的组合物的口服施用将免疫靶向粘膜组织，诸如肠相关淋巴样组织(GALT)。也可以靶向别的粘膜组织，诸如鼻咽淋巴样组织(NALT)和支气管相关淋巴样组织(BALT)。
也可以按剂量日程表(例如疫苗组合物的初次施用及后续加强施用)施用疫苗和/或抗原性配制剂。在具体的实施方案中，可以在初次施用后2周至1年，优选约1、约2、约3、约4、约5至约6个月的任何时间施用第二剂组合物。另外，可以在第二剂后并且在初次施用后约3个月至约2年，或甚至更久，优选约4、约5、或约6个月、或约7个月至约1年施用第三剂。任选地，可以在第二剂后在受试者的血清和/或尿液或粘膜分泌物中检测不到特异性免疫球蛋白或检测到低水平的特异性免疫球蛋白时施用第三剂。在一个优选的实施方案中，在第一次施用后约1个月施用第二剂，并且在第一次施用后约6个月施用第三剂。在另一个实施方案中，在第一次施用后约6个月施用第二剂。
在另一个实施方案中，可以以联合疗法的一部分施用纳米颗粒。例如，可以与其它免疫原性组合物和/或抗病毒剂一起配制纳米颗粒。
熟练技术人员能容易地确定药物配制剂的剂量，例如通过首先鉴定有效引发防范性或治疗性免疫应答的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白的血清滴度或者通过测量血清样品或尿液样品或粘膜分泌物中的抗体的抑制性比率进行。可以自动物研究确定所述剂量。
另外，熟练技术人员能实施人临床研究以确定用于人的优选有效剂量。此类临床研究是本领域常规且公知的。要采用的精确剂量也会取决于施用路径。可以从自体外或动物测试系统得到的剂量-响应曲线外推有效剂量。
如本领域也公知的，可以通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强特定组合物的免疫原性。已经在实验中使用佐剂来促进针对未知抗原的免疫力的普遍性增加(例如美国专利No.4,877,611)。免疫方案已经使用佐剂来刺激应答达多年之久，并且因此，佐剂是本领域普通技术人员公知的。一些佐剂影响抗原被呈递的方式。例如，免疫应答在蛋白质抗原通过明矾沉淀时是增加的。抗原的乳化也延长抗原呈递的持续时间。可以包含佐剂。合适的佐剂包括那些记载于Vogel et al.,“A Compendium of VaccineAdjuvants and Excipients(第2版)”的，通过提及将其完整收入本文用于所有目的。
其它例示性的佐剂包括完全弗氏佐剂(免疫应答的非特异性刺激物，其含有杀死的结核分枝杆菌)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其它佐剂包含GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物，诸如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A、Montanide ISA 206、和单磷酰脂质A(MPL)。也涵盖RIBI，其在2％鲨烯/Tween 80乳剂中含有自细菌提取的三种成分，即MPL、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate)(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。也可以使用MF-59、MHC抗原。
在一个实施方案中，佐剂是具有约2至10个双层的少层脂质囊泡，以实质上球壳形式排列，被水性层分开，围绕没有脂双层的大无定形中央腔。少层脂质囊泡可以以下述几种方式起作用以刺激免疫应答，即作为非特异性刺激物，作为抗原的载体，作为别的佐剂的载体，及其组合。在例如通过混合抗原与预先形成的囊泡，使得抗原对于囊泡而言仍然在胞外来制备疫苗时，少层脂质囊泡作为非特异性免疫刺激物起作用。通过在囊泡的中央腔内包囊抗原，囊泡既起免疫刺激物又起抗原的载体的作用。在另一个实施方案中，囊泡主要由非磷脂囊泡制成。在其它实施方案中，囊泡是Novasomes。是范围为约100nm至约500nm的少层非脂质囊泡。它们包含Brij 72、胆固醇、油酸和鲨烯。已经显示了Novasomes是一种对于抗原有效的佐剂(参见美国专利5,629,021，6,387,373，和4,911,928，通过提及将它们完整收入本文用于所有目的)。
在一个方面中，以磷酸盐缓冲盐水中的约0.05至约0.1％溶液使用，通过使用诸如明矾等药剂来实现佐剂效果。或者，可以作为与以约0.25％溶液使用的糖合成聚合物的混合物生成纳米颗粒。一些佐剂(例如自细菌获得的某些有机分子)作用于宿主而不是抗原。一个例子是胞壁酰二肽(N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[MDP])，即一种细菌肽聚糖。在其它实施方案中，也可以使用血蓝蛋白和血红蛋白。尽管可以采用其它软体动物和节肢动物血蓝蛋白和血红蛋白，但是来自钥孔虫戚的血蓝蛋白(KLH)的使用在某些实施方案中是优选的。
也可以使用各种多糖佐剂。例如，已经描述了在小鼠的抗体应答上使用各种肺炎球菌多糖佐剂(Yin et al.,1989)。应当如指示的那样采用产生最佳响应，或者在其它情况中不产生阻抑的剂量(Yin et al.,1989)。多糖的多胺种类是特别优选的，诸如壳多糖和壳聚糖，包括脱乙酰化壳多糖。在另一个实施方案中，描述了胞壁酰二肽的亲脂性二糖-三肽衍生物，其用于自磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油形成的人工脂质体。
其它合适的佐剂包括两亲剂和表面活性剂，例如皂苷和衍生物诸如QS21(Cambridge Biotech)。基于皂苷的佐剂包括那些含有单独的和组合的基质A和基质C的。例示性的合适的基于皂苷的佐剂记载于美国已公布申请20120107353和20110081378，通过提及将它们收入本文用于所有目的。
也可以采用非离子型嵌段共聚物表面活性剂(Rabinovich et al.,1994)。寡核苷酸是另一组有用的佐剂(Yamamoto et al.,1988)。Quil A和香菇多糖是可以在某些实施方案中使用的其它佐剂。
另一组佐剂是解毒的内毒素，诸如美国专利No.4,866,034的精制解毒内毒素。这些精制解毒内毒素在脊椎动物中有效产生佐剂应答。当然，可以组合解毒的内毒素与其它佐剂以制备多佐剂配制剂。例如，特别涵盖解毒内毒素与海藻糖二霉菌酸酯的组合，如记载于美国专利No.4,435,386。也涵盖解毒内毒素与海藻糖二霉菌酸酯和内毒性糖脂的组合(美国专利No.4,505,899)，解毒内毒素与细胞壁骨架(CWS)或CWS和海藻糖二霉菌酸酯的组合亦然，如记载于美国专利No.4,436,727，4,436,728和4,505,900。仅CWS和海藻糖二霉菌酸酯而无解毒内毒素的组合也会是有用的，如记载于美国专利No.4,520,019。
本领域技术人员会知道可以与疫苗联合的不同种类的佐剂，包括烷基溶血磷脂(ALP)；BCG；和生物素(包括生物素化衍生物)等。特别涵盖使用的某些佐剂是来自Gram-细胞的磷壁酸。这些包括脂磷壁酸(LTA)、核醣醇磷壁酸(RTA)和甘油磷壁酸(GTA)。也可以采用其合成对应物的活性形式(Takada et al.,1995)。
各种佐剂(甚至那些通常不在人中使用的佐剂)仍可以在其它脊椎动物中采用，其中例如期望提高抗体或随后获得活化的T细胞。可能源自佐剂或细胞的毒性或其它不利作用(例如使用未照射肿瘤细胞时可能发生的)在此类情况中是无关的。
诱导免疫应答的另一种方法可以通过将纳米颗粒与“免疫刺激剂”一起配制来实现。这些是身体自身的提高免疫系统应答的化学信使(细胞因子)。免疫刺激剂包括但不限于具有免疫刺激、免疫加强、和促炎性活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；和其它免疫刺激分子，诸如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1、B7.2、等。免疫刺激性分子可以与纳米颗粒在同一配制剂中施用，或者可以分开施用。可以施用蛋白质或编码蛋白质的表达载体以产生免疫刺激效应。
明矾可以在具有下述下限的范围中存在：约0.2μg、约0.4μg、约0.6μg、约0.8μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约9μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约110μg、约120μg、约130μg、约140μg、或约150μg。明矾可以以具有下述上限的范围存在：约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约110μg、约120μg、约130μg、约140μg、约150μg、或约200μg。在具体的方面中，明矾的范围是约80μg至约120μg或约100μg至约120μg。
基于皂苷的佐剂可以在具有下述下限的范围中存在：约0.2μg、约0.4μg、约0.6μg、约0.8μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约9μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、或约30μg。基于皂苷的佐剂可以以具有下述上限的范围存在：约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约110μg、约120μg、约130μg、约140μg、约150μg、或约200μg。在具体的方面中，基于皂苷的佐剂的范围是约5μg至约20μg或约1μg至约10μg。
这些剂量是在小鼠中特别合适的，并且可以基于典型的20g小鼠重量对约60Kg人重量进行调节以供人使用。
刺激抗MERS CoV免疫应答的方法
纳米颗粒可用于制备免疫原性组合物以刺激赋予针对MERS CoV病毒的免疫力或实质性免疫力的免疫应答。粘膜和细胞免疫两者可以促成针对感染和疾病的免疫力。在上呼吸道中局部分泌的抗体是抵抗天然感染的主要因子。分泌性免疫球蛋白A(sIgA)参与上呼吸道的保护，而血清IgG参与下呼吸道的保护。由感染诱导的免疫应答针对相同的病毒或抗原性相似的病毒株的再感染提供保护。也可以对其他受试者施用在用本文中公开的纳米颗粒免疫后在宿主中生成的抗体，从而在受试者中提供被动施用。
本公开内容提供了生成高亲和力抗MERS-CoV抗体的方法。通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的高亲和力抗体是如下生成的，即对动物施用包含MERS-CoV纳米颗粒的免疫原性组合物，自动物收集血清和/或血浆，并自血浆和/或血浆纯化抗体。在一个实施方案中，动物是人。在一个实施方案中，动物是牛或马。在另一个实施方案中，牛或马动物是转基因的。在又一个实施方案中，转基因牛或马动物生成人抗体。在一个实施方案中，方法进一步包括施用佐剂或免疫刺激性化合物。在又一个实施方案中，对人受试者施用经过纯化的高亲和力抗体。在一个实施方案中，人受试者处于MERS-CoV感染的风险。
纳米颗粒能在对脊椎动物(例如人)施用时在所述脊椎动物中诱导实质性免疫力。实质性免疫力源自针对纳米颗粒的免疫应答，其在所述脊椎动物中针对病毒感染提供保护或改善感染或至少减轻病毒感染的症状。在一些情况中，若所述脊椎动物受到感染，则所述感染会是无症状的。响应可以不是完全保护性响应。在此情况中，若所述脊椎动物受到MERSCoV病毒感染，则脊椎动物会经历与未免疫脊椎动物相比减轻的症状或更短的症状持续时间。
在一个实施方案中，本公开内容提供了在受试者中诱导针对病毒感染或其至少一种症状的实质性免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的纳米颗粒。在另一个实施方案中，所述诱导实质性免疫力缩短MERS症状的持续时间。在另一个实施方案中，在受试者中诱导针对病毒感染或其至少一种症状的实质性免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的纳米颗粒。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在又一个实施方案中，与佐剂或免疫刺激剂一起配制所述纳米颗粒。
在实施方案中，组合物中存在的每种抗原的剂量可以是约0.2μg、约0.4μg、约0.6μg、约0.8μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约9μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约110μg、约120μg、约130μg、约140μg、或约150μg。例如，可以依照MERS刺突蛋白含量测量量。例如，1μg纳米颗粒是约1μg MERS刺突蛋白。
通过用纳米颗粒免疫生成的抗体
本文中公开的纳米颗粒在宿主中诱导高亲和力抗MERS-CoV抗体的生成。这些高亲和力抗MERS-CoV抗体展现比经由常规方法(例如噬菌体展示；参见Zhang et al.2014)生成的抗MERS-CoV抗体要高的亲和力。
术语“亲和力”指表位和抗体的抗原结合位点之间的相互作用的强度。例如，可以使用下述方程确定亲和力：
其中KA＝亲和常数；[Ab]＝抗体上未被占据的结合位点的摩尔浓度；[Ag]＝抗原上未被占据的结合位点的摩尔浓度；而[Ab-Ag]＝抗体-抗原复合物的摩尔浓度。KA描述了在达到平衡的点时存在多少抗体-抗原复合物。这发生所花费的时间取决于扩散速率，并且对于每种抗体是相似的。然而，高亲和力抗体会比低亲和力抗体在更短的时段中结合更大量的抗原。所生成的抗体的KA(亲和常数)可以有所变化，并且范围介于约105mol-1至约1012mol-1或更多之间。KA可以受到包括pH、温度、和缓冲液组成在内的因素影响。
所生成的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以精确测量单克隆抗体的亲和力，因为它们是同质的，并且对于单一表位是选择性的。多克隆抗体是异质的，并且会含有识别几种表位的不同亲和力的抗体的混合物，因此仅能测量平均亲和力。
可以使用本领域中通常采用的任何手段来测量抗体亲和力，包括但不限于使用生物传感器，诸如表面等离振子共振(例如Biacore)。共振单位与可溶性配体对固定化受体(或可溶性抗体对固定化抗原)的结合程度成比例。测定不同已知浓度的受体(抗体)和配体(蛋白质抗原)平衡时的结合量容许计算平衡常数(KA，KD)，和解离和结合速率(koff，kon)。
例如，KD(平衡解离常数)是抗体与其抗原之间的koff/kon比率。KD和亲和力是反比关系的。KD值越低(抗体浓度越低)，抗体的亲和力越高。大多数抗体具有低微摩尔(10-6)至纳摩尔(10-7至10-9)范围中的KD值。一般认为高亲和力抗体在低纳摩尔范围(10-9)中，很高亲和力抗体在皮摩尔(10-12)范围或更低(例如10-13至10-14范围)中。在一个实施方案中，通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范围为约10-6至约10-15、约10-7至约10-15、约10-8至约10-15、约10-9至约10-15、约10-10至约10-15、约10-11至约10-15、约10-12至约10-15、约10-13至约10-14、约10-13至约10-15、和约10-14至约10-15的KD。在一个优选的实施方案中，通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范围为约10-10至约10-14的KD。
通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有低解离速率(koff)，指示它们紧密结合抗原。在一个实施方案中，通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范围为约10-3M-1至约10-13M-1、约10-5M-1至约10-13M-1、约10-6M-1至约10-13M-1、约10-7M-1至约10- 13M-1、约10-8M-1至约10-13M-1、约10-9M-1至约10-13M-1、约10-10M-1至约10-13M-1、约10-11M-1至约10-13M-1、或约10-12M-1至约10-13M-1的koff。在另一个实施方案中，通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范围为约10-4M-1至约10-10M-1、约10-4M-1至约10-9M-1、或约10-4M-1至约10-8M-1的koff。
通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有高结合速率(kon)，指示它们紧密结合抗原。在一个实施方案中，通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范围为约103M至约108M、约104M至约107M、约104M至约106M、约104M至约105M、约105M至约107M、或约105M至约106M的kon。
通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体中和MERS-CoV病毒。抗体可以是广泛中和性抗体，并且中和一种或多种MERS-CoV病毒株、进化枝、或冠状病毒，或者抗体仅能中和一种MERS-CoV病毒株。可以通过本领域中通常采用的任何手段来测量抗体的中和能力，包括但不限于荧光降低中和测试(FRNT50)、测量自经免疫细胞释放的病毒体的量的基于细胞的体外测定法、和测量经免疫动物中的感染的体内测定法。
本公开内容通过下述实施例进一步例示，所述实施例不应解释为限制性的。通过提及完整收录贯穿本申请及附图引用的所有参考文献、专利和已公布的专利申请的内容用于所有目的。
实施例1
MERS CoV刺突纳米颗粒的生成
通过在Sf9细胞中过表达杆状病毒中的MERS CoV刺突蛋白(图8和9)生成纳米颗粒。在纯化后，主要以三聚体形式回收含有刺突蛋白的纳米颗粒VLP(图4和6)。
实施例2
使用MERS CoV刺突纳米颗粒诱导免疫应答
对小鼠施用VLP，如图5中显示的。在45天时段结束时，自小鼠提取血液以评估免疫应答。图7显示了施用SARS CoV刺突纳米颗粒VLP或MERSCoV刺突纳米颗粒VLP的小鼠的中和性抗体滴度。通过使用佐剂基质M1获得最高响应。
实施例3
自转染色体牛生成的有力的抗MERS-CoV人免疫球蛋白在体内抑制MERS-CoV
为了证明疫苗接种后自Tc牛获得的抗MERS CoV hIgG抗体和免疫球蛋白能在体外和在体内中和MERS CoV，我们对三个分开的Tc牛群施用三种实验性MERS CoV疫苗以诱导针对MERS CoV的高滴度中和性抗体。测试的第一种疫苗是完整的杀死的Jordan株(进化枝A)MERS-CoV病毒体(WKV)疫苗，第二种是Al-Hasa(进化枝B)MERS-CoV刺突纳米颗粒(SN)疫苗，而第三种是Al-Hasa MERS-CoV刺突蛋白pDNA疫苗。通过体外测定法发现了pDNA疫苗是免疫原性较差的，没有进一步评估(数据没有呈现)。然而，来自经WKV(称作SAB-300)和SN(称作SAB-301)疫苗接种的Tc牛两者的康复期者血清和高度纯化的hIgG免疫球蛋白能够在体外交叉中和病毒，不诱导抗体依赖性的MERS-CoV进入人Raji B细胞中，并且快速降低MERS-CoV的Ad5-hDPP4转导小鼠模型中的病毒感染(Erasmus染色)。
方法和材料
动物研究
转染色体(Tc)牛克隆和抗体生成
如Matsushita,et al.,PLoS One,2014.9(3):p.e90383；Sano,et al.,PLoS One,2013.8(10):p.e78119；及Kuroiwa,et al.,Nat Biotechnol,2009.27(2):p.173-81所述生成Tc牛。简言之，此研究中使用的Tc牛在内源牛免疫球蛋白基因的三重敲除(IGHM-/-IGHML1-/-IGL-/-)方面是纯合的，并且携带由人染色体14片段(其含有整个人免疫球蛋白重链基因座)和人染色体2片段(其含有整个人免疫球蛋白卡帕轻链基因座)组成的人类人工染色体(HAC)。
灭活的完整病毒体生成
通过自用Jordan-N3/2012株(GenBank KC776174.1)感染的Vero CCL-81细胞收集培养液，生成完整的灭活MERS-CoV病毒体以进行疫苗接种。用钴源照射4x108PFU的MERS-CoV，直到实现6兆拉德的剂量。对于灭活，对材料测试安全性。在经照射的传代材料中没有检出MERS-CoV特异性信号。
MERS-CoV刺突纳米颗粒生成
如Coleman et al.,2014所述生成纯化的Al-Hasa株MERS-CoV刺突蛋白纳米颗粒。简言之，用特定的重组杆状病毒感染2-3x 106个细胞/ml的Sf9细胞。于27±2℃在连续搅拌的情况中温育经感染的Sf9细胞，并且于68-72hpi通过以4000xg离心15分钟收获细胞。用非离子型去污剂自细胞膜提取刺突蛋白，并且通过以10,000xg离心30分钟除去不溶性材料。使用阴离子交换层析、亲和层析和大小排阻层析的组合纯化刺突蛋白装配体。在纯化期间，除去大部分去污剂，这容许刺突蛋白三聚体形成更高等级的蛋白质-蛋白质胶束纳米颗粒。将纯化的刺突纳米颗粒进行0.2微米过滤，并且于-80℃贮存。
Tc牛疫苗接种
如图10A中显示的，以1-2x 108PPF/剂用完整的杀死的MERS-CoV病毒(WKV)免疫群1中的三只Tc牛(#2244；#2252和#2254)，所述完整的杀死的MERS-CoV病毒(WKV)用作为水包油乳剂的Montanide ISA 25佐剂(Seppic)加皂苷衍生免疫刺激剂Quil A(AccurateChemicals)配制。以2mg/剂用重组MERS-CoV刺突纳米颗粒(SN)免疫群2中的两只Tc牛(#2178和#2183)，所述重组MERS-CoV刺突纳米颗粒(SN)用作为水包油包水乳剂的MontanideISA 206佐剂加上Quil A配制。以3至4周间隔将这两群中的Tc牛免疫5次。
腺病毒/hDPP4小鼠中的体内MERS-CoV攻击研究
用Erasmus染色MERS-CoV感染经转导的hDPP4 BALB/c小鼠。简言之，给BALB/c腹膜内注射100或500μg阴性对照或自牛收集的测试免疫球蛋白(SAB-300或SAB-301)。12小时后，在总体积50μl中用MERS-CoV(1x105PFU)鼻内感染小鼠。为了获得病毒滴度，将肺取入PBS中，并使用手动匀浆器将肺匀浆。在Vero 81细胞上滴定病毒。对于MERS-CoV，以PFU/g组织表示病毒滴度。
结果和讨论
Tc动物中生成的抗原特异性hIgG的评估
实施MERS-CoV刺突蛋白特异性ELISA以评估用WKV或SN(图10B)和SAB-300和SAB-301(图10C)免疫后Tc牛中的抗原特异性hIgG应答。ELISA结果证明了对于血清和SAB-300和SAB-301两者(图10)，在第二次疫苗接种(V2)时强力的MERS-CoV刺突特异性hIgG应答，并且维持高滴度到最后一次免疫(V5)。此数据指示自用WKV或SN免疫的Tc牛生成靶向MERS-CoV蛋白的高滴度hIgG抗体，并且这两种免疫球蛋白在纯化后保留活性。
在体外通过血清、SAB-300和SAB-301中和MERS-CoV
荧光降低中和测试-50％降低(FRNT50)
实施了两项中和测定法以鉴定SAB-300和SAB-301的体外中和潜力。使用荧光降低中和测试(FRNT50)和病毒感染中和测定法对来自接种疫苗的牛的血清、SAB-300和SAB-301测定其在体外抑制MERS-CoV感染的能力。FRNT测定法使用荧光报告感染，而病毒感染中和测定法使用细胞存活力报告。
对来自接种疫苗的牛的血清(图11A)，及SAB-300和SAB-301(图11B)实施了FRNT50测定法。我们发现了牛#2244V2产生高滴度中和性抗体，来自牛#2178和#2183的V2亦然。在与相等量的阳性对照经抗原亲和纯化的抗刺突家兔抗体相比时，Tc牛V2血清具有显著更多的中和。此数据与图10B中的抗原特异性ELISA结果一致。然后，在相同的FRNT50测定法中对SAB-300(自牛#2244V2纯化的hIgG)和SAB-301(自#2178和#2183的V2纯化的hIgG)测试中和。数据证明了SAB-300和SAB-301产生相似的高水平的中和性抗体滴度(图11C)。与相等量的阳性对照经抗原亲和纯化的家兔抗刺突抗体相比，这两种经过纯化的hIgG制备物在中和MERS-CoV方面是高度有效的，这证明了SAB-300和SAB-301两者都能够在体外抑制MERS-CoV感染。
另外，SAB-300和SAB-301引起对Vero E6细胞中生长的MERS-CoV的显著中和，而非特异性对照血清对Vero E6细胞的MERS-CoV感染没有显著影响(图12A)。自用SAB-300预处理的MERS-CoV感染的细胞释放的感染性MERS-CoV水平低于测定法的检测限(158TCID50/ml；图12A)，这指示了SAB-300是一种很强的中和性抗体。自用SAB-301预处理的MERS-CoV感染的细胞释放的感染性MERS-CoV水平在除1:8000和1:16000以外的所有稀释度低于测定法的检测限(158TCID50/ml；图12A)，这提示了血清SAB-301是一种强中和性抗体，但是抑制性不如SAB-300。
SAB-300和SAB-301不引起MERS-CoV的抗体增强
为了证明受到抗体结合的MERS-CoV病毒不容许病毒体进入正常情况下不被感染的细胞中，测试Raji细胞(一种通常不被MERS-CoV感染的永生化人B细胞系)以查看抗MERS抗体的存在是否能容许病毒RNA的转录和活病毒的释放。用与SAB-300和SAB-301预温育的MERS-CoV感染Raji细胞(图12B)。在感染后48小时时对培养基实施病毒mRNA的RT-PCR和TCID50测定法以评估感染。TCID50测定法未能检出自Raji细胞释放的MERS-CoV，这指示了它们未被MERS-CoV感染。相反，此测定法发现了经相似处理的Vero E6细胞(其通常受MERS-CoV感染)在感染后48小时时产生高水平的病毒(数据未显示)。为了确定MERS-CoV RNA是否在用与SAB-300和SAB-301预温育后的MERS-CoV感染的Raji细胞中检出，自经感染的细胞提取RNA，并且用对MERS-CoV新转录RNA特异性的引物(前导引物)通过Taqman实时PCR进行分析(图12B)。在仅用MERS-CoV感染的Raji细胞，用自疫苗接种前血浆纯化的非特异性阴性对照hIgG感染的Raji细胞，或用经SAB-300或SAB-301预处理的MERS-CoV感染的细胞中没有显著检出MERS-CoV新转录病毒RNA(前导引物组)。这些数据证明了SAB-300或SAB-301没有引起MERS-CoV感染的抗体依赖性增强。
MERS-CoV复制的体内抑制
我们在MERS-CoV的小鼠模型中测试了SAB-300和SAB-301的功效。小鼠对于MERS-CoV是不允许的；然而，在用表达MERS-CoV受体人二肽基肽酶4(hDPP4)的腺病毒转导时，它们变为允许的，并且复制病毒(Zhao,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,2014.111(13):p.4970-5)。为了测试Tc抗体的抗病毒活性，用75ul PBS中的2.5x108PFU Ad5-hDPP4鼻内转导BALB/c小鼠(6-8周)。在转导后5天时，用一剂100或500μg的对照hIgG、SAB-300或SAB-301通过腹膜内注射处理小鼠。12小时后，用总体积50μl中的MERS-CoV(1x105PFU)鼻内感染小鼠。在感染的5天过程里不给予另外的抗体注射。在感染后1、3和5天时，对小鼠实施安乐死，并且切出它们的肺。为了获得病毒滴度，使用手动匀浆器在PBS中将肺匀浆，通过离心澄清，并且在Vero细胞上滴定(图13)。在感染后第1天和第3天在无处理组的肺和接受阴性对照人IgG的组中发现约1x106PFU/mg肺组织的滴度，滴度在5dpi时下降至1x105。与hIgG对照注射组相比，在感染后第1天发现用100μg或500μg SAB-300注射的小鼠分别具有病毒滴度的约50倍或500倍降低(图13A)。到感染后第3天，100μg组的病毒滴度降低是约5000倍，而接受500ug的小鼠中的滴度低于检测水平。在感染后5天时，这两个处理组中的病毒滴度低于检测水平(图13A)。对SAB-301抗体发现了病毒滴度的相似降低，只是在感染后第1天与SAB-300处理的小鼠相比肺滴度适度更高(图13B)。到感染后第5天，所有SAB-301处理的小鼠具有低于检测水平的病毒滴度(图13B)。这些数据证明了SAB-300和SAB-301两者都能够在单次防范性注射的情况中保护小鼠免于MERS-CoV感染。
实施例4
用MERS-CoV刺突蛋白(S)纳米颗粒免疫的动物中的抗体的BIACORE分析
通过抗S亲和力(BiacoreTM)分析测试来自遵循图10A和实施例3中显示的一系列免疫用MERS-CoV S纳米颗粒疫苗免疫的两头Tc牛(#2178和2183)的两种抗体的亲合力。我们测试了疫苗接种3(v3)、疫苗接种4(v4)和疫苗接种5(v5)后这些动物的血清中的抗体的亲合力。简言之，使用与CM5芯片胺偶联的蛋白A/G，将牛Tc血清IgG捕获至流动室。将0、20和40nM的MERS刺突蛋白抗原注射至流动室达180秒，接着解离600秒。应用1:1拟合模型。以时间的函数测量结合和解离速率，并且在传感图上进行绘图，并且自结合和解离速率计算解离常数。图14和表1中显示了结果。
表1
表2显示了通过Ying et al.,J.Virol.(2014)中披露的噬菌体展示生成的抗S1单抗的亲和力。这两张表中的数据的比较证明了经由噬菌体展示生成的MERS-CoV单抗的报告KD和抗体Koff速率比Tc牛中诱导的多克隆抗S应答小几个数量级。
表2
其它实施方案
本领域技术人员会认识到，或者仅仅使用常规实验就能够确定，本文中描述的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案意图由本文中提供的权利要求书所涵盖。
援引收录
本申请通过援引完整收录本文中公开的所有出版物或参考文献用于所有目的。
本申请通过援引完整收录下列各项用于所有目的：2007年6月27日提交的美国流水号12/306,965，2007年12月20日提交的美国流水号61/015,440，2006年10月18日提交的美国流水号11/582,540，2006年10月18日提交的美国流水号12/633,995，2005年10月18日提交的美国流水号60/727,513；2006年3月10日提交的60/780,847；2006年5月15日提交的60/800,006；2006年7月17日提交的60/831,196；2006年7月21日提交的60/832,116，和2006年9月19日提交的60/845,495，和2003年7月11日提交的10/617,569。
参考文献
1.Berglund,P.,Fleeton,M.N.,Smerdou,C.,and Liljestrom,P.(1999).Immunization with recombinant Semliki Forest virus induces protectionagainst influenza challenge in mice.Vaccine 17,497-507.
2.Cox,J.C.,and Coulter,A.R.(1997).Adjuvants--a classification andreview of their modes of action.Vaccine 15,248-256.
3.Crawford,J.,Wilkinson,B.,Vosnesensky,A.,Smith,G.,Garcia,M.,Stone,H.,and Perdue,M.L.(1999).Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protectagainst lethal influenza infections by avian H5and H7subtypes.Vaccine 17,2265-2274.
4.Crowther R A,Kiselev N A,Bottcher B,Berriman J A,Borisova G P,OseV,Pumpens P.(1994).Three-dimensional structure of hepatitis B virus coreparticles determined by electron cryomicroscopy.Cell 17,943-50.
5.Gomez-Puertas,P.,Mena,I.,Castillo,M.,Vivo,A.,Perez-Pastrana,E.,andPortela,A.(1999).Efficient formation of influenza virus-like particles:dependence on the expression levels of viral proteins.J.Gen.Virol.80,1635-1645.
6.Johansson,B.E.(1999).Immunization with influenza A virushemagglutinin and neuraminidase produced in recombinant baculovirus resultsin a balanced and broadened immune response superior to conventionalvaccine.Vaccine 17,2073-2080.
7.Lakey,D.L.,Treanor,J.J.,Betts,B.F.,Smith,G.E.,Thompson,J.,Sannella,E.,Reed,G.,Wilkinson,B.E.,and Wright,P.E.(1996)Recombinant baculovirusinfluenza A hemagglutinin vaccines are well tolerated and immunogenic inhealthy adults.J.Infect.Dis.174,838-841.
8.Latham,T.,and Galarza,J.M.(2001).Formation of wild-type andchimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression ofonly four structural proteins.J.Virol.75,6154-6165.
9.Mena,I.,Vivo,A.,Perez,E.,and Portela,A(1996).Rescue of a syntheticchloramphenicol acetyltransferase RNA into influenza-like particles obtainedfrom recombinant plasmids.J.Virol.70,5016-5024.
10.Murphy,B.R.,and Webster,R.G.(1996).Orthomyxoviruses.In"Virology"(D.M.K.B.N.Fields,P.M.Howley,Eds.)Vol.1,pp.1397-1445.Lippincott-Raven,Philadelphia.
11.Neumann,G.,Watanabe,T.,and Kawaoka,Y.(2000).Plasmid-drivenformation of influenza virus-like particles.J.Virol.74,547-551.
12.Olsen,C.W.,McGregor,M.W.,Dybdahl-Sissoko,N.,Schram,B.R.,Nelson,K.M.,Lunn,D.P.,Macklin,M.D.,and Swain,W.F.(1997).Immunogenicity and efficacyof baculovirus-expressed and DNA-based equine influenza virus hemagglutininvaccines in mice.Vaccine 15,1149-1156.
13.Peiris,J.S.,Guan,Y.,Markwell,D.,Ghose,P.,Webster,R.G.,andShortridge,K.F.(2001).Cocirculation of avian H9N2 and contemporary"human"H3N2influenza A viruses in pigs in southwestern China:potential for geneticreassortment？J.Virol.75,9679-9686.
14.Pumpens,P.,and Grens,E.(2003).Artificial genes for chimeric virus-like particles.In:"Artificial DNA"(Khudyakov,Y.E,and Fields,H.A.,Eds.)pp.249-327.CRC Press,New York.
15.Pushko,P.,Parker,M.,Ludwig,G.V.,Davis,N.L.,Johnston,R.E.,andSmith,J.F.(1997).Replicon-helper systems from attenuated Venezuelan equineencephalitis virus:expression of heterologous genes in vitro and immunizationagainst heterologous pathogens in vivo.Virology 239,389-401.
16.Slepushkin,V.A.,Katz,J.M.,Black,R.A.,Gamble,W.C.,Rota,P.A.,andCox,N.J.(1995).Protection of mice against influenza Avirus challenged byvaccination with baculovirus-expressed M2 protein.Vaccine 13,1399-1402.
17.Treanor,J.J.,Betts,R.F.,Smith,G.E.,Anderson,E.L.,Hackett,C.S.,Wilkinson,B.E.,Belshe,R.B.,and Powers,D.C.(1996).Evaluation of a recombinanthemagglutinin expressed in insect cells as an influenza vaccine in young andelderly adults.J.Infect.Dis.173,1467-1470.
18.Tsuji,M.,et al.(1998).Recombinant Sindbis viruses expressing acytotoxic T-lymphocyte epitope of a malaria parasite or of influenza viruselicit protection against the corresponding pathogen in mice.J.Virol.72,6907-6910.
19.Ulmer,J.B.,et al.(1993).Heterologous protection against influenzaby injection of DNAencoding a viral protein.Science 259,1745-1749.
20.Ulmer,J.B.,et al.(1998).Protective CD4+and CD8+T cells againstinfluenza virus induced by vaccination with nucleoprotein DNA.J.Virol.72,5648-5653.
21.Watanabe,T.,Watanabe,S.,Neumann,G.,and Kawaoka,Y.(2002)Immunogenicity and protective efficacy of replication-incompetent influenzavirus-like particles.J.Virol.76,767-773.
22.Zhou,X.,et al.(1995).Generation of cytotoxic and humoral immuneresponses by non-replicative recombinant Semliki Forestvirus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,3009-3013.
23.Zabel et al.(2014).Viral Particles Drive Rapid Differentiation ofMemory B Cells into Secondary Plasma Cells Producing Increased Levels ofAntibodies.J.Immunol.192:5499-5508.
24.Zhang et al.(2000).HPV6b virus like particles are potentimmunogens without adjuvant in man.Vaccine.18:1051-8.

Claims (13)

1.一种免疫原性组合物，其包含
(i)MERS-CoV纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含MERS-CoV抗原，其中所述抗原由杆状病毒表达的三聚体形式的全长刺突多肽组成，其中所述刺突多肽是所述纳米颗粒中的唯一多肽，和
(ii)基于皂苷的佐剂，其中所述基于皂苷的佐剂包含组合的基质A佐剂和基质C佐剂且其中所述基于皂苷的佐剂是所述组合物中的唯一佐剂；且
其中所述组合物能够诱导针对MERS-CoV的中和性抗体。
2.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒包含所述刺突多肽的至少5个三聚体至30个三聚体。
3.权利要求2的组合物，其中所述纳米颗粒包含所述刺突多肽的至少10个三聚体至20个三聚体。
4.权利要求1的组合物，其中所述纳米颗粒的浓度是至少20μg/mL至60μg/mL。
5.权利要求4的组合物，其中所述纳米颗粒的浓度是至少30μg/mL至50μg/mL。
6.权利要求1至3中任一项的组合物，其中所述刺突多肽包含SEQ ID NO:2。
7.权利要求1至3中任一项的组合物，其中所述刺突多肽由SEQ ID NO:2组成。
8.一种生成高亲和力抗体的方法，其包括对动物施用权利要求1-7任一项的免疫原性组合物，自所述动物收集血清和/或血浆，并自所述血清和/或血浆纯化抗体。
9.权利要求8的方法，其中所述动物是牛或马。
10.权利要求9的方法，其中所述牛或马动物是转基因动物。
11.权利要求8的方法，其中所述抗体具有介于10-8和10-15之间的KD。
12.权利要求11的方法，其中所述抗体具有介于10-12和10-14之间的KD。
13.权利要求8的方法，其进一步包括对人受试者施用经过纯化的高亲和力抗体。
CN201480051512.9A 2013-09-19 2014-09-19 免疫原性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组合物和方法 Active CN105555306B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361880111P 2013-09-19 2013-09-19
US61/880,111 2013-09-19
PCT/US2014/056517 WO2015042373A1 (en) 2013-09-19 2014-09-19 Immunogenic middle east respiratory syndrome coronavirus (mers-cov) compositions and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105555306A CN105555306A (zh) 2016-05-04
CN105555306B true CN105555306B (zh) 2019-12-03

Family

ID=51660661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480051512.9A Active CN105555306B (zh) 2013-09-19 2014-09-19 免疫原性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组合物和方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US10751410B2 (zh)
EP (1) EP3046579A1 (zh)
JP (1) JP6643239B2 (zh)
KR (1) KR102399854B1 (zh)
CN (1) CN105555306B (zh)
BR (1) BR112016006122B1 (zh)
CA (1) CA2922258C (zh)
HK (1) HK1225631A1 (zh)
IL (1) IL244298B (zh)
MX (1) MX2016003419A (zh)
RU (1) RU2685185C2 (zh)
SA (1) SA516370772B1 (zh)
SG (2) SG10201802194WA (zh)
WO (1) WO2015042373A1 (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150064104A (ko) * 2012-09-23 2015-06-10 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담 사람 베타 코로나바이러스의 계통 c 및 이의 바이러스 수용체로서 n-말단 디펩티딜 펩티다아제의 확인
US9889194B2 (en) 2013-03-01 2018-02-13 New York Blood Center, Inc. Immunogenic composition for MERS coronavirus infection
IL276210B2 (en) 2013-11-29 2024-01-01 Inovio Pharmaceuticals Inc MERS-COV vaccine
US11103575B2 (en) 2014-02-28 2021-08-31 The New York Blood Center, Inc. Immunogenic composition for MERS coronavirus infection
JP2017006008A (ja) * 2015-06-17 2017-01-12 オーストリッチファーマ株式会社 Ｍｅｒｓ用抗体および抗血清
EP3344291A4 (en) * 2015-09-03 2019-04-10 Novavax, Inc. VACCINE COMPOSITIONS WITH IMPROVED STABILITY AND IMMUNOGENICITY
CN106119213A (zh) * 2016-06-20 2016-11-16 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 以流感病毒M1为骨架的MERS‑CoV嵌合型VLPs疫苗
EP3541419B1 (en) * 2016-11-18 2022-01-05 New York Blood Center, Inc. Immunogenic composition for mers coronavirus infection
KR20180058206A (ko) * 2016-11-23 2018-05-31 에스케이케미칼 주식회사 중동호흡기증후군 코로나바이러스 s 단백질 면역원 조성물 및 이의 제작 방법
KR102167727B1 (ko) * 2017-06-21 2020-10-20 경희대학교 산학협력단 드로소필라 멜라노개스터 s2를 이용한 메르스 항원 단백질 생산방법
WO2019023196A1 (en) 2017-07-24 2019-01-31 Novavax, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING RESPIRATORY DISEASE
KR101895228B1 (ko) * 2017-08-23 2018-10-30 대한민국 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 스파이크 단백질에 대한 단일클론항체 및 이의 용도
IL305911B1 (en) 2018-03-19 2024-09-01 Novavax Inc Multifunctional nanoparticle vaccines for influenza
US10953089B1 (en) 2020-01-27 2021-03-23 Novavax, Inc. Coronavirus vaccine formulations
AU2021214064A1 (en) * 2020-01-27 2022-08-18 Novavax, Inc. Coronavirus vaccine formulations
US11202753B1 (en) 2020-03-06 2021-12-21 Aquavit Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for generating immune responses in subjects using microchannel delivery devices
CN111484560A (zh) * 2020-03-24 2020-08-04 深圳市华启生物科技有限公司 冠状病毒模型及其应用
CN111450047A (zh) * 2020-03-25 2020-07-28 天津大学 一种mers病毒免疫凝胶制剂的合成方法
WO2021215857A1 (ko) * 2020-04-22 2021-10-28 포항공과대학교 산학협력단 삼량체를 형성하는 코로나-19 바이러스 (covid-19, coronavirus disease 2019)의 재조합 스파이크 단백질 및 식물에서의 상기 재조합 스파이크 단백질의 대량 생산 방법과 이를 기반으로하는 백신조성물 제조 방법
US11129890B1 (en) * 2020-05-19 2021-09-28 Vigene Biosciences, Inc. Non-integrating HIV-1 comprising mutant RT/IN proteins and the SARS-CoV-2 spike protein
CN115838433A (zh) * 2020-10-27 2023-03-24 中国科学院微生物研究所 一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用
WO2022115503A1 (en) * 2020-11-25 2022-06-02 Dupont Nutrition Biosciences Aps Treatment and prevention of coronavirus infection
CN113292640B (zh) * 2021-06-18 2021-12-24 国药中生生物技术研究院有限公司 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1472332A (zh) * 2003-06-03 2004-02-04 中国科学院上海药物研究所 抗SARS－CoV药物作用靶标、药物筛选方法及抗SARS药物
WO2004085633A1 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 The University Of Hong Kong A novel human virus causing severe acute respiratory syndrome (sars) and uses thereof

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1544007A (en) 1921-08-11 1925-06-30 Hughes Arthur Sheridan Toilet partition
US4520019A (en) 1982-04-29 1985-05-28 Ribi Immunochem Research, Inc. Stable composition and preparation thereof
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4505900A (en) 1982-05-26 1985-03-19 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4435386A (en) 1982-05-26 1984-03-06 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4505899A (en) 1982-05-26 1985-03-19 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4436728A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US4911928A (en) 1987-03-13 1990-03-27 Micro-Pak, Inc. Paucilamellar lipid vesicles
US6387373B1 (en) 1993-01-15 2002-05-14 Novavax, Inc. Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants
US5629021A (en) 1995-01-31 1997-05-13 Novavax, Inc. Micellar nanoparticles
US20040121465A1 (en) 2002-02-14 2004-06-24 Novavax, Inc. Optimization of gene sequences of virus-like particles for expression in insect cells
SE0300795D0 (sv) 2003-03-24 2003-03-24 Isconova Ab Composition comprising iscom particles and live micro-organisms
WO2009081285A2 (en) * 2007-12-17 2009-07-02 Medical Research Council Technology Hepatitis c virus antibodies
DK3067064T3 (da) 2008-12-09 2020-06-08 Novavax Inc Modificerede rsv-f-proteiner og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CN102470168A (zh) 2009-07-10 2012-05-23 伊斯克诺瓦公司 新组合物
RU2403063C1 (ru) 2009-08-28 2010-11-10 Автономная некоммерческая организация "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ") Вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004085633A1 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 The University Of Hong Kong A novel human virus causing severe acute respiratory syndrome (sars) and uses thereof
CN1472332A (zh) * 2003-06-03 2004-02-04 中国科学院上海药物研究所 抗SARS－CoV药物作用靶标、药物筛选方法及抗SARS药物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A predicted receptor-binding and critical neutralizing domain in S protein of the novel human coronavirus HCoV-EMC;Jiang SB et al.;《Journal of Infection》;20130531;第66卷(第5期);第464页右栏第2-5段， *
Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV;Ye V.Liu et al.;《Vaccine》;20110930;第29卷(第38期);第6607页第2段第6-10行以及第6610页第3段第1-2行，第6012页第2段第1-7行 *
R9UQ53;Wang N et al.;《EMBL》;20130918;第2-3页 *
中东呼吸综合征冠状病毒感染;段昭君等;《中国病毒病杂志》;20130731;第3卷(第4期);第245-249页 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1225631A1 (zh) 2017-09-15
IL244298A0 (en) 2016-04-21
JP2016536346A (ja) 2016-11-24
RU2685185C2 (ru) 2019-04-16
SG10201802194WA (en) 2018-05-30
RU2016111934A (ru) 2017-10-05
KR102399854B1 (ko) 2022-05-19
CN105555306A (zh) 2016-05-04
BR112016006122A2 (pt) 2017-09-26
BR112016006122B1 (pt) 2023-11-14
CA2922258A1 (en) 2015-03-26
KR20160055164A (ko) 2016-05-17
US10751410B2 (en) 2020-08-25
IL244298B (en) 2021-06-30
SA516370772B1 (ar) 2023-01-08
EP3046579A1 (en) 2016-07-27
US20160206729A1 (en) 2016-07-21
WO2015042373A1 (en) 2015-03-26
RU2016111934A3 (zh) 2018-03-22
MX2016003419A (es) 2016-10-10
SG11201601423SA (en) 2016-04-28
JP6643239B2 (ja) 2020-02-12
CA2922258C (en) 2022-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105555306B (zh) 免疫原性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组合物和方法
CN103282023B (zh) 狂犬病糖蛋白病毒样颗粒(vlp)
CN103865892B (zh) 功能性流感病毒样颗粒(vlp)
CN102307591B (zh) 修饰的rsv f蛋白及其使用方法
CN103002909B (zh) 包含含有至少一个cxxc基序的多肽和异源抗原的药物组合物及其用途
KR20140077169A (ko) 호흡기 세포 융합 바이러스에 대한 재조합 나노입자 ｒｓｖ ｆ 백신
CN101668857A (zh) 嵌合的新城疫病毒vlp
RU2575800C2 (ru) Вирусоподобные частицы (vlp) из гликопротеина вируса бешенства

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant