BR112016006122B1 - COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA COMPREENDENDO UMA NANOPARTÍCULA DO CORONAVÍRUS DA SÍNDROME RESPIRATÓRIA DO ORIENTE MÉDIO (MERS-CoV) - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS E MÉTODOS COM CORONAVÍRUS DA SÍNDROME RESPIRATÓRIA DO ORIENTE MÉDIO (MERS-CoV). A presente invenção descreve nanopartículas contendo proteínas do vírus da MERS em estruturas poliméricas, e composições contendo as nanopartículas formuladas para administração como composições imunogênicas. Além disso, a presente invenção provê construções de vetores que codificam as proteínas, e células hospedeiras contendo os vetores construídos. A invenção também inclui métodos para produzir as nanopartículas e administrá-las a vertebrados, incluindo métodos para induzir respostas imunes à MERS que reduzem ou previnem a infecção pelo vírus.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE CORRELATOS

[001]Este pedido de patente reivindica o benefício deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No 61/880 111, depositado em 19 de setembro de 2013, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente para todos os fins.

Descrição do arquivo de texto submetido por via eletrônica

[002]O conteúdo do arquivo de texto submetido por via eletrônica junto ao presente é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de sequências (Nome do arquivo: NOVV-056/01WO_Seqlist.txt, data de criação: 18 de setembro de 2014, tamanho do arquivo 17.384 megabytes).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003]Os coronavírus podem causar doença em animais como os humanos. A SARS (Síndrome respiratória aguda grave) é um exemplo de tal doença. Recentemente, surgiu um novo coronavírus, o coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV), que está associado com casos fatais em humanos. A Organização Mundial da Saúde (OMS) identificou o MERS-CoV como uma “ameaça à saúde mundial”, e sua presença foi relatada em 21 países no Oriente Médio e na Europa. O MERS-CoV é um vírus respiratório altamente patogênico que provoca dificuldade respiratória grave e potencialmente insuficiência renal nas pessoas infectadas [1, 2].

[004]Os coronavírus prendem-se às membranas celulares, via suas glicoproteínas Spike (Espícula) (S) na superfície do vírion, com o seu receptor cognato em células hospedeiras (por exemplo, dipeptidil peptidase 4 (DPP4), encontrada em várias células humanas, incluindo células do pulmão e do rim). A glicoproteína S consiste em um domínio S1 no N-terminal que contém o domínio de ligação ao receptor (RBD) e um domínio S2 responsável pela fusão vírus-célula. O RBD do MERS-CoV é constituído por um domínio central que foi co-cristalizado com a proteína DPP4 humana, mostrando que interage com as lâminas 4 e 5 da DPP4 [11]. Em outros coronavírus, inclusive no SARS-CoV, anticorpos contra o RBD são capazes de neutralizar e inibir o crescimento do vírus in vitro [12-14]. Em modelos com SARS-CoV em camundongos, anticorpos neutralizantes induzidos por vacina e transferidos passivamente comprovaram que são eficazes em inibir a patogênese pulmonar e o óbito [15]. No entanto, há relatos de Intensificação da Infecção Dependente de Anticorpos (Antibody Dependent Enhancement ou ADE, em inglês) em células imunes humanas para o CoV associado à SARS in vitro embora a sua significância clínica in vivo seja desconhecida.

[005]Plasma e/ou imunoglobulina humanos na fase de convalescência têm sido utilizados eficazmente para prevenir e tratar muitos agentes infecciosos virais [16]. O sistema de saúde pública da Inglaterra e o Consórcio Internacional de Infecções Respiratórias Agudas Graves e Emergentes (International Severe Acute Respiratory & Emerging Infection Consortium, ISARIC) identificaram a imunoterapia passiva com anticorpos neutralizantes (incluindo plasma convalescente) como uma abordagem para o tratamento de MERS-CoV que justifica a prioridade de estudo. No entanto, a produção de grandes quantidades de plasma e/ou imunoglobulinas humanas anti- patógeno com anticorpos de alta afinidade e avidez requer atualmente doações por humanos convalescentes, que pode limitar a disponibilidade generalizada desses produtos derivados de humanos por uma série de motivos culturais, ligados à infraestrutura e logísticos. Há necessidade de meios alternativos para produzir rapidamente imunoglobulina policlonal humana específica para prevenir e tratar agentes infecciosos, inclusive MERS-CoV.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006]A presente invenção descreve composições e métodos para simular respostas imunes contra infecção pelo coronavírus (CoV) que causa a síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV). A presente invenção provê composições que são imunogênicas e proporcionam proteção contra infecção pelo MERS-CoV. Vantajosamente, as composições induzem anticorpos neutralizantes contra o MERS- CoV e podem ser utilizadas como vacinas.

[007]A presente invenção também provê um método para induzir imunidade substancial contra infecção viral em um animal suscetível ao MERS-CoV, compreendendo administrar ao menos uma dose eficaz da vacina incluindo uma nanopartícula do MERS-CoV. Em uma modalidade, o referido método compreende administrar a um animal a referida nanopartícula por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.

[008]Em aspectos, a nanopartícula contém somente um tipo de proteína do MERS-CoV. Em aspectos especiais, a única proteína é uma proteína Spike (S).

[009]Em um aspecto, a invenção provê uma composição imunogênica compreendendo uma nanopartícula do MERS-CoV, em que a nanopartícula compreende ao menos um trímero de um polipeptídeo Spike. Em outra modalidade, a nanopartícula compreende pelo menos cinco trímeros a cerca de 30 trímeros do polipeptídeo Spike. Em outra modalidade, a nanopartícula compreende pelo menos dez trímeros a cerca de 20 trímeros do polipeptídeo Spike. Em uma modalidade, a concentração da nanopartícula é pelo menos de 20 μg/mL a cerca de 60 μg/mL. Em outra modalidade, a concentração da nanopartícula é pelo menos de 30 μg/mL a cerca de 50 μg/mL. Em mais uma modalidade, o polipeptídeo Spike compreende a SEQ ID NO: 2. Em ainda mais uma modalidade, o polipeptídeo Spike consiste na SEQ ID NO: 2.

[010]Em outro aspecto, a invenção provê um método para produzir um anticorpo de alta afinidade, compreendendo administrar a um animal uma composição imunogênica compreendendo uma nanopartícula do MERS-CoV, em que a nanopartícula compreende ao menos um trímero de um polipeptídeo Spike, coletar soro e/ou plasma do animal e purificar o anticorpo do soro e/ou plasma. Em uma modalidade, o método compreende ainda a administração de um adjuvante. Em mais uma modalidade, o adjuvante é selecionado a partir do grupo constituído por Montanide ISA 206, Quil A, Alumen, adjuvante de Freund, adjuvante incompleto de Freund e adjuvantes à base de hidróxido de alumínio. Em uma modalidade, o animal é bovino ou equino. Em mais uma modalidade, o animal bovino ou equino é um animal transgênico.

[011]Em uma modalidade, o anticorpo produzido pela imunização de um animal com a nanopartícula possui uma KD entre 10-8 e 10-15. Em mais uma modalidade, o anticorpo possui uma KD entre aproximadamente 10-12 e 10-14 ou entre aproximadamente 10-13 e 10-14.

[012]Em ainda outro aspecto, a invenção compreende ainda administrar o anticorpo de alta afinidade produzido pelo método a um humano.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[013]A Figura 1 ilustra a estrutura do coronavírus.

[014]A Figura 2 ilustra partículas vacinais obtidas realizando os métodos descritos nesta invenção.

[015]A Figura 3 ilustra a ligação do anticorpo contra as nanopartículas VLPs do CoV associado à MERS CoV e as nanopartículas VLPs do CoV associado à SARS, ora descritas, pelo anticorpo anti-MERS e pelo anticorpo anti-SARS, respectivamente.

[016]A Figura 4 ilustra micrográficos eletrônicos das nanopartículas VLPs do CoV associado à MERS e das nanopartículas VLPs do CoV associado à SARS CoV, ora descritas.

[017]A Figura 5 ilustra um protocolo de imunização para as nanopartículas VLPs do CoV associado à MERS e as nanopartículas VLPs do CoV associado à SARS, ora descritas, em diferentes períodos de tempo, doses diferentes e com e sem adjuvante.

[018]A Figura 6 ilustra partículas vacinais obtidas realizando os métodos aqui descritos. As proteínas Spike da MERS são mostradas montadas em trímero de micelas proteína-proteína de 26 nm.

[019]A Figura 7 ilustra os resultados de neutralização após a imunização com as nanopartículas VLPs do MERS-CoV e as nanopartículas VLPs do SARS-CoV ora descritas em camundongos. O adjuvante M matriz é especialmente eficaz.

[020]A Figura 8 ilustra uma sequência de nucleotídeos com códons otimizados da proteína Spike do MERS-CoV.

[021]A Figura 9 ilustra uma sequência de aminoácidos da proteína Spike do MERS-CoV.

[022]A Figura 10A-C mostra uma produção de anticorpos específicos contra a proteína Spike da MERS e títulos pelo ELISA. O Painel A mostra a estratégia de Vacinação (v indica o número de vacinas aplicadas; por exemplo, v1 é a primeira vacina, v2 é a segunda vacina, etc.). O Painel B mostra os títulos de anticorpos contra a proteína Spike recombinante do MERS-CoV nas amostras de soro de animais Tc individuais durante o período de imunização, conforme medidos por ELISA. O valor do título (unidas/mL) é definido como a diluição mais alta de amostra de soro, na qual a leitura de OD450 era 2,5 vezes mais alta do que a do branco. O Painel C mostra os títulos de anticorpo contra a proteína Spike recombinante do MERS-CoV em SAB-300 e SAB-301. O valor de atividade do título (unidades/mg) é definido como a diluição mais alta de 1 mg de anticorpo na qual a leitura de OD450 era 2,5 vezes mais alta do que a do branco.

[023]A Figura 11A-B mostra os resultados de um ensaio de neutralização por redução da fluorescência. O Painel A mostra soros bovinos vacinados que foram testados quanto à neutralização pelo ensaio FRNT50. A massa (μg) de soro necessária para 50% de inibição do MERS-CoV detectada é apresentada no gráfico para cada amostra. A infecção foi quantificada após pré-tratamento do MERS-CoV com uma diluição dos soros. Depois da infecção, as células foram fixadas e marcadas com anticorpo anti-spike para quantificar o nível na qual somente 50% das células foram infectadas em comparação a soros simulados. O Painel B mostra os resultados do ensaio FRNT50 para SAB-300 e SAB-301, que foram analisados quanto à capacidade com que inibiriam a infecção por MERS-CoV em células Vero. O anticorpo Anti-Spike purificado de coelho com afinidade pelo antígeno foi utilizado como o controle positivo nesses ensaios FRNT50. Estatística: Teste T não pareado com correção de Welch, pressupondo distribuição gaussiana. Não foi encontrada significância. As barras são os IC de 95%.

[024]A Figura 12A-B mostra ensaios de neutralização de MERS-CoV. O Painel A mostra SAB-300 e SAB-301 que foram testados quanto a sua capacidade para neutralizar MERS-CoV, pelo ensaio de TCID50 inserido no gráfico em percentual do título do vírus, quando comparado a hIgG purificada de controle negativo. Uma porcentagem mais alta significa menos inibição da infecção. O Painel B mostra intensificação dependente de anticorpos de SAB-300 e SAB-301 no MERS-CoV. RNA do MERS-CoV previamente incubado com SAB-300 e SAB-301, em 48 horas após a infecção, foi analisado quanto à quantidade de transcrito específico de MERS-CoV e mostrado no gráfico em expressão relativa (fold change) quando comparado a amostras simuladas. n.s. significa não significativo.

[025]A Figura 13A-B mostra a inibição da replicação de MERS-CoV in vivo. SAB- 300 (A) ou SAB-301 (B) foi transferido para camundongos BALB/c transduzidos com Ad5-hDPP4 (6 semanas, fêmeas) por via intraperitoneal 12 horas antes da infecção pelo MERS-CoV. Os camundongos foram então infectados com 1x105 PFU de MERS-CoV por via intranasal. Os títulos do vírus nos pulmões foram medidos nos momentos indicados. Os títulos são expressos em PFU/g de tecido. n = 3 camundongos/grupo/momento. *P <0,05 em comparação ao grupo Sem Tratamento; P <0,05 em comparação ao grupo Ab Controle.

[026]A Figura 14 mostra a cinética de ligação da proteína S do MERS-CoV em relação à IgG humana derivada de Tc bovina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[027]Deve ser entendido que formas no singular, como “um”, “uma”, “o” e “a”, são usadas por todo este pedido de patente por conveniência, contudo, exceto quando o contexto ou uma afirmação explícita indicar o contrário, as formas no singular destinam-se a incluir o plural. Além disso, deve ser entendido que todo artigo de periódicos, patentes, pedidos de patente, publicações e os semelhantes ora citados são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente e para todos os efeitos. Deve-se entender que todas as faixas numéricas incluem todo e qualquer ponto numérico dentro da faixa numérica, e ser interpretado como se estas recitassem todo e qualquer ponto numérico individualmente. Os pontos finais de todas as faixas direcionadas ao mesmo componente ou propriedade são inclusivos, e o que se pretende é que possam ser combinados independentemente.

[028]“Aproximadamente” inclui todos os valores tendo substancialmente o mesmo efeito, ou fornecendo substancialmente o mesmo resultado, bem como o valor de referência. Assim, a faixa abrangida pelo termo “aproximadamente” variará dependendo do contexto no qual o termo é utilizado, por exemplo, o parâmetro com o qual o valor de referência está associado. Dessa forma, dependendo do contexto, “aproximadamente” pode significar, ±15%, ±10%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1% ou ± menos de 1%. De modo importante, todas as recitações de um valor de referência precedidas pelo termo “aproximadamente” destinam-se também a ser uma recitação do valor de referência sozinho.

[029]Neste relatório descritivo, o termo “baculovírus”, também conhecido como Baculoviridae, refere-se a uma família de vírus envelopados com DNA que infectam artrópodes, cujos membros podem ser utilizados como vetores de expressão para a produção de proteínas recombinantes em culturas de células de inseto. O vírion contendo um ou mais nucleocapsideos em forma de bastonete, compreendendo uma molécula de DNA de fita dupla, circular, extremamente enrolado (Mr 54 x 106154 x 106). O vírus utilizado como vetor é geralmente o vírus da poliedrose nuclear (NVP) Autographa californica. A expressão dos genes introduzidos está sob o controle do forte promotor que normalmente regula a expressão do componente proteico de poliedros da grande inclusão nuclear nos quais os vírus se encaixam nas células infectadas.

[030]Neste relatório descritivo, o termo “derivado de” refere-se à origem ou fonte, e pode incluir moléculas naturais, recombinantes, não purificadas ou purificadas.

[031]Neste relatório descritivo, o termo “estrutura macromolecular de proteínas” refere-se à construção ou ao arranjo de uma ou mais proteínas.

[032]Neste relatório descritivo, o termo “vacina” refere-se a um preparado de patógenos mortos ou enfraquecidos, ou de determinantes antigênicos derivados que são utilizados para induzir a formação de anticorpo ou imunidade contra o patógeno. Aplica-se uma vacina para conferir imunidade contra a doença, por exemplo, MERS que é causada pelo vírus CoV associado à MERS, ou SARS, que é causada pelos vírus CoV associado à SARS CoV. A presente invenção provê composições vacinais que são imunogênicas e que conferem proteção. Além disso, o termo “vacina” também se refere a uma suspensão ou solução de um imunógeno (por exemplo, Nanopartícula VLP) que é administrado a um vertebrado para produzir imunidade protetora, ou seja, imunidade que reduz a gravidade da doença associada com a infecção.

[033]Neste relatório descritivo, o termo “imunidade substancial” refere-se a uma resposta imune na qual, quando as nanopartículas são administradas a um vertebrado, há indução do sistema imune no referido vertebrado, resultando na prevenção da infecção, melhora da infecção ou redução de pelo menos um sintoma relacionado à infecção viral no referido vertebrado.

[034]Neste relatório descritivo, o termo “adjuvante” refere-se a um composto que, quando utilizado em combinação com um imunógeno específico (por exemplo, uma nanopartícula VLP) em uma formulação, aumenta ou de outra forma altera ou modifica a resposta imune resultante. Modificação da resposta imune inclui intensificar ou ampliar a especificidade de qualquer uma ou de ambas, a resposta imune de anticorpos e a celular. Modificação da resposta imune também pode significar diminuir ou suprimir certas respostas imunes específicas para o antígeno.

[035]Neste relatório descritivo, o termo “estimulador imune” refere-se a um composto que intensifica uma resposta através de mensageiros químicos do próprio corpo (citocinas). Essas moléculas compreendem várias citocinas, linfocinas e quimiocinas com atividades imunoestimulatórias, imunopotencializadoras e pró- inflamatórias, como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); fatores de crescimento (por exemplo, fator estimulante de colônias (CSF) de granulócitos-macrófagos (GM)); e outra moléculas imunoestimulatórias, como fator inflamatório dos macrófagos, ligante Flt3, B7.1; B7.2, etc. Moléculas estimuladoras do sistema imune podem ser administradas na mesma formulação, como as nanopartículas VLPs, ou podem ser administradas separadamente. A proteína ou um vetor de expressão que codifica a proteína podem ser administrados para produzir um efeito imunoestimulatório.

[036]Neste relatório descritivo, uma “dose eficaz” geralmente se refere àquela quantidade da nanopartícula suficiente para induzir imunidade, prevenir e/ou melhorar a infecção viral ou para reduzir pelo menos um sintoma da infecção e/ou reforçar a eficácia de outra dose de uma nanopartícula. Uma dose eficaz pode referir-se à quantidade da nanopartícula suficiente para retardar ou minimizar o aparecimento de uma infecção. Uma dose eficaz pode também se referir à quantidade da nanopartícula que proporciona um benefício terapêutico no tratamento ou no controle da infecção. Além disso, uma dose eficaz é a quantidade que diz respeito às nanopartículas isoladas, ou combinadas com outras terapias, que proporciona um benefício terapêutico no tratamento ou controle de uma infecção viral. Uma dose eficaz pode também ser a quantidade suficiente para intensificar a própria resposta imune do indivíduo (por exemplo, de um humano) contra uma exposição subsequente ao vírus. Os níveis de imunidade podem ser monitorados, por exemplo, medindo a quantidades de anticorpos secretores neutralizantes e/ou séricos, por exemplo, ensaio de neutralização em placa, fixação do complemento, imunoenzimático ou de microneutralização. No caso de uma vacina, uma “dose eficaz” é aquele que previne uma doença ou reduz a gravidade de sintomas.

[037]Neste relatório descritivo, o termo “resposta de anticorpos substancialmente protetora” refere-se a uma resposta imune mediada por anticorpos contra um vírus, que é exibida por um vertebrado (por exemplo, um humano), que previne ou melhora uma infecção ou que reduz pelo menos um de seus sintomas. Nanopartículas podem estimular a produção de anticorpos, por exemplo, anticorpos neutralizantes, que bloqueiam a entrada de vírus em células, bloqueiam a replicação do referido vírus ao se ligarem ao vírus e/ou protegem as células hospedeiras da infecção e destruição.

[038]Neste relatório descritivo, o termo “resposta celular substancialmente protetora” refere-se a uma resposta imune que é mediada por linfócitos T e/ou por outros leucócitos contra vírus, exibida por um vertebrado (por exemplo, um humano), que previne ou melhora uma infecção que reduz pelo menos um de seus sintomas. Um aspecto importante da imunidade celular envolve uma resposta específica para um antígeno pelas células T citolíticas (“CTL”). As CTLs possuem especificidade por antígenos peptídicos, apresentados em associação com proteínas codificadas pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e expressos nas superfícies de células. As CTLs ajudam a induzir e promover a destruição de micróbios intracelulares, ou a lise de células infectadas por tais micróbios. Outro aspecto da imunidade celular envolve uma resposta específica para um antígeno por células T helper (auxiliar). As células T helper atuam ajudando a estimular a função e o enfoque da atividade de células efetoras não específicas contra células exibindo antígenos peptídicos em associação com moléculas MHC em suas superfícies. Uma “resposta imune celular” também se refere à produção de citocinas, quimiocinas e de outras moléculas produzidas por células T ativadas e/ou outros leucócitos, inclusive aqueles derivados de células T CD4+ e CD8+.

[039]Neste relatório descritivo, o termo “imunidade substancial em base populacional” refere-se à imunidade resultante de nanopartículas administradas a indivíduos em uma população. A imunidade no referido indivíduo na referida população resulta na prevenção, melhora da infecção ou na redução de pelo menos um sintoma relacionado à infecção viral no referido indivíduo, e previne a disseminação do referido vírus para outros na população. O termo população é definido como grupo de indivíduos (por exemplo, crianças em idade escolar, idosos, indivíduos sadios, etc.) e pode compreender uma área geográfica (por exemplo, cidades específicas, escolas, bairros, local de trabalho, país, estado, etc.).

[040] Neste relatório descritivo, o termo “formulação antigênica” ou “composição antigênica” refere-se a um preparado que, quando administrado a um vertebrado, especialmente um mamífero, induzirá uma resposta imune.

[041]Neste relatório descritivo, o termo “vertebrado” ou “indivíduo” ou “paciente” refere-se a qualquer membro do subfilo dos cordados, incluindo, entre outros, humanos e outros primatas, inclusive primatas não humanos, como chimpanzés e outras espécies de gorilas e macacos; animais agrícolas como bois, ovelhas, suínos, cabras e cavalos; mamíferos domésticos como cães e gatos; animais de laboratório incluindo roedores como camundongos, ratos e cobaias; aves, incluindo aves domésticas, selvagens e de caça como galinhas, perus e outras galináceas, patos, gansos, e os semelhantes também são exemplos não limitantes. Os termos “mamíferos” e “animais” estão incluídos nessa definição. Indivíduos adultos e recém- nascidos destinam-se a serem abrangidos.

Nanopartículas VLPs

[042]Um dos objetivos no desenvolvimento de vacinas é a produção de vacinas que estimulem o sistema imune contra um patógeno, mas que não sejam por si só infecciosas. Isso conduziu o uso de vírions inteiros em vacinas para longe de composições mais minimalistas. Contudo, essas composições minimalistas apresentam os seus próprios obstáculos e, especialmente, muitas vezes exibem menor imunogenicidade requerendo o uso de adjuvantes e sistemas que reforçam a resposta imune. Nanopartículas compreendendo proteínas virais nativas apresentam-se como um meio para imunização que aproveita a habilidade natural dos vírus para penetrar na célula e estimular uma resposta imune.

[043]As nanopartículas, como aqui descritas, são um tipo especial de partículas virais (VLP). As nanopartículas contêm proteínas virais, mas não contêm qualquer material genético não viral e, assim, não são por si só infecciosas. As nanopartículas são formadas por automontagem de proteínas virais produzidas por recombinação e estimulam respostas imunes especialmente úteis. Sem estar preso à teoria, acredita- se que o tamanho, a estrutura repetitiva e a natureza particulada contribuem para as respostas imunes potentes. De notável, a resposta imune potente pode ser obtida mesmo na ausência de um adjuvante.

Estrutura da nanopartícula

[044]As nanopartículas contêm proteínas virais, tais como proteínas do capsídeo viral ou do revestimento, dispostas em forma polimérica. Tipicamente, o polímero é pelo menos um trímero de proteínas virais. Em outros aspectos, o polímero pode conter mais de três monômeros de proteínas virais. Por exemplo, o polímero pode conter 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 unidades monoméricas (designadas como 4-mer, 5-mer, 6-mer e assim por diante). Em aspectos específicos, os polímeros podem se montar em estruturas de ordem superior. Assim, por exemplo, as nanopartículas podem conter pelo menos aproximadamente 3 polímeros, pelo menos 5 polímeros, pelo menos 10 polímeros, pelo menos 15 polímeros, pelo menos 20 polímeros ou pelo menos cerca de 30 polímeros. Em aspectos específicos, a nanopartícula contém entre 5 e 15 polímeros, entre 5 e 20 polímeros ou entre 5 e 30 polímeros. Em ainda outros aspectos, a nanopartícula contém entre 5 e 200 polímeros, entre 10 e 200 polímeros ou entre 10 e 50 polímeros. Assim, em exemplos específicos, as nanopartículas podem conter de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 trímeros.

[045]Em geral, as estruturas mais complexas de ordem superior podem ser obtidas aumentando a concentração de proteína. Em um exemplo, concentrações proteicas mais baixas produzem nanopartículas compreendendo aproximadamente 5 polímeros, enquanto concentrações proteicas mais altas (por exemplo, 30-50 μg/mL) produzem nanopartículas compreendendo cerca de 10 a 20 polímeros. Em um exemplo não limitante, a concentração das nanopartículas é pelo menos cerca de 10 μg/mL, cerca de 20 μg/mL, cerca de 30 μg/mL, cerca de 40 μg/mL, cerca de 50 μg/mL, cerca de 60 μg/mL, cerca de 100μg/mL, cerca de 200 μg/mL ou cerca de 500 μg/mL. Especificamente, a concentração das nanopartículas pode ser entre cerca de 10 μg/mL a 1 mg/mL, entre cerca de 20 μg/mL a 500 μg/mL, entre cerca de 30 μg/mL e 100 μg/mL ou entre cerca de 30 μg/mL e 50 μg/mL.

Proteínas em nanopartícula

[046]As nanopartículas ora descritas podem compreender qualquer proteína do MERS-CoV, incluindo, entre outras, a proteína Spike (S), a proteína da Membrana (M), a proteína do Nucleocapsídeo (N) e a proteína do Envelope (E), ou uma combinação destas. As proteínas podem ser obtidas ou derivadas de qualquer cepa, clado ou espécie de MERS-CoV. As nanopartículas podem compreender uma ou mais proteínas de um ou mais isolados, cepas, clados e/ou espécies de MERS-CoV. Em uma modalidade, as proteínas são obtidas ou derivadas da cepa Jordan- N3/2012 (GenBank KC776174.1) de MERS-CoV. Em outra modalidade, as proteínas são obtidas ou derivadas da cepa Munich_2013 de MERS-CoV. Em outra modalidade, as proteínas são obtidas ou derivadas da cepa Al-Hasa_1_2013 de MERS-CoV. As proteínas compreendidas em nanopartículas podem também ser derivadas ou obtidas a partir de uma variedade de outras fontes, inclusive, entre outros, a cepa Hafr-Al-batin_1_2013, a cepa Bisha_1_2012, a cepa Qatar_3_2013, a cepa Camel_Egypt_2013, vírus do clado A de MERS-CoV, vírus do clado B de MERS-CoV, as cepas intimamente relacionadas ao coronavírus do morcego HKU4 e HKU5 e/ou outros coronavírus intimamente relacionados. As proteínas do MERS- CoV podem também ser produzidas sinteticamente ou por recombinação in vitro. Em uma modalidade, as proteínas são produzidas por recombinação em células de insetos, como as células Sf9.

[047]Em uma modalidade, o polímero pode compreender um ou mais tipos diferentes de proteínas do MERS-CoV. Em mais uma modalidade, o polímero compreende um único tipo de proteína do MERS-CoV. Em uma modalidade preferida, o polímero compreende somente proteína Spike. Em modalidade, a proteína em um polímero consiste em proteína Spike. Em mais uma modalidade, a nanopartícula não contém proteína da membrana ou do nucleocapsídeo. Em outra modalidade adicional, a nanopartícula não compreende quaisquer sequências do ácido nucleico viral.

[048]Em uma modalidade, a nanopartícula compreende uma proteína Spike ou um fragmento desta. Em outra modalidade adicional, a nanopartícula compreende um trímero de proteínas Spike ou fragmentos destas. Em outra modalidade, a nanopartícula compreende pelo menos um polímero de proteína Spike codificado pela SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a nanopartícula compreende pelo menos um polímero de proteína Spike incluindo a SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a nanopartícula compreende pelo menos um polímero de proteína Spike consistindo na SEQ ID NO: 2. Em mais uma modalidade, a nanopartícula compreende pelo menos um polímero do domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína Spike.

[049]As nanopartículas podem ser preparadas como descrito na técnica (por exemplo, como descrito em US20100239617, publicado em 23 de setembro de 2010 e aqui incorporado para todos os fins). Os textos gerais que descrevem técnicas da biologia molecular que se se aplicam a presente invenção, tais como clonagem, mutação, cultura celular e os semelhantes, incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Califórnia (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 (“Sambrook”) e Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, uma empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (“Ausubel”). Esses textos descrevem a mutagênese, o uso de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes relacionados à clonagem e à mutação de proteínas. Assim, a invenção também abrange usar métodos conhecidos da engenharia de proteínas e da tecnologia do DNA recombinante para melhorar ou alterar as características das proteínas expressas sobre ou nas nanopartículas. As técnicas incluem, entre outras, mutagênese sítio-dirigida, mutagênese pontual aleatória, recombinação homóloga (embaralhamento de DNA (DNA shuffling)), mutagênese usando modelos contendo uracila, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese de DNA modificada com fosforotioato, mutagênese usando DNA duplex com lacunas ou as semelhantes. Métodos adequados adicionais incluem reparo de pareamentos incorretos pontuais, mutagênese usando cepas hospedeiras deficientes em reparo, restrição-seleção e restrição-purificação, mutagênese por deleção, mutagênese por síntese total de genes, reparo de quebra de fita dupla e os semelhantes. A mutagênese, por exemplo, envolvendo construções quiméricas também está incluída na presente invenção. Em uma modalidade, a mutagênese pode ser guiada por informações conhecidas da molécula natural ou da molécula natural alterada ou mutante, por exemplo, sobre sequência, comparações de sequências, propriedades físicas, estrutura cristalina ou os semelhantes.

Proteínas SPIKE da MERS

[050]Proteínas Spike ou seus fragmentos são obtidos ou derivados de isolados, cepas, clados e/ou sequências do MERS-CoV. Alternativamente, podem ser produzidas por recombinação ou sinteticamente. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos adequada do MERS-CoV é descrita sob o No de Acesso no Genbank AGN70962 (Figura 9 (SEQ ID NO: 2)). Em uma modalidade, a proteína Spike ou seu fragmento é obtido de uma cepa Al-Hasa do MERS-CoV.

[051]A invenção provê variantes das proteínas do MERS-CoV. As variantes podem conter alterações nas sequências de aminoácidos das proteínas constituintes. O termo “variante”, com respeito a um polipeptídeo, refere-se a uma sequência de aminoácidos que está alterada em um ou mais aminoácidos em relação à sequência de referência. A variante pode ter mudanças “conservadoras”, em que um aminoácido substituído possui propriedades estruturais ou químicas semelhantes, por exemplo, a substituição de leucina por isoleucina. Alternativamente, uma variante pode ter mudanças “não conservadoras”, por exemplo, substituição de uma glicina por um triptofano. Variações análogas mínimas podem também incluir a deleção ou inserção de aminoácidos, ou ambas. A orientação para determinar quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou excluídos sem eliminar a atividade biológica ou imunológica pode ser encontrada utilizando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, o software DNASTAR.

[052]Variantes naturais podem ocorrer em decorrência de variações antigênicas graduais (antigenic drift). As variações antigênicas graduais são mudanças pequenas nas proteínas virais que acontecem continuamente ao longo do tempo. Assim, uma pessoa infectada por uma determinada cepa de MERS-CoV desenvolve anticorpos contra aquele vírus, mas, à medida que cepas mais novas do vírus surgem, os anticorpos contra as cepas mais antigas não reconhecem mais o vírus mais novo e a infecção pode voltar a ocorrer. Essas proteínas naturais e variantes de RBD do MERS-CoV podem ser utilizadas para produzir as nanopartículas ora descritas.

[053]Em algumas modalidades, as mutações contêm alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas que não alteram as propriedades ou atividades da proteína codificada ou como as proteínas são criadas. Variantes de nucleotídeos podem ser produzidas por uma variedade de motivos, por exemplo, otimizar a expressão de códons para um determinado hospedeiro (trocar códons no mRNA humano para aqueles preferidos por células de inseto como as células Sf9). Ver a publicação do Pedido de Patente U.S. 2005/0118191, aqui incorporada, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente para todos os fins. Em um aspecto especial, a proteína preferida é codificada por uma sequência de nucleotídeos com códons otimizados conforme mostrada na Figura 8 (SEQ ID NO: 1). O ácido nucleico e os polipeptídeos podem ser pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos às sequências mostradas nas Figuras 8 e 9 (SEQ ID NOS: 1 e 2).

[054] Além disso, os nucleotídeos podem ser sequenciados para assegurar que regiões corretas de codificação foram clonadas e não contém quaisquer mutações indesejadas. Os nucleotídeos podem ser subclonados em um vetor de expressão (por exemplo, baculovírus) para expressão em qualquer célula. O precedente é somente um exemplo da maneira como as proteínas virais podem ser clonadas. O técnico no assunto entende que métodos adicionais estão disponíveis e são possíveis.

[055]Esta invenção também provê construções e métodos que aumentarão a eficiência de produção das nanopartículas. Por exemplo, remover sítios de clivagem de proteínas a fim de aumentar a expressão proteica. Outros métodos compreendem a adição de sequências líderes para o transporte mais eficiente. Por exemplo, uma sequência de sinalização heteróloga pode ser fundida a uma proteína da MERS. Em uma modalidade, a sequência de sinalização pode ser derivada do gene de uma célula de inseto. Em outra modalidade, o peptídeo de sinalização é a sequência de sinalização de quitinase, que funciona eficientemente em sistemas de expressão de baculovírus. Em outra modalidade, a troca de sequências líderes por outras entre as proteínas pode melhorar o transporte das proteínas.

[056]Vetores adequados que codificam proteínas, ou fragmentos destas, do MERS-CoV podem ser utilizados. O vetor pode ser, por exemplo, um fago, plasmídeo, vetor, viral ou retroviral. Em uma modalidade, o vetor é um vetor baculovírus recombinante. As construções e/ou vetores que codificam genes devem ser ligadas operativamente a um promotor apropriado, como o promotor de poliedrina do AcMNPV (ou de outro baculovírus), o promotor PL do fago lambda, os promotores lac, phoA e tac de E. coli, os promotores precoce e tardio do SV40 e promotores de LTRs retrovirais são exemplos não limitantes. Outros promotores adequados serão bem conhecidos pelo técnico no assunto, dependendo da célula hospedeira e/ou da taxa de expressão desejada. As construções de expressão conterão ainda sítios para início, término de transcrição e, na região transcrita, um sítio de ligação a ribossomos para tradução. A porção codificadora dos transcritos expressos pelas construções incluirão de preferência um códon iniciador de tradução, no início, e um códon de terminação posicionado na extremidade do polipeptídeo a ser traduzido.

[057]Os vetores de expressão incluirão de preferência pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem genes de dihidrofolato redutase, G418 ou de resistência à neomicina, para cultura de células eucarióticas, e genes de resistência à tetraciclina, canamicina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias. Entre os vetores preferidos estão vetores de vírus, como baculovírus, poxvírus (por exemplo, vírus Vaccinia, vírus da varíola aviária, vírus da varíola de canários, vírus da varíola de aves domésticas, vírus da varíola de guaxinins, vírus da varíola de suínos, etc.), adenovírus (por exemplo, adenovírus canino), herpesvírus e retrovírus. Vetores bacterianos podem também ser usados. Os vetores bacterianos exemplares incluem pQE70, pQE60 e pQE-9, vetores pBluescript, vetores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Entre os vetores eucarióticos preferidos estão pFastBac1 pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 e pSG, pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL. Outros vetores adequados serão facilmente visíveis para o técnico no assunto.

[058]Vetores, por exemplo, vetores compreendendo polipeptídeos do MERS-CoV, podem ser transfectados em células hospedeiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a introdução de ácidos nucleicos em células eucarióticas pode ser por co-precipitação com fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção e transfecção empregando reagentes à base de poliamina para a transfecção. Em uma modalidade, o referido vetor é um baculovírus recombinante.

[059]Vetores recombinantes como aqueles descritos acima podem ser utilizados para transfectar, infectar ou transformar, e podem expressar proteínas em células eucarióticas e/ou células procarióticas. Entre as células hospedeiras eucarióticas estão células hospedeiras de leveduras, insetos, aves, plantas, C. elegans (ou nematódeo) e de mamíferos. Entre os exemplos de células de insetos encontram-se as células de Spodoptera frugiperda (Sf), por exemplo, Sf9, Sf21, as células de Trichoplusia ni, por exemplo, células High Five, e as células S2 de Drosophila. Os exemplos de células hospedeiras de fungos (incluindo leveduras) são de S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K. lactis), de espécies de Candida incluindo C. albicans e C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris e Yarrowia lipolytica. Os exemplos de células de mamíferos são as células COS, células de rim de hamster neonato, células L de camundongo, células LNCaP, células de ovário do hamster chinês (CHO), células renais embrionárias humanas (HEK) e células do macaco verde africano, células CV1, células HeLa, células MDCK, células Vero e Hep-2. É possível também utilizar oócitos de Xenopus laevis ou outras células de origem anfíbia. As células hospedeiras procarióticas incluem células bacterianas, por exemplo, de E. coli, B. subtilis e de micobactérias.

[060]Métodos para cultivar células, criadas para produzir nanopartículas, incluem, entre outros, técnicas de cultura celular em batelada, alimentada por batelada, contínua e por perfusão. Cultura celular significa o crescimento e a propagação de células em um biorreator (uma câmara de fermentação) onde as células propagam- se e expressam proteína (por exemplo, proteínas recombinantes) para purificação e isolamento. Tipicamente, a cultura celular é realizada em condições atmosféricas estéreis e de temperatura controlada em um biorreator. Um biorreator é uma câmara usada para cultivar células, na qual as condições ambientais, como temperatura, atmosfera, agitação e/ou pH, podem ser monitoradas. Em uma modalidade, o referido biorreator é uma câmara de aço inoxidável. Em outra modalidade, o referido biorreator é uma bolsa plástica previamente esterilizada (por exemplo, Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ). Em outra modalidade, as referidas bolas plásticas previamente esterilizadas são bolsas de 50 litros a 1000 litros.

[061]As nanopartículas podem então ser isoladas utilizando métodos que conservam a sua integridade, como por centrifugação em gradiente, por exemplo, de cloreto de césio, sacarose e iodixanol, bem como por técnicas padrão de purificação incluindo, por exemplo, cromatografia por troca iônica ou por filtração em gel.

[062]A seguir, é apresentado um exemplo de como nanopartículas podem ser produzidas, isoladas e purificadas. Normalmente, as nanopartículas são produzidas a partir de linhagens de células recombinantes construídas para criar nanopartículas quando as referidas células são cultivadas em cultura celular.

[063]Por exemplo, a produção de nanopartículas pode iniciar semeando células Sf9 (não infectadas) em frascos agitados, permitindo que as células expandam e aumentem de escala à medida que estas crescem e se multiplicam (por exemplo, de um frasco de 125 mL para uma bolsa Wave de 50 litros). O meio usado para cultivar a célula é formulado para a linhagem celular apropriada (de preferência, meios livres de soro, por exemplo, ExCell-420 para insetos, JRH). Em, seguida, as referidas células são infectadas com baculovírus recombinante na multiplicidade de infecção mais eficiente (por exemplo, de 1 a aproximadamente 3 unidades formadoras de placa por célula). Uma vez a infecção tenha ocorrido, as proteínas são expressas a partir do genoma do vírus, se montam em nanopartículas VLPs e são secretadas das células aproximadamente 24 a 72 horas após a infecção. Normalmente, a infecção é mais eficiente quando as células estão no meio da fase de crescimento logarítmico (4-8 x 106 células/mL) e são pelo menos cerca de 90% viáveis.

[064]Alternativamente, as nanopartículas podem ser produzidas, por exemplo, infectando células hospedeiras (por exemplo, Sf9) com um baculovírus recombinante compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam a proteína ou proteínas de interesse do MERS-CoV. As células infectadas são incubadas e colhidas. A proteína do MERS-CoV (por exemplo, proteína Spike) é extraída da membrana celular com um detergente. Em seguida, permite-se às proteínas se montarem naturalmente para formar estruturas (por exemplo, trímeros) que são então purificados. A remoção do detergente durante a purificação permite que as proteínas formem estruturas de ordem superior, tais como nanopartículas compreendendo estruturas múltiplas (por exemplo, nanopartículas micelares proteína-proteína compreendendo trímeros de proteínas). Em geral, o número de estruturas nas nanopartículas é influenciado pela concentração proteica, com concentrações proteicas mais altas produzindo nanopartículas compreendendo números maiores de estruturas (por exemplo, trímeros).

[065]As nanopartículas podem ser colhidas aproximadamente 48 a 96 horas após a infecção, quando os níveis de nanopartículas VLPs no meio da cultura celular estiverem no máximo, mas antes que haja lise celular extensa. A densidade e viabilidade das células Sf9, no momento da colheita, podem ser de aproximadamente 1,5 x 106 células/mL com pelo menos 20% de viabilidade, como mostrado por ensaio de exclusão com corante. Em seguida, o meio é removido e clarificado. NaCl pode ser adicionado ao meio até uma concentração de 0,4 a aproximadamente 1,0 M, de preferência até 0,5 M, para evitar agregação indesejável. A remoção de células e de resíduos celulares do meio de cultura celular contendo nanopartículas pode ser realizada por filtração com fluxo tangencial (TFF) utilizando cartucho filtrante com fibra oca previamente esterilizada de uso único de 0,5 ou 1,00 μm ou um dispositivo similar.

[066]Em seguida, as nanopartículas no meio de cultura que foi clarificado podem ser concentradas por ultrafiltração utilizando um cartucho descartável previamente esterilizado de fibra oca e com limite para massa molecular de 500.000. As nanopartículas concentradas podem ser diafiltradas contra 10 volumes de solução salina com tampão fosfato (PBS), pH 7,0 a 8,0, contendo NaCl 0,5 M, para remover componentes residuais do meio.

[067]As nanopartículas concentradas diafiltradas podem ser ainda purificadas em gradiente descontínuo de sacarose de 20% para 60% em tampão PBS, pH 7,2, com NaCI 0,5 M, por centrifugação a 6.500 x g por 18 horas a aproximadamente 4° C a 10° C. Normalmente, as nanopartículas VLPs formarão uma banda visível distinta entre cerca de 30% e 40% de sacarose ou na interface (em gradiente com etapa de 20% e 60%), e podem ser coletadas no gradiente e armazenadas. Esse produto pode ser diluído para compreender 200 mM de NaCl, no preparo para a etapa seguinte no processo de purificação. Esse produto contem nanopartículas VLPs e pode conter partículas intactas de baculovírus.

[068]A purificação adicional das nanopartículas pode ser realizada por cromatografia de troca aniônica, ou por centrifugação isopícnica em almofada de sacarose a 44%. Na cromatografia de troca aniônica, a amostra do gradiente de sacarose (ver acima) é carregada na coluna contendo um meio um ânion (por exemplo, Matriz Fractogel EMD TMAE) e eluída por meio de um gradiente de sal (aproximadamente, de 0,2 M a 1,0 M de NaCl) que pode separar a nanopartícula de outros contaminados (por exemplo, baculovírus e DNA/RNA). No método de almofada de sacarose, a amostra compreendendo as nanopartículas é adicionada a uma almofada de sacarose a 44% e centrifugada por quase 18 horas a 30.000 g. As nanopartículas formam uma banda no topo de sacarose 44%, enquanto o baculovírus precipita no fundo e outras proteínas contaminantes ficam na camada de sacarose 0% no topo. O pico ou banda de nanopartículas é coletado.

[069]O baculovírus intacto pode ser inativado, se desejado. A inativação pode ser realizada por métodos químicos, por exemplo, formalina ou β-propil lactona (BPL). A remoção e/ou a inativação do baculovírus intacto pode também ser realizada em grande medida utilizando precipitação seletiva e métodos cromatográficos conhecidos na técnica, conforme exemplificados acima. Os métodos de inativação compreendem incubar a amostra contendo as nanopartículas em BPL 0,2% por 3 horas de aproximadamente 25 °C a 27 °C. O baculovírus pode também ser inativado incubando a amostra contendo as nanopartículas em BPL 0,05% a 4 °C por 3 dias, depois a 37 °C por uma hora.

[070] Depois da etapa de inativação/remoção, pode-se submeter o produto compreendendo as nanopartículas a outra etapa de diafiltração para remover qualquer reagente da etapa de inativação e/ou qualquer sacarose residual, e para colocar as nanopartículas no tampão desejado (por exemplo, PBS). A solução compreendendo as nanopartículas pode ser esterilizada por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, filtração estéril) e armazenada na geladeira ou congelador.

[071]As técnicas acima podem ser praticadas em uma variedade de escalas. Por exemplo, frascos em T, frascos agitados, frascos de centrifugação até biorreatores de dimensão industrial. Os biorreatores podem compreender um tanque de aço inoxidável ou uma bolsa previamente esterilizada de plástico (por exemplo, o sistema vendido pela Wave Biotech, Bridgewater, NJ). O técnico no assunto saberá qual é o mais desejável para as suas finalidades.

Formulações farmacêuticas ou de vacinas e administração

[072]As composições farmacêuticas úteis no presente contêm um veículo farmaceuticamente aceitável, incluindo qualquer diluente ou excipiente adequado, o qual inclui qualquer agente farmacêutico que não induza por si só a produção de uma resposta imune nociva ao vertebrado que recebe a composição e que possa ser administrado sem toxicidade indevida junto com a nanopartícula. Neste relatório descritivo, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa ser aprovado por uma agência reguladora do Governo Federal ou de um estado ou estar listado na Farmacopeia dos Estados Unidos, Farmacopeia Europeia ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em vertebrados e, mais especificamente, em humanos.

[073]Em geral, as nanopartículas são administradas em um montante ou quantidade eficaz (como definido acima) suficiente para estimular uma resposta imune contra uma ou mais cepas do vírus MERS-CoV. Essas composições podem ser usadas como vacina e/ou composições antigênicas para induzir uma resposta imune protetora em um vertebrado. As composições podem conter nanopartículas com tipos diferentes de polímeros. Por exemplo, as composições podem conter primariamente trímeros, com o restante sendo composto por polímeros diferentes. Em uma modalidade, as nanopartículas administradas em uma quantidade eficaz para estimular uma resposta imune contra uma ou mais cepas do vírus MERS-CoV compreendem pelo menos de aproximadamente 5 a 100 trímeros, pelo menos cerca de 10 a 90 trímeros, pelo menos cerca de 20 a 50 trímeros, pelo menos cerca de 10 a 30 trímeros ou pelo menos cerca de 10 a 20 trímeros de proteínas do MERS-CoV. Em mais uma modalidade de composição, as nanopartículas administradas compreendem pelo menos aproximadamente 5 a 100 trímeros, pelo menos cerca de 10 a 90 trímeros, pelo menos cerca de 20 a 50 trímeros, pelo menos cerca de 10 a 30 trímeros ou pelo menos cerca de 10 a 20 trímeros de proteína Spike ou de seu fragmento (como RBD).

[074]Em uma modalidade não limitante, a concentração das nanopartículas é pelo menos cerca de 10 μg/mL, cerca de 20 μg/mL, cerca de 30 μg/mL, cerca de 40 μg/mL, cerca de 50 μg/mL, cerca de 60 μg/mL, cerca de 100μg/mL, cerca de 200 μg/mL ou cerca de 500 μg/mL. Em aspectos específicos, a concentração das nanopartículas é entre aproximadamente 10 μg/mL e 1 mg/mL, entre aproximadamente 20 μg/mL e 500 μg/mL, entre aproximadamente 30 μg/mL e 100 μg/mL ou entre aproximadamente 30 μg/mL e 50 μg/mL.

[075]Em outros exemplos, as composições podem conter nanopartículas de ordem superior como 5-mers a 6-mers. Em aspectos específicos, as composições contêm pelo menos 70% de 5-mers a 6-mers, pelo menos 80% de 5-mers a 6-mers ou pelo menos 90% de 5-mers a 6-mers. Em outros aspectos, a composição contém pelo menos 70% de 5-mers a 6-mers, pelo menos 80% de 5-mers a 6-mers ou pelo menos 90% de 5-mers a 6-mers.

[076]Em uma modalidade, as formulações farmacêuticas ora descritas compreendem nanopartículas incluindo uma proteína do MERS-CoV, frequentemente uma proteína Spike, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[077]Em outras modalidades, as composições podem incluir nanopartículas contendo proteínas do MERS-CoV, ou variantes como a variante de RBD, provenientes de cepas diferentes de MERS. Tais composições podem ser administradas para conferir imunidade contra múltiplas cepas diferentes. Em um aspecto uma composição pode conter nanopartículas para proporcionar uma resposta imune contra uma primeira cepa, uma segunda cepa, uma terceira cepa. Em outro aspecto, as nanopartículas podem proporcionar uma resposta imune contra quatro, cinco ou seis cepas. Em outra modalidade, as formulações farmacêuticas compreendem um anticorpo purificado de alta afinidade produzido em um animal que recebeu as nanopartículas.

[078]Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, tampão aquoso isotônico estéril e combinações destes. Uma discussão aprofundada de veículos, diluentes e de outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis é apresentada em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J., versão atual). A formulação deve se adequar ao modo de administração. Em uma modalidade preferida, a formulação é adequada para administração a humanos, de preferência é estéril, não particulada e/ou não pirogênica.

[079]A composição, se desejado, pode também conter quantidades mínimas de agentes hidratantes ou emulsificantes, ou agentes de tamponamento do pH. A composição pode ser uma forma sólida, como um pó liofilizado adequado para reconstituição, uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação prolongada ou pó. A formulação oral inclui veículos padrão, tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc., em graus farmacêuticos.

[080]A invenção também provê uma embalagem ou kit farmacêutico, compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes das formulações vacinais imunogênicas. Em uma modalidade preferida, o kit compreende dois recipientes, um contendo nanopartículas e o outro contendo um adjuvante. Um aviso pode estar associado a tais recipientes, na forma prescrita por uma agência de governo que regulamenta a fabricação, o uso ou a venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, sendo que tal aviso reflete a aprovação pela agência da fabricação, do uso ou da venda para administração humana.

[081]As formulações podem ser embaladas em um recipiente hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou envelope, indicando a quantidade da composição. Em uma modalidade, a composição é fornecida como um líquido, em outra modalidade, como um pó liofilizado seco esterilizado ou concentrado livre de água em um recipiente hermeticamente fechado e que podem ser reconstituídos, por exemplo, com água ou solução salina até a concentração apropriada para administração a um indivíduo. De preferência, a composição é fornecida como um pó liofilizado seco estéril em um recipiente hermeticamente fechado em uma dose unitária de preferência próxima a 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 50 μg, 100 μg, 125 μg, 150 μg ou a 200 μg. Alternativamente, a dose unitária da composição é inferior a aproximadamente 1 μg, (por exemplo, próxima a 0,08 μg, 0,04 μg, 0,2 μg, 0,4 μg , 0,8 μg, próxima ou inferior a 0,5 μg, próxima ou inferior 0,25 μg próxima ou inferior a 0,1 μg), ou próxima ou superior a 125 μg, (por exemplo, próxima ou superior a 150 μg, próxima ou superior a 250 μg ou próxima ou superior a 500 μg). Essas doses podem ser medidas em nanopartículas totais ou em μg de proteína do MERS-CoV (por exemplo, proteína Spike ou seu fragmento). A composição de nanopartículas deve ser administrada dentro de aproximadamente 12 horas, de preferência dentro de aproximadamente 6 horas, dentro de aproximadamente 5 horas, dentro de aproximadamente 3 horas ou dentro de aproximadamente 1 hora depois de ser reconstituída a partir do pó liofilizado.

[082]Em uma modalidade alternativa, uma composição de nanopartículas é fornecida em forma líquida dentro de um recipiente hermeticamente fechado, indicando a quantidade e a concentração da composição de nanopartículas. De preferência, a forma líquida da composição de nanopartículas é fornecida em um recipiente hermeticamente fechado a pelo menos 50 μg/mL, mais preferivelmente a pelo menos cerca de 100 μg/mL, pelo menos cerca de 200 μg/mL, pelo menos 500 μg /mL ou pelo menos 1 mg/mL.

[083]As nanopartículas podem ser administradas a um animal para suscitar uma resposta imune contra o MERS-CoV. Em uma modalidade, o animal é suscetível à infecção pelo MERS-CoV. Em uma modalidade, o animal é um humano. De preferência, a administração das nanopartículas suscita imunidade substancial contra pelo menos uma cepa, isolado, clado e/ou espécie de MERS-CoV. Em uma modalidade, a administração das nanopartículas suscita imunidade substancial contra pelo menos 2 ou mais cepas, isolados, clados e/ou espécies de MERS-CoV. Em mais uma modalidade, a administração das nanopartículas suscita imunidade substancial contra outro coronavírus. Tipicamente, a dose pode ser ajustada dentro dessa faixa com base em, por exemplo, idade, condição física, peso corporal, sexo, dieta, tempo de administração e outros fatores clínicos.

[084]Assim, são aqui descritos métodos para formular uma vacina ou composição antigênica que induz imunidade substancial contra infecção viral ou contra pelo menos um de seus sintomas em um indivíduo, compreendendo adicionar à referida formulação uma dose eficaz de uma nanopartícula.

[085]Embora a estimulação de imunidade substancial com uma dose única seja preferida, doses adicionais podem ser administradas, pela mesma via ou por uma diferente, para alcançar o efeito desejado. Em neonatos e lactantes, por exemplo, podem ser necessárias administrações múltiplas para suscitar níveis suficientes de imunidade. A administração pode ser contínua em intervalos por toda a infância, conforme necessário para manter níveis suficientes de proteção contra a infecção. Do mesmo modo, adultos especialmente suscetíveis à infecção repetida ou séria, como, por exemplo, profissionais de saúde, profissionais de cuidados diários, familiares de crianças jovens, os idosos e indivíduos com função cardiopulmonar comprometida, podem necessitar imunizações múltiplas para estabelecer e/ou manter respostas imunes protetoras. Os níveis da imunidade induzida podem ser monitorados, por exemplo, medindo-se a quantidade de anticorpos neutralizantes secretores e no soro, e as doses ajustadas ou vacinas repetidas, conforme necessário, para suscitar e manter níveis desejados de proteção.

[086]Assim, em uma modalidade, um método para induzir imunidade substancial contra infecção viral ou contra pelo menos um de seus sintomas em um indivíduo, compreende administrar pelo menos uma dose de uma nanopartícula, em que a nanopartícula contém pelo menos um trímero compreendendo proteína Spike, ou seu fragmento, do MERS-CoV. Em outros aspectos, a nanopartícula compreende ao menos um trímero consistindo essencialmente em uma proteína Spike, ou seu fragmento, do MERS-CoV Spike. Na verdade, a proteína Spike pode ser a única proteína no trímero e/ou na nanopartícula.

[087]Os métodos para administrar uma composição compreendendo nanopartículas (formulações vacinais e/ou antigênicas) incluem, entre outros, administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intravenosa e subcutânea), epidural e na mucosa (por exemplo, intranasal e por via oral ou pulmonar ou por supositórios). Em uma modalidade específica, as composições da presente invenção são administradas por via intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica ou intradérmica. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, do colón, da conjuntiva, nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, bexiga e mucosa intestinal, etc.) e podem ser administradas junto com outros agentes biologicamente ativos. Em algumas modalidades, as vias de administração intranasal ou através de outras mucosas de uma composição compreendendo nanopartículas podem induzir uma resposta de anticorpos ou outra imune que seja substancialmente superior à obtida por outras vias de administração. Em outra modalidade, as vias de administração intranasal ou por outras mucosas de uma composição compreendendo nanopartículas podem induzir uma resposta de anticorpos ou outra imune que induzir proteção cruzada contra outras cepas de vírus. A administração pode ser sistêmica ou local. A formulação vacinal profilática é administrada por via sistêmica, por exemplo, por injeção subcutânea ou intramuscular, utilizando uma agulha e seringa, ou um dispositivo para injeção sem agulha. Alternativamente, a formulação vacinal é administrada por via intranasal, por gotas, grandes partículas aerossóis (superiores a cerca de 10 micra) ou por spray no trato respiratório superior. Embora qualquer um das vias de liberação acima resulte em uma resposta imune, a administração intranasal confere o benefício adicional de suscitar imunidade na mucosa no local de entrada do vírus.

[088]Em ainda outra modalidade, a vacina e/ou formulação antigênica é administrada de tal maneira a ter como alvo tecidos mucosos a fim de suscitar uma resposta imune no local da imunização. Por exemplo, é possível direcionar a imunização para tecidos mucosos, como o tecido linfoide associado ao intestino (GALT), utilizando a administração oral de composições que contenham adjuvantes com propriedades especiais de direcionamento a mucosas. Tecidos mucosos adicionais podem também servir de alvo, coo o tecido linfoide associado á nasofaringe (NALT) e tecido linfoide associado aos brônquios (BALT).

[089]As vacinas e/ou formulações antigênicas podem também ser administradas seguindo um esquema posológico, por exemplo, uma administração inicial da composição vacinal com administrações subsequentes de reforço. Em modalidades especiais, uma segunda dose da composição é administrada em algum momento de duas semanas a um ano, de preferência aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5 até aproximadamente 6 meses depois da administração inicial. Adicionalmente, uma terceira dose pode ser administrada depois da segunda dose, e de aproximadamente três meses a aproximadamente dois anos, ou mesmo um prazo mais longo, de preferência aproximadamente 4, aproximadamente 5 ou aproximadamente 6 meses ou aproximadamente 7 meses a aproximadamente um ano depois da administração inicial. A terceira dose pode ser opcionalmente administrada quando nenhum ou níveis baixos de imunoglobulinas específicas são detectados no soro e/ou na urina ou em secreções de mucosas do indivíduo após a segunda dose. Em uma modalidade preferida, uma segunda dose é administrada aproximadamente um mês depois da primeira administração, e uma terceira dose é administrada aproximadamente seis meses depois da primeira administração. Em outra modalidade, a segunda dose é administrada aproximadamente seis meses depois da primeira administração.

[090]Em outra modalidade, uma nanopartícula pode ser administrada como parte de uma terapia combinada. Por exemplo, as nanopartículas podem ser formuladas com outras composições imunogênicas e/ou antivirais.

[091]A dose da formulação farmacêutica pode ser determinada rapidamente pelo técnico no assunto, por exemplo, identificando primeiramente doses eficazes para suscitar uma resposta imune profilática ou terapêutica, por exemplo, medindo-se o título no soro de imunoglobulinas específicas para o vírus, ou medindo-se a relação inibitória de anticorpos em amostras de soro, ou amostras de urina ou em secreções mucosas. As referidas doses podem ser deter determinadas a partir de estudos animais.

[092]Além disso, estudos clínicos em humanos podem ser realizados para determinar a dose eficaz preferida para humanos por um técnico no assunto. Tais estudos clínicos são rotineiros e bem conhecidos na técnica. A dose precisa a ser empregada também dependerá da via de administração. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em animais.

[093]Conforme é também bem conhecido na técnica, a imunogenicidade de uma determinada composição pode ser intensificada pelo uso de estimuladores não específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes têm sido utilizados experimentalmente para promover um aumento generalizado na imunidade contra antígenos desconhecidos (por exemplo, Patente U.S. No 4 877 611). Nos protocolos de imunização, adjuvantes têm sido utilizados para estimular respostas há muitos anos e, como tais, adjuvantes são conhecidos pelo técnico no assunto. Alguns adjuvantes afetam a maneira na qual os antígenos são apresentados. Por exemplo, a resposta imune é aumentada quando antígenos proteicos são precipitados por alumínio. A emulsificação de antígenos também prolonga a duração da apresentação de antígenos. Adjuvantes podem ser incluídos. Os adjuvantes adequados incluem aqueles descritos em Vogel et al., “A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2a Edição),” cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente para todos os fins.

[094]Outros adjuvantes exemplares incluem o adjuvante completo de Freund (um estimulador não específico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis morto), adjuvantes incompletos de Freund e adjuvante à base de hidróxido de alumínio. Outros adjuvantes compreendem GMCSP, BCG, hidróxido de alumínio, compostos MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídio A, Montanide ISA 206 e monofosforil lipídio A (MPL). RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, MPL, dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS) em uma emulsão de esqualeno 2%/Tween 80, também é contemplado. MF-59, Novasomes®, antígenos de MHC podem também ser utilizados.

[095]Em uma modalidade, o adjuvante é uma vesícula paucilamelar de lipídios tendo aproximadamente duas a dez bicamadas, dispostas na forma de invólucros substancialmente esféricos, separados por camadas aquosas envolvendo uma grande cavidade central amorfa livre de bicamadas lipídicas. As vesículas paucilamelares de lipídios podem atuar estimulando a resposta imune de diversas maneiras, como veículos para o antígeno, como veículos de adjuvantes adicionais e combinações destes. As vesículas paucilamelares de lipídios atuam como estimuladores imunes não específicos quando, por exemplo, uma vacina é preparada, misturando o antígeno com as vesículas pré-formadas, de tal modo que o antígeno permaneça no meio extracelular em relação às vesículas. O encapsulamento de um antígeno dentro da cavidade central da vesícula permite que a vesícula atue como um estimulador imune e como um veículo para o antígeno. Em outra modalidade, as vesículas são feitas primariamente de vesículas não fosfolipídicas. Em outra modalidade, as vesículas são Novasomes. Novasomes® são vesículas paucilamelares não fosfolipídicas que variam de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 500 nm. Estas compreendem Brij 72, colesterol, ácido oleico e esqualeno. Os Novasomes demonstraram ser um adjuvante eficaz para antígenos (ver, as Patentes U.S. 5 629 021, 6 387 373 e 4 911 928, aqui incorporadas, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente para todos os fins).

[096]Em um aspecto, um efeito adjuvante é conseguido pelo uso de um agente, como o alumínio, utilizado em uma solução entre aproximadamente 0,05 e aproximadamente 0,1% em solução salina com tampão fosfato. Alternativamente, as nanopartículas podem ser criadas como uma mistura com polímeros sintéticos de açúcares (Carbopol®), utilizados em uma solução a aproximadamente 0,25%. Alguns adjuvantes, por exemplo, certas moléculas orgânicas obtidas de bactérias, atuam no hospedeiro em vez de no antígeno. Um exemplo é o muramil dipeptídeo (N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina [MDP]), um peptidoglicano bacteriano. Em outras modalidades, hemocianinas e hemoeritrinas podem também ser utilizadas. O uso da hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH) é preferido em certas modalidades, embora outras hemocianinas e hemoeritrinas de moluscos e artrópodes possam ser empregadas.

[097]Vários adjuvantes polissacarídeos podem também ser utilizados. Por exemplo, foi descrito o uso de vários adjuvantes polissacarídeos de pneumococos nas respostas de anticorpos de camundongos (Yin et al., 1989). As doses que produzem respostas ótimas, ou que de outra forma não produzem supressão, devem ser empregadas como indicadas (Yin et al., 1989). Variedades poliamina de polissacarídeos são especialmente preferidas, tais como quitina e quitosano, incluindo quitina desacetilada. Em outra modalidade, um derivado lipofílico dissacarídeo-tripeptídeo de muramil dipeptídeo é descrito para uso em lipossomos artificiais, e formado a partir de fosfatidil colina e fosfatidil glicerol.

[098]Outros adjuvantes adequados incluem agentes de superfície ativa, por exemplo, saponina e derivados como QS21 (Cambridge Biotech). Os adjuvantes à base de saponina incluem aqueles contendo Matriz A e Matriz C, isoladamente ou combinados. Adjuvantes adequados exemplares à base de saponina são descritos nas Publicações de Pedido de Patente U.S. 20120107353 e 20110081378, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência neste pedido de patente para todos os fins.

[099]Tensoativos não iônicos formados por copolímeros em bloco (Rabinovich et al., 1994) podem também ser empregados. Os oligonucleotídeos são outro grupo útil de adjuvantes (Yamamoto et al., 1988). Quil A e lentinen são outros adjuvantes que podem ser utilizados em certas modalidades.

[0100]Outro grupo de adjuvantes é formado pelas endotoxinas detoxificadas, tais como a endotoxina detoxificada refinada da Patente U.S. No 4 866 034. Essas endotoxinas detoxificadas refinadas são eficazes na produção de respostas a adjuvantes em vertebrados. Evidentemente, as endotoxinas detoxificadas podem ser combinadas com outros adjuvantes para preparar uma formulação multi-adjuvante. Por exemplo, a combinação de endotoxinas detoxificadas com dimicolato de trealose é especialmente contemplada, conforme descrita na Patente U.S. No 4 435 386. Combinações de endotoxinas detoxificadas com dimicolato de trealose e glicolipídios endotóxicos são também contempladas (Patente U.S. No 4 505 899), como é a combinação de endotoxinas detoxificadas com esqueleto da parede celular (CWS) ou CWS e dimicolato de trealose, como descrito nas Patentes U.S. Nos 4 436 727, 4 436 728 e 4 505 900. Combinações de apenas CWS e dimicolato de trealose, sem endotoxinas detoxificadas, são também cogitadas como úteis, conforme descrito na Patente U.S. No 4 520 019.

[0101]Os técnicos no assunto conhecerão os tipos diferentes de adjuvantes que podem ser conjugados a vacinas, incluindo alquil lisofosfolipídios (ALP); BCG; e biotina (inclusive derivados biotinilados) entre outros. Certos adjuvantes especialmente contemplados para uso são os ácidos teicoicos de células Gram. Estes incluem os ácidos lipoteicoicos (LTA), ácidos ribitol teicoicos (RTA) e ácido glicerol teicoico (GTA). As formas ativas de seus correspondentes sintéticos podem também ser empregadas (Takada et al., 1995).

[0102]Vários adjuvantes, mesmo aqueles que não são comumente utilizados em humanos, podem ainda assim ser empregados em outros vertebrados, quando, por exemplo, se deseja elevar o nível de anticorpos ou obter subsequentemente células T ativadas. A toxicidade ou outros efeitos adversos que podem resultar do adjuvante ou das células, por exemplo, conforme podem ocorrer quando se utilizam células tumorais não irradiadas, são irrelevantes em tais circunstâncias.

[0103]Outro método para induzir uma resposta imune pode ser conseguido formulando as nanopartículas com “estimuladores imunes”. Estes são mensageiros químicos do próprio corpo (citocinas) para aumentar a resposta do sistema imune. Os estimuladores imunes incluem, entre outros, várias citocinas, linfocinas e quimiocinas com propriedades imunoestimulatórias, imunopotencializadoras e pró- inflamatórias, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL- 13); fatores de crescimento (por exemplo, fator estimulante de colônias (CSF) de granulócitos-macrófagos (GM)); e outras moléculas imunoestimulatórias, como fator inflamatório de macrófagos, ligante Flt3, B7.1; B7.2, etc. As moléculas imunoestimulatórias podem ser administradas na mesma formulação que as nanopartículas, ou podem ser administradas separadamente. A proteína ou um vetor codificador da proteína podem ser administrados para produzir um efeito imunoestimulatório.

[0104]Alumínio pode estar presente em uma faixa com limite inferior próximo a: 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg, 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg, 5 μg, 6 μg, 7 μg, 9 μg, 10 μg, 15 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 35 μg, 40 μg, 45 μg, 50 μg, 60 μg, 70μg, 80 μg, 90 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg ou 150 μg. Alumínio pode estar presente em uma faixa com limite superior próximo a: 10 μg, 15 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 35 μg, 40 μg, 45 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 90 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg, 150 μg ou 200 μg. Em aspectos específicos, a faixa de alumínio é de 80 μg a 120 μg ou de 100 μg a 120 μg.

[0105]O adjuvante à base de saponina pode estar presente em uma faixa com limite inferior próximo a: 0,2 μg, 0,4 μg , 0,6 μg 0,8 μg, 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg, 5 μg, 6 μg, 7 μg, 9 μg, 10 μg, 15 μg, 20 μg, 25 μg ou 30 μg, O adjuvante à base de saponina pode estar presente em uma faixa com limite superior próximo a: 10 μg, 15 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 35 μg, 40 μg, 45 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 90 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg, 150 μg ou 200 μg. Em aspectos específicos, a faixa de adjuvante à base de saponina é de 5 μg a 20 μg ou de 1 μg a 10 μg.

[0106]Essas doses são especialmente adequadas em camundongos e podem ser ajustadas para uso humano com base no peso típico de camundongos de 20 g em comparação ao peso humano de aproximadamente 60 Kg.

Método para estimular uma resposta imune anti-MERS-CoV

[0107]As nanopartículas são úteis para preparar composições imunogênicas e estimular uma resposta imune que confira imunidade ou imunidade substancial contra vírus MERS-CoV. A imunidade mucosa e a celular podem contribuir para a imunidade contra infecção e doença. Anticorpos secretados localmente no trato respiratório superior representam um fator importante na resistência à infecção natural. A imunoglobulina A secretora (sIgA) está envolvida na proteção do trato respiratório superior, e a IgG sérica na proteção do trato respiratório inferior. A resposta imune induzida por uma infecção protege contra a reinfecção pelo mesmo vírus ou por uma cepa viral semelhante em termos antigênicos. Os anticorpos produzidos em um hospedeiro, após imunização com as nanopartículas ora descritas, podem também ser administrados a outros, pelo qual proporcionando administração passiva no indivíduo.

[0108]A presente invenção provê um método para produzir anticorpos anti-MERS- CoV de alta afinidade. Os anticorpos de alta afinidade produzidos pela imunização com as nanopartículas ora descritas são produzidos administrando-se uma composição imunogênica compreendendo uma nanopartícula de MERS-CoV a um animal, coletando o soro e/ou o plasma do animal e purificando o anticorpo proveniente do soro e/ou do plasma. Em uma modalidade, o animal é um humano. Em uma modalidade, o animal é bovino ou equino. Em outra modalidade, o animal bovino ou equino é transgênico. Em ainda mais uma modalidade, o animal bovino ou equino transgênico produz anticorpos humanos. Em uma modalidade, o método compreende ainda a administração de um adjuvante ou composto imune estimulante. Em mais uma modalidade, o anticorpo purificado de alta afinidade é administrado a um humano. Em uma modalidade, o humano está em risco de infecção pelo MERS-CoV.

[0109]As nanopartículas podem induzir imunidade substancial em um vertebrado (por exemplo, um humano) quando administradas ao referido vertebrado. A imunidade substancial, resultante de uma resposta imune contra as nanopartículas, protege ou melhora a infecção ou pelo menos reduz um sintoma da infecção viral no referido vertebrado. Em alguns casos, se o referido vertebrado for infectado, a referida infecção será assintomática. A resposta pode não ser uma resposta totalmente protetora. Nesse caso, se o referido vertebrado for infectado por um vírus MERS-CoV, o vertebrado apresentará sintomas reduzidos ou uma duração mais curta de sintomas quando comparado a um vertebrado não imunizado.

[0110]Em uma modalidade, a invenção provê métodos para induzir imunidade substancial contra infecção viral, ou contra pelo menos um de seus sintomas em um indivíduo, compreendendo administrar ao menos uma dose eficaz de uma nanopartícula. Em outra modalidade, a referida indução de imunidade substancial reduz a duração de sintomas da MERS. Em outra modalidade, um método para induzir imunidade substancial contra infecção viral, ou contra pelo menos um de seus sintomas em um indivíduo, compreende administrar ao menos uma dose eficaz de uma nanopartícula. Em outra modalidade, o referido indivíduo é um mamífero. Em outra modalidade, o referido mamífero é um humano. Em mais uma modalidade, a referida nanopartícula é formulada com um adjuvante ou estimulador imune.

[0111]Em modalidades, a dose de cada antígeno presente em uma composição pode ser próxima a 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg, 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg, 5 μg, 6 μg, 7 μg, 9 μg, 10 μg, 15 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 35 μg, 40 μg, 45 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 90 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg ou a 150 μg. Por exemplo, as quantidades podem ser medidas de acordo com o teor da proteína MERS Spike. Por exemplo, 1 μg de uma nanopartícula representa aproximadamente 1 μg de proteína MERS Spike.

Anticorpos produzidos por imunização com nanopartículas

[0112]As nanopartículas ora descritas induzem a produção de anticorpos anti- MERS-CoV de alta afinidade no hospedeiro. Esses anticorpos anti-MERS-CoV de alta afinidade demonstram afinidades superiores à de anticorpos anti-MERS-Co-V produzidos por meio de métodos convencionais (por exemplo, expressão em fagos; ver Zhang et al. 2014).

[0113]O termo “afinidade” refere-se à força da interação entre um epítopo e o sítio de ligação a antígeno de um anticorpo. A afinidade pode ser determinada, por exemplo, utilizando a equação:

[0114] Onde KA = constante de afinidade; [Ab] = concentração molar de sítios de ligação desocupados no anticorpo; [Ag] = concentração molar de sítios de ligação desocupados no antígeno; e [Ab-Ag] = concentração molar do complexo anticorpo- antígeno. A KA descreve a quantidade de complexo anticorpo-antígeno existente no ponto em que o equilíbrio é atingido. O tempo decorrido para que isso ocorra depende da taxa de difusão e é semelhante para todo anticorpo. Contudo, os anticorpos de alta afinidade se ligarão a uma quantidade maior de antígeno em um período mais curto do que os anticorpos de baixa afinidade. A KA (constante de afinidade) dos anticorpos produzidos pode variar, e situa-se entre aproximadamente 105 mol-1 e aproximadamente 1012 mol-1 ou mais. A KA pode ser influenciada por fatores incluindo pH, temperatura e composição do tampão.

[0115]Os anticorpos produzidos podem ser anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais. A afinidade de anticorpos monoclonais pode ser medida com exatidão, pois estes anticorpos são homogêneos e seletivos para um único epítopo. Os anticorpos policlonais são heterogêneos e conterão uma mistura de anticorpos com afinidades diferentes para reconhecer diversos epítopos - portanto, a afinidade somente pode ser determinada em média.

[0116]A afinidade de anticorpos pode ser medida usando-se qualquer meio comumente empregado na técnica, inclusive, entre outros, o uso de biossensores, tais como ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, Biacore). As unidades de ressonância são proporcionais ao grau de ligação do ligante solúvel ao receptor imobilizado (ou do anticorpo solúvel ao antígeno imobilizado). Determinar a quantidade de ligação no equilíbrio com concentrações conhecidas diferentes de receptor (anticorpo) e de ligante (antígeno proteico) permite o cálculo de constantes no equilíbrio (KA, KD) e das taxas de dissociação e de associação (koff, kon).

[0117]Por exemplo, KD (a constante de dissociação no equilíbrio) é uma razão de koff/kon, entre o anticorpo e seu antígeno. KD e afinidade estão inversamente relacionadas. Quanto mais baixo o valor de KD (concentração menor de anticorpo), mais alta a afinidade do anticorpo. A maioria dos anticorpos possui valores de KD na faixa micromolar baixa (10-6) à nanomolar (10-7 a 10-9). Considera-se que anticorpos de alta afinidade estão na faixa nanomolar baixa (10-9), estando os anticorpos de muito alta afinidade na faixa picomolar (10-12) ou mais baixa (por exemplo, faixa de 10-13 a 10-14). Em uma modalidade, os anticorpos produzidos pela imunização com as nanopartículas, ora descritas, possuem uma KD que varia, em valores aproximados, de 10-6 a 10-15, de 10-7 a 10-15, de 10-8 a 10-15 e de 10-9 a 10-15, de 10-10 a 10-15, de 10-11 a 10-15, de 10-12 a 10-15, de 10-13 a 10-14, de 10-13 a 10-15 e de 10-14 a 10-15. Em uma modalidade preferida, os anticorpos produzidos pela imunização com as nanopartículas, ora descritas, possuem uma KD que varia de aproximadamente 10-10 a aproximadamente 10-14.

[0118]Os anticorpos produzidos pela imunização com as nanopartículas, ora descritas, possuem uma taxa de dissociação (Koff) baixa, indicando que estes se ligam firmemente ao antígeno. Em uma modalidade, os anticorpos produzidos pela imunização com as nanopartículas, ora descritas, possuem uma Koff que varia, em valores aproximados, de 10-3 M-1 a 10-13 M-1, de 10-5 M-1 a 10-13 M-1, de 10-6 M-1 a 1013 M-1, de 10-7 M-1 a 10-13 M-1, de 10-8 M-1 a 10-13 M-1, de 10-9 M-1 a 10-13 M-1, de 10-10 M-1 a 10-13 M-1, de 10-11 M-1 a 10-13 M-1 ou de 10-12 M-1 a 10-13 M-1. Em outra modalidade, os anticorpos produzidos pela imunização com as nanopartículas, ora descritas, possuem uma Koff que varia, em valores aproximados, de 10-4 M-1 a 10-10 M-1, de 10-4 M-1 a 10-9 M-1 ou de 10-4 M-1 a 10-8 M-1.

[0119]Os anticorpos produzidos pela imunização com as nanopartículas, ora descritas, possuem uma taxa de associação (Kon) alta, indicando que estes se ligam firmemente ao antígeno. Em uma modalidade, os anticorpos produzidos pela imunização com as nanopartículas, ora descritas, possuem uma Kon que varia, em valores aproximados, de 103 M a 108 M, de 104 M a 107 M, de 104 M a 106 M, de 104 M a 105 M, de 105 M a 107 M ou de 105 M a 106 M.

[0120]Os anticorpos produzidos pela imunização com as nanopartículas, ora descritas, neutralizam o vírus MERS-CoV. Os anticorpos podem ser anticorpos neutralizantes em amplo sentido e neutralizam uma ou mais cepas, clados do vírus MERS-CoV ou coronavírus, ou os anticorpos podem neutralizar apenas uma cepa do vírus MERS-CoV. A capacidade de neutralização dos anticorpos pode ser medida por qualquer meio comumente empregado na técnica, inclusive, entre outros, Teste de Neutralização por Redução da Fluorescência (FRNT50), ensaios celulares in vitro, que medem a quantidade de vírion liberado de células imunizadas, e ensaios in vivo que medem a infecção em um animal imunizado.

[0121]Esta invenção é ilustrada mais detalhadamente pelos exemplos a seguir que não devem ser interpretados como limitação. Os conteúdos de todas as referências, patentes e publicações de pedidos de patente citadas por todo este pedido de patente, bem como nas Figuras, são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência para todos os fins.

Exemplo 1 Produção de nanopartículas com Spike de MERS-CoV

[0122]As nanopartículas são produzidas por superexpressão da proteína Spike de MERS CoV (Figuras 8 e 9) em baculovírus em células Sf9. Após a purificação, as nanopartículas VLPs contendo a proteína Spike são recuperadas predominantemente na forma de trímero (Fugas 4 e 6).

Exemplo 2 Indução de resposta imune utilizando nanopartículas com Spike de MERS- CoV

[0123]As VLPs foram administradas a camundongos como mostrado na Figura 5. Ao final do período de 45 dias, extraiu-se sangue dos camundongos para avaliar a resposta imune. A Figura 7 ilustra títulos de anticorpos neutralizantes para camundongos que receberam a nanopartícula VLP com Spike do SARS-CoV ou a nanopartícula VLP com Spike do MERS-CoV. A maior resposta foi obtida utilizando como adjuvante a Matriz M1.

Exemplo 3 Imunoglobulina humana potente anti-MERS-CoV produzida a partir de bovinos transcromossômicos inibe MERS-CoV in vivo

[0124]Para demonstrar que os anticorpos e imunoglobulina hIgG anti-MERS CoV hIgG obtidos de bovinos Tc, depois de vacinados, poderiam neutralizar MERS-CoV in vitro e in vivo, três vacinas experimentais contra MERS-CoV foram administradas a três grupos separados de Bovinos Tc para induzir altos títulos de anticorpos neutralizantes contra MERS-CoV. A primeira vacina testada era uma vacina (WKV) com vírion do MERS-CoV de vírus inteiros mortos da cepa Jordan (clado A), a segunda era uma vacina (SN) com nanopartícula de Spike do MERS-CoV de uma cepa Al-Hasa (clado B) e a terceira era uma vacina com pDNA de proteína Spike do MERS-CoV de uma cepa Al-Hasa. A vacina com pDNA demonstrou ser pouco imunogênica por ensaio in vitro e não foi avaliada mais (dados não apresentados). No entanto, o soro convalescente e imunoglobulina hIgG altamente purificada de bovinos Tc vacinados com a WKV (denominada SAB-300) e SN (denominada SAB- 301) foram capazes de neutralização cruzada do vírus in vitro, não induziram a entrada dependente de anticorpos do MERS-CoV em células Raji B humanas e reduziram rapidamente a infecção viral (cepa Erasmus) em um modelo de MERS- CoV em camundongos transduzidos com Ad5-hDPP4.

Métodos e materiais Estudos animais Clonagem e produção de anticorpos em bovinos transcromossômicos (Tc)

[0125]Bovinos Tc foram produzidos como descrito em Matsushita, et al. PLoS One, 2014. 9(3): p. e90383, Sano, et al. PLoS One, 2013. 8(10): p. e78119, e Kuroiwa, et al., Nat Biotechnol, 2009. 27(2): p. 173-81. Resumidamente, os bovinos Tc utilizados neste estudo são homozigotos por desabilitação tripla nos genes endógenos de imunoglobulinas bovinas (IGHM-/- IGHML1-/- IGL-/-) e são portadores de um cromossomo humano artificial (HAC) consistindo em um fragmento do cromossomo 14 humano, que contém o locus inteiro da cadeia pesada de imunoglobulina humana, e um fragmento do cromossomo 12 humano que contém o locus inteiro da cadeia leve kappa de imunoglobulina humana.

Produção de vírion inteiro inativado

[0126]Vírions inteiros inativados de MERS-CoV foram produzidos para vacinação, coletando o meio de células Vero CCL-81 infectadas com a cepa Jordan-N3/2012 (GenBank KC776174.1). 4x108 PFU de MERS-CoV foram irradiadas com uma fonte de cobalto até que ser alcançada uma dose de 6 MRads. A segurança do material foi testada quanto à inativação. Nenhum sinal específico de MERS-CoV foi detectado no material submetido a passagens de irradiação.

Produção de nanopartículas com Spike de MERS-CoV

[0127]Nanopartículas com proteína Spike purificada da cepa Al-Hasa de MERS- CoV foram produzidas como descrito em Coleman et al. 2014. Resumidamente, células Sf9 a 2-3 x 106 células/mL foram infectadas com baculovírus recombinante específico. As células Sf9 foram incubadas com agitação contínua a 27 + 2 °C e colhidas a 68-72 hpi por centrifugação a 4000xg por 15 minutos. Proteínas Spike foram extraídas das membranas celulares com um detergente não iônico, e o material insolúvel foi removido por centrifugação a 10.000xg por 30 minutos. As montagens de proteína Spike foram purificadas utilizando uma combinação de cromatografia de troca aniônica, afinidade e exclusão por tamanho. Durante a purificação, a maior parte do detergente foi removida, permitindo que trímeros de proteína Spike formassem nanopartículas micelares proteína-proteína de ordem superior. As nanopartículas com Spike purificada foram filtradas em 0,2 micra e armazenadas a -80 °C.

Vacinação de bovinos Tc

[0128]Conforme mostrado na Figura 10A, três bovinos Tc no Grupo 1 (no 2244; no 2252 e no 2254) foram imunizados com o vírus MERS-CoV inteiro morto (WKV) a 1-2 x 108 PPF/dose formulada com adjuvante Montanide ISA 25 (Seppic) em emulsão óleo em água mais o estimulante imune derivado de saponina Quil A (Accurate Chemicals). Dois bovinos Tc no Grupo 2 (no 2178 e no 2183) foram imunizados com a Nanopartícula com Spike recombinante de MERS-CoV (SN) a 2 mg/dose formulada com o adjuvante Montanide ISA 206 em emulsão água em óleo em água mais Quil A. Os bovinos Tc nos dois grupos foram imunizados 5 vezes com intervalos de três a quatro semanas.

Estudos de desafio in vivo com MERS-CoV em camundongos Adenovírus/hDPP4

[0129]Camundongos BALB/c transduzidos com hDPP4 foram infectados com a cepa Erasmus de MERS-CoV. Resumidamente, os camundongos BALB/c receberam injeção por via intraperitoneal com 100 ou 500 μg de controle negativo ou imunoglobulina teste coletada dos bovinos (SAB-300 ou SAB-301). Doze horas mais tarde, os camundongos foram infectados por via intranasal com MERS-CoV (1x105 PFU) em um volume total de 50 μL. Para obter os títulos dos vírus, os pulmões foram removidos em PBS e homogeneizados utilizando um homogeneizador manual. O vírus foi titulado em células Vero 81. Os títulos virais são expressos em PFU/g de tecido para MERS-CoV.

Resultados e discussão Avaliação de hIgG específica para antígeno produzida em animais Tc

[0130]Ensaios pela técnica ELISA específicos para proteína Spike de MERS-CoV foram realizados para avaliar a resposta de hIgG específica para antígeno em bovinos Tc após a imunização com WKV ou SN (Figura 10B) e SAB-300 e SAB-301 (Figura 10C). Os resultados do ELISA demonstraram resposta robusta de hIgG específica para Spike do MERS-CoV na segunda vacina (V2) e altos títulos mantidos até a última imunização (V5) para o soro e SAB-300 e SAB-301 (Figura 10). Esses dados indicam que anticorpos hIgG de título elevado direcionados para proteínas de MERS-CoV, foram gerados pelos bovinos Tc imunizados com WKV ou SN e que ambas as imunoglobulinas retiveram a atividade após a purificação.

Neutralização in vitro de MERS-CoV por soros, SAB-300 e SAB-301 Teste de Neutralização por Redução da Fluorescência - 50% de redução (FRNT50)

[0131]Foram realizados dois ensaios de neutralização para identificar o potencial de neutralização de SAB-300 e SAB-301 in vitro. Os soros de bovinos vacinados, SAB-300 e SAB-301 foram avaliados quanto à sua capacidade para inibir infecção pelo MERS-CoV in vitro utilizando um Teste de Neutralização por Redução da Fluorescência (FRNT50) e um ensaio de neutralização de infecção viral. O ensaio FRNT relata infecção utilizando fluorescência, e o ensaio de neutralização de infecção viral relata utilizando viabilidade celular.

[0132]O ensaio FRNT50 foi realizado no soro de bovinos vacinados (Figura 11A), e SAB-300 e SAB-301 (Figura 11B). Constatou-se que a V2 do bovino no 2244 produziu alto título de anticorpos neutralizantes, como o fez a V2 dos bovinos no 2178 e no 2183. Quando comparada a uma quantidade igual do anticorpo anti-Spike de coelho de controle positivo, ou seja, purificado com afinidade pelo antígeno, o soro após V2 de bovinos Tc é significativamente mais neutralizante. Esses dados condizem com os resultados do ensaio por ELISA específico para o antígeno na Figura 10B. SAB-300, hIgG purificada do bovino no 2244 após V2, e SAB-301, hIgG purificada de V2 do no 2178 e no 2183, foram então testadas para neutralização no mesmo ensaio FRNT50. Os dados demonstram que SAB-300 e SAB-301 geraram níveis elevados semelhantes de títulos de anticorpos neutralizantes (Figura 11C). Quando comparados às quantidades iguais de um anticorpo anti-Spike purificado de Coelho com afinidade pelo antígeno, o controle positivo, ambos os preparados de hIgG purificada eram altamente eficazes em neutralizar MERS-CoV, demonstrando que ambas, SAB-300 e SAB-301, eram capazes de inibir infecção por MERS-CoV in vitro.

[0133]Adicionalmente, SAB-300 e SAB-301 provocaram neutralização significativa de MERS-CoV cultivado em células Vero E6, ao passo que o soro controle não específico não teve efeito significativo sobre a infeção por MERS-CoV de células Vero E6 (Figura 12A). Os níveis de MERS-CoV infeccioso liberado de células infectadas com MERS-CoV, previamente tratadas com SAB-300, foram abaixo do limite de detecção do ensaio (158 TCID50/mL; Figura 12A), indicando que SAB-300 é um anticorpo neutralizante muito forte Os níveis de MERS-CoV infeccioso liberado de células infectadas com MERS-CoV, previamente tratadas com SAB-301, foram abaixo do limite de detecção do ensaio (158 TCID50/mL; Figura 12A) em todas as diluições, exceto em 1:8000 e 1:16000, sugerindo que SAB-301 no soro é um anticorpo neutralizante forte, mas não tão inibitório quanto SAB-300.

SAB-300 e SAB-301 não provocam intensificação de anticorpos do MERS- CoV

[0134]Para demonstrar que vírus MERS-CoV ligados por anticorpos não permitem a entrada do vírion em células que não são normalmente infectadas, células Raji, uma linhagem imortalizada de células B humanas que não é tipicamente infectada por MERS-CoV, foram testadas para investigar se a presença de anticorpos anti- MERS permitiria a transcrição de RNA viral e a liberação de vírus vivos. Células Raji previamente incubadas com SAB-300 e SAB-301, foram infectadas com MERS-CoV, (Figura 12B). RT-PCR para mRNA viral e ensaios de TCID50 foram realizados no meio em 48 horas após a infecção para avaliar infecção. O ensaio de TCID50 não pôde detectar MERS-CoV liberado das células Raji indicando que estas não foram infectadas por MERS-CoV. Por outro lado, esse ensaio revelou que células Vero E6, que são tipicamente infectadas por MERS-CoV, tratadas de maneira semelhante, produzem níveis elevados do vírus em 48 horas após a infecção (dados não mostrados). Para determinar se o RNA de MERS-CoV era detectado em células Raji infectadas com MERS-CoV após a incubação prévia com SAB-300 e SAB-301. O RNA das células infectadas foi extraído e analisado por PCR Taqman em tempo real com primers específicos para RNA recentemente transcrito de MERS-CoV (primer líder) (Figura 12B). Não houve detecção significativa de RNA viral recentemente transcrito de MERS-CoV (conjunto de primer líder) em células Raji infectadas com MERS-CoV apenas, infectadas com a hIgG purificada não específica de controle negativo, proveniente de plasma antes da vacina, ou em células infectadas por MERS-CoV previamente tratadas com SAB-300 ou SAB-301. Esses dados demonstram que não há intensificação dependente de anticorpos de infecção pelo MERS-CoV, que fosse causada por SAB-300 ou SAB-301.

Inibição da replicação de MERS-CoV in vivo

[0135]Testou-se a eficácia de SAB-300 e SAB-301 em um modelo de MERS-CoV em camundongos. Os camundongos não são permissivos ao MERS-CoV; contudo, quando transduzidos com um adenovírus que expressa o receptor de MERS-CoV, Dipeptidil peptidase 4 humana (hDPP4), os camundongos se tornam permissivos e replicam o vírus (Zhao, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A, 2014. 111(13): p. 4970-5). Para testar a atividade antiviral dos anticorpos Tc, camundongos BALB/c (6-8 semanas) foram transduzidos por via intranasal com 2,5x108 PFU de Ad5-hDPP4 em 75 μL de PBS. Cinco dias após a transdução, os camundongos foram tratados por injeção intraperitoneal com uma única dose de 100 ou 500 μg de hIgG controle, SAB-300 ou SAB-301. Doze horas mais tarde, os camundongos foram infectados por via intranasal com MERS-CoV (1x105 PFU) em um volume total de 50 μL. Não foram aplicadas injeções adicionais de anticorpos no transcorrer de 5 dias da infecção. Em 1, 3 e 5 dias após a infecção, os camundongos foram sacrificados e seus pulmões foram dissecados. Para obter os títulos do vírus, os pulmões foram homogeneizados em PBS utilizando um homogeneizador manual, clarificados por centrifugação e titulados em células Vero (Figura 13). Títulos ~1x106 PFU/mg de tecido pulmonar foram encontrados nos pulmões do grupo sem tratamento, além de no grupo que recebeu IgG humana de controle negativo no 1o e no 3o dia após a infeção, com os títulos em queda para 1x105 no 5o dia após a infecção (dpi). Os camundongos injetados com 100 μg ou 500 μg de SAB-300, reduções de ~50 vezes ou 500 vezes, respectivamente, apresentavam títulos do vírus, encontrados no 1o dia após a infecção, quando comparados ao grupo da injeção hIgG controle (Figura 13A). No 3o dia após a infecção, a redução no título do vírus para o grupo de 100 μg foi de ~5000 vezes, enquanto os títulos nos camundongos recebendo 500 μg foram abaixo do nível de detecção. Em 5 dias após a infecção, os títulos do vírus nos dois grupos tratados estavam abaixo do nível de detecção (Figura 13A). Reduções semelhantes no título do vírus foram encontradas para o anticorpo SAB-301, exceto que os títulos no pulmão foram discretamente mais altos no 1o dia após a infecção, quando comparados aos camundongos tratados com SAB-300 (Figura 13B). No 5o dia após a infecção, todos os camundongos tratados com SAB-301 apresentavam títulos do vírus abaixo do nível de detecção (Figura 13B). Esses dados demonstram que SAB-300 e SAB-301 foram capazes de proteger os camundongos da infecção pelo MERS-CoV com uma única injeção profilática.

Exemplo 4 Análise BIACORE de anticorpos em animais imunizados com nanopartículas de proteína Spike (S) de MERS-CoV

[0136]A avidez de dois anticorpos provenientes de dois bovinos Tc (no 2178 e 2183) imunizados com a vacina contendo nanopartículas S de MERS-CoV, após uma série de imunizações como mostradas na Figura 10A e no Exemplo 3, foi testada por análise de afinidade anti-S (Biacore™). Testou-se a avidez de anticorpos no soro desses animais após a vacina 3 (v3), vacina 4(v4) e vacina 5 (v5). Resumidamente, utilizando uma proteína A/G amina acoplada a um chip CM5, a IgG do soro de bovinos Tc foi capturada para a célula de fluxo. Antígeno de proteína Spike MERS a 0, 20 e 40 nM foi injetado na célula de fluxo por 180 segundos e seguido pela dissociação por 600 segundos. O modelo de ajuste 1:1 foi aplicado. As taxas de associação e dissociação foram medidas em função do tempo e inseridas em um sensorgrama, e a constante de dissociação foi calculada a partir das taxas de associação e dissociação. Os resultados são mostrados na Figura 14 e na Tabela 1.

[0137]Tabela 1

[0138]A Tabela 2 mostra a afinidade de mAbs anti-S1 produzidos por expressão em fagos, conforme descrito em Ying et al. J. Virol. (2014). Uma comparação dos dados nessas duas tabelas demonstra que a KD relatada e as taxas de Koff dos mAbs contra MERS-CoV produzidos por expressão em fagos são ordens de magnitude inferiores às respostas anti-S de policlonais induzidas no bovino Tc.

[0139]Tabela 2

Outras modalidades

[0140]Os técnicos no assunto reconhecerão, ou serão capazes de averiguar utilizando não mais do que a experimentação rotineira, equivalentes às modalidades ora descritas. Tais equivalentes destinam-se a ser abrangidos pelas reivindicações anexadas ao presente.

Incorporação por referência

[0141]Este pedido de patente incorpora, em sua totalidade, todas as publicações ou referências ora descritas, por referência para todos os fins.

[0142]Este pedido de patente incorpora por referência para todos os fins, a totalidade dos seguintes: U.S. No de Série 12/306 965, depositado em 27 de junho de 2007, U.S. No de Série 61/015 440, depositado em 20 de dezembro de 2007, U.S. No de Série 11/582 540, depositado em 18 de outubro de 2006, U.S. No de Série 12/633 995, depositado em 18 de outubro de 2006 U.S. Nos de Série 60/727 513, depositado em 18 de outubro de 2005; 60/780 847, depositado em 10 de março de 2006; 60/800 006, depositado em 15 de maio de 2006; 60/831 196, depositado em 17 de julho de 2006; 60/832 116, depositado em 21 de julho de 2006, e 60/845 495, depositado em 19 de setembro de 2006, e 10/617 569, depositado em 11 de julho de 2003.

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Claims (5)

1. Composição imunogênica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) uma nanopartícula do MERS-CoV, em que a nanopartícula compreende um antígeno do MERS-CoV, em que o antígeno consiste em polipeptídeo Spike de comprimento total expresso em baculovírus consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID: 2, em que o polipeptídeo Spike de comprimento total está em forma de trímero; e em que o polipeptídeo Spike é o único polipeptídeo na nanopartícula, e (ii) um adjuvante, em que o adjuvante consiste em dois tipos de partículas de matriz ISCOM, em que o primeiro tipo de partícula compreende uma Fração A de lipídio e saponina de Quillaja Saponaria Molina, e o segundo tipo de partícula compreende uma Fração C de lipídio e saponina de Quillaja Saponaria Molina; em que a composição é capaz de induzir anticorpos neutralizantes contra MERS-CoV.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a nanopartícula compreende de cinco trímeros a 30 trímeros do polipeptídeo Spike.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a nanopartícula compreende de dez trímeros a 20 trímeros do polipeptídeo Spike.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a concentração da nanopartícula é de 20 μg/mL ± 15% a cerca de 60 μg/mL ± 15%.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a concentração da nanopartícula é de 30 μg/mL ± 15% a 50 μg/mL ± 15%.