KR20180058206A - 중동호흡기증후군 코로나바이러스 s 단백질 면역원 조성물 및 이의 제작 방법 - Google Patents

중동호흡기증후군 코로나바이러스 s 단백질 면역원 조성물 및 이의 제작 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군에서 선택된, 어느 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 MERS-CoV S 면역원성 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 면역원성 조성물은 높은 수율을 기대할 수 있으며, 우수한 MERS-CoV 예방을 위한 조성물을 제공할 수 있다.

Description

중동호흡기증후군 코로나바이러스 S 단백질 면역원 조성물 및 이의 제작 방법 {Immunogenic Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) S protein composition and producing method thereof}
본 발명은 중동호흡기증후군(MERS-CoV) 감염증을 치료 및/또는 예방하기 위한 면역유발 조성물을 포함하는 MERS-CoV 스파이크(spike, S) 면역원 및 이의 변형, 제조, 또는 사용에 관한 것이다.
2012년 9월 중동 지역을 중심으로 처음 발생한 중동기증후군(Middle East Respiratory Syndrome, MERS)은 급성폐렴, 급성 신부전증 등의 중증 급성 호흡기 증후군을 일으킨다. 2012년 이후부터 2016년 9월까지 전 세계 27개국에서 확인된 MERS laboratory-confirmed case는 (WHO기준) 1800건이었으며 이 중 최소 640명이 사망하여 치사율이 약 36%에 이르는 중증 전염성 질환이다. MERS의 임상적 증상은 발열을 동반한 호흡기 증상이 주로 나타나며, 설사와 구토 등을 동반하기도 한다. MERS의 주요 취약 대상은 50대 이상의 기저 질환 및 면역 질환 등을 앓고 있는 노약자 및 면역 기능 저하자 이며, 림프구 및 혈소판 감소를 보이며 급성 신부전증이 나타나는 사례도 있다. 2015년 한국에서 대유행 하였으며, 이때 사람 간의 2차 감염의 사례로 인해 대유행(out-break)이 발생하였다.
MERS의 원인 병원체는 2012년 최초로 네덜란드의 Erasmus University Medical center Rotterdam에 의해 코로나바이러스 계열로 확인되었으며, 국제 바이러스 분류 위원회(ICTV)에 의해 2013년 5월 "중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-Coronavirus)"로 명명되었다. (도 1) 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 베타 코로나바이러스에 속하며, 양성의 단일가닥 RNA 바이러스(positive sense single strand RNA virus)로 바이러스의 게놈(genome)은 30kb정도의 크기를 가지고 있고 10개의 단백질을 암호화(coding) 하고 있다. 현재까지 사람 간 감염 및 전파 경로에 대한 명확한 규명은 이루어지지 않았으나, 사람의 DPP4(Dipeptidyl peptidase 4) 수용체가 주요 바이러스 리셉터 (receptor)로 알려져 있다. 또한 MERS-CoV의 유전자는 박쥐의 코로나바이러스인 Bat-CoV-HKU4와 Bat-CoV-HKU5와 유전자 상동성이 높은 것으로 알려져 있어 박쥐에서 유래된 것으로 추정되고 있으며, 중동지역에 서식하는 단봉낙타의 혈청에서 MERS의 중화항체가 발견됨에 따라 낙타가 사람에 MERS-CoV를 전파하는 유력한 매개 감염원으로 추정 하고 있다. 최근 중증의 낙타에서 분리된 바이러스와 MERS 사망자에서 분리된 바이러스의 전장 유전자 염기서열 분석 결과가 일치하며 낙타를 통해 MERS-CoV가 사람에게 감염되었다는 중요한 증거가 밝혀졌다.
MERS-CoV 는 4개의 구조 단백질을 암호화 하고 있으며, 구조단백질은 spike(S), membrane (M), envelope (E), nucleocapsid (N)이다. 이중 S 단백질은 type I trans-membrane glycoprotein으로 MERS-CoV의 표면에 존재하는데, envelope과 anchor를 형성하며 trimeric 형태로 구성되어 있다. (도 2) MERS-CoV S 단백질은 대부분의 coronavirus가 그렇듯이, host range와 tropism을 결정하는데 중요한 역할을 한다. MERS-CoV 의 S단백질은 receptor binding 부분인 S1과 membrane fusion 부분인 S2로 구성되어 있으며, MERS-CoV 의 S1 sub-domain에 있는 receptor binding domain (RBD)는 CD-26 이라고 알려진 dipeptidyl peptidase-4 (DPP4) receptor를 인지하고 binding을 하는 것으로 알려져 있다. 반면 COV-NL63과 SARS-COV는 Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)와 binding 하며, Porcine respiratory coronavirus 와 몇몇 COV는 aminopeptidase N (APN)을 인지하는 것으로 알려져 있다. S2 subdomain의 HR domain들은 virus의 envelope와 target 세포의 세포막과의 mediated fusion에 관여되어 있다. 이 spike protein은 코로나바이러스의 주요 항원으로, 높은 면역원성을 유도하기 때문에 백신이나 치료제의 대상이다.
Nianshuang Wang, et al. "Structure of MERS-CoV Spike receptor-binding domain complexed with human receptor DPP4." Cell Research (2013) 23:986-993.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 높은 MERS-CoV 항원 생산능력(수율)을 얻어, 높은 면역원성을 갖는 면역원 조성물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 높은 항체가를 갖는 MERS-CoV 백신 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 발명자들은 MERS-CoV 항원 수율의 향상을 통해, 바이러스 수득에까지 필요한 시간 및 비용을 절감시키고자 한다.
기술의 개요
본 발명은 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV) 항원, 상기 면역원을 포함하는 면역원 조성물, 또는 상기 면역원 조성물을 포함하는 백신에 관한 것이다. 보다 구체적으로 기술하자면, 본 발명은 새로운 MERS-CoV S 단백질 발현 펩타이드 또는 MERS-CoV 항원을 제조하여 사용하는 방법에 대한 것이다.
본 발명으로 확보된 면역원은 동물 또는 사람이 실제 MERS-CoV에 감염되었을 때 나타나는 면역 반응을 거짓 유도 하게 한다. 또한, 본 발명은 이런 거짓 면역 반응이 유도되고, 유지 됨으로써 실제 MERS-CoV가 감염 되었을 때 MERS-CoV를 체내에서 중화하는 역할을 할 수 있다.
본 발명은 MERS-CoV S 면역원을 배양하고 정제 하는 적절한 방법을 제시한다. 본 발명에 기술된 배양 및 정제 방법으로 생산되는 MERS-CoV S 면역원은 media에서 생산되는 방법 보다 더 높은 수율을 기대할 수 있다. 또한, 본 발명에 제시된 배양 및 정제 방법으로 생산된 MERS-CoV S 면역원은 높은 면역원성을 제공한다.
본 원에 기재되어 있는 각각의 저널 논문, 특허, 특허 출원, 공개공보 등은 전체 내용 혹은 부분 내용을 참조하였으며, 해당 내용이 언급된 것 또한 본 원에 포함된다는 것이 이해되어야 한다.
정의
본 원에 사용한 용어 "면역원(immunogen)"은 면역원성을 유발 하는 모든 물질을 의미하며, 용어 "항원"을 포함하여, 체내에 들어와서 면역 반응을 유발하는 모든 물질을 의미한다. 용어 "면역원"은 단백질 또는 단백질이 모여 구성된 거대 단백질 분자 또는 상기 단백질이 용해되어 단편을 이루는 형태를 포함한다. 거대 단백질은 다수의 단백질 배열 및 단백질 집합을 의미하며, 폴리머 면역원 및 VLP가 포함되어 있다. 여기서 면역원성 유발은 세포성 면역 및 체액성 면역 모두를 의미한다. 용어 "면역원"은, 예를 들어 체내에 침투한 외부물질 전체 및 일부가 포함되며, 면역원에 의한 세포성 면역 유도는 항원 특이 항체 생성을 의미할 수도 있다. 항원 특이 항체 중에는 재 침투한 외부물질을 방어하고 중화 작용을 하는 중화 항체가 포함되어 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단편(fragment)"은 조각, 절편 등과 같은 의미로 사용될 수 있으며, 단백질의 일부가 면역원성 기능을 상실하지 않고 MERS-CoV S 단백질로부터 분리된 형태를 포함하는 것으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포막으로부터 분리되는 과정에서 원심분리에 의해 MERS-CoV S 단백질의 파쇄, 절단이 유발되는 경우, 면역원성을 상실하지 않는 한, 본 발명의 MERS-CoV S 단백질의 단편으로, 본 발명의 MERS-CoV 면역원에 포함될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "백신"은 죽거나 약해진 병원체 또는 병원체에 대항하여 항체의 형성 또는 면역성을 유도하는데 사용된 유래 항원 결정부위의 조합제를 의미한다. 백신은 MERS CoV 바이러스에 의해 유발된 MERS에 대해 면역을 제공하도록 제공된다. 또한, 용어 "백신"은 척추동물에 투여되어 보호 면역성, 즉 감염과 관련된 질환의 심각성을 감소시키는 면역성을 발생시키는 면역원 현탁액 또는 용액을 의미한다.
본 원에 표현되어 있는 "포함"은 이라는 용어는, 해당 내용 및 내용물이 함께 있음을 의미한다. 용어 "포함"은 내용 및 내용물의 첨가 또는 함유를 의미하기도 한다. 하지만, 용어 "포함"은 해당 내용 및 내용물이 독립적, 단독적으로도 사용될 수 있다는 사실에 유의해야 한다.
"약"은 참조 값으로서 동일한 효과 및 결과를 제공하는 값들이 모두 포함된다. 하지만, "약"은 참조 값에 대해서만 의미를 부여한다. 또한, 용어 "약"에 의해 포함된 범위는 용어가 포함되는 내용(참조 값)의 범위나 특성에 따라 변할 수 있다. 따라서, 내용에 따라, "약"은, 예를 들어, ±15%, ±10%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, 또는 1% 미만을 의미할 수 있다.
본 원에 기재된 모든 수치 범위는 수치 범위 값 내에 있는 모든 수치 값을 포함 하고 있다. 예를 들어 "1000-3000"의 수치 범위는 1000 이상 3000 이하의 수치를 모두 포함하고 있음을 이해 해야 한다. 또한, 본 원에 기재되어 있는 모든 수치는 독립적 수치 범위로 인정 될 수도 있으며, 각 수치 값 간의 연결-복합적인 범위들로도 인정 될 수 있다.
본 발명에 사용된 "유효량"은 일반적으로 면역성을 유도하고, 바이러스 감염을 예방 및/또는 완화 또는 감염의 적어도 하나의 증상을 감소 및/또는 면역원의 효과를 증가시키는데 충분한 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편 또는 MERS-CoV S 단백질의 집합체의 양을 의미한다. 유효량은 감염의 개시를 지연 또는 최소화하는데 충분한 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편 또는 MERS-CoV S 단백질의 집합체의 양을 의미할 수 있다. 유효량은 감염의 치료 또는 관리에 치료 이익을 제공하는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편 또는 MERS-CoV S 단백질의 집합체의 양을 의미할 수 있다. 유효량은 바이러스에 대한 후속 노출에 대항하여 피험자(예를 들어, 인간) 자신의 면역 반응을 강화시키는데 충분한 양일 수 있다. 면역성 의 수준은, 예를 들어, 플라크 중화, 보체 고정, 효소-연결 면역부착 또는 미세중화 분석법에 의해, 예를 들어, 분비 및/또는 혈청 항체를 중화하는 양을 측정함으로써 관찰될 수 있다. 백신의 경우에, "유효량"은 질환을 예방하거나 증상의 심각성을 감소시키는 것이다.
본원에서 사용된 baculovirus (배큘로바이러스)는 곤충세포에 감염을 일으키는 바이러스를 의미한다. 본원에 사용된 baculovirus는 alfalfa looper (또는 Autographa californica라고 알려진 밤나방과-Noctuidae에 포함된 나방) 핵다각체병 바이러스 주 (nucleopolyhedrovirus strains; NPV strains) 및 변형된 바이러스 주들을 의미한다. 또한, 본원에서 사용된 baculovirus는 Bombyx mori (누에나방과-Bombycidae에 속해있는 누에나방) 핵다각체병 바이러스 주 (NPV) 및 변형된 바이러스도 포함됨을 유의해야 한다.
본원에서 사용된 MERS-CoV S 재조합 baculovirus는 상동적 재조합을 이용하여 제작 된다. 생성된 상동적 재조합 baculovirus는 적정한 세포에 감염될 시 (예를 들어 곤충세포계열) 재조합된 MERS-CoV S 외래 단백질을 생산 할 수 있다. 재조합된 MERS-CoV S 단백질은 폴리헤드린 (polyhedrin) 프로모터에 의해 과 발현 된다.
MERS - CoV 면역원
본 발명은 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군에서 선택된, 어느 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 MERS-CoV S 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 면역원성 조성물은 MERS-CoV의 스파이크(S) 단백질 또는 이의 단편 또는 상기 MERS-CoV의 스파이크 단백질 조합체를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 MERS-CoV 단백질을 포함할 수 있다.
상기 MERS-COV S 유전자는 GenBank accession No. KF186567 (Al-Hasa_1_2013) 및 KT029139 (MERS-COV/KOR/KNIH/002_05_2015) 균주로부터 얻어지거나 유래할 수 있다. 해당 유전자의 DNA 서열은 곤충 세포에서 발현이 용이하도록 codon이 최적화 될 수 있으며, Seq ID NO:1 (Al-Hasa_1_2013, 유전자 서열), Seq ID NO:2 (Al-Hasa_1_2013, 아미노산 서열), Seq ID NO:3 (KOR/KNIH/002_05_2015, 유전자 서열), 및 Seq ID NO:4 (KOR/KNIH/002_05_2015, 아미노산 서열)로 얻을 수 있다.
또한, MERS-CoV S 단백질이 배양액으로 분비되게 만들어진 Seq ID. No: 5, Seq ID. No: 6, Seq ID. No: 7, 및/또는 Seq ID. No: 8의 MERS-CoV S 부분 단백질의 유전자 서열 및 아미노산 서열을 제공할 수 있다.
본 발명은 MERS-CoV 단백질의 변형물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 서열번호로 언급된 아미노산 서열의 변형물은 구성 단백질의 아미노산 서열에 변화를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드와 관련하여 "변형물"이란 용어는 참조 서열과 관련하여 하나 이상의 아미노산에 의해 변화된 아미노산 서열을 의미한다. 변형물은 "보존성" 변화를 가질 수 있으며, 치환 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성, 예를 들어, 아이소루신에 의한 루신의 대체를 가진다. 선택적으로, 변형물은 "비 보존성" 변화를 가질 수 있으며, 예를 들어, 트립토판에 의한 글리신의 대체를 가질 수 있다. 유사한 미세 변형은 또한 아미노산 결실 또는 삽입 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 어느 아미노산 잔기가 생물학적 또는 면역학적 활성을 제거하지 않고 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는데는 당업계에 주지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, DNASTAR 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 MERS-CoV 면역원성 조성물에 포함되는 핵산 및 폴리펩타이드는 서열목록에 도시된 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 특히 MERS-CoV S 부분의 전체 혹은 일부 유전자 서열번호 1, 3, 5, 7 및/또는 아미노산 서열번호 2, 4, 6, 8을 이용한, MERS-CoV 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 발명자들은 상기 서열번호 2, 4, 6, 8의 핵산 및/또는 폴리펩타이드, 바람직하게 서열번호 2 및/또는 4 의 폴리펩타이드를 이용하여 특히 우수한 항체가를 제공하고, 면역원 수율의 향상을 가져오는 면역원성 조성물을 제공한다.
약학적 또는 백신 제제 및 투여
본 발명의 일 실시예는 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군에서 선택된, 어느 하나의 MERS-CoV S 폴리펩타이드가 포함된 MERS-CoV 예방 백신을 제공한다.
상기 백신은 보조제 또는 면역 증강제가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 이 조성물을 투여받는 척추동물에 해로운 면역 반응을 자체로 유발하지 않는 임의의 약학적 물질을 포함하고, MERS-CoV S 폴리펩타이드와 함께 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 적절한 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 운반자를 포함한다. 본 발명에서 사용된 대로, "약학적으로 허용가능한"이란 용어는 미국 약전, 유럽 약전 또는 척추동물 및 더욱 구체적으로 인간에 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열되는 것을 의미한다. 본 발명의 MERS CoV S 면역원은 MERS CoV 바이러스의 하나 이상의 균주에 대항하여 면역 반응을 자극하는데 충분한 유효량 또는 양(위에서 정의함)으로 투여된다. 이런 조성물은 척추동물에서 보호성 면역반응을 유도하기 위한 백신 및/또는 면역원 조성물로서 사용될 수 있다. 조성물은 다른 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편을 함유할 수 있다.
한 비-제한적인 실시태양에서, 면역원의 농도는 적어도 약 10㎍/mL, 약 20㎍/mL, 약 30㎍/mL, 약 40㎍/mL, 약 50㎍/mL, 약 60㎍/mL, 약 100㎍/mL, 약 200㎍/mL, 또는 약 500㎍/mL이다. 특정 양태에서, 면역원의 농도는 약 10㎍/mL 내지 약 1mg/mL, 또는 약 20㎍/mL 내지 약 500㎍/mL, 또는 약 30㎍/mL 내지 약 100㎍/mL 또는 약 30㎍/mL 내지 약 50㎍/mL이다. 다른 실시태양에서 면역원의 농도는 10㎍/mL 내지 200㎍/mL 포함될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학적 제제는 MERS-CoV 단백질, 주로 스파이크 단백질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 약학적 제제는 면역원이 투여된 동물에서 생산된 정제된, 고 친화력 항체를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체들은 식염수, 버퍼 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 살균 등장성 수성 버퍼 및 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 담체들, 희석제들 및 다른 부형제들은 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. N.J. current edition)에 제공된다. 상기 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 제제는 인간에 대한 투여에 적합한데, 바람직하게는 살균되고, 미립자가 아니고 및/또는 발열성이 아니다. 원한다면, 상기 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 재조합에 적합한 동결건조 분말과 같은 고체 형태, 액체 용액, 서스펜션, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 서방성 제제 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체들을 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 면역원성 백신 제제들의 성분들의 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 키트는 2개의 용기를 포함하며, 하나는 MERS CoV 면역원을 포함하고, 다른 하나는 항원 보강제를 포함한다. 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규율하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 공지는 이런 용기(들)에 결합될 수 있고, 상기 공지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의해 승인을 나타낸다. 제제는 조성물의 양을 나타내는 앰플(ampoule) 또는 사체트(sachette)와 같은 밀봉된 용기에 포장될 수 있다. 한 실시태양에서, 조성물은 액체로 공급되고, 다른 실시태양에서는, 밀봉된 용기에 있는 건조 살균된 동결건조 분말 또는 물 제거 농축물로 공급되며, 예를 들어, 물 또는 식염수로 피험자에게 투여하기 위해 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 바람직하게는 약 1㎍, 약 5㎍, 약 10㎍, 약 20㎍, 약 25㎍, 약 30㎍, 약 50㎍, 약 100㎍, 약 125㎍, 약 150㎍, 또는 약 200㎍의 단위 복용량에 기밀한 용기에서 건조 살균 동결건조 분말로서 공급된다. 선택적으로, 조성물의 단위 복용량은 약 1㎍(예를 들어, 약 0.08㎍, 약 0.04㎍, 약 0.2㎍, 약 0.4㎍, 약 0.8㎍, 약 0.5㎍ 이하, 약 0.25㎍ 이하 또는 약 0.1㎍ 이하) 또는 약 125㎍ 초과(예를 들 어, 약 150㎍ 이상, 약 250㎍ 이상 또는 약 500㎍ 이상)이다. 이런 복용량은 전체 MERS-CoV 단백질(예를 들어, 스파이크 단백질 또는 이의 단편)의 ㎍로서 측정될 수 있다. 본 발명의 면역원은 동결건조 분말로 재구성된 후 약 12시간 내에, 바람직하게는 약 6시간 내에, 약 5시간 내에, 약 3시간 내에, 또는 약 1시간 내에 투여되어야 한다. 다른 실시태양에서, MERS-CoV 단백질 면역원성 조성물은 MERS-CoV 단백질 조성물의 양과 농도를 나타내는 밀봉된 용기에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게는, 본 발명의 면역원 조성물의 액체 형태는 적어도 약 50㎍/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 약 100㎍ /ml, 적어도 약 200㎍/ml, 적어도 500㎍/ml, 또는 적어도 1mg/ml로 밀봉된 용기에 공급된다.
본 발명의 백신 또는 면역원 조성물은 MERS-CoV에 대항하여 면역 반응을 유도하도록 동물에게 투여될 수 있다. 한 실시태양에서, 동물은 MERS-CoV 감염에 취약하다. 한 실시태양에서, 동물은 인간이다. 바람직하게는, 면역원의 투여는 적어도 하나의 MERS-CoV 균주, 분리물, 클레이드 및/또는 종에 대항하여 실질적 면역성을 유도한다. 한 실시태양에서, 면역원의 투여는 적어도 2개 이상의 MERS-CoV 균주, 분리물, 클레이드 및/또는 종에 대항하여 실질적 면역성을 유도한다. 통상적으로, 복용량은, 예를 들어, 나이, 신체 조건, 체중, 나이, 식품, 투여 시간 및 다른 임상적 인자를 기초로 이 범위 내에서 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효량의 면역원을 상기 제제에 첨가하는 단계를 포함하여, 피험자의 감염 또는 이의 적어도 하나의 증상에 대해 실질적 면역성을 유발하는 백신 또는 면역원 조성물을 제제화하는 방법을 포함한다. 1회 복용량에 의한 실질적 면역성의 자극이 바람직하지만, 원하는 효과를 얻기 위해서, 동일하거나 다른 경로를 통해 추가 복용량이 투여될 수 있다. 신생아 및 유아에서, 예를 들어, 충분한 수준의 면역을 유발하기 위해 복 수의 투여가 필요할 수 있다. 투여는 감염에 대항하는 충분한 수준의 보호를 유지하기 위해 필요한 경우, 유년 시기에 걸쳐 간격을 주고 계속될 수 있다. 이와 유사하게, 예를 들어, 보건 요원, 어린이집 교사, 어린이들의 가족 구성원, 노인 및 손상된 심폐소생 기능을 가진 개인들과 같이 반복되거나 심각한 인플루엔자 감염에 특히 영향받기 쉬운 어른들은 보호 면역 반응을 일으키고 및/또는 유지하기 위해 다수의 면역이 필요할 수 있다. 유도된 면역성의 수준은 보호의 원하는 수준을 유발하고 유지하기 위해 필요한 것과 같이, 예들 들어, 중화 분비선 및 혈청 항체 및 조절된 복용량 또는 반복된 백신 접종의 양을 측정함으로써 관찰될 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 피험자에서 바이러스 감염 또는 이의 적어도 하나의 증상에 대해 실질적 면역성을 유도하는 방법은 적어도 1회 유효량의 MERS CoV 스파이크 단백질 또는 이의 단편 또는 집합체를 투여하는 단계를 포함한다. 백신 및/또는 면역원 제제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 내피, 근육내, 정맥 및 피하), 경막외 및 점막(예를 들어, 비강 및 경구 또는 폐 경로 또는 좌약)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시태양에서, 상기 조성물은 근육내, 정맥, 피하, 경구 또는 피내로 투여된다. 상기 조성물은, 예를 들어, 주입 또는 일시 주사, 상피 또는 점막 안쪽(예를 들어, 구강 점막, 결장, 결막, 비인 강, 인두중앙부, 질, 요로, 방광, 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 임의의 편리한 경로에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적으로 활성인 물질과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 비강 또는 다른 점막 경로를 통한 투여는 다른 투여 경로보다 실질적으로 높은 항체 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 실시태양에서, 면역원성 조성물 및/또는 백신의 투여의 비강 또는 다른 점막 경로는 바이러스의 다른 균주들에 대항하여 교차 보호를 유도할 항체 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있다. 투여는 전신 또는 국부적 일 수 있다. 예방 백신 제제는 바늘 및 주사를 사용하여 피하 또는 근육내 주사 또는 바늘 없는 주사 장치에 의 해 전신으로 투여된다. 선택적으로, 백신 제제는 상기도 속으로의 방울, 큰 입자 에어로졸(약 10 마이크론보다 큼) 또는 분사에 의해 비강으로 투여된다. 전달의 상기 경로 중 임의의 것은 면역 반응을 일으키는 반면에, 비강 투여는 바이러스의 침투 위치에서 점막 면역성을 유발하는 증가된 효과를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 백신 및/또는 면역원성 제제는 면역화의 부위에 면역 반응을 유발하도록 점막 조직을 표적으로 하는 방식으로 투여된다. 예를 들어, 장 관련 림프양 조직(gut associated lymphoid tissue)(GALT)과 같은 점막 조직은 특정 표적화 특성들을 가진 면역원 보강제를 함유하는 조성물의 경구 투여를 사용함으로써 면역화를 위한 표적이 될 수 있다. 비인두 림프양 조직(nasopharyngeal lymphoid tissue(NALT)) 및 기관지 관련 림프 양 조직(bronchial-associated lymphoid tissue(BALT))과 같은 다른 점막 조직도 표적이 될 수 있다. 백신 및/또는 면역원성 제제는 최초 백신 조성물을 투여하고 뒤이어 투여를 강화하는 것과 같은 복용 계획에 따라 투여될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 조성물의 두 번째 복용은 최초 투여 후 2주 내지 1년 중 어느 때, 바람 직하게는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 내지 약 6개월에 투여된다. 또한, 세 번째 복용은 두 번째 복용 후 및 최초 투여 후 약 3개월 내지 약 2년 이상, 바람직하게는 약 4, 약 5, 또는 약 6개월 또는 약 7개월 내지 약 1년 에 투여될 수 있다. 세 번째 복용은 두 번째 복용 후 피험자의 혈청 및/또는 소변 또는 점막 분비물에 특정 면역글로블린이 없거나 적은 양의 특정 면역글로블린이 탐지될 때 경구로 투여될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 제 2 복용은 제 1 투여 후 약 1달에 투여되고 세 번째 복용은 제 1 투여 후 약 6개월에 투여된다. 다른 실시태양에서, 제 2 복용은 제 1 투여 후 약 6개월에 투여된다. 다른 실시태양에서, MERS-CoV 단백질을 포함하는 면역원은 조합 치료의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들어, MERS-CoV 단백질 또는 이의 단편 또는 이의 집합체는 다른 면역원성 조성물 및/또는 항바이러스제로 제제화될 수 있다. 약학적 제제의 복용량은, 예를 들어, 바이러스 특이적 면역글로블린의 혈청 역가를 측정하거나 혈청 샘플 또는 소변 샘플 또는 점막 분비물에서 항체들의 억제 비율을 측정함으로써 예방 또는 치료 면역 반응을 유발하는데 효과적인 복용량을 먼저 확인함으로써 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 또한, 인간 임상 연구들은 당업자에 의해 인간에 대한 바람직한 유효량을 결정하는데 수행될 수 있다. 이런 임상 연구들은 일상적이고 당업계에 주지되어 있다. 사용될 정확한 복용량은 투여 경로에 의존할 것이다. 유효량은 생체 외 또는 동물 검사 시스템으로부터 유도된 복용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다. 당업계에 주지된 것과 같이, 특정 조성물의 면역성은 항원 보강제로 알려진, 면역 반응의 비특이적 자극제를 사용함으로써 향상될 수 있다. 항원 보강제는 알려지지 않은 면역원들에 대항하는 면역의 일반적인 증가를 실험적으로 향상시키기 위해 사용되었다(예를 들어, 미국특허 No. 4,877,611). 면역화 프로토콜은 수년 동안 반응들을 자극하는 항원 보강제를 사용하였고, 항원 보강제는 당업자에게 주지되어 있다. 일부 항원 보강제는 항원들이 존재하는 방식에 영향을 준다. 예를 들어, 면역 반응은 단백질 항원들이 명반에 의해 침지될 때 증가한다. 항원의 에멀션화는 항원 제공 기간을 연장한다. 항원 보강제가 포함될 수 있다. 적절한 항원 보강제는 모든 목적을 위해 전문이 참조로 포함된 보겔 등.,"A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2 nd Edition)에 기 술된 것들을 포함한다. 다른 예시적인, 항원 보강제는 완전한 프로인트 항원 보강제(죽은 마이코박테리아 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 항원 보강제 및 수산화알루미늄 항원 보강제를 포함한다. 다른 항원 보강제들은 GMCSP, BCG, 수산화알루미늄, thur-MDP 및 nor-MDP와 같은 MDP 화합물, CGP (MTP-PE), 지질 A, 몬타니드 ISA 206 및 모노포스포릴 지질 A(MPL)를 포함한다. 박테리아, MPL, 트 레할로스 다이마이콜레이트(TDM) 및(CWS) 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀션 속의 세포벽 골격(CWS)으로부터 추출된 3 개 구성요소를 함유하는 RIBI가 고려된다. MF-59, 노바솜 ®, MHC 항원도 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 항원 보강제는 지질 이중층이 제거된 큰 비결정 중앙 공동을 둘러싸는 수성층에 의해 분리된 실질적으로 구형 덮개 형태로 배열된 2개 내지 10개 이중층을 가진 파우실라멜라 지질소포(paucilamellar lipid vesicle)이다. 파우실라멜라 지질소포는 비특이적 자극제, 항원에 대한 운반자, 다른 항원 보강제의 운반자 및 이의 조합과 같은 여러 방식으로 면역 반응을 자극하는 역할을 할 수 있다. 파우실라멜라 지질소포는 백신이 미리형성된 소포를 가진 항원을 혼합하여 제조될 때, 비특이적 면역 증강제로 작용하여 항원은 소포에 대해 세포 외에 남게 된다. 소포의 중앙 공동 내의 항원을 캡슐화함으로써 소포는 면역 증강제 및 항원을 위한 운반자로 작용한다. 다른 실시태양에서, 소포는 비 인지질 소포로 주로 제조된다. 다른 실시태양에서, 소포는 노바솜이다. 노바솜 ®은 약 100nm 내지 약 500nm의 파우실라멜라 비 인지질 소포이다. 이들은 Brij 72, 콜레스테 롤, 올레산 및 스쿠알렌을 포함한다. 노바솜은 항원을 위한 효과적인 항원 보강제로 증명되었다(모든 목적을 위 해 전문이 참조로 본 발명에 포함된 미국특허 5,629,021, 6,387,373 및 4,911,928 참조). 한 태양에서, 항원 보강제 효과는 명반과 같은 물질의 사용에 의해 성취되고, 인산염 버퍼 식염수 속에 약 0.05 내지 약 0.1% 용액으로 사용된다. 선택적으로, 면역원은 약 0.25% 용액으로 사용된 설탕의 합성 고분자(카보폴®)과의 선혼합물로 제조될 수 있다. 일부 항원 보강제, 예를 들어, 박테리아로부터 얻은 특정 유기 분자는 항원보다 숙주에 작용한다. 예는 뮤라밀 다이펩티드(N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민[MDP]), 박테리아 펩티도글리칸이다. 다른 실시예에서, 헤모시아닌 및 헤모에리트린이 사용될 수 있다. 비록 연체동물문 및 절 지동물 헤모시아닌 및 헤모에리트린이 사용될 수 있지만, 열쇠구멍(keyhole limpet)(KLH)으로부터의 헤모시아닌은 특정 실시예에서 바람직하다. 다양한 폴리사카라이드 항원 보강제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 생쥐의 항체 반응에 대한 폐렴구균성 폴리사 카라이드 항원 보강제의 용도는 개시되어 있다(Yin et al, 1989). 최적 반응을 일으키거나 억제를 일으키지 않는 복용량은 지시한 대로 사용되어야 한다(Yin et al, 1989). 폴리사카라이드의 폴리아민 변형체들은 특히 바람 직하고, 탈아세틸화된 키틴을 포함하는 키틴 및 키토산과 같다. 다른 실시예에서, 인공 리포솜에서의 용도에 대해 개시된 무라밀 다이펩타이드 친유성 다이사카라이드-트라이펩티드 유도체는 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline) 및 포스파티딜 글리세롤(phosphatidyl glycerol)로부터 형성되었다. 다른 적절한 항원 보강제는 양극성인 표면 활성제, 예를 들어, 사포닌 및 QS21(캠브리지 바이오텍)와 같은 유도 체를 포함한다. 사포닌-기반 항원 보강제는 기질 A 및 기질 C을 단독으로 및 조합으로 함유하는 것들을 포함한다.
비이온성 블럭 공중합체 계면활성제(Rabinovich et al, 1994)가 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 항원 보강제의 다른 유용한 그룹이다(Yamamoto et al, 1988). 다른 그룹의 항원 보강제는 미국특허 제4,866,034호의 정제된 해독된 엔도톡신과 같은 해독된 엔도톡신이다. 이런 정제 해독된 엔도톡신은 척추 동물에서 항원 보강제 반응을 일으키는데 효과적이다. 물론, 해독된 엔도톡신은 다가-항원 보강제 제제를 제조하기 위해 다른 항원 보강제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 해독된 엔도톡신과 트레할로스 다이마이콜레이트의 결합은 미국특허 No. 4,435,386에 개시된 것과 같이, 특히 고려된다. 해독된 엔도톡신과 트레할로스 다이마이콜레이트 및 엔도톡신 당지질의 결합도 고려되고(미국특허 제4,505,899호), 해독 된 엔도톡신과 세포벽 골격(CWS) 또는 CWS 및 트레할로스 다이마이콜레이트의 결합은 미국특허 No. 4,436,727, 4,436,728 및 4,505,900에 개시된 것과 같이 고려된다. 해독된 엔도톡신 없이, CWS와 트레할로스 다이마이콜레 이트의 결합도 미국특허 No. 4,520,019에 개시된 것과 같이 효과적인 것으로 생각된다. 알킬 리소인지질(ALP); BCG; 및 비오틴(비오티닐화된 유도체 포함)을 포함하는 백신 과 접합할 수 있는 다른 종류의 항원 보강제를 더 고려할 수 있다. 사용을 특히 고려하는 소정의 항원 보강제는 그람 세포로부터 유래하는 테이코산(teichoic acid)이다. 이것은 리포테이코산(LTA), 리비톨 테이코산(RTA) 및 글리세롤 테이 코산(GTA)을 포함한다. 이런 합성 대응체의 활성 형태가 또한 사용될 수 있다(Takada et al, 1995).
인간에서 통상적으로 사용되지 않는 다양한 항원 보강제는 예를 들어, 항체를 생성하거나 뒤이어 활성 T 세포를 얻기 원하는 경우에, 다른 척추동물에서 여전히 사용될 수 있다. 항원 보강제 또는 예를 들어, 방사선 조사되지 않은 종양 세포를 사용하여 발생할 수 있는 것과 같은 세포로부터 발생할 수 있는 독성 또는 다른 역효과는 이런 환경과 무관하다. 면역 반응을 유도하는 다른 방법은 "면역 증강제"와 함께 본 발명의 면역원을 제제화함으로써 완성될 수 있다. 이들은 면역 시스템의 반응을 증가시키기 위한 신체 자신의 화학적 메신저(사이토카인)이다. 면역 증강제들은 인터루킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13)과 같은 면역 자극 활성, 면역 증강 활성 및 염증 유발 활성을 가진 다양한 사이토카인, 림포카인 및 케모카인; 성장 인자(예를 들어, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (granulocyte-macrophage(GM)-colony stimulating factor(CSF)); 및 대식세포 염증 인자, Flt3 리간드, B7.1, B7.2 등과 같은 다른 면역자극분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역 자극 분자들은 면역원으로서 동일한 제제에 투여될 수 있거나 개별적으로 투여될 수 있다. 단백질 또는 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 면역자극 효과를 일으키기 위해 투여될 수 있다. 명반은 다음 하한을 가진 범위로 존재할 수 있다: 약 0.2㎍, 약 0.4㎍, 약 0.6㎍, 약 0.8㎍, 약 1㎍, 약 2㎍, 약 3㎍, 약 4㎍, 약 5㎍, 약 6㎍, 약 7㎍, 약 9㎍, 약 10㎍, 약 15㎍, 약 20㎍, 약 25㎍, 약 30㎍, 약 35㎍, 약 40㎍, 약 45㎍, 약 50㎍, 약 60㎍, 약 70㎍, 약 80㎍, 약 90㎍, 약 100㎍, 약 110㎍, 약 120㎍, 약 130㎍, 약 140㎍, 또는 약 150㎍. 명반은 다음 상한을 가진 범위로 존재할 수 있다: 약 10㎍, 약 15㎍, 약 20㎍, 약 25 ㎍, 약 30㎍, 약 35㎍, 약 40㎍, 약 45㎍, 약 50㎍, 약 60㎍, 약 70㎍, 약 80㎍, 약 90㎍, 약 100㎍, 약 110㎍, 약 120㎍, 약 130㎍, 약 140㎍, 약 150㎍ 또는 약 200㎍. 특정 양태에서, 명반 범위는 약 80㎍ 내지 약 120㎍ 또는 약 100㎍ 내지 약 120㎍이다. 사포닌-기반 항원 보강제는 다음 하한을 가진 범위로 존재할 수 있다: 약 0.2㎍, 약 0.4㎍, 약 0.6㎍, 약 0.8㎍, 약 1㎍, 약 2㎍, 약 3㎍, 약 4㎍, 약 5㎍, 약 6㎍, 약 7㎍, 약 9㎍, 약 10㎍, 약 15㎍, 약 20㎍, 약 25 ㎍, 약 30㎍. 사포닌-기반 항원 보강제는 다음 상한을 가진 범위로 존재할 수 있다: 약 10㎍, 약 15㎍, 약 20㎍, 약 25㎍, 약 30㎍, 약 35㎍, 약 40㎍, 약 45㎍, 약 50㎍, 약 60㎍, 약 70㎍, 약 80㎍, 약 90㎍, 약 100 ㎍, 약 110㎍, 약 120㎍, 약 130㎍, 약 140㎍, 약 150㎍ 또는 약 200㎍. 특정 양태에서, 사포닌-기반 항원 보강제는 약 5㎍ 내지 약 20㎍ 또는 약 1㎍ 내지 약 10㎍이다. 이런 복용량은 생쥐에서 특히 적절하며 20g의 통상적인 생쥐 체중 대 약 60kg의 인간 체중을 기반으로 인간 사용에 대해 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시 태양에서, MERS-CoV S 단백질, 이의 단편, 또는 집합체, 더 바람직하게 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이상의 폴리펩타이드가 포함된 MERS-CoV S 면역원성 조성물 또는 이를 포함하는 백신을 투여하는 것을 포함하는, MERS-CoV 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법을 제공한다.
MERS - CoV S 단백질 면역원 제조
MERS - CoV S 유전자 도입 재조합 baculovirus의 생산
본 발명의 일 실시예에서, (a) 서열번호 1, 3, 5 및 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 MERS-COV S 단백질 유전자를 도입하여 재조합 바이러스 벡터를 제작하는 단계, 및 (b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 숙주 세포에 접종시켜 상기 숙주 세포를 배양하여 MERS-COV S 단백질 항원이 발현되는 배양물을 얻는 단계를 포함하는 MERS-COV S 단백질 항원을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 발현된 MERS-COV S 단백질 또는 이의 단편을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 바이러스 벡터는 예를 들어, 파아지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있으며, 바람직하게 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
일 실시태양에서, 벡터는 재조합 바큘로바이러스 벡터이다. 유전자를 암호화하는 구조체 및/또는 벡터는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터(또는 다른 바큘로바이러스), 파이지 람바다 PL 프로모터, E.coli lac, phoA 및 tac 프로모터와 같은 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 하며, 바람직하게는 폴리헤드린 (polyhedrin) 프로모터에 의해 과 발현 될 수 있다.
발현 구조체들은 전사 개시, 종결을 위한 부위 및 전사된 영역에, 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 더 포함할 것이다. 구조체들에 의해 발현된 전사체들의 암호 부분은 초기에 번역 개시 코돈 및 번역될 폴리펩타이드의 단부에 적절하게 위치한 종결 코돈을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 발현 벡터들은 적어도 하나의 선택가능한 마커를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이런 마커들은 다이하이드로 폴레이트 환원효소, G418 또는 진핵세포 배양을 위한 네오미신 저항 유전자(neomycin resistance gene) 및 E.coli 및 다른 박테리아 배양을 위한 테트라사이클린, 카나미신, 또는 임피실린 저항 유전자를 포함한다. 벡터들 중에서 배큘로바이러스과(Baculoviridae, 예를 들어, 오토그라파 캘리포니카 뉴클레오폴리헤드로 바이러스-Autographa californica nucleopolyhedrovirus), 아데노바이러스과(Adenoviridae, 예를 들어, 카닌 아데노 바이러스-canine adenovirus), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae, 예를 들어, 아비 헤파드나 바이러스-avihepadnavirus), 백시니아바이러스과(Vacciniaviridae, 예를 들어, 변형 백시니아 안카라 바이러스-modified vaccinia Ankara virus), 및 파보바이러스과(Parvoviridae, 예를 들어, 오토노머스 파보바이러스- Autonomous Parvovirus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 바이러스 벡터가 바람직하다. 상기 배큘로바이러스는 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵다각체 병 바이러스 주 또는 그 변형된 바이러스 주; 또는 몸빅스 모리(Bombyx mori) 핵다각체 병 바이러스 주 또는 그 변형된 바이러스 주를 포함할 수 있다. 박테리아 벡터가 또한 사용될 수 있다. 예시적 박테리아 벡터는 pQE70, pQE60 및 pQE-9, p블루스크립트 벡터, 파아지스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 진핵 벡터들 중에서 pFastBac1 pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL 등이 바람직하다.
상기한 것과 같은 재조합 벡터는 형질감염, 감염 또는 형질전환하는데 사용될 수 있고 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 단백질을 발현시킬 수 있다. 진핵 숙주 세포들은 효모, 곤충, 조류, 식물, 꼬마선충(또는 선충) 및 포유류 숙주 세포를 포함할 수 있다. 곤충 세포의 비제한적인 예는 예를 들어, Sf9, Sf21과 같은 Spodoptera frugiperda (Sf) 세포, 하이 파이브 세포와 같은 Trichoplusiani 세포 및 Drosophila S2 세포들이다. 곰팡이(효모 포함) 숙주 세포들의 예는 S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis(K. lactis), C. albicans 및 C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe(S. pombe), Pichia pastoris, 및 Yarrowia lipolytica를 포함하는 칸디다균의 종들이다. 포유류 세포들의 예는 293세포 계열(human embryonic kidney lineage), CHO세포 계열 (Chinese hamster ovary cell lineage), Vero세포 계열 (African green monkey lineage), MRC세포 계열 (human lung fibroblast cell lineage), 및 MDCK 세포 계열 (madin-darby canine kidney cell lineage)세포들이다. 아프리카발톱개구리(Xenopus laevis oocyte) 또는 양서류 출처의 다른 세포들도 사용될 수 있다. 원핵 숙주 세포들은, 예를 들어, 대장균(E. coli), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 마이코박테리아와 같은 박테리아 세포를 포함한다.
MERS - CoV S 단백질, 이의 단편 또는 조합체의 발현, 분리
주로 MERS-CoV 면역원으로 작용하는 MERS- CoV S 단백질, 이의 단편 또는 조합체는 상기 숙주 세포들이 세포 배양액에서 성장할 때 단백질을 생성하기 위해 가공된 재조합 세포주로부터 생산된다.
상기 세포들은 가장 효율적인 감염 다중도에서 재조합 배큘로바이러스 벡터로 감염된다. 상기 가장 효율적인 감염 다중도는 바람직하게, 0.001 내지 5.0 MOI, 더 바람직하게 0.002 내지 4.0 MOI, 0.003 내지 3.0 MOI, 0.004 내지 2.0 MOI, 더욱 더 바람직하게 0.005내지 1.0 MOI, 가장 바람직하게 0.01 내지 0.8 MOI 일 수 있다.
상기 재조합 배큘로바이러스의 감염은 세포들이 성장의 초기-로그 단계에 있고 1.0E5-7.0E6 cell/ml 농도, 바람직하게 5.00E5-1.50E6 cells/ml 농도 범위에 있을 때 효과적으로 일어날 수 있다.
상기 재조합 배큘로바이러스를 감염시킨 후 세포를 수확하는 것은 바람직하게 세포들의 생존율(viability)은 1% 이상, 99% 이하, 바람직하게 50 내지 98.9%, 바람직하게 60 내지 98.5%, 더 바람직하게 75 내지 98%인 상태에서 수확하는 것이 효과적이다.
상기 재조합 배큘로바이러스의 감염 조건은 사멸 단계의 세포에서 유출되는 protease들에 의한 타겟 단백질 절단을 최소화할 수 있다. 또한 바이러스 접종물을 적게 사용하더라도 배양물의 수율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법은 단백질의 분리를 위한 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로 (C) 상기 배양물을 3000 내지 8000xg 에서 1-30분간 원심분리하여 상청액과 세포를 분리하여 침강된 Sf9 세포를 얻는 단계, (d) 상기 침강된 Sf9 세포를 pH 6.5-8.5의 용해 버퍼로 세포 용해(cell lysis)하여 용해액을 얻는 단계; 및 (e) 상기 용해액을 순차 원심분리하여 상기 용해액의 상청액을 제거하여 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 MERS-CoV 항원이 포함된 세포의 구성요소만을 얻는 단계 (f) 상기 MERS-CoV 항원이 포함된 세포 구성요소에서 MERS-CoV이 포함된 항원이 포함된 부분만을 선택적으로 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (e)에 언급된 'MERS-CoV 항원이 포함된 세포의 구성요소'로는 plasma membrane, rough ER, smooth ER, Golgi 등을 의미한다.
상기 배양물을 원심분리하여, 배지를 제외한 침강된 Sf9 세포를 이용함으로써, 생산 수율을 향상시킬 수 있다. 즉, 배양물을 포함하는 배지를 그대로 이용하지 않고, 원심분리 후에 상청액을 제거하는 단계를 거치게 되어, 단백질 생산량의 증가를 가져올 수 있다.
바람직하게 상기 (c) 단계의 원심분리는 1000 내지 20000xg의 속도로, 바람직하게 1500 내지 15000xg의 속도로, 더 바람직하게 2000 내지 10000xg의 속도로, 가장 바람직하게 3000 내지 8000xg에서 1-30분간 실시할 수 있다.
상기 (e) 단계의 순차 원심분리는 적어도 2단계를 거쳐 수행될 수 있다.
1차 원심분리에서, (i) 상기 세포 용해액을 500 내지 20,000xg의 속도로 1-30분 원심분리하여, 침강된 침전물을 제거하고 세포막을 포함하는 상청액을 취할 수 있다. 바람직하게 상기 (e)의 (i) 단계의 원심분리는 700 내지 18,000xg의 속도로, 바람직하게 1,000 내지 15,000xg의 속도로, 더 바람직하게 1,500 내지 10,000xg의 속도로, 가장 바람직하게 2,000 내지 7,000xg에서 1-30분간 실시할 수 있다.
2차 원심분리에서, (ii) 상기 (i) 단계의 상청액을 4-10℃에서 10,000 내지 400,000xg로 60-420분간 초원심분리하여 침전물을 취하고 상청액을 제거하여 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편이 포함된 세포의 구성요소만을 취할 수 있다. 바람직하게 상기 (e)의 (ii) 단계의 원심분리는 10,000 내지 400,000xg의 속도로, 바람직하게 20,000 내지 350,000xg의 속도로, 더 바람직하게 35,000 내지 300,000xg의 속도로, 가장 바람직하게 50,000 내지 250,000xg에서 60-420분간 실시할 수 있다.
상기 (f) 단계의 추출 과정은 적어도 2단계를 거쳐 수행될 수 있다.
상기 (e) 과정에서 순차원심 분리를 끝낸 후 확보된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 MERS-CoV 항원이 포함된 세포의 구성요소로부터 (i) 추출 버퍼를 첨가하여 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편이 포함된 부분만 추출하며,
(ii) 상기 (i)의 추출로 확보된 내용물을 4-10℃에서 5,000 내지 300,000xg 로 초원심분리하여 상청액을 버리고 침전물만 확보한다. 바람직하게 상기 (f)의 (ii) 단계의 원심분리는 7,000 내지 200,000xg의 속도로, 바람직하게 10,000 내지 250,000xg의 속도로, 더 바람직하게 15,000 내지 200,000xg의 속도로, 가장 바람직하게 30,000 내지 150,000xg에서 실시할 수 있다.
상기 항원 제조 방법은 (g) MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 MERS-COV 항원을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 항원을 정제하는 단계는 적어도 2 단계의 정제 과정을 포함할 수 있다.
상기 정제는 (i) 양이온 교환 크로마토그래피법(anion exchange chromatography)으로 정제를 실시하며,
(ii) 글루코스 친화 크로마토그래피법(glucose affinity chromatography)으로 정제를 실시할 수 있다.
상기 크로마토그래피를 이용한 정제방법은 업계에서 통상적으로 단백질을 정제하는데 이용하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 1: Robert K. Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, 1993, Springer Science & Business Media , 또는 2: Coelho, L. C. B. B. et al., Protein Purification (Edited by Rizwan Ahmad) : chapter 3 affinity chromatography, 2012, Intech, DOI: 10.5772/1287를 이용할 수 있다.
본 발명은 높은 생산능력(수율)을 갖는 MERS-CoV 항원 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 MERS-CoV 백신은 높은 항체가를 제공한다.
본 발명은 MERS-CoV 바이러스가 생산하는 항원의 수율을 향상시키고, 바이러스 접종물의 양을 최소화하여 프로세스상 효율을 최적화할 수 있다.
본 발명은 MERS-CoV 항원 수득에 필요한 시간 및 비용을 절감할 수 있다.
도 1은 MERS-CoV의 바이러스학적 상세 분류내용이다.
도 2는 MERS-CoV S 단백질을 암호화 하고 있는 유전자를 도식화 한 그림이다. 여기에서 SP는 signal peptide를 의미한다. 여기서 S1, S2는 각각 S1, S2 sub-domain을 의미한다. 또한, RBD는 receptor binding domain을 의미하고 TM은 trans-membrane domain을 의미한다.
도 3은 Anion exchange chromatography 법으로 MERS-CoV S를 1차 정제하고 확인하는 데 사용한 WB 결과이다. 여기서 사용한 Anion exchange chromatography는 TMAE 이다.
도 4는 Affinity chromatography법을 사용하여 2차 정제를 수행 한 후 filter membrane으로 UD/DF를 수행 한 결과 이다. 여기서 Affinity chromatography 법은 Lentil Lectin resin chromatography 법이다.
도 5는 정제된 MERS-CoV S 항원의 DLS 제타 평균 (Zeta-average) 값이다.
도 6은 정제된 MERS-CoV S 항원의 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy) 사진이다.
도 7은 동물 실험 일정을 도식화 한 그림이다. 여기서 사용한 동물은 mouse 이다. 여기서 injection은 MERS-CoV S 항원의 투여를 의미한다. 이때 투여되는 항원에는 면역 증강제가 포함될 수 있다. 여기서 W는 한 주(week)를 나타낸다.
도 8은 알루미늄(Aluminum) 계열 어쥬번트의 유무 및 투여량에 따른 MERS-COV S 항원의 마우스 면역원성 유도를 알아보기 위한 총항체 역가 측정 실험 결과 그래프이다. 여기서 총항체 역가는 일라이쟈 (ELISA)분석을 통해 확인 된 값이다. 여기서 GMT는 Geometric Mean Titer (기하평균 값)이다. 여기서 "2.5ug+Adjuvant", "8ug+Adjuvant" 및 "25ug+Adjuvant" 는 MERS-COV S 항원 2.5ug, 8ug, 25ug을 각각 알루미늄 어쥬번트에 흡착한 물질들 이다. 여기서 "PBS+Adjuvant"는 멸균된 포스페이트 버퍼 셀라인 (phosphate buffer saline)에 알루미늄 어쥬번트를 혼합한 물질이다.
도 9는 투여 횟수 및 채혈시기에 따른 MERS-CoV S 항원의 마우스 면역원성 유도를 알아보기 위한 총항체 역가 측정 실험 결과 그래프이다. 여기서 총항체 역가는 일라이쟈 (ELISA)분석을 통해 확인 된 값이다. 여기서 GMT는 Geometric Mean Titer (기하평균 값)이다. 여기서 "2.5ug+Adjuvant" 과 "8ug+Adjuvant" 는 MERS-CoV S 항원 2.5ug 와 8ug을 각각 알루미늄 어쥬번트에 흡착한 물질들 이다. 여기서 "PBS+Adjuvant"는 멸균된 포스페이트 버퍼 셀라인 (phosphate buffer saline)에 알루미늄 어쥬번트를 혼합한 물질이다. 여기서 "1st boosting" 는 첫 번째 MERS-CoV S 항원을 투여 후 두 번째 투여를 의미한다. 여기서 "2nd boosting"은 세 번째 투여를 의미한다. 여기서 "2주차"는 투여 후 2주 후 채혈을 의미한다. 여기서 "4주차"는 투여 후 4주 후 채혈을 의미한다.
도 10은 본 예시에서 발현/정제된 면역원을 투여 후 유도된 항체가 면역원성을 나타내는 것을 확인하기 위한 항원-RBD 면역 특이적 IgG항체역가 측정 실험 결과 그래프이다. 여기서 항원-RBD 면역 특이적 IgG항체역가는 특이적 항체 샌드위치 일라이쟈 (specific antibody sandwich ELISA)법을 통해 확인 된 값이다. 여기서 특이적 항체는 RBD와 특이적으로 결합하는 1E9 단클론 항체이다. "8ug+Adjuvant"는 MERS-CoV S 항원 8ug을 알루미늄 어쥬번트에 흡착한 물질들 이다. 여기서 "PBS+Adjuvant"는 멸균된 포스페이트 버퍼 셀라인 (phosphate buffer saline)에 알루미늄 어쥬번트를 혼합한 물질이다.
도 11 내지 도 18은 본 발명의 MERS-CoV S 유전자 및 폴리펩타이드 서열을 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. MERS - CoV S 유전자 도입 재조합 baculovirus의 생산
Accession No. KF186567 (Al-Hasa_1_2013) MERS-CoV S 단백질의 코돈을 최적화시켜 얻어진 항원을 준비하였다. 기술된 MERS-CoV S 유전자는 cloning을 거쳐 MERS-CoV S 단백질 재조합 baculovirus (AcMNPV)를 만든 후 곤충세포, Sf9에 접종한다.
Sf9 곤충세포의 평소 세포 농도는 3.00E6/ml을 넘지 않아야 한다. Sf9 곤충세포는 멸균된 125ml / 250ml / 500ml / 1L spinner flask 또는 5L / 50L /100L bioreactor 에서 배양을 한다. 본 예시에서 배양에 사용한 배지는 혈청이 함유되지 않은 무혈청 곤충 세포 특화 배지를 사용한다. 여기서 무혈청 곤충 세포 특화 배지는 Insect Express (Lonza) 등이 포함 될 수 있다. 본 예시에서 MERS-CoV S 생산을 위한 MERS-CoV S 재조합 baculovirus는 0.01-0.8 MOI (Multiplicity Of Infection) 사이로 접종을 하고 이때 Sf9 곤충세포의 농도는 성장 단계가 exponential phase의 초기단계인 5.00E5-1.50E6의 농도를 사용한다. 본 예시에서 사용한 MERS-CoV S 재조합 baculovirus는 접종 후 60-90시간이 되었을 때 harvest를 하며, 이때 viability는 75-98% 사이에 있어야 한다. 본 예시에서 낮은 성장단계의 세포에 낮은 농도의 바이러스를 접종하고 비교적 높은 viability에서 harvest하는 이유는, 사멸 단계의 세포에서 유출되는 protease 들에 의한 타겟 단백질 절단을 최소화하고, 사용되는 바이러스 접종물의 양을 최소화하기 위함이다.
실시예 2. MERS - CoV S 항원의 발현, 정제, 분석
서열번호 4의 폴리펩타이드 면역원은 다음과 같은 방법으로 얻는다.
먼저 실시예 1에서 재조합 baculovirus 접종 후 확보된 Sf9 곤충세포를 3000-8000xg에서 1-30분간 원심 하여 cell 침강층과 media 상청액을 분리한다. 분리된 media 상청액은 제거하고, 침강된 cell을 확보한다. 침강된 Sf9 cell은 용해 버퍼를 첨가하여 용해 시킨다. 용해 버퍼는 적절한 버퍼와 salt등이 포함되어 있으며, pH는 6.5-8.5 사이에 있다.
용해된 용해액을 순차 원심분리 방법 (differential centrifugation)을 실시하여 MERS-CoV S 단백질이 포함된 세포막을 분리한다. 본 예시에서 순차 원심분리 방법은 다음과 같다. 용해 및 파쇄 된 cell lysate를 2000-7000xg에서 1-30분 원심하여, 침강된 침전물을 제거하고 상청액을 취한다. 침전물에는 nuclei, 일부 mitochondria, lysosome, peroxisome등이 포함되어 있고, 상청액에는 잔여 lysosome과 peroxisome, mitochondria 및 cytosolic proteins, microsomes, ER, Golgi, 세포막이 포함되어 있다. 상청액을 다시 4℃에서 50,000-250,000xg로 60-420분간 초원심하여 침전물을 취하고 상청액을 제거한다.
분리된 세포막을 추출 버퍼를 첨가하여 세포막을 분쇄하고 초원심 분리기를 이용하여 30,000-150,000xg 에서 원심 하여, MERS-CoV S 단백질이 포함된 원액을 추출한다. 추출 버퍼는 적절한 버퍼와 non-ionic detergent, salt 등이 포함되어 있으며, pH는 6.5-8.5 사이에 있다.
MERS-CoV S 단백질이 포함된 추출 원액은 anion exchange chromatography법으로 1차 정제를 실시한다. 본 원에서는 TMAE chromatography를 이용하고, AKTA explorer (HPLC, BD)를 사용하여 1차 정제를 실시하였다. 본 예시에서 TMAE는 Fractogel TMAE Hicap(M) resin (Merck)을 사용하였고, pressure가 0.3 메가파스칼 (MPa)을 넘지 않는 범위에서 추출된 원액시료를 로딩하였다. 시료는 로딩한 후 로딩 버퍼로 washing 해주고, 일루션 버퍼로 7CV 만큼 일루션 하였다. 로딩 버퍼 (loading buffer)와 일루션 버퍼(elution buffer)는 Tris, Triton X-100, NaCl 등이 포함되어 있으며, pH는 7.0-8.5 사이에 있다. (도 3) 1차 정제를 실시한 정제 원액을 glucose affinity chromatography법으로 2차 정제를 한다. 본 예시에서 2차 정제는 lentil lectin resin (lentil lectin sepharose 4B)을 사용하였으며, 로딩과 일루션은 0.3 메가파스칼(MPa) 미만의 압력으로 실시한다. 로딩 버퍼는 Tris, NaCl, CaCl2, tween80, MnCl2 등이 포함되어 있으며, pH는 7.0-8.5 사이에 있다. 일루션 버퍼는 borate, methyl mannoside, methyl glucoside등으로 구성되어 있고, pH는 5.0-6.5 사이에 있다. 2차 정제가 끝난 원액은 filter membrane을 이용하여 원액을 ultrafiltration 및 diafiltration으로 여과 및 농축 한다. (도 4) 최종적으로 여과 농축된 항원을 DLS로 측정한 Zeta-average 값은 20-100nm 이며 (도 5), 전자 현미경을 이용하여 항원을 관찰 한다. (도 6)
본 예시에서 단백질은 각 정제과정의 동일한 부피의 샘플을 βME(베타-머캡토에탄올)을 포함하는 2xSDS 샘플 버퍼로 희석하여 SDS-gel 의 각 well 당 15-20㎕ 채운 후 전기영동 하여 쿠마시 염색법에 의해 전체 단백질들을 염색하였다. 또한, SDS-gel을 membrane에 transfer 하여 항-단일 혹은 복합 MERS-COV S 특이 항체를 이용하여 WB (웨스턴 블랏)법으로 추가 분석하였다. WB은 단백질이 전이된 membrane을 5% skim milk(Sigma)가 포함된 완충용액(PBS)으로 4℃에서 4-24시간 동안 인큐베이션 하고 완충용액으로 세척 후 1:2000으로 희석한 MERS-COV S 특이 항체를 첨가하여 4℃에서 4-24시간 동안 인큐베이션 한다. 인큐베이션 후 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척하고, 1:5000으로 희석된 겨자무과산화효소(HRP) 결합 Goat anti-rabbit IgG 항체(Invitrogen, US)을 첨가하고 상온에서 1-2시간 동안 인큐베이션 한다. 인큐베이션이 끝난 membrane은 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척하고 ECL detection reagent (Amersham) 으로 발색하여 film으로 찍어 현상한다.
실시예 3. MERS - CoV S 항원을 이용한 동물 투여/면역 유도
본 예시에서 확보된 항원으로 mouse를 이용한 동물실험을 수행하였다. 실험에 사용한 mouse는 동물실험에 사용된 항원은 그 자체로도 사용을 할 수 있으며, 면역 증강제-예를 들어 알루미늄 어쥬번트와 함께 사용할 수도 있다. 어쥬번트는 예를 들어 알루미늄 또는 칼슘 염, 자세하게는 수산화, 인산, 인산 칼슘등의 무기 염을 포함할 수 있다.
알루미늄 (Aluminum 또는 Alum) 계열의 어쥬번트는 현재 사람을 대상으로 하는 백신에서 가장 보편적으로 사용하는 어쥬번트이기 때문에 새로운 어쥬번트를 개발하고 평가하는데 필요한 standard로 사용할 정도로 안정성과 효과가 입증 되어 있는 어쥬번트이다. Alum 어쥬번트 중 대표적으로 사용 하는 것이 aluminum hydroxide(Al(OH)3)와 aluminum phosphate(AlPO4)이며, 이 두 alum 어쥬번트는 각각 상이한 물리적 특성과 어쥬번트 특성을 나타낸다. 특히 aluminum hydroxide가 aluminum 흡착 백신에서 가장 널리 사용하고 있고, 본 예시에서 aluminum hydroxide를 면역 증강제로 사용하였으며, 이때 aluminum hydroxide는 180ug/1회 투여 의 수준으로 사용하였다..
본 예시에서 투여하는 MERS-CoV S 항원의 농도는 2.5ug/ml, 8ug/ml, 25ug/ml의 각기 다른 농도를 투여하였고, 투여 횟수는 2회 투여 하는 그룹과 3회 투여하는 그룹으로 다르게 적용하였다. 본 예시에서의 투여 일정은 최초 투여 2주 후 2회 투여, 2회 투여 2주후 3회 투여하여 진행 하였으며, 채혈은 최초 투여 후 2주, 3주, 4주, 6주, 8주 (3회 투여군만) 간격으로 실시 하였다. (도 7)
실시예 4. MERS - CoV S 항원을 투여한 동물의 면역원성 확인
본 예시에서 확보된 MERS-CoV S 항원은 aluminum hydroxide 어쥬번트 사용유무, 투여양, 투여횟수, 채혈 시기에 따른 면역원성 유도 효과를 확인 하였다. 본 예시에서 유도된 면역원성의 확인은 총항체가 측정과 중화항체 측정을 통해 실시하였다.
본 예시에서 항원-특이적 IgG항체역가를 확인하기 위한 총항체가 측정은 ELISA법을 사용하여 수행하였다. 96-well plate에 MERS-CoV S 항원을 well 당 100ng씩 coating 하고 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 인큐베이션이 끝난 plate는 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척한 후 5% skim milk가 포함된 완충용액으로 4시간 동안 인큐베이션 하고 0.1 tween20이 포함된 완충용액으로 다시 3회 세척한다. 확보된 mouse 혈액은 원심하여 혈청 샘플을 확보하고, 준비된 혈청 샘플을 최초 농도 1/20으로 희석한 후 4배씩 연속 희석을 수행하여 마지막 농도를 1/36980배로 만든다. 희석된 혈청 샘플들을 세척이 끝난 96-well plate에 100㎕씩 넣어준 상온에서 2시간 인큐베이션 하고, 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척한다. 세척이 끝난 plate에 1:3000으로 희석된 겨자무과산화효소(HRP) 결합 Goat anti-mouse IgG 항체(Invitrogen, US)를 well당 100㎕ 넣은 후 상온에서 2시간 인큐베이션 하고 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척한다. 세척이 끝난 plate의 각 well에 3,3A,5,5A-테트라메틸벤지딘 섭스트레이트(TMB substrate, KPL)를 첨가하여 HRP와 10분간 반응 시킨 후, TMB stop solution (KPL)을 넣어 반응을 중지 시켰다. 각 웰에 대한 흡광도 450nm값을 Microtiter plate reader (Molecular Devices) 를 사용하여 측정하였고, 본 예시에서 측정된 총 항체가는 발현/정제 된 MERS-COV S 항원이 면역원성을 높게 유도함을 확인하였다. (도 8a, 도 9)
본 예시에서 발현/정제된 MERS-COV S 면역원이 세포의 DPP4 receptor와 binding 하여 중화 면역반응을 일으키는 것으로 알려진 RBD(receptor binding domain)를 정확히 포함하는 것을 확인 하기 위해 항원-RBD 면역 특이적 IgG항체역가를 specific antibody sandwich ELISA법으로 측정하였다. 96-well plate에 MERS-CoV S RBD 부분에 특이적으로 결합하는 1E9 RBD specific 항체을 well 당 100ng씩 coating 하고 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 인큐베이션이 끝난 plate는 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척한 후 5% skim milk가 포함된 완충용액으로 4시간 동안 인큐베이션 하고 0.1 tween20이 포함된 완충용액으로 다시 3회 세척한다. 이후 MERS-COV S 항원을 well당 100ng씩 1E9 RBD specific 항체가 (Xian-Chun Tang et al. PNAS 2014;111:E2018-E2026) coating된 plate에 넣어 준 후 상온에서 2시간 인큐베이션 하고, 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척한다. 준비된 혈청 샘플을 최초 농도 1/20으로 희석한 후 4배씩 연속 희석을 수행하여 마지막 농도를 1/36980배로 만든다. 희석된 혈청 샘플들을 세척이 끝난 96-well plate에 100㎕씩 넣어준 상온에서 2시간 인큐베이션 하고, 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척한다. 세척이 끝난 plate에 1:3000으로 희석된 겨자무과산화효소(HRP) 결합 Goat anti-mouse IgG 항체(Invitrogen, US)를 well당 100㎕ 넣은 후 상온에서 2시간 인큐베이션 하고 0.1% tween20이 포함된 완충용액으로 3회 세척한다. 세척이 끝난 plate의 각 well에 3,3A,5,5A-테트라메틸벤지딘 섭스트레이트(TMB substrate, KPL)를 첨가하여 HRP와 10뷴건 반응 시킨 후, TMB stop solution (KPL)을 넣어 반응을 중지 시켰다. 각 웰에 대한 흡광도 450nm값을 Microtiter plate reader (Molecular Devices) 를 사용하여 측정하였고, 본 예시에서 측정된 항원-RBD 면역 특이적 IgG항체역가는 발현/정제 된 MERS-COV S 면역원이 면역에 특이적 작용하는 RBD부분을 효과적으로 표지하고 면역원 투여시 효과적으로 RBD부분에 대한 항체를 유도함을 반증하는 결과이다. (도 10)
서열번호 2의 폴리펩타이드 항원을 이용한 면역 유도 반응에서 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
<110> SK CHEMICALS CO., LTD. <120> Immunogenic Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) S protein composition and producing method thereof <130> P17-262 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4062 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALHA-SK-FL <400> 1 atgatccact ccgttttcct gctgatgttc ctcctgaccc ctaccgaatc ctacgttgac 60 gttggacccg actcagttaa gtccgcttgc atcgaagtcg acatccaaca gaccttcttc 120 gacaagacct ggcctagacc catcgacgtt tccaaggctg acggtatcat ctaccctcag 180 ggaagaacct actccaacat caccatcacc taccagggtt tgttcccata ccagggagac 240 cacggtgata tgtacgtgta ctccgctgga cacgctacag gaacaactcc acagaagttg 300 ttcgtcgcta actactccca ggacgttaag cagttcgcta acggattcgt cgtcagaatc 360 ggagctgccg ccaactccac cggaactgtt atcatcagcc catccaccag agctactatc 420 agaaagatct accctgcttt catgctgggt tcctccgttg gtaacttctc cgacggtaag 480 atgggaaggt tcttcaacca caccctggtt ctcttgccag acggatgcgg aactttgttg 540 agggctttct actgcatcct ggaacctagg tccggaaacc actgtcctgc tggaaattcc 600 tacacctctt 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Cys 165 170 175 Gly Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg Ser Gly 180 185 190 Asn His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr Tyr His 195 200 205 Thr Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Ser 210 215 220 Leu Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr Phe Met 225 230 235 240 Tyr Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Ile 245 250 255 Thr Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr Val Asp 260 265 270 Leu Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val Tyr Asp 275 280 285 Thr Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln 290 295 300 Ser Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro 305 310 315 320 Leu Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala 325 330 335 Ile Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu 340 345 350 Ser Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala 355 360 365 Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp 370 375 380 Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys 385 390 395 400 Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser 405 410 415 Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala 420 425 430 Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr 435 440 445 Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile 450 455 460 Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile 465 470 475 480 Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys 485 490 495 Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr 500 505 510 Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser 515 520 525 Ile Phe Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln 530 535 540 Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr 545 550 555 560 Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn 580 585 590 Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu 595 600 605 Tyr Gly Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly 610 615 620 Val Arg Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly 625 630 635 640 Tyr Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser 645 650 655 Val Pro Val Ser Val Ile Tyr Asp Lys Glu Thr Lys Thr His Ala Thr 660 665 670 Leu Phe Gly Ser Val Ala Cys Glu His Ile Ser Ser Thr Met Ser Gln 675 680 685 Tyr Ser Arg Ser Thr Arg Ser Met Leu Lys Arg Arg Asp Ser Thr Tyr 690 695 700 Gly Pro Leu Gln Thr Pro Val Gly Cys Val Leu Gly Leu Val Asn Ser 705 710 715 720 Ser Leu Phe Val Glu Asp Cys Lys Leu Pro Leu Gly Gln Ser Leu Cys 725 730 735 Ala Leu Pro Asp Thr Pro Ser Thr Leu Thr Pro Arg Ser Val Arg Ser 740 745 750 Val Pro Gly Glu Met Arg Leu Ala Ser Ile Ala Phe Asn His Pro Ile 755 760 765 Gln Val Asp Gln Leu Asn Ser Ser Tyr Phe Lys Leu Ser Ile Pro Thr 770 775 780 Asn Phe Ser Phe Gly Val Thr Gln Glu Tyr Ile Gln Thr Thr Ile Gln 785 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tccaaggctg acggtatcat ctaccctcag 180 ggaagaacct actccaacat caccatcacc taccagggtt tgttcccata ccagggagac 240 cacggtgata tgtacgtgta ctccgctgga cacgctacag gaacaactcc acagaagttg 300 ttcgtcgcta actactccca ggacgttaag cagttcgcta acggattcgt cgtcagaatc 360 ggagctgccg ccaactccac cggaactgtt atcatcagcc catccaccag agctactatc 420 agaaagatct accctgcttt catgctgggt tcctccgttg gtaacttctc cgacggtaag 480 atgggaaggt tcttcaacca caccctggtt ctcttgccag acggatgcgg aactttgttg 540 agggctttct actgcatcct ggaacctagg tccggaaacc actgtcctgc tggaaattcc 600 tacacctctt tcgctaccta ccacacccct gctacagatt gctctgacgg aaactacaac 660 cgtaacgcta gtctgaactc cttcaaggag tacttcaacc tgcgtaactg caccttcatg 720 tacacctaca acatcaccga ggacgagatc ctggagtggt tcggcatcac ccagaccgct 780 caaggtgttc acttgttctc ctccaggtac gttgacttgt acggaggaaa tatgttccag 840 ttcgctaccc tgcctgttta cgacaccatc aagtactact ccatcatccc tcacagcatc 900 cgttccatcc agtccgaccg taaggcttgg gctgctttct acgtttacaa gctccagcca 960 ctgaccttct tgctcgactt ctccgttgac ggttacatca 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Ala Leu His Gly Ala Asn Leu Arg Gln Asp Asp Ser Val Arg Asn 835 840 845 Leu Phe Ala Ser Val Lys Ser Ser Gln Ser Ser Pro Ile Ile Pro Gly 850 855 860 Phe Gly Gly Asp Phe Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Val Ser Ile Ser 865 870 875 880 Thr Gly Ser Arg Ser Ala Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp 885 890 895 Lys Val Thr Ile Ala Asp Pro Gly Tyr Met Gln Gly Tyr Asp Asp Cys 900 905 910 Met Gln Gln Gly Pro Ala Ser Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Tyr 915 920 925 Val Ala Gly Tyr Lys Val Leu Pro Pro Leu Met Asp Val Asn Met Glu 930 935 940 Ala Ala Tyr Thr Ser Ser Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly Val Gly Trp 945 950 955 960 Thr Ala Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ile Pro Phe Ala Gln Ser Ile 965 970 975 Phe Tyr Arg Leu Asn Gly Val Gly Ile Thr Gln Gln Val Leu Ser Glu 980 985 990 Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Lys Phe Asn Gln Ala Leu Gly Ala Met 995 1000 1005 Gln Thr Gly Phe Thr Thr Thr Asn Glu Ala Phe Arg Lys Val Gln Asp 1010 1015 1020 Ala Val Asn Asn Asn Ala Gln Ala Leu Ser Lys Leu Ala Ser Glu Leu 1025 1030 1035 1040 Ser Asn Thr Phe Gly Ala Ile Ser Ala Ser Ile Gly Asp Ile Ile Gln 1045 1050 1055 Arg Leu Asp Val Leu Glu Gln Asp Ala Gln Ile Asp Arg Leu Ile Asn 1060 1065 1070 Gly Arg Leu Thr Thr Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Gln Leu Val Arg 1075 1080 1085 Ser Glu Ser Ala Ala Leu Ser Ala Gln Leu Ala Lys Asp Lys Val Asn 1090 1095 1100 Glu Cys Val Lys Ala Gln Ser Lys Arg Ser Gly Phe Cys Gly Gln Gly 1105 1110 1115 1120 Thr His Ile Val Ser Phe Val Val Asn Ala Pro Asn Gly Leu Tyr Phe 1125 1130 1135 Met His Val Gly Tyr Tyr Pro Ser Asn His Ile Glu Val Val Ser Ala 1140 1145 1150 Tyr Gly Leu Cys Asp Ala Ala Asn Pro Thr Asn Cys Ile Ala Pro Val 1155 1160 1165 Asn Gly Tyr Phe Ile Lys Thr Asn Asn Thr Arg Ile Val Asp Glu Trp 1170 1175 1180 Ser Tyr Thr Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Pro Glu Pro Ile Thr Ser Leu 1185 1190 1195 1200 Asn Thr Lys Tyr Val Ala Pro His Val Thr Tyr Gln Asn Ile Ser Thr 1205 1210 1215 Asn Leu Pro Pro Pro Leu Leu Gly Asn Ser Thr Gly Ile Asp Phe Gln 1220 1225 1230 Asp Glu Leu Asp Glu Phe Phe Lys Asn Val Ser Thr Ser Ile Pro Asn 1235 1240 1245 Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ile Asn Thr Thr Leu Leu Asp Leu Thr Tyr 1250 1255 1260 Glu Met Leu Ser Leu Gln Gln Val Val Lys Ala Leu Asn Glu Ser Tyr 1265 1270 1275 1280 Ile Asp Leu Lys Glu Leu Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Asn Lys 1285 1290 <210> 7 <211> 3885 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KOR-SK-dTM <400> 7 atgatccact ccgttttcct gctgatgttc ctcctgaccc ctaccgaatc ctacgttgac 60 gttggacccg actcagttaa gtccgcttgc atcgaagtcg acatccaaca gaccttcttc 120 gacaagacct ggcctagacc catcgacgtt tccaaggctg acggtatcat ctaccctcag 180 ggaagaacct actccaacat caccatcacc taccagggtt tgttcccata ccagggagac 240 cacggtgata tgtacgtgta ctccgctgga cacgctacag gaacaactcc acagaagttg 300 ttcgtcgcta actactccca ggacgttaag cagttcgcta acggattcgt cgtcagaatc 360 ggagctgccg ccaactccac cggaactgtt atcatcagcc catccaccag agctactatc 420 agaaagatct accctgcttt catgctgggt tcctccgttg gtaacttctc cgacggtaag 480 atgggaaggt tcttcaacca caccctggtt ctcttgccag acggatgcgg aactttgttg 540 agggctttct actgcatcct ggaacctagg tccggaaacc actgtcctgc tggaaattcc 600 tacacctctt tcgctaccta ccacacccct gctacagatt gctctgacgg aaactacaac 660 cgtaacgcta gtctgaactc cttcaaggag tacttcaacc tgcgtaactg caccttcatg 720 tacacctaca acatcaccga ggacgagatc ctggagtggt tcggcatcac ccagaccgct 780 caaggtgttc acttgttctc ctccaggtac gttgacttgt acggaggaaa tatgttccag 840 ttcgctaccc tgcctgttta cgacaccatc aagtactact ccatcatccc tcacagcatc 900 cgttccatcc agtccgaccg taaggcttgg gctgctttct acgtttacaa gctccagcca 960 ctgaccttct tgctcgactt ctccgttgac ggttacatca ggcgtgctat cgactgcggt 1020 ttcaacgact tgtcccaatt gcactgctcc tacgaatcct tcgacgttga atccggagtt 1080 tactccgtct cctccttcga agctaagcct tccggatcag ttgttgagca ggctgagggt 1140 gttgaatgcg atttctcccc tttgttgtcc ggaacccctc ctcaagttta caacttcaag 1200 cgtctcgtct tcaccaactg caactacaac ctcaccaagc tgctctccct cttctccgtt 1260 aacgacttca cctgcagcca gatcagccca gctgctattg ctagtaactg ctacagcagc 1320 ttgatcctcg actacttcag ctacccactc agcatgaaga gcgacttgag cgttagcagc 1380 gctggtccaa ttagccagtt caactacaag cagagcttca gcaacccaac ctgcttgatc 1440 ctggctaccg ttcctcacaa cttgaccacc atcaccaagc ctttgaagta cagctacatc 1500 aacaagtgca gccgtctcct cagcgacgac cgtactgagg ttcctcaatt ggttaacgct 1560 aaccagtaca gcccatgcgt tagcatcttc ccaagcaccg tttgggaaga cggtgattac 1620 tacaggaagc agttgagccc attggagggt ggtggatggt tggttgctag tggttcaact 1680 gttgctatga ctgagcagtt gcagatggga ttcggaatca cagtccagta cggtacagac 1740 actaacagcg tgtgcccaaa gctcgaattc gccaacgaca caaagatcgc cagccagttg 1800 ggaaactgcg ttgagtacag cttgtacggt gtcagcggac gtggtgtgtt tcaaaactgc 1860 acagctgtcg gtgtgaggca acaaaggttc gtgtacgacg cttaccaaaa cctggtggga 1920 tactacagcg acgatggaaa ctactactgc ctccgtgctt gtgtgagtgt gcctgtgagt 1980 gtcatctacg acaaggagac taagactcac gctactctgt tcggtagcgt ggcttgtgag 2040 catatcagca gcactatgag ccagtacagc cgttctacaa ggagcatgct caagcgtcgt 2100 gatagcacat acggaccact ccaaacacct gtgggttgtg tcctgggact cgtgaattca 2160 tctctgttcg tcgaagactg caagctgcct ctcggtcaat ctctctgtgc tctccctgat 2220 acacctagta ctctcacacc tcgttctgtg cgttctgtgc caggtgaaat gcgtctcgct 2280 tctattgctt tcaaccaccc aatccaggtg gatcaactca actcttcata cttcaagctg 2340 tctatcccca ctaacttctc tttcggtgtg acacaggagt acatccagac aactatccag 2400 aaggtgacag tggactgcaa gcagtacgtg tgcaacggtt tccagaagtg tgagcagctg 2460 ctgcgcgagt acggccagtt ctgttctaag atcaaccagg ccctccacgg tgctaacctg 2520 cgccaagacg attctgtccg caatctcttc gcttctgtga agtcaagtca gtcatctccc 2580 atcatccccg gtttcggtgg tgatttcaac ctcacactcc tggagccagt gtctatcagt 2640 actggtagtc gctctgctcg ctcagctatc gaagacctgc tgtttgacaa ggtcactatc 2700 gctgacccag gttacatgca gggttacgac gattgtatgc agcagggccc cgcttcagcc 2760 cgcgatctca tttgtgccca atatgtggcc ggctataaag tcctgccccc cctcatggat 2820 gtgaatatgg aagccgccta tacttcatct ctgctcggct caattgccgg cgtgggctgg 2880 acagccggcc tgtcatcatt tgccgccatt ccctttgccc aatcaatttt ttatcgcctg 2940 aatggcgtgg gcattactca acaagtgctc tcagaaaatc aaaaactcat tgccaataaa 3000 ttcaaccaag ccctgggcgc catgcaaaca ggcttcacta caacaaacga ggcctttcgc 3060 aaagtgcaag atgccgtgaa taacaacgcc caagccctgt ctaagctggc ctcagaactg 3120 tcaaatactt tcggcgccat ttctgccagt atcggcgata tcatccagcg cctcgatgtg 3180 ctcgaacaag atgcccaaat tgaccgcctc attaacggcc gcctcacaac actgaatgcc 3240 tttgtggccc aacaactcgt gcgctcagaa tcagccgccc tgtcagccca actcgccaaa 3300 gataaagtca atgaatgtgt caaagcccaa tctaaacgct ctggcttttg tggccaaggc 3360 acacatattg tgtctttcgt ggtcaacgcc cccaatggcc tgtattttat gcacgtgggc 3420 tattacccca gtaaccacat cgaggtggtc agtgcctatg gcctgtgtga tgccgccaat 3480 cccactaatt gtattgcccc cgtcaacggc tattttatca agactaacaa cactcgcatc 3540 gtcgacgagt ggtcatacac aggctcatca ttctacgccc ccgaacccat tacatctctg 3600 aacacaaagt acgtcgcccc ccaagtgaca taccagaaca tctcaactaa cctcccccca 3660 ccactgctcg gcaactcaac aggcatcgat tttcaagatg aactggatga gttcttcaag 3720 aacgtctcaa cttcaatccc caacttcggc tctctgacac agatcaacac tacactgctc 3780 gacctgactt acgagatgct gtctctgcag caggtcgtca aggccctgaa cgagtcttac 3840 atcgacctga aggagctggg caactacact tactacaaca agtaa 3885 <210> 8 <211> 1294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KOR-SK-dTM <400> 8 Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu 20 25 30 Val Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile 35 40 45 Asp Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr 50 55 60 Ser Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp 65 70 75 80 His Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr 85 90 95 Pro Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe 100 105 110 Ala Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser Thr Gly 115 120 125 Thr Val Ile Ile Ser Pro Ser Thr Arg Ala Thr Ile Arg Lys Ile Tyr 130 135 140 Pro Ala Phe Met Leu Gly Ser Ser Val Gly Asn Phe Ser Asp Gly Lys 145 150 155 160 Met Gly Arg Phe Phe Asn His Thr Leu Val Leu Leu Pro Asp Gly Cys 165 170 175 Gly Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg Ser Gly 180 185 190 Asn His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr Tyr His 195 200 205 Thr Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Ser 210 215 220 Leu Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr Phe Met 225 230 235 240 Tyr Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Ile 245 250 255 Thr Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr Val Asp 260 265 270 Leu Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val Tyr Asp 275 280 285 Thr Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln 290 295 300 Ser Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro 305 310 315 320 Leu Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala 325 330 335 Ile Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu 340 345 350 Ser Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala 355 360 365 Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp 370 375 380 Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys 385 390 395 400 Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser 405 410 415 Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala 420 425 430 Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr 435 440 445 Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile 450 455 460 Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile 465 470 475 480 Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys 485 490 495 Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr 500 505 510 Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser 515 520 525 Ile Phe Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln 530 535 540 Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr 545 550 555 560 Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn 580 585 590 Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu 595 600 605 Tyr Gly Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly 610 615 620 Val Arg Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly 625 630 635 640 Tyr Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser 645 650 655 Val Pro Val Ser Val Ile Tyr Asp Lys Glu Thr Lys Thr His Ala Thr 660 665 670 Leu Phe Gly Ser Val Ala Cys Glu His Ile Ser Ser Thr Met Ser Gln 675 680 685 Tyr Ser Arg Ser Thr Arg Ser Met Leu Lys Arg Arg Asp Ser Thr Tyr 690 695 700 Gly Pro Leu Gln Thr Pro Val Gly Cys Val Leu Gly Leu Val Asn Ser 705 710 715 720 Ser Leu Phe Val Glu Asp Cys Lys Leu Pro Leu Gly Gln Ser Leu Cys 725 730 735 Ala Leu Pro Asp Thr Pro Ser Thr Leu Thr Pro Arg Ser Val Arg Ser 740 745 750 Val Pro Gly Glu Met Arg Leu Ala Ser Ile Ala Phe Asn His Pro Ile 755 760 765 Gln Val Asp Gln Leu Asn Ser Ser Tyr Phe Lys Leu Ser Ile Pro Thr 770 775 780 Asn Phe Ser Phe Gly Val Thr Gln Glu Tyr Ile Gln Thr Thr Ile Gln 785 790 795 800 Lys Val Thr Val Asp Cys Lys Gln Tyr Val Cys Asn Gly Phe Gln Lys 805 810 815 Cys Glu Gln Leu Leu Arg Glu Tyr Gly Gln Phe Cys Ser Lys Ile Asn 820 825 830 Gln Ala Leu His Gly Ala Asn Leu Arg Gln Asp Asp Ser Val Arg Asn 835 840 845 Leu Phe Ala Ser Val Lys Ser Ser Gln Ser Ser Pro Ile Ile Pro Gly 850 855 860 Phe Gly Gly Asp Phe Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Val Ser Ile Ser 865 870 875 880 Thr Gly Ser Arg Ser Ala Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp 885 890 895 Lys Val Thr Ile Ala Asp Pro Gly Tyr Met Gln Gly Tyr Asp Asp Cys 900 905 910 Met Gln Gln Gly Pro Ala Ser Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Tyr 915 920 925 Val Ala Gly Tyr Lys Val Leu Pro Pro Leu Met Asp Val Asn Met Glu 930 935 940 Ala Ala Tyr Thr Ser Ser Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly Val Gly Trp 945 950 955 960 Thr Ala Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ile Pro Phe Ala Gln Ser Ile 965 970 975 Phe Tyr Arg Leu Asn Gly Val Gly Ile Thr Gln Gln Val Leu Ser Glu 980 985 990 Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Lys Phe Asn Gln Ala Leu Gly Ala Met 995 1000 1005 Gln Thr Gly Phe Thr Thr Thr Asn Glu Ala Phe Arg Lys Val Gln Asp 1010 1015 1020 Ala Val Asn Asn Asn Ala Gln Ala Leu Ser Lys Leu Ala Ser Glu Leu 1025 1030 1035 1040 Ser Asn Thr Phe Gly Ala Ile Ser Ala Ser Ile Gly Asp Ile Ile Gln 1045 1050 1055 Arg Leu Asp Val Leu Glu Gln Asp Ala Gln Ile Asp Arg Leu Ile Asn 1060 1065 1070 Gly Arg Leu Thr Thr Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Gln Leu Val Arg 1075 1080 1085 Ser Glu Ser Ala Ala Leu Ser Ala Gln Leu Ala Lys Asp Lys Val Asn 1090 1095 1100 Glu Cys Val Lys Ala Gln Ser Lys Arg Ser Gly Phe Cys Gly Gln Gly 1105 1110 1115 1120 Thr His Ile Val Ser Phe Val Val Asn Ala Pro Asn Gly Leu Tyr Phe 1125 1130 1135 Met His Val Gly Tyr Tyr Pro Ser Asn His Ile Glu Val Val Ser Ala 1140 1145 1150 Tyr Gly Leu Cys Asp Ala Ala Asn Pro Thr Asn Cys Ile Ala Pro Val 1155 1160 1165 Asn Gly Tyr Phe Ile Lys Thr Asn Asn Thr Arg Ile Val Asp Glu Trp 1170 1175 1180 Ser Tyr Thr Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Pro Glu Pro Ile Thr Ser Leu 1185 1190 1195 1200 Asn Thr Lys Tyr Val Ala Pro Gln Val Thr Tyr Gln Asn Ile Ser Thr 1205 1210 1215 Asn Leu Pro Pro Pro Leu Leu Gly Asn Ser Thr Gly Ile Asp Phe Gln 1220 1225 1230 Asp Glu Leu Asp Glu Phe Phe Lys Asn Val Ser Thr Ser Ile Pro Asn 1235 1240 1245 Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ile Asn Thr Thr Leu Leu Asp Leu Thr Tyr 1250 1255 1260 Glu Met Leu Ser Leu Gln Gln Val Val Lys Ala Leu Asn Glu Ser Tyr 1265 1270 1275 1280 Ile Asp Leu Lys Glu Leu Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Asn Lys 1285 1290

Claims (34)

  1. 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군에서 선택된, 어느 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 MERS-CoV S 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 서열번호 2 또는 4의 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 면역원성 조성물.
  3. 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군에서 선택된, 어느 하나의 MERS-CoV S 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하는, MERS-CoV 예방 백신.
  4. 제3항에 있어서, 상기 백신은 보조제 또는 면역 증강제가 더 포함된 것을 특징으로 하는, MERS-CoV 예방 백신.
  5. 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이상의 폴리펩타이드를 포함하는 MERS-CoV S 면역원성 조성물 또는 이를 포함하는 백신을 투여하는 것을 포함하는, MERS-CoV 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법.
  6. (a) 서열번호 1, 3, 5 및 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 MERS-CoV S 단백질 유전자를 도입하여 재조합 바이러스 벡터를 제작하는 단계; 및
    (b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 숙주 세포에 접종시켜 상기 숙주 세포를 배양하여 MERS-CoV S 단백질 면역원이 발현되는 배양물을 얻는 단계를
    포함하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 발현된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 배큘로바이러스과(Baculoviridae) 아데노바이러스과(Adenoviridae), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 백시니아바이러스과(Vacciniaviridae), 및 파보바이러스과(Parvoviridae)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 배큘로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵다각체 병 바이러스 주 또는 그 변형된 바이러스 주; 또는
    몸빅스 모리(Bombyx mori) 핵다각체 병 바이러스 주 또는 그 변형된 바이러스 주를 포함하는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 마이코박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 원핵 숙주 세포;
    293세포 계열(human embryonic kidney lineage), CHO세포 계열 (Chinese hamster ovary cell lineage), Vero세포 계열 (African green monkey lineage), MRC세포 계열 (human lung fibroblast cell lineage), 및 MDCK 세포 계열 (madin-darby canine kidney cell lineage)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 포유류 숙주 세포; 또는
    Sf9, Sf21세포, 및 하이 파이브(High-Five) 세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 곤충 숙주 세포 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 서열번호 1, 3, 5 및 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 MERS-CoV S 단백질 유전자를 도입하여 재조합 배큘로바이러스 벡터를 제작하는 단계이며,
    상기 (b) 단계는 상기 재조합 배큘로바이러스 벡터를 0.001 내지 5 MOI로 5.00E5-1.50E6 농도의 Sf9 곤충세포에 감염시키는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스 벡터는 0.002 내지 4.0 MOI로 Sf9 곤충세포에 감염되는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스 벡터는 0.003 내지 3.0 MOI로 Sf9 곤충세포에 감염되는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스 벡터는 0.004 내지 2.0 MOI 로 Sf9 곤충세포에 감염되는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스 벡터는 0.005내지 1.0 MOI 로 Sf9 곤충세포에 감염되는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스 벡터는 0.01 내지 0.8 MOI 로 Sf9 곤충세포에 감염되는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 MERS-CoV S 단백질 항원은 Sf9 세포의 생존율이 1내지 99%인 상태에서 수득되는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 MERS-CoV S 단백질 항원은 Sf9 세포의 생존율이 75내지 98%인 상태에서 수득되는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 면역원 제조 방법은
    (c) 상기 배양물을 1,000 내지 20,000xg에서 1-30분간 원심분리하여 상청액과 세포를 분리하여 침강된 Sf9 세포를 얻는 단계;
    (d) 상기 침강된 Sf9 세포를 pH 6.5-8.5의 용해 버퍼로 세포 용해(cell lysis)하여 용해액을 얻는 단계;
    (e) 상기 용해액을 순차 원심분리하여 상기 용해액의 상청액을 제거하여 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편이 포함된 세포의 구성요소만을 얻는 단계; 및
    (f) 상기 MERS-CoV 항원이 포함된 세포 구성요소에서 MERS-CoV이 포함된 항원 이 포함된 부분만을 선택적으로 추출하는 단계를 포함하는, MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 (c)단계는 상기 배양물을 1,500 내지 15,000xg의 속도로 원심분리하는 것을 특징으로 하는, MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 (c)단계는 상기 배양물을 2,000 내지 10,000xg 의 속도로 원심분리하는 것을 특징으로 하는, MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 (c)단계는 상기 배양물을 3,000 내지 8,000xg 의 속도로 원심분리하는 것을 특징으로 하는, MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 (e) 단계의 순차 원심분리는
    (i) 상기 용해액을 500 내지 20,000xg 에서 1-30분 원심분리하여, 침강된 침전물을 제거하고 세포막을 포함하는 상청액을 취하는 단계; 및
    (ii) 상기 (i) 단계의 상청액을 4-10℃에서 50,000-250,000xg로 60-420분간 초원심분리하여 침전물을 취하고 상청액을 제거하여 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편이 포함된 세포의 구성요소만을 취하는 단계를 포함하는, MERS-CoV S 단백질 항원을 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 (e)단계의 순차 원심분리의 (i) 단계는 상기 용해액을 500 내지 20000xg에서 1-30분 원심분리하여, 침강된 침전물을 제거하고 세포막을 포함하는 상청액을 취하는 단계인 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 (e)단계의 순차 원심분리의 (i) 단계는 상기 용해액을 1,000 내지 15,000xg 에서 1-30분 원심분리하여, 침강된 침전물을 제거하고 세포막을 포함하는 상청액을 취하는 단계인 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 (e)단계의 순차 원심분리의 (i) 단계는 상기 용해액을 1,500 내지 10,000xg 에서 1-30분 원심분리하여, 침강된 침전물을 제거하고 세포막을 포함하는 상청액을 취하는 단계인 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 (e)단계의 순차 원심분리의 (i) 단계는 상기 용해액을 2,000 내지 7,000xg 에서 1-30분 원심분리하여, 침강된 침전물을 제거하고 세포막을 포함하는 상청액을 취하는 단계인 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 (e)단계의 (ii) 단계는 (i) 단계의 상청액을 10,000 내지 400,000xg의 속도로 초원심분리하여 침전물을 취하는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  30. 제24항에 있어서,
    상기 (e)단계의 (ii) 단계는 (i) 단계의 상청액을 20,000 내지 350,000xg의 속도로 초원심분리하여 침전물을 취하는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  31. 제24항에 있어서,
    상기 (e)단계의 (ii) 단계는 (i) 단계의 상청액을 35,000 내지 300,000xg의 속도로 초원심분리하여 침전물을 취하는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  32. 제24항에 있어서,
    상기 (e)단계의 (ii) 단계는 (i) 단계의 상청액을 50,000 내지 250,000xg의 속도로 초원심분리하여 침전물을 취하는 것을 특징으로 하는 MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  33. 제20항에 있어서, 상기 (f) 단계의 추출 과정은
    (i) 상기 순차원심 분리를 끝낸 후 확보된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 MERS-CoV 항원이 포함된 세포의 구성요소로부터 추출 버퍼를 첨가하여 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편이 포함된 부분을 선택적으로 추출하는 단계;
    (ii) 상기 (i)의 추출로 확보된 내용물을 4-10℃에서 5,000 내지 300,000xg 로 초원심분리하여 상청액을 버리고 침전물만 확보하는 단계를 포함하는, MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
  34. 제20항에 있어서, 상기 면역원 제조 방법은
    (g) MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 MERS-CoV 항원을 정제하는 단계를 더 포함하며,
    상기 정제는 (i) 양이온 교환 크로마토그래피법으로 1차 정제를 실시하며,
    (ii) 글루코스 친화 크로마토그래피법으로 2차 정제를 실시하는 것을 특징으로 하는, MERS-CoV S 단백질 면역원을 제조하는 방법.
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