KR20230060818A

KR20230060818A - 말라리아 원충의 msp-8, msp-9 및 rap1을 포함하는 바이러스 유사입자 조합 백신

Info

Publication number: KR20230060818A
Application number: KR1020210145420A
Authority: KR
Inventors: 전복실; 이수화
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2023-05-08

Abstract

본 발명은 말라리아 원충의 MSP-8, MSP-9 및 RAP1을 포함하는 바이러스 유사입자(Virus-like particles, VLPs) 조합 백신에 관한 것으로서, 구체적으로, 인플루엔자 M1을 이용하여 말라리아 질병을 유발하는 기생 원충 (Plasmodium berghei, ANKA strain) MSP-8, MSP-9 및 RAP1 항원 유전자 후보의 바이러스 유사입자 백신을 제조하였다. Plasmodium 속 MSP-8, MSP-9 및 RAP1 단백질을 발현하는 바이러스 유사입자를 각각 제조하였으며, 이를 1:1:1 비율로 조합하여 동물모델(마우스)에서 효능을 확인하였다. 백신을 마우스에 접종 시 쥐 말라리아 원충 감염에 대한 방어면역을 일으키며 말라리아 원충으로 발생하는 과 염증반응을 완화시킨다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에서 개발된 바이러스 유사 입자 백신 기술은 말라리아 원충 외에도 다양한 기생충 및 바이러스 감염 질환에 대응할 수 있는 기술적인 파급 효과를 가지고 있다.

Description

말라리아 원충의 MSP-8, MSP-9 및 RAP1을 포함하는 바이러스 유사입자 조합 백신{Virus-like particles combination vaccines comprising MSP-8, MSP-9 and RAP1 of malaria protozoa}

본 발명은 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질 8(merozoite surface protein 8; MSP-8), 메로조이트 표면 단백질 9(merozoite surface protein 9; MSP-9) 및 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 바이러스 유사입자(Virus-like particles, VLPs) 조합 백신에 대한 것이다.

말라리아는 사람 혈액 속에서 기생하여 학질을 일으키며, 세계적으로 단일 질환으로 가장 많은 사망자(연간 240 만명)를 발생시키는 질환이다. 매년 약 300 내지 500백만명이 비교적 높은 유병율(morbidity) 및 치사율(mortality)로 말라리아에 감염되고 있다. 특히 아동 뿐만 아니라 이전에 말라리아에 노출된 적이 없는 성인의 경우에도 말라리아 감염에 의한 유병율 및 치사율이 심각한 수준이다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 매년 아프리카에서만 2 내지 3백만 어린이들이 말라리아로 사망하는 것으로 추산한다. 또한, 약물 저항성 기생충(Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax) 및 살충제-저항성 매개체(Anopheles mosquitoes)에 의해 유발되는 말라리아의 광범위한 발생 및 유병율의 증가로 인해, 많은 국가에서 말라리아의 새로운 통제 방법을 개발해야 할 필요성을 강조하고 있다.

국내에서는 휴전선과 인근한 경기 북부 지방 및 강원 북서부를 중심으로 말라리아가 재 출현하였으며, 현재 감염위험 지역이 점차 확대되고 있다. 국내에서 매년 천명 이상의 환자가 발생하고 있으나, 현재 말라리아 치료제인 클로로퀸(chloroquine), 아르테메터(artemether) 등은 내성을 유발하므로 백신 접종법이 말라리아 원충을 예방함에 있어 가장 효과적인 방법으로 평가되고 있다.

한편, 바이러스-유사입자는 실제 바이러스 구조와 형태학적으로 유사한 항원의 종류를 의미하며, 여러 바이러스에 대한 백신 항원으로 제안되어 왔다. 바이러스-유사입자는 바이러스 구조 단백질들의 결합을 통하여 실제 바이러스와 유사한 형태로 조립되지만, 조립과정에서 바이러스의 유전자가 포함되지 않아 감염의 위험성이 없어 매우 안전한 것이 특징이다.

종래에는 말라리아 백신과 관련하여 재조합 단백질 또는 약독화된 백시니아 바이러스로 제공되는 2개의 항원(Pfs25와 Pvs25)에 중점을 두어 연구하였지만, 그 효과가 크지 않다고 알려짐에 따라, 효과가 향상된 말라리아 백신의 연구개발이 요구되고 있다.

한국공개특허 제10-2021-0096368호(2021.08.05 공개)

본 발명의 목적은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 1) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자; 2) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질 8(merozoite surface protein 8; MSP-8)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자; 및 3) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질 9(merozoite surface protein 9; MSP-9)를 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 M1을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열; 및 RAP1을 암호화하는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스-유사입자를 발현시키는 단계를 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자; 2) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질 8(merozoite surface protein 8; MSP-8)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자; 및 3) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질 9(merozoite surface protein 9; MSP-9)를 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 말라리아 원충의 MSP-8, MSP-9 및 RAP1을 포함하는 바이러스 유사입자(Virus-like particles, VLPs) 조합 백신에 관한 것으로서, 구체적으로, 인플루엔자 M1을 이용하여 말라리아 질병을 유발하는 기생 원충 (Plasmodium berghei , ANKA strain) MSP-8, MSP-9 및 RAP1 항원 유전자 후보의 바이러스 유사입자 백신을 제조하였다. Plasmodium 속 MSP-8, MSP-9 및 RAP1 단백질을 발현하는 바이러스 유사입자를 각각 제조하였으며, 이를 1:1:1 비율로 조합하여 동물모델(마우스)에서 효능을 확인하였다. 백신을 마우스에 접종 시 쥐 말라리아 원충 감염에 대한 방어면역을 일으키며 말라리아 원충으로 발생하는 과 염증반응을 완화시킨다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에서 개발된 바이러스 유사 입자 백신 기술은 말라리아 원충 외에도 다양한 기생충 및 바이러스 감염 질환에 대응할 수 있는 기술적인 파급 효과를 가지고 있다.

도 1은 말라리아 원충 유전자 곤봉체 관련 단백질 1 (rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 이용하여 쥐 말라리아 원충 바이러스 유사입자 (virus-like particles, VLPs)를 제조한 결과를 나타낸다. (A) 인플루엔자 M1을 core protein으로 이용한 Plasmodium berghei의 RAP1을 발현하는 VLPs 백신을 전자현미경으로 확인하였다. (B) P. berghei RAP1 VLP 백신을 말라리아 원충 감염 혈청 및 인플루엔자 M1 단일 항체로 반응시킨 웨스턴 블랏 결과이다.
도 2 및 도 3은 말라리아 원충 MSP-8, MSP-9 및 RAP1 조합 바이러스 유사입자 백신을 마우스에 접종시킨 후, 수집한 혈청에서 항체반응 확인 및 백신 접종 후, Plasmodium berghei (ANKA strain) 치사량을 마우스에 감염시킨 뒤 비장에서 면역세포 반응을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4 내지 도 6은 말라리아 원충 MSP-8, MSP-9 및 RAP1 조합 바이러스 유사입자 백신을 마우스에 접종시키고 Plasmodium berghei (ANKA strain) 치사량을 마우스에 감염시킨 후, 비장 내 염증성 사이토카인, 혈중 기생충 증식율 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)을 제공한다.

본 발명에서 “말라리아(malaria)”는 말라리아 원충에 감염되어 발생하는 급성 열성 전염병을 의미하는 것으로서, 원인 병원체의 종류에 따라 증상 및 특징이 다르다. 구체적으로, 본 발명에서 상기 말라리아 원충은 설치류 말라리아 원충(Plasmodium berghei ANKA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “바이러스-유사입자(Virus-Like Particles, VLPs)”는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 소단위체를 의미한다. 예컨대, 상기 바이러스-유사입자는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여되어 있거나, 바이러스성 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자의 경우 자발적 자가 어셈블리를 진행할 수도 있다.

본 발명에서 “말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자”는 말라리아에 대한 특이적인 면역 반응을 유도하며, 바이러스와 유사한 형태를 가진 단백질 구조체(입자)를 의미한다.

상기 바이러스-유사입자는 바이러스에서 유래한 구조 단백질이 조립되어 바이러스와 유사한 형태의 입자를 생성함과 동시에 말라리아 원충으로부터 유래한 항원 결정 부위를 포함함으로써, 상기 바이러스-유사입자를 특정 개체에 접종하였을 때 말라리아에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적 일 예로서, 상기 단백질 구조체는 바이러스 유래의 구조 단백질 외부에 말라리아 원충 유래의 항원 결정 부위가 결합된 형태를 가질 수 있다.

상기 바이러스 유래의 구조 단백질(core protein)은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1)일 수 있다.

본 발명에서 “인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1)”은 인플루엔자 바이러스의 구조 단백질로서, 인플루엔자 바이러스의 외피(envelop)인 지방층 안쪽에 코트(coat)를 형성하는 기질단백질(matrix protein)을 의미한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 8개의 분절된 음성가닥 RNA, 표면 단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, H), 뉴라미다제(neuraminidase, N), 뉴클레오프로테인(neucleoprotein, NP) 매트릭스(matrix, M1), 프로톤 이온-채널 단백질(proton ion-channel protein, M2), 중합효소 염기 단백질 1(polymerase acidic protein, PA), 중합효소 염기 단백질 2(PB2, polyMerase basic protein 2), 중합효소 산성 단백질(PA, polymerase acidic protein) 및 비구조 단백질 2(NS2, nonstructural protein 2)와 같은 단백질을 포함하는데, 이때 매트릭스 단백질 1은 외형을 층으로 둘러 쌓고 있음으로써 코어와 외피 간의 연결체로 작용한다. 상기 매트릭스 단백질 1은 바이러스-유사입자 생성에 있어, 바이러스-유사입자를 안정한 형태로 조립하는데 중요한 역할을 한다.

상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 A/Puerto Rico/8/34, A/Bangkok/163/2000, A/AA/Huston/1945, A/Berlin/6/2006, A/Brandenburg/1/2006, A/Brevig Mission/1/1918, A/Chile/8885/2001, A/DaNang/DN311/2008, A/FLW/1951, A/FW/1/1950, A/Fiji/15899/83, A/Fort Monmouth/1-MA/1947, A/HaNoi/TX233/2008, A/Iowa/CEID23/2005, A/Malaysia/35164/2006, A/Managua/4086.04/2008, A/Texas/VR06-0502/2007, A/WSN/1933, A/Colorado/18/2011, A/Kentucky/04/2010, A/Maryland/28/2009, A/New Mexico/05/2012, A/Philippines/TMC10-135/2010, A/Singapore/GP4307/2010, A/Singapore/GP489/2010, A/Boston/14/2007, A/Brisbane/09/2006, A/Hong Kong/CUH34175/2002, A/Kyrgyzstan/WRAIR1256P/2008, A/Malaysia/12550/1997, A/Nanjing/1663/2010, A/Wyoming/08/2010, A/Berkeley/1/1968, A/Korea/426/1968 등으로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 A/Puerto Rico/8/34 유래 M1 단백질을 바이러스-유사입자의 구조 단백질로 활용하였다.

상기 말라리아 원충으로부터 유래한 항원 결정 부위는 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)일 수 있다.

본 발명에서 용어 “항원 결정 부위(epitope)”는 각각의 항체 또는 T 세포 수용체에 의한 인식의 기본 요소 또는 최소 단위이며, 상기 항체 또는 T 세포 수용체가 결합하는 특정 도메인, 영역 또는 분자 구조를 의미한다. 상기 항원 결정 부위는 말라리아에서 유래할 수 있으며, 상기 말라리아에 대한 면역 활성을 유도할 수 있으면 특별히 제한되지 않는다.

구체적으로 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 곤봉체 관련 단백질 1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1 또는 곤봉체 관련 단백질 1은 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 기능적 동등물을 포함한 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 가장 구체적으로는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다.

본 발명에서 용어 "실질적으로 동등한 생리활성"은 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1 또는 곤봉체 관련 단백질 1과의 구조적, 기능적 상동성으로 인해 말라리아에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자로서의 활성을 의미한다.

보다 구체적으로 상기 인플루엔자 바이러스 메트릭스 단백질 1은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 곤봉체 관련 단백질 1은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화 될 수 있다. 예컨대, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 M1은 Genebank Accession No. ABO21712 또는 Genebank Accession No. EF467824 로 표현되는 유전자일 수 있다. 상기 곤봉체 관련 단백질 1은 Genebank Accession No. XP034422120.1 또는 Genebank Accession No. XM_034565422.1로 표현되는 유전자일 수 있다.

상기 바이러스-유사입자는 개체 내에서 항원으로 작용하며 수상돌기세포(dendritic cells)와 같은 항원 표지 세포와의 반응을 통해 T 또는 B 면역 세포에 항원을 표지할 수 있다.

바람직하게는, 상기 M1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 RAP1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 MSP-8은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 MSP-9는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 MSP-8은 서열번호 7의 핵산 서열로 이루어지고, 상기 MSP-9는 서열번호 8의 핵산서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “백신 조성물”은 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 이후의 병원균 감염을 예방할 수 있는 조성물을 의미한다. 상기 백신 조성물은 말라리아 원충에 대한 항원성을 나타내는 바이러스-유사입자를 포함하는 조성물일 수 있다.

구체적으로, 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 면역 자극제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 공지되어있으며, 단백질, 설탕 등을 포함한다. 상기 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 포함한다. 수용액 담체는 식용수 및 완충배지를 포함하는 물, 알코올/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제로서 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 방부제로는 포르말린 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 백신 조성물은 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 보조제는 프로인트 완전보존제, 프로인트 불완전보존제, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플투론 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 백신 조성물은 면역 자극제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역 자극제는 인공적으로 합성된 레바미솔, 이소프레노신 및 사이토카인을 포함할 수 있다. 사이토카인의 일 예로서 인터페론-α, 인터류킨-2, GM-CSF, GCSF 등이 있다. 상기 백신 조성물은 상기 바이러스-유사입자 또는 이의 농축액을 포함하는 형태이거나, 형질전환 숙주 세포 자체 또는 형질전환 세포의 건조 분말 형태로 사용할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물은 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제2보조제를 더 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제가 함께 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트calcium carbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등이 함께 사용될 수 있다. 또한 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 사용될 수 있다. 비수용성제제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 M1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 RAP1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “벡터”는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 고리형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 용어 “발현 벡터”는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 벡터는 바큘로바이러스(Baculovirus) 벡터일 수 있다. 상기 바큘로바이러스(Baculovirus)는 사람이나 척추동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성을 가지고 있는 병원성 바이러스를 의미한다.

상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포는 상기 바이러스-유사입자를 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다.

상기 바이러스-유사입자를 암호화하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 상기 바이러스-유사입자를 암호화하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.

또한, 상기 발현 벡터는 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein, yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP) 유전자 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명에서 용어 “숙주 세포(host cell)”는 바이러스에 의해 감염될 수 있고 바이러스 유사 입자에 의해 면역될 수 있는 모든 유기체를 의미한다. 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 대사 조작될 수 있다.

상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주 세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.

본 발명에서 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 또는 특정 세포 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 대상 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl2 방법, 하나한 방법 및 전기 천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 형질 전환 대상 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트 및 열 충격을 이용한 형질 전환법과 전기천공법에 의해 실시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 바이러스-유사입자는 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 별도의 원인 감염체, 즉 본 발명에서 는 말라리아 원충 없이도 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으므로 높은 생산성 및 경제성이 구현될 수 있다.

상기 바이러스-유사입자는 당해 기술 분야에 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스-유사입자는 상기 구조 단백질 및 항원 인식 부위를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 소정의 숙주 세포를 형질 전환시킨 후 배양하여 제조될 수 있으며, 세포 안에서 발현된 단백질이 세포 표면에서 조립된 후 배양 상층액으로 배출될 수 있다. 이 때, 상기 바이러스-유사입자에 포함된 표면단백질은 고정화 과정을 거치지 않고 자연 그대로의 형태를 유지하고 있으므로 개체 내에서 특정 병원체에 대한 목적하는 면역반응을 유도할 수 있다.

상기 형질 전환된 숙주 세포는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 상기 바이러스-유사입자를 발현할 수 있으므로 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 바이러스-유사입자 단백질을 수득할 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> 말라리아 원충 유전자 RAP1을 이용하여 쥐 말라리아 원충 바이러스 유사입자 (virus-like particles, VLPs ) 제조

인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1) 및 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 바이러스-유사입자를 제조하기 위해, 설치류 말라리아(Plasmodium berghei ANKA)의 RAP1의 일부를 항원 유전자로 선정하였다. 백신 제조를 위해 P. berghei의 최적화된 RAP1이 pFastBac 벡터에 삽입되어 있는 형태로 genscript사에 주문하였다.

상기 인플루엔자 매트릭스 단백질 1(M1) 유전자는 한국 공개특허 10-2019-0009691호에 기재된 M1 유전자와 동일한 서열을 사용하였다(GenBank accession number: EF467824, 1027bp).

이후, 상기 인플루엔자 M1 단백질 유전자를 RAP1 암호화 서열이 도입된 pFastBac 벡터에 도입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다. 이때, 상기 pFastBac 벡터에 도입된 M1 및 RAP1 유전자가 제대로 도입되었는지를 DNA 염기서열 결정법에 의해 확인하였다.

RAP1 및 M1을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(recombinant BaculoViruses, rBVs)를 제조하기 위하여, cellfectin Ⅱ(Invitrogen) 및 SF9 세포를 이용하여 DNA 형질 감염을 수행하였다. RAP1 및 M1을 포함하는 pFastBac 벡터를 이용한 형질 전환은 white/blue 스크리닝에 의해 수행되었다. 재조합 바큘로바이러스는 Bacto-Bac 발현 시스템(Invitrogen)를 통해 제조사의 매뉴얼에 따라 제조되었다.

말라리아의 바이러스-유사입자는 RAP1 및 M1을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(rBVs)에 의해 공동-감염된 SF9 곤충 세포에서 생산하였다. 상청액 내의 바이러스-유사입자는 고속원심분리(30분, 45,000×g)를 사용해 펠렛화하였다.

바이러스-유사입자를 4℃에서 인산완충식염수(PBS)에 하룻밤 동안 재현탁하였고, 불연속 수크로오스 구배(15-30-60%)를 통해 4℃, 45,000×g에서 1 시간 동안 수확하고 정제하였다. 단백질 농도는 QuantiPro BCA Assay Kit(Sigma-Aldrich)에 의해 결정하였다.

상기에서 제작한 인플루엔자 M1을 core protein으로 이용한 Plasmodium berghei의 RAP1을 발현하는 VLPs 백신을 전자현미경법 및 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다(도 1).

바이러스-유사입자를 곤충세포에서 생성한 VLPs 백신의 형태를 확인하기 위해 주사전자현미경(transmission electron microscope)을 통해 촬영하였다. VLPs는 negative stain 후 grid에 올려 주사전자현미경 아래서 관찰하였다(도 1A).

RAP1 VLPs 백신의 구성성분을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 시행하였다. VLPs 샘플을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)에 전기영동하여 단백질의 크기별로 분리하고 이것을 NC 멤브레인에 옮겼다. 멤브레인은 5% 스킴 밀크(skim milk)로 30분 동안 실온에서 반응시켰다. TBST buffer로 씻어낸 후, 말라리아 원충(Plasmodium berghei) 감염 혈청 (1:500 으로 희석함, RAP1을 검출하기 위함) 및 인플루엔자 M1 단일클론항체 (1:2000으로 희석함, M1을 검출하기 위함)에 멤브레인을 담궈 약 16시간 (overnight) 4℃ 에서 반응시켰다. TBST buffer로 씻어낸 후, HRP-conjugated goat anti-mouse IgG 항체를 1:3000으로 희석하여 1시간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 ECL 용액을 뿌려 암실에서 필름에 현상하여 밴드(band)를 확인하였다(도 1B).

한편, 본 발명에서 사용된 말라리아 원충 메로조이트 표면 단백질 8(merozoite surface protein 8; MSP-8) 및 메로조이트 표면 단백질 9(merozoite surface protein 9; MSP-9) VLPs는 각각 본 발명자들이 이전에 출원한 한국특허출원 제10-2020-0123118호(출원일: 2020.09.23) 및 한국특허출원 제10-2020-0009722호(출원일: 2020.01.28)에 기재된 대로 제조하였다.

< 실시예 2> 동물모델에서 백신효능 검증

말라리아 원충 MSP-8, MSP-9 및 RAP1 조합 바이러스 유사입자 백신을 마우스에 접종시킨 후 수집한 혈청에서 항체반응 확인 및 백신 접종 후, Plasmodium berghei (ANKA strain) 치사량을 마우스에 감염시킨 뒤 비장에서 면역세포 반응을 확인하였다.

마우스로부터 수집한 혈청에서 항체반응을 확인하기 위해 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 시행하였다. 말라이아 원충 항원 및 조합 VLPs (MSP8+MSP9+RAP1)를 2 또는 0.5 ug/ml이 되도록 0.05M carbonate buffer에 희석시켜 96 well immunoplate에 well 당 100 ul 씩 분주하여 코팅하였다(overnight at 4℃). Plate는 PBST로 씻어낸 후, 0.2% gelatin in PBST 를 well 당 200 ul 씩 분주하여 차단(blocking)하였다(37℃에서 1시간 동안). PBST로 씻어낸 후, 마우스로부터 수집한 혈청을 연속 희석(serial dilution) 하여 well 당 100 ul 씩 분주하여 반응시켰다(37℃에서 2시간 동안). PBST로 씻어낸 후, HRP-conjugated goat anti-mouse IgG 항체를 1:3000으로 희석하여 반응시켰다(37℃에서 1시간 동안). PBST로 씻어낸 후, OPD가 첨가된 substrate buffer를 well 당 100 ul 씩 분주하여 반응시켰다. 이후, 발색 정도를 보고 2N 황산을 넣어 반응을 중단시켰다.

마우스에 MSP-8, MSP-9, RAP1 조합 VLPs 백신을 4주 간격으로 2번 접종(Intramuscular route) 후, 마우스로부터 정해진 시기에 혈액을 수집하고 혈청에서 말라리아 원충 특이 IgG (도 2A)와 조합 VLPs 특이 IgG (도 2B) 항체가를 ELISA 분석법으로 확인하였다. 조합 VLPs 백신 접종 후 말라리아원과 조합 VLPs 백신 특이 IgG 항체가 비면역화 마우스 그룹과 비교하여 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 그중에서도, 2차 접종 후 수집한 혈청에서 아주 높은 IgG 항체반응을 확인하였다.

또한, 마우스의 비장을 수집하여 비장을 갈아 세포를 분리하였다. 세포는 다량의 RBC와 섞여있어 RBC lysis buffer를 처리하여 RBC를 제거하였다. 분리한 세포는 10^6씩 튜브에 나눠 담아 fc block 처리 후, CD3, CD4, CD8, B220, CD27, IgG1등의 형광 항체를 붙여 반응시켰다(얼음에서 30분 동안). 씻어낸 후, 유세포 분석(flow cytometry) 기계에 로딩하여 읽었다.

조합 VLPs 백신 접종 후 그리고 치사량의 말라리아 원충을 감염시킨 후, 모든 마우스에서 비장을 수집하여 CD4⁺ 및 CD8⁺ T cell과 memory B cell의 군집을 확인하였다(도 3). 기생충 감염 대조군(Naive Challenge)과 비교하였을 때, 조합 VLPs 백신 면역화 그룹에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T cell이 유의한 수준으로 증가하였으며(도 3A 및 도 3B), memory B cell 역시 높은 수준으로 검출된 것을 확인하였다(도 3C).

< 실시예 3> 말라리아 원충 바이러스 유사입자 백신 방어효능

말라리아 원충 MSP-8, MSP-9 및 RAP1 조합 바이러스 유사입자 백신을 마우스에 접종시키고 Plasmodium berghei (ANKA strain) 치사량을 마우스에 감염시킨 후, 비장내 염증성 사이토카인, 혈중 기생충 증식율을 확인하였다.

마우스의 혈청과 비장액 (비장세포 분리시 원심분리하여 상층액을 보관하였다가 사용함)에서 염증성 사이토카인을 측정하였다. 실험 방법은 상기 실시예 2에 기재한 ELISA 분석법과 같다. 다른 점은 코팅(coating) 과정에서 항원이 아닌 사이토카인 캡쳐(cytokine capture) 항체를 사용하였다. 차단(Blocking) 후 마우스의 혈청 및 비장액을 분주하여 반응시켰다(RT에서 2시간 동안). 반응 후 검출 항체(detection antibody)와 반응시켰다. 그 후에 발색시약을 넣어 발색을 확인하였다.

비 면역화 마우스와 MSP-8, MSP-9, RAP1 조합 VLPs 백신 면역화 마우스에 치사량의 말라리아 원충을 감염시킨 후 6일째 일부 마우스에서 비장 및 혈액을 수집하여 염증반응을 확인하였다(도 4). 비 면역화 감염 대조군(Naive Challenge)과 비교하였을 때, 조합 VLPs 면역화 그룹(Immunization)은 혈액에서 현저히 낮은 수준의 전 염증성 사이토카인 TNF-alpha (도 4A), IFN-gamma (도 4B)가 검출되었다. 뿐만아니라 비장에서의 IFN-gamma 수준 역시 비면역화 감염 대조군(Naive Challenge)에 비해 면역화 그룹(Immunization)에서 유의하게 감소한 것을 확인하였다(도 4D).

마우스의 혈액 내, 말라리아 원충을 존재를 확인하기 위해 마우스로부터 피를 회수하였다. 피 2 ul를 PBS 100 ul에 넣고 풀어준 뒤 사이버그린(syber green) 시약(말라리아 원충의 핵에 붙는 형광 항체) 0.5-1 ul 넣고 반응시켰다(37℃에서 30분 동안). 반응 후, 바로 유세포 분석(flow cytometry) 기계에 로딩하여 읽었다.

비 면역화 마우스와 MSP-8, MSP-9, RAP1 조합 VLPs 백신 면역화 마우스에 치사량의 말라리아 원충을 감염시킨 후 혈액을 수집하여 기생충 증식반응(parasitemina)을 확인하였다(도 5). MSP-8, MSP-9, RAP1 조합 VLPs 백신 접종군(Immunization)은 비 면역화 감염 대조군(Naive Challenge)에 비해 혈중 기생충 증식반응이 장기간 지연되는 것을 확인하였다.

조합 VLPs 백신을 접종한 후, 모든 마우스에 치사량의 P. berghei를 감염시켜 생존반응을 확인하였다(도 6). 비 면역화 감염 대조군(Naive Challenge)은 감염 42일 이내 모든 마우스가 사망하였지만, 조합 VLPs 백신 접종군(Immunization)은 비 면역화 감염 대조군(Naive Challenge) 그룹보다 최대 18일 생존기간이 연장된 것을 확인하였다(도 6B).

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Virus-like particles combination vaccines comprising MSP-8, MSP-9 and RAP1 of malaria protozoa <130> ADP-2021-0480 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Influenza virus A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) matrix protein 1 <400> 1 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250 <210> 2 <211> 604 <212> PRT <213> Plasmodium berghei ANKA/RAP1 <400> 2 Met Phe Ile Lys Ile Val Ser Leu Phe Ile Leu Ser Arg Leu Val Phe 1 5 10 15 Gln Asp Tyr Ser Val Ala Phe Asn Ile Arg Asp Ser Asn Ile Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Ser His Gly Tyr Asn Ser Pro Gly Ile Asn Asn Asp Lys Leu 35 40 45 Gly Asn Leu Asn Tyr Phe Thr Glu Ile Phe Pro Lys Met Ser Phe Leu 50 55 60 Gln Glu Asp Asp Asp Val Asn Gln Asn Lys Asn Gly Thr Ser Asn Lys 65 70 75 80 Asp Ser Glu Lys Gln Asp Ala Asn Ser Ile Ala Asp Ser Asp Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Arg Asp Tyr Ala Leu Phe Asn Gly Asn Leu Ile Ala Asp Leu 100 105 110 Lys Glu Glu Glu Pro Ile Asp Glu Thr Ala Glu Glu Glu Thr Ile Asn 115 120 125 Glu Asn Ile Asp Glu Lys Asn Thr Ser Thr Ile Lys Tyr Thr Pro Asp 130 135 140 Tyr Thr Pro Arg Leu Lys Lys Ala Met His Thr Leu Gly Tyr Asp Lys 145 150 155 160 Glu Phe Lys Leu Ala Glu Leu Thr Thr Ile Gln Ser Cys Pro Asn Asp 165 170 175 Asn Phe Leu Phe Asp Ile Phe Pro Gln Ala Ile Gln Lys Phe Gln Glu 180 185 190 Asn Asp Met Lys Tyr Ile Gln Thr Gln Gly Asp Gln Tyr Val Glu Cys 195 200 205 Ile Lys Lys His Lys Leu Val Gly Ser Asp Asn Gln Asp Leu Lys Leu 210 215 220 Asn Phe Gly Asn Ser Val Asn Thr Phe Gly Pro Tyr Lys Ile Pro Gln 225 230 235 240 Lys Met Ile Thr Phe Asp Leu Ile Arg Leu Pro Ser Asn Ile Thr Pro 245 250 255 Val Asn Leu Ala Asn Asp Tyr Tyr Leu Ser Glu Ser Glu Phe Pro Asn 260 265 270 Leu His Lys Leu Asn Tyr Cys Leu Leu His Pro Ala Lys Leu Glu Lys 275 280 285 Leu Leu Lys Arg Lys Asp Ile Lys Ser Tyr Ile Asn Asn Thr Glu Ser 290 295 300 Gly Ser Tyr Asp Asn Phe Phe Lys Lys Ala Met Asn Glu Ser Ile Glu 305 310 315 320 Cys His Val Glu Asn Thr Leu His Met Ile Leu Ser Lys Leu Thr Leu 325 330 335 Phe Met Phe Phe Asn Val Asn Lys Pro Asp Ser Lys Asn Ile Leu Lys 340 345 350 Lys Gln Leu Tyr Ile Ile Lys Ser Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Arg Lys 355 360 365 Tyr Val Asp Asn Ala Tyr Lys Lys Val Ile Asn Asn Phe Lys Asp Tyr 370 375 380 Glu Asn Lys Ile Lys Leu Ile Asp Ser Asn Leu Glu Asn Ile Thr Ser 385 390 395 400 Tyr Tyr Ala Ala His Ala Phe Gly Asn Leu Cys Asn Thr Tyr Met Glu 405 410 415 Lys Asp Asn Ile Tyr Glu Ala Asn Ala Tyr Leu Tyr Glu His Ile Ala 420 425 430 Pro Ser Ile Lys Ile Phe Ser Ser Cys Ile Lys His Leu Thr Ile Tyr 435 440 445 Asn Tyr Ile Ile Ser Asn Leu Leu Gly Gln Val Lys His Leu Met Ser 450 455 460 Tyr Thr Pro Arg Lys Pro Ile Leu Lys Asp Ile His Phe Lys Ala Leu 465 470 475 480 Leu Asn Lys Phe Lys Lys Pro Gln Asn Val Asn Glu Leu Pro Tyr Asp 485 490 495 Pro Thr Val Lys Ser Phe Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Glu Pro Ile 500 505 510 His Gly Leu Ile His Ser Tyr Phe Glu Tyr Lys Lys Lys Asp Leu Leu 515 520 525 Asp Ile Met Gln Lys Leu Lys Leu Asp Ile Phe Ser Leu Ala Asn Lys 530 535 540 Asp Leu Lys Phe Pro Ser Ala Asp Leu Pro Asp Tyr Lys Leu Phe Lys 545 550 555 560 Asp Ile Val Asn Lys Tyr Lys Lys Glu Ile Lys Ile Leu Phe Gln Glu 565 570 575 Met Asn Ser Glu Tyr Val Lys Leu Phe Lys Met Arg Ile Ser Ala Phe 580 585 590 Tyr Gln Lys Asp Phe Phe Ile Tyr Asp Arg Val Phe 595 600 <210> 3 <211> 1027 <212> DNA <213> Influenza virus A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) matrix protein 1 <400> 3 agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120 tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360 caaagaaatc 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Leu Glu Ile Ile Asn Tyr Ala Leu 195 200 205 Tyr Asn Gly Pro Lys Glu Leu Glu Asn Arg Ile Lys Ser Gly Leu Asn 210 215 220 Glu Ile Asn Asn Ile Ile Ile Ser Glu Ser Leu Thr Ser Ile Tyr Ser 225 230 235 240 Ser Val Val Ser Gly Leu Asn Ile Asn Cys Lys Ile Lys Asp Asp Leu 245 250 255 Ile Thr Ile Leu Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Phe Lys Val Asp Phe 260 265 270 Ser Ser Gln Ala Thr Met Ile Val Pro Gly Gln Tyr Ser His Glu His 275 280 285 Gly Asn Met Lys Lys Ile Ser Glu Tyr Phe Ile Glu Lys Asn Arg Ile 290 295 300 Cys Lys Asn Glu Lys Cys Pro Ile Asn Ser Asn Cys Tyr Val Ile Asp 305 310 315 320 Asn Val Glu Thr Cys Arg Cys Ile Pro Gly Phe Ser Lys Asn Lys Glu 325 330 335 Ser Glu Ser Leu Lys Cys Asp Ile Asp Glu Ser Thr Ser Cys Glu Asn 340 345 350 Asn Asn Gly Gly Cys Asp Val Asn Ala Thr Cys Leu Leu Leu Glu Asp 355 360 365 Lys Ile Met Cys Glu Cys Asn Asn Lys Tyr Asn Gly Asp Gly Ile Tyr 370 375 380 Cys Ser Asn Ala Ile Tyr Tyr Gly Met Asn Val Phe Val Phe Phe Leu 385 390 395 400 Ile Ser Ile Val Cys Ile Tyr Ile 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Phe Asp Gly Leu Ser Lys Ser Gln Glu Lys Ile Cys 195 200 205 Ser Asn Glu Asp Asp Thr Asn Val Gly Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser 210 215 220 Ser Val Gln Asp Ile Phe Asp Glu Gly Glu Asn Ile Met Asn Val Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Leu Val Gln Glu Ser Asp Gly Ile Gly Asn Glu Leu Ala 245 250 255 Gly Leu Ile Glu Lys Gly Lys Glu Ile Gly Glu Gln Ile Val Asn Ile 260 265 270 Glu Gly Leu Leu Ser Pro Lys Asn Gly Leu Phe Ser Gly Gly Leu Pro 275 280 285 Ser Leu Asn Lys Leu Tyr Glu Phe Thr Ser Asn Leu Ser Ser Tyr Glu 290 295 300 Tyr Leu Leu Val Lys Leu Lys Asp Ser Ile Ile Ser Lys Leu Lys Asp 305 310 315 320 Ile Leu Leu Arg Leu Leu Tyr Lys Ser Tyr Ile Thr Tyr Arg Lys Asn 325 330 335 Lys Ser Ile Glu Leu Gly Glu Glu Glu Ile Pro Met Val Ser Lys Asp 340 345 350 Glu Tyr Leu Asp Glu Leu Lys Lys Gly Val Ile Gln Leu Ser Met Lys 355 360 365 Leu Leu Tyr Ser Lys Ile Lys Arg Leu Leu Ile Lys Ile Lys Asn Lys 370 375 380 Met Ser Arg Lys Lys Lys Thr Glu Asn Ile Pro Asp Pro Leu Pro Val 385 390 395 400 Glu Ser Ser Ile Tyr Asp Tyr Asp Asp Asp Asp Ala Ile Val Asp Asp 405 410 415 Thr Ala Asp Asp Asp Ala Ala Asp Asp Asp Val Ala Asp Asn Asp Lys 420 425 430 Phe Ile Ser Phe Asn Lys Ser Ser Ser His Met Lys Leu Phe Arg Gly 435 440 445 Ile Leu Pro Gln Lys Lys Ser Ile Val Ser Thr Ile Asp Lys Met Ile 450 455 460 Ser Glu Ile Asp Leu Tyr Glu Gln Gly Leu Tyr Thr Asp Thr His Ala 465 470 475 480 Asp Tyr Glu Asn Asp Glu Ile Leu Ser Thr Val Glu Gly Met Asp Glu 485 490 495 Thr Glu Ser Asp Glu Ala Glu Leu Ser Asn Glu Cys Val Gln Lys Ile 500 505 510 Ile Asp Glu Asn Ile Ala Val Glu Ala Ile Asn Asn Leu Leu Lys Val 515 520 525 Asp Glu Ser Ala Val Glu Glu Arg Glu Asn Val Asn Asp Ser Glu Asn 530 535 540 Lys Ser Asn Asn Ser Ser Ile Asp Ile Glu Lys Gly Ala Ser Thr Pro 545 550 555 560 Ser Asp Ile Ser Glu Ile Pro Asn Ile Ile Lys Lys Ile Val Ile Tyr 565 570 575 Val Ile Lys Glu Arg Ile Tyr Asp Leu Ala Glu Glu Leu Ser Asp Asn 580 585 590 Lys Leu Glu Asp Glu Ser Lys Thr Ser Thr Pro Ser Asn Asn Ile Ile 595 600 605 Leu Glu Asp Thr Pro 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caccatcctg 780 aacctgtccg acggcaagta cttcaaggtg gacttctcca gccaggccac tatgatcgtc 840 cctggacagt actcccacga gcacggcaac atgaagaaga tcagcgagta cttcatcgaa 900 aagaaccgca tctgcaagaa cgagaagtgc ccaatcaact ctaactgcta cgtgatcgac 960 aacgtcgaaa cttgccgttg catccctggc ttctcaaaga acaaggagtc tgaatcactg 1020 aagtgcgaca tcgacgagtc caccagctgc gaaaacaaca acggtggctg cgacgtgaac 1080 gctacttgcc tgctgctgga ggacaagatc atgtgcgaat gcaacaacaa gtacaacggc 1140 gacggaatct actgctccaa cgccatctac tacggaatga acgtgttcgt cttcttcctg 1200 atcagcatcg tctgcatcta catcatgtaa 1230 <210> 8 <211> 1857 <212> DNA <213> Plasmodium berghei ANKA/MSP-9 <400> 8 atgaagataa gtatcgtggc attcccttta cttatgattg ctctcagaag caaatctacc 60 aatgctcata aaacaaataa tttggaagcc caaattaatt atggtattat aaataattat 120 aacgaattgt taaaagtagc aaaatgccaa tattgcttaa ctaccaccaa tcctgttgaa 180 gaagaaaatt gtgatgaaat aatggaagaa tgtagaggat tgttaagcaa taaagacctt 240 ggatttttat taaaagccat aacagatgag tctatgcata ataaatctca atatattcat 300 ggaaaacata gtaatacatt 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Claims

인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs).
제1항에 있어서, 상기 M1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 RAP1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자.
제1항에 있어서, 상기 M1은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 RAP1은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
M1을 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열; 및 RAP1을 암호화하는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터.
제5항에 있어서, 상기 M1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 RAP1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터.
제5항 또는 제6항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
제7항에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제5항 또는 제6항의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및
상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스-유사입자를 발현시키는 단계를 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자의 제조 방법.
1) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 곤봉체 관련 단백질 1(rhoptry-associated protein 1; RAP1)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자;
2) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질 8(merozoite surface protein 8; MSP-8)을 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자; 및
3) 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질 9(merozoite surface protein 9; MSP-9)를 포함하는 말라리아에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
제5항에 있어서, 상기 M1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 RAP1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 MSP-8은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 MSP-9는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 백신 조성물.