CN105622760A

CN105622760A - 一种禽传染性支气管炎多表位粘膜免疫疫苗及其应用

Info

Publication number: CN105622760A
Application number: CN201610056709.2A
Authority: CN
Inventors: 张晓丹; 李殿明; 蒲勤; 齐春梅; 田春辉; 刘甜甜; 任百亮; 张导春; 党将将; 吴启凡
Original assignee: Qingdao Mingqin Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Mingqin Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2016-06-01

Abstract

本发明涉及一种用于预防禽传染性支气管炎的融合蛋白及该融合蛋白的制备方法及其应用。具体而言，本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含禽传染性支气管炎病毒IBV主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白主要的抗原表位、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位及纯化标签，本发明还涉及该融合蛋白的制备方法及其药学应用。

Description

一种禽传染性支气管炎多表位粘膜免疫疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及用于粘膜免疫的融合蛋白，用于预防禽传染性支气管炎，其由禽传染性支气管炎病毒IBV主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白的多个抗原表位、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位及纯化标签序列组成，及其制备方法和应用。

背景技术

禽传染性支气管炎(AvianInfectiousBronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，感染鸡生长受阻、耗料增加、产蛋下降、死淘率增加，出现呼吸困难、肾脏病变等症状。本病主要的传播途径是飞沫传染，此外，也可以通过饲料、饮水等经消化道传染。各种日龄、性别和品种的鸡均易感染，尤以1-4周龄雏鸡最为严重，雏鸡感染后由于呼吸道或肾脏病变而引起死亡，死亡率高达40％-90％。IB最早于1931年由Schalk和Hawn在美国报道。1936年，Beach和Scbalm证明其病原为病毒。我国最早于1972年由邝荣禄首次在广东省发现，随后国内大部分省份都有本病发生的报道，至今为止，该病已呈世界范围流行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。目前针对IB的防治，尚无特效疗法，主要通过疫苗来预防，针对IB所用的疫苗品类繁多，有弱毒活疫苗、灭活疫苗以及多价疫苗等，然而由于本病血清型众多，疫苗免疫效果并不理想，灭活疫苗效果不稳定，传统弱毒苗不能抵抗其他血清型毒株的攻击，还存在散毒、变异和重组等引起的毒力返强问题。因此，研制安全有效的新型疫苗是当务之急。

禽传染性支气管炎病毒是冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)第三群禽冠状病毒的代表株。IBV基因组编码四种结构蛋白：纤突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)和小膜蛋白(E)，其中纤突蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白是主要的结构蛋白。S蛋白被宿主细胞的蛋白酶切割为S1和S2两条多肽蛋白。S1亚单位是IBV产生致病性和感染性的主要蛋白，能诱导机体产生血凝抑制抗体、病毒中和抗体、交叉反应ELISA抗体及细胞介导的免疫应答。N蛋白是唯一位于膜内的蛋白，有助于形成核衣壳，能特异性地结合到引导RNA上，参与病毒RNA的合成、转录和翻译，此外，N蛋白有免疫识别相关靶位，能诱导机体产生抗体和细胞介导的免疫应答，在体液免疫和细胞免疫中也起着重要作用。M蛋白是冠状病毒外膜最主要的成分，在病毒装配时可通过与核衣壳相互作用而将后者结合到囊膜上，与病毒的复制有关。除此之外，M蛋白能控制并介导病毒粒子从粗面内质网(RER)和高尔基体膜出芽，在有补体存在的条件下可以中和病毒的感染。E基因是以IBV为代表的抗原III群冠状病毒区别于抗原I和II群冠状病毒的主要标志之一，E蛋白在病毒粒子的组成中需要量很少，在IBV感染细胞中却大量存在，说明E蛋白可能与感染细胞的细胞凋亡有关，另外在病毒的复制过程中，E蛋白与M蛋白协同作用，参与病毒样颗粒的形成和出芽。

近来兴起的黏膜免疫，不仅可以产生很强的抗体应答，而且还能产生较好的细胞免疫效果。黏膜免疫需要有黏膜佐剂分子，研究证实霍乱毒素B亚单位(简称CTB)、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(简称LTB)均是良好的佐剂分子(LyckeN，EuropeanJ.ofImmunol，1992，22：2277-2281)。

然而，目前尚未见针对禽传染性支气管炎的多表位粘膜免疫疫苗，为了有效预防禽传染性支气管炎，人们迫切需要一种新型、高效、安全的疫苗。本发明提供了一种新的能用于粘膜免疫的融合蛋白及其疫苗组合物，能有效预防禽传染性支气管炎病毒的感染。

发明内容

本发明根据不同结构蛋白在病毒感染中的作用，选择主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白的多个抗原表位作为疫苗框架结构，通过柔性Linker连接后再与大肠杆菌不耐热毒素B亚单位串联，克隆入pRSETB载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的禽传染性支气管炎粘膜免疫疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防禽传染性支气管炎病毒的感染。

在第一个方面，本发明提供了一种用于制备粘膜免疫疫苗的融合蛋白，其含有对禽传染性支气管炎病毒主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白筛选得到的抗原表位以及大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(LTB)。所述“禽传染性支气管炎病毒主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白的抗原表位”指的是具有免疫原性的禽传染性支气管炎病毒主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白中的一部分多肽或其具有基本相同免疫原性的功能等价物，优选是选自SEQIDNo.4、6、8、10、12和14的氨基酸序列或其功能等价物。所述的LTB指的是大肠杆菌不耐热毒素B亚单位或其具有基本相同粘膜佐剂功能的功能等价物，优选是如SEQIDNo.16所示的氨基酸序列或其功能等价物。所述的融合蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。

在第二个方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的禽传染性支气管炎粘膜免疫疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式、DNA形式，通过人工合成方式合成抗原表位串联序列，然后通过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，经过筛选、发酵、纯化等工艺获得禽传染性支气管炎粘膜免疫疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等。优选本发明中的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二方面所述的核算分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称为“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其他各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可以使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His、Leu、Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以获得所需要的融合蛋白。

在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述的细胞已用本发明第三方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。

在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明第四个方面的宿主细胞表达本发明第一个方面的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其他生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属螯合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等点聚焦以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

在第六个方面，本发明提供了一种用于粘膜免疫的药物组合物，其包括本发明第一个方面所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体，能预防禽传染性支气管炎病毒的感染。对于本领域普通技术人员来说，已经有很多公知的方法能将蛋白质或多肽活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。优选该药物组合物为注射剂型、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型、这些组合物包括不同缓冲液内容(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)、相应的离子强度和pH值，以及其他物质(如聚乳酸、甘露醇等)。也优选该药物组合物为疫苗组合物，优选进一步含有佐剂，如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG序列等。

在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的融合蛋白在制备预防禽传染性支气管炎的药物中的应用。在第八个方面，本发明提供了本发明第五个方面所述的药物组合物在制备预防禽传染性支气管炎的药物中的应用。在本发明的一个优选实施方式中，通过对实验动物以特定剂量年末给药，有效地保护了实验动物。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为含有融合蛋白编码基因的表达载体pRSETB-IBV(S1/N)-LTB的示意图。

图2显示了重组表达载体pRSETB-IBV(S1/N)-LTB用HamHI+EcoRI酶切后的电泳结果，其中M为DNAMarker，泳道1为空质粒，泳道2为质粒酶切图，泳道3为未酶切对照。

图3为融合蛋白编码基因表达产物SDS-PAGE鉴定结果，其中M为分子量Marker，从上至下依次为97KD、66KD、43KD、31KD、20KD、14KD，1泳道为诱导样品，2泳道为未诱导阴性对照，箭头所指为表达的目的蛋白。

图4显示了样品纯化WesternBlot印迹结果，其中M为预染Marker，1为样品，2为阴性对照。

图5显示了免疫SPF鸡ELISA检测血清特异性抗体结果，其中(◆-◆)为经口、鼻免疫组；(■-■)为经肌肉注射免疫组；(▲-▲)为PBS对照组。

图6显示了疫苗免疫后SPF鸡外周血CD4+T淋巴细胞亚类数量的变化，其中(◆-◆)为经口、鼻免疫组；(■-■)为经肌肉注射免疫组；(▲-▲)为PBS对照组。

图7显示了疫苗免疫后SPF鸡外周血CD8+T淋巴细胞亚类数量的变化，其中(◆-◆)为经口、鼻免疫组；(■-■)为经肌肉注射免疫组；(▲-▲)为PBS对照组。

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐明本发明，但并不构成对本发明范围的限制，以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》(2002年，第三版，科学出版社)所述方法进行。

实施例一融合蛋白基因的来源

本发明综合分析国内禽传染性支气管炎病毒主要流行株的基因序列、抗原结构、流行病学研究进展，根据其主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白的氨基酸序列，利用相关生物信息学软件对其亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和二级结构进行分析，预测可能的B细胞抗原表位及T细胞抗原表位，并综合相关报道，从而确定S1蛋白抗原表位4段，N蛋白抗原表位2段。将所有表位用柔性Linker连接形成疫苗骨架结构后再与LTB串联，该疫苗总体结构为：

IBVS1Epitope1-IBVS1Epitope2-IBVS1Epitope3-IBVS1Epitope4-IBVNEpitopel-IBVNEpitope2-LTB-Tag

实施例二大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

将实施例一中设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了BamHI(5’端)和EcoRI(3’端)限制性酶切位点，将合成好的片段克隆到pMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与涉及序列一致(见序列表)。将重组质粒命名为pMD18T-IBV(S1/N)-LTB，用相应的限制性内切酶对质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETB质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μL反应体系，体系内加入质粒2μL，限制性内切酶5个活性单位(NewEnglandbiolabs)，10×缓冲液1μL，去离子水补齐，37.0℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μL200mMEDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中电泳30分钟。紫外灯下将pRSETB质粒和目的片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段为1∶2-3的比例将多表位核苷酸片段与表达载体混合，反应体系15μL，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为pRSETB-IBV(S1/N)-LTB(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

转化：将pRSETB-IBV(S1/N)置冰上融化，加入1mL连接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒钟，然后迅速放回冰水浴90秒钟，加入1mLLB培养液，37.0℃静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μLLB培养基重悬菌体，将菌液均匀涂布于含有100μL/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。

鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，使用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切，可以切出相应禽传染性支气管炎疫苗基因大小片段的克隆为1400bp左右，可初步确定为阳性克隆(见图2)，阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。

诱导表达：将阳性克隆过夜培养，次日早上按照1∶100转接，37℃震荡培养3小时候，加入0.5mMIPTG诱导，继续培养3小时，制备样品。常规SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，可在53KD分子量处见到特异性条带为正确克隆(见图3)。取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图4)。最后筛选得到的高效分泌表达融合蛋白的工程菌，命名为pRSETB-IBV(S1/N)-LTB/BL21(DE3，PLys)。

实施例三工程菌的发酵

将生产菌种接种到2mL含有100μL/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养12小时活化菌种。将活化好的菌种以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃震荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0℃±0.1℃，溶氧控制在20％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0-1.2时流加补料500mL，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检测表达情况。

实施例四融合蛋白的纯化

将收集的菌体，用包涵体洗液I(1％TritonX-100，20MmTris-c1pH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包涵体，并用包涵体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mMTris-c1pH8.0)混悬二次超声洗涤包涵体，二次低温离心收集包涵体。包涵体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mMTris-c1(pH＝8.0)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30分钟，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(pH＝8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱。再用1.5M硫酸铵、100mMEDTA、pH＝8.5的10mM磷酸氢二钠平衡上疏水层析柱，再平衡，用pH＝8.5的10mM磷酸氢二钠洗脱，即得禽传染性支气管炎多表位疫苗半成品原液，进行SDS-PAGE以及Western-blot印记检定纯化产物是否为目的蛋白。通过稀释或浓缩将重组蛋白调整到合适浓度后，进行制剂配制，再过滤除菌，最后分装或直接储藏备用。后通过IBV阳性血清ELISA(检测抗原部分)和GM₁-ELISA(检测LTB部分)跟踪检测，确定疫苗冻干和稳定保护剂，建立了冻干工艺。

GM₁-ELISA检测LTB部分与神经节苷脂的结合方法如下：

96孔板用5mg/L的GM₁(Sigma，美国)50μL4℃包被过夜，用含0.05％Tween20的PBS洗板后用200μL1％BSA室温封闭4小时，洗板，加入适当浓度的待检样品，同时设立阳性[CT(霍乱毒素)标准品]、阴性(牛血清白蛋白标准品)及试剂空白对照，37℃2小时，洗板后加入1∶200兔抗LTB抗血清100μL，37℃2小时，洗板后加入1∶20000HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔IgG抗血清(武汉博士德生物工程有限公司)100μL，37℃2小时，洗板后显色(OPD作为底物)数分钟，2.5％H₂SO₄终止显色。测定A₄₉₂值，实验组A₄₉₂/阴性对照A₄₉₂＞2.1视为阳性结果。

实施例五多表位粘膜免疫疫苗安全性实验

1试验动物4周龄SPF鸡30只。

2疫苗由公司研发中心提供。

将30只4周龄SPF鸡随机分为三组，每组10只，组间无体重差异。免疫组一经口、鼻腔分两等份接种疫苗100μL/只；免疫组二经腿部肌肉两点注射100μL/只；对照组经腿部肌肉两点注射PBS100μL/只。饲养2周，观察试验动物采食、饮水及精神是否正常、是否产生过敏反应、是否死亡或出现其他异常情况，并在免疫前和试验结束后，对试验动物称重，记录并分析。

3结果

结果见表1，两个免疫组试验动物免疫后均未出现任何过敏反应或中毒症状，SPF鸡精神状态良好，采食、饮水、活动等一切正常，未出现明显局部炎症等损伤性临床副反应，无死亡发生，表明多表位粘膜免疫疫苗对鸡是安全的。两个免疫组试验动物的体重增长与对照组相比，差异不显著(P＞0.05)，表明多表位粘膜免疫疫苗对动物体重无不良影响。

表1多表位粘膜免疫疫苗安全性检测结果

组别

采食

精神

炎性反应

死亡

接种前体重(g)

接种2周后体重(g)

平均增重(g)

免疫组一

正常

无

236.77±21.79

513.14±37.64

18.07±1.38

免疫组二

正常

无

252.23±30.01

524.86±41.38

19.47±2.09

对照组

正常

无

249.17±25.33

514.09±40.23

18.92±2.24

实施例六动物试验分组与免疫

将45只1日龄SPF鸡随机分为3组，15只/组，预饲一周，适应环境。第一组经口、鼻腔分两等份接种100微克(100μL，0.1mg/mL)重组疫苗，第二组经腿部肌肉两点注射接种100微克(100μL，0.1mg/mL)重组疫苗，第三组为对照组，腿部肌肉两点注射100μLPBS溶液。两周后，同等剂量同样方法加强免疫一次。分别在首免前和首免后7、14、21、28、35、42日对各组试验鸡进行翅下静脉采血，分离血清-70℃保存用于特异性抗体检测。每组随机挑选5只试验鸡采集1mL肝素抗凝血用于外周血T淋巴细胞亚类的检测。免疫21天采血后，每组随机挑选5只试验鸡，用500μLPBS(含1％BSA)冲洗气管和肺，收集冲洗物，12000rpm/min离心5分钟，取上清-70℃保存备用。

实施例七特异性抗体的ELISA检测

ELISA方法检测气管、肺冲洗物以及血清中的抗体，其具体步骤如下：将纯化的IBV重组蛋白抗原用PBS(pH7.4)稀释成10μg/mL，加入酶标板中，100μL/孔，4℃静置包被过夜；去掉液体，用PBST(含0.05％Tween-20，pH7.4)洗板三次，3分钟/次，加入5％脱脂奶粉，100μL/孔，37℃封闭1小时；沉板三次，用血清稀释液(含0.5％小牛血清的PBST)将待检样品1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800倍稀释，加入酶标板，100μL/孔，同时用免疫PBS的血清做阴性对照，37℃孵育1小时；洗板三次，用1∶2000稀释的HRP标记兔抗鸡IgG加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育1小时。加入TMB底物100μL/孔，避光显色15分钟；加入2MH₂SO₄终止反应，于450nm波长下检测吸光度值(BIORAD680酶标仪)。

试验结果：

免疫后，对照组SPF鸡的气管、肺冲洗物中未检测到特异性抗体；经口鼻免疫组和经肌注免疫组均可在气管、肺冲洗物中检测到很高的粘膜抗体效价，最高可达1∶6400，最低为1∶1600，经口鼻免疫组高于经肌注免疫组。

口鼻免疫组和肌注免疫组试验鸡血清中的IgG抗体滴度呈现相同的消长趋势，首次免疫后开始缓慢升高，二免后迅速上升并在35天(二免后三周)达到高峰，然后呈下降趋势；免后35天抗体滴度最高可达1∶12800，最低为1∶6400，肌注免疫组平均抗体滴度高于口鼻免疫组，而PBS对照组未检测到抗体(见图5)，说明多表位粘膜免疫疫苗能够诱导机体产生明显的体液免疫反应。

实施例八外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量检测

1外周血淋巴细胞的分离取抗凝血0.5mL与Hank’s液1∶1混匀，轻轻加在淋巴细胞分层页面上。2000rpm/min离心15分钟，小心收集中间的淋巴细胞，用Hank’s液洗涤沉淀两次，再以RPMI-1640培养基将细胞稀释成1×10⁷个/mL，分装后离心抽干备用。

2T淋巴细胞亚类的测定将已制备好的淋巴细胞分为三组，一、二组分别用10倍稀释的CD4+、CD8+单抗重悬，三组用PBS重悬作为对照，冰水浴30分钟；1500rpm/min离心5分钟，弃上清；PBS洗三遍，最后用不含血清的PBS重悬沉淀并检测。

3结果

3.1CD4+T细胞亚群的检测

结果如图6，首次免疫后，口鼻免疫组和肌注免疫组的试验鸡外周血中CD4+T淋巴细胞数量开始增加，二免后持续上升并在二免后2周(首免第28天)达到高峰，然后开始下降；在观察期内，免疫组都显著高于PBS对照组(P＜0.05)；口鼻免疫组与肌注免疫组之间无显著差异(P＞0.05)。

3.2CD8+T细胞亚群的检测

结果如图7，经口、鼻免疫和经肌肉注射免疫的试验鸡接种疫苗后，外周血CD8+T淋巴细胞的数量变化趋势相同，都在首免后数量开始增加，二免后持续上升并在二免后2周(首免第28天)达到高峰，然后呈下降趋势；在观察期间，免疫组与PBS对照组相比，差异极显著(P＜0.01)；经肌肉注射免疫组略高于经口鼻免疫组，两个免疫组之间无显著差异(P＞0.05)。

实施例九多表位粘膜免疫疫苗攻毒保护试验

将60只7日龄SPF鸡随机分为3组，第一组经口、鼻腔分两等份接种100微克(100μL，0.1mg/mL)重组疫苗，第二组经腿部肌肉两点注射接种100微克(100μL，0.1mg/mL)重组疫苗，第三组为对照组，腿部肌肉两点注射100μLPBS溶液。两周后，同等剂量同样方法加强免疫一次。二免后第21天分别用100倍半数致死剂量(50％LthalDose，LD₆₀)的强毒IBV滴鼻或点眼。攻毒后连续14天观察鸡群的精神状态、发病和死亡情况，统计死亡数并计算死亡率。临床发病判断标准为：缩头闭目、垂翅挤堆、食欲不振、咳嗽、喘气、打喷嚏、流泪、流涕等。

保护率＝[(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率]×100％。

试验结果：

结果如表2，经口、鼻免疫组试验鸡2只发病，其中一只死亡，其他试验鸡均精神状态良好、采食正常，未出现临床症状，保护率达93.75％；经肌肉注射免疫组的试验鸡未发病且无死亡发生，保护率为100％；对照组的试验鸡全部发病，出现咳嗽、喘气、打喷嚏等明显临床症状，死亡率为80％。

表2多表位粘膜免疫疫苗对SPF试验鸡的保护效应

组别	发病率(n＝20)	死亡率(n＝20)	保护率(n＝20)
				口鼻免疫组	(2/20)10％	(1/20)5％	(18/20)93.75％
肌肉注射组	(0/20)0％	(0/20)0％	(20/20)100％
				对照组	(20/20)100％	(16/20)80％	(4/20)20％

Claims

1.一种用于黏膜免疫的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

4.一种载体，其含有权利要求2或3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的载体。

6.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其包括用权利要求5所述的宿主细胞表达权利要求1所述的融合蛋白。并分离所述的融合蛋白。

7.一种用于粘膜免疫的药物组合物，其包括权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的融合蛋白在制备预防禽传染性支气管炎的药物中的应用。

9.权利要求7所述的药物组合在制备预防禽传染性支气管炎的药物中的应用。