WO2022122036A1 - 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用,所述免疫原包括PreS蛋白或全长S蛋白中的至少一者,或者所述免疫原包括多种能够组装形成SARS-CoV-2病毒样颗粒的结构蛋白,所述免疫原可用于制备疫苗和/或药物,具有安全性高、免疫效果理想以及免疫持久性长的优点。。
Description
本申请涉及生物制药领域,具体涉及一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2,简称新冠病毒)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19,简称新冠肺炎)的新发呼吸道病原体。SARS-CoV-2具有较强的传染性、较长的潜伏期以及高隐蔽性特点。
目前有研究发现,新型冠状病毒SARS-CoV-2包括刺突蛋白(Spike,S蛋白)、包膜蛋白(Envelope,E蛋白)、膜蛋白(Membrane/matrix,M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋白)四个结构蛋白,其中,S蛋白包括S1亚基,所述S1亚基上具有RBD结构域(Receptor binding domain,RBD),通过RBD结构域与人体细胞上的ACE2受体蛋白相结合,使得SARS-CoV-2感染人体细胞。
COVID-19疫苗是预防COVID-19、防止COVID-19疫情蔓延的有效措施之一。目前,虽然已有一些COVID-19疫苗问世,但是COVID-19疫苗的安全性、刺激机体免疫应答反应的水平以及免疫保护周期仍有待进一步地提高。
新冠疫情仍在全球肆虐,确诊人数已突破千万级别。因此,如何提供一种安全性高、诱导机体免疫水平高且免疫持久性长的COVID-19疫苗以提升群体免疫水平具有重要意义。
本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用,以提高COVID-19疫苗的安全性、免疫效果和免疫持久性。
第一方面,本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原,所述免疫原包括PreS蛋白或SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白中的至少一者;
或者,所述免疫原包括多种蛋白,所述多种蛋白包括:所述PreS蛋白、所述全长S蛋白或SARS-CoV-2病毒的S1蛋白RBD结构域中的至少一者,以及下述蛋白(a)至蛋白(e)中的至少一者:
(a)SARS-CoV-2病毒的M蛋白,所述M蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列;
(b)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的M蛋白,所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列;
(c)SARS-CoV-2病毒的E蛋白,所述E蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列;
(d)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的E蛋白,所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列;
其中,所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列,所述S1蛋白RBD结构域的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列,所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
所述多种蛋白可以具有以下组合:
(1)所述全长S蛋白和所述M蛋白;
(2)所述全长S蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白;
(3)所述全长S蛋白和所述E蛋白;
(4)所述全长S蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白;
(5)所述全长S蛋白、所述M蛋白和所述E蛋白;
(6)所述全长S蛋白、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述E蛋白;
(7)所述全长S蛋白、所述M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白;
(8)所述全长S蛋白、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白;
(9)所述S1蛋白RBD结构域和所述M蛋白;
(10)所述S1蛋白RBD结构域和所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白;
(11)所述S1蛋白RBD结构域和所述E蛋白;
(12)所述S1蛋白RBD结构域和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白;
(13)所述S1蛋白RBD结构域、所述M蛋白和所述E蛋白;
(14)所述S1蛋白RBD结构域、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述E蛋白;
(15)所述S1蛋白RBD结构域、所述M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白;
(16)所述S1蛋白RBD结构域、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白;
(17)所述PreS蛋白和所述M蛋白;
(18)所述PreS蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白;
(19)所述PreS蛋白和所述E蛋白;
(20)所述PreS蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白;
(21)所述PreS蛋白、所述M蛋白和所述E蛋白;
(22)所述PreS蛋白、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述E蛋白;
(23)所述PreS蛋白、所述M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白;
(24)所述PreS蛋白、所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白和所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白。
在本申请的一些实施例中,所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白包括SARS-CoV-2病毒的E蛋白、柔性连接肽以及SARS-CoV-2病毒的N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位,所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述E蛋白的N端或C端;和/或
所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白包括SARS-CoV-2病毒的M蛋白、柔性连接肽以及所述N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位,所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述M蛋白的N端或C端。
在本申请的一些实施例中,所述柔性连接肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。
第二方面,本申请提供了一种核酸分子,所述核酸分子包括编码PreS蛋白的核苷酸序列或编码SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列中的至少一者;
或者,所述核酸分子包括编码PreS蛋白的核苷酸序列、编码SARS-CoV-2病毒的S蛋白的RBD结构域的核苷酸序列或编码SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列中的至少一者,以及下述核苷酸序列(A)至核苷酸序列(D)中的至少一者:
(A)编码SARS-CoV-2病毒的M蛋白的核苷酸序列;
(B)编码SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的M蛋白的核苷酸序列;
(C)编码SARS-CoV-2病毒的E蛋白的核苷酸序列;
(D)编码SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的E蛋白的核苷酸序列。
在本申请的一些实施例中,当所述核酸分子包括编码多种蛋白的核苷酸序列时,所述编码多种蛋白的核苷酸序列为串联的重组基因片段,或者所述编码多种蛋白的核苷酸序列包括编码所述多种蛋白中任一蛋白的核苷酸序列。
第三方面,本申请提供一种表达载体,包括:载体,以及如第二方面中任意一种所述的核酸分子。
在本申请的一些实施例中,所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒。
在本申请的一些实施例中,所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒。
第四方面,本申请提供了一种重组腺病毒,所述重组腺病毒是将如第三方面中任意一种所述的表达载体转染腺病毒包装细胞,然后进行细胞培养获得的。
在本申请的一些实施例中,所述重组腺病毒的制备方法包括如下步骤:
构建重组穿梭载体,所述重组穿梭载体装载有如第二方面中任意一种所述的核酸分子;
对所述重组穿梭载体进行双酶切,回收目的基因片段,所述目的基因片段包括如第二方面中任意一种所述的核酸分子;
制备腺病毒载体骨架;
将所述目的基因片段与所述腺病毒载体骨架连接,获得表达载体;
对所述表达载体进行线性化处理;以及
将线性化处理后的所述表达载体转染腺病毒包装细胞,然后进行细胞培养,获得所述重组腺病毒。
在本申请的一些实施例中,用于构建所述重组腺病毒的穿梭质粒选自pShuttle-CMV质粒;所述腺病毒载体骨架选自删除E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒,或者所述腺病毒载体骨架选自删除E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒;所述腺病毒包装细胞选自HEK293A细胞。
第五方面,本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒样颗粒,由多种蛋白装配形成,所述多种蛋白包括:PreS蛋白、SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白或SARS-CoV-2病毒的S1蛋白RBD结构域中的至少一者,以及下述蛋白(a)至蛋白(e)中的至少一者:
(a)SARS-CoV-2病毒的M蛋白,所述M蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列;
(b)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的M蛋白,所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列;
(c)SARS-CoV-2病毒的E蛋白,所述E蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列;
(d)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的E蛋白,所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列;
其中,所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列,所述S1蛋白RBD结构域的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列,所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
在本申请的一些实施例中,所述SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法包括:经表达系统表达所述多种蛋白,装配形成所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒。所述表达系统为真核生物或原核生物。作为所述表达系统的真核生物例如可以是酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞,所述哺乳动物细胞例如可以是COS(绿猴细胞系)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、小鼠细胞和人类细胞等。作为所述表达系统的原核生物例如可以是大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌等。
在本申请的一些实施例中,所述制备方法包括如下步骤:
将编码所述多种蛋白中各种蛋白的核苷酸序列通过接头序列连接,获得串联的基因重组片段;
将所述串联的基因重组片段经表达系统表达,获得所述多种蛋白;以及
所述多种蛋白装配形成所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒。
其中,所述多种蛋白可以彼此独立地表达;或者,所述多种蛋白以融合蛋白的形式表达;或者,所述多种蛋白中的一部分蛋白以融合蛋白的形式表达,另一部分蛋白分别独立地表达。
在本申请的一些实施例中,编码所述多种蛋白中任一种蛋白的核苷酸序列分别处于独立的表达框,或者编码所述多种蛋白中至少两种蛋白的核苷酸序列串联至同一个表达框。
在本申请的一些实施例中,所述多种蛋白中任一种蛋白独立地表达,所述制备方法包括如下步骤:
制备多个表达载体,各个所述表达载体分别装载有编码所述多种蛋白中任一种蛋白的核苷酸序列;
将所述多个表达载体导入同一个表达系统表达,获得所述多种蛋白;以及
所述多种蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。
在本申请的一些实施例中,所述多种蛋白包括至少一种融合蛋白和一种非融合蛋白,所述融合蛋白包括至少两种不同的蛋白,编码所述融合蛋白的核苷酸序列和编码所述非融合蛋白的核苷酸序列彼此独立地装载于不同的表达载体,所述制备方法包括如下步骤:
制备第一表达载体,所述第一表达载体装载有编码所述融合蛋白的核苷酸序列,其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列是将编码所述融合蛋白中各种蛋白的核苷酸序列通过接头序列连接,获得的串联的基因重组片段;
制备第二表达载体,所述第二表达载体装载有编码非融合蛋白的核苷酸序列;
将所述第一表达载体和所述第二表达载体导入同一个表达系统表达,获得所述多种蛋白;以及
所述多种蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。
第六方面,本申请还提供了一种药物组合物,包括如如第一方面中任意一种所述的免疫原、或如第二方面中任意一种所述的核酸分子、或如第三方面中任意一种所述的表达载体、或如第四方面中任意一种所述的重组腺病毒、或如第五方面中任意一种所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒。
在本申请的一些实施例中,所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料。
佐剂是指通过增强巨噬细胞活性促进机体T细胞或B细胞的反应,参与半抗原或抗原免疫应答的天然的或合成的物质。佐剂能增强药物组合物的特异性免疫反应,从而提升药物组合物的免疫效果。可与本申请的药物组合物共同施用的佐剂包括但不限于干扰素、趋化因子、肿瘤坏死因子、颗粒溶素、乳铁蛋白、卵白蛋白和白细胞介素。
辅料是指生产药物组合物和调配处方时所用的赋形剂和附加剂,具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能,以使药物组合物达到一定的保质期和生物利用度,从而提高药物组合物的安全性和有效性。可与本申请的药物组合物共同施用的辅料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。
在本申请的一些实施例中,所述药物组合物为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型,适用于粘膜施用的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂或喷雾剂中的至少一种;适用于肌内或皮下施用的剂型为注射剂。
第七方面,本申请还提供了一种免疫方法,将有效量的如第六方面中任意一种所述的 药物组合物以鼻喷给药、滴鼻给药、气溶胶吸入式给药、肌肉注射、皮下注射或口服给药的方式中的至少一种给药于受试者。
本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用,所述免疫原包括PreS蛋白或SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白中的至少一者,其中,PreS蛋白是通过对野生型S蛋白的关键位点进行突变而形成的,PreS蛋白具有免疫性强、可诱导产生高滴度中和抗体的优点,经免疫实验发现,PreS蛋白作为免疫原诱导产生的S蛋白特异性IgG抗体滴度是SARS-CoV-2病毒的S蛋白作为免疫原诱导产生的特异性IgG抗体滴度的三倍以上;或者,所述免疫原包括多种蛋白,所述多种蛋白可以装配形成SARS-CoV-2病毒样颗粒,S蛋白或S1蛋白RBD结构域或PreS蛋白展示于所述SARS-CoV-2病毒样颗粒的包膜上,从而赋予所述SARS-CoV-2病毒样颗粒良好的免疫递呈效果,能够诱导机体产生高滴度的中和抗体,刺激机体产生理想的免疫应答反应,达到治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的目的。
所述SARS-CoV-2病毒的免疫原、包含编码所述免疫原的核苷酸序列的生物材料(如:核酸分子、表达载体、重组腺病毒、SARS-CoV-2病毒样颗粒等)可以制成用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物,具有安全性高、免疫效果理想以及免疫持久性长的优点,所述疫苗和/或药物可以采用成熟的生产工艺进行规模化生产,以快速满足市场需求。
图1为本申请实施例1中pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒的结构示意图。
图2为本申请实施例1中PreS基因片段的鉴定电泳图谱,其中,泳道M代表Marker(DL1000),泳道1和泳道2均代表PreS基因片段的PCR产物,白色圆圈内的条带对应为PreS基因片段。
图3为本申请实施例1中HEK293A细胞培养上清液样品和实施例2中HEK293A细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱,其中,泳道M代表蛋白分子量Maker,泳道1代表经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后的HEK293A细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇),泳道2代表经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后的HEK293A细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂),白色圆圈内代表PreS蛋白的条带;泳道3代表经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后的HEK293A细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇),泳道4代表经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后的HEK293A细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂),白色方框内代表S蛋白的条带;泳道5至泳道8为阴性对照。
图4为本申请实施例1中Vero细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱,其中,泳道M代表蛋白分子量Maker,泳道1代表经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇),泳道2代表经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂),白色圆圈内代表PreS蛋白的条带。
图5为本申请实施例1中纯化后的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的电镜图。
图6为本申请实施例2中pAdC68XY3-S重组腺病毒质粒的结构示意图。
图7为本申请实施例2中S基因片段的鉴定电泳图谱,其中,泳道M代表Marker(DL1000),泳道1至泳道3均代表S基因片段的PCR产物,白色方框内的条带对应为S基因片段。
图8为本申请实施例2中Vero细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图 谱,其中,泳道M代表蛋白分子量Maker,泳道1代表阴性对照,泳道2代表经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇),泳道3代表经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂),白色方框内代表S蛋白的条带。
图9为本申请实施例2中纯化后的rAdC68XY3-S重组腺病毒的电镜图。
图10为本申请实施例3中编码VLP1蛋白组合的串联的基因重组片段的结构示意图。
图11为本申请实施例4中编码VLP2蛋白组合的串联的基因重组片段的结构示意图。
图12为本申请实验例1中各组试验小鼠血清中S蛋白特异性IgG抗体滴度的数据图,其中,D0表示各组试验小鼠免疫第0天,D21表示各组试验小鼠免疫第21天。
图13为本申请实验例2中各组试验小鼠免疫第1天至免疫第113天的血清中S蛋白特异性IgG抗体滴度的变化趋势图,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为S蛋白特异性IgG抗体滴度(Log
10)。
图14为本申请实验例3的各单剂组的试验小鼠的血清中S蛋白特异性IgG抗体滴度的变化趋势图,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为S蛋白特异性IgG抗体滴度。
图15为本申请实验例3的各个实验组的试验小鼠的肺泡灌洗液中S蛋白特异性IgG抗体滴度的变化趋势图,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为S蛋白特异性IgG抗体滴度。
图16为本申请实验例3的各双剂组的试验小鼠的血清中S蛋白特异性IgG抗体滴度的变化趋势图,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为S蛋白特异性IgG抗体滴度。
图17为本申请实验例4中各组试验小鼠的血清中S蛋白特异性IgG抗体滴度水平图。
图18为本申请实验例4中各组试验小鼠的血清中S1蛋白RBD特异性IgG抗体滴度水平图。
图19为本申请实验例4中各组试验小鼠的血清中S蛋白特异性IgA抗体滴度水平图。
图20为本申请实验例4中各组试验小鼠的血清中S1蛋白RBD特异性IgA抗体滴度水平图。
图21为本申请实验例5中各组试验仓鼠在攻毒实验的第1天、第27天以及第41天的血清中S蛋白结合抗体滴度水平图,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为S蛋白结合抗体滴度。
图22为本申请实验例5中各组试验仓鼠在攻毒实验的第1天、第27天以及第41天的血清中S1 RBD蛋白结合抗体滴度水平图,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为S1 RBD蛋白结合抗体滴度。
图23为本申请实验例5中各组试验仓鼠在攻毒实验的第1天、第27天以及第41天的血清中中和抗体滴度水平图,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为中和抗体滴度。
图24为本申请实验例5中各组试验仓鼠在攻毒实验的第3天和第7天的肺部病毒载量水平图一,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为肺部2-D CT ORF1ab载量。
图25为本申请实验例5中各组试验仓鼠在攻毒实验的第3天和第7天的肺部病毒载量水平图二,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为TCID50(mL/g)。
图26为本申请实验例5中各组试验仓鼠在攻毒实验的第42天和第49天的病理评分结果图,其中,横坐标为免疫时间(天,Day),纵坐标为病理得分的数值。
下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例, 都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中涉及的动物实验在Non-GLP(Non-Good Laboratory Practice)实验室条件下开展,并按照“动物福利伦理审查实验室动物指南”处理动物。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本申请的内容。
本申请中的术语“S蛋白”可以来源于已知的任何SARS-CoV-2病毒株,在本申请实施例中,S蛋白来源于毒株SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1),全长具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。SARS-CoV-2的S蛋白包括S1亚基,所述S1亚基上具有RBD(Receptor binding domain,RBD)结构域,通过RBD结构域与人体细胞上的ACE2受体蛋白相结合,使得SARS-CoV-2感染人体细胞。
本申请中的术语“PreS蛋白”是指一种稳定呈现SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白在与人体细胞上的ACE2受体蛋白结合前构象的蛋白,可以是已知的任何SARS-CoV-2病毒株的野生型S蛋白经优化而形成的,所述优化例如可以是点突变。在本申请实施例中,PreS蛋白是来源于毒株SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1)的野生型S蛋白经点突变而形成的,具有如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
本申请中的术语“融合蛋白”是指有目的地将两段以上编码功能蛋白的基因连接在一起以形成融合的重组基因片段,并由同一调控序列控制所述融合的重组基因片段表达后所得的蛋白质产物。
本申请中的术语“核酸分子”是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,例如可以是通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)片段、核糖核酸(RNA)片段以及寡核苷酸片段中的任意一种,以及通过连接、切割、内切核酸酶作用或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段,可以是单链的或双链的。在本申请实施例中,PreS基因片段、S基因片段、VLP1基因片段和VLP2基因片段均属于核酸分子。
本申请中的术语“HEK293”是指人胚胎肾细胞293,其是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系,具有极少表达细胞外配体所需的内生受体、易转染的特性,分为293A、293T等类型,其中,293A用来包装腺病毒。在本申请实施例中,将HEK293A细胞作为pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒的转染细胞,以包装产生rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒;另外,将HEK293A细胞作为rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒的表达系统,以表达产生蛋白组合VLP1。
本申请中的术语“Vero”是指非洲绿猴肾细胞,其是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的异倍体细胞。在本申请实施例中,将Vero细胞作为rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒的表达系统,以表达产生VLP1蛋白组合。
本申请的术语“表达框”是指开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),其包含一段可以编码目的蛋白的核苷酸序列,并且该核苷酸序列上具有起始密码子和终止密码子。
本申请中的术语“载体”是指能够运输另一种核酸的核酸分子,例如可以是质粒、病毒、粘粒等,所述病毒例如可以是腺病毒、安卡拉牛痘病毒(MVA)、水泡性口炎病毒(VSV)等,所述腺病毒例如可以是Ad5型人腺病毒、Ad26型人腺病毒、AdC3型黑猩猩腺病毒、AdC7型黑猩猩腺病毒、AdC68型黑猩猩腺病毒等。在本申请实施例中,载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒。
本申请中的术语“表达载体”是指一种DNA构建体,其含有与合适的控制序列可操作地 连接的核酸分子,所述控制序列能够实现所述核酸分子在合适的表达系统中表达。
本申请中的术语“表达系统”是指用于表达外源基因蛋白的一类宿主,例如可以是真核生物、原核生物、病毒等。在本申请实施例中,HEK293A细胞和Vero细胞均属于表达系统。
本申请中的术语“病毒样颗粒”是指含有SARS-CoV-2病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,没有SARS-CoV-2病毒的核酸,不能自主复制,在形态上与真正的SARS-CoV-2病毒相同或相似,从而易于被免疫系统识别并产生很好的免疫效果。在本申请实施例中,VLP1含有SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白、M蛋白和E蛋白;VLP2含有SARS-CoV-2病毒的S1蛋白RBD结构域、M蛋白以及N蛋白抗原表位融合的E蛋白。
本申请中的术语“免疫原”是指可以刺激机体产生免疫应答的一类物质,在本申请实施例中,S蛋白、PreS蛋白、VLP1蛋白组合和VLP2蛋白组合均属于免疫原。
本申请中的术语“免疫”是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排除抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能,包括天然免疫和获得性免疫。在本申请的一个实施例中,通过对受试者给药rAdC68XY3-PreS重组腺病毒,而引起机体免疫系统针对免疫原(PreS蛋白)的免疫应答反应。在本申请的另一个实施例中,通过对受试者给药rAdC68XY3-S重组腺病毒,而引起机体免疫系统针对免疫原(S蛋白)的免疫应答反应。在本申请的另一个实施例中,通过对受试者给药VLP1或VLP2,而引起受试者机体的免疫应答反应。
本申请的术语“药物组合物”包括治疗目的的组合物和免疫/预防目的的组合物。所述治疗目的是指改善或减轻COVID-19的至少一种症状,可以延迟COVID-19的恶化或进展,或可以延迟或阻止其他相关疾病或并发症的发作。所述免疫/预防目的是指可以刺激或引起生物体产生免疫应答以达到预防SARS-CoV-2感染目的。药物组合物可以是包括一种或多种免疫原的组合物,例如:药物组合物包括VLP1蛋白组合和/或VLP2蛋白组合,又如:药物组合物包括SARS-CoV-2的全长S蛋白和/或PreS蛋白。所述药物组合物还可以是包括核酸分子的组合物,所述核酸分子编码一种或多种的免疫原或免疫原性表位,并且所述核酸分子可以包括在载体(如:质粒、病毒)中而形成表达盒、表达载体、转化体等形式。所述药物组合物例如可以是疫苗,所述疫苗可以是mRNA疫苗、DNA疫苗、重组载体疫苗等类型。此外,所述药物组合物例如还可以是药物制剂。在本申请的一些实施例中,物组合物包括rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和/或rAdC68XY3-S重组腺病毒。在另一些实施例中,所述药物组合物包括VLP1和/或VLP2。
本申请的术语“对象”是指能够发生细胞免疫应答的任何生物体,包括人类和其他哺乳类动物,还包括已被SARS-CoV-2感染且尚未治愈、曾被SARS-CoV-2感染且已治愈或具有SARS-CoV-2感染风险的任何个体。落入本申请范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于:灵长类、家畜(例如羊、牛、马、猴、猪等)、实验室试验动物(例如兔、鼠等)、宠物(例如猫、狗等)和圈养野生动物(例如狼、狐狸、鹿等)。在一些实施例中,对象为试验小鼠。在一些实施例中,所述对象优选为人类。
本申请的术语“有效量”是指足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种症状改善的给药剂量,或是能够刺激细胞免疫应答以达到预防疾病目的的给药剂量。有效量取决于众多因素,例如:药物的活性、采用的递送方式等,且可以由本领域技术人员根据对象的个体情况容易地确定。
本申请中的术语“湿转法”是通过将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的胶片浸入转印缓冲液中,使得经SDS-PAGE分离获得的蛋白质样品从胶片上转印至转印膜上而得以固定。例如:在一些实施方式中,将经SDS-PAGE分离获得的PreS蛋白从胶片上转印至转印膜上而得以固定。
除非另有说明,以下实施例中使用的培养基、试剂和溶液均为市售商品,或者可以通过本领域已知方法制备。
一、本申请实施例中涉及培养基的说明
(1)DMEM培养基购自美国的Hyclone实验室。
(2)LB培养基
每100mL的LB液体培养基中,包括:1.0g的蛋白胨,0.5g的酵母粉,以及1.0g的NaCl。对于LB固体培养基,是在LB液体培养基配方的基础上添加20g/L的琼脂。
二、本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒及动物的说明详见下表1:
表1本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒、蛋白组合及病毒样颗粒的说明
三、本申请实施例中涉及的基因片段、蛋白、试剂以及溶液的说明:
本申请实施例中涉及的除引物之外的基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本申请实施例中涉及的所有引物是由武汉擎科生物技术有限公司合成。
本申请实施例中涉及的限制性内切酶(如:NotI、KpnI和PacI)、归位内切酶(如:PI-SceI和I-CeuI)、连接酶(如:T4连接酶)、酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer)、PCR反应混合液(2×PrimerSTAR mix)以及双蒸水(ddH
2O)均购自宝生物工程(大连)有限公司。
本申请实施例中涉及的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒以及病毒RNA/DNA提取试剂盒均购自美国的Axygen公司。
本申请实施例中涉及的Lipofectamine
TM2000试剂盒和ECL显色液购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。
本申请实施例中涉及的PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜购自美国默克(Merck)公司。
本申请实施例中涉及的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司。
本申请实施例中涉及的S蛋白购自京天成公司。
本申请实施例中涉及的鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体购自美国的GeneTex公司。
本申请实施例中涉及的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)购自美国的KPL公司。
下面结合实施例、对比例和实验例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1:rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的制备与表达
一、构建rAdC68XY3-PreS重组腺病毒
本实施例以rAdC68XY3-PreS重组腺病毒在表达系统内表达产生的PreS蛋白作为目的免疫原,PreS蛋白是野生型S蛋白的关键位点突变而形成的,野生型S蛋白来源于毒株SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1),PreS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。将经过人源密码 子优化后获得的PreS基因片段作为rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的靶基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示,PreS基因片段能够编码产生PreS蛋白。
在本实施例中,rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒,所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒,E1编码区的缺失使得rAdC68XY3-PreS重组腺病毒不能在普通细胞(如:人体细胞)内复制,具有很高的生物安全性,仅能在HEK293A等细胞中复制,E3编码区的缺失使得rAdC68XY3-PreS重组腺病毒具有更大的插入基因容量。
1.1构建pShuttle-PreS重组质粒
本实施例选择未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒作为载体。pShuttle--CMV为穿梭型质粒,其上含有CMV增强子、CMV启动子、T7启动子、嵌合内含子和bGH poly(A)加尾信号,并具有NotI和KpnI双酶切位点,还具有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性。
所述构建pShuttle-PreS重组质粒,具体包括如下步骤:
S1.11、在PreS基因片段的起始密码子前面加入Kozak序列,并在其3’端和5’端分别添加NotI和KpnI酶切位点,然后进行基因合成;
S1.12、采用NotI和KpnI限制性内切酶对步骤S1.11合成的基因片段进行双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,胶回收长度为3769bp的目的基因片段,其中,双酶切后回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施;
S1.13、采用NotI和KpnI限制性内切酶对pShuttle-CMV进行双酶切,采用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后,胶回收长度为4093bp的载体骨架,其中,双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施;
S1.14、将步骤S1.12获得的目的基因片段,与步骤S1.13获得的载体骨架相混合,在T4连接酶的作用下16℃连接过夜,获得pShuttle-PreS连接产物;
S1.15、将步骤S1.14获得的pShuttle-PreS连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上,37℃静置培养过夜,获得多个单菌落,其中,转化按照本领域常规的热激转化方式实施;
S1.16、挑取步骤1.15中的多个单菌落接种于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,获得多个菌液;
S1.17、对步骤1.16中的多个菌液分别进行质粒提取操作,将提取的质粒测序,测序结果正确的质粒即为pShuttle-PreS重组质粒,其中,质粒提取操作根据质粒提取试剂盒操作说明实施。
1.2构建pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒
在本实施例中,选择自行构建的pShuttle-PreS和商购的pAdC68XY3-GFP来构建pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒,pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒的结构如图1所示。
所述构建pAdC68XY3-PreS重组腺病毒表达载体,具体包括如下步骤:
S1.21、采用PI-SceI和I-CeuI限制性内切酶对pShuttle-PreS进行双酶切,采用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后,胶回收长度为4246bp的目的基因片段,其中,回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施,目的基因片段包含PreS基因片段的表达调控元件;
S1.22、采用PI-SceI和I-CeuI限制性内切酶对pAdC68XY3-GFP进行双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,胶回收长度为33062bp的载体骨架,其中,双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施;
S1.23、将步骤1.21获得的目的基因片段,与步骤S1.22获得载体骨架混合,在T4连接酶的作用下16℃连接过夜,获得pAdC68XY3-PreS连接产物;
S1.24、将pAdC68XY3-PreS连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)抗性的LB平板上,37℃培养过夜,获得多个单菌落,其中,转化按照本领域常规的热激转化方式实施;
S1.25、挑取步骤1.24中的多个单菌落分别接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中,37℃培养过夜,获得多个菌液;
S1.26、对步骤1.25中的多个菌液分别进行质粒提取操作,然后对提取的质粒测序,测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒,其中,质粒提取操作根据质粒提取试剂盒操作说明实施;
S1.27、将步骤1.26中测序结果正确的pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上,37℃培养过夜;挑取多个培养获得的单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中,37℃培养过夜,之后使用质粒提取试剂盒提取质粒后进行测序。
经测序,pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示,其中,PreS基因片段插入位置为AdC68型黑猩猩腺病毒基因组中缺失的E1编码区。
1.3线性化处理pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒
采用PacI限制性内切酶对1.2中获得的所述pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒进行酶切,以使所述pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒线性化,其中,酶切温度为37℃,酶切时间为三小时,酶切体系详见下表2:
表2 pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒线性化的酶切体系
试剂 | 用量 |
酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer) | 5μL |
PacI限制性内切酶 | 5μL |
pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒 | 10μg |
双蒸水(ddH 2O) | 补加至总体系为50μL |
总体系 | 50μL |
酶切完成后,采用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物,其中,回收的基因片段长度为35556bp,实现pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒线形化,并通过微量核酸定量仪对回收后的基因片段进行定量分析。
1.4制备rAdC68XY3-PreS重组腺病毒
对1.3中酶切后回收的基因片段(长度为35556bp)进行转染操作,采用Lipofectamine
TM2000试剂盒进行转染操作,并选择HEK293A细胞作为表达系统。根据Lipofectamine
TM2000试剂盒的操作说明,将1.3中酶切后回收的基因片段(长度为35556bp)转染于汇合度为60~70%的HEK293A细胞内。
在Lipofectamine
TM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中,用于培养HEK293A细胞的培养基为MEM培养基,并在转染前两小时将MEM培养基更换为DMEM培养基。转染五小时后,更换培养基为含10%(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基。
转染隔日,在倒置显微镜下观察细胞病变,直至60%的HEK293A细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融三次,然后在1200×g的转速下离心五分钟,收集上清液,获得的上清液中包含rAdC68XY3-PreS重组腺病毒,并将上清液分装后置于-80℃超低温冰箱保存备用。
二、鉴定rAdC68XY3-PreS重组腺病毒基因组中的PreS基因片段
以rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的全基因组作为模板,采用PCR技术扩增PreS基因片段。针对PreS基因片段设计用于PCR扩增的正向引物F1和反向引物R1,所述正向引物 F1如SEQ ID NO.22所示,所述反向引物R1如SEQ ID NO.23所示。采用病毒RNA/DNA提取试剂盒对上述1.4中获得的上清液进行全基因组提取操作,具体操作参照试剂盒操作说明进行。
其中,PCR反应体系详见下表3:
表3为PCR反应体系一览表
试剂 | 用量/μL |
PCR反应混合液(2×PrimerSTAR mix) | 5.0 |
正向引物F1(10μM) | 1.0 |
反向引物R1(10μM) | 0.5 |
模板 | 0.5 |
双蒸水(ddH 2O) | 3.0 |
总体系 | 10 |
PCR反应程序具体为:①95℃预变性2min;②95℃变性15s;③45℃退火15s;④72℃延伸90s;⑤重复②~④30个循环;⑥72℃,5min。
PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果如图2所示,白色圆圈内的条带预估为PreS基因片段,然后切胶回收该条带并测序,测序结果显示该条带即为PreS基因片段。其中,所述切胶回收采用胶回收试剂盒进行,具体操作参照胶回收试剂盒中的操作说明实施。
三、rAdC68XY3-PreS重组腺病毒表达PreS蛋白
分别选择HEK293A细胞和Vero细胞作为表达系统,以分别检测rAdC68XY3-PreS重组腺病毒在HEK293A细胞和Vero细胞中PreS蛋白的表达。具体包括如下步骤:
S3.1、将表达系统按5×10
5个/孔的接种量接种于六孔板的孔内,选用MEM培养基培养表达系统,以使表达系统在孔内增殖;
S3.2、当孔内表达系统的汇合率达到90%时,将rAdC68XY3-PreS重组腺病毒接种于孔内,并设置阴性对照,在37℃的条件下静置培养;
S3.3、当37℃静置培养48h后,先将粘壁细胞刮于细胞培养液中,然后将细胞培养液离心,并收集上清液,将该上清液标记为细胞培养上清液;
S3.4、取80μL步骤S3.3中获得的细胞培养上清液,然后加入20μL五倍浓缩的SDS-PAGE上样缓冲液(5×SDS-PAGE Loading Buffer),并在100℃下煮沸五分钟,获得该细胞培养上清液的待检样品;
S3.5、结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)技术检测步骤S3.4中获得的待检样品中的PreS蛋白表达。
其中,在所述步骤S3.2中,当所述表达系统为HEK293A细胞时,rAdC68XY3-PreS重组腺病毒按照感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)0.2进行接种;当所述表达系统为Vero细胞时,rAdC68XY3-PreS重组腺病毒按照MOI 20进行接种。
在所述步骤S3.3中,当所述表达系统为HEK293A细胞时,所述阴性对照即为未接种有rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的HEK293A细胞;当所述表达系统为Vero细胞时,所述阴性对照即为未接种有rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的Vero细胞。
在所述步骤S3.5中,结合SDS-PAGE和WB技术检测各个待检样品,具体包括如下步骤:
S3.51、将所述待检样品进行8%SDS-PAGE电泳;
S3.52、电泳结束后,利用湿转法将目的PreS蛋白转印至PVDF膜上;
S3.53、将附着有PreS蛋白的PVDF膜浸泡于含5%(质量百分比)脱脂奶粉的PBST溶液中,在4℃下封闭过夜;
S3.54、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.53的所述PVDF膜两次,然后将所述PVDF膜浸泡于鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)中,在37℃下孵育一小时;
S3.55、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.54的所述PVDF膜两次,然后将所述PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)中,在37℃下孵育一小时;
S3.56、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.55的所述PVDF膜两次,然后将ECL显色液加至于所述PVDF膜的附着有PreS蛋白的一面上,化学发光法显色。
其中,在所述步骤S3.51中,10%SDS-PAGE电泳的条件为:①保持电压100V二十分钟;②保持电压160V一小时二十分钟。
在所述步骤S3.54中,可用兔抗anti-RBD多克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)替代所述鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)。
在所述步骤S3.55中,可用HRP标记的羊抗兔IgG稀释液(稀释比例为1:5000)替代所述HRP标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)。
需要说明的是,利用WB技术检测各个待检样品也可通过商品化的Western Blot ECL化学发光法显色试剂盒进行。
如图3和图4所示,经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后,HEK293A细胞和Vero细胞的所述细胞培养上清液的待检样品中均能成功检测到PreS蛋白的表达,表达的PreS蛋白分子量约为180~200KD,需要说明的是,表达的PreS蛋白存在高度的糖基化。
四、rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的纯化及检定
4.1小规模扩增rAdC68XY3-PreS重组腺病毒
首先,提供汇合度为90%的HK293A细胞;然后,将rAdC68XY3-PreS重组腺病毒按照MOI0.2接种于所述HEK293A细胞中,并置于37℃、5%(体积百分比)CO
2的培养箱内静置培养;待70%以上的细胞变圆、脱落时,使用细胞刮将粘壁细胞刮下,然后将细胞培养液2265×g离心十分钟,并分别收集上清液和细胞沉淀;最后,将收集的所述细胞沉淀重悬于PBS缓冲液中,并在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融三次,2265×g离心十分钟以收集上清液,将两次收集的上清液合并,并标记为rAdC68XY3-PreS重组腺病毒保存液以用于下一步纯化。
4.2纯化rAdC68XY3-PreS重组腺病毒
在生物安全柜中,向一50mL的离心管中缓慢加入12mL密度为1.4g/mL的氯化铯溶液,然后非常轻缓地加入9mL密度为1.2g/mL的氯化铯溶液,接着在不连续梯度的顶部加入13mL的所述rAdC68XY3-PreS重组腺病毒保存液,获得待纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒样品。
预冷离心转子至4℃,将待纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒样品于4℃、100000×g离心一百二十分钟,对于SW28型号的转子需采用23000r/min的转速。离心后,小心抽吸病毒带,获得含rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的溶液。将所述含rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的溶液转移至一无菌的15mL离心管内,向其中加入等体积的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH为7.9),获得稀释的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒悬液。
取另一50mL的离心管,向其中加入20mL密度为1.35g/mL的氯化铯溶液,然后非常轻缓地在氯化铯溶液的顶部加入15mL所述稀释的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒悬液。平衡所述离心管后,在4℃、100000×g离心十八小时,对于SW28型号的转子需采用23000r/min的转速。离心结束后,小心收集蓝白色病毒带。将获得的蓝白色病毒带置于10000道尔顿 的纤维素酯膜中,4℃透析至PBS溶液中以去除氯化铯,获得纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒溶液。向纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒溶液中加入10%(体积百分数)甘油,分装后冻存于-80℃冰箱中以备用。
4.3 rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的检定及分析
采用2%(质量百分比)磷钨酸溶液(pH为6.8)复染纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒,然后进行电镜检测,如图5所示,经电镜观察可看到完整的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒颗粒。
此外,采用腺病毒滴度-TCID50法检测纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒,检测结果显示纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒滴度在109TCID50/ml以上。其中,所述腺病毒滴度-TCID50法参考文献(
G.,Archiv f experiment Pathol u Pharmakol,162:480-483,1931)进行。
实施例2:rAdC68XY3-S重组腺病毒的制备与表达
本实施例对来源于毒株SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1)的野生型S蛋白进行信号肽替换操作,获得的全长S蛋白作为目的免疫原,所述全长S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。将经过人源密码子优化后获得的S基因片段作为rAdC68XY3-S重组腺病毒的靶基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示,S基因片段能够编码产生SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白。rAdC68XY3-S重组腺病毒的结构如图6所示。
rAdC68XY3-S重组腺病毒的构建参照实施例1进行,依次构建pShuttle-S重组质粒、构建pAdC68XY3-S重组腺病毒质粒和制备rAdC68XY3-S重组腺病毒,在此不再赘述。
经测序,pAdC68XY3-S重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示,其中,S基因片段插入位置为AdC68型黑猩猩腺病毒基因组中缺失的E1编码区。
需要说明的是,对于构建pShuttle-S重组质粒,起始合成的基因片段(对应步骤S1.11)为:在S基因片段的起始密码子前面加入Kozak序列,并在编码全长S蛋白的N端的核苷酸序列处添加编码Jev信号肽的核苷酸序列,最后在3’端和5’端分别添加NotI和KpnI酶切位点。
以rAdC68XY3-S重组腺病毒的全基因组作为模板,采用PCR技术扩增S基因片段。针对S基因片段设计用于PCR扩增的正向引物F2和反向引物R2,所述正向引物F2如SEQ ID NO.26所示,所述反向引物R2如SEQ ID NO.27所示。
其中,提取rAdC68XY3-S重组腺病毒的全基因组、PCR反应体系以及PCR反应程序参照实施例2进行,在此不再赘述。
PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果如图7所示,白色方框内的条带预估为S基因片段,然后切胶回收该条带并测序,测序结果显示该条带即为S基因片段。其中,所述切胶回收采用胶回收试剂盒进行,具体操作参照胶回收试剂盒中的操作说明实施,在此不再赘述。
rAdC68XY3-S重组腺病毒表达S蛋白参照实施例1进行,仅需将实施例1中的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒替换为rAdC68XY3-S重组腺病毒,在此不再赘述。
如图3和图8所示,经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后,HEK293细胞和Vero细胞的细胞培养上清液的待检样品中均能成功检测到S蛋白的表达,表达的S蛋白分子量约为180~200KD,需要说明的是,表达的S蛋白存在高度的糖基化。
rAdC68XY3-S重组腺病毒的纯化及检定参照实施例1进行,仅需将实施例1中的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒替换为rAdC68XY3-S重组腺病毒,在此不再赘述。
如图9所示,经电镜观察可看到完整的rAdC68XY3-S重组腺病毒颗粒。采用腺病毒滴度-TCID50法检测纯化的rAdC68XY3-S重组腺病毒,检测结果显示纯化的rAdC68XY3-S重组腺病毒滴度在9.0TCID50/ml以上。
实施例3:制备用于表达VLP1蛋白组合的rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒
本实施例提供了一种VLP1蛋白组合的制备方法,如图10所示,VLP1蛋白组合包括信号肽、SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白、接头蛋白F-P2A、E蛋白和M蛋白,其中,所述全长S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
VLP1蛋白组合的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示,编码VLP1蛋白组合的VLP1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。当VLP1蛋白组合表达时,所述全长S蛋白、所述M蛋白和所述E蛋白通过同一个表达框进行表达。
5.1构建pShuttle-VLP1重组质粒
本实施例选择未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒作为pShuttle-VLP1重组质粒的载体。所述构建pShuttle-VLP1重组质粒,包括如下步骤:
S5.11、在VLP1基因片段的起始密码子前面加入Kozak序列,并在编码全长S蛋白的N端的核苷酸序列处添加编码Jev信号肽的核苷酸序列,最后在3’端和5’端分别添加NotI和Kpn酶切位点,然后进行基因合成;
S5.12、采用NotI和KpnI限制性内切酶对步骤S5.11合成的基因片段进行双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,胶回收目的基因片段,双酶切后回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施;
S5.13、采用NotI和KpnI限制性内切酶对pShuttle-CMV进行双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,胶回收长度为4093bp的载体骨架,其中,双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施;
S5.14、将步骤S5.12获得的目的基因片段,与步骤S5.13获得的载体骨架相混合,在T4连接酶的作用下16℃连接过夜,获得pShuttle-VLP1连接产物;
S5.15、将步骤S5.14获得的pShuttle-VLP1连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上,37℃静置培养过夜,获得多个单菌落,其中,转化按照本领域常规的热激转化方式实施;
S5.16、挑取步骤S5.15中的多个单菌落接种于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,获得多个菌液;
S5.17、对步骤S5.16中的多个菌液分别进行质粒提取操作,将提取的质粒测序,测序结果正确的质粒即为pShuttle-VLP1重组质粒,其中,质粒提取操作根据质粒提取试剂盒操作说明实施。
5.2构建pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒
在本实施例中,选择自行构建的pShuttle-VLP1和商购的pAdC68XY3-GFP来构建pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒以作为表达载体,具体包括如下步骤:
S5.21、采用PI-SceI和I-CeuI限制性内切酶对pShuttle-VLP1进行双酶切,采用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后,胶回收目的基因片段,其中,回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施,目的基因片段包括VLP1基因片段和VLP1蛋白组合的表达框;
S5.22、采用PI-SceI和I-CeuI限制性内切酶对pAdC68XY3-GFP进行双酶切,采用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后,胶回收长度为33062bp的载体骨架,其中,双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施;
S5.23、将步骤S5.21获得的目的基因片段,与步骤S5.22获得载体骨架混合,在T4连接酶的作用下16℃连接过夜,获得pAdC68XY3-VLP1连接产物;
S5.24、将pAdC68XY3-VLP1连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)抗性的LB平板上,37℃培养过夜,获得多个单菌落,其中,转化按照本领域常规的热激转化方式实施;
S5.25、挑取步骤S5.24中的多个单菌落分别接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中,37℃培养过夜,获得多个菌液;
S5.26、对步骤S5.25中的多个菌液分别进行质粒提取操作,然后对提取的质粒测序,测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒,其中,质粒提取操作根据质粒提取试剂盒操作说明实施;
S5.27、将步骤S5.26中测序结果正确的pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上,37℃培养过夜;挑取多个培养获得的单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中,37℃培养过夜,之后使用质粒提取试剂盒提取质粒后送测序公司测序。
5.3线性化处理pAdC68XY3-VLP1重组腺病毒质粒
参照1.3进行。
5.4制备rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒
参照1.4进行。
5.5、鉴定rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒基因组中的VLP1基因片段
以rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒的全基因组作为模板,采用PCR技术扩增VLP1基因片段。针对VLP1基因片段设计用于PCR扩增的正向引物F1’和反向引物R1’,所述正向引物F1如SEQ ID NO.14所示,所述反向引物R1’如SEQ ID NO.15所示。采用病毒RNA/DNA提取试剂盒对上述1.4中获得的上清液进行全基因组提取操作,具体操作参照操作说明进行,在此不再赘述。
其中,PCR反应体系与反应程序参照实施例1中的第二部分。
PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收目的条带并测序,测序结果正确代表目的条带即为VLP1基因片段。
5.6、rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒表达VLP1蛋白组合
参照实施例1的第三部分进行。
经rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒感染后,HEK293A细胞和Vero细胞的待检样品中均能成功检测到VLP1所含各蛋白的表达,并且rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒在HEK293细胞和Vero细胞中表达SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白、E蛋白和M蛋白后,上述三个蛋白能够借助细胞膜结构自行组装形成病毒样颗粒VLP1。
实施例4制备用于表达VLP2蛋白组合的rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒
本实施例提供了一种可表达两个独立的蛋白(VLP2蛋白组合)的rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒的制备方法,如图11所示,两个独立的蛋白分别为S1蛋白RBD结构域-M蛋白的融合蛋白和N蛋白抗原表位融合的E蛋白,且这两个独立的蛋白能够借助细胞膜结构自行组装形成病毒样颗粒VLP2,S1蛋白RBD结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示;N蛋白抗原表位融合的E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示,N蛋白抗原表位融合的E蛋白由SARS-CoV-2病毒的E蛋白、柔性连接肽以及SARS-CoV-2病毒的N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位组成,抗原表位通过柔性连接肽连接于E蛋白的C端,柔性连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示,其中,抗原表位为CD4
+T细胞识别的表位。
编码VLP2蛋白组合的VLP2基因片段为重组基因片段,VLP2基因片段具有第一表达框和第二表达框,其中,S1蛋白RBD结构域-M蛋白的融合蛋白通过第一表达框进行表达,N蛋白抗原表位融合的E蛋白单独通过第二表达框进行表达。第一表达框的核苷酸序列如 SEQ ID NO.16所示,对应表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示;第二表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,对应表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示,并且第二表达框前采用EF1a启动子。
rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒的制备方法参照实施例1中rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒的制备方法进行,依次进行步骤:构建pShuttle-VLP2重组质粒、构建pAdC68XY3-VLP2重组腺病毒质粒、线性化处理pAdC68XY3-VLP2重组腺病毒质粒、制备rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒、鉴定rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒基因组中的VLP2基因片段以及rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒表达VLP2蛋白组合,其中,采用正向引物F1’和反向引物R1’鉴定VLP2基因片段。需要说明的是,rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒在表达系统(如HEK293A细胞和Vero细胞)中表达VLP2蛋白组合后,VLP2蛋白组合能够在表达系统内自行组装形成VLP2。
对比例rAdC68XY3-GFP重组腺病毒的制备及纯化
本对比例提供了一种rAdC68XY3-GFP重组腺病毒,rAdC68XY3-GFP重组腺病毒的制备方法是:将商购的pAdC68XY3-GFP重组质粒线性化,并转染HEK293细胞,经细胞培养而获得rAdC68XY3-GFP重组腺病毒,具体操作参照实施例1进行。
将制备获得的rAdC68XY3-GFP重组腺病毒进行小规模扩增及纯化,具体操作参照实施例1进行,将纯化获得的rAdC68XY3-GFP重组腺病毒留存备用。
实验例1
本实验例旨在比较rAdC68XY3-GFP重组腺病毒、rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和rAdC68XY3-S重组腺病毒的免疫活性。
选取18只试验小鼠(约3~7天时间适应环境),动物经检验检疫后随机分为三组,每组6只,每组的具体情况详见下表4:
表4实验例1中分组情况一览表
组别 | 免疫情况 |
阴性对照组 | 采用rAdC68XY3-GFP重组腺病毒对试验小鼠进行免疫 |
实验组1 | 采用rAdC68XY3-PreS重组腺病毒对试验小鼠进行免疫 |
实验组2 | 采用rAdC68XY3-S重组腺病毒对试验小鼠进行免疫 |
对各组的试验小鼠进行腹腔注射免疫,每只每次注射为5微克,每周注射1次,共注射3次,21天后眼眶取血。采用酶联免疫反应(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)法检测试验小鼠血清中特异性IgG抗体滴度,包括如下步骤:
S10、采用无菌碳酸钠缓冲液(pH为9.6)和商购的S蛋白配置S蛋白溶液,所述S蛋白溶液的浓度为0.5μg/mL,然后将所述S蛋白溶液按照100μL/孔加入至96孔酶标板,置于4℃包被过夜;
S20、次日,弃去酶标板孔内的液体,用PBST缓冲液洗板三次,然后每孔加入封闭液,置于37℃封闭一小时;
S30、封闭结束后,弃去所述酶标板孔内的封闭液,然后用封闭液对免疫后的试验小鼠血清进行系列梯度稀释,并将稀释后的血清按照100μL/孔加入至所述酶标板,每个稀释度血清设置三个平行样,设置封闭液作为空白对照,置于37℃孵育一小时;
S40、步骤S30的孵育结束后,用PBST缓冲液洗板三次,然后将过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(稀释比例为1:1000)按照100μL/孔加入至所述酶标板,置于37℃孵育一小时;
S50、步骤S40的孵育结束后,用PBST缓冲液洗板三次,按照100μL/孔加入作为生色底物的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),暗处放置15分钟;
S60、按照100μL/孔加入0.2mol/L的硫酸终止反应,用酶标仪在波长450nm和参比波长620nm处测定吸光度。
对步骤S10至步骤S60需要说明的是,所述碳酸钠缓冲液(pH为9.6)的配方是:每1000mL的碳酸钠缓冲液中,包括8.4g的碳酸氢钠(NaHCO
3)和3.5g的碳酸钠(Na
2CO
3)。所述PBST缓冲液为含有0.1%(质量百分数)吐温-20的PBS缓冲液,所述封闭液为含有10%(质量百分数)脱脂奶粉的PBS缓冲液,PBS缓冲液采用本领域常规技术手段配置。
实验结果如图12所示,其中,实验组1的特异性IgG抗体滴度几何平均值为8445,实验组2的特异性IgG抗体滴度几何平均值为2263,说明PreS蛋白和SARS-CoV-2病毒的S蛋白均可以诱导产生特异性IgG抗体。其中,PreS蛋白诱导产生的特异性IgG抗体滴度可以达到S蛋白诱导产生的特异性IgG抗体滴度的三倍以上,这意味着免疫原PreS可以诱导产生高滴度的特异性IgG抗体,证明PreS蛋白在制备用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物中具有巨大优势。
实验例2
本实验例旨在验证rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的免疫持久性。
本实验例的试验动物为恒河猴,试验恒河猴经检验检疫后分为七组,每组的具体情况详见下表5:
表5实验例2中分组情况一览表
按照表5中的给药剂量和给药方式对各个组的试验恒河猴进行免疫,免疫2剂后采血,测定血清中S蛋白特异性IgG抗体滴度,实验结果如图13所示,相较于NC组和VC组,实验1组至实验5组具有更佳的免疫效果,并且实验1组至实验5组在免疫后的第52天至第113天呈现较高的抗体水平,实验1组至实验5组在免疫后的第113天的抗体水平仅有极小幅度的下降。
实验例3
本实验例旨在比较rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和rAdC68XY3-S重组腺病毒的免疫效果。
本实验例的试验动物为C57BL/6小鼠,试验小鼠经检验检疫后分为八组,每组的具体情况详见下表6:
表6实验例3中分组情况一览表
按照表6中的给药剂量和给药方式对各个组的试验小鼠进行免疫,其中,实验1组至实验4组为单剂组,实验5组至实验8组为双剂组。对于单剂组的试验小鼠,在第一剂免疫之后的第29天,对各个试验小鼠进行采血以检测血样中S蛋白特异性IgG抗体滴度,并检测各个试验小鼠的肺泡灌洗液中S蛋白特异性IgA抗体滴度,实验结果如图14和图15所示。对于双剂组的试验小鼠,在第二剂免疫之后的第21天,对各个试验小鼠进行采血以 检测血样中S蛋白特异性IgG抗体滴度,并检测各个试验小鼠的肺泡灌洗液中S蛋白特异性IgA抗体滴度,实验结果如图15和图16所示。
由图14至图16可知,rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和rAdC68XY3-S重组腺病毒均能诱导机体产生较高水平的S蛋白特异性IgA抗体滴度,并且采用滴鼻给药方式均能诱导粘膜免疫,并且rAdC68XY3-PreS重组腺病毒诱导机体产生的S蛋白特异性IgA抗体滴度水平高于rAdC68XY3-S重组腺病毒。对于rAdC68XY3-PreS重组腺病毒,采用滴鼻给药方式的免疫效果优于肌肉给药方式。
实验例4
本实验例旨在比较rAdC68XY3-S重组腺病毒和rAdC68XY3-S1重组腺病毒的免疫效果。rAdC68XY3-S1重组腺病毒的制备方法参照实施例1进行,其中,将经过人源密码子优化后获得的S1基因片段作为rAdC68XY3-S1重组腺病毒的靶基因,S1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示,S1基因片段能够编码产生SARS-CoV-2的S蛋白的S1亚基。
本实验例的试验动物为C57BL/6小鼠,试验小鼠经检验检疫后分为五组,每组的具体情况详见下表7:
表7实验例4中分组情况一览表
按照表7中的给药剂量和给药方式对各个组的试验小鼠进行免疫,在第二剂免疫之后的第27天,对各个组的试验小鼠进行采血,并检测血清中的S蛋白特异性IgG抗体滴度、S1蛋白RBD特异性IgG抗体滴度、S蛋白特异性IgA抗体滴度以及S1蛋白RBD特异性IgA抗体滴度,实验结果如图17至图20所示。由图17至图20可知,无论是滴鼻给药方式还是肌肉注射给药方式,rAdC68XY3-S重组腺病毒诱导机体产生的免疫水平均高于rAdC68XY3-S1重组腺病毒,并且rAdC68XY3-S重组腺病毒采用滴鼻给药方式能够诱导粘 膜免疫,而rAdC68XY3-S1重组腺病毒无论是滴鼻给药方式还是肌肉注射给药方式均不能诱导机体产生高水平的粘膜免疫。
实验例5
本实验例旨在比较rAdC68XY3-GFP重组腺病毒和rAdC68XY3-PreS重组腺病毒对于SARS-CoV-2病毒感染的保护力。
选取51只生理状态相似的仓鼠进行攻毒实验,试验仓鼠经检验检疫后分为五组,每组的具体情况详见下表8:
表8实验例5中分组情况一览表
按照表8中的给药剂量和给药方式对各个组的试验仓鼠进行免疫,在第二剂免疫之后的第14天进行攻毒实验,对各个实验组的试验仓鼠别接种10
5pfu TCID50剂量的SARS-CoV-2病毒,观察各个实验组的试验仓鼠的生存情况,并且在攻毒实验的第1天、第27天以及第41天采血以检测血清中S蛋白结合抗体滴度(如图21所示,以NIBSC阳性血清作为阳性对照)、S1蛋白RBD结合抗体滴度(如图22所示,以NIBSC阳性血清作为阳性对照)和中和抗体滴度(如图23所示),并在攻毒实验的第3天和第7天检测各个实验组的试验仓鼠的肺部病毒载量(如图24和图25所示),攻毒实验的第42天和第49天的病理评分结果如图26所示。
由图21至图26可知,rAdC68XY3-PreS重组腺病毒在仓鼠攻毒模型上显示有较强的保护力,说明rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的保护力理想。在攻毒实验的第41天,无论是经低剂量的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒免疫的试验仓鼠,还是经高剂量的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒免疫的试验仓鼠,体内均可以检测到高水平的S蛋白结合抗体滴度、S1 RBD蛋白结合抗体滴度和中和抗体滴度;在攻毒后的第7天,无论是经低剂量的rAdC68XY3-PreS 重组腺病毒免疫的试验仓鼠,还是经高剂量的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒免疫的试验仓鼠,肺部病毒载量较低;在攻毒后的第3天和第7天,无论是经低剂量的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒免疫的试验仓鼠,还是经高剂量的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒免疫的试验仓鼠,病理评分结果均较低,说明有较好的保护力。
实验例6
本实验例旨在比较比较rAdC68XY3-GFP重组腺病毒、rAdC68XY3-PreS重组腺病毒、rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒以及rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒的免疫效果。
本实验例的试验动物为C57BL/6小鼠,试验小鼠经检验检疫后分为四组,每组的具体情况详见下表9:
表9实验例6中分组情况一览表
按照表9中的给药剂量和给药方式对各个组的试验小鼠进行免疫,在免疫的第0天和第42天采血,测定血清中S蛋白特异性IgG抗体滴度和S1蛋白RBD特异性IgG抗体滴度,其中,对于第42天的血样,实验1组的小鼠血清起始稀释倍数为100倍,实验2组至实验5组的小鼠血清起始稀释倍数为1600,实验结果详见下表10和表11:
表10各组小鼠血清中S蛋白特异性IgG抗体滴度水平一览表
由表10可知,rAdC68XY3-PreS重组腺病毒、rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒和rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒均能够诱导试验小鼠产生S蛋白特异性IgG抗体,并且rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒诱导试验小鼠产生S蛋白特异性IgG抗体滴度的水平均高于rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒。
表11各组小鼠血清中RBD特异性IgG抗体滴度水平一览表
由表11可知,rAdC68XY3-PreS重组腺病毒、rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒和rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒均能够诱导试验小鼠产生S1蛋白特异性IgG抗体,并且rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒诱导试验小鼠产生S1蛋白RBD特异性IgG抗体滴度的水平均高于rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒。
采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)分别检测实验1组至实验5组中试验小鼠的第42天血清中IFN-γ和IL-4水平,每组设置四个检测平行样,四个平行样的来源是:每组有8只试验小鼠,依序将每两只试验小鼠的第42天血清混合形成一个平行样,以实验1组为例,将1号小鼠和2号小鼠的第42天血清混合形成1号样,将3号小鼠和4号小鼠第42天血清的混合形成2号样,将5号小鼠和6号小鼠的第42天血清混合形成3号样,将7号小鼠和8号小鼠的第42天血清混合形成4号样。此外,阳性对照(刺激物为PMA)、阴性对照(未经免疫的阴性小鼠血清)和空白对照(pH7.4的碳酸盐缓冲液)分别设置两个平行样,其中,pH7.4的碳酸盐缓冲液的配置方法为:称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g和磷酸二氢钾0.24g,加超纯水溶解并稀释至1000mL,实验结果详见下表12至表15:
表12 ELISPOT IFN-γ检测(刺激物为S蛋白)结果一览表
组别 | 1号样斑点数 | 2号样斑点数 | 3号样斑点数 | 4号样斑点数 |
实验1组 | 8 | 5 | N/A | N/A |
实验2组 | 382 | 382 | 369 | 438 |
实验3组 | 77 | 94 | 189 | 96 |
实验4组 | 558 | 301 | 890 | 442 |
阴性对照组 | 1483 | 1453 | / | / |
阳性对照组 | 0 | 0 | / | / |
空白对照组 | 1 | 0 | / | / |
由表12可知,在S蛋白的刺激下,经滴鼻给药rAdC68XY3-PreS重组腺病毒免疫的试验小鼠和经滴鼻给药rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒免疫的试验小鼠体内均能产生高水平的IFN-γ,并且诱导产生IFN-γ的水平均高于经滴鼻给药rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒免疫的试验小鼠。
表13 ELISPOT IFN-γ检测结果一览表二
由表13可知,在多种不同的免疫原刺激下,经rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒免疫的试验小鼠和经rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒的试验小鼠体内均能诱导产生IFN-γ。
表14 ELISPOT IL-4检测(刺激物为S蛋白)结果一览表
组别 | 1号样斑点数 | 2号样斑点数 | 3号样斑点数 | 4号样斑点数 |
实验1组 | 54 | 51 | N/A | N/A |
实验2组 | 82 | 94 | 96 | 85 |
实验3组 | 63 | 56 | 92 | 69 |
实验4组 | 54 | 77 | 106 | 140 |
阴性对照组 | 299 | 292 | / | / |
阳性对照组 | 20 | 21 | / | / |
空白对照组 | 15 | 21 | / | / |
由表14可知,在S蛋白的刺激下,经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒免疫的试验小鼠、经rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒免疫的试验小鼠以及经rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒免疫的试验小鼠体内均能诱导产生IL-4,并且差异不明显。
表15 ELISPOT IL-4检测结果一览表二
由表15可知,在多种不同的免疫原刺激下,经rAdC68XY3-VLP1重组腺病毒免疫的试验小鼠和经rAdC68XY3-VLP2重组腺病毒的试验小鼠体内均能诱导产生IL-4。
以上对本申请所提供的一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用,进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想;本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
Claims (20)
- 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原,其中,所述免疫原包括PreS蛋白或SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白中的至少一者;或者,所述免疫原包括多种蛋白,所述多种蛋白包括:所述PreS蛋白、所述全长S蛋白或SARS-CoV-2病毒的S1蛋白RBD结构域中的至少一者,以及下述蛋白(a)至蛋白(e)中的至少一者:(a)SARS-CoV-2病毒的M蛋白,所述M蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列;(b)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的M蛋白,所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列;(c)SARS-CoV-2病毒的E蛋白,所述E蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列;(d)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的E蛋白,所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列;其中,,所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列,所述S1蛋白RBD结构域的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列,所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述的免疫原,其中,所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白包括SARS-CoV-2病毒的E蛋白、柔性连接肽以及SARS-CoV-2病毒的N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位,所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述E蛋白的N端或C端;和/或所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白包括SARS-CoV-2病毒的M蛋白、柔性连接肽以及所述N蛋白中诱导T细胞免疫的抗原表位,所述抗原表位通过所述柔性连接肽连接于所述M蛋白的N端或C端。
- 根据权利要求2所述的免疫原,其中,所述柔性连接肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。
- 一种核酸分子,其中,所述核酸分子包括编码PreS蛋白的核苷酸序列或编码SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列中的至少一者;或者,所述核酸分子包括编码PreS蛋白的核苷酸序列、编码SARS-CoV-2病毒的S蛋白的RBD结构域的核苷酸序列或编码SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列中的至少一者,以及下述核苷酸序列(A)至核苷酸序列(D)中的至少一者:(A)编码SARS-CoV-2病毒的M蛋白的核苷酸序列;(B)编码SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的M蛋白的核苷酸序列;(C)编码SARS-CoV-2病毒的E蛋白的核苷酸序列;(D)编码SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的E蛋白的核苷酸序列。
- 根据权利要求4所述的核酸分子,其中,当所述核酸分子包括编码多种蛋白的核苷酸序列时,所述编码多种蛋白的核苷酸序列为串联的重组基因片段,或者所述编码多种蛋白的核苷酸序列包括编码所述多种蛋白中任一蛋白的核苷酸序列。
- 一种表达载体,其中,包括:载体,以及如权利要求4中所述的核酸分子。
- 根据权利要求6所述的表达载体,其中,所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒。
- 根据权利要求7所述的表达载体,其中,所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3 编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒。
- 一种重组腺病毒,其中,所述重组腺病毒是将如权利要求6至8任一项中所述的表达载体转染腺病毒包装细胞,然后进行细胞培养获得的。
- 根据权利要求9所述的重组腺病毒,其中,所述重组腺病毒的制备方法包括如下步骤:构建重组穿梭载体,所述重组穿梭载体装载有如权利要求4所述的核酸分子;对所述重组穿梭载体进行双酶切,回收目的基因片段,所述目的基因片段包括如权利要求4所述的核酸分子;制备腺病毒载体骨架;将所述目的基因片段与所述腺病毒载体骨架连接,获得表达载体;对所述表达载体进行线性化处理;以及将线性化处理后的所述表达载体转染腺病毒包装细胞,然后进行细胞培养,获得所述重组腺病毒。
- 根据权利要求10所述的重组腺病毒,其中,用于构建所述重组腺病毒的穿梭质粒选自pShuttle-CMV质粒;所述腺病毒载体骨架选自删除E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒,或者所述腺病毒载体骨架选自删除E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒;所述腺病毒包装细胞选自HEK293A细胞。
- 一种SARS-CoV-2病毒样颗粒,其中,由多种蛋白装配形成,所述多种蛋白包括:PreS蛋白、SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白或SARS-CoV-2病毒的S1蛋白RBD结构域中的至少一者,以及下述蛋白(a)至蛋白(e)中的至少一者:(a)SARS-CoV-2病毒的M蛋白,所述M蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列;(b)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的M蛋白,所述N蛋白抗原表位融合的M蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列;(c)SARS-CoV-2病毒的E蛋白,所述E蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列;(d)SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原表位融合的E蛋白,所述N蛋白抗原表位融合的E蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列;其中,所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列,所述S1蛋白RBD结构域的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列,所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求12所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒,其中,所述SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法包括:经表达系统表达所述多种蛋白,装配形成所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒。
- 根据权利要求13所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒,其中,所述制备方法包括如下步骤:将编码所述多种蛋白中各种蛋白的核苷酸序列通过接头序列连接,获得串联的基因重组片段;将所述串联的基因重组片段经表达系统表达,获得所述多种蛋白;以及所述多种蛋白装配形成所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒。
- 根据权利要求14所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒,其中,编码所述多种蛋白中任一种蛋白的核苷酸序列分别处于独立的表达框,或者编码所述多种蛋白中至少两种蛋白的核 苷酸序列串联至同一个表达框。
- 根据权利要求13所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒,其中,所述多种蛋白中任一种蛋白独立地表达,所述制备方法包括如下步骤:制备多个表达载体,各个所述表达载体分别装载有编码所述多种蛋白中任一种蛋白的核苷酸序列;将所述多个表达载体导入同一个表达系统表达,获得所述多种蛋白;以及所述多种蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。
- 根据权利要求13所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒,其中,所述多种蛋白包括至少一种融合蛋白和一种非融合蛋白,所述融合蛋白包括至少两种不同的蛋白,编码所述融合蛋白的核苷酸序列和编码所述非融合蛋白的核苷酸序列彼此独立地装载于不同的表达载体,所述制备方法包括如下步骤:制备第一表达载体,所述第一表达载体装载有编码所述融合蛋白的核苷酸序列,其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列是将编码所述融合蛋白中各种蛋白的核苷酸序列通过接头序列连接,获得的串联的基因重组片段;制备第二表达载体,所述第二表达载体装载有编码非融合蛋白的核苷酸序列;将所述第一表达载体和所述第二表达载体导入同一个表达系统表达,获得所述多种蛋白;以及所述多种蛋白自行装配形成所述SARS-CoV-2病毒样颗粒。
- 一种药物组合物,其中,包括如权利要求1至3任一项中所述的免疫原、或如权利要求4或5所述的核酸分子、或如权利要求6至8任一项中所述的表达载体、或如权利要求9至11任一项中所述的重组腺病毒、或如权利要求12至17任一项中所述的SARS-CoV-2病毒样颗粒。
- 根据权利要求18所述的药物组合物,其中,所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料;所述药物组合物为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型,适用于粘膜施用的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂或喷雾剂中的至少一种;适用于肌内或皮下施用的剂型为注射剂。
- 一种免疫方法,其中,将有效量的如权利要求18或19所述的药物组合物以鼻喷给药、滴鼻给药、气溶胶吸入式给药、肌肉注射、皮下注射或口服给药的方式中的至少一种给药于受试者。
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