JPH06511392A

JPH06511392A - 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン

Info

Publication number: JPH06511392A
Application number: JP6504958A
Authority: JP
Inventors: ソンデルミーエル，パウラス・ヤコブス・アントニウス; ウイレムス，マルシア・ヤコバ
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1993-07-23
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2019-05-24
Also published as: DE69332480T2; ATE227775T1; ES2187508T3; DK0606452T3; WO1994003621A1; PT606452E; EP0606452A1; DE69332480D1; JP3529134B2; AU4702293A; US6521236B1; EP0606452B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えネコヘルペスウィルスのベクターワクチン本発明は、ネコヘルペスウィルス（ＦＨＶ）ゲノムの１セクシヨンに突然変異を含むＦＨＶ突然変異体、ＦＨＶゲノムの前記セクションを含む核酸配列、前記セクションから誘導されるＤＮＡを両端に有する異種ＤＮＡ配列を含む核酸配列、このような核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子、ＦＨＶ突然変異体に感染した細胞培養物及びＦＨＶ突然変異体を含むワクチンに係る。

ネコの疾患における主要な臨床問題の１つは気道感染に結び付けられる。これらの症例の大部分はネコヘルペスウィルス１　（ＦＨＶ）又はネコカリチウイルスに起因する。

ＦＨＶはネコにおけるネコウィルス性鼻気管炎の原因剤である。子ネコではＦＨＶ感染は全身化し、致死率は５０％に達し得る。この疾患は一般的であり、世界中に認められ、くしゃみ、抑犠及び目鼻からの粘液分泌により特徴付けられる。

ＦＨＶはヘルペスウィルス科、アルファヘルペスウィルス亜科の１員である。ゲノムは長さ約１２６ｋｂであり、約９９ｋｂのユニークな長（ＵＬ）領域と、約８ｋｂの倒置反復配列を両端に有する約９ｋｂのユニークな短（Ｕ、）領域からなる２７ｋｂの短領域とから構成される（Ｇｒａｉｌら、　Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、１１６．　２０９−２２０、１９９１）。

ＦＨＶ感染の有病率及び重度性により、生又は殺した修飾ＦＨＶを含むネコウィルス性鼻気管炎ワクチンが開発され、その結果、疾患発生率は低下するようになった。

ＦＨＶ感染以外に、ネコはネコ白血病ウィルス、ネコカリチウイルス、ネコ免疫不全症ウィルス、ネココロナウィルス及びネコクラミジアのような種々の他の病原体による感染も受ける。

現在では、一般にこれらの病原性微生物によるネコの感染は生ワクチン又は不活化ワクチンで防御することができる。

しかしながら、この種のワクチンには多数の欠点がある。

弱毒生ワクチンを使用すると、弱毒化の不十分な病原性微生物を動物に接種する危険が常に伴う。更に、弱毒病原体はビルレント状態に戻り、接種動物が発病し、病原体が他の動物に広がる恐れがある。

不活化ワクチンは一般に低レベルの免疫しか誘導しないので、繰り返し免疫感作することが必要である。更に、病原体の中和誘導抗原決定基が不活化処理により変化し、ワクチンの保護力価が低下する恐れがある。

更に、複数種の生ウイルスワクチンを組み合わせると、抗原成分の相互作用により、構成成分の１種以上の力価が低下するという問題がある。

更に、現在投与されている生弱毒又は不活化ＦＨＶワクチンでは、特定の動物がＦＨＶフィールドウィルスのキャリヤーであるのか、あるいは動物がワクチン接種されたのかを決定することができない。従って、ＦＨＶワクチンを接種した動物とフィールドウィルスに感染した動物とを区別し、ビルレントフィールドウイルスの拡散を減じるように適切な対策を講じることが重要である。感染宿主動物中で抗体の産生を通常もたらすＦＨＶの非必須（糖）タンパク質をコードする遺伝子に突然変異を導入することにより、例えば血清学的に識別可能なマーカーを導入することができる。

本発明の目的は、ネコウィルス性鼻気管炎に対するワクチンの製造用としてのみならず、ネコの他の感染性疾患に対するワクチンの製造用としても使用可能なＦＨＶ突然変異体を提供することであり、該変異体は生きた弱毒病原体をワクチンとして使用した場合に予想される潜在的危険を解消し、必ずしもアジュバントを必要とせずに体液免疫系と細胞免疫系のいずれをも有効に刺激し、種々の抗原成分の不利な相互干渉の危険なしに多価ワクチンを実現可能にする。

本発明の別の目的は、フィールド株又は他のＦＨＶワクチンウィルスから区別可能なＦＨＶワクチンウィルスを提供することである。

本発明は、図１に主に定義する制限酵素地図を有するＦＨＶゲノムのＤＮＡフラグメントの内側に位置するオープンリーディングフレーム−１の上流非コーディング領域からオーブンリーディングフレーム−６の下流非コーディング領域に及ぶＦＨＶゲノムのセクションに突然変異を含むＦＨＶ突然変異体を提供する。

突然変異とは、親ＦＨＶのゲノムの上記セクションに存在する遺伝情報に対してこのセクションにおける遺伝情報が変化していることを意味する。

突然変異は特に、配列番号２〜７に示す１種以上の抗原性もしくは機能性ポリペプチドを産生ずることができないＦＨＶ突然変異体又は挿入異種核酸配列を含むＦＨＶ突然変異体をもたらす核酸置換、欠失、挿入もしくは逆位又はその組み合わせである。

本発明のＦＨＶ突然変異体は任意のＦＨＶ株から誘導することができ、例えばＧ２６２０株（オランダ国、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂ、Ｖ、の市販品）　、Ｃ−２７（ＡＴＣＣＶＲ−６３６）　、ＦＶＲｍ（ＡＴＣＣＶＲ−８１４）　、ＦＶＲｍワクチン（ＡＴＣＣＶＲ−８１５）又はＦ２から誘導することができる。

本明細書中で使用する「ポリペプチド」なる用語はアミノ酸の分子鎖を意味し、産物の特定長ではな（、所望により、例えばグリコジル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によってｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ修飾され得る。即ち、特にペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。

本発明の有用なＦＨＶ突然変異体の必要条件は、突然変異がゲノムＦＨＶ配列の許容位置又は領域、即ち感染や複製に必要なＦＨＶの必須機能を損なうことな（突然変異の組み込みに使用可能な位置又は領域に導入されることである。

ＦＨＶゲノム中の遺伝子の位置については従来はとんど１９９１）はＦＨＶゲノムの物理的地図を開示した。

Ｎｕｎｂｅｒｇら（Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６３゜３２４０−３２４９．　１９８９）及びＣｏ１ｅら（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６４．　４９３０−４９３８．　１９９０）はチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を同定し、この遺伝子をＦＨＶゲノムの５ａｌＩ−Ａ制限フラグメント（Ｒｏｔａら、前出）中にマツピングした。その後、ＦＨＶ　ＴＫ遺伝子にＦｅＬＶ　ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子を挿入した数種の組換えＦＨＶ株が構築された。

本発明で言及するＦＨＶゲノムのセクションは、ＦＨＶゲノムでは従来同定されていない。驚くべきことに、この領域ではＦＨＶの必須機能を損なわずに異種ＤＮＡの組み込みなどの突然変異が可能であることが判明した。

本発明のＦＨＶ突然変異体を作成するべ（１以上の突然変異を導入するために使用されるＦＨＶゲノムのセクションは、ゲノムＦＨＶ　ＤＮＡを酵素５ａｕ３Ａで部分消化することにより生成される１３．５ｋｂ制限フラグメント内に位置する（図１）。

前記フラグメントを制限酵素マツピングにより詳細に分析すると、Ｇｒａｉｌら（前出）の地図上の地図単位０゜８７〜０．９６のウィルスゲノムのＵＳセグメント内の１領域にほぼ対応する。

１以上の突然変異を導入するために本発明で使用するＦＨＶゲノムのセクションは１．９及び５．２ｋｂの２つの隣接するＢａｍＨＩフラグメント内に位置し、長さ約６゜ｌｋｂであり、６個の連続するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列と、これらのオープンリーディングフレームの両端の遺伝子間配列とがらなり、該遺伝子間配列は０ＲＦ−１の上流非コーディング配列及び０ＲＦ−６の下流の非コーディング配列を含む。

これらのフランキング遺伝子間配列はＯＲＦもしくはタンパク質コーディングＤＮＡ配列の一部を形成せず、又はウィルスの複製を調節する配列を含まない。該フランキング配列は最近像のオープンリーディングフレームの始点又は終点まで上流及び下流方向に伸びている。

特に、本発明は配列番号２〜７に示すポリペプチドをコードする０ＲＦ１〜６のＤＮＡ配列とその遺伝子間フランキング配列とを含む領域、より好ましくは配列番号１に示すＤＮＡ配列を含む領域に及ぶＦＨＶゲノムのセクションに突然変異を含むＦＨＶ突然変異体を提供する。

０ＲＦ−１はヌクレオチド位置１２７〜１２８１　（配列番号１）に位置するオープンリーディングフレームであり、３８４アミノ酸（配列番号２）のポリペプチドをコードし、β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の挿入に使用されるヌクレオチド位１１２１０にユニークなりｇ１１１部位を含み、従って、０ＲＦ−１によりコードされる仮想ポリペプチドは細胞の感染又はウィルスの複製のための必須機能をもたない。

ＯＲＦ〜２はヌクレオチド位置１４６０からヌクレオチド位置３０５８　（配列番号１）まで伸びており、５３２アミノ酸（配列番号３）のポリペプチドをコードする。β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を同様にこのＯＲＦのＥｃｏＲＶ部位の１つに挿入した。

０ＲＦ−３は小さいオープンリーディングフレームであり、０ＲＦ−２以外の相で同定され、０ＲＦ−２と共通のヌクレオチド配列を共有する。０ＲＦ−３はヌクレオチド位置３０５５〜３３５７　（配列番号１）に位置し、１００アミノ酸（配列番号４）のポリペプチドをコードする。β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の挿入のために５ｐｅ１部位を選択した。

０ＲＦ−４はヌクレオチド位置３５０５からヌクレオチド位置３９６３　（配列番号１）まで伸びており、１５２アミノ酸（配列番号５）のポリペプチドをコードする。

０ＲＦ−５及び０ＲＦ−６はいずれも内部反復配列に向かって逆方向に翻訳される。０ＲＦ−５はヌクレオチド位置４２５６〜４８９７に位置し、２１３アミノ酸（配列番号１に相補的な配列番号６）のポリペプチドをコードするする。０ＲＦ−６はヌクレオチド位置５１３８〜６１４２に位置し、３３４アミノ酸（配列番号１に相補的な配列番号７）のポリペプチドをコードする。

生存可能なウィルスをもたらす異種β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を組み込むための挿入部位として５７３７位（配列番号１．０ＲＦ−６）の５ａｕ３Ａ部位も使用され、従ってこの領域はウィルス感染及び複製に必須ではない。

特に、本発明のＦＨＶ突然変異体を得るためにＦＨＶに導入される突然変異は上記に定義したような１以上のオープンリーディングフレーム、好ましくは０ＲＦ −１，０ＲＦ−２，０ＲＦ−３及び／又は０ＲＦ−６の内側に導入される。

０ＲＦ−１に突然変異を導入すると、ＦＨＶ突然変異体の保護特性をさほど悪化させずに生きたＦＨＶ突然変異体のビルレンスを著しく低下できることが予想外にも判明した。この知見の結果、例えば上記に定義したような領域１こ欠失又は挿入を導入することにより、ワクチン接種すべき動物に目鼻経路であっても生形態で安全に投与し得る弱毒化ＦＨＶ突然変異体を得ることが可能になった。

ＦＨＶゲノムのＤＮＡ配列には個々のＦＨＶウィルス間に自然の変異が存在し得ることが理解されよう。これらの変異は１以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、逆位又は付加をもたらし得る。これらのＦＨＶ変異体は、本明細書中に開示するＯＲＦとは異なる対応するＯＲＦをコードし得る。このような変異ＯＲＦのＤＮＡ配列は、配列番号１のＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションや、当該ＯＲＦを含む類似領域を位置決定するように物理的地図を比較するなど数種の方法により位置決定され得る。従って本発明は、上記に定義したような突然変異を導入することが可能であり且つ任意のＦＨＶ株から取得可能なＦＨＶゲノムのセクションを提供する。

更に、遺伝子工学技術を使用して上記変異を誘導し、その結果として上記セクションのＤＮＡ配列に関連するＤＮＡ配列を得ることも可能である。当然のことながら、このような関連ＤＮＡ配列により特徴付けられるＦＨＶゲノムの前記セクションに組み込まれた突然変異を含むＦＨＶ突然変異体も本発明の範囲内に含まれる。

本発明の好適態様によると、突然変異がＦＨＶゲノムへの異種ＤＮＡ配列の挿入からなるＦ　ＨＶ突然変異体が提供される。

ＦＨＶゲノムに組込まれる異種ＤＮＡ配列は、タープ・ノドＯＲＦによりコードされるポリペプチドと異なるポリペプチドをコードするか又は非コーディングＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列であり、上記ＯＲＦからの遺伝子産物の発現を妨げるのに適切なオリゴヌクレオチドを含む任意の源（例えばウィルス、真核生物、原核生物又は合成源）力）ら誘導され得る。

このような適切なオリゴヌクレオチドは、第２の異種ＤＮＡ配列の挿入に有用な１以上の適切な制限酵素開裂部位以外に、可能な読み枠の各々で両方向に３個の翻訳停止コドンを含み得る。

特に、異種ＤＮＡ配列は保護免疫応答を誘発することカベ可能なネコ種の重要な病原体の抗原をコードし、該抗原１ま宿主細胞中で複製後に本発明のＦＨＶ突然突然変異二番り発現される。

好ましくは、本明細書中に開示するＦＨＶゲノムのセクションに組み込むＤＮＡ配列としては、ネコ白血病ウィルス、ネコ免疫不全症ウィルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボウイルス、ネココロナウィルス及びネコクラミジアの抗原をコードするＤＮＡ配列が予想される。

更に、医薬又は診断用ポリペプチド、特に例えばリンフ才力イン、インターフェロン又はサイトカインのような免疫調節剤をコードする核酸配列を前記セクションに組み込んでもよい。

更に、本明細書中に開示するオープンリーディングフレームは必須機能を示さないので、これらの領域の１以上を部分的又は完全に欠失させて夫々のオープンリーディングフレームの抗原性又は機能性遺伝子産物を発現させな０ようにし、所望によりその後、異種ＤＮＡ配列を欠失部位１こ組み込んでもよい。

本発明のＦＨＶ突然変異体により異種ＤＮＡ配列を発現させるための必須条件は、異種ＤＮＡ配列に適切なプロモーターが作動的に結合していることである。当業者に自明の通り、プロモーターは、ＦＨＶ突然変異体に感染した細胞中に遺伝子転写を誘導し得る任意の真核生物、原核生物又はウィルスプロモーターから選択することができ、例えばレトロウィルスＬＴＲのプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９．　６７７７−６７８１．　１９８２）、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９．１４２２−１４２７．　１９８０）又はサイトメガロウィルスタンパク質合成前プロモーター（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら、　Ｃｅ１ｌ　土１．　５２１−５３０、１９８５）から選択することができる。

ＦＨＶゲノムに異種ＤＮＡ配列を導入するためには１ｎｖｉｖｏ相同組換え技術を使用することができる。このためには、まずＦＨＶゲノムＤＮＡとの組換えのための組換えＤＮＡ分子を構築する。このような分子は任意の適切なプラスミド、コスミド又はファージ、最適にはプラスミドから誘導され得、所望によりプロモーターと作動的に結合した異種ＤＮＡ配列を含む。本明細書中に定義するようなＦＨＶゲノムの非必須セクションの全部又は一部を含むゲノムＦＨＶ　ＤＮＡのフラグメントに前記ＤＮＡ配列及びプロモーターを導入し、組換えＤＮＡ分子にサブクローニングする。

る酵素活性を検出するか又は組換えＦＨＶにより免疫学的異種ＤＮＡ配列の両端のこれらの所謂挿入領域配列は、ＦＨＶウィルスゲノムとｉｎ　ｖｔｖｏ相同組換えが可能なように、例えば５０〜３０００ｂｐの適当な長さを有するべきである。所望であれば、同−又は異なる病原体に由来し且つ本明細書中に定義するＦＨＶの挿入領域配列を両端に有する２種以上の異なる異種ＤＮＡ配列を含む構築物を作成してもよい。このような組換えＤＮＡ分子を利用して２種以上の異なる抗原性ポリペプチドを発現する組換えＦＨＶを製造し、多価ワクチンを提供することができる。

第２に、適切なＦＨＶ配列を両端に有する異種ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子の存在下で細胞（例えばネコ腎細胞（ＣＲＦＫ）又はネコ胚細胞）をＦＨＶ　ＤＮＡでトランスフェクトし、組換えＤＮＡ分子中の挿入領域配列とＦＨＶゲノム中の挿入領域配列との間で組換えが行われるようにしてもよい。適切なフランキング挿入領域配列を両端に有する異種ＤＮＡ配列を含む核酸配列で感染細胞をトランスフェクトすることにより、組換えを誘導することもできる。その後、例えばハイブリダイゼーション、異種ＤＮＡ配列と共に同時組込みされた遺伝子によりコードされ適正に位置付けられた部位で１種以上の酵素で制限消化すに発現される抗原性異種ポリペプチドを検出することにより、細胞培養物中で産生された組換えウィルス子孫を伊１えば遺伝子型又は表現型により選択することができる。ネオマイシン、ゲンタマイシン又はミコフェノール酸のような化合物に対する耐性に基づいてポジティブに組換えウィルスを選択することもできる。選択した組換えＦＨＶを細胞培養物中で大規模に培養した後、組換えＦＨＶを含有する材料又は前記ＦＨＶにより発現された異種ポリペプチドを収集する。

本発明による欠失変異体が所望される場合（こ１′！、１ｎｖｉｖｏ相同組換え技術により上記ウィルスゲノムカ）らの領域を部分的又は完全に欠失させること力（できる。

まず、配列番号１に示したユニークな短配り１１の一部を含み且つ少な（とも１００個のヌクレオチドを両端に有するＤＮＡフラグメントを適当なプラスミドベクタ一にサブクローニングする。

上記領域に導入すべき欠失を上記プラスミド中（こ形成するには、オーブンリーディングフレーム内又（よその近傍番コる。残りのプラスミド分子を再環化すると、新規同定された領域内に存在するコーディング配列の少な（とも一部を欠失する誘導体が形成される。あるいは、オープンリーディングフレームの配列内に存在する制限部位内から出発する漸進的欠失を１又は２方向に導入してもよい。

この目的のためには、Ｂａ１ｌやエンドヌクレアーゼＩＩＩといった酵素を使用することができる。再環化されたプラスミド分子を大腸菌細胞に形質転換し、個々のコロニーを制限マツピングにより分析し、指定領域に導入された欠失の寸法を決定する。欠失の正確な位置付けは配列解析により得られる。定義された欠失を含むプラスミドをＦＨＶウィルスＤＮＡと共に培養ネコ細胞に同時トランスフェクトしてもよい。ｉｎ　ｖｉｖｏ組換え後、ウィルスゲノムの上記領域内の適正位置に欠失が導入される。ウィルス子孫中の組換え体は例えば、最初に欠失を導入した接合部に生成されるヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする１５〜２０塩基長の合成オリゴマーにより同定され得る。

本発明による生きたＦＨＶ突然変異体、特に特定病原体に由来する１種以上の異なる異種ポリペプチドを発現させる生きたＦＨＶは、動物、特に家畜及び家畜以外のネコ科及びイヌ材種にワクチン接種するために使用することができる。このような化ベクターワクチンの接種後、好ましくはＦＨＶ突然変異体は接種宿主内で複製され、ＦＨＶポリペプチドと共に異種ポリペプチドをｉｎ　ｖｉｖｏで発現する。接種宿主で発現されたポリペプチドはこうして、ＦＨＶと特定病原体の両方に対する免疫応答を誘発する。特定病原体に由来する異種ポリペプチドが感染防御免疫応答を刺激し得る場合、本発明のＦＨＶ突然変異体を接種した動物は、当該病原体による事後感染及びＦＨＶ感染に対して免疫性となる。即ち、本発明のＦＨＶゲノムの挿入領域に組み込まれた異種核酸配列はｉｎ　ｖｉｖｏで連続的に発現され得、病原体に対して確実で、安全で且つ長期的な免疫を提供する。

１種以上の異なる異種ポリペプチドを含有及び発現する本発明のＦ　ＨＶ突然変異体は、−価又は多価ワクチンとして機能し得る。

生ワクチンを製造するには、本発明の組換えＦＨＶ突然変異体をネコ起源の細胞培養物上で成長させる。組繊細胞培養液及び／又は細胞を収集することにより、こうして成長したウィルスを回収する。生ワクチンは懸濁液の形態で製造してもよいし、あるいは凍結乾燥してもよい。

ワクチンは、免疫学的有効量の組換えＦＨＶ以外に医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤も含有し得る。

本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤の例としては、安定剤（例えば５ＰＧＡ）、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアルブミンやカゼイン）、タンパク質含有物質（例えばウシ血清や脱脂乳）、及び緩衝液（例えばリン酸塩緩衝液）が挙げられる。

場合により、アジュバント活性を有する１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適切なアジュバントは、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油エマルジョン（例えばＢａｙｏｌ　Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ　５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥ溶解物などである。

有用な用量は年齢、体重、投与法及びワクチン接種が所望される病原体の型により異なる。適切な用量は、例えば約１０”　〜１０”ｐ　ｆ　ｕ／匹であり得る。

本発明のＦＨＶ突然変異体は不活化ワクチンの製造にも利用することができる。

動物に投与する場合、本発明によるＦＨＶ突然変異体は特に鼻腔内、皮肉、皮下又は筋肉的投与され得る。

本発明は更に、本発明のＦＨＶ突然変異体により発現される異種ポリペプチドを含むサブユニットワクチン、医薬製剤及び診断用製剤にも係る。このためには、異種ポリペプチドの発現を促進する条件下で前記ＦＨＶに感染した細胞を培養する。異種ポリペプチドをその後、所期用途に応じである種度まで常法により精製し、更に処理して免疫活性、治療活性又は診断活性を有する製剤を得る。

特定病原体に対する上記能動免疫感作は、健康な動物への感染防御処置として適用され得る。抗原性ポリペプチドをコードする特定病原体に由来する異種遺伝子を含む本発明のＦＨＶ突然変異体により誘発された抗体を含む抗血清を用いて、既に該特定病原体に感染した動物を治療できることは言うまでもない。本発明の組換えＦＨＶに対する抗血清は、適当な免疫応答を誘発するために有効な量の前記ＦＨＶ突然変異体で動物（例えばネコ）を免疫感作することにより製造され得る。その後、動物から採血して抗血清を製造することができる。

本発明の別の目的は、ＦＨＶ感染に対するネコ種の免疫感作用ワクチンの製造及び診断試験の準備に適用可能なＦＨＶポリペプチドをコードする核酸配列を提供することである。

このような核酸配列は、夫々配列番号２及び３に示すようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする０ＲＦ−１又は０ＲＦ−２の少なくとも一部を含むことを特徴とする。

好ましくは、核酸配列は夫々ヌクレオチド位置１２７〜１２８１及び１４６０〜３０５８　（配列番号１）に位置するヌクレオチド配列を有する０ＲＦ−１又は０ＲＦ−２のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む。

本発明の核酸配列は、天然では該配列が会合又は結合しない種々の複製実施ＤＮＡ配列と連結することができ、このようなりＮＡ配列は、場合によりβ−ガラクトシダーゼのような融合タンパク質配列をコードするＤＮＡの部分を含み、こうして適切な原核又は真核生物宿主の形質転換に使用可能な所謂組換えＤＮＡ分子を生成する。このようなハイブリッドＤＮＡ分子は好ましくは、例えばプラスミド又はバクテリオファージ、コスミドもしくはウィルス中に存在する核酸配列から誘導される。

一般に、本発明で有用なベクターを構築するのにＤＮＡ配列をクローニングするためには原核生物が好適である。

例えば、大腸菌に１２が特に有用である。例えばＤＨ５α又はＪＭＩＯＩのような他の大腸菌株も使用できる。

発現のためには、本発明の核酸配列を発現制御配列に作動的に連結する。このような制御配列はプロモーター、エンハンサ−、オペレーター及びリポソーム結合部位を含み得る。

本発明は更に、配列番号２及び３に夫々示すようなアミノ酸配列を有する０ＲＦ −１又は０ＲＦ−２によりコードされるポリペプチドの免疫学的特徴を示すポリペプチドを含み、即ち、該ポリペプチドは該ポリペプチドが通常会合する完全ウィルス又は他のタンパク質を本質的に含まない０ＲＦ−１又は０ＲＦ−２によりコードされるポリペプチドの１種以上の免疫反応性及び／又は抗原決定基を含む。

ＦＨＶ感染に対するネコの免疫感作は例えば、免疫学的に該当する範囲での本発明のポリペプチドを所謂サブユニットワクチンとして動物に投与することにより達せられる。

サブユニットワクチンの代わりに生ベクターワクチンを使用してもよい。本発明の核酸配列は、組換え微生物がなおも複製することができ、挿入核酸配列によりコードされるポリペプチドを発現できるように、組換えＤＮＡ技術により微生物（例えば細菌又はウィルス）に導入される。

上記ＯＲＦ　１又は２によりコードされるＦＨＶポリペプチドを使用して、ポリクローナル、単−特異性及びモノクローナルの抗体を製造することができる。本発明のポリペプチドに対する抗体又は抗血清は、受動免疫療法、診断イムノアッセイ及び抗イデイオタイプ抗体の製造に使用することができる。

本発明は更に、本発明のポリペプチドの少な（とも１種又はその抗原フラグメントを含む「免疫化学試薬」にも係「免疫化学試薬」なる用語は、本発明のポリペプチドが適切な支持体に結合されているか又は標識物質を備えて０ることを意味する。

実施例ＩＦＨＶゲノムのユニークな短配列における新規挿入領域の特徴付け。

−ＦＨＶ　ＤＮＡの調製及びλベクターＥＭＢＬ４におけるゲノムライブラリーの樹立。

トリプトース２．０ｇ／ｌ、ラクトアルブミン氷解物２゜５ｇ／ｌ及びウシ胎児血清５％を補充したグラスゴーの変形最少必須培地中で、Ｃｒａｎｄｅ　１１− Ｒｅｅｓネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞（Ｃｒａｎｄｅｌｌ、Ｒ，Ａ、ら。

Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　旦、　１７６−１８５．　１９７３）上でＦＨＶ−１のワクチン株（ネコ鼻気管炎ウィルス、６２６２０株としてオランダ、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂ、Ｖ、からの市販品）を成長させた。十分な細胞変性効果が生じた後に細胞上清を回収し、ポリエチレングリコール沈殿によりウィルスを濃縮した（Ｙａｍａｍｏ　ｔ　ｏ、に、Ｒ，ら、　Ｖｉｒｏｌｏｇ７４０、７３４−７４４．　１９７０）　。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０゜５％ＳＤＳを含有する緩衝液中で１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ。

米国）で３７℃で２時間消化することによりＤＮＡをウィルス粒子から遊離させた。フェノール／クロロホルム１：１混合物で繰り返し抽出後、核酸を２倍容量のエタノールで沈殿させ、ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解させた。酵素製造業者により推奨される条件に従ってウィルスＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ。

米国）で部分消化し、反応生成物を分取用０．８％アガロースゲル上で分離した。

１０〜１５ｋｂのサイズフラクションのフラグメントを単離し、ＢａｍＨＩ及び５ａｌＩで消化したバクテリオファージλＥＭＢＬ４からのＤＮＡと２時間１５ ℃で連結した（Ｋａｉｓｅｒ、に、及びＭｕｒｒａｙ、Ｎ、”ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ”、第１巻、第１章、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５）。反応生成物をｉｎ　ｖｔｔｒｏパッケージングしくＰｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ。

米国）、組換えファージを大腸菌宿主株ＬＥ３９２上にプレートした。５ａｌＩで消化したＦＨＶゲノムＤＮＡの分取用アガロースゲル電気泳動により単離した１０〜１５ｋｂ制限フラグメントから構成されるｓｔｐ標識ＤＮＡプローブでニトロセルロースレプリカフィルターをスクリーニングすることによりλＥＭＢＬ４中のライブラリーを集積し、ウィルスゲノムの比較的大きい５ａｌｔ制限フラグメント中に特異的に存在する配列を有するインサートを含む組換え体を得たく技術的詳細についてはＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ。

ら、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ１″、　第２章、　Ｃ。

Ｉｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９を参照されたい）。これらのスクリーニング手順から得た個々の組換え体を増幅し、λインサートＤＮＡの制限パターンを完全ＦＨＶゲノムの公知地図（Ｇｒａｉｌ　Ａ、ら、　Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、。

更に検討するために単離株の１つλＦＨＶＯ４を選択し、このクローンの１３．５ｋｂインサート（図１参照）を前出のＧｒａｉｌらの地図上の単位０．８７〜０．９６のウィルスゲノムのユニークな短セグメント中に位置付けした。

実施例２ＦＨＶのユニークな短ゲノムセグメントの制限部位におけるマーカー遺伝子の挿入。

λＦＨＶＯ４の４．８ｋｂ　５ａｃ１７ラグメントをｐＧＥＭ３Ｚｉ、：ｆブ））ロー＝ングし、ｐｉ；”ＨＶ１３　（図２Ａ参照）を形成した処、マーカー遺伝子の組み込みに適切な位置にユニークなりｇｌＩＩ制限部位があることが判明した。挿入に使用した遺伝子はｐｃＨｌｌｏ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、　スウェーデン）から、ＳＶ４０複製起点の近傍の７２ｂｐ　５ｐｈｌフラグメントを、ＢａｍＨＩ及び５ａｉｌの両方の認識配列と、ＤＮＡを５ｐｈｌで消化後に生成される末端に適合可能な一重鎖末端とを含む１２塩基二重鎖合成オリグヌクレオチドにより置換して誘導した。

ｐｃＨｌｌｏの２つのｓｐｈ　Ｉ制限部位の間にリンカ−を挿入すると、いずれの部位にもｓｐｈ　Ｉの認識配列は復元されず、ＳＶ４０初期プロモーターの上流にＢａｍＨＩ及び５ａｉｌ部位が生成される。次いでＢａｍＨＩで消化して４．０ｋｂβ−ガラクトシダーゼ発現カセットを生成し、ｐ　ＦＨＶ　１３のＢｇｌｌＩ部位に挿入してｐＦＨＶ１９を得た（図２Ｂ参照）。プラスミドｐＦＨＶ１９の線形化ＤＮＡをリン酸カルシウム媒介ＤＮＡ沈殿（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、　Ｌ、及びｖ、　ｄ、　Ｅｂ、　Ａ、Ｊ、　、　Ｖｉｒｏｌ。

ｇＹ　５２、　４５６−４６７、１９７３）によりウィルスＤＮＡと共にＣＲＦＫ細胞に導入した。ｐ　Ｆ　ＨＶ　１９からのＤＮＡＩμｇを最終容量３７６μ ｌのＨ２Ｏ中でＦＨＶ感染細胞からのＤＮＡ１５μｇと混合し、２ＸＨＢＳＰ　（１０ｍＭ　ＫＣｌ、　２８０ｍＭ　ＮａＣ１，１２ｍＭグルコース、１．５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，５０ｍＭＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，０’）５００μｌに加えた。ＩＭＣａＣＩ□溶液１２４μｌを漸次加え、混合物を室温で３０分間インキュベートすることにより沈殿を形成した。

培養培地５ｍｌ中にＣＲＦＫ細胞の半集密的単層を各々収容する２つのφ５ｃｍの皿に沈殿ＤＮＡの懸濁液を静かに加えた。５時間後、培地を除去し、１５％グリセロールを含有するＨＢＳＰ５ｍｌを細胞に重層した。１〜２分間インキュベーション後、溶液を除去し、細胞を培地で洗い、皿を培養培地中０．７５％アガロースの上層と共にインキュベートした。３〜４日後、細胞変性効果が現れ始めたら、最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌの基質Ｂｌｕｏｇａｌ　（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を含有する第２のアガロース上層を加え、青色のプラークが検出されるまでプレートをインキュベートした。陽性プラークを肉眼的に釣菌し、新鮮なＣＲＦＫ細胞を含むフラスコに移し、ウィルスを増幅した。組換えウィルスの均質なストックが樹立されるまでプレート培養手順及びプラーク単離を続けた。最終調製物からのウィルス材料を使用してサザンブロッティングによりウィルスゲノムを詳細に分析すると共に、動物ワクチン接種実験を行った。

ｐ　ＦＨＶ　１３中に存在するようなりｇｌ１１部位に挿入されたβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含む組換えＦＨＶは、ＣＲＦＫ細胞上の組織培養物中で連続継代後も安定的であることが判明した。

ＦＨＶゲノムのユニークな短セグメントにおいてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を挿入可能な第２の部位をλＦＨＶ０４の５．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメント中にマツピングした。ｐＧＥＭａＺ中にこのフラグメントを含むサブクローンをｐＦＨＶｌｏ　（図３Ａ参照）と命名し、４塩基認識配列を有しており且つ酵素Ｂｇｌｌｌ又はＢａｍＨＩにより生成される末端に適合可能な付着ＤＮＡ末端を生成する制限酵素５ａｕ３Ａで部分消化した。５ａｕ３Ａ制限消化物に臭化エチジウム１０μｇ　／　ｍ　ｌを加えることにより、線形化プラスミドＤＮＡがより小さいフラグメントに消化しないようにした。

ｐＦＨＶｌｏの全長７．９ｋｂの線形化ＤＮＡを精製し、上記ＢａｍＨＩβ−ガラクトシダーゼ発現カセットと連結し、ｐＦＨＶｌｏの３ａｕ３Ａ制限部位の１つにランダムに挿入されたマーカー遺伝子を含む組換え体（λＦＨ０４に由来する５、２ｋｂ　ＢａｍＨＩインサートの５ａｕ３Ａ部位の１つにマーカー遺伝子を含む組換え体を含む）を得た。

この実験から選択した候補の１つは、図３Ａに示す５ａｕ３Ａ部位に挿入されたマーカー遺伝子を含むことが判明した。

この構築物をｐＦＨＶ２３と命名し、このプラスミドのＤＮＡをｐ　ＦＨＶ　１９について上述したようにウィルスＤＮＡと共にＣＲＦＫ細胞にトランスフェクトした。

β−ガラクトシダーゼ活性を発現する組換えＦＨＶをトランスフェクション子孫から検出することができ、これらのＦＨＶを上記手順に従って均質精製した。従って、この場合も図３Ａに示す５ａｕ３Ａ部位に対応するＦＨＶゲノム中の位置にＤＮＡを挿入しても、ウィルス維持に必須の機能には支障ない。

配列番号１に示す完全配列から詳細な制限地図を作成し、該当するオープンリーディングフレームの正確な位置をその近傍に示した。この結果として得られるグラフ（図４）から明らかなように、０ＲＦ−２と０ＲＦ−３の両方の内側に正確に位置付けられた数個の制限部位が判明した。しかしながら、実施例２中で上述したβガラクトシダーゼ発現カセットは両端にＢａｍＨＩ部位を有するので、前記制限部位のいずれもマーカー遺伝子の挿入に直接使用することはできなかった。従って、まず下記修飾を導入する必要があった。以下の全操作にはプラスミドｐＦＨＶ１０　（図１及び３ａ参照）を選択した。第１段階では地図位置５１００と５３００の間の０．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント（図３ａ参照）を除去し、約７．７ｋｂの寸法を有する残りの部分を再環化し、領域のこの部分に最初に存在していたＢｇｌｌｌ及びＢａｍＨＩ部位の両方を除去した。

この欠失により、ただ１つのＢａｍＨ１部位を含み且つＢｇｌＩＩ部位を含まないプラスミドｐＦＨＶ４０が形成された。配列番号１により定義される領域の内側の適切な位置にＢｇｌＩＩ認識配列ＡＧＡＴＣＴを含む合成二重鎖リンカ−分子を挿入することにより、ｐＦＨＶ４０から誘導体を作成することができた。

夫々図５に示すように０ＲＦ−２及び０ＲＦ−３に挿入できるように、ＥｃｏＲＶ又は５ｐｅｌのいずれかの制限部位に基づいてこれらの位置の２つを選択した。即ち、実施例２中で５ａｕ３Ａについて上述した手順と同様に臭化エチジウムの存在下で、配列及び制限消化物中の複数位置で両方の酵素により切断し、分取用アガロースゲル電気泳動により精製可能な線形化全長プラスミドＤＮＡ分子の大部分を生成した。ＥｃｏＲＶの場合には平滑末端を有する合成りｇｌｌｌ−リンカ−を使用し、Ｓｐｅ　Ｉ消化ＤＮＡの場合にはＣＴＡＧ末端を含む合成りｇｌｌｌ−リンカ−を使用してＤＮＡを再環化した。

ｐＦＨＶ４０中の適正な位置にＢｇｌ１１部位が挿入されているか否かを制限分析により確認した。次に、実施例２中で上述したと同一の手順に従って、新たに生成されたＢｇｌ　Ｉ　Ｉ部位に、ＢａｍＨＩ部位を両端に有するβ−ガラクトシダーゼ発現カセットを挿入した。２．１ｋｂ（図４参照）に位置付けられるＥｃｏＲＶに置換するＢｇｌＩ■部位を生成した後に０ＲＦ−２にマーカー遺伝子を挿入し、図５ａに示すような制限地図を有するｐＦＨＶ５Ｑを得た。０ＲＦ− ３の場合には、約３．１ｋｂの５ｐｅＩ位に新たに生成されたＢｇｌＩＩ部位によりマーカー遺伝子を組み込んだ。

実施例２中で上述したように、ｐＦＨＶ５Ｑ及びｐＦＨＶ５５の両方のＤＮＡをウィルスＤＮＡと共にＣＲＦＫ細胞に同時トランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼ活性を発現する組換えＦ　ＨＶをＢ　ｌ　ｕｏｇａ　１染色により検出することができ、アガロース重層を使用して単一プラーク単離によりウィルスを回収した。組換えウィルスを細胞培養物中で数回継代培養した処、ｐ　Ｆ　ＨＶ　６０及びｐＦＨＶ５５に由来する構築物のいずれにも安定的に組み込まれたβ −ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を保持していることが判明した。

図１に示す５．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ及び４．３ｋｂＳａｃｌ制限フラグメントの該当部分でヌクレオチド配列解析を行った。

ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　３　Ｚ又はｐＳＰ７２　（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）のいずれかにλＦＨＶＯ４のフラグメントを両方向にサブクローニングした。

張り出した５°及び３′末端を生成する適切な制限酵素でプラスミドＤＮＡを二重消化後、酵素エキソヌクレアー３５１−３５９．　１９８４）を使用して漸進的欠失を導入した。張り出した一重鎖３゛末端の存在により、プラスミドベクターＤＮＡはエキソヌクレアーゼＩＩＩにより消化されなかった。反応混合物のサンプルを３０秒間隔で採取し、前出のＨｅｎ１ｋｏｆｆの方法に従って処理し、再環化したＤＮＡ分子を生成し、コンピテント大腸菌細胞に形質転換させた。個々のコロニーのミニ調製物からのプラスミドＤＮＡを、元のフラグメントに導入された欠失のサイズの制限マツピングにより分析した。Ｔ７ボリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用する鎖停止反応で二重鎖ＤＮＡ上のヌクレオチド配列決定により、漸進的欠失を含む候補群を分析した。

鎖伸長反応を特異的に開始させることにより、ヌクレオチド配列内の不完全又は曖昧な読み取り値を解析した。配列データをまとめ、Ｇｅｎｅ−Ｍａｓｔｅｒ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、米国）又は同等のソフトウェアを使用して解析した。全データをまとめた結果、配列番号２，３，４，５．６及び７に示すアミノ酸配列を有する夫々のポリペプチドをコードする６個のオープンリーディングフレームからなるＦＨＶゲノムのユニークな類セグメント内の約６．ｌｋｂ領域（配列番号１）が判明した。

６個のオーブンリーディングフレームとその両端の介在非翻訳ＤＮＡ配列とからなる約６．１ｋｂの領域は、感染及び複製に必要な必須ウィルス機能を失わせることなくＦＨＶのゲノムに外来遺伝子を挿入するために使用することができる。

特に、夫々ｐＦＨＶ１３及びｐＦＨＶｌｏにβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を挿入するために実施例２で使用したヌクレオチド位置１２１０のＢｇｌＩＩ制限部位と５７３７位の５ａｕ３Ａ部位とは、ウィルス感染又は複製に必須ではないＦＨＶゲノムの位置にマ１．ピングすることが判明した。

０ＲＦ−１（図１参照）のＣ０ＯＨ末端領域内に位置する１３ｇ１Ｉ！部位に挿入されたβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含む組換えＦＨＶ株Ｃ４−１− ４−１を、ネコワクチン接種後経過における評価のために選択し、親ＦＨＶ株Ｇ２６２０と比較した。病原性とビルレントＦＨＶ株による抗原投与感染により生じた臨床徴候に対するウィルスの防御能力とに基づき、新規ＦＨＶワクチン株としてのＣ４−１−４−１の力価を調べた。

特異的病原体を含まない１２週齢のネコに約１×１０１１Ｔ　ＣＩ　Ｄ　５ｏのＦＨＶ突然変異体又は親株を、片外鼻孔０゜３ｍｌ、口腔咽頭に０．４ｍｌ投与することによって目鼻感染させた。ＦＨＶ感染に特異的な臨床徴候について動物を２週間にわたって毎日観察し、表１に示すような基準に基づいて採点した。ワクチン接種から６週間後に１×１０５　ＴＣＩＤ、。のＦＨＶ株５ＧＥ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ、米国）を目鼻投与することによってネコに抗原投与し、ＦＨＶ感染の臨床徴候を２週間にわたって監視した。

ワクチン接種及び抗原投与後の臨床観察結果を表２に要約する。Ｃ４−１−４− １株を０鼻経路でワクチン接種した群１のネコは親株Ｇ２６２０を接種した群２の動物に比較して臨床徴候のスコアレベルが低かった。

抗原投与後では、ワクチン接種した群１のネコはワクチン接種しない群３の対照に比較して臨床スコアが更に著しく低かった。

従って、突然変異株Ｃ４−１−４−１はネコに口重投与した場合にビルレンスが低く、しかも抗原投与Ｆ　ＨＶ感染の臨床徴候に対して高レベルの防御を誘発し得る。

表１表２実施例５ＦＨＶのゲノムに異種遺伝子を挿入するための組換えプラスミドの構築。

ＦＨＶに外来遺伝子を挿入し、その後発現させるために使用する組換えプラスミドは、０ＲＦ−１（図１）中にマツピングされるヌクレオチド位置１２１０　（配列番号１）に位置するＢｇｌＩＩ制限部位に基づいて作成した。０ＲＦ−１の方向がプラスミドベクターのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの方向と同一になるように、λＦＨＶＯ４からの５．２ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＰ７２　（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉ　５ｃｏｎｓ　ｉｎ、米国）のＢｇ１１１部位でプラスミドにサブクローニングした。ヌクレオチド配列解析について実施例３に記載したと同様の手順に従って、酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用する単一方向欠失技術によりこの構築物ｐＦＨＶｌｌを処理した。

この結果、元の５．２ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントからの残りの０．４ｋｂと、はぼ中央に位置するユニークなりｇ１１１部位と、ウィルスゲノムとのｉｎ　ｖｉｖｏ組換えを可能にするために十分なフランキングＦＨＶゲノム配列とを有するむｐＦＨＶ２７が生成された。

ＦＨＶウィルスをゲノムに挿入した後に外来遺伝子の発現を誘導し得る強力なプロモーターをラウス肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ）のＬＴＲ配列から選択した。プロモーターはｐＲＳＶｃａｔ　（Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｍら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７９．　６７７７−６７８１、１９８２）からの５８０ｂｐ　Ｎｄｅｌ／ＨｉｎｄｌｌＩ制限フラグメント上にマツピングし、フラグメントの両側で二重鎖合成リンカ−によりｐＧＥＭ３ＺのＨｉ　ｎ　ｄ　１１１及びＰｓｔＩ部位間に挿入した。一方の部位でＨｉｎｄｌｌｌに適合可能な付着末端を含み且つ他方の部位でＮｄｅｌに適合可能な付着末端を含む３０ｂｐリンカ−を用いて、ベクターｐＧＥＭ３ＺからのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＬＴＲプロモーターを有するＲ３ＶフラグメントのＮｄｅ１部位とを連結した。しかしながら、連結後、両方の制限部位は６塩基対認識配列の外側のヌクレオチドにおける故意の修飾により復元されない。これらの２つの部位の除去以外に、リンカ− 自体の内側に存在する新しい制限部位（ＢａｍＨＩ）が対応位置に生成された。

ＬＴＲフラグメントからのＨｉｎｄｌＩＩ部位をｐＧＥＭ３ＺからのＰｓｔＩ部位に結合する第２の２０ｂｐリンカ−を合成し、この場合は末端のいずれの認識配列も破壊せずにｐＧＥＭ３Ｚのポリリンカー中に既に存在していた制限部位Ｂｇｌｌ！及びＸｈｏＩに適切な制限部位ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩを付加した。従って、合成された誘導体ｐＶＥＣ０１は、ＬＴＲプロモーター配列と外来遺伝子を挿入するために使用可能なその直後の多重制限部位とを有する６５０ｂｐ制限フラグメントを含む。６５０ｂｐフラグメントは両端にＢａｍＨＩ制限部位を有しており、ｐＦＨＶ２７中に存在するユニークなりｇｌＩＩ部位にそのまま転移させた。これらの２種の制限酵素により生成された付着末端は適合可能であるが、連結はＢｇｌｌＩ又はＢａｍＨＩの元の認識配列のいずれも復元しない。得られた構築物をｐＦＨＶ３８と命名し、制限マツピング（図６）により検討した。

このＦＨＶ組換えベクターの構造はＬＴＲプロモーターのすぐ下流に外来遺伝子を挿入し、その後、ｉｎ　ｖｉｖｏ組換えによりＦＨＶゲノムに完全な発現カセットを組み込むことが可能であった。ＬＴＲの下流の種々の制限部位、特に酵素Ｂｇｌｌｌ及び５ａｌＩの制限部位の位置は、多重遺伝子挿入をも可能なように設計する。

λＦＨｖ０４からの１３．５ｋｂ　ＤＮＡインサートの制限地図。このＤＮＡフラグメントの位置はＦＨＶゲノムのユニークな短領域の右側部分にマツピングされる。挿入領域は上部に示す６個のオーブンリーディングフレームと遺伝子間非翻訳配列から構成される。４．８ｋｂ　５ａｃＩ及び５．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントをｐＧＥＭ３Ｚにサブクローニングし、夫々ｐ　ＦＨＶ　１３及びｐＦＨＶＩＯを得た。配列分析の結果、最も左側のＥｃｏＲＩ制限部位は相互に５０ｂｐ内に位置付けられる２個の６塩基認識配列を含むことが判明した。

図２Ａ、λＦＨＶＯ４からの４．８ｋｂ　５ａｃｌを含むｐＧＥＭ３Ｚの誘導体であるプラスミドｐＦＨＶ１３の制限地図。ＤＮＡを挿入するために使用した３、１ｋｂのユニークなりｇｌＩＩを三角形で明示する。

Ｂ、β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含む４．Ｏｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントの挿入によりｐＦＨＶ１３から誘導されるプラスミドｐＦＨＶ１９の制限地図。

設置Ａ、λＦＨＶＯ４からの５．２ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントを含むｐＧＥＭ３Ｚの誘導体であるプラスミドｐＦＨ■１０の制限地図。三角形で明示した５ａｕ３Ａ部位をＤＮＡの挿入に使用した。

Ｂ、β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含む４．Ｏｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントの挿入によりｐＦＨＶｌｏから誘導されるプラスミドｐＦＨＶ２３の制限地図。

阻配列番号１に示す配列から誘導される詳細な制限地図。

６個のオーブンリーディングフレームの位置を上部に示す。

ウィルスＤＮＡをプラスミドｐＦＨＶ６０と共に同時トランスフェクトすることによりマーカー遺伝子を０ＲＦ−２に挿入するために２、ｌｋｂのＥｃｏＲＶ部位を使用した。

同様にマーカー遺伝子を０ＲＦ−３に挿入するために３゜１ｋｗのＳｐｅ　Ｉ部位を使用した。この場合には、プラスミドｐＦＨＶ５５を同時トランスフェクションに使用した。

図５いずれもｐＦＨＶ４０から誘導したｐＦＨＶ６０　（Ａ）及びｐＦＨＶ５５　（Ｂ）の制限地図。このプラスミドはｐＦＨＶＩＯから誘導し、両方の制限部位が連結後に復元されないように５．ｌｋｂ付近（図３Ａ）で０．２ｋｂＢａｍＨ１ −Ｂｇ　ｌ　Ｉ　Ｉフラグメントを欠失させた。

Ａ８図４に示すＥｃｏＲＶ部位に等価の位置にβ−ガラクトンダーゼ遺伝子を挿入したｐＦＨＶ４０の誘導体であるｐＦＨＶ５Ｑの制限地図。

８９図４に示すＳｐｅ　１部位に挿入することによりｐＦＨＶ４０から誘導しりｐ　Ｆ　ＨＶ　５５　（７）制限地図。０ＲＦ−３のコーディング配列はこの構築物では失われている。

図６ｐＦＨＶ３８の制限地図。ｉｎ　ｖｉｖＯ組換えベクターは制限部位（例えばＢｇｌｌＩ又は５ａｉｌ）でプロモーターの下流に挿入可能な外来遺伝子の発現に必要なＬＴＲプロモーターを含む。

配列番号：１配列の長さ：６１５４塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）起源：生物名：ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ−１）株名：Ｇ２６２０配列の特徴特徴を表わす記号：ＣＤＳ存在位置：１２７．．１２８１他の情報：　／ラベル＝ＯＲＦ−１配列の特徴特徴を表わす記号：　ＣＤＳ存在位置：１４６０．．３０５８他の情報：　／ラベル＝ＯＲＦ−２配列の特徴特徴を表わす記号：ＣＤＳＧＡＡＡＣＣＡＣＧＣＡＡＡＡＡＴＧＧＡ（：　ＡＣＣＡＧＡＣＡＧＡ　ＡＡＧＧＴＧＧＧＴＴ　ＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴ　入ＡＴＣ：ＴＣ入`ＴＣ１０２０ＴＧＧＡ丁ＧＧＡＧＴ　ＣＡ丁ＣＡＡＴＣＴＡ　ＣＡＴＴＴＴＴＴＧＴ　ＧＡＣＣＧＴＡＡＡＧ　ＧＣＡＡＡＡＣＡＴＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴb１９８０ＧＴｒＡＡＣＣ（：ＣＡ　ＧＣＡＣＣＧＧＴＴＣＡＣＴｒＡＡＴＡＡＣＡＣＣＡＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＣＡ’！？ｒＣＣＡＣＧＴ@２０４０ＡＣＡＣＧＣＴＣＣＴ　ＣＣＡＧＡＴＩ’ＡＣＡ　ＣＴＣＧＣにＴＡＧＴ　ＴＡＡＡＡＧＡＴＴＡ　ＡＡＧＴＣＴＡＴＴＴ　ＴＡＡＡＡＴＧ`ＣＣ３゜６０ＴＧＡＣＧＧＧＣＴＣＧＴＴＣＭＴＡＡＡ　ＣＡＴＡＧＣＡＴＡＣＧＴＴＡＴＧＡＣＡＴ　ＧＧＴＣＴＡＣＣＧＣＧＴＣＴＴＡＴＡＴＧ　４O２０ＧＧＧＡＣＧＡＴＴＧ　ＰｒＴＴＴＡＧＡＴＴＧ　ＧＧＴ’ｆＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＴＡ　ＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡ　ＣＡＧＧＧＧＡfＴＣ４０８０ＣＡＡＣＴＡＴＡＴＧ　ＧＴＣＣＧＴＧＡＴＴ　ＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡ　ＴＧＴＡＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＡＣＡ　ＧＧＧφπＧＧＧ　T０４０Ｔｏ！ＴＡＡＴ　ＡＡＡＴＣＴＡＴＴＧ　ＣＡＣＣＴＡＧＧＴＡ　ＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧ　ＧＡＡ丁ＣＡＧＧＡＧ　ＧＣＧＧＴＴＧＴＧＡ　T１０゜ＣＣＣＣＡＣＧＧＧＧ　ＴＣＧＣＡＧＴＣＴＡ　ＣＡＣＧＡＴＣＣＧＴ　ＣＧＣＡＴＡＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＴＴＧＴ　ＣＣＡ冗ＡＣＣＣＡ@６゜６０ＡＴＣＧＡＣＣＧＣＴ　ＣＣＴＧＡＧＴＴＣＴ　ＧＧにＧＧＴＴｒＴＡ　ＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧ　ＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴ　ＧＧＣＣＴＡＣＣfＣ６１２０ＧＡＴＧＣＴＴＣＣＴ　ＴＣＣＣＴｒＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧ　６１５４Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｐｈａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　’Ｉ’ｙｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌ≠■ ２２５　２コ０　２コ５　２４０Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｇｎ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｖａ１２６０　２６５　２フ０配列番号：３配列の長さ：５３２アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列の特徴他の情報：　／ラベル＝ＯＲＦ−２配列：配列番号３：Ｍａｔ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　工ｌｅ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　工１ｅ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｉｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　５ｅｒＬ　５　１０　１５Ｔｙｒ工ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＠工１ｅ　Ａｓｎ　Ｖａｌコ０５　３１０　コ１５　３２０配列番号：４配列の長さ：１００アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー二直鎮状配列の種類：タンパク質配列の特徴他の情報：　／ラベル＝ＯＲＦ−３配列　配列番号４Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａ８ｎ　Ａｌａ　ＴＹＩ−工１ｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒコ５　４０　４５Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ工１ｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　ＡｒｇＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　八ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　工１ｅ　Ａｒｇ　工ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＬｙＳ　Ｌｅｕ　工１ｅ　工１ｅ配列番号、５配列の長さ：１５２アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列の特徴他の情報：　／ラベル＝ＯＲＦ−４配列：配列番号５゜配列番号＝６配列の長さ＝２１３アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列の特徴他の情報：　／ラベル＝ＯＲＦ−５配列：配列番号６：Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｓｓｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｈｉ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｍ＠ｔ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．図１により本質的に定義される制限酵素地図を有するＦＨＶゲノムのＤＮＡフラグメント内に位置するオープンリーディングフレーム−１の上流非コーディング領域からオープンリーディングフレーム−６の下流非コーディング領域に及ぶＦＨＶゲノムのセクションに突然変異を含むＦＨＶ突然変異体。
２．前記セクションが、配列番号２〜７に示すポリペプチド又はその変異体をコードし連続するオープンリーディングフレームＯＲＦ−１〜ＯＲＦ−６のＤＮＡ配列を含む領域に及ぶことを特徴とする請求項１に記載のＦＨＶ突然変異体。
３．前記セクションが、配列番号１に示すＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のＦＨＶ突然変異体。
４．突然変異が異種ＤＮＡ配列の挿入からなることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のＦＨＶ突然変異体。
５．異種ＤＮＡ配列がポリペプチドをコードし、ＦＨＶ突然変異体に感染した細胞における前記ＤＮＡ配列の発現を調節するプロモーターの制御下にあることを特徴どする請求項４に記載のＦＨＶ突然変異体。
６．異種ＤＮＡ配列がネコ病原体の抗原をコードすることを特徴とする請求項４又は５に記載のＦＨＶ突然変異体。
７．抗原がネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボウイルス、ネココロナウイルス及びネコクラミジアから構成される群から選択される病原体に由来することを特徴とする請求項６に記載のＦＨＶ突然変異体。
８．ＦＨＶゲノムの前記セクションのＤＮＡ配列の少なくとも一部が欠失していることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のＦＨＶ突然変異体。
９．請求項１に記載のＦＨＶゲノムのセクションの少なくとも一部を含む核酸配列。
１０．請求項１に記載のＦＨＶゲノムのセクションから誘導されるＤＮＡ配列を両端に有する異種ＤＮＡ配列を含む核酸配列。
１１．請求項９又は１０に記載の核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子。
１２．請求項１１に記載の組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされだ宿主細胞。
１３．請求項１から８のいずれか一項に記載のＦＨＶ突然変異体に感染した細胞培養物。
１４．請求項１から８のいずれか一項に記載のＦＨＶ突然変異体を含むワクチン。
１５．請求項１４に記載のワクチンを投与することからなる、感染性疾患に対する動物の免疫感作方法。