CN112048007A - 一种通用型新型冠状病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种通用型新型冠状病毒疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种通用型新型冠状病毒疫苗及其制备方法，所述疫苗为表达新型冠状病毒结构蛋白S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白和非结构蛋白ORF1a多蛋白的融合蛋白的人工抗原递呈细胞，所述疫苗模拟机体的自然免疫系统，在存在细胞因子的情况下，融合蛋白形成的多种多肽片段被抗原递呈细胞所递呈，可以刺激机机体产生免疫反应并形成免疫记忆，具有广谱免疫刺激作用；所述疫苗可以实现快速大规模工业化生产，具有安全性高、成本低的优势。

Description

一种通用型新型冠状病毒疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种通用型新型冠状病毒疫苗及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染人体细胞的关键在于S蛋白与ACE2蛋白的结合。在SARS病毒和MERS病毒中，S蛋白也行使着同样的作用。因此，S蛋白决定了病毒的宿主范围和特异性，是宿主中抗体的重要作用位点，同时也是疫苗、治疗性抗体和诊断试剂的关键靶标。
引起COVID-19的病毒是新出现的冠状病毒变种，病毒的刺突蛋白(S蛋白)与受体ACE2的结合能力比SARS-CoV更强，这也解释了新冠病毒的感染能力强的原因。新型冠状病毒会刺激感染者的先天性免疫系统，使体内释放大量的细胞因子，引起细胞因子风暴和急性炎症反应，从而引发急性呼吸窘迫综合症(ARDS)和多器官衰竭。现阶段尚无有效的疫苗或药物治疗COVID-19，且人们对新型冠状病毒的认识还十分有限，为疫苗研发带来挑战。疫苗研发面临的最大挑战在于找到合适的动物模型，目前主要使用非人类灵长类的感染模型验证研发疫苗的安全性与疗效，但是费用极高，耗时较长。
在现有的病毒疫苗技术中，全病毒抗原疫苗是以传统的灭活病毒或减毒病毒作为抗原，存在安全性低、成本高的问题；病毒特定抗原疫苗是以合成的S蛋白作为抗原，而人工合成S蛋白主要利用细菌、酵母菌、细胞或病毒载体进行表达，存在耗时长、效价单一、病毒易逃逸、有效期短、成本高的问题；DNA和mRNA疫苗注射入体内需要进入细胞并转化成蛋白后才具有免疫作用，免疫原性问题是目前该技术无法突破的瓶颈。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种通用型新型冠状病毒疫苗及其制备方法，所述疫苗采用免疫修饰的抗原递呈细胞表达新型冠状病毒的关键结构蛋白和非结构蛋白，诱导机体产生免疫应答并形成免疫记忆，用于预防与治疗新型冠状病毒感染。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗组合蛋白，所述疫苗组合蛋白包括新型冠状病毒S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白或ORF1a多蛋白中的任意一种或至少两种的组合，形成疫苗刺激反应。
本发明中，含有新型冠状病毒的关键结构蛋白和非结构蛋白的疫苗组合蛋白可以刺激机机体产生免疫反应并形成免疫记忆，具有广谱免疫刺激作用。
第二方面，本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗组合融合蛋白，所述融合蛋白包括新型冠状病毒S蛋白信号肽和S蛋白受体结合域；
所述S蛋白受体结合域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP。
所述S蛋白信号肽包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLP。
本发明中，融合蛋白含有新型冠状病毒侵入人体细胞的最重要结构S蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，所述融合蛋白有助于刺激机体产生特异性强的抗新型冠状病毒抗体。
优选地，所述融合蛋白仅含有S蛋白信号肽和S蛋白受体结合域，并在羧基端添加一段短肽，设计的融合蛋白S包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFEFDIKLIAIPSTSREFR。
本发明的融合蛋白在包括S蛋白信号肽和S蛋白受体结合域的基础上，进一步包括E蛋白的部分肽段和M蛋白的部分肽段。
优选地，所述E蛋白的部分肽段包括E蛋白的氨基端肽段。
优选地，所述M蛋白的部分肽段包括M蛋白的羧基端肽段。
优选地，所述E蛋白的氨基端肽段包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4：
MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLV。
优选地，所述M蛋白的羧基端肽段包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5：
PKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ。
优选地，所述融合蛋白由S蛋白信号肽、S蛋白受体结合域、E蛋白的氨基端肽段和M蛋白的羧基端肽段组成，设计的融合蛋白SEM包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:6：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPMYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQPNNTA。
本发明的融合蛋白在包括S蛋白信号肽、S蛋白受体结合域、E蛋白的氨基端肽段和M蛋白的羧基端肽段的基础上，进一步包括N蛋白的部分肽段和ORF1a多蛋白的部分肽段。
优选地，所述N蛋白的部分肽段包括N蛋白的螺旋-转角结构域。
优选地，所述ORF1a多蛋白的部分肽段包括蛋白酶功能域和ORF1a多蛋白的羧基端肽段。
优选地，所述N蛋白的螺旋-转角结构域包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:7：
PNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSP。
优选地，所述ORF1a多蛋白的部分肽段包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:8：
PFVDRQTAQAAGTDTTITVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRTILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQ。
优选地，所述融合蛋白由S蛋白信号肽、S蛋白受体结合域、E蛋白的氨基端肽段、M蛋白的羧基端肽段、N蛋白的螺旋-转角结构域和ORF1a多蛋白组成，设计的融合蛋白SEMNP包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:9：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPMYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPPFVDRQTAQAAGTDTTITVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRTILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQ。
本发明根据新型冠状病毒的核酸序列，构建包含多种新型冠状病毒关键蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白经过酶解之后形成的多肽片段，被抗原递呈细胞所递呈，可以刺激机体内的B细胞和T细胞变为特异性抗病毒抗原的成熟B细胞和T细胞，并刺激活化的免疫细胞进一步增殖，达到预防控制感染的效果。
第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的融合蛋白的编码基因，所述编码基因包括编码S蛋白信号肽的核酸分子和编码S蛋白受体结合域的核酸分子，融合蛋白S的编码基因包括SEQ ID NO:10所示的核酸序列；
SEQ ID NO:10：
atgttcgtattccttgtactcttgcctctcgttagcagtcagtgcgtaaacctcactacgaggacgcagttgccccccaacataacgaatctgtgcccgttcggagaggttttcaacgcgacccggtttgcgtctgtgtatgcgtggaacagaaagcgaatctctaattgtgtcgccgattattctgttttgtacaacagcgcatcattttccaccttcaaatgttatggagtcagccccacaaagctgaatgatctttgctttacgaatgtctacgccgacagctttgtaatacgcggcgacgaggtgcgacagatcgcccccggacaaacagggaagatcgcagactacaattataaactgcctgatgacttcacgggttgtgttattgcgtggaatagtaataacctggactctaaagttggcggcaactacaattatctgtatcgcctgtttagaaagagtaatctcaagcctttcgagcgggacatcagtaccgagatctaccaggccggctctaccccgtgcaacggtgtagaaggctttaattgttactttcccttgcagtcctatggctttcagccaaccaatggcgtgggctatcaaccgtaccgggtagttgtgctgtcattcgaattcgatatcaagcttatcgcgataccgtcgacctcgagggaattccgataa。
优选地，所述编码基因还包括编码E蛋白的氨基端肽段的核酸分子和编码M蛋白的羧基端肽段的核酸分子，融合蛋白SEM的编码基因包括SEQ ID NO:11所示的核酸序列；
SEQ ID NO:11：
atgttcgtattccttgtactcttgcctctcgttagcagtcagtgcgtaaacctcactacgaggacgcagttgccccccaacataacgaatctgtgcccgttcggagaggttttcaacgcgacccggtttgcgtctgtgtatgcgtggaacagaaagcgaatctctaattgtgtcgccgattattctgttttgtacaacagcgcatcattttccaccttcaaatgttatggagtcagccccacaaagctgaatgatctttgctttacgaatgtctacgccgacagctttgtaatacgcggcgacgaggtgcgacagatcgcccccggacaaacagggaagatcgcagactacaattataaactgcctgatgacttcacgggttgtgttattgcgtggaatagtaataacctggactctaaagttggcggcaactacaattatctgtatcgcctgtttagaaagagtaatctcaagcctttcgagcgggacatcagtaccgagatctaccaggccggctctaccccgtgcaacggtgtagaaggctttaattgttactttcccttgcagtcctatggctttcagccaaccaatggcgtgggctatcaaccgtaccgggtagttgtgctgtcattcgaactgttgcacgccccagcaacggtgtgtgggcccatgtatagcttcgtgtctgaagagaccggtactctcattgtaaactccgtcctcctgttcctcgcgttcgtagtgttcctcctcgtgcctaaagagataacagtggcaacttctaggactctctcctactataaactcggtgcctcccagagggtagcgggcgatagtgggttcgctgcctactccaggtatcgaatcggaaattataaacttaatacggatcacagttcatcttccgataacatcgctcttcttgtacaaccgaataacaccgctag。
优选地，所述编码基因还包括编码N蛋白的螺旋-转角结构域的核酸分子和编码ORF1a多蛋白的核酸分子，融合蛋白SEMNP的编码基因包括SEQ ID NO:12所示的核酸序列；
SEQ ID NO:12：
atgttcgtattccttgtactcttgcctctcgttagcagtcagtgcgtaaacctcactacgaggacgcagttgccccccaacataacgaatctgtgcccgttcggagaggttttcaacgcgacccggtttgcgtctgtgtatgcgtggaacagaaagcgaatctctaattgtgtcgccgattattctgttttgtacaacagcgcatcattttccaccttcaaatgttatggagtcagccccacaaagctgaatgatctttgctttacgaatgtctacgccgacagctttgtaatacgcggcgacgaggtgcgacagatcgcccccggacaaacagggaagatcgcagactacaattataaactgcctgatgacttcacgggttgtgttattgcgtggaatagtaataacctggactctaaagttggcggcaactacaattatctgtatcgcctgtttagaaagagtaatctcaagcctttcgagcgggacatcagtaccgagatctaccaggccggctctaccccgtgcaacggtgtagaaggctttaattgttactttcccttgcagtcctatggctttcagccaaccaatggcgtgggctatcaaccgtaccgggtagttgtgctgtcattcgaactgttgcacgccccagcaacggtgtgtgggcccatgtatagcttcgtgtctgaagagaccggtactctcattgtaaactccgtcctcctgttcctcgcgttcgtagtgttcctcctcgtgcctaaagagataacagtggcaacttctaggactctctcctactataaactcggtgcctcccagagggtagcgggcgatagtgggttcgctgcctactccaggtatcgaatcggaaattataaacttaatacggatcacagttcatcttccgataacatcgctcttcttgtacaaccgaataacaccgctagctggtttacggccctcacgcagcacggtaaggaagacctcaaattcccccgaggccagggtgttccgataaacactaatagttcaccagacgaccaaattgggtattacagacgagctactcgacggattcgagggggagacggtaagatgaaagacctgtcaccacggtggtatttttattatttggggactggtccggaagcgggcctgccgtatggggcaaataaggacggtatcatctgggtggctacggaaggcgctcttaacacacccaaggaccatataggaacccgaaatccagctaataatgccgcaatagttttgcaactcccccaagggacaacacttcctaaaggtttttatgccgaaggtagtcgcgggggctcacaagcctctagtcggtcatcatccaggtcccgcaatagtagtcgcaactctactccgggaagtagccggggtacatcccctccctttgtggataggcaaacggctcaggcagcgggtacggatactaccatcacagtgaatgtgcttgcatggctgtatgcagcggttattaacggggacaggtggttcctgaaccggttcaccactacattgaatgatttcaatctcgtagccatgaagtataactacgagccattgactcaagatcatgtagacatcttggggcccctgagcgcgcaaacgggaattgcagtactggacatgtgcgcatctttgaaagagttgctgcagaacggaatgaatggaaggacgattctcggaagcgcattgctggaagacgaattcacaccatttgacgttgtccgacaatgctccggagtcacgtttcagtga。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第三方面所述的编码基因。
优选地，所述表达载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
第五方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第四方面所述的慢病毒载体和辅助质粒的哺乳细胞包装得到。
第六方面，本发明提供了一种抗原递呈细胞，所述抗原递呈细胞表达细胞因子；
所述细胞因子包括Calnexin(CNX)、GM-CSF、CD80、CD86、Flt3-L、IL-2或IL-12中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，利用慢病毒技术将Calnexin(CNX)、GM-CSF、CD80、CD86、Flt3-L、IL-2或IL-12等细胞因子导入髓系来源抗原递呈细胞，构建得到人工抗原递呈细胞(artificialantigen presenting cells，aAPC)。
第七方面，本发明提供了一种通用型新型冠状病毒疫苗，所述疫苗为表达第二方面所述的融合蛋白的抗原递呈细胞。
本发明采用抗原递呈细胞表达新型冠状病毒的关键蛋白构建细胞疫苗，有利于解决个体化细胞输注的安全性与高成本问题，可以加速细胞疫苗的制备时间、快速实现大规模工业生产，采用丝裂霉素C和γ辐射线照射处理，进一步加强安全系数，解决了疫苗细胞制备与安全管控的风险，并严密规范控制制备流程，降低成本。
优选地，所述抗原递呈细胞表达细胞因子。
优选地，所述抗原递呈细胞表达Calnexin(CNX)、GM-CSF、CD80、CD86、Flt3-L、IL-2或IL-12中的任意一种或至少两种的组合。
本发明的疫苗的预防和治疗过程旨在模拟机体的自然免疫系统，在存在细胞因子的情况下，暴露新型冠状病毒的结构蛋白和非结构蛋白，刺激机体产生免疫应答并形成免疫记忆，并产生抗新型冠状病毒蛋白的特异性抗体，再次感染病毒时可以快速诱导较强的免疫记忆。
优选地，所述抗原递呈细胞的基因组中整合有第三方面所述的编码基因。
优选地，所述抗原递呈细胞包括第四方面所述的表达载体和/或第五方面所述的重组慢病毒。
第八方面，本发明提供了一种第七方面所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：
采用第五方面所述的重组慢病毒转染第六方面所述的抗原递呈细胞，灭活处理后得到所述疫苗。
本发明合成新型冠状病毒的多种结构蛋白和非结构蛋白构成的融合蛋白的编码迷你基因(minigene)，通过慢病毒系统转染免疫修饰的人工抗原递呈细胞(aAPC)，由此构建的细胞疫苗具有广谱免疫刺激作用，有效刺激机体发生细胞免疫反应并产生相应抗体，可以进行大规模工业生产。
优选地，所述灭活处理包括丝裂霉素C处理和/或γ射线照射。
本发明中，采用浓缩的慢病毒迷你基因LV-SEMNP、LV-SEM或LV-S转染aAPC，建立永续性人工合成抗原递呈细胞株(COVID-19-:aAPC-SEMNP、aAPC-SEM和aAPC-S)，采用丝裂霉素C和/或γ射线照射进行灭活处理，进一步加强疫苗的安全系数，制备得到通用型新型冠状病毒COVID-19/aAPC疫苗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明构建包含新型冠状病毒结构蛋白S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白和非结构蛋白ORF1a多蛋白的融合蛋白及其编码迷你基因(minigene)，利用慢病毒系统转染入免疫修饰的人工抗原递呈细胞中，融合蛋白在机体内被酶解形成多种多肽片段，被抗原递呈细胞所递呈，可以刺激机体内的B细胞和T细胞变为特异性抗病毒抗原的成熟B细胞和T细胞，并刺激活化的免疫细胞进一步增殖，达到预防控制感染的效果；
(2)本发明的疫苗的预防和治疗过程旨在模拟机体的自然免疫系统，在存在细胞因子的情况下，暴露新型冠状病毒的结构蛋白和非结构蛋白，刺激机体产生免疫应答并形成免疫记忆，并产生抗新型冠状病毒蛋白的特异性抗体，再次感染病毒时可以快速诱导较强的免疫记忆，具有广谱免疫刺激作用；
(3)本发明为了实现对疫苗的快速大规模工业化生产，采用优选出来的抗原递呈细胞株表达新型冠状病毒的关键蛋白构建细胞疫苗，有利于解决个体化细胞输注的安全性与高成本问题，可以加速细胞疫苗的制备时间、快速实现大规模工业生产，疫苗制备过程中采用丝裂霉素C和/或γ辐射线照射进行灭活处理，进一步提高了疫苗的安全系数，解决了疫苗细胞制备与安全管控的风险，并严密规范控制制备流程，降低成本。
附图说明
图1为通用型新型冠状病毒疫苗的制备流程示意图；
图2为含有迷你基因的慢病毒载体系统；
图3为通用型人工疫苗细胞(aAPC)经由慢病毒修饰后的细胞表型分析图，其中，图3A为流式分析比较树突状细胞与aAPC细胞表面HLA抗原(-ABC、-DP,DR,DQ)的表达，图3B为流式分析比较未修饰的aAPC与慢病毒修饰的aAPC细胞表面CD80/CD86、FL与细胞内GM-CSF和IL-2的表达；
图4为aAPC经含有不同迷你基因(aAPC-S、-SEM、-SEMNP)慢病毒修饰后的病毒蛋白表达情况；
图5A为来源于供者一的T细胞经aAPC-SEMNP刺激后的扩增倍数，图5B为来源于供者二的T细胞经aAPC-SEMNP刺激后的扩增倍数，图5C为不同供者的T细胞经aAPC-SEMNP刺激后，CD4+T细胞的抗原表型，图5D为不同供者的T细胞经aAPC-SEMNP刺激后，CD8+T细胞的抗原表型；
图6A为通用型新冠病毒疫苗aAPC-SEMNP刺激供者1(Donor1)T细胞的效应因子反应测试，图6B为通用型新冠病毒疫苗aAPC-SEMNP刺激供者2(Donor2)T细胞的效应因子反应测试，图6C为通用型新冠病毒疫苗aAPC-SEMNP刺激供者3(Donor3)T细胞的效应因子反应测试，图6D为通用型新冠病毒疫苗aAPC-SEMNP刺激供者4(Donor4)T细胞的效应因子反应测试。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1融合蛋白的设计
将新型冠状病毒SARS-CoV-2的核酸序列与SARS和MERS病毒进行比较，SARS-CoV-2病毒主要表达四种结构蛋白S蛋白(surface glycoprotein)、E蛋白(Envelop protein)、M蛋白(Membrane protein)、N蛋白(nucleocapsid phosphoprotein)和一种蛋白酶ORF1a多蛋白(polyprotein cleavage protease)；
本实施例根据公布的S蛋白全长1273aa氨基酸序列(MN908947.3)，选取S蛋白信号肽(SEQ ID NO:2)和S蛋白受体结合域(SEQ ID NO:1)作为融合蛋白的第一部分，选取E蛋白氨基端29aa肽段(SEQ ID NO:4)作为融合蛋白的第二部分，选取M蛋白羧基端58aa肽段(SEQID NO:5)作为融合蛋白的第三部分，选取N蛋白中间162aa螺旋-转角结构域(SEQ ID NO:7)作为融合蛋白的第四部分，并选取ORF1a多蛋白羧基端123aa肽段(SEQ ID NO:8)作为融合蛋白的第五部分，设计得到长度为595aa的融合蛋白SEMNP(SEQ ID NO:9)；又，融合蛋白中的每一种病毒蛋白长度亦可加大或缩小，例如；
本实施例对融合蛋白SEMNP进行截短，删除N蛋白螺旋-转角结构域的大部分肽段和ORF1a多蛋白羧基端的全部肽段，设计得到长度为315aa的融合蛋白SEM(SEQ ID NO:6)；
本实施例进一步对融合蛋白SEMNP进行截短，仅保留S蛋白信号肽和S蛋白受体结合域，并在羧基端添加一段短肽，设计得到长度为228aa的融合蛋白S(SEQ ID NO:3)。
实施例2迷你基因的设计
将融合蛋白SEMNP的氨基酸序列转换为对应的核酸序列，优化后得到SEQ ID NO:12所示的融合蛋白SEMNP编码基因；
删除SEMNP编码基因的3’端部分NP序列(nt.4990-5840，NheI-SpeI deletion)，获得SEQ ID NO:11所示的融合蛋白SEM编码基因；
删除SEMNP编码基因的3’端部分EMNP序列(nt.4680-5850，BstBI-BstBIdeletion)，获得SEQ ID NO:10所示的融合蛋白S编码基因。
实施例3慢病毒载体的构建
人工合成如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的融合蛋白S、SEM和SEMNP的编码基因，将上述核酸分子双酶切，于37℃水浴中孵育30min，将酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行DNA电泳，使用琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收酶切片段；
如图2所示，将酶切片段插入线性化慢病毒载体TYF中，构建含有迷你基因的慢病毒载体LV-S、LV-SEM和LV-SEMNP。
实施例4人工抗原递呈细胞(aAPC)与树突状细胞(dendritic cells，DC)的制备
(1)aAPC的制备
aAPC是采用人源髓系相关细胞：髓系白血病细胞(acute myelogenous leukemiaAML)、KG-1或K562进行慢病毒修饰表达CNX、GM-CSF、CD80、CD86、Flt-L、IL-2和IL-12制备的，以增强aAPC的抗原呈递功能，筛选高表达细胞因子的细胞株作为疫苗株。
(2)DC的制备
将外周血单核细胞铺于培养皿中，采用AIM-V培养基(Gibco-BRL，CA，USA)培养2小时；
温和移除未贴附的细胞后，采用添加有50ng/mL GM-CSF(Biosource，CA，USA)和25ng/mL IL-4(Biosource，CA，USA)的AIM-V培养基继续培养24小时；
PBS清洗细胞后，更换新鲜的含有20ng/mL IFN-γ(Gentaur)、50ng/mL TNF-α(R&Dsystems，MN，USA)、10ng/mL IL-1β(R&D systems，MN，USA)、10ng/mL IL-6(R&D systems)和1μM PGE2(Sigma-Aldrich，MO，USA)的AIM-V培养基，培养24小时，产生成熟的树突状细胞。
实施例5人工抗原递呈细胞(aAPC)的表型分析
筛选的aAPC细胞株经慢病毒修饰后，表达细胞因子，采用流式细胞仪进行表型分析，步骤如下：
采用抗体PE-anti-HLA-ABC、FITC-anti-HLA-DR,DP,DQ、FITC-anti-CD80、FITC-anti-CD86对aAPC进行染色，4℃保持30min，并用含1％FBS的PBS洗涤两次。
细胞内染色分析根据文献进行，简言之，细胞经过Monensin(Sigma)处理5小时后，进行固定和穿孔(permeablized)处理，随后加入针对GM-CSF、IL-2、Flt3-ligand(FL)的抗体(BD Bioscience)，并使用FIX/PERM和PERM/Wash solution(BD)进行染色，流式细胞仪上机，用Flowjo软件分析不同抗原呈递细胞亚群的百分比，结果见图3。
如图3A所示，对比正常不成熟的DC细胞，aAPC不表达HLA-ABC和-DP,-DR,-DQ，因此可降低免疫排异反应。如图3B所示，未修饰的APC低表达CD80和CD86，不表达GM-CSF和IL-2，经修饰后的aAPC高表达CD80、CD86、GM-CSF和IL-2，未修饰的APC不表达Flt-L(FL)，经修饰后的aAPC高表达FL。
实施例6通用型新型冠状病毒疫苗的制备
通用型新型冠状病毒疫苗的制备流程如图1所示，首先采用浓缩的慢病毒迷你基因LV-SEMNP、LV-SEM或LV-S转染aAPC，建立永续性人工合成抗原递呈细胞株(COVID-19-:aAPC-SEMNP、aAPC-SEM和aAPC-S)，采用丝裂霉素C和/或γ射线照射进行灭活处理后，制备得到通用型新型冠状病毒疫苗COVID-19/aAPC-SEMNP、COVID-19/aAPC-SEM和COVID-19/aAPC-S。
实施例7通用型新冠病毒疫苗(aAPC-SEMNP)病毒蛋白表达分析
向细胞样品加入RIPA裂解液进行细胞裂解1h，采用BCA法测定蛋白质浓度，计算样品溶液的蛋白浓度和上样量；
根据蛋白定量结果，将蛋白质溶液、6×SDS样品缓冲液和RIPA裂解液按比例配制成总体积为25μL蛋白上样液，于100℃中孵育5min；
按照快速制胶试剂盒制备10％上层胶和下层胶，跑胶时，浓缩胶电压为70V，当蛋白跑至分离胶时，调整分离胶电压为120V，直到电极线位置；
根据蛋白分子量(Marker)的位置和胶的大小，剪取PVDF膜浸泡在无水乙醇中，转膜用的滤纸浸泡在转膜缓冲液中，利用半干转仪器盘进行上机转膜；
转膜结束后，将膜置于5％BSA中进行1h室温封闭，封闭后加入S蛋白、N蛋白、P蛋白和M蛋白一抗，于4℃冰箱孵育过夜；
隔天加入二抗室温反应1h，最后采用HRP底物试剂盒对PVDF膜进行处理，在成像仪上进行曝光。
结果如图4所示，aAPC-S细胞高表达S蛋白(26kD)，aAPC-SEMNP细胞株高表达SMENP融合蛋白(66kD)，aAPC-SEM细胞表达SEM融合蛋白(35kD)。
实施例8通用型新冠病毒疫苗aAPC-SEMNP刺激T细胞功能分析
(1)Covid-19/aAPC刺激T细胞的功能性测试一：
COVID-19/aAPC疫苗刺激外周血T细胞后，基于CD27、CD28、CD45RA、CD4和CD8表面染色流式细胞术，对CTL细胞进行分析，其中，Tcm指中枢记忆T细胞(CD27+，CD28+，CD45RA-)，Tem指效应记忆T细胞(CD27+/-，CD28+/-，CD45RA-)，Teff指末端效应T细胞(CD27-，CD28-，CD45RA-)。
结果如图5A和图5B所示，两个不同供者的T细胞经刺激后，2～3周后都进行扩增反应；如图5C和图5D所示，扩增的T细胞经由表面抗原染色分析，显示表达记忆性与效应T细胞抗原表型。
(2)Covid-19/aAPC刺激T细胞的功能性测试二：
将COVID-19/aAPC疫苗刺激后产生的CTL(EIE)，加入相关抗原肽(SEMNP混合，S，E，M，N，P和HIV多肽)，或是aAP-SEMNP，aAPC-SEM，aAPC-S人工疫苗细胞，进行刺激隔夜，利用ELISPOT免疫检测抗原特异性反应的强弱。
4位健康供者的外周血单核细胞(PBMCs)经SEMNP抗原刺激产生的CTL(EIE)，被Covid-19多肽S、M、E、N、P及5种混合SEMNP，和不同aAPC疫苗细胞再次刺激过夜，进行ELISpot分析。
结果如图6A、图6B、图6C和图6D所示，每一位供者经不同蛋白肽刺激后，表达产生IFN-γ，说明aAPC疫苗(-S，-SEM，-SEMNP)能大量诱发T细胞特异性免疫反应。
综上所述，本发明的通用型新型冠状病毒疫苗模拟机体的自然免疫系统，在存在细胞因子的情况下，融合蛋白形成的多种多肽片段被抗原递呈细胞所递呈，可以刺激机机体产生免疫反应并形成免疫记忆。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京美康基免生物科技有限公司
<120> 一种通用型新型冠状病毒疫苗及其制备方法
<130> 20200911
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1 5 10 15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
20 25 30
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
35 40 45
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
50 55 60
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
65 70 75 80
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
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Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
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Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
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Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
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Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
165 170 175
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Ala Thr Val Cys Gly Pro
195
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25
<210> 3
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
50 55 60
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
100 105 110
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
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Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
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Leu Ser Phe Glu Phe Asp Ile Lys Leu Ile Ala Ile Pro Ser Thr Ser
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225
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys
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Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp His Ser Ser
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<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
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Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
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Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
65 70 75 80
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Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
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Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
165 170 175
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
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Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
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Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Pro Lys Glu Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
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Ser Pro
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
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<210> 9
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
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Glu Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala
530 535 540
Gln Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ser Leu Lys Glu Leu
545 550 555 560
Leu Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Ala Leu Leu
565 570 575
Glu Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val
580 585 590
Thr Phe Gln
595
<210> 10
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgttcgtat tccttgtact cttgcctctc gttagcagtc agtgcgtaaa cctcactacg 60
aggacgcagt tgccccccaa cataacgaat ctgtgcccgt tcggagaggt tttcaacgcg 120
acccggtttg cgtctgtgta tgcgtggaac agaaagcgaa tctctaattg tgtcgccgat 180
tattctgttt tgtacaacag cgcatcattt tccaccttca aatgttatgg agtcagcccc 240
acaaagctga atgatctttg ctttacgaat gtctacgccg acagctttgt aatacgcggc 300
gacgaggtgc gacagatcgc ccccggacaa acagggaaga tcgcagacta caattataaa 360
ctgcctgatg acttcacggg ttgtgttatt gcgtggaata gtaataacct ggactctaaa 420
gttggcggca actacaatta tctgtatcgc ctgtttagaa agagtaatct caagcctttc 480
gagcgggaca tcagtaccga gatctaccag gccggctcta ccccgtgcaa cggtgtagaa 540
ggctttaatt gttactttcc cttgcagtcc tatggctttc agccaaccaa tggcgtgggc 600
tatcaaccgt accgggtagt tgtgctgtca ttcgaattcg atatcaagct tatcgcgata 660
ccgtcgacct cgagggaatt ccgataa 687
<210> 11
<211> 947
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgttcgtat tccttgtact cttgcctctc gttagcagtc agtgcgtaaa cctcactacg 60
aggacgcagt tgccccccaa cataacgaat ctgtgcccgt tcggagaggt tttcaacgcg 120
acccggtttg cgtctgtgta tgcgtggaac agaaagcgaa tctctaattg tgtcgccgat 180
tattctgttt tgtacaacag cgcatcattt tccaccttca aatgttatgg agtcagcccc 240
acaaagctga atgatctttg ctttacgaat gtctacgccg acagctttgt aatacgcggc 300
gacgaggtgc gacagatcgc ccccggacaa acagggaaga tcgcagacta caattataaa 360
ctgcctgatg acttcacggg ttgtgttatt gcgtggaata gtaataacct ggactctaaa 420
gttggcggca actacaatta tctgtatcgc ctgtttagaa agagtaatct caagcctttc 480
gagcgggaca tcagtaccga gatctaccag gccggctcta ccccgtgcaa cggtgtagaa 540
ggctttaatt gttactttcc cttgcagtcc tatggctttc agccaaccaa tggcgtgggc 600
tatcaaccgt accgggtagt tgtgctgtca ttcgaactgt tgcacgcccc agcaacggtg 660
tgtgggccca tgtatagctt cgtgtctgaa gagaccggta ctctcattgt aaactccgtc 720
ctcctgttcc tcgcgttcgt agtgttcctc ctcgtgccta aagagataac agtggcaact 780
tctaggactc tctcctacta taaactcggt gcctcccaga gggtagcggg cgatagtggg 840
ttcgctgcct actccaggta tcgaatcgga aattataaac ttaatacgga tcacagttca 900
tcttccgata acatcgctct tcttgtacaa ccgaataaca ccgctag 947
<210> 12
<211> 1788
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgttcgtat tccttgtact cttgcctctc gttagcagtc agtgcgtaaa cctcactacg 60
aggacgcagt tgccccccaa cataacgaat ctgtgcccgt tcggagaggt tttcaacgcg 120
acccggtttg cgtctgtgta tgcgtggaac agaaagcgaa tctctaattg tgtcgccgat 180
tattctgttt tgtacaacag cgcatcattt tccaccttca aatgttatgg agtcagcccc 240
acaaagctga atgatctttg ctttacgaat gtctacgccg acagctttgt aatacgcggc 300
gacgaggtgc gacagatcgc ccccggacaa acagggaaga tcgcagacta caattataaa 360
ctgcctgatg acttcacggg ttgtgttatt gcgtggaata gtaataacct ggactctaaa 420
gttggcggca actacaatta tctgtatcgc ctgtttagaa agagtaatct caagcctttc 480
gagcgggaca tcagtaccga gatctaccag gccggctcta ccccgtgcaa cggtgtagaa 540
ggctttaatt gttactttcc cttgcagtcc tatggctttc agccaaccaa tggcgtgggc 600
tatcaaccgt accgggtagt tgtgctgtca ttcgaactgt tgcacgcccc agcaacggtg 660
tgtgggccca tgtatagctt cgtgtctgaa gagaccggta ctctcattgt aaactccgtc 720
ctcctgttcc tcgcgttcgt agtgttcctc ctcgtgccta aagagataac agtggcaact 780
tctaggactc tctcctacta taaactcggt gcctcccaga gggtagcggg cgatagtggg 840
ttcgctgcct actccaggta tcgaatcgga aattataaac ttaatacgga tcacagttca 900
tcttccgata acatcgctct tcttgtacaa ccgaataaca ccgctagctg gtttacggcc 960
ctcacgcagc acggtaagga agacctcaaa ttcccccgag gccagggtgt tccgataaac 1020
actaatagtt caccagacga ccaaattggg tattacagac gagctactcg acggattcga 1080
gggggagacg gtaagatgaa agacctgtca ccacggtggt atttttatta tttggggact 1140
ggtccggaag cgggcctgcc gtatggggca aataaggacg gtatcatctg ggtggctacg 1200
gaaggcgctc ttaacacacc caaggaccat ataggaaccc gaaatccagc taataatgcc 1260
gcaatagttt tgcaactccc ccaagggaca acacttccta aaggttttta tgccgaaggt 1320
agtcgcgggg gctcacaagc ctctagtcgg tcatcatcca ggtcccgcaa tagtagtcgc 1380
aactctactc cgggaagtag ccggggtaca tcccctccct ttgtggatag gcaaacggct 1440
caggcagcgg gtacggatac taccatcaca gtgaatgtgc ttgcatggct gtatgcagcg 1500
gttattaacg gggacaggtg gttcctgaac cggttcacca ctacattgaa tgatttcaat 1560
ctcgtagcca tgaagtataa ctacgagcca ttgactcaag atcatgtaga catcttgggg 1620
cccctgagcg cgcaaacggg aattgcagta ctggacatgt gcgcatcttt gaaagagttg 1680
ctgcagaacg gaatgaatgg aaggacgatt ctcggaagcg cattgctgga agacgaattc 1740
acaccatttg acgttgtccg acaatgctcc ggagtcacgt ttcagtga 1788

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒疫苗组合蛋白，其特征在于，所述疫苗组合蛋白包括新型冠状病毒S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白或ORF1a多蛋白中的任意一种或至少两种的组合，形成疫苗刺激反应。
2.一种新型冠状病毒疫苗组合融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括新型冠状病毒S蛋白信号肽和S蛋白受体结合域；
优选地，所述S蛋白受体结合域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述S蛋白信号肽包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述融合蛋白由S蛋白信号肽和S蛋白受体结合域组成；
优选地，所述融合蛋白包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括E蛋白的部分肽段和M蛋白的部分肽段；
优选地，所述E蛋白的部分肽段包括E蛋白的氨基端肽段；
优选地，所述M蛋白的部分肽段包括M蛋白的羧基端肽段；
优选地，所述E蛋白的氨基端肽段包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
优选地，所述M蛋白的羧基端肽段包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
优选地，所述融合蛋白由S蛋白信号肽、S蛋白受体结合域、E蛋白的氨基端肽段和M蛋白的羧基端肽段组成；
优选地，所述融合蛋白包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括N蛋白的部分肽段和ORF1a多蛋白的部分肽段；
优选地，所述N蛋白的部分肽段包括N蛋白的螺旋-转角结构域；
优选地，所述ORF1a多蛋白的部分肽段包括蛋白酶功能域和ORF1a多蛋白的羧基端肽段；
优选地，所述N蛋白的螺旋-转角结构域包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
优选地，所述ORF1a多蛋白包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
优选地，所述融合蛋白由S蛋白信号肽、S蛋白受体结合域、E蛋白的氨基端肽段、M蛋白的羧基端肽段、N蛋白的螺旋-转角结构域和ORF1a多蛋白组成；
优选地，所述融合蛋白包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
5.一种权利要求2-4任一项所述的融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括编码S蛋白信号肽的核酸分子和编码S蛋白受体结合域的核酸分子；
优选地，所述编码基因包括SEQ ID NO:10所示的核酸序列；
优选地，所述编码基因还包括编码E蛋白的氨基端肽段的核酸分子和编码M蛋白的羧基端肽段的核酸分子；
优选地，所述编码基因包括SEQ ID NO:11所示的核酸序列；
优选地，所述编码基因还包括编码N蛋白的螺旋-转角结构域的核酸分子和编码ORF1a多蛋白的核酸分子；
优选地，所述编码基因包括SEQ ID NO:12所示的核酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5所述的编码基因；
优选地，所述表达载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求6所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞包装得到。
8.一种抗原递呈细胞，其特征在于，所述抗原递呈细胞表达细胞因子；
所述细胞因子包括Calnexin、GM-CSF、CD80、CD86、Flt3-L、IL-2或IL-12中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种通用型新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为表达权利要求2-4任一项所述的融合蛋白的抗原递呈细胞；
优选地，所述抗原递呈细胞表达细胞因子；
优选地，所述抗原递呈细胞表达Calnexin、GM-CSF、CD80、CD86、Flt3-L、IL-2或IL-12中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述抗原递呈细胞的基因组中整合有权利要求5所述的编码基因；
优选地，所述抗原递呈细胞包括权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的重组慢病毒。
10.一种权利要求9所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求7所述的重组慢病毒转染权利要求8所述的抗原递呈细胞，灭活处理后得到所述疫苗；
优选地，所述灭活处理包括丝裂霉素C处理和/或γ射线照射。
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