CN114592010A - NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114592010A
CN114592010A CN202210201224.3A CN202210201224A CN114592010A CN 114592010 A CN114592010 A CN 114592010A CN 202210201224 A CN202210201224 A CN 202210201224A CN 114592010 A CN114592010 A CN 114592010A
Authority
CN
China
Prior art keywords
car
leu
ser
cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210201224.3A
Other languages
English (en)
Inventor
谢国柱
张晗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Hospital Southern Medical University
Original Assignee
Southern Hospital Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Hospital Southern Medical University filed Critical Southern Hospital Southern Medical University
Priority to CN202210201224.3A priority Critical patent/CN114592010A/zh
Publication of CN114592010A publication Critical patent/CN114592010A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NK‑CAR‑MbIL‑15细胞及其制备方法和应用。本发明提供了一种表达膜结合型IL‑15的重组载体，包括表达嵌合抗原受体的结构和表达膜结合型IL‑15的结构。本发明所述重组载体能在NK‑CAR细胞上表达膜结合型IL‑15，所述IL‑15表达后会挂在NK细胞膜上而不会游离出来，同时由于这种表达膜结合型IL‑15存在更长的铰链区，活动空间大，能容易地与NK细胞自身的IL‑15受体(IL15Rβγ)结合，从而激活IL‑15受体下游信号通路，促进NK‑CAR细胞的自我增殖，同时避免了分泌型IL‑15带来的细胞因子毒性。

Description

NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用。
背景技术
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，缩写CAR)修饰的免疫细胞，为使用遗传工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。CAR基因主要包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域：前者用于识别肿瘤表面特异性分子和后者用于启动识别肿瘤表面分子后的免疫细胞应答，发挥细胞毒作用。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。但是CAR-T存在本身的缺陷，一方面临床使用中存在细胞因子风暴的风险，难以控制，严重时会造成患者死亡。另一面，CAR-T属于个性化治疗，不能异体回输限制了其大规模的制备。
自然杀伤(natural killer，缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，先天免疫系统反应的关键性介质细胞。NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用免疫细胞 (包括NK细胞)来治疗癌症是近年来新趋势，这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。
CAR-NK细胞因为具有更高安全性、多重靶细胞杀伤途径、易制备通用型细胞产品等独特生物学优势，使它具有更广阔前景及巨大临床价值的免疫治疗手段。然而，NK细胞为天然免疫细胞，体内扩增能力差且体内存活时间较短。目前NK细胞常在添加细胞因子的培养基中进行体外扩增，但是此方法通常仅能扩增几十倍数量的NK细胞；另一种大量扩增的方法是用K562饲养细胞 (Feeder cells)与NK细胞共培养刺激，这种方法可把NK细胞扩增1000倍以上。然而，K562是白血病细胞株，与NK细胞共培养之前需接受致死性辐射剂量来确保最终的NK细胞产品不含有增殖性或活力的K562细胞，尽管如此，仍不可完全避免残留K562细胞输入病人体内后存在的成瘤风险。另一种方法是在 CAR-NK细胞上表达促NK细胞增殖的分泌型细胞因子IL-15，从而促进CAR-NK细胞的体内外增殖，然而，这种分泌型IL-15显然会带来潜在的全身系统性毒性。如何促进CAR-NK细胞的有效扩增，避免细胞因子毒性成为了本行业亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用，促进NK-CAR细胞的体内外有效扩增，避免分泌型IL-15带来的细胞因子毒性。
本发明提供了一种表达膜结合型IL-15的重组载体，包括表达嵌合抗原受体的结构和表达膜结合型IL-15的结构。
优选的，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激域及信号活化域；
所述跨膜结构域包括NKG2D或CD8的跨膜区；所述共刺激域包括2B4或 4-1BB；所述信号活化域包括CD3ζ。
优选的，所述表达嵌合抗原受体的结构包括ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ或ScFV-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ。
优选的，所述表达膜结合型IL-15的结构包括IL-15-CD8 hinge-CD8 TM。
优选的，所述膜结合型IL-15与所述嵌合抗原受体之间包括2A肽连接。
本发明还提供了一种NK-CAR-MbIL-15细胞，包括上述技术方案所述的重组载体。
本发明还提供了所述的NK-CAR-MbIL-15细胞的制备方法，包括如下步骤：
利用2A肽将合成或扩增编码IL-15-CD8 hinge-CD8 TM的融合蛋白的核苷酸与合成或扩增编码ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ或ScFV-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸连接后，克隆到慢病毒表达载体上，得重组慢病毒表达载体；
利用慢病毒包装质粒和所述重组慢病毒表达载体感染细胞，包装得到慢病毒；
利用所述慢病毒感染NK细胞，得到NK-CAR-MbIL-15细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述的NK-CAR-MbIL-15细胞在制备提高 NK-CAR细胞免疫治疗的产品中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，包含上述技术方案所述的 NK-CAR-MbIL-15细胞。
优选的，所述的药物组合物还包括药学可接受的辅料。
本发明提供了一种表达膜结合型IL-15的重组载体，包括表达嵌合抗原受体的结构和表达膜结合型IL-15的结构。本发明所述重组载体能在NK-CAR细胞上表达膜结合型IL-15，这种IL-15表达后会挂在NK细胞膜上而不会游离出来，同时由于这种表达膜结合型IL-15存在更长的铰链区，活动空间大，能容易地与 NK细胞自身的IL-15受体(IL15Rβγ)结合，从而激活IL-15受体下游信号通路，促进NK-CAR细胞的自我增殖，同时避免了分泌型IL-15带来的细胞因子毒性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例3共表达膜结合型IL-15(mbIL-15)的CAR(NK-CAR)载体；
图2为实施例3表达膜结合型IL-15(mbIL-15)的CAR-NK细胞 (NK-CAR-MbIL-15细胞)；
图3为实施例4共表达膜结合型IL-15(mbIL-15)的CAR(T-CAR)载体；
图4为流式检测不同CAR模式的细胞阳性率的结果图；
图5为不同CAR模式的细胞的增殖效果检测图；
图6为不同CAR模式的细胞对靶细胞的杀伤效果图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明提供了一种表达膜结合型IL-15的重组载体，包括表达嵌合抗原受体的结构和表达膜结合型IL-15的结构。
在本发明中，所述嵌合抗原受体优选包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激域及信号活化域；所述跨膜结构域优选包括NKG2D或CD8的跨膜区；所述共刺激域优选包括2B4或4-1BB；所述表达嵌合抗原受体的结构优选包括S cFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ(记为NK-CAR)或ScFV-CD8 hinge-C D8 TM-4-1BB-CD3ζ(记为T-CAR)。本发明所述ScFV-CD8hinge-NKG2D TM -2B4-CD3ζ的融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’- MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYL NWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYF CQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSET LSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISK DNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSST TTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSNLFVASWIA VMIIFRIGMAVAIFCCFFFPRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQ EQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTI YEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNE LNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-3’，编码所述ScFV -CD8hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID N O：2所示，具体为：5’-ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTG GCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAATTGTGATGACCCAGTCACCC GCCACTCTTAGCCTTTCACCCGGTGAGCGCGCAACCCTGTCTTGCAGAGCC TCCCAAGACATCTCAAAATACCTTAATTGGTATCAACAGAAGCCCGGACAG GCTCCTCGCCTTCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCATTCTGGAATCCCT GCCAGGTTCAGCGGTAGCGGATCTGGGACCGACTACACCCTCACTATCAG CTCACTGCAGCCAGAGGACTTCGCTGTCTATTTCTGTCAGCAAGGGAACA CCCTGCCCTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGCTCGAGATTAAAGGTGGA GGTGGCAGCGGAGGAGGTGGGTCCGGCGGTGGAGGAAGCCAGGTCCAAC TCCAAGAAAGCGGACCGGGTCTTGTGAAGCCATCAGAAACTCTTTCACTG ACTTGTACTGTGAGCGGAGTGTCTCTCCCCGATTACGGGGTGTCTTGGATC AGACAGCCACCGGGGAAGGGTCTGGAATGGATTGGAGTGATTTGGGGCTC TGAGACTACTTACTACTCTTCATCCCTCAAGTCACGCGTCACCATCTCAAA GGACAACTCTAAGAATCAGGTGTCACTGAAACTGTCATCTGTGACCGCAG CCGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTAAGCATTACTATTATGGCGGGAGCTACGCAATGGATTACTGGGGACAGGGTACTCTGGTCACCGTGTCCAGCACCA CTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGC CTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATTCAAACCTATTCGTAGCTAGTT GGATAGCAGTAATGATTATTTTCCGTATCGGAATGGCCGTAGCTATCTTCTG CTGCTTCTTTTTTCCAAGGAGAAAGAGGAAGGAGAAGCAGTCAGAGACC AGTCCCAAGGAATTTTTGACAATTTACGAAGATGTCAAGGATCTGAAAACC AGGAGAAATCACGAGCAGGAGCAGACTTTTCCTGGAGGGGGGAGCACCA TCTACTCTATGATCCAGTCCCAGTCTTCTGCTCCCACGTCACAAGAACCTG CATATACATTATATTCATTAATTCAGCCTTCCAGGAAGTCTGGATCCAGGAA GAGGAACCACAGCCCTTCCTTCAATAGCACTATCTATGAAGTGATTGGAAA GAGTCAACCTAAAGCCCAGAACCCTGCTCGATTGAGCCGCAAAGAGCTGG AGAACTTTGATGTTTATTCCCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTC CAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGT CGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAG AAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAA CGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGA AAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACT CAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGC CGCCTCGG-3’；
本发明所述ScFV-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：3所示，具体为：5’-MALPVTALLLPLALLLHAARPEI VMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLH SGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGG GGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQ PPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAV YYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLY IFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQL YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-3’；编码所述 ScFV-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ I D NO：4所示，具体为：5’-ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCG CTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAATTGTGATGACCCAGTCA CCCGCCACTCTTAGCCTTTCACCCGGTGAGCGCGCAACCCTGTCTTGCAGA GCCTCCCAAGACATCTCAAAATACCTTAATTGGTATCAACAGAAGCCCGGA CAGGCTCCTCGCCTTCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCATTCTGGAATC CCTGCCAGGTTCAGCGGTAGCGGATCTGGGACCGACTACACCCTCACTATC AGCTCACTGCAGCCAGAGGACTTCGCTGTCTATTTCTGTCAGCAAGGGAA CACCCTGCCCTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGCTCGAGATTAAAGGTG GAGGTGGCAGCGGAGGAGGTGGGTCCGGCGGTGGAGGAAGCCAGGTCCA ACTCCAAGAAAGCGGACCGGGTCTTGTGAAGCCATCAGAAACTCTTTCAC TGACTTGTACTGTGAGCGGAGTGTCTCTCCCCGATTACGGGGTGTCTTGGA TCAGACAGCCACCGGGGAAGGGTCTGGAATGGATTGGAGTGATTTGGGGC TCTGAGACTACTTACTACTCTTCATCCCTCAAGTCACGCGTCACCATCTCAA AGGACAACTCTAAGAATCAGGTGTCACTGAAACTGTCATCTGTGACCGCA GCCGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTAAGCATTACTATTATGGCGGGAGCT ACGCAATGGATTACTGGGGACAGGGTACTCTGGTCACCGTGTCCAGCACC ACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCA GCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCG TGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCT GGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAG GCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAG AGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGC AGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCA ATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACG GGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGC CTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGAT TGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTAC CAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCA GGCCCTGCCGCCTCGG-3’。
本发明所述表达膜结合型IL-15的结构优选包括IL-15-CD8 hinge-CD8 T M。本发明所述IL-15-CD8 hinge-CD8 TM的融合蛋白的氨基酸序列优选如SE Q ID NO：5所示，具体为：5’-MALPVTALLLPLALLLHAARPNWVNVISDLK KIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVE NLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSTTTPA PRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVL LLSLVITLYC-3’；编码所述IL-15-CD8 hinge-CD8 TM的融合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：6所示，具体为：5’-ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCC TGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCAACTGGGTGA ATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATT GATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACA GCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGA GATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAAC AGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAG GAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATT GTCCAAATGTTCATCAACACTTCTACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCC ACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCA TGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGC CTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTTGA-3’。
本发明所述膜结合型IL-15与所述嵌合抗原受体之间优选包括2A肽连接，进一步优选为P2A连接。本发明所述表达嵌合抗原受体和表达膜结合型IL-15 的结构以及二者之间的连接方式优选如图1或3所示。
本发明所述表达嵌合抗原受体的结构和表达膜结合型IL-15的结构中的涉及的基因序列均来自于NCBI，通过DNA合成技术合成目的DNA片段，按照图1或3所示的结构将目的DNA片段顺次连接，得到所述表达膜结合型IL-15 的重组载体。
本发明所述重组载体能在NK-CAR细胞上表达膜结合型IL-15，这种IL-15 表达后会挂在NK细胞膜上而不会游离出来，同时由于这种表达膜结合型IL-15 存在更长的铰链区，活动空间大，能容易地与NK细胞自身的IL-15受体 (IL15Rβγ)结合，从而激活IL-15受体下游信号通路，促进NK-CAR细胞的自我增殖，同时避免了分泌型IL-15带来的细胞因子毒性。
本发明还提供了NK-CAR-MbIL-15细胞，包括上述技术方案所述的重组载体。
本发明还提供了上述NK-CAR-MbIL-15细胞的制备方法，包括如下步骤：
利用2A肽将合成或扩增编码IL-15-CD8 hinge-CD8 TM的融合蛋白的核苷酸与合成或扩增编码ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ或ScFV-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸连接后，克隆到慢病毒表达载体上，得重组慢病毒表达载体；
利用慢病毒包装质粒和所述重组慢病毒表达载体感染细胞，包装得到慢病毒；
利用所述慢病毒感染NK细胞，得到NK-CAR-MbIL-15细胞。
本发明所述慢病毒指逆转录病毒科下的属，能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞，传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA。
本发明所述慢病毒载体优选为pHIV。本发明所述慢病毒包装质粒优选为3 质粒(BaEV,detal 8.9，表达质粒)。
本发明优选利用慢病毒包装质粒和所述慢病毒表达载体感染293T细胞，包装得到慢病毒。本发明对所述包装的具体过程没有严格要求，收集感染后的293T 细胞的培养上清液，浓度得到病毒滴度为1x108/mL的慢病毒。
本发明优选利用病毒滴度为1x108/mL的慢病毒感染NK细胞，得到 NK-CAR-MbIL-15细胞。本发明所述NK细胞优选为人体外周血来源NK细胞、脐带血来源NK细胞、造血干细胞来源NK细胞、iPSCs来源的NK细胞或NK 细胞系，进一步优选包括人外周血NK细胞、脐带血来源NK细胞、造血干细胞来源NK细胞、iPSCs来源的NK细胞或NK-92细胞。在本发明具体实施过程中以NK-92细胞为例进行说明，但不能仅仅将其认定为本发明技术方案的全部保护范围。
本发明所述NK-CAR-MbIL-15细胞在NK-CAR细胞上表达膜结合型IL-15，挂在NK细胞膜上而不会游离出来，同时由于这种表达膜结合型IL-15存在更长的铰链区，活动空间大，能容易地与NK细胞自身的IL-15受体(IL15Rβγ)结合，从而激活IL-15受体下游信号通路，促进NK-CAR细胞的自我增殖，同时避免了分泌型IL-15带来的细胞因子毒性了，提高NK-CAR细胞免疫治疗的效果。
本发明还提供了一种药物组合物，包含上述技术方案所述的 NK-CAR-MbIL-15细胞。本发明所述药物组合物优选还包括药学可接受的辅料。本发明对辅料的具体类型没有严格要求，根据药物的剂型常规选择即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
慢病毒载体的制备
基因合成ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ-P2A-IL-15-CD8 hinge-CD8 TM(具体如图1所示，其中，ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；IL-15-CD8 hinge-CD8 TM的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，编码ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)。
利用限制性内切酶(XbaI和BmtI)酶切，利用T4连接酶将ScFV-CD8 hinge-NKG2DTM-2B4-CD3ζ-P2A-IL-15-CD8 hinge-CD8 TM融合基因序列转化连接到pHIV载体中，pHIV载体(购买自Addgene)。
载体转化NEB stable感受态细菌，氨苄青霉素药物筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得pHIV-CAR-MbIL-15转染载体。
实施例2
慢病毒的制备
(1)转染前24小时，以2×106(密度)将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。
(2)将包装质粒与表达质粒(BaEV 10ug、Delta 8.910ug、表达质粒20ug) 混匀后加入培养皿中。
(3)分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液，25000转离心2小时浓缩病毒液，浓缩后的病毒液通过转导Jurkat T细胞(1000g离心1小时)， 72小时后测病毒滴度为1×108PFU/mL，得表达CAR-MbIL-15的慢病毒。
实施例3
NK-CAR(NK-CAR)-MbIL-15细胞的制备
将NK92细胞密度调整至1×106/ml，按照感染复数(MOI)＝10向NK-92 细胞中添加实施例2的慢病毒，1000g离心1小时后置于孵箱培养24小时后更换新鲜培养基继续培养48小时，流式检测转导效率，得到NK-CAR(NK-CAR) -MbIL-15细胞(如图2所示)。
实施例4
NK-CAR(T-CAR)-MbIL-15细胞的制备
同实施例1～3，区别在于在制备慢病毒载体时，基因合成如图3所示的 ScFV-CD8hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-IL-15-CD8 hinge-CD8 TM重组载体 (具体如图3所示，其中，ScFV-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码ScFV-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；IL-15-CD8 hinge-CD8 TM的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，编码ScFV-CD8hinge-NKG2D TM -2B4-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)，得到NK-CAR(T-CAR)-MbIL-15细胞。
对比例1
同实施例1～3，区别在于利用GFP代替MbIL-15，得NK-CAR(NK-CAR) -GFP细胞。
对比例2
同实施例4，区别在于利用GFP代替MbIL-15，得NK-CAR(T-CAR)-GFP 细胞。
对比例3
在NK-CAR细胞上表达促NK细胞增殖的分泌型细胞因子IL-15(载体结构： ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ-P2A-IL-15)，得NK-CAR(NK-CAR) -sIL15细胞。
测试例1
以正常生长的NK92细胞为空白对照，利用流式检测实施例3、实施例4和对比例1～3转导效率，流式检测结果如图4所示。图4从左到右依次为对照组，即未转CAR分子的NK92细胞；实施例4NK-CAR(T-CAR)-GFP细胞、实施例3NK-CAR(NK-CAR)-GFP细胞、对比例2NK-CAR(T-CAR)-MbIL-15、对比例1NK-CAR(NK-CAR)-MbIL-15和对比例3NK-CAR(NK-CAR)-sIL15 细胞。图4纵坐标表示流式表示CAR的表示水平，横坐标表示GFP的表达。
根据图4记载的内容可以看出，相比正常生长的NK92细胞，实施例3～4 和对比例1～3标记的信号值显著升高，正常生长的NK92细胞、实施例3～4和对比例1～3阳性率依次为2.88％、93.7％、97％、99.6％、91.2％和92.3％)。
测试例2
以正常生长的NK92细胞为空白对照，利用CCK8试剂盒检测实施例3～4、对比例1～3表达不同CAR模式的细胞的增殖能力；利用荧光素酶法以不同的效靶比(E/T)检测实施例3～4、对比例1～3表达不同CAR模式的细胞对靶细胞的杀伤效果，增殖能力检测结果如表1和图5所示，杀伤效果检测结果如表2 和图6所示。其中，表1和图5中NK92、TGFP、NKGFP、NKSIL15、TMB、NKMB 依次对应的为空白对照、对比例2、对比例1、对比例3、实施例4和实施例3 的细胞。表2和图6中NK92、TGFP、NKGFP、Tmb15、NKmb15、NKSIL15 依次对应的为空白对照、对比例2、对比例1、实施例4、实施例3和对比例3 的细胞。
表1不同CAR模式的细胞的增殖效果
细胞类型 0d 1d 2d 3d 4d
NK92 1 1.63 2.11 2.20 2.54
TGFP 1 1.63 2.15 2.15 2.60
NKGFP 1 1.64 2.44 2.92 3.95
NKSIL15 1 1.66 2.51 3.06 5.15
TMB 1 1.67 2.70 3.63 7.77
NKMB 1 1.66 2.37 2.83 4.12
表2不同CAR模式的细胞对靶细胞的杀伤效果(％)
细胞类型 5(效靶比) 2.5(效靶比) 1(效靶比) 0.5(效靶比)
NK92 82.10 53.50 24.02 17.27
TGFP 96.05 85.69 55.32 33.14
NKGFP 95.70 81.45 40.23 16.85
TmbIL15 97.81 94.04 68.25 43.04
NKmbIL15 97.92 91.12 65.19 41.71
NKSIL15 98.29 95.96 83.78 64.55
根据表1～2和图5～6记载的内容可以看出，相比空白对照组，本发明 NK-CAR-mbIL15细胞能够促进NK-CAR细胞自我增殖，同时可提高对肿瘤细胞的杀伤效果。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 南方医科大学南方医院
<120> NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
210 215 220
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ser Asn Leu Phe Val Ala Ser Trp Ile Ala Val Met
305 310 315 320
Ile Ile Phe Arg Ile Gly Met Ala Val Ala Ile Phe Cys Cys Phe Phe
325 330 335
Phe Pro Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys
340 345 350
Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg
355 360 365
Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr
370 375 380
Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala
385 390 395 400
Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg
405 410 415
Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile
420 425 430
Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys
435 440 445
Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
450 455 460
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
465 470 475 480
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
500 505 510
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
515 520 525
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
530 535 540
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
545 550 555 560
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
565
<210> 2
<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900
cggggtcttg acttcgcctg cgattcaaac ctattcgtag ctagttggat agcagtaatg 960
attattttcc gtatcggaat ggccgtagct atcttctgct gcttcttttt tccaaggaga 1020
aagaggaagg agaagcagtc agagaccagt cccaaggaat ttttgacaat ttacgaagat 1080
gtcaaggatc tgaaaaccag gagaaatcac gagcaggagc agacttttcc tggagggggg 1140
agcaccatct actctatgat ccagtcccag tcttctgctc ccacgtcaca agaacctgca 1200
tatacattat attcattaat tcagccttcc aggaagtctg gatccaggaa gaggaaccac 1260
agcccttcct tcaatagcac tatctatgaa gtgattggaa agagtcaacc taaagcccag 1320
aaccctgctc gattgagccg caaagagctg gagaactttg atgtttattc ccgcgtgaaa 1380
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1440
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1500
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1560
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1620
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1680
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1707
<210> 3
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
210 215 220
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 4
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900
cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960
gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020
tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080
tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140
agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200
ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260
gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320
atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380
gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440
caggccctgc cgcctcgg 1458
<210> 5
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
20 25 30
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
35 40 45
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
50 55 60
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
65 70 75 80
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
85 90 95
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
100 105 110
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
115 120 125
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
130 135 140
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
145 150 155 160
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
165 170 175
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
180 185 190
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
195 200
<210> 6
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120
catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180
atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240
catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300
gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360
ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctaccac taccccagca 420
ccgaggccac ccaccccggc tcctaccatc gcctcccagc ctctgtccct gcgtccggag 480
gcatgtagac ccgcagctgg tggggccgtg catacccggg gtcttgactt cgcctgcgat 540
atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 600
actctttact gttga 615

Claims (10)

1.一种表达膜结合型IL-15的重组载体，其特征在于，包括表达嵌合抗原受体的结构和表达膜结合型IL-15的结构。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激域及信号活化域；
所述跨膜结构域包括NKG2D或CD8的跨膜区；所述共刺激域包括2B4或4-1BB；所述信号活化域包括CD3ζ。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述表达嵌合抗原受体的结构包括ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ或ScFV-CD8 hinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ。
4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述表达膜结合型IL-15的结构包括IL-15-CD8 hinge-CD8 TM。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述膜结合型IL-15与所述嵌合抗原受体之间包括2A肽连接。
6.一种NK-CAR-MbIL-15细胞，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的重组载体。
7.权利要求6所述的NK-CAR-MbIL-15细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用2A肽将合成或扩增编码IL-15-CD8 hinge-CD8 TM的融合蛋白的核苷酸与合成或扩增编码ScFV-CD8 hinge-NKG2D TM-2B4-CD3ζ或ScFV-CD8hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白的核苷酸连接后，克隆到慢病毒表达载体上，得重组慢病毒表达载体；
利用慢病毒包装质粒和所述重组慢病毒表达载体感染细胞，包装得到慢病毒；
利用所述慢病毒感染NK细胞，得到NK-CAR-MbIL-15细胞。
8.权利要求6所述的NK-CAR-MbIL-15细胞或权利要求7所述制备方法得到的NK-CAR-MbIL-15细胞在制备提高NK-CAR细胞免疫治疗的产品中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求6所述的NK-CAR-MbIL-15细胞或权利要求7所述制备方法得到的NK-CAR-MbIL-15细胞。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，所述的药物组合物还包括药学可接受的辅料。
CN202210201224.3A 2022-03-03 2022-03-03 NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用 Pending CN114592010A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210201224.3A CN114592010A (zh) 2022-03-03 2022-03-03 NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210201224.3A CN114592010A (zh) 2022-03-03 2022-03-03 NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114592010A true CN114592010A (zh) 2022-06-07

Family

ID=81807412

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210201224.3A Pending CN114592010A (zh) 2022-03-03 2022-03-03 NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114592010A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115947869A (zh) * 2022-11-28 2023-04-11 广州佰芮慷生物科技有限公司 一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、car-nk细胞及用途
WO2024017362A1 (zh) * 2022-07-22 2024-01-25 上海先博生物科技有限公司 靶向gprc5d和/或bcma的嵌合抗原受体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113481169A (zh) * 2021-08-11 2021-10-08 南方医科大学南方医院 一种细胞激活依赖性分泌系统及应用
CN113528452A (zh) * 2020-07-06 2021-10-22 上海鑫湾生物科技有限公司 共表达IL-21和hrCD16嵌合受体的免疫细胞及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528452A (zh) * 2020-07-06 2021-10-22 上海鑫湾生物科技有限公司 共表达IL-21和hrCD16嵌合受体的免疫细胞及其应用
CN113481169A (zh) * 2021-08-11 2021-10-08 南方医科大学南方医院 一种细胞激活依赖性分泌系统及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张晗等: "ＣＡＲ 载体优化对ＣＡＲ－ＮＫ 细胞体内持久抗肿瘤活性的研究", 第十四届全国免疫学学术大会会议论文集, pages 450 *
曹正锋;万兵;王丽珩;刘丹;龚卫娟;季明春;: "双表达外源性4-1BBL/IL-15的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究", 现代免疫学, no. 01, pages 12 - 17 *
闵静婷;黄艳平;樊红莲;赵报;汪洪涛;李正红;: "IL-15、IL-21和4-1BBL增强NK-92细胞增殖和细胞毒性的实验研究", 现代肿瘤医学, no. 13 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024017362A1 (zh) * 2022-07-22 2024-01-25 上海先博生物科技有限公司 靶向gprc5d和/或bcma的嵌合抗原受体及其应用
CN115947869A (zh) * 2022-11-28 2023-04-11 广州佰芮慷生物科技有限公司 一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、car-nk细胞及用途
CN115947869B (zh) * 2022-11-28 2023-12-12 广州佰芮慷生物科技有限公司 一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、car-nk细胞及用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107868791B (zh) 一种加强型Slit2 CAR-T和CAR-NK细胞制备方法和应用
CN110684121B (zh) 一种靶向her2联合表达pd1-mica融合蛋白的嵌合抗原受体及其表达载体和应用
CN114592010A (zh) NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用
CN113913379B (zh) T淋巴细胞及其应用
CN110144326A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN110684120B (zh) 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体及其应用
CN111690050B (zh) 识别ebv-lmp2抗原的tcr及相应的核酸分子、载体、细胞和药物
CN111606999B (zh) 兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒及其应用
CN104910278B (zh) 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒
WO2009139413A1 (ja) サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法
CN113773402A (zh) 一种双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞及药物组合物
WO2017071173A1 (zh) 经il-12/cd62l融合蛋白改造的肿瘤治疗剂及其制法和用途
CN110358734B (zh) 以Tcm为主要效应成分的CAR-T制备方法及其应用
CN110526970A (zh) 靶向cd133的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN111139222B (zh) 一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途
CN111378624B (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN115212299A (zh) Car-t和car-m联用在制备抗肿瘤药物中的应用
CN112111013A (zh) 一种靶向claudin 18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞、构建方法及其用途
CN114250198A (zh) 一种增强免疫细胞抗肿瘤效果的方法
CN115552019A (zh) 在髓样细胞和小胶质细胞中特异性表达治疗性蛋白的病毒载体
CN110684119B (zh) 一种靶向her2的嵌合抗原受体及其表达载体和应用
CN110157674A (zh) 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN110669144B (zh) 一种靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN111763264A (zh) 一种靶向psca的嵌合抗原受体及其应用
CN105585637B (zh) 基于il-12稳定膜表达的肿瘤治疗剂及其制法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination