CN111139222B

CN111139222B - 一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN111139222B
Application number: CN201910463947.9A
Authority: CN
Inventors: 段海峰; 薛冰华; 于婷婷; 肖秀孝; 解晶; 庞如梦; 张群伟; 弓景波
Original assignee: Beijing Shuangyin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Huaao Xuande Biomedical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-05-30
Also published as: CN111139222A

Abstract

本发明公开了一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到，其能够将无免疫源性的肿瘤转化为有免疫源性的肿瘤，同时能够与PD1抗体联用抑制实体肿瘤的增殖，显著增加瘤内浸润淋巴细胞的含量。本发明提供的重组间充质干细胞的制备方法，操作简单，条件易控，成本低廉，适合大规模应用。

Description

一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

免疫治疗已成为继靶向治疗后，肿瘤治疗领域的重要进展。特别是对于没有靶向驱动基因变异及治疗靶点的患者，免疫治疗的出现给他们带来了新的希望。同时，临床研究表明，肿瘤患者一旦响应免疫治疗，往往能带来长期的获益，甚至是疾病的完全缓解。

目前，已有多个PD-1/PD-L1抑制剂(如纳武利尤单抗和阿特珠单抗等)，共获批用于非小细胞肺癌、尿路上皮癌等12种实体瘤和所有微卫星高不稳定性(MSI-H)实体瘤的二/三线甚至一线治疗，但目前没有高效的单一针对PD-1/PD-L1抑制剂疗效预测的分子标志物。FDA批准用于指导免疫治疗患者筛查的生物标记物中，PD-L1表达阳性患者的免疫治疗有效率仍然很低。同时，虽然肿瘤突变负荷(TMB)是一种预测PD-1/PD-L1抑制剂治疗的重要标志物，但高TMB(TMB-H)患者的客观缓解率也仅有约30％。TMB联合PD-L1预测PD-1/PD-L1抑制剂效果也并不理想。

PD-L1蛋白表达反映的是肿瘤组织中潜在的PD-1/PD-L1药物作用靶点，而MSI-H和TMB-H一定程度上能反映患者肿瘤新抗原的数量。PD-L1表达阳性和TMB-H的患者响应PD-1/PD-L1抑制剂仍不理想的原因可能和肿瘤的免疫微环境有关，当中最重要的是肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的状态相关，只有在有浸润淋巴细胞存在的情况下，新抗原才能体现出免疫源性。

相关研究根据TILs的存在与否，将肿瘤分为所谓的“冷肿瘤”和“热肿瘤”，即，热肿瘤是有浸润淋巴细胞的肿瘤，而冷肿瘤则相反，“热”和“冷”反映的是肿瘤是否有免疫源性。冷肿瘤的PD-1/PD-L1抑制剂的有效率较低，而热肿瘤中PD-L1高表达的肿瘤则更有可能响应PD-1/PD-L1治疗，患者也可能有更多的肿瘤新抗原。

然而，在热肿瘤中PD-L1高表达的不同患者中，TILs的细胞类型和功能状态也不相同。同一患者不同时间TILs也并不是一成不变的，TILs的mRNA和蛋白表达会受疾病治疗等的影响，肿瘤免疫微环境的异质性影响了不同患者对免疫治疗的响应。例如：研究分析TILs不同类型细胞对免疫治疗的影响，CD3+和CD8+TILs与非小细胞肺癌、黑色素瘤等实体瘤更好的临床获益相关，然而只有CD8是一个独立的预后因素，而FOXP3+调节性T细胞等与免疫获益负相关；临床研究证实PD-L1表达阳性的TILs响应阿特珠单抗治疗。同时，TILs细胞类型、T细胞受体的克隆变化、肿瘤放化疗后的新抗原变化等都能反映免疫微环境动态变化的一部分，这些都能反映肿瘤对免疫治疗的响应。免疫微环境的变化，可能会使原本并不响应免疫治疗的患者，变为响应治疗。

但是，现有技术中无法高效改变免疫微环境，即无法高效实现“冷”“热”肿瘤的转化，使得PD1抗体在应用于实体瘤的治疗时存在应用限制，同时无法扩展免疫治疗应用范围及提高免疫治疗有效率。

因此，有必要提供一种重组间充质干细胞及其制备方法和应用，该重组间充质干细胞能够使肿瘤具有免疫源性，且能够对实体瘤实现有效治疗。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，利用具有趋化肿瘤杀伤细胞的趋化因子来修饰间充质干细胞，使得趋化因子在间充质干细胞中过表达，同时优化了制备过程中的病毒包装、转导等步骤，使得制备的重组间充质干细胞在肿瘤局部能够形成高浓度的趋化因子，实现无免疫源性的冷肿瘤能够转化为有免疫源性的热肿瘤，同时能够与PD1抗体联用抑制实体肿瘤的增殖，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供一种重组间充质干细胞，其中，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到。

第二方面，提供一种第一方面所述的重组间充质干细胞的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：

步骤1，获取用于修饰间充质干细胞的基因及包含该基因的重组质粒；

步骤2，制备携带上述基因的重组病毒；

步骤3，制备得到重组间充质干细胞。

第三方面，提供一种第二方面所述的方法制备的重组间充质干细胞。

第四方面，提供一种第一方面所述的重组间充质干细胞或第三方面所述的重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤药物中的用途。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明所提供的重组间充质干细胞，能够在肿瘤局部形成高浓度的趋化因子，将冷肿瘤转化为肿瘤；

(2)本发明所提供的重组间充质干细胞，结合PD1抗体的应用，能够有效抑制实体瘤的增殖，显著增加瘤内浸润淋巴细胞的含量；

(3)本发明提供的重组间充质干细胞，能够同时利用间充质干细胞的持久存活、归巢到肿瘤部位的特性以及趋化因子趋化肿瘤杀伤细胞的功能，能够改变患者的免疫微环境使之响应免疫治疗，扩展免疫治疗应用范围、提高免疫治疗有效率；

(4)本发明提供的重组间充质干细胞的制备方法，操作简单，条件易控，成本低廉，适合大规模应用。

附图说明

图1示出本发明实施例1中获得的重组质粒的结构示意图；

图2示出实验例1中所述间充质干细胞Lptn和CCL4因子的分泌量的比较示意图；

图3示出实验例2中各组治疗药物对黑色素瘤的抑制效果；

图4示出实验例2中黑色素瘤的体积随着药物治疗的变化效果；

图5示出实验例3中不同治疗药物对肿瘤内部浸润淋巴细胞含量的影响；

图6示出实验例3中采用不同治疗药物后小鼠脾脏外周淋巴细胞的含量变化。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明人研究发现，放疗后，肿瘤会产生更多的突变以及肿瘤新抗原，经伊匹单抗治疗耐药后，TILs增多(CD8、CD4表达上升)的肿瘤更容易响应抗PD-1/PD-L1治疗。即多线治疗后，可能会有部分“冷”肿瘤(无免疫源性的肿瘤)转化为了“热”肿瘤(有免疫源性的肿瘤)。而对于无免疫源性的肿瘤，肿瘤组织中没有货，只有很少的免疫细胞，对此类肿瘤进行免疫治疗的疗效是不佳的，需要联合一些其他治疗来让肿瘤组织中聚集免疫细胞。

因此，本发明的第一方面提供了一种重组间充质干细胞，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到，其能够将无免疫源性的肿瘤转化为有免疫源性的肿瘤。

其中，所述间充质干细胞(MSC)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。其具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；同时，间充质干细胞来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性，能够在肿瘤局部持续高表达趋化因子。

根据本发明一种优选的实施方式，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

其中，所述脐带间充质干细胞来源于离体的脐带组织，取材方便，来源广泛，不受伦理的争论和限制，同时取材对供者无创伤，不受供者年龄因素的影响，体外分离培养简单，扩增迅速，免疫源性较低，无致瘤性，可作为基因治疗的细胞子载体。在体内或体外特定的诱导条件下，脐带间充质干细胞可分化为多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，是细胞移植治疗的理想种子细胞。

根据本发明一种优选的实施方式，所述趋化因子选自T细胞趋化因子、NK细胞趋化因子、巨噬细胞趋化因子中的一种或多种。

其中，所述趋化因子是使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，其对不同靶细胞具有一定趋化效应。

在进一步优选的实施方式中，所述趋化因子选自CCL1-28、CXCL1-17、XCL1(Lptn)、XCL2、CX3CL1中的一种或多种。

在更进一步优选的实施方式中，所述趋化因子为CCL4基因和Lptn基因。

本发明人研究发现，CCL4是趋化T细胞、NK细胞和巨噬细胞等肿瘤杀伤细胞的主要趋化因子。而Lptn(淋巴细胞趋化因子)由多种免疫细胞分泌，包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞和NKT细胞等。在外周淋巴组织中，Lptn主要趋化表达XCR1受体的CD8+DCs，随后CD8+DCs以主要组织相容性复合体MHC-I类分子向CD8+T细胞交叉递呈抗原，促进CD8+T淋巴细胞分化成具有细胞毒性作用的效应T细胞。

在本发明中，优选选择CCL4和Lptn基因来修饰间充质干细胞，利用间充质干细胞能够归巢到肿瘤部位的特性，在无免疫源性的肿瘤(冷肿瘤)局部形成高浓度趋化因子，趋化T细胞和巨噬细胞到肿瘤局部，将冷肿瘤转化为热肿瘤。

在本发明中，所述CCL4基因和Lptn基因以Lptn-T2A-CCL4(简写为Lptn-CCL4)融合基因的形式修饰间充质干细胞。

根据本发明一种优选的实施方式，所述Lptn-CCL4融合基因的编码核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列，Lptn-CCL4融合基因的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.2所示序列。

在进一步优选的实施方式中，所述Lptn-CCL4融合基因的编码核苷酸序列为SEQID NO.1所示序列，Lptn-CCL4融合基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

本发明的第二方面，提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：

步骤2，制备携带上述基因的重组病毒；

步骤3，制备得到重组间充质干细胞。

以下进一步描述所述重组间充质干细胞的制备方法：

步骤1，获取用于修饰间充质干细胞的基因及包含该基因的重组质粒。

在本发明中，所述基因为趋化因子融合基因，优选为Lptn-CCL4融合基因。

其中，步骤1包括以下子步骤：

步骤1-1，获取融合基因的各个基因片段，进行连接，获得融合基因。

根据本发明一种优选的实施方式，采用PCR方法扩增出待融合的各个基因片段，经电泳鉴定正确后回收目的基因片段。

在本发明中，由于待融合的基因(如：Lptn基因和CCL4基因)均为已知序列，需要根据已知序列设计引物，并从相应的重组质粒上经普通PCR扩增得到基因片段。

在进一步优选的实施方式中，所述扩增得到的基因片段通过连接序列连接，所述连接序列为T2A序列、E2A序列或P2A序列，优选为T2A序列。

其中，所述T2A序列的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。

在本发明中，所述融合基因优选采用现有技术中常用的重叠延伸PCR、TBIO法及PTDS法等合成，如：由中美泰和生物技术(北京)有限公司采用重叠延伸PCR法全基因合成，或由金唯智公司采用TBIO法法合成。

步骤1-2，将融合基因和载体质粒均进行双酶切，并回收酶切产物。

根据本发明一种优选的实施方式，利用相同的限制性内切酶对融合基因和载体质粒同时进行双酶切，所述限制性内切酶为BamH I和EcoR I。

其中，在构建好的融合基因的上下游分别含有BamH I和EcoR I酶切位点。

优选地，所述融合基因(Lptn-CCL4)的浓度为80～120ng/μl，优选为100ng/μl。

在进一步优选的实施方式中，所述载体质粒为普通过表达质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体中的一种或多种，优选为慢病毒载体。

其中，慢病毒载体是指在人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)基础上改造而成的，能利用逆转录酶和整合酶将目的RNA转变为DNA并整合到宿主细胞的染色体中，从而使目的基因在宿主细胞中长期而稳定的表达。慢病毒与逆转录病毒相比，对分裂细胞(无核膜)和非分裂细胞(有核膜)均具有转导能力，慢病毒的整合前复合体能通过ATP依赖的核孔复合体进入细胞核，从而能稳定且高效的转导各种哺乳动物细胞系和原代细胞。

本发明人研究发现，利用慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。

在更进一步优选的实施方式中，所述慢病毒载体选自pLVX、pCDH和pLNCX中的一种，优选为pCDH。

优选地，所述慢病毒载体质粒为pCDH-EF1。

其中，所述慢病毒载体质粒pCDH-EF1为市购可得，优选购自Addgene。

更优选地，将融合基因和载体质粒的酶切产物经电泳鉴定正确后，进行回收。

其中，所述酶切产物回收采用现有技术中常用的试剂盒进行回收。

步骤1-3，将酶切产物经过连接、转化、培养及筛选后获得重组质粒。

在本发明中，将回收的酶切产物加入T4DNA连接酶连接，于4℃连接过夜，转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，然后取80～120μL菌液涂布至含有氨苄抗性的固体LB培养基上，于37℃过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR检测，然后对检测阳性的阳性克隆送样测序，与NCBI-BLAST数据库序列进行比对，对测序结果正确的克隆进行质粒提取，获得含有融合基因的重组质粒。

步骤2，制备携带上述基因的重组病毒。

在本发明中，优选为制备携带上述Lptn-CCL4基因的重组慢病毒，其中，所述步骤2包括以下子步骤：

步骤2-1，对包装细胞进行预处理和培养。

根据本发明一种优选的实施方式，所述包装细胞为293T细胞。

其中，所述293T细胞是由293细胞派生、表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白，或是用以包装病毒。

在进一步优选的实施方式中，所述预处理包括对包装细胞进行解冻、离心和加入培养基重悬。

其中，所述293T细胞(包装细胞)一般于液氮中冻存。

根据本发明一种优选的实施方式，所述解冻为将冻存的包装细胞迅速置于37℃水浴中直至冰块消失。

在进一步优选的实施方式中，所述离心为将解冻的包装细胞逐滴加入含有预热的培养基的离心管中，然后进行离心，弃上清。

在更进一步优选的实施方式中，所述离心的转速为1000～1500rpm，离心时间为2～5min，

优选地，所述离心的转速为1100～1400rpm，离心时间为2～4min，更优选地，所述离心的转速为1200rpm，离心时间为3min。

根据本发明一种优选的实施方式，所述离心管中加入的预热培养基和进行细胞重悬的培养基相同，其组成为：10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM。

其中，所述FBS为胎牛血清，所述DMEM是一种含有各种氨基酸和葡萄糖的培养基，广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养以及单一细胞培养。

在进一步优选的实施方式中，将重悬的细胞接种在培养皿中，在37℃、5％CO₂饱和湿度下培养。

其中，所述培养皿优选为直径为150mm的培养皿。

在更进一步优选的实施方式中，所述培养为悬浮培养和/或贴壁培养，优选为贴壁培养。

根据本发明一种优选的实施方式，在包装细胞的培养过程中，当细胞汇合度达到90％以上时，进行传代培养。

其中，所述传代培养按照以下步骤进行：将旧培养基弃掉，加入灭菌PBS溶液(磷酸盐缓冲液)洗涤包装细胞，而后弃去，再加入0.25％Trypsin-EDTA消化液，消化1～2min直至细胞完全消化；然后加入含血清的培养基终止消化，并将细胞悬液进行离心，优选1200rpm离心3min，将离心所得细胞用培养基重悬，所用培养基组成与预热培养基的组成相同。

在进一步优选的实施方式中，在培养皿中接种传代培养后的包装细胞，以用于包装慢病毒，每个培养皿中的接种量为1.0×10⁷～1.5×10⁷个细胞，优选为1.2×10⁷个细胞；

每个培养皿中加入的培养基的量为15～25ml，优选为20ml。

其中，所述培养基的组成与预热培养基的组成相同。

将接种传代培养细胞的培养皿置于37℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养。

步骤2-2，包装重组病毒。

其中，所述步骤2-2包括以下子步骤：

步骤2-2-1，在转染前，将步骤2-1中获得的包装细胞更换培养基。

根据本发明一种优选的实施方式，在转染前1～3小时，优选2小时，将步骤2-1中获得的包装细胞的培养基进行更换。

在进一步优选的实施方式中，所述更换的培养基为DMEM培养基，所述更换的培养基的体积为15～25ml，优选为16～22ml，如18ml。

步骤2-2-2，向容器中加入培养基，然后再加入包装质粒、包膜质粒和目的质粒。

根据本发明一种优选的实施方式，所述向容器中加入的培养基为预热的DMEM培养基，所述加入的培养基的体积为1～2ml，优选为1ml。

其中，所述容器为经过灭菌的容器，如离心管。

在本发明中，优选选择第二代三质粒慢病毒包装系统，主要是由于其包装出的慢病毒滴度高，适合于本发明中重组间充质干细胞的制备要求。

在进一步优选的实施方式中，所述包装质粒为PSPAX和/或PCMV-dR8.91，所述包膜质粒为PMD.2G和/或PCMV-VSV-G；

优选地，所述包装质粒为PSPAX，所述包膜质粒为PMD.2G。

其中，所述目的质粒为步骤1中制备得到的含有融合基因的重组质粒。

在更进一步优选的实施方式中，所述包装质粒、包膜质粒和目的质粒的质量比为1:2:3。

所选质粒质量配比系统能够高效的生产获得高滴度的慢病毒颗粒，同时能够最大的节省质粒用量。

在本发明中，将上述质粒混合后，吹打混匀。

步骤2-2-3，向另一容器中加入培养基和转染试剂，并将此容器中的混合物加入步骤2-2-2的容器中，形成DNA-转染试剂复合物。

其中，所述容器为经过灭菌的容器，如离心管。

根据本发明一种优选的实施方式，所述加入的培养基为预热的DMEM培养基，所述加入的培养基的体积为1～2ml，优选为1ml。

在进一步优选的实施方式中，所述转染试剂为磷酸钙、聚醚酰亚胺(PEI)、脂质体转染试剂(Lipofectamin2000/3000/LTX)，优选为聚醚酰亚胺。

本发明人研究发现，采用磷酸钙作为转染试剂，需要加入血清来降低磷酸钙对细胞的毒性，其受培养基pH的影响非常大，在试剂使用时对溶液配制及操作要求很高，且包装效率较低。

而采用聚醚酰亚胺(PEI)作为转染试剂，包装成本低且效率高，方法简单，对细胞毒性低，适于大规模使用。

在更进一步优选的实施方式中，所述加入的转染试剂与DMEM的体积比为(130～200)：1000，优选为(150～180)：1000，更优选为162:1000。

本发明人研究发现，当加入的转染试剂与DMEM的体积比为(130～200)：1000，优选为(150～180)：1000，更优选为162:1000时，转染试剂能够更好的与质粒交联，同时也能够最大限度的降低转染试剂对细胞的毒性。

根据本发明一种优选的实施方式，在将转染试剂和培养基的混合物加入步骤2-2-2的容器中之前，先将两个容器在室温下温育培养3～7min，优选为5min。

在进一步优选的实施方式中，将转染试剂和培养基的混合物成滴加入步骤2-2-2容器中，混合均匀后，室温孵育8～12min，优选为10min。

其中，经过混合后，形成DNA-转染试剂复合物。

步骤2-2-4，将步骤2-2-3中的DNA-转染试剂复合物加入步骤2-2-1处理的包装细胞中进行转染，然后培养。

根据本发明一种优选的实施方式，所述转染为瞬时转染，在转染时，所述包装细胞的汇合度为60～90％。

本发明人研究发现，当包装细胞的汇合度过大时(大于90％)，细胞会在病毒收集前因为接触抑制而大量死亡，不易包装成功；当包装细胞的汇合度过小时(小于60％)，细胞量过少，会导致有些质粒接触不到细胞，也不容易包装成功。

在进一步优选的实施方式中，将转染后的体系置于37℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养。

步骤2-2-5，培养一段时间后，弃除步骤2-2-4中的培养基，更换新的培养基，然后继续培养。

根据本发明一种优选的实施方式，在培养6～8h后更换新的培养基，所述新的培养基为预热的含有5％FBS的DMEM培养基，然后继续于37℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养。

在进一步优选的实施方式中，所述每个培养皿中加入的培养基为18～22ml，优选为20ml。

步骤2-2-6，在更换新的培养基后，收集上清液存储。

其中，在更换新的培养基24h和48h后，分别收集上清液存储于4℃中，同时更换新鲜培养基，所述新鲜培养基的组成与添加量与步骤2-2-5中更换的新培养基相同。

步骤2-3，对上述包装的重组病毒进行收集、过滤和浓缩处理。

根据本发明一种优选的实施方式，所述收集为将收集存储的上清液于2000～5000rpm下进行离心，所述离心时间为10～20min，

优选地，所述离心的转速为3000～4000rpm，离心时间为12～18min，

更优选地，所述离心的转速为3500rpm，离心时间为15min。

本发明人发现，离心收集到的重组病毒粗品含有的杂质较多，需要过滤以除去其中的细胞杂质，以保证后续应用的有效性和安全性。

根据本发明一种优选的实施方式，所述过滤为采用过滤膜过滤以出去细胞杂质，所述滤膜的孔径为0.40～0.50μm，优选为0.45μm。

根据本发明一种优选的实施方式，所述浓缩为将过滤后的重组病毒与5×聚乙二醇(PEG)混匀，静置后，离心，弃上清，再将沉淀进行重悬。

在进一步优选的实施方式中，所述静置为在4℃下静置24小时；

所述离心为在4℃下离心，转速为2000～4000rpm，优选为3000rpm，时间为20～40min，优选为30min。

在更进一步优选的实施方式中，采用DMEM培养基对沉淀进行重悬。

步骤2-4，对重组病毒进行滴度测定。

其中，所述滴度是稀释度的倒数，病毒滴度即病毒悬液的浓度，就是指pfu的数值。

在本发明中，所述重组病毒的滴度测定按照以下步骤进行：

(1)在滴度测定前24h，在6孔板每孔中接种1×10⁶个293T细胞，加入无抗生素的293T培养基(10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM)，于37℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养过夜；

(2)24h后加入步骤2-3中获得的重组病毒，按梯度为0μl、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl和0.5μl分别加入6个孔中，24h后换液，继续培养48h后加入0.25％Trypsin-EDTA消化液对6孔板中的细胞进行消化；

(3)通过流式细胞分析仪分析测定GFP(绿色荧光蛋白)细胞的表达阳性率。

在本发明中，重组病毒(重组慢病毒)的滴度在10⁸TU/ml以上，即为可进行转导的病毒。

步骤3，制备得到重组间充质干细胞。

所述步骤3包括以下子步骤：

步骤3-1，获得间充质干细胞。

其中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，采用脐带组织块爬片法分离间充质干细胞，按照以下步骤进行：

将正常分娩的人离体脐带放入PBS缓冲液(含有200U/ml青霉素和200U/ml链霉素)中，用注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，再将小块脐带组织用200目滤网过滤，收集滤网上的脐带组织块，去掉过小的脐带组织块，获得直径为1～1.5mm的组织块；将组织块直接接种在培养瓶中，放置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中，静置1～2小时；待组织块贴壁牢固后，添加含10％胎牛血清的α-MEM培养液，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养，待脐带组织间充质干细胞增生至铺满培养瓶的约80％时，加入0.25％胰蛋白酶(含0.01％EDTA)消化，得到原代细胞。

脐带组织块爬片法分离培养MSC，72h后在脐带组织周围有少量细胞爬出，约7天后，细胞游离出组织，并逐渐形成克隆。

选择P3代细胞，用0.05％胰蛋白酶消化，PBS洗两遍后分别用小鼠抗人CD11b-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-FITC及CD19-FITC抗体标记5×10⁵个间充质干细胞，室温避光放置30min，再用PBS洗两遍后，4％多聚甲醛固定，进行流式细胞仪检测细胞表面标志物。鉴定合格的细胞冻存于液氮罐中，用时复苏并做后期处理。

步骤3-2，将制备的重组病毒转导至间充质干细胞，制备得到重组间充质干细胞。

其中，所述步骤3-2包括以下子步骤：

步骤3-2-1，复苏预先冻存的间充质干细胞。

其中，复苏预先冻存的P3代间充质干细胞至培养皿中，所述培养皿的直径优选为150mm，加入20ml无血清培养基37℃、5％CO₂饱和湿度培养；待复苏细胞长满后，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化。细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用MSC无血清培养基重悬，所述MSC无血清培养基为市售可得，优选购自Bioind。

步骤3-2-2，将间充质干细胞接种至培养皿中，再加入步骤2中制备的重组病毒，进行培养。

根据本发明一种优选的实施方式，每个培养皿中接种间充质干细胞的数量为2～2.5×10⁶个。

在进一步优选的实施方式中，在接种24h后更换新培养基，所述更换的培养基为无血清的α-MEM培养基。

在更进一步优选的实施方式中，在更换培养基的培养皿中加入聚凝胺，所述聚凝胺的终浓度为8ug/ml。

根据本发明一种优选的实施方式，所述加入的重组病毒的滴度大于10⁸TU/ml，所述重组病毒按照感染复数MOIs为30～50加入培养皿中。

优选地，所述感染复数为35～45，优选为40。

其中，所述感染复数MOI指的是转导时病毒与细胞数量的比值。本发明人研究发现，当MOI大于50时，会造成重组病毒的浪费；当MOI小于30时，转导效率较低。

在进一步优选的实施方式中，所述培养为在37℃、5％CO₂饱和湿度下培养6～8小时，然后弃掉含有重组病毒的α-MEM培养基，更换为无血清培养基，再于37℃、5％CO₂饱和湿度下继续培养48～72小时。

步骤3-2-3，待细胞长满，经过消化、离心、重悬和传代培养，获得重组间充质干细胞。

其中，在经过转导后的细胞长满后，加入0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，然后将细胞悬液在800rpm离心5min，将离心所得的细胞用无血清培养基重悬，再按1:6的传代比例进行传代，最后于无血清培养基中37℃、5％CO₂饱和湿度下培养72h，获得重组间充质干细胞。

本发明的第三方面，提供了一种第二方面所述方法制备的重组间充质干细胞。

本发明的第四方面，提供了一种第一方面所述重组间充质干细胞或第二方面所述方法制备的重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为实体瘤，包括但不限于黑色素瘤、肺癌或肝癌。

根据本发明一种优选的实施方式，所述重组间充质干细胞可以提高趋化因子的分泌量，实现肿瘤内部高浸润淋巴细胞。

在进一步优选的实施方式中，所述重组间充质干细胞可以提高Lptn和CCL4因子的分泌量。

在更进一步优选的实施方式中，所述重组间充质干细胞还可以与PD1抗体联用治疗黑色素瘤，

所述重组间充质干细胞与PD1抗体联用能够抑制黑色素瘤的增殖，和/或增加瘤内浸润淋巴细胞含量。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1获得Lptn-CCL4融合基因及其重组质粒

(1)根据Genebank中的人源Lptn基因序列，由中美泰和生物技术(北京)有限公司全基因合成人源Lptn基因，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列。

根据Genebank中的人源CCL4基因序列，由中美泰和生物技术(北京)有限公司全基因合成人源CCL4基因，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示序列，其氨基酸序列为SEQ IDNO.8所示序列。

将上述人Lptn基因和人CCL4基因经由中美泰和生物技术(北京)有限公司全基因合成编码人Lptn-CCL4的DNA分子，上下游分别含有BamHI和EcoRI酶切位点，其中，Lptn和CCL4通过T2A序列(编码核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示序列，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列)连接，获得的Lptn-CCL4的DNA分子(即融合基因)的编码核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列一致，氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列一致。

(2)以100ng/μl为Lptn-CCL4的DNA为模板，用BamHI和EcoRI双酶切，将重组慢病毒载体质粒pCDH-EF1(购自Addgene)也用BamHI和EcoRI双酶切，酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，4℃连接过夜，转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，取100μL菌液涂布至含有氨苄抗性的固体LB板上，37℃过夜培养。挑取单克隆进行菌落PCR，将阳性克隆送样测序，保存测序结果正确的克隆并提取质粒，质粒示意图如图1所示。

其中，所述琼脂糖购自Biowest，DNA电泳marker购自天根生化科技(北京)有限公司，PCR扩增体系购自宝日医生物技术(北京)有限公司，DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，限制性内切酶BamHI和EcoRI购自NEB，T4DNA连接酶购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司，序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司公司进行。

实施例2制备携带Lptn-CCL4的重组慢病毒

(1)从液氮中取出1支冻存的293T细胞(购自ATCC)迅速放到37℃水浴中直至冰块消失，逐滴加入含有5ml预热培养基的15ml离心管中，1200rpm离心3min，弃上清，用293T培养基(10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM)重悬细胞接种至150mm培养皿中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养。培养过程中，待细胞汇合度达90％以上时，进行传代培养，弃去旧培养基，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞后弃去PBS溶液，加入2ml0.25％Trypsin-EDTA消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来；加入含血清的培养基终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min，离心所得细胞用培养基重悬。每个包被过的150mm培养皿细胞接种1.2×10⁷个细胞用于包装慢病毒，37℃、5％CO₂饱和湿度培养，20ml培养基/皿。

其中，293T培养基(10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM)来源于Gibco，PBS溶液购自Gibco，Trypsin-EDTA消化液购自Gibco。

(2)转染前2小时，将293T细胞培养基更换为18ml DMEM培养基，向A灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，按照1:2:3的质量比例加入包膜质粒PMD.2G、包装质粒PSPAX和实施例1中制备的重组质粒的混合物，吹打混匀；向B灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，然后加入162μl转染试剂PEI，混合均匀；A管和B管在室温下温育5min；将B管中的液体成滴的加入到A管中，混合均匀，室温孵育10min，以便形成DNA-转染试剂复合物。将DNA-转染试剂复合物转移至预先换液的293T细胞中，混匀，37℃、5％CO2饱和湿度培养。培养6-8h后吸弃含有转染混和物的培养基，每皿细胞加入20ml预热的含5％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO2饱和湿度培养。换液后分别在24h和48h收集上清液暂存储于4℃，并换20ml新鲜培养基。

其中，DMEM培养基购自Gibco，包膜质粒PMD.2G、包装质粒PSPAX购自Addgene，所述转染试剂PEI购自Polysciences，FBS购自Bioind。

(3)将上述收集的上清液4℃、3500rpm离心15min，弃沉淀，采用孔径为0.45μm的滤膜过滤。将过滤后的重组慢病毒与5X PEG混匀，4℃放置24小时后，4℃3000rpm离心30min，弃上清，将沉淀重悬至500μl DMEM培养基中。

(4)在滴度测定前24h，在6孔板每孔中接种1×10⁶个293T细胞，加入无抗生素的293T培养基(10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM)，于37℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养过夜；24h后加入步骤(3)中获得的重组慢病毒，按梯度为0μl、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl和0.5μl分别加入6个孔中，24h后换液，继续培养48h后加入0.25％Trypsin-EDTA消化液对6孔板中的细胞进行消化；通过流式细胞仪(型号为：BeckmanAS28118)分析测定GFP细胞的阳性率，结果表征慢病毒的滴度均在10⁸TU/ml以上，为可用慢病毒。

实施例3制备Lptn-CCL4修饰的间充质干细胞

(1)采用脐带组织块爬片法分离间充质干细胞，具体方法如下：将正常分娩的离体脐带放入含有200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的PBS缓冲液中，为保证脐带组织活性，新鲜脐带需在6h内分离完毕。用20mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm3大小的组织块，再将获得的小块脐带组织用200目滤网滤过，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm的多个脐带组织块。收集直径为1-1.5mm的组织块，将组织块直接接种在培养瓶中，直接放置于5％CO₂、37℃培养箱内，静置1-2h。待组织块贴壁比较牢固后，添加含10％胎牛血清的α-MEM培养液(购自Gibco)，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养瓶中脐带组织间充质干细胞增生铺满约80％；以0.25％胰蛋白酶(0.01％EDTA)消化，所得细胞为原代细胞。利用脐带组织块爬片法分离培养间充质干细胞，72h后在脐带组织周围有少量细胞爬出，约7天后，细胞游离出组织，并逐渐形成克隆。

选择P3代细胞，用0.05％胰蛋白酶消化，PBS洗两遍后分别用小鼠抗人CD11b-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-FITC及CD19-FITC抗体标记5×10⁵个间充质干细胞，室温避光放置30min，再用PBS洗两遍后，4％多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。鉴定合格的细胞冻存于液氮罐中，用时复苏并做后期处理。

其中，小鼠抗人CD11b-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-FITC及CD19-FITC抗体购自eBioscience，多聚甲醛购自国药集团。

(2)复苏预先冻存的P3代间充质干细胞至一个150mm培养皿，20ml无血清培养基37℃、5％CO₂饱和湿度培养。待复苏细胞长满后，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用间充质干细胞无血清培养基(购自Bioind)重悬。每个150mm培养皿细胞接种2×10⁶细胞，接种后的第二天吸取细胞的培养基弃掉，更换为无血清的α-MEM培养基，20ml培养基/皿，加入16μl聚凝胺Polybrene(购自Sigma)，按照40MOIs感染复数加入重组慢病毒(滴度为1×10⁸U/ml)，37℃、5％CO₂饱和湿度培养7h。7小时后弃掉含有病毒的α-MEM培养基(购自Gibco)，更换为无血清培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度继续培养3天。待细胞长满，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用无血清培养基重悬，按照1:6的传代比例进行传代，无血清培养基37℃、5％CO₂培养3天，获得重组间充质干细胞。

对比例

对比例1

本对比例所述细胞为仅通过是实施例3步骤(1)获得的间充质干细胞。

对比例2

本对比例所述制备方法与实施例3相似，区别在于，其制备的重组间充质干细胞为用慢病毒空载体(即不含Lptn-CCL4基因的慢病毒)转导得到。

实验例

实验例1

在100mm培养皿中，分别培养实施例3、对比例1和对比例2中制备的细胞，当细胞汇合度达到70％～80％时，吸弃原有间充质干细胞无血清培养基，加入10mlα-MEM培养基，于37℃、5％CO₂饱和湿度继续培养48h，收集三个样品细胞的上清液，于4℃保存备用。

用人源Lptn ELISA检测试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)和人源CCL4ELISA检测试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)按照说明书检测三个样品细胞Lptn和CCL4因子的分泌量，结果如图2所示。

由图2可知，与对比例1和对比例2相比，本发明实施例3制备的间充质干细胞分泌的Lptn和CCL4因子的浓度显著增加，经过48小时无血清培养富集后，实施例3制备的重组间充质干细胞分泌的Lptn和CCL4因子浓度均可达到1.5μg以上。

实验例2

(1)选取70只6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠(购自斯贝福(北京)生物科技有限公司)，随机分为7个组(记为：组1～组7)，每组10只小鼠。其中，组1为野生组，组2为对照组。

(2)鼠B16F10黑色素瘤为本实验室保存，复苏后用PBS清洗两遍，皮下注射至C57BL/6J小鼠，约2～3周待肿瘤长大后处死小鼠，剥离肿瘤，无菌条件下剪碎，用70目无菌细胞筛网轻轻研磨组织，将收集的细胞用PBS清洗、计数、离心，按1×10⁶个/100μl重悬，注射到组2～组7小鼠右腋皮下。

(3)组2～组7分别给予不同药物和细胞治疗，其中，组3为仅给予PD1抗体治疗，组4仅给予间充质干细胞治疗(对比例1中所述细胞)，组5给予间充质干细胞(对比例1中所述细胞)和PD1抗体治疗，组6仅给予实施例3制备的重组间充质干细胞治疗，组7给予实施例3制备的重组间充质干细胞与PD1抗体治疗。

其中，各组给药方式均为尾静脉注射，所有组均要求上午给药。

给药时间为：细胞要求每7天注射一次细胞，一共给予3次细胞；PD1抗体要求每周给予两次药物。

给药量：组2(对照组)，每只小鼠每次注射100μl生理盐水，腹腔注射；

细胞：每只小鼠每次注射量为1×10⁶细胞/100ul，每7天一次，尾静脉注射。

PD1抗体：药物作用浓度为50ug/鼠，每3-4天一次，尾静脉注射。

(3)自造模起，小鼠隔天称重。肿瘤长出后，每天用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，肿瘤体积计算方法为长度×宽度×宽度/2。造模第30天，小鼠全部脱颈处死，立即解剖，称量小鼠体重和肿瘤重量；

计算肿瘤生长抑制率，其计算方法为：

(1-药物治疗组肿瘤湿重均值/对照组肿瘤湿重均值)×100％。

组2～组7的肿瘤的生长抑制效果和肿瘤解剖结果分别如图3和4所示。

由图3可知，组7给予实施例3制备的重组间充质干细胞与PD1抗体联合的治疗方式，可显著抑制小鼠黑色素瘤的增殖，抑制效率高达50％，其他组无显著差异。

由图4可以看出，组7中的治疗方式使得小鼠黑色素瘤的体积显著减小。

实验例3

解剖实验例2中治疗后的组2～组7中的小鼠，称重取1g左右大小的肿瘤组织和完整的脾脏，用10ml注射器塞研磨并过70μm筛网，细胞悬液800g离心5分钟，去上清，然后根据小鼠脏器淋巴细胞分离试剂盒(购自天津灏洋生物科技有限公司)进行淋巴细胞分离，简单操作如下：将离心所得的细胞用样本稀释液重悬，然后将细胞悬液用样本分离液进行分离，800g离心20分钟，然后吸取白膜层，将分离得到的2×10⁶个肿瘤浸润淋巴细胞用PBS洗两次，转入流式管中，按照需求分别加入抗CD3、CD4、CD8和NK1.1小鼠流式抗体，按照抗体说明书给予抗体用量，用PBS将体系调整到100μl，室温避光孵育30min，孵育完成后用PBS洗两次，最后用400ul PBS重悬上机检测。调节性T细胞检测(Treg检测)根据小鼠Treg细胞染色试剂盒(购自eBioscience)进行标记。结果如图5和6所示。

由图5可知，组7中重组间充质干细胞和PD1抗体联用的治疗方式，能够显著增加肿瘤内部浸润淋巴细胞的含量。

由图6可知，虽然与野生组(组1)相比，接种肿瘤的老鼠在后期会明显耗竭外周组织中杀伤性T细胞的含量，但同时自然杀伤细胞的含量却明显上升，此时动物外周起免疫作用的细胞则主要为自然杀伤细胞，同时值得注意的是重组间充质干细胞和PD1抗体联用的治疗方式，能够显著增加外周脾脏中自然杀伤细胞的含量。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

序列表

<110> 北京双因生物科技有限公司

<120> 一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途

<130> 2019

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 675

<212> DNA

<213> Lptn-CCL4编码核苷酸序列(Homo sapiens)

<400> 1

atgagacttc tcatcctggc cctccttggc atctgctctc tcactgcata cattgtggaa 60

ggtgtaggga gtgaagtctc agataagagg acctgtgtga gcctcactac ccagcgactg 120

ccggttagca gaatcaagac ctacaccatc acggaaggct ccttgagagc agtaattttt 180

attaccaaac gtggcctaaa agtctgtgct gatccacaag ccacgtgggt gagagacgtg 240

gtcaggagca tggacaggaa atccaacacc agaaataaca tgatccagac caagccaaca 300

ggaacccagc aatcgaccaa tacagctgtg accctgactg gcgagggcag aggaagtctg 360

ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggacctatga agctctgcgt gactgtcctg 420

tctctcctca tgctagtagc tgccttctgc tctccagcgc tctcagcacc aatgggctca 480

gaccctccca ccgcctgctg cttttcttac accgcgagga agcttcctcg caactttgtg 540

gtagattact atgagaccag cagcctctgc tcccagccag ctgtggtatt ccaaaccaaa 600

agaagcaagc aagtctgtgc tgatcccagt gaatcctggg tccaggagta cgtgtatgac 660

ctggaactga actga 675

<210> 2

<211> 224

<212> PRT

<213> Lptn-CCL4氨基酸序列(Homo sapiens)

<400> 2

Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys

20 25 30

Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr

35 40 45

Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val

65 70 75 80

Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln

85 90 95

Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu

100 105 110

Thr Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

115 120 125

Asn Pro Gly Pro Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Met

130 135 140

Leu Val Ala Ala Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser

145 150 155 160

Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro

165 170 175

Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln

180 185 190

Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys Gln Val Cys Ala Asp

195 200 205

Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn

210 215 220

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> T2A编码核苷酸序列(人工序列)

<400> 3

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acct 54

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> T2A氨基酸序列(人工序列)

<400> 4

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 5

<211> 342

<212> DNA

<213> Lptn编码核苷酸序列(Homo sapiens)

<400> 5

atgagacttc tcatcctggc cctccttggc atctgctctc tcactgcata cattgtggaa 60

ggtgtaggga gtgaagtctc agataagagg acctgtgtga gcctcactac ccagcgactg 120

ccggttagca gaatcaagac ctacaccatc acggaaggct ccttgagagc agtaattttt 180

attaccaaac gtggcctaaa agtctgtgct gatccacaag ccacgtgggt gagagacgtg 240

gtcaggagca tggacaggaa atccaacacc agaaataaca tgatccagac caagccaaca 300

ggaacccagc aatcgaccaa tacagctgtg accctgactg gc 342

<210> 6

<211> 114

<212> PRT

<213> Lptn氨基酸序列(Homo sapiens)

<400> 6

Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys

20 25 30

Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr

35 40 45

Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val

65 70 75 80

Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln

85 90 95

Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu

100 105 110

Thr Gly

<210> 7

<211> 279

<212> DNA

<213> CCL4编码核苷酸序列(Homo sapiens)

<400> 7

atgaagctct gcgtgactgt cctgtctctc ctcatgctag tagctgcctt ctgctctcca 60

gcgctctcag caccaatggg ctcagaccct cccaccgcct gctgcttttc ttacaccgcg 120

aggaagcttc ctcgcaactt tgtggtagat tactatgaga ccagcagcct ctgctcccag 180

ccagctgtgg tattccaaac caaaagaagc aagcaagtct gtgctgatcc cagtgaatcc 240

tgggtccagg agtacgtgta tgacctggaa ctgaactga 279

<210> 8

<211> 92

<212> PRT

<213> CCL4氨基酸序列(Homo sapiens)

<400> 8

Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Met Leu Val Ala Ala

1 5 10 15

Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr

20 25 30

Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val

35 40 45

Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val

50 55 60

Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser

65 70 75 80

Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn

85 90

Claims

1.一种重组间充质干细胞，其特征在于，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到；

所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；

所述趋化因子为CCL4和Lptn；

所述CCL4基因和Lptn基因以Lptn-T2A-CCL4融合基因的形式修饰间充质干细胞；

所述Lptn-T2A-CCL4融合基因的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤2，制备携带上述基因的重组病毒；

步骤3，制备得到重组间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

步骤1中，所述用于修饰间充质干细胞的基因为趋化因子融合基因，

所述步骤1包括以下子步骤：

步骤1-1，获取融合基因的各个基因片段，进行连接，获得融合基因；

步骤1-2，将融合基因和载体质粒均进行双酶切，并回收酶切产物；

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2包括以下子步骤：

步骤2-1，对包装细胞进行预处理和培养；

步骤2-2，包装重组病毒；

步骤2-3，对上述包装的重组病毒进行收集、过滤和浓缩处理；

步骤2-4，对重组病毒进行滴度测定；

其中，步骤2-1中，所述包装细胞为293T细胞。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3包括以下子步骤：

步骤3-1，获得间充质干细胞；

步骤3-2，将制备的重组病毒转导至间充质干细胞，制备得到重组间充质干细胞；

步骤3-2包括以下子步骤：

步骤3-2-1，复苏预先冻存的间充质干细胞；

步骤3-2-2，将间充质干细胞接种至培养皿中，再加入步骤2中制备的重组病毒，进行培养；

6.一种权利要求1所述的重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤、肺癌或肝癌。