CN110218742B - 一种病毒感染细胞用试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于基因工程技术领域的一种病毒感染细胞用试剂及其应用。所述病毒感染细胞用试剂，包括硝酸丁康唑、地西他滨和丁酸钠中的两种或三种。利用所述试剂，慢病毒感染原代T细胞的效率可达80％以上，要远高于现有方法。同时，采用CAR‑T的载体，通过这种技术获得的CAR‑T细胞增殖能力不受影响，对特异性肿瘤的杀伤能力也不受影响。

Description

一种病毒感染细胞用试剂及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种病毒感染细胞用试剂及其应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是通过恢复免疫系统的抗肿瘤免疫应答能力从而实现利用免疫系统来治疗癌症的一种治疗方法，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。当前的嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)以及T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞(TCR-T)作为过继性细胞回输治疗技术两大最新的免疫细胞技术，被认为是肿瘤的过继性细胞免疫疗法中最有前景的治疗方式之一。
T细胞过继性细胞回输治疗技术原理如下：识别黑色素瘤相关抗原的重组TCR和嵌合抗原受体(CAR)的基因序列被包装进病毒载体中，通过病毒感染可以实现TCR/CAR在T细胞上的表达，通过将基因工程编辑的T细胞(表达活性的TCR/CAR分子)扩增和回输进患者体内以达到治疗肿瘤的目的。CAR-T/TCR-T疗法要求对病人的效应T细胞在体外进行基因编辑和扩增，这些细胞将具有特异识别和杀伤肿瘤细胞的能力，通过T细胞回输实现治疗肿瘤的目的。如何实现T细胞CAR/TCR分子的高效表达是此过程十分关键的步骤之一，因而传递CAR/TCR基因载体的设计显得尤为重要。常用的载体有病毒载体和非病毒载体(Non-ViralVectors)，非病毒载体虽然较病毒载体在免疫原性等方面有优势，但是其不仅要克服细胞内及细胞外的屏障，还要克服许多来自提高转染效率的挑战，其次由于没有通用的传送手段，目前可行性非常低，而病毒载体在实现基因转导和表达的效率方面有着绝对的优势，也是目前基因治疗的主流载体。
T细胞由于其本身的生物特性使其进行病毒感染实现外源基因表达的效率非常低，基于不断研究，越来越多的研发工作需要对原代T细胞进行基因编辑，目前国际上也没有十分成熟的产品可以高效感染原代T细胞并保证操作简单，这严重限制和阻碍了相关研究工作的开展。
发明内容
为此，本发明的目的在于克服现有技术中感染T细胞效率差、操作复杂的缺点，提供一种感染T细胞用感染试剂及其应用。
一种病毒感染细胞用试剂，包括硝酸丁康唑、地西他滨和丁酸钠中的两种或三种。
上述试剂中，所述硝酸丁康唑的用量为1-20μg/ml、地西他滨的用量为1-30μg/ml和丁酸钠的用量为1-15mM/L。
上述试剂中，优选的，所述硝酸丁康唑的用量为2.5-15μg/ml、地西他滨的用量为5-25μg/ml和丁酸钠的用量为3-6mM/L。
上述试剂中，还包括聚凝胺。
上述试剂中，所述聚凝胺的用量为5-10μg/ml。
一种病毒感染细胞用试剂盒，包括上述试剂。
一种上述试剂或上述试剂盒在病毒感染细胞中的应用。
上述应用中，硝酸丁康唑在病毒感染细胞前10-30min加入细胞培养液，地西他滨和/或丁酸钠在病毒感染时加入培养液。
上述应用中，所述病毒为慢病毒或重组慢病毒，所述细胞为T细胞。
上述应用中，添加辅助感染试剂，所述辅助感染试剂为聚凝胺，感染复数为40-80MOIs；离心感染，离心条件为：温度为4-32℃，转速为800-2000g，时间为1-2h。
本发明具有以下优点及突出的技术效果：
(1)利用本发明的感染T细胞用感染试剂进行T细胞感染，对于原代T细胞的感染效率可达80％以上，要远高于现有方法。同时，采用CAR-T的载体，通过这种技术获得的CAR-T细胞增殖能力不受影响，对特异性肿瘤的杀伤能力也不受影响。
附图说明
图1不同感染复数的EGFP病毒对原代T细胞的感染效率；
图2不同离心条件对原代T细胞的感染效率；
其中，a、b、c、d代表不同字母代表不同组之间的差异显著性，即字母相同无差异，字母不同有差异。
图3不同化合物添加进行感染后T细胞表达EGFP的情况。
图4不同组合化合物对新鲜来源的原代T细胞的感染效率影响。
图5不同组合化合物对冻存复苏的原代T细胞的感染效率影响。
图6抗CD19嵌合抗原受体T细胞以及EGFP修饰T细胞在5:1效靶比时不同杀伤时间对CD19高表达靶细胞Raji的杀伤效果。
图7抗CD19嵌合抗原受体T细胞以及EGFP修饰T细胞在4h时不同效靶比对CD19高表达靶细胞Raji的杀伤效果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
实施例1原代T细胞的扩增
采用本公司之前专利(申请号201810090357.1)扩增技术。简单如下：
1、活化培养瓶：向培养瓶中加入活化剂至覆盖瓶底，向75cm2细胞培养瓶中加入10mL活化剂即充满瓶底，4℃孵育12h，得活化培养瓶，所述活化剂由CD3单克隆抗体和IFN-γ溶于PBS缓冲溶液(pH7.35～7.45)配制而成，CD3单克隆抗体浓度为50μg/mL，IFN-γ浓度为2000U/mL；
2、配制活化培养基：向44mL基础培养基中加入5mL自体血浆和1mL的CIK细胞激活剂，得活化培养基，其中所述的CIK细胞激活剂由IL-2、IL-1α和IFN-γ溶于PBS缓冲溶液配制而成，IL-2浓度为50000U/mL，IL-1α浓度为50000U/mL，IFN-γ的浓度为100000U/mL，其中自体血浆为取抗凝外周血以2000rpm/min离心20min后分离收集血浆，并56℃灭活30min，1500rpm/min离心10min所得；
3、分离并接种单个核细胞：首先，分离外周血或脐血中的单个核细胞：取抗凝外周血50～100mL，2000rpm/min离心20min，分离收集血浆，56℃灭活30min，并1500rpm/min离心10min，得自体血浆，用于配制活化培养基；另向去掉血浆的血液中添加1～1.5倍血浆体积的无菌PBS稀释血液，用FicollPaque(购于北京百奥莱博科技有限公司，产品编号BTN131136)分离外周血单个核细胞(PBMCs)，得单个核细胞。然后，以步骤②配制的活化培养基重悬单个核细胞，控制接种密度为1×106个/mL，接种于步骤①处理的活化培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱中培养72h，得原代T细胞，接种之前可用PBS缓冲溶液轻轻冲洗活化培养瓶1-2次；
实施例2、携带CAR基因序列的慢病毒生产的过程
1、293T细胞准备：
从液氮中取出1支冻存的293T细胞(购自ATCC)迅速放到37℃水浴中直至冰块消失，逐滴加入含有5ml预热培养基的15ml离心管中，1200rpm离心3min，弃上清，用293T培养基(10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM)重悬细胞接种至150mm培养皿中，37℃、5％CO2饱和湿度培养。
培养过程中，待细胞汇合度达90％以上时，进行传代培养，弃去旧培养基，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞后弃去PBS溶液，加入2ml 0.25％Trypsin-EDTA消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。加入含血清的培养基终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min，离心所得细胞用培养基重悬。每个包被过的150mm培养皿细胞接种1.2×107细胞用于包装慢病毒，37℃、5％CO2饱和湿度培养，20ml培养基/皿。
2、转染293T细胞：
转染前2小时，将293T细胞培养基更换为18ml DMEM培养基，向A灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，按照质量比例1:2:3(总量54ug)加入包装质粒混合物，吹打混匀。向B灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，然后加入162μl转染试剂PEI，混合均匀。A管和B管在室温下温育5min。将B管中的液体成滴的加入到A管中，混合均匀，室温孵育10min，以便形成DNA-转染试剂复合物。
将DNA-转染试剂复合物转移至预先换液的293T细胞中，混匀，37℃、5％CO2饱和湿度培养。培养6-8h后吸弃含有转染混和物的培养基，每皿细胞加入20ml预热的含5％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO2饱和湿度培养。换液后分别在24h和48h收集上清液暂存储于4℃，并换20ml新鲜培养基。
转染后24h收集细胞在荧光显微镜下观察，得到的结果如图2所示。根据图2可知，PEI转染辅助质粒和pCDH-EF1-EGFP(表达绿色荧光蛋白EGFP)进入293T细胞24h后，99％以上的293T细胞均为阳性。
3、重组慢病毒收集与浓缩
将收集到的液体4℃、3500rpm离心15min，弃沉淀，将上清与5X PEG混匀，4℃放置24小时后，4℃3000rpm离心30min，弃上清，将沉淀重悬至500μl DMEM培养基中，进行病毒滴度测定。
4、重组慢病毒滴度测定
滴度测定前1天，在6孔板每孔中接种为1*106个293T细胞，加入2ml无抗生素的293T培养基，37℃、5％CO2饱和湿度过夜培养。次日加浓缩的病毒，梯度分别设为0μl(对照组)、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl和0.5μl，感染后的24小时换液。72h后消化6孔板中的细胞(方法同“细胞传代”)，通过流式分析测定GFP细胞的阳性率，结果表征慢病毒的滴度均在108TU/ml以上，为可用慢病毒(高滴度携带EGFP绿色荧光蛋白报告基因的慢病毒)。
携带抗CD19的嵌合抗原载体(Anti-CD19 CAR)的慢病毒生产方式同上。
实施例3不同感染复数的EGFP病毒对原代T细胞的感染效率
利用获得的高滴度携带EGFP绿色荧光蛋白报告基因的慢病毒颗粒对获得的原代T细胞进行感染，探索不同的感染方式和不同的病毒感染复数对原代T细胞的感染效率。
感染方式选择如下：(1)直接将病毒加入T细胞培养体系中进行一次感染；(2)直接将病毒加入T细胞培养体系中进行两次感染，即在一次感染后更换培养液，然后再进行一次感染。(3)4℃1000g离心1h；(4)32℃1000g离心1h。
病毒感染复数我们选择从0-100的MOI进行感染，分别是0、20、40、60、80和100MOIs。所有组在感染时均添加8μg/ml的polybrene作为辅助感染试剂。
根据图1结果可知，在我们的培养体系中，4℃和32℃两种离心的感染条件对原代T细胞的感染效率明显优于直接感染组的感染效率。同时，在感染复数60及以上已无明显的感染效率差异。
实施例4不同离心条件对原代T细胞的感染效率
利用获得的高滴度携带EGFP绿色荧光蛋白报告基因的慢病毒颗粒对获得的原代T细胞进行感染，进一步探索不同的离心感染条件和不同的病毒感染复数对原代T细胞的感染效率。
离心感染条件如下：(1)1000g 32℃离心2小时；(2)2000g 32℃离心2小时；(3)800g 32℃离心1小时。根据实施例3中的结果，将病毒感染复数进一步限定在40MOIs、60MOIs和80MOIs。所有组在感染时均添加8μg/ml的polybrene作为辅助感染试剂。
根据图2结果可知，不同离心条件对感染效率影响不大，但结合感染复数来看，在MOI为40时，选择1000g 32℃离心2小时即可达到与其它组相近的感染效率。
实施例5采用不同药物处理
在在MOI为40时，选择1000g 32℃离心2小时的基础上，通过一些组合化合物的方式来进一步提高原代T细胞的感染效率。
选择之前冻存的分离培养获得的第3天的原代细胞进行试验，将第三天的细胞进行复苏，然后在复苏第二天时，结合上述条件进行细胞感染，具体选择药物及浓度如下：硝酸丁康唑(Butoconazole nitrate，简写Bu)15μg/ml，地西他滨(Decitabine，简写De)10μg/ml，丁酸钠(Sodium butyrate，简写So)5mM/L，其中硝酸丁康唑在病毒感染原代T细胞前15分钟加入的T细胞的培养液中，然后等到病毒感染时再加入相应浓度的地西他滨和丁酸钠，同时，培养基中还需要添加8μg/ml的polybrene作为辅助感染试剂，然后采用40MOIs为感染复数，32℃1000g离心2小时为感染条件。
离心感染完成后，弃掉含有病毒颗粒和组合化合物的细胞上清，然后将离心所得细胞用新鲜的细胞培养基进行重悬并接种继续培养，在第11天时对细胞进行计数，用流式细胞仪检测T细胞表达EGFP的情况，结果如图3和表1所示。通过对不同组合化合物的筛选，最终确定的组合物可以将冻存复苏后的原代T细胞的感染效率提高到30％以上甚至是45％左右，且不影响T细胞的增殖。
在验证EGFP感染T细胞效率的同时，验证了转染效率最高的两组(Bu+De组和Bu+De+So组)的特异性的嵌合抗原T细胞的修饰载体(抗CD19的嵌合抗原载体)的感染效率，同时还对比了不同来源的原代T细胞(包含新鲜培养的外周血来源的T细胞和脐血来源的T细胞)的感染效果。通过图4和图5，我们可以看出，结合基础感染条件和组合化合物，将新鲜培养的脐血来源的原代T细胞的感染效率提高到70％以上，更重要的是可以将新鲜培养的外周血来源的原代T细胞的感染效率显著提高到85％甚至90％以上。
图3和图4来源于外周血单个核细胞，图3的细胞用的是冻存过的细胞，图4的细胞用的是新鲜分离外的细胞。图5用的细胞是来源于脐带血的单个核细胞细胞，图5中的drug-induction是指三种药物的组合物，即Bu+De+So，基础感染条件相同。
在上述基础的感染条件下，当将硝酸丁康唑10μg/ml，地西他滨5μg/ml，丁酸钠6mM/L组合使用，也可以得到上述类似结果。
表1不同药物对T细胞感染效率的影响及细胞增殖情况的影响
Figure BDA0002092898530000071
实施例6通过组合化合物诱导获得的抗CD19嵌合抗原受体T细胞对CD19高表达肿瘤的杀伤效率验证
利用组合化合物(Bu+De+So)诱导制备的抗CD19嵌合抗原受体T细胞体外抗肿瘤效果进行评价，包括以下步骤：
以淋巴系统表达CD19的细胞系Raji细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)作为靶细胞，分别用慢病毒载体anti CD19 CAR感染的T细胞(即，步骤五中制得抗WT1嵌合抗原受体T细胞)、感染普通EGFP的T细胞和未感染的T细胞制得效应细胞，将靶细胞按照密度10000个/ml接种96孔板，每孔100μl，按照1:1，5:1，10:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，同时加入CCK8(碧云天)试剂，置于5％CO2，37℃培养箱连续培养4h，期间在450nm波长下每隔1h连续读数，计算杀伤效率。图5和6为本发明的Anti CD19 CAR-T细胞、普通感染EGFP T细胞和未感染的T细胞对靶细胞Raji的杀伤效果示意图，如图6和图7所示，结果表明，通过该种方法得到的嵌合抗原受体T细胞对CD19阳性细胞具有很强且特异的杀伤作用，组合化合物不影响T细胞的效应能力。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种病毒感染细胞用试剂，其特征在于，包括硝酸布康唑、地西他滨和丁酸钠；所述硝酸布康唑的用量为1-20μg/ml、地西他滨的用量为1-30 μg /ml和丁酸钠的用量为1-15mM/L。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述硝酸布康唑的用量为2.5-15μg/ml、地西他滨的用量为5-25 μg /ml和丁酸钠的用量为3-6mM/L。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，还包括聚凝胺。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述聚凝胺的用量为5-10μg /ml。
5.一种病毒感染细胞用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的试剂。
6.权利要求1-4任一项所述试剂或权利要求5所述试剂盒在病毒感染细胞中的应用；所述病毒为慢病毒；所述细胞为T细胞。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，硝酸布康唑在病毒感染细胞前10-30min加入细胞培养液，地西他滨和丁酸钠在病毒感染时加入培养液。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，添加辅助感染试剂，所述辅助感染试剂为聚凝胺，感染复数为40-80 MOIs；离心感染，离心条件为：温度为4-32℃， 转速为800-2000g，时间为1-2h。
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