CN114540294A - 靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用 - Google Patents
靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114540294A CN114540294A CN202210245137.8A CN202210245137A CN114540294A CN 114540294 A CN114540294 A CN 114540294A CN 202210245137 A CN202210245137 A CN 202210245137A CN 114540294 A CN114540294 A CN 114540294A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- exosome
- cells
- supernatant
- cell
- culturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 116
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 49
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 82
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 24
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 50
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 27
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 18
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 17
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 16
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 16
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- NTHXOOBQLCIOLC-UHFFFAOYSA-N iohexol Chemical compound OCC(O)CN(C(=O)C)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NTHXOOBQLCIOLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960001025 iohexol Drugs 0.000 claims description 10
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 6
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 abstract description 21
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 230000010415 tropism Effects 0.000 abstract description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 5
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 5
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 5
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 5
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 description 5
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 5
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150066398 CXCR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- QSDMBPUDRLSHJR-UHFFFAOYSA-N OC1C(C(I)=CC=C2)=C2OC2=CC=CC=C12 Chemical compound OC1C(C(I)=CC=C2)=C2OC2=CC=CC=C12 QSDMBPUDRLSHJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，包括：S1，将质粒、Lentiviral Mix和转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；S2，制备目的蛋白高表达干细胞；S3，采用S2得到的干细胞培养提取外泌体；S4，取si‑Survivin与外泌体混合，进行电转，然后冰上孵育，即得到载有si‑Survivin的外泌体。本发明构建了具有高趋向性及高siRNA装载效率的外泌体，从而实现目的基因的沉默。改造后外泌体表面CXCR4蛋白大幅提高，表现出高趋向性及良好的肿瘤聚集效果，在体外和体内都表现出显著的抑制肿瘤细胞生长的效果且具有优良的生物安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医药技术领域，尤其是涉及一种可精准靶向肿瘤递送基因药物的干细胞外泌体的制备和应用。
背景技术
迄今为止，部分癌症仍然难以治愈。目前的治疗手段中，手术与放射治疗均不适用于广泛转移的患者。化疗通过注射药物进入血液循环以对抗全身癌细胞，但同时对正常细胞杀伤较大。近年来，应用靶向技术向肿瘤区域精确递送药物的“靶向治疗”和利用肿瘤特异的信号传导或特异代谢途径控制的“靶点治疗”获得越来越多的医生和学者的关注。提高载体的靶向性具有重大意义，近年来，间充质干细胞的特殊的“归巢性”引起关注，且MSCs广泛地分布于全身多种组织，如骨髓、脂肪组织、肝脏、胎盘、脐带血、脐带组织等，是良好的靶向载体。细胞归巢，最终归巢至骨髓，归巢至各个脏器，归巢至炎症及创伤部位，甚至归巢至肿瘤部位。研究表明，骨髓，血液和健康的组织和器官中都有它们的存在。简而言之，某些特定信号分子与MSCs膜上相应受体结合，共同驱动其归巢行为。移植的干细胞顺利归巢至微环境，这要求损伤部位的信号分子和MSCs表面受体相一致。参与归巢行为的小组成员很多，有诸如趋化因子、生长因子和黏附分子等。趋化因子主要负责由远及近。特定的组织分泌特定的趋化因子，并且通过趋化因子的浓度梯度，吸引带有趋化因子受体的细胞定向到达该组织。在损伤过程中，不同组织细胞能释放不同的化学趋化因子，这些趋化因子能促进MSCs迁移。
MSC治疗瓶颈在于MSCs有可能在一定程度上促进肿瘤转移，而外泌体无增增殖能力。基于间充质干细胞特殊“归巢性”及其较强的外泌体分泌能力，干细胞来源外泌体作为靶向治疗药物载体具有巨大潜力。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用。
根据本发明的一个方面，提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，包括：
S1，慢病毒液的制备：将质粒、Lentiviral Mix和转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；
S2，制备目的蛋白高表达干细胞：对干细胞进行培养，用S1收集的病毒液感染培养后的干细胞，再加入聚凝胺培养，然后筛选获得稳定感染的细胞株；
S3，采用S2得到的干细胞培养提取外泌体：将S2获得的细胞株培养后离心，所得上清液再加入缓冲层后进行第一次超速离心，收集靠近缓冲层的溶液；再将收集的溶液加入缓冲层后进行第二次超速离心，收集缓冲层中的颗粒，即得外泌体；
S4，制备装载siRNA的外泌体：取si-Survivin与上述S304所得外泌体混合，进行电转，然后冰上孵育，即得到载有si-Survivin的外泌体。
在本发明一些实施例中，所述S1，具体包括：
S101，在培养皿中接种293T细胞，待细胞融合度达到转染要求；
S102，将无血清培养基、质粒、慢病毒混合物和转染试剂混匀后放置室温，滴加到S101接种293T细胞的培养皿中培养过夜后吸弃上清，用PBS轻轻洗细胞，加入DMEM高糖培养基；
S103，将S102加入DMEM高糖培养基的293T细胞，继续培养一段时间后，离心，上清液使用滤器过滤后即为病毒液。
在本发明一些实施例中，所述S1，还包括以下一种或多种选择：
-S101中，接种的293T细胞为4×106-6×106个；
-S102中，采用0.5-5ml无血清培养基，质粒的量为5-15μg，Lentiviral Mix用量为5-20μg，转染试剂采用HG TransgeneTM Reagent，HG TransgeneTM Reagent用量为40-80μg；
-S102中，混匀后放置室温的时间为5-30min；
-S103中，在37℃，5％CO2培养一段时间后，4℃，500g-2000g离心，上清液使用0.45μm滤器过滤后即为病毒液。
在本发明一些实施例中，所述S2，具体包括：
S201，培养干细胞，培养后弃培养基；
S202，用S1中收集的病毒液感染培养后的干细胞，再加入聚凝胺，培养一段时间后，加嘌呤霉素筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。
在本发明一些实施例中，所述S2还包括以下一种或多种选择：
-所述干细胞为间充质干细胞第5-6代，所述干细胞生长密度为60％-70％；
-所述间充质干细胞的接种量为5×105，培养时间12-48h；
-所述病毒液感染细胞MOI值为50-400；
-所述聚凝胺的浓度为1-20μg/mL；
-所述嘌呤霉素的浓度为0.5-1μg/mL；
-所得到的干细胞表面目的蛋白表达量为原始干细胞的200-300倍。
在本发明一些实施例中，所述S3，具体包括：
S301，将S2获得的细胞株放入条件培养基培养，再将条件培养基放入离心管进行离心，沉淀为死细胞，丢弃沉淀，吸取上清，得到的上清液继续离心，沉淀为细胞碎片，丢弃沉淀，取上清；
S302，加入碘杂醇形成缓冲层，对S301所得上清进行第一次超速离心；
S303，经S302第一次超速离心后，外泌体迁移并浓缩到碘杂醇和上清液之间的界面层，收集靠近界面和缓冲层的部分；
S304，将S303收集到的液体加入PBS，放入含有碘化醇缓冲垫的离心管进行第二次超速离心，第二次超速离心后收集缓冲垫中所有颗粒，悬浮于无菌PBS中，即得到外泌体溶液。
在本发明一些实施例中，所述S3，还包括以下一种或多种选择：
-S301中，将条件培养基放入离心管进行离心，离心参数为：温度4℃，转速为2000g，时间为10-30min；
-S301中，得到的上清液继续离心，离心参数为：4℃，转速为10000g，时间为20-30min；
-S302中，所述碘杂醇与S301最终得到的上清液的体积比为(1-2):1000；所述碘杂醇的浓度为60％；
-S302中，第一次超速离心的转速为100000-120000g，离心时间总和为60-180min；所述第一次超速离心后提取到的分界层溶液体积为2-12ml；
-S304得到的外泌体溶液中，外泌体大小为100-180nm；所述第二次超速离心后得到的沉淀用0.5-2mlPBS冲悬。
在本发明一些实施例中，所述S4，还包括以下一种或多种选择：
-所述si-Survivin与外泌体的混合，其中两者质量比为1:2-20；
-所述si-Survivin与外泌体混合反应温度为0-4℃；
-所述电转采用脉冲波电转，脉冲时间为10-15ms；
-所述冰上孵育，时间为0.5-2h。
本发明的第二方面，提供一种干细胞外泌体，所述干细胞外泌体为上述的方法制备得到的载有si-Survivin的外泌体。
可选地，所述载有si-Survivin的外泌体表面有特征性蛋白CD9，CD63，CD81的表达，且有目的蛋白高效表达。
本发明的第三方面，提供一种上述干细胞外泌体在制备靶向肿瘤部位递送基因药物中的应用，所述肿瘤部位为肿瘤细胞所在部位，所述肿瘤细胞为A549肺癌细胞、MGC803胃癌细胞任一种。进一步的，外泌体的使用浓度15-80μg/ml，与肿瘤细胞共培养的浓度。
与现有技术相比，本发明实施例具有如下的有益效果：
本发明上述的干细胞外泌体及其制备方法，可以提高外泌体载药系统对肿瘤部位的抑制，是一种能精准靶向肿瘤递送基因药物的干细胞外泌体。
本发明上述的干细胞外泌体的制备方法，通过慢病毒转染改造外泌体来源细胞，从而建立趋向性更强的运载体系，利用外泌体特异性靶向肿瘤部位并促进癌细胞凋亡，用于癌症靶向治疗。
本发明上述的干细胞外泌体及其制备方法，特征蛋白是CD9，CD63，CD81，表面趋向因子是CXCR4，通过优选外泌体表面趋向因子CXCR4蛋白的过表达，本发明表面趋向因子CXCR4过表达的外泌体在进入细胞到达溶酶体后，在酸性条件下，si-Survivin被释放，释放后外泌体实现在溶酶体的逃逸。释放的si-Survivin降低肿瘤细胞内Survivin的表达，从而降低分裂增殖的能力，实现肿瘤部位细胞群体性的抑制，并降低细胞活性。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为CXCR4表达质粒；
图2为改造前后MSCs表面CXCR4蛋白流式检测；
图3为改造前后MSCs上清液所提取的外泌体扫描电镜图；
图4为改造前后MSCs上清液所提取的外泌体表面CXCR4蛋白流式检测；
图5为对肿瘤细胞的Survivin敲低效率；
图6为对肿瘤的体内治疗效果；
图7为采用流式细胞仪进行表面蛋白检测结果；
图8为外泌体制备及效果验证设计流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例中，所使用的主要材料和来源分别如下，没有说明的均可以直接市购获取：
无血清培养基、嘌呤霉素购自上海少辛生物有限公司；质粒、Lentiviral Mix(慢病毒包装所使用除目的基因质粒外其他质粒)直接购于吉满生物；si-Survivin购于生工生物工程有限公司；外泌体富集培养基(Opti prep购于Axis-Shield公司)；MSC购自生工生物；siRNA购自生工生物；A549肺癌细胞、MGC803胃癌细胞购自生工生物。
转染试剂可以采用市购的HG TransgeneTM Reagent；条件培养基可以采用干细胞培养基培养感染后MSC稳定细胞株4天后的培养基液体，也就是细胞上清液；干细胞培养基购于上海朴茂生物科技有限公司，MedGroTM serum-free culture medium kit。
图8为外泌体制备及效果验证设计流程图。通过慢病毒转染改造外泌体来源细胞，从而建立趋向性更强的运载体系，利用外泌体特异性靶向肿瘤部位并促进癌细胞凋亡，用于癌症靶向治疗。
实施例1
本实施例提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)慢病毒液的制备：在10cm培养皿中接种5×106个293T细胞，待细胞融合度达80％进行转染。取1.5ml EP管加入1ml无血清培养基，与10μg质粒、10μg Lentiviral Mix和60μg HG TransgeneTM Reagent混匀后放置室温20min，滴加到培养皿中培养过夜后，吸弃上清，PBS轻轻洗三遍细胞，加入新的DMEM完全培养基。换掉上清液，主要是为了除去多余的质粒、Lentiviral Mix和HG TransgeneTM Reagent。
对加入DMEM完全培养基的293T细胞继续培养，37℃，5％CO2培养48h后，4℃，500g离心5min。上清液使用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管即为病毒液。
(2)制备目的蛋白高表达干细胞：将MSC细胞以5×105接种于5cm细胞培养皿，培养24h后弃培养基；将步骤(1)得到的病毒液以MOI 100感染MSC细胞(间充质干细胞)，再加入polybrene(终浓度4μg/mL)37℃培养2天后加嘌呤霉素(0.5μg/mL)筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。接种的细胞数量与培养基大小成比例。
(3)外泌体提取：
S301，将获得的细胞株放入条件培养基培养，再将经过0.22um滤器过滤的200ml条件培养基转移至50ml离心管，离心，具体离心参数为：4℃，2000g，20min。离心后丢弃沉淀(沉淀为死细胞)，用移液枪吸取上清，注意在颗粒上方留下约半厘米的液体，防止吸取到沉淀。得到的上清液继续离心，具体离心参数为：4℃，10000g，30min。离心后丢弃沉淀(沉淀为细胞碎片)，取上清，此处颗粒不可见，吸取上清，余约半厘米液体。
S302，取一个或多个试管，在试管的底部加入400μl 60％碘杂醇(iodixanol)形成缓冲层。并加入3/4管S301最终所得上清，使用Beckman SW28转子，4℃，100000g，70min。
S303，经S302处理后，可以让试管内上清中的外泌体迁移，以便富集该管液体内外泌体，即外泌体迁移并浓缩到60％碘杂醇和外泌体富集培养基之间的界面层，收集1毫升靠近界面和缓冲层的部分。
S304，收集到的液体加入30mlPBS，倒入含有50μl 60％碘化醇缓冲垫的SW28管，离心，离心转速为100000g，离心时间为70min。离心后收集缓冲垫中所有颗粒，将收集的颗粒悬浮于1ml无菌PBS中，即得到外泌体溶液。
(4)制备装载siRNA的外泌体：取si-Survivin 4.8μg与上述S304所得外泌体溶液80μg混合，加入电转缓冲液至100μl，加入预冷30分钟的电转杯，使用脉冲波电转10-15ms，在冰上孵育1h，即可得到载有si-Survivin的外泌体。
实施例2
(1)慢病毒液的制备：在10cm培养皿中接种5×106个293T细胞，待细胞融合度达80％进行转染。取1.5ml EP管加入1ml无血清培养基，与10μg质粒、10μg Lentiviral Mix和60μg HG TransgeneTM Reagent混匀后放置室温20min，滴加到培养皿中培养过夜后换液。37℃，5％CO2培养48h后，4℃，500g离心5min。上清液使用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管即为病毒液。
(2)制备目的蛋白高表达干细胞：将MSC细胞以5×105接种于5cm细胞培养皿，24h弃培养基，将病毒液以MOI 80感染细胞，加入polybrene(终浓度4μg/mL)37℃培养2天后加嘌呤霉素(0.5μg/mL)筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。
(3)外泌体提取：
S301，将获得的细胞株放入条件培养基培养，再将经过0.22um滤器过滤的200ml条件培养基转移至50ml离心管，4℃，1000g，20min。丢弃沉淀(死细胞)，用移液枪吸取上清，注意在颗粒上方留下约半厘米的液体，防止吸取到沉淀。得到的上清液继续离心，4℃，10000g，30min。丢弃沉淀(细胞碎片)，取上清，此处颗粒不可见，吸取上清，余约半厘米液体。
S302，取一个或多个试管，在试管的底部加入200μl 60％碘杂醇(iodixanol)形成缓冲层。加入3/4管S301最终所得上清，使用Beckman SW28转子，4℃，120000g，60min。
S303，经S302处理后，外泌体迁移并浓缩到60％碘杂醇和外泌体富集培养基之间的界面层，收集1毫升靠近界面和缓冲层的部分。
S304，收集到的液体加入30mlPBS，加入含有50μl 60％碘化醇缓冲垫的SW28管，120000g，60min。收集缓冲垫中所有颗粒，悬浮于1ml无菌PBS中即可得到外泌体溶液。
(4)制备装载siRNA的外泌体：取si-Survivin 8μg与上述S304所得外泌体80μg混合，加入电转缓冲液至100μl，加入预冷30分钟的电转杯，使用脉冲波电转10-15ms，在冰上孵育1h，即可得到载有si-Survivin的外泌体。
实施例3
(1)慢病毒液的制备：在10cm培养皿中接种5×106个293T细胞，待细胞融合度达80％进行转染。取1.5ml EP管加入1ml无血清培养基，与10μg质粒、10μg Lentiviral Mix和60μg HG TransgeneTM Reagent混匀后放置室温20min，滴加到培养皿中培养过夜后换液。37℃，5％CO2培养48h后，4℃，500g离心5min。上清液使用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管即为病毒液。
(2)制备目的蛋白高表达干细胞：将MSC细胞以5×105接种于5cm细胞培养皿，24h弃培养基；将病毒液以MOI 100感染细胞，加入polybrene(终浓度4μg/mL)37℃培养2天后加嘌呤霉素(0.5μg/mL)筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。
(3)外泌体提取：
S301，将获得的细胞株放入条件培养基培养，再将经过0.22um滤器过滤的200ml条件培养基转移至50ml离心管，4℃，2000g，20min。丢弃沉淀(死细胞)，用移液枪吸取上清，注意在颗粒上方留下约半厘米的液体，防止吸取到沉淀。得到的上清液继续离心，4℃，10000g，30min。丢弃沉淀(细胞碎片)，取上清，此处颗粒不可见，吸取上清，余约半厘米液体。
S302，取一个或多个试管，在试管的底部加入400μl 60％碘杂醇(iodixanol)形成缓冲层。并加入S301最终所得上清，使用Beckman SW28转子，4℃，120000g，60min。
S303，经S302处理后，外泌体迁移并浓缩到60％碘杂醇和外泌体富集培养基之间的界面层，收集1毫升靠近界面和缓冲层的部分。
S304，收集到的液体加入30mlPBS，加入含有50μl 60％碘化醇缓冲垫的SW28管，120000g，60min。收集缓冲垫中所有颗粒，悬浮于1ml无菌PBS中即可得到外泌体溶液。
(4)制备装载siRNA的外泌体：取si-Survivin 8μg与上述S304所得外泌体80μg的比例混合，加入电转缓冲液至100μl，加入预冷30分钟的电转杯，使用脉冲波电转10-15ms，在冰上孵育1h，即可得到载有si-Survivin的外泌体。
对上述实施例得到的载有si-Survivin的外泌体，用NTA进行粒径大小的检测，并用TEM观察形态大小。利用流式细胞仪检测表面标志性蛋白CD81，CD63，CD9。粒径大小为100-1800nm，形态呈碗状，如图3所示。
通过流式细胞仪进行表面蛋白检测：
10μg外泌体与醛/硫酸胶乳珠共同孵化过夜，以1700rpm离心3分钟。然后吸出上清液，注意避免去除沉淀。用1毫升PBS洗涤下部沉淀物，将相应的流动抗体加入100ul沉淀悬液中，在室温下避光孵育15分钟。孵化后每管加入400ul PBS，以2000rpm离心3分钟。丢弃上清液，用400ul pbs清洗下部沉淀物，并转移到流式细胞仪上进行检测。结果用FlowJo进行分析。值得注意的是，当流式细胞仪用于检测外泌体表面蛋白时，CD63、CD81、CD9抗体购自ABGENT(美国)，CXCR4抗体来自Abcam。结果为normal exo和CXCR4high Exo的流式检测结果，结果显示CD63，CD81，CD9都有表达，证明都是外泌体。如图7所示。
基于上述实施例得到的干细胞外泌体，以下对其在在制备靶向肿瘤部位递送基因药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
一、对A549肺癌细胞的共培养及皮下瘤的治疗
A549细胞汇合度控制在60-70％，在加入上述实施例得到的载有si-Survivin的外泌体前，先对A549细胞进行换液，换上新的培养液后，按20μg/ml载有si-Survivin的外泌体加入到培养液中，24小时后进行活性检测。当小鼠模型皮下瘤体积到达100mm3后，进行治疗，按2g/kg对小鼠进行尾静脉注射，每7天注射一次，治疗3周。与其余实验组组对照可得CXCR4高表达的外泌体具有更强的抗肿瘤效果。
二、对MGC803胃癌细胞的共培养及皮下瘤的治疗
MGC803细胞汇合度控制在60-70％，在加入运载siRNA的CXCR4高表达外泌体前，先对MGC803细胞进行换液，换上新的培养液后，按20μg/ml运载siRNA的CXCR4高表达外泌体加入到培养液中，24小时后进行活性检测。当小鼠模型皮下瘤体积到达100mm3后，进行治疗，按2g/kg对小鼠进行尾静脉注射，每7天注射一次，治疗3周。与其余实验组组对照可得CXCR4高表达的外泌体具有更强的抗肿瘤效果。
图1为CXCR4表达质粒；图中质粒具备CXCR4基因序列以及GFP荧光蛋白，有利于后续外泌体在细胞内的定位，实现外泌体在细胞内的可视化。
图2为改造前后MSCs表面CXCR4蛋白流式检测；图中改造(包括前期慢病毒感染以及后续si-Survivin加载)后MSC表面CXCR4蛋白表达为1000左右，普通MSC细胞为10左右，说明通过慢病毒感染MSC获得良好效果。左图为改造前，右图为改造后，左图峰值所对应横坐标为10左右，右图峰值为1000，倍数为100倍左右。
图3为改造前后MSCs上清液所提取的外泌体扫描电镜图；图中改造前后外泌体大小体积相近，说明改造MSC不会造成其释放的外泌体形态等改变。上方图片为不同放大倍数电镜下的改造前MSCs所产生外泌体，上方图片为不同放大倍数电镜下的改造后MSCs所产生外泌体。
图4为改造前后MSCs上清液所提取的外泌体表面CXCR4蛋白流式检测；图中改造后外泌体表面CXCR4表达约为80，普通外泌体约为10，有利于外泌体向肿瘤部位聚集。左图为改造前，右图为改造后，左图峰值所对应横坐标为10，右图峰值对应横坐标在50-100范围值内。
图5为对肿瘤细胞的Survivin敲低效率；图中CXCR4high Exo/si-Survivin实验组与对照组相比(High指的是改造后表面CXCR4高表达，Normal为未改造)，Survivin的mRNA水平高度明显下降。其余的实验组只表现出微小的减少或几乎没有变化的mRNA水平。这一结果证实了CXCR4high Exo/si-Survivin降低细胞内Survivin的表达，印证了CXCR4high Exo传递RNA的有效性和效率。
图6为对肿瘤的体内治疗效果，这里的肿瘤是指A549对应的肺癌细胞皮下肿瘤以及MGC803对应的胃癌细胞皮下肿瘤。图中CXCR4normal Exo/si-Survivin实验组对肿瘤生长的抑制没有CXCR4high Exo/si-Survivin实验组强。21天后，CXCR4high Exo/si-Survivin实验组的肿瘤体积大小约为对照组的20％，而CXCR4normal Exo/si-Survivin实验组的肿瘤则增长到约400mm3。在治疗21天后，CXCR4high Exo/si-Survivin实验组的肿瘤体积仍小于200mm3。
本发明上述实施例，通过慢病毒转染改造外泌体来源细胞，从而建立趋向性更强的运载体系，利用外泌体特异性靶向肿瘤部位并促进癌细胞凋亡，用于癌症靶向治疗。本发明构建了具有高趋向性及高siRNA装载效率的外泌体，从而实现目的基因的沉默。改造后外泌体表面CXCR4蛋白提高近十倍，表现出高趋向性及良好的肿瘤聚集效果，2小时内即可通过溶酶体途径释放内容物，持续作用48小时，而后实现逃逸，在体外和体内都表现出显著的抑制肿瘤细胞生长的效果且具有优良的生物安全性，是一种安全性高，靶向性高，适用范围广的药物运载体系。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。上述各优选特征在互不冲突的情况下，可以任意组合使用。
Claims (10)
1.一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括：
S1，慢病毒液的制备：将质粒、Lentiviral Mix和转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；
S2，制备目的蛋白高表达干细胞：对干细胞进行培养，用S1收集的病毒液感染培养后的干细胞，再加入聚凝胺培养，然后筛选获得稳定感染的细胞株；
S3，采用S2得到的干细胞培养提取外泌体：将S2获得的细胞株培养后离心，所得上清液再加入缓冲层后进行第一次超速离心，收集靠近缓冲层的溶液；再将收集的溶液加入缓冲层后进行第二次超速离心，收集缓冲层中的颗粒，即得外泌体；
S4，制备装载siRNA的外泌体：取si-Survivin与上述S304所得外泌体混合，进行电转，然后冰上孵育，即得到载有si-Survivin的外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1，具体包括：
S101，在培养皿中接种293T细胞，待细胞融合度达到转染要求；
S102，将无血清培养基、质粒、慢病毒混合物和转染试剂混匀后放置室温，滴加到S101接种293T细胞的培养皿中培养过夜后吸弃上清，用PBS轻轻洗细胞，加入DMEM高糖培养基；
S103，将S102加入DMEM高糖培养基的293T细胞，继续培养一段时间后，离心，上清液使用滤器过滤后即为病毒液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1，还包括以下一种或多种选择：
-S101中，接种的293T细胞为4×106-6×106个；
-S102中，采用0.5-5ml无血清培养基，质粒的量为5-15μg，Lentiviral Mix用量为5-20μg，转染试剂采用HG TransgeneTM Reagent，HG TransgeneTM Reagent用量为40-80μg；
-S102中，混匀后放置室温的时间为5-30min；
-S103中，在37℃，5％CO2培养一段时间后，4℃，500g-2000g离心，上清液使用0.45μm滤器过滤后即为病毒液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2，具体包括：
S201，培养干细胞，培养后弃培养基；
S202，用S1中收集的病毒液感染培养后的干细胞，再加入聚凝胺，培养一段时间后，加嘌呤霉素筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S2还包括以下一种或多种选择：
-所述干细胞为间充质干细胞第5-6代，所述干细胞生长密度为60％-70％；
-所述间充质干细胞的接种量为5×105，培养时间12-48h；
-所述病毒液感染细胞MOI值为50-400；
-所述聚凝胺的浓度为1-20μg/mL；
-所述嘌呤霉素的浓度为0.5-1μg/mL；
-所得到的干细胞表面目的蛋白表达量为原始干细胞的200-300倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3，具体包括：
S301，将S2获得的细胞株放入条件培养基培养，将条件培养基放入离心管进行离心，沉淀为死细胞，丢弃沉淀，吸取上清，得到的上清液继续离心，沉淀为细胞碎片，丢弃沉淀，取上清；
S302，加入碘杂醇形成缓冲层，对S301所得上清进行第一次超速离心；
S303，经S302第一次超速离心后，外泌体迁移并浓缩到碘杂醇和上清液之间的界面层，收集靠近界面和缓冲层的部分；
S304，将S303收集到的液体加入PBS，放入含有碘化醇缓冲垫的离心管进行第二次超速离心，第二次超速离心后收集缓冲垫中所有颗粒，悬浮于无菌PBS中，即得到外泌体溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述S3，还包括以下一种或多种选择：
-S301中，将条件培养基放入离心管进行离心，离心参数为：温度4℃，转速为2000g，时间为10-30min；
-S301中，得到的上清液继续离心，离心参数为：4℃，转速为10000g，时间为20-30min；
-S302中，所述碘杂醇与S301最终得到的上清液的体积比为(1-2):1000；所述碘杂醇的浓度为60％；
-S302中，第一次超速离心的转速为100000-120000g，离心时间总和为60-180min；所述第一次超速离心后提取到的分界层溶液体积为2-12ml；
-S304得到的外泌体溶液中，外泌体大小为100-180nm；所述第二次超速离心后得到的沉淀用0.5-2mlPBS冲悬。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述S4，还包括以下一种或多种选择：
-所述si-Survivin与外泌体的混合，其中两者质量比为1:2-20；
-所述si-Survivin与外泌体混合反应温度为0-4℃；
-所述电转采用脉冲波电转，脉冲时间为10-15ms；
-所述冰上孵育，时间为0.5-2h。
9.一种干细胞外泌体，其特征在于，所述干细胞外泌体为权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的载有si-Survivin的外泌体。
10.一种权利要求9所述干细胞外泌体在制备靶向肿瘤部位递送基因药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤部位为肿瘤细胞所在部位，所述肿瘤细胞为A549肺癌细胞、MGC803胃癌细胞任一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210245137.8A CN114540294A (zh) | 2022-03-14 | 2022-03-14 | 靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210245137.8A CN114540294A (zh) | 2022-03-14 | 2022-03-14 | 靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114540294A true CN114540294A (zh) | 2022-05-27 |
Family
ID=81663576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210245137.8A Pending CN114540294A (zh) | 2022-03-14 | 2022-03-14 | 靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114540294A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115197908A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-10-18 | 上海交通大学 | 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 |
| CN117625691A (zh) * | 2023-11-28 | 2024-03-01 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种以外泌体和含核定位序列多肽为基础的基因递送方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108251378A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-07-06 | 江苏大学 | 一种过表达ptgds基因的间质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
| CN108753726A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-06 | 西南医科大学 | 一种含有ECRG4 mRNA的外泌体及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-03-14 CN CN202210245137.8A patent/CN114540294A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108251378A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-07-06 | 江苏大学 | 一种过表达ptgds基因的间质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
| CN108753726A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-06 | 西南医科大学 | 一种含有ECRG4 mRNA的外泌体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHUYUE XU ET AL.: "Engineered mesenchymal stem cell-derived exosomes with high CXCR4 levels for targeted siRNA gene therapy against cancer", 《NANOSCALE》, vol. 14, pages 1 - 3 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115197908A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-10-18 | 上海交通大学 | 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 |
| CN117625691A (zh) * | 2023-11-28 | 2024-03-01 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种以外泌体和含核定位序列多肽为基础的基因递送方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109294985B (zh) | 一种用于nk细胞体外扩增的培养基体系及nk细胞体外扩增的方法 | |
| JP7193886B2 (ja) | キメラ抗原受容体で修飾されたγδ Ｔ細胞を生産する方法 | |
| CN114540294A (zh) | 靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用 | |
| CN110055218B (zh) | 一种人工改造自然杀伤性细胞及其制备与应用 | |
| WO2009139413A1 (ja) | サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法 | |
| WO2019228108A1 (zh) | 用于提高细胞转染效率的试剂组合物 | |
| CN110684730A (zh) | 一种利用滋养细胞高效扩增nk细胞的制备方法 | |
| CN106754723B (zh) | 一种具有抗肿瘤功能的免疫细胞及其应用 | |
| CN110684790A (zh) | 抗b7-h3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用 | |
| CN110438077B (zh) | 一种NK与γδT细胞的同时培养方法 | |
| WO2023123195A1 (zh) | 一种目的基因可调控的工程化免疫细胞及其制备方法和应用 | |
| CN112251411B (zh) | 一种miR-17-92修饰的间充质干细胞、外泌体及其制备方法和应用 | |
| WO2021184449A1 (zh) | 一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法及应用 | |
| CN113201508A (zh) | 一种重组新城疫溶瘤病毒及制备方法与应用 | |
| WO2023005486A1 (zh) | 一种ebv复合抗原、树突状细胞疫苗及其应用 | |
| CN110358737A (zh) | 一种利用外泌体制备嵌合抗原受体t淋巴细胞的方法 | |
| CN115478048A (zh) | 培养脂肪间充质干细胞制备外泌体 | |
| CN103013906B (zh) | 一种生物膜及其制备方法和应用 | |
| CN115737841A (zh) | 一种用于增强t细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物及其制备方法与应用 | |
| CN106039448B (zh) | Aids细胞吸附治疗仪 | |
| CN115029320A (zh) | 用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体、制备方法、应用 | |
| CN110922490B (zh) | 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用 | |
| CN113832190A (zh) | 一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法及其应用 | |
| CN114410686A (zh) | 一种工程化外泌体原位纳米疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN112029730A (zh) | 一种基因修饰的间充质干细胞及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |