CN115814108A - 一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法 - Google Patents
一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物靶向载体技术领域，更具体地，涉及一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法。包括过表达肿瘤抗原的巨噬细胞凋亡产生的微颗粒，以及该微颗粒包裹的能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的药物小分子有效成分；所述微颗粒表面还修饰有M2型巨噬细胞靶向分子。本发明提供的载药微颗粒更有利于被M2型肿瘤相关巨噬细胞摄取，提高逆极化药物对M2型肿瘤相关巨噬细胞的逆极化效果，改善肿瘤微环境，并利用逆极化后的巨噬细胞对微颗粒所携带的肿瘤抗原加工呈递，刺激抗原特异性CD8T细胞激活以及干性样CD8T细胞的增殖分化，实现对表达同种抗原肿瘤类型的抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于药物靶向载体技术领域，更具体地，涉及一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法。
背景技术
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAM)占实体肿瘤质量的50％左右，是肿瘤微环境的重要组成部分，是引起肿瘤微环境免疫抑制的重要原因之一。大量研究表明，M2型肿瘤相关巨噬细胞能够促进肿瘤生长、血管生成、转移、耐药和免疫抑制，发挥促肿瘤作用。与此相反，M1型肿瘤相关巨噬细胞具有更强的肿瘤细胞吞噬能力，能够分泌IL-12和TNF-α等促炎细胞因子、释放活性氧，有效杀伤肿瘤细胞，同时，M1型肿瘤相关巨噬细胞可以有效呈递抗原激活Th1型免疫反应，在抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。因此，将M2型肿瘤相关巨噬细胞逆极化成M1型，恢复其抗肿瘤能力，是肿瘤免疫治疗的一个重要途径。
纳米材料因其独特的理化特性和靶向修饰性等，在靶向药物输送方面具有明显优势。相对于人工合成的纳米药物载体可能具有的生物相容性差等问题，利用细胞或细胞来源的囊泡用作药物载体引起广泛关注。巨噬细胞在体内受到肿瘤微环境中细胞因子、趋化因子等多种信号的诱导，能够被招募至肿瘤组织。因此，巨噬细胞作为药物载体具有天然的肿瘤组织靶向性和深部穿透能力。但是，巨噬细胞负载的药物会影响巨噬细胞活性从而导致其药物传递效率下降。而且，被招募至肿瘤组织的巨噬细胞在肿瘤微环境的诱导下有可能会转变为M2型肿瘤相关巨噬细胞，有促进肿瘤生长的风险。因此，十分有必要寻找替代巨噬细胞的药物载体。
目前，细胞来源的胞外囊泡作为药物载体已引起关注。这种天然生物来源的囊泡具有低免疫原性、优良的体内长循环特性及较高细胞靶向性等特点。作为一类重要的胞外囊泡，微颗粒(Microparticles，MPs)是细胞在相关信号的刺激下触发细胞膜下的骨架变化，导致细胞膜在局部向外膨出，包裹细胞内容物，并以囊泡的形式释放到细胞外所产生的，其粒径在100-1000nm。巨噬细胞来源载药微颗粒能够被巨噬细胞摄取，有效递送小分子药物，逆转巨噬细胞极性。但是，这种巨噬细胞载药微颗粒不能够有效靶向并逆极化M2型巨噬细胞，影响了其对肿瘤的免疫治疗效果。
专利CN 109893515A公开了一种巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法，利用巨噬细胞来源微颗粒修饰甘露糖作为载药体系，增强对M2型巨噬细胞的靶向性并逆极化M2型巨噬细胞为M1型巨噬细胞。但是仅改善了肿瘤微环境，未充分利用巨噬细胞的抗原递呈功能，发挥的肿瘤治疗效果有限。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法，解决了现有技术药物的脱靶效应，对机体的毒副作用，肿瘤相关巨噬细胞无法有效刺激CD8 T细胞抗原特异性激活且诱导T细胞耗竭等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，包括过表达肿瘤抗原的巨噬细胞凋亡产生的微颗粒，以及该微颗粒包裹的药物小分子有效成分，所述药物小分子有效成分为能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的小分子药物；所述微颗粒表面还修饰有M2型巨噬细胞靶向分子。
优选地，通过慢病毒转染、腺病毒转染、质粒转染或基因编辑方式过表达所述肿瘤抗原；所述巨噬细胞为源自于人体外周血中的循环单核细胞、人源单核细胞系、小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠单核/巨噬细胞系中的一种。
优选地，所述微颗粒、所述药物小分子有效成分以及所述M2型巨噬细胞靶向分子的质量比为1000：(30-60)：(2-5)。
优选地，所述肿瘤抗原包括癌症睾丸抗原、肝癌抗原AFP、黑色素瘤抗原、前列腺特异性抗原PSA、前列腺特异性抗原PAP和肿瘤新抗原中的一种或多种，可选地，所述肿瘤新抗原包括Actn4、Adpgk、Ap3d1、Tubb3、Dag1、Eef2、Tnpo3、Tubb3、Reps1、Cpne1和Cpsf3l中的一种或多种。
优选地，所述药物小分子有效成分为免疫激动类小分子药物、代谢类小分子药物或其他具有逆极化M2为M1的小分子药物，所述免疫激动类小分子药物为STING激动剂CDN、TLR激动剂R848、R837与poly(I:C)和AMPK激活剂中的一种或多种；所述代谢类小分子药物为芳香烃受体AhR抑制剂和谷氨酰胺转运体抑制剂中的一种或多种；所述其他具有逆极化M2为M1的小分子药物包括组胺受体抑制剂和阿司匹林中的一种或多种；
所述M2型巨噬细胞靶向分子为DSPE-PEG-M2pep、SR-B1靶向肽和DSPE-PEG-Man中的一种或多种。
优选地，所述工程化巨噬细胞载药微颗粒的粒径为300～500nm。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：通过基因工程改造制备稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞；
S2：将所述稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞经紫外辐照诱导凋亡后，与药物小分子有效成分混匀孵育，所述药物小分子有效成分为能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的小分子药物，收集得到过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒；
S3：将过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒与M2型巨噬细胞靶向分子孵育，通过膜磷脂交换使所述M2型巨噬细胞靶向分子交换至所述载药微颗粒的膜表面，收集得到所述工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂。
优选地，步骤S1中，通过慢病毒转染、腺病毒转染、质粒转染或基因编辑方式制备稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞。
进一步优选地，采用慢病毒转染方式首先制备得到过表达所述肿瘤抗原的慢病毒，然后用过表达所述肿瘤抗原的慢病毒转染巨噬细胞，筛选得到稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞；所述巨噬细胞与过表达所述肿瘤抗原的慢病毒的含量比为5×105个：(3～6)×106PFU。
优选地，步骤S3中，所述过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒与所述M2型巨噬细胞靶向分子的质量比为(10-100)：1；步骤S2和S3中，所述收集条件为：在4℃条件下，以500-20000g的离心力收集。
按照本发明的另一个方面，提供了一种治疗肿瘤的药物，其包括所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂。
进一步优选地，所述治疗肿瘤的药物，包括所述工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，还包括免疫检查点抑制剂，其中所述免疫检查点抑制剂为PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体和VISTA抗体中的一种或多种。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，包括过表达肿瘤抗原的巨噬细胞凋亡产生的微颗粒，以及该微颗粒包裹的药物小分子有效成分，所述药物小分子有效成分为能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的小分子药物；所述微颗粒表面还修饰有M2型巨噬细胞靶向分子。将表达肿瘤抗原的巨噬细胞来源微颗粒修饰M2型巨噬细胞靶向分子后作为本发明的药物制剂载体，可使作为有效成分的药物分子在肿瘤部位富集并被M2型肿瘤相关巨噬细胞摄取，在降低药物脱靶效应及对机体毒副作用的同时，提高对M2型肿瘤相关巨噬细胞的逆极化效果，改善肿瘤免疫微环境，增强对肿瘤细胞的杀伤效果。
(2)本发明所述载药微颗粒上负载了具有逆极化M2型巨噬细胞到M1型的药物，能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型，并利用逆极化后得到的M1型巨噬细胞对微颗粒携带的肿瘤抗原进行加工呈递，同时利用肿瘤组织中大量存在的巨噬细胞作为抗原呈递细胞(APCs)，不仅挑战了利用树突细胞(DCs)作为抗原呈递细胞(APCs)的常规方法，还充分发挥了巨噬细胞的抗原呈递功能，刺激CD8 T细胞抗原特异性激活，从而增强对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。
(3)本发明提供的载药微颗粒制剂由于负载了具有逆极化M2型巨噬细胞到M1型的药物，能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型，同时利用肿瘤组织中大量存在的巨噬细胞作为APCs，而巨噬细胞的抗原呈递功能还增强了抗原特异性CD8 T细胞以及抗原特异性干性样CD8 T在肿瘤组织中的浸润与激活，更利于实现对肿瘤的长期免疫监视作用。
(4)本发明首先通过基因工程改造获得稳定过表达肿瘤抗原的工程化巨噬细胞，然后经紫外辐照凋亡后与药物小分子有效成分、M2型巨噬细胞靶向分子共孵育，收集得到所述工程化巨噬细胞载药微颗粒。该制备方法简单，且具有一定的通用性。本发明通过选择针对特定肿瘤类型的肿瘤相关抗原基因作为目的基因，或者对患者个体化的肿瘤组织或外周血的全基因进行测序，筛选个体化肿瘤新抗原基因作为目的基因，通过基因工程改造获得稳定过表达相应的个体化肿瘤新抗原的巨噬细胞，实现个性化肿瘤治疗。
(5)本发明以巨噬细胞微颗粒为载体，在循环稳定性、免疫原性以及生物安全性更优的基础上，一些实施例中通过慢病毒转染方式获得稳定表达不同肿瘤抗原的巨噬细胞，构建了一个可以作为肿瘤个性化治疗的平台。
附图说明
图1A为经表达AFP的慢病毒转染后的巨噬细胞中AFP表达；
图1B为表达AFP的巨噬细胞来源微颗粒中AFP表达；
图1C为携带抗原并修饰靶向肽的载药微颗粒的粒径；
图1D为携带抗原并修饰靶向肽的载药微颗粒的zeta电位；
图1E为携带抗原并修饰靶向肽的载药微颗粒的电镜；
图2A为不同组织中巨噬细胞对PKH26标记微颗粒的摄取；
图2B为肿瘤组织中不同细胞对PKH26标记微颗粒的摄取；
图3A为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化M2巨噬细胞后M1相关蛋白CD80的表达；
图3B为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化M2巨噬细胞后M2相关蛋白CD206的表达；
图3C为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8T细胞共孵育后，AFP212特异性CD8 T细胞的数量；
图3D为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8T细胞共孵育后，AFP212特异性CD8 T细胞的激活；
图3E为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8T细胞共孵育后，CD8 T细胞对Hepa1-6肿瘤细胞的杀伤；
图3F为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8T细胞共孵育后，CD8 T细胞对B16-OVA肿瘤细胞的杀伤；
图4A为携带Adpgk新抗原肽并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化M2巨噬细胞后M1相关蛋白CD80的表达；
图4B为携带Adpgk新抗原肽并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化M2巨噬细胞后M2相关蛋白CD206的表达；
图4C为携带Adpgk新抗原肽并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞后与CD8 T细胞共孵育后，Adpgk特异性CD8 T细胞的数量；
图4D为携带Adpgk新抗原肽并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8 T细胞共孵育后，Adpgk特异性CD8 T细胞的激活；
图5A为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒逆极化M2巨噬细胞后M1相关蛋白CD80的表达；
图5B为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒逆极化M2巨噬细胞后M2相关蛋白CD206的表达；
图5C为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8 T细胞共孵育后，AFP212特异性CD8 T细胞的数量；
图5D为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8 T细胞共孵育后，AFP212特异性CD8 T细胞的激活；
图5E为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8 T细胞共孵育后，CD8 T细胞对Hepa1-6肿瘤细胞的杀伤；
图5F为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒逆极化后的M2巨噬细胞与CD8 T细胞共孵育后，CD8 T细胞对B16-OVA肿瘤细胞的杀伤；
图6A为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，荷瘤肝脏图片；
图6B为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，肿瘤组织重量；
图6C为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后的小鼠生存期；
图7A为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，肿瘤组织中AFP抗原特异性CD8 T细胞的数量；
图7B为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，肿瘤组织中分泌IFNγ的AFP抗原特异性CD8 T细胞的数量；
图7C为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，肿瘤组织中AFP抗原特异性干性样CD8 T细胞的数量；
图7D为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，肿瘤组织中分泌颗粒酶B的终末耗竭型CD8 T细胞数量；
图8A为携带抗原并修饰M2靶向肽的载药微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，小鼠血清中谷丙转氨酶含量；
图8B为携带抗原并修饰M2靶向肽的载药微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，小鼠血清中乳酸脱氢酶含量；
图8C为携带抗原并修饰M2靶向肽的载药微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，小鼠血清中血尿素氮含量；
图8D为携带抗原并修饰M2靶向肽的载药微颗粒尾静脉给药Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠过程中小鼠体重变化；
图9A为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒联合PD-1抗体治疗Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，荷瘤肝脏图片；
图9B为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒联合PD-1抗体治疗Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后，肿瘤组织重量；
图9C为携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒联合PD-1抗体治疗Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠后的小鼠生存期。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明提供的一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，包括过表达肿瘤抗原的巨噬细胞凋亡产生的微颗粒，以及该微颗粒包裹的药物小分子有效成分，所述药物小分子有效成分为能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的小分子药物；所述微颗粒表面还修饰有M2型巨噬细胞靶向分子。
一些实施例中，通过慢病毒转染、腺病毒转染、质粒转染或基因编辑方式过表达所述肿瘤抗原；所述巨噬细胞为源自于人体外周血中的循环单核细胞、人源单核细胞系、小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠单核/巨噬细胞系中的一种。
一些实施例中，所述微颗粒、所述药物小分子有效成分以及所述M2型巨噬细胞靶向分子的质量比为1000：(30-60)：(2-5)。
本发明所述稳定过表达肿瘤抗原的工程化巨噬细胞，这里肿瘤抗原可以为医学上认可的或能够通过全基因组测序及外显子组测序可以鉴定的肿瘤相关抗原与肿瘤特异性抗原，一些实施例中，所述肿瘤相关抗原为癌症睾丸抗原(包括但不限于NY-ESO-1)、肝癌抗原AFP、黑色素瘤抗原(包括但不限于MAGE家族、MART-1与gp100)和前列腺特异性抗原PSA和PAP的一种或多种。一些实施例中，所述肿瘤抗原还包括肿瘤新抗原，其中肿瘤新抗原为肿瘤细胞基因突变产生的可以由基因组测序技术鉴定的抗原肽，包括Actn4、Adpgk、Ap3d1、Tubb3、Dag1、Eef2、Tnpo3、Tubb3、Reps1、Cpne1和Cpsf3l中的一种或多种。本发明所述药物小分子有效成分为能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的小分子药物。一些实施例中，所述药物小分子有效成分为免疫激动类小分子药物、代谢类小分子或其他具有逆极化M2为M1功能的小分子药物，所述免疫激动类小分子药物为STING激动剂CDN、TLR激动剂R848、R837与poly(I:C)和AMPK激活剂中的一种或多种；所述代谢类小分子药物为芳香烃受体AhR抑制剂和谷氨酰胺转运体抑制剂中的一种或多种；所述其他药物包括组胺受体抑制剂和阿司匹林中的一种或多种。
一些实施例中，所述M2巨噬细胞靶向分子为DSPE-PEG-M2pep、SR-B1靶向肽和DSPE-PEG-Man中的一种或多种。
一些实施例中，所述工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂的粒径为300～500nm。所述载药微颗粒制剂为纳米尺寸，更有利于载药微颗粒制剂在肿瘤部位富集、更有效靶向并逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞、恢复巨噬细胞对肿瘤的杀伤、改善肿瘤抑制性免疫微环境、有效杀伤肿瘤细胞，对正常组织不会产生任何损伤，避免使用外源性材料作为载体而对机体产生的毒副作用。
本发明还提供了一种所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：通过基因工程改造制备稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞；
S2：将所述稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞经紫外辐照诱导凋亡后，与药物小分子有效成分混匀孵育，所述药物小分子有效成分为能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的小分子药物，收集得到过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒；
S3：将过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒与M2型巨噬细胞靶向分子孵育，通过膜磷脂交换使所述M2型巨噬细胞靶向分子交换至所述载药微颗粒的膜表面，收集得到所述工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂。
一些实施例中，步骤S1中，通过慢病毒转染、腺病毒转染、质粒转染或基因编辑方式制备稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞。较佳地，采用慢病毒转染方式首先制备得到过表达所述肿瘤抗原的慢病毒，然后用表达所述肿瘤抗原的慢病毒转染巨噬细胞，筛选得到稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞。
一些实施例中，将慢病毒包装质粒、慢病毒包膜质粒以及携带有肿瘤抗原基因作为目的基因的载体质粒转染HEK 293T细胞，收集过表达肿瘤抗原的慢病毒；其中慢病毒包装质粒为psPAX2、pMDLg/pRRE和pRSV/Rev中的一种或多种；所述慢病毒包膜质粒为pMD2.G-VSVG和pCMV-VSV-G中的一种或多种；所述携带有肿瘤抗原基因作为目的基因的载体质粒，其中肿瘤抗原基因为医学上认可的或能够通过全基因组测序及外显子组测序可以鉴定的一种或多种肿瘤相关抗原与肿瘤特异性抗原制备得到，包括癌症睾丸抗原(包括NY-ESO-1)、肝癌抗原AFP、黑色素瘤抗原(包括gp100、Trp2和MART1))、前列腺特异性抗原PSA和PAP。一些实施例中肿瘤抗原基因还可以通过肿瘤新抗原制备得到，其中肿瘤新抗原包括Actn4、Adpgk、Ap3d1、Tubb3、Dag1、Eef2、Tnpo3、Tubb3、Reps1、Cpne1和Cpsf3l中的一种或多种。
一些实施例中，所述携带有肿瘤抗原基因作为目的基因的载体质粒，其中肿瘤抗原基因还可以为通过对癌症患者个体化的肿瘤组织和外周血的全基因测序，制备得到个体化肿瘤新抗原基因。过表达患者个体化肿瘤新抗原的工程化巨噬细胞并进一步构建工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，由此实现患者的个性化治疗。
一些实施例中，步骤S1中，通过调控慢病毒包装质粒、慢病毒包膜质粒以及携带目的基因的载体质粒的质量比，以得到高滴度慢病毒。一些实施例中，所述慢病毒包装质粒、慢病毒包膜质粒以及携带有肿瘤抗原基因作为目的基因的载体质粒按质量比3:1:4的比例转染HEK293T细胞。
一些实施例中，步骤S1中，所述收集过表达所述肿瘤抗原的慢病毒的具体操作为：将慢病毒包装质粒、慢病毒包膜质粒以及携带有肿瘤抗原基因作为目的基因的载体质粒按质量比3:1:4的比例混匀后，与HEK293T细胞置于37℃、5％ CO2无菌培养箱中培养72h，在4℃条件下，以8×104g的离心力离心2h，收集沉淀得到过表达所述肿瘤抗原的慢病毒。
一些实施例中，步骤S1中，所述巨噬细胞与所述表达所述肿瘤抗原的慢病毒的含量比为5×105个：(3～6)×106PFU。
一些实施例中，步骤S1中，所述稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞的获得的具体操作为：将5×105个RAW264.7细胞接种于细胞培养板，于37℃、5％ CO2无菌培养箱培养，期间吸弃旧培养基并补充新培养基，并根据培养情况，更换培养基种类，最后将培养基替换为含筛选试剂的完全培养基，并每隔两天进行更换，持续培养10天依然存活的细胞即为稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞。
一些实施例中，步骤S2具体为：将所述稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞于300J/m2的紫外光下辐照1h诱导凋亡，与终浓度为150-250μg/mL的药物小分子有效成分混匀后，置于37℃、5％ CO2无菌细胞培养箱中培养20-30h，600g离心10min去除细胞碎片，收集上清，再18000g离心30min后弃上清，用无菌PBS重悬沉淀，收集得到过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒。
一些实施例中，步骤S3中，所述过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒与M2型巨噬细胞靶向分子的质量比为(10-100)：1。
一些实施例中，所述步骤S2和S3中，在4℃条件下，以500-20000g的离心力收集微颗粒。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，其包括所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂。所述药物的给药方式为静脉给药或瘤内给药，其剂型包括注射剂或冻干得到的粉末。
一些实施例中，所述治疗肿瘤的药物，其包括所述工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，还包括免疫抑制分子，其中所述免疫检查点抑制剂为PD-1抗体、PD-L1抗体、CTL1-4抗体和VISTA抗体中的一种或多种。所述工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂与所述免疫检查点抑制剂，具体使用时，二者单独给药，且免疫检查点抑制剂可采用5-10mg/kg给药剂量。
本发明使用的术语“微颗粒”是由巨噬细胞凋亡释放产生的。
本发明一些实施例中通过将慢病毒包装质粒、慢病毒包膜质粒和携带有肿瘤特异性抗原基因作为目的基因的载体质粒转染HEK293T细胞，得到稳定过表达所述肿瘤抗原的慢病毒，用过表达所述肿瘤抗原的慢病毒转染巨噬细胞，筛选得到稳定过表达所述肿瘤抗原的巨噬细胞，并经紫外辐照凋亡后与药物小分子有效成分、M2型巨噬细胞靶向分子共孵育，收集得到所述工程化巨噬细胞载药微颗粒，除了使工程化巨噬细胞载药微颗粒在肿瘤部位富集并被M2型肿瘤相关巨噬细胞摄取，提高对M2型肿瘤相关巨噬细胞的逆极化效果，改善肿瘤微环境，还利用逆极化后得到的M1型巨噬细胞对微颗粒携带的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原进行加工呈递，增强对肿瘤细胞的杀伤效果，实现个性化肿瘤治疗。
本发明所述载药微颗粒利用肿瘤组织中大量存在的巨噬细胞作为抗原呈递细胞(APCs)，不仅挑战了利用树突细胞(DCs)作为抗原呈递细胞(APCs)的常规方法，还由于工程化巨噬细胞还稳定过表达肿瘤抗原，因此还能够充分发挥巨噬细胞的抗原呈递功能，刺激CD8 T细胞抗原特异性激活，从而增强对肿瘤细胞的特异性杀伤作用；此外，巨噬细胞的抗原呈递功能还增强了抗原特异性干性样CD8 T在肿瘤组织中的浸润与激活，更利于实现对肿瘤的长期免疫监视作用。
以下为实施例：
下述实施例中使用的各种细胞、试剂及实验动物：
Hepa1-6细胞购自武汉博士德生物工程有限公司；C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；小鼠巨噬细胞系RAW264.7、HEK293T细胞购自上海细胞库。
Toll样受体7/8激动剂瑞喹莫德(R848)购自InvivoGen公司；DSPE-PEG-Mal购自上海芃硕生物科技有限公司，M2pep购自合肥国肽生物科技有限公司；psPAX2和pM2.GVSVG来源于Addgenge；表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-AFP和pCDH-Adpgk-Zeocin通过常规分子生物学手段构建获得；嘌呤霉素购自赛国生物科技有限公司；IL-2和IL-4购自Peprotech生物科技有限公司；MeAIB购自MedChemExpress公司；PKH26荧光染料购自Sigma公司；LDH试剂盒购自Abcam公司。
以下为实施例：
实施例1用于甲胎蛋白(AFP)高表达肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒及其制备方法
1.实验材料和试剂
小鼠巨噬细胞系RAW264.7、HEK293T细胞、Toll样受体7/8激动剂瑞喹莫德(R848)、DSPE-PEG-M2pep，紫外线装置为生物安全柜所有。
2.实验步骤
1)提取MEF细胞的RNA并反转录得到cDNA；用AFP的酶切引物通过PCR扩增得到CDS片段；对CDS片段和表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro进行双酶切；DNA连接酶连接双酶切产物，利用pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的嘌呤霉素抗性筛选得到AFP的表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-AFP并测序鉴定。
将质粒psPAX2、pM2.GVSVG、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-AFP按质量比3:1:4(总量16μg)混合均匀后，加入装有1mL opti-MEM培养基的EP管，37℃孵育5min；同时取20μL PEI与1mL opti-MEM培养基37℃孵育5min；将上述液体混匀后37℃继续孵育15min，加入到2×106个HEK293T细胞中，置于37℃、5％ CO2无菌培养箱中培养72h。
用移液枪于超净工作台中吸取上述HEK293T细胞上清，并用0.45μm的无菌滤器过滤去除细胞碎片。过滤后的上清移入无菌超速离心管中，4℃、8×104g离心2h，收集沉淀得到表达AFP的慢病毒。将5×105个RAW264.7细胞接种于6孔板中，第二天吸弃旧培养基，加入900μL无血清培养基同时加入5×106PFU左右AFP慢病毒，于37℃、5％ CO2无菌培养箱培养6h后，加入100μL胎牛血清并补充2mL完全培养基，于37℃、5％ CO2无菌培养箱中孵育24h，吸弃含有慢病毒的旧培养基，加入3mL新鲜的完全培养基继续培养，24h后替换培养基为含终浓度2μg/mL嘌呤霉素的完全培养基，每隔两天更换新鲜的含嘌呤霉素的完全培养基，持续培养10天依然存活的细胞即为RAW264.7AFP。胰蛋白酶消化RAW264.7AFP，离心得到细胞沉淀，用RIPA裂解细胞，1×104rpm离心10min，取上清得到蛋白沉淀，100℃煮样10min，加入5×蛋白上样缓冲液，western blot检测AFP表达。RAW264.7AFP细胞样品为实验组，RAW264.7细胞样品为对照组1，转染表达空质粒慢病毒的RAW264.7细胞样品(RAW264.7EV)为对照组2，Hepa1-6细胞样品为阳性对照。
2)调整RAW264.7AFP细胞浓度至5×106个/mL。取5mL细胞放置于10cm细胞培养皿中，暴露于300J/m2的紫外光下辐照1h。置于37℃、5％ CO2无菌细胞培养箱中，24h后对凋亡巨噬细胞实施分离。600g离心10min去除细胞碎片，收集上清，再18000g离心30min后弃上清，用无菌PBS重悬沉淀收集得到携带AFP抗原的微颗粒MPsAFP，按上述1)中方法制备样品，western blot检测AFP表达。按上述制备方法，由RAW264.7、RAW264.7EV凋亡细胞上清分离得到的微颗粒MPs，MPsEV分别作为对照组1，2，Hepa1-6细胞样品作为阳性对照。
3)称取10mg M2pep溶于0.5mL pH为8.0的PBS中，称取8.8mg DSPE-PEG-Mal溶于0.5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，二者混匀后，补充pH为8.0的PBS至12mL，室温条件下搅拌反应4h。使用截留分子量为3000Da的透析袋于PBS中透析，24h后将透析袋内的液体冻干后获得M2型巨噬细胞靶向肽(DSPE-PEG-M2pep)。
4)按上述2)中方法对RAW264.7AFP细胞进行紫外辐照，结束后加入终浓度为200μg/mL的R848，混匀后置于37℃、5％ CO2无菌细胞培养箱中。24h后，按2)中方法对凋亡巨噬细胞实施分离，得到的微颗粒(R848@MPsAFP)与DSPE-PEG-M2pep以质量比50：1的比例于PBS溶液中4℃培养24h。18000g离心30min后弃上清，1mL PBS重悬沉淀，再18000g离心30min后用无菌PBS重悬沉淀，收集得到修饰有M2靶向肽并携带AFP抗原的载药微颗粒R848@M2pep-MPsAFP，作为实验组。按上述处理方式，不添加R848，RAW264.7上清收集到的巨噬细胞微颗粒，不孵育DSPE-PEG-M2pep为MPs，作为对照组1；不添加R848，RAW264.7上清收集到的巨噬细胞微颗粒，孵育DSPE-PEG-M2pep为M2pep-MPs，作为对照组2；不添加R848，RAW264.7AFP上清收集到的巨噬细胞微颗粒，不孵育DSPE-PEG-M2pep为MPsAFP，作为对照组3；不添加R848，RAW264.7AFP上清收集到的巨噬细胞微颗粒，孵育DSPE-PEG-M2pep为M2pep-MPsAFP，作为对照组4；添加R848，RAW264.7上清收集到的巨噬细胞微颗粒，不孵育DSPE-PEG-M2pep为R848@MPs，作为对照组5；添加R848，RAW264.7上清收集到的巨噬细胞微颗粒，孵育DSPE-PEG-M2pep为R848@M2pep-MPs，作为对照组6；添加R848，RAW264.7AFP上清收集到的巨噬细胞微颗粒，不孵育DSPE-PEG-M2pep为R848@MPsAFP，作为对照组7。
5)将得到的微颗粒溶解于PBS中，使用带633nm He-Ne激光器的纳米粒度及zeta电位仪检测其粒径以及zeta电位分布。具体设定条件为：温度为25℃，平衡时间为120s。同时，将铜网有碳膜一面朝上置于一次性PE手套上，将一定浓度的微颗粒滴加在铜网表面，平衡5min，依次使用4％多聚甲醛固定10min，磷钨酸染色5min，PBS清洗后用滤纸吸干铜网表面液体，将铜网置于滤纸上静置过夜，使用TEM观察样品形貌。
3.实验结果
实验结果发现，RAW264.7AFP细胞(图1A)与MPsAFP(图1B)成功表达AFP抗原，各种微颗粒平均粒径分布为400nm左右(图1C)，zeta电位为-19mV左右(图1D)，表明微颗粒携带抗原、DSPE-PEG-M2pep修饰及负载R848基本不改变微颗粒的粒径和zeta电位。TEM图片显示(图1E)，微颗粒形貌为不规则球形。
实施例2微颗粒在M2型肿瘤相关巨噬细胞的蓄积
1.实验材料和试剂
Hepa1-6鼠肝癌细胞，PKH26流式抗体，C57BL/6小鼠。
2.实验步骤
1)小鼠Hepa1-6原位肝癌肿瘤模型的建立：在C57BL/6小鼠腋下部位接种3×106个Hepa1-6细胞构建皮下肝癌模型，待肿瘤体积生长到约500mm3，剥离肿瘤并均匀切成约1mm×1mm×1mm大小的瘤块，将3-4个瘤块接种在C57BL/6小鼠肝脏部位建立小鼠Hepa1-6原位肝癌肿瘤模型。
2)模型构建15天后，随机将荷瘤小鼠分为4组，每组4只。将所制备的PKH26标记的M2pep-MPsAFP以15mg(蛋白量)/kg的给药量经尾静脉注射入Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠体内作为实验组，将所制备的PKH26标记的MPs以15mg(蛋白量)/kg的给药量经尾静脉注射入Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠体内作为对照组1，将所制备的PKH26标记的M2pep-MPs以15mg(蛋白量)/kg的给药量经尾静脉注射入Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠体内作为对照组2，将所制备的PKH26标记的MPsAFP以15mg(蛋白量)/kg的给药量经尾静脉注射入Hepa1-6原位肝癌荷瘤小鼠体内作为对照组3。
3)尾静脉注射24h后处死各组小鼠，取肝、脾、肺、肾、肿瘤。肺及肿瘤用眼科手术剪尽可能剪碎，在含0.08％胶原酶Ⅰ的RPMI 1640无血清培养基中消化1h，挤压通过金属筛网，再用200目尼龙筛网过滤2次，红细胞裂解液裂解，PBS洗两次即得到单细胞悬液。肝脏、脾脏以及肾脏直接用10mL注射器内芯挤压磨碎组织，后用200目筛网过滤2次，红细胞裂解液裂解，PBS洗两次即得到单细胞悬液。
4)得到的单细胞悬液，取1×106个细胞加入荧光染料标记的抗体，使用CytoFLEXS流式细胞仪检测不同细胞中PKH26的荧光强度。CD45-为肿瘤细胞，CD11b+F4/80+为巨噬细胞，CD11b+F4/80+CD80+为M1型巨噬细胞，CD11b+F4/80+CD206+为M2型巨噬细胞，CD45+CD3+为T细胞，CD45+F4/80-CD11c+为树突状细胞，CD45+CD11b+Gr1+为髓源抑制性细胞(MDSCs)，CD45+CD3+CD4+CD25+Foxp3+为调节性T细胞(Tregs)。
3.实验结果
由图2A所示，相对于肝枯否细胞、脾巨噬细胞、肺巨噬细胞和肾巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞中能够摄取更多靶向肽修饰的微颗粒；在肿瘤组织中(图2B)，与未修饰靶向肽的微颗粒相比，靶向肽修饰的微颗粒在M2型肿瘤相关巨噬细胞中的摄取量更多。表明靶向肽修饰的微颗粒能够在肿瘤部位有效蓄积，并且对M2型肿瘤相关巨噬细胞具有良好靶向能力。
实施例3：携带AFP抗原并修饰靶向肽的载R848微颗粒重编程M2型巨噬细胞
1.实验材料和试剂
使用的RAW264.7小鼠巨噬细胞以及表达AFP抗原的RAW264.7AFP小鼠巨噬细胞同实施例1，R848、IL-4、IL-2、CD8 T细胞分选试剂盒、LDH试剂盒、荧光标记的流式抗体。
2.实验步骤
1)将5×105个RAW264.7细胞接种于细胞六孔板中，加入20ng/mL IL-4刺激于37℃、5％CO2无菌培养箱中培养24h得到M2型巨噬细胞。载药微颗粒制备方法同实施例1。
2)在M2型巨噬细胞中加入载药微颗粒于37℃、5％ CO2无菌培养箱中共孵育，24h后收集细胞，标记流式荧光抗体，CytoFLEX S流式细胞仪检测M1、M2相关蛋白的表达。携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒(R848@M2pep-MPsAFP)处理的M2型巨噬细胞作为实验组，不做处理的M2型巨噬细胞作为对照组1，未携带AFP抗原不修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组2；未携带AFP抗原修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(M2pep-MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组3；携带AFP抗原未修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(MPsAFP)处理的M2巨噬细胞作为对照组4；携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(M2pep-MPsAFP)处理的M2型巨噬细胞作为对照组5；游离R848作为对照组6；未携带AFP抗原不修饰M2靶向肽的载R848微颗粒(R848@MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组7；未携带AFP抗原修饰M2靶向肽的载R848微颗粒(R848@M2pep-MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组8；携带AFP抗原未修饰M2靶向肽的载R848微颗粒(R848@MPsAFP)处理的M2型巨噬细胞作为对照组9。
3)按照实施例2中方法制备小鼠脾脏单细胞悬液，用Mojosort小鼠CD8 T细胞分选试剂盒以及Mojosort磁极分离小鼠脾脏单细胞悬液，得到CD8 T细胞，用含有20ng/mL IL-2的RPMI1640完全培养基重悬，接种在6孔板中待用。将上述2)中加药处理后的M2巨噬细胞与CD8 T细胞依据1：1的比例于37℃、5％ CO2无菌培养箱中共孵育5天，标记流式荧光抗体，CytoFLEX S流式细胞仪检测抗原特异性CD8 T细胞的数量与激活。
将激活的CD8 T细胞与Hepa1-6依据10:1的比例于37℃、5％ CO2无菌培养箱中共孵育6h后，LDH试剂盒检测上清中LDH的浓度，计算CD8 T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
3.实验结果
如图3A至图3F所示，相比于未载药微颗粒、游离R848、未携带AFP抗原且未经靶向肽修饰的载药微颗粒、未携带AFP抗原但修饰有靶向肽的载药微颗粒、携带AFP抗原但未经靶向肽修饰的微颗粒，实验组携带AFP抗原且修饰有靶向肽的载药微颗粒能够显著上调M1相关蛋白CD80(图3A)，下调M2相关蛋白CD206(图3B)的表达，逆极化M2型巨噬细胞至M1型；同时，实验组载药微颗粒处理过的M2型巨噬细胞能够显著促进AFP抗原特异性CD8 T细胞增殖(图3C)、激活(图3D)，且激活的CD8 T细胞仅对表达AFP抗原的Hepa1-6肿瘤细胞(图3E)而非表达OVA的B16-OVA肿瘤细胞(图3F)具有更特异性杀伤作用。表明本发明提供的携带肿瘤抗原且修饰有M2靶向肽的载药微颗粒能够有效逆极化M2型巨噬细胞，同时利用逆极化后的巨噬细胞作为抗原呈递细胞将微颗粒携带的肿瘤抗原加工呈递，刺激CD8 T细胞抗原特异性激活，特异性杀伤表达同种抗原的肿瘤细胞。
实施例4：携带Adpgk新抗原肽并修饰靶向肽的载R848微颗粒重编程M2型巨噬细胞
1.实验材料和试剂
使用的RAW264.7小鼠巨噬细胞同实施例1，R848、IL-4、IL-2、CD8 T细胞分选试剂盒荧光标记的流式抗体同实施例3。
2.实验步骤
1)根据抗原肽Adpgk的氨基酸序列反推得到抗原肽的DNA序列；设计引物进行环状PCR，将Adpgk的基因序列整合到表达载体pCDH-Zeocin上，得到表达载体pCDH-Adpgk-Zeocin；测序并在HEK293T细胞中进行表达鉴定。
表达Adpgk新抗原的RAW264.7Adpgk小鼠巨噬细胞构建方法使用psPAX2、pM2.GVSVG、pCDH-Adpgk-Zeocin质粒按质量比3:1:4(总量16μg)混合均匀后转染HEK293T细胞，使用终浓度为100μg/mL的博来霉素筛选稳定表达Adpgk的巨噬细胞系，其余详细步骤同实施例1，制备得到表达Adpgk新抗原的RAW264.7Adpgk小鼠巨噬细胞。M2巨噬细胞诱导方法同实施例3，载药微颗粒制备方法同实施例1。
2)M2巨噬细胞逆极化处理及检测方法同实施例3。携带Adpgk新抗原并修饰M2靶向肽的载R848微颗粒(R848@M2pep-MPsAdpgk)处理的M2巨噬细胞作为实验组，不做处理的M2型巨噬细胞作为对照组1，未携带Adpgk新抗原不修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组2；未携带Adpgk新抗原修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(M2pep-MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组3；携带Adpgk新抗原未修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(MPsAdpgk)处理的M2型巨噬细胞作为对照组4；携带Adpgk新抗原并修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(M2pep-MPsAdpgk)处理的M2型巨噬细胞作为对照组5；游离R848作为对照组6；未携带Adpgk新抗原不修饰M2靶向肽的载R848微颗粒(R848@MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组7；未携带Adpgk新抗原修饰M2靶向肽的载R848微颗粒(R848@M2pep-MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组8；携带Adpgk新抗原未修饰M2靶向肽的载R848微颗粒(R848@MPsAdpgk)处理的M2型巨噬细胞作为对照组9。
3)小鼠脾脏CD8 T细胞分离、抗原特异性激活刺激方法同实施例3。
4)上述3)中激活的CD8 T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤检测同实施例3。
3.实验结果
如图4A至图4D所示，相比于未载药微颗粒、游离R848、未携带Adpgk新抗原且未经靶向肽修饰的载药微颗粒、未携带Adpgk新抗原但修饰有靶向肽的载药微颗粒、携带Adpgk新抗原但未经靶向肽修饰的微颗粒，实验组携带Adpgk新抗原且修饰有靶向肽的载药微颗粒能够显著上调M1相关蛋白CD80(图4A)，下调M2相关蛋白CD206(图4B)的表达，逆极化M2巨噬细胞至M1表型；同时，携带Adpgk新抗原且修饰有靶向肽的载药微颗粒处理过的M2型巨噬细胞能够将Adpgk新抗原呈递给CD8 T细胞，促进Adpgk新抗原特异性CD8 T细胞增殖(图4C)、激活(图4D)。表明本实施例提供的载药微颗粒也能够携带肿瘤新抗原，并有效逆极化M2型巨噬细胞，同时利用逆极化后的巨噬细胞作为抗原呈递细胞将微颗粒携带的肿瘤新抗原呈递给CD8 T细胞，刺激CD8 T细胞抗原特异性激活。
实施例5：携带AFP抗原的载谷氨酰胺转运蛋白(SNAT2)抑制剂MeAIB微颗粒重编程M2型巨噬细胞
1.实验材料和试剂
使用的RAW264.7小鼠巨噬细胞以及表达AFP抗原的RAW264.7AFP小鼠巨噬细胞，MeAIB，IL-4、IL-2、CD8 T细胞分选试剂盒、LDH试剂盒、荧光标记的流式抗体同实施例3。
2.实验步骤
1)将R848替换为MeAIB，载药微颗粒收集方法其他步骤同实施例1。其中MeAIB孵育浓度为50nM。
2)M2巨噬细胞诱导方法同实施例3，M2巨噬细胞逆极化处理方法及检测方法同实施例3，携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒(MeAIB@M2pep-MPsAFP)处理的M2型巨噬细胞作为实验组，不做处理的M2巨噬细胞作为对照组1，未携带AFP抗原不修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组2；未携带AFP抗原修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(M2pep-MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组3；携带AFP抗原未修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(MPsAFP)处理的M2型巨噬细胞作为对照组4；携带AFP抗原并修饰M2靶向肽的不载药微颗粒(M2pep-MPsAFP)处理的M2型巨噬细胞作为对照组5；游离R848作为对照组6；未携带AFP抗原不修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒(MeAIB@MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组7；未携带AFP抗原修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒(MeAIB@M2pep-MPs)处理的M2型巨噬细胞作为对照组8；携带AFP抗原未修饰M2靶向肽的载MeAIB微颗粒(MeAIB@MPsAFP)处理的M2型巨噬细胞作为对照组9。
3)小鼠CD8 T细胞分离方法，激活方法以及激活检测方法同实施例3。
4)上述3)中激活的CD8 T细胞对肿瘤细胞的杀伤以及检测方法同实施例3。
3.实验结果
如图5A至图5F所示，相比于未载药微颗粒、游离MeAIB、未携带AFP抗原且未经靶向肽修饰的载药微颗粒、未携带AFP抗原但修饰有靶向肽的载药微颗粒、携带AFP抗原但未经靶向肽修饰的微颗粒，实验组携带AFP抗原且修饰有靶向肽的载药微颗粒能够显著上调M1相关蛋白CD80(图5A)，下调M2相关蛋白CD206(图5B)的表达，逆极化M2巨噬细胞至M1表型；同时，携带AFP抗原且修饰有靶向肽的载药微颗粒处理过的M2巨噬细胞能够显著促进抗原特异性CD8 T细胞增加(图5C)、激活(图5D)，且激活的CD8 T细胞仅对表达AFP抗原的Hepa1-6肿瘤细胞(图5E)而非表达OVA的B16-OVA肿瘤细胞(图5F)具有更特异性杀伤作用。表明本实施例提供的携带肿瘤抗原且修饰有M2靶向肽的微颗粒能够携带各种逆极化M2巨噬细胞的药物实现M2到M1的逆极化作用，同时利用逆极化后的巨噬细胞作为抗原呈递细胞将微颗粒携带的肿瘤抗原加工呈递，刺激CD8 T细胞抗原特异性激活，杀伤表达同种抗原的肿瘤细胞。
实施例6：携带AFP抗原的载药微颗粒对小鼠Hepa1-6原位肝癌的抑制效果
1.实验材料和试剂
使用的RAW264.7细胞同实施例1，Hepa1-6小鼠肝癌细胞、C57BL/6小鼠同实施例2，R848。
2.实验步骤
1)微颗粒收集同实施例1。
2)小鼠Hepa1-6原位肝癌模型构建同实施例2。
3)模型构建10天后，将荷瘤小鼠平均分为10组，每组13只，尾静脉注射PBS、MPs、M2pep-MPs、MPsAFP、M2pep-MPsAFP、R848、R848@MPs、R848@M2pep-MPs、R848@MPsAFP和R848@M2pep-MPsAFP，其中PBS处理组注射100μL PBS；未载药的微颗粒(MPs、M2pep-MPs、MPsAFP、M2pep-MPsAFP)给药剂量为按照蛋白量15mg/kg，并溶解于100μL PBS中进行给药；R848处理组给药剂量为0.5mg/kg；载药微颗粒(R848@MPs、R848@M2pep-MPs、R848@MPsAFP和R848@M2pep-MPsAFP)按照R848给药剂量0.5mg/kg，溶解于100μL PBS中进行给药)。每3天给药一次，总共6次，每天固定时间测量小鼠体重。给药结束后，每组随机抽取8只继续进行生存期实验。其余小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，取出肿瘤组织，称重并拍照。R848@M2pep-MPsAFP处理的荷瘤小鼠为实验组，PBS、MPs、M2pep-MPs、MPsAFP、M2pep-MPsAFP、R848、R848@MPs、R848@M2pep-MPs、R848@MPsAFP处理的荷瘤鼠依次为对照组1、2、3、4、5、6、7、8、9。
3.实验结果
如图6A肿瘤图片以及图6B瘤重所示，R848@M2pep-MPsAFP显著抑制了Hepa1-6原位肿瘤生长，其肿瘤抑制效果明显优于其余各组。同时，生存期结果(图6C)也显示R848@M2pep-MPsAFP显著延长了荷瘤小鼠的生存期，显著优于其余各对照组。
实施例7：携带AFP抗原的载药微颗粒显著改善小鼠Hepa1-6原位肝癌组织中的CD8T细胞数量与质量
1.实验材料和试剂
使用的RAW264.7细胞、R848同实施例1，Hepa1-6小鼠肝癌细胞、C57BL/6小鼠同实施例2。
2.实验步骤
1)微颗粒收集同实施例1。
2)小鼠Hepa1-6原位肝癌模型构建同实施例2。
3)模型构建以及给药处理同实施例6。给药结束后，每组随机抽取5只小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，剥离肿瘤组织并制备成单细胞悬液，制备方法同实施例2，荧光抗体标记后，CytoFLEX S流式细胞仪检测抗原特异性CD8 T细胞数量、激活以及干性样CD8 T细胞数量及分化。CD45+CD3+CD8+AFP212-MHC-I tetramer+为AFP抗原特异性CD8 T细胞，CD45+CD3+CD8+AFP212-MHC-I tetramer+IFNγ+为激活的AFP抗原特异性CD8 T细胞，CD45+CD3+CD8+AFP212-MHC-I tetramer+PD-1+TCF-1+为干性样CD8 T细胞，CD45+CD3+CD8+AFP212-MHC-I tetramer+PD-1+TCF-1-Granzyme B+为分化的干性样CD8 T细胞。R848@M2pep-MPsAFP处理的荷瘤小鼠为实验组，PBS、MPs、M2pep-MPs、MPsAFP、M2pep-MPsAFP、R848、R848@MPs、R848@M2pep-MPs、R848@MPsAFP处理的荷瘤鼠依次为对照组1、2、3、4、5、6、7、8、9。
3.实验结果
如图7A至图7D所示，R848@M2pep-MPsAFP显著促进了肿瘤组织中AFP抗原特异性CD8T细胞的增殖(图7A)与激活(图7B)，同时增加AFP抗原特异性干性样CD8 T细胞的数量(图7C)以及分泌颗粒酶B的终末耗竭型CD8 T细胞(图7D)，说明R848@M2pep-MPsAFP对CD8 T细胞数量及质量的改善作用显著优于其余各对照组。
实施例8：载药微颗粒的生物安全性
1.实验材料和试剂
使用的RAW264.7细胞、R848同实施例1，Hepa1-6小鼠肝癌细胞、C57BL/6小鼠同实施例2。
2.实验步骤
1)微颗粒收集同实施例1。
2)小鼠Hepa1-6原位肝癌模型构建同实施例2。
3)模型构建以及给药处理同实施例6。给药过程中每天测量小鼠体重，给药结束后，取各组小鼠静脉血并离心得到血清，检测血清中谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、血尿素氮含量。R848@M2pep-MPsAFP处理的荷瘤小鼠为实验组，PBS、MPs、M2pep-MPs、MPsAFP、M2pep-MPsAFP、R848、R848@MPs、R848@M2pep-MPs、R848@MPsAFP处理的荷瘤鼠依次为对照组1、2、3、4、5、6、7、8、9。
3.实验结果
如图8A至图8D所示，与注射PBS的对照组小鼠相比，注射R848@M2pep-MPsAFP的小鼠血清中谷丙转氨酶(图8A)、乳酸脱氢酶(图8B)、血尿素氮(图8C)的含量以及小鼠体重(图8D)均无明显变化，说明R848@M2pep-MPsAFP静脉给药不产生肝脏、心肌以及肾脏毒性，携带抗原并修饰M2靶向肽的载药微颗粒对机体无毒副作用。
实施例9：携带AFP抗原的载药微颗粒增强PD-1抗体的抗肝癌效果
1.实验材料和试剂
RAW264.7细胞、R848同实施例1，Hepa1-6小鼠肝癌细胞、C57BL/6小鼠同实施例2。
2.实验步骤
1)微颗粒收集同实施例1。
2)小鼠Hepa1-6原位肝癌模型构建同实施例2。
3)模型构建10天后，将荷瘤小鼠平均分为PBS、R848@M2pep-MPsAFP、PBS+PD-1抗体和R848@M2pep-MPsAFP+PD-1抗体共4组，每组13只。PBS处理组尾静脉注射给药(100μL PBS)，每三天注射一次，共给药6次；R848@M2pep-MPsAFP处理组尾静脉注射给药(依据R848给药剂量为0.5mg/kg给药)，每三天注射一次，共给药6次；PBS+PD-1抗体处理组为二者单独给药，PBS尾静脉注射给药(100μL PBS)后第二天注射PD-1抗体(给药剂量为5mg/kg)，其中PBS每三天注射一次，共给药6次，PD-1抗体每四天注射一次，共给药4次；R848@M2pep-MPsAFP+PD-1抗体处理组为二者单独给药，R848@M2pep-MPsAFP尾静脉注射给药(依据R848给药剂量为0.5mg/kg给药)后第二天注射PD-1抗体(给药剂量为5mg/kg)，其中R848@M2pep-MPsAFP每三天注射一次，共给药6次，PD-1抗体每四天注射一次，共给药4次。给药结束后，每组随机抽取8只继续进行生存期实验。其余小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，取出肿瘤组织，称重并拍照。R848@M2pep-MPsAFP+PD-1抗体为实验组，PBS、R848@M2pep-MPsAFP、PBS+PD-1抗体处理的荷瘤鼠依次为对照组1、2、3。
3.实验结果
如图9A肿瘤图片以及图9B瘤重所示，PD-1抗体+R848@M2pep-MPsAFP显著抑制了Hepa1-6原位肿瘤生长，其肿瘤抑制效果明显优于其余各组。同时，生存期结果(图9C)也显示PD-1抗体+R848@M2pep-MPsAFP显著延长了荷瘤小鼠的生存期，显著优于其余各对照组。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，其特征在于，包括过表达肿瘤抗原的巨噬细胞凋亡产生的微颗粒，以及该微颗粒包裹的药物小分子有效成分，所述药物小分子有效成分为能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的小分子药物；所述微颗粒表面还修饰有M2型巨噬细胞靶向分子。
2.如权利要求1所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，其特征在于，通过慢病毒转染、腺病毒转染、质粒转染或基因编辑方式过表达所述肿瘤抗原；所述巨噬细胞为源自于人体外周血中的循环单核细胞、人源单核细胞系、小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠单核/巨噬细胞系中的一种。
3.如权利要求1所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，其特征在于，所述微颗粒、所述药物小分子有效成分以及所述M2型巨噬细胞靶向分子的质量比为1000：(30-60)：(2-5)。
4.如权利要求1所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，其特征在于，所述肿瘤抗原包括癌症睾丸抗原、肝癌抗原AFP、黑色素瘤抗原、前列腺特异性抗原PSA、前列腺特异性抗原PAP和肿瘤新抗原中的一种或多种，可选地，所述肿瘤新抗原包括Actn4、Adpgk、Ap3d1、Tubb3、Dag1、Eef2、Tnpo3、Tubb3、Reps1、Cpne1和Cpsf3l中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，其特征在于，所述药物小分子有效成分为免疫激动类小分子药物、代谢类小分子药物或其他具有逆极化M2为M1的小分子药物，所述免疫激动类小分子药物为STING激动剂CDN、TLR激动剂R848、R837与poly(I:C)和AMPK激活剂中的一种或多种；所述代谢类小分子药物为芳香烃受体AhR抑制剂和谷氨酰胺转运体抑制剂中的一种或多种；所述其他具有逆极化M2为M1的小分子药物包括组胺受体抑制剂和阿司匹林中的一种或多种；
所述M2型巨噬细胞靶向分子为DSPE-PEG-M2pep、SR-B1靶向肽和DSPE-PEG-Man中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，其特征在于，所述工程化巨噬细胞载药微颗粒的粒径为300～500nm。
7.一种如权利要求1至6任一项所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：通过基因工程改造制备稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞；
S2：将所述稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞经紫外辐照诱导凋亡后，与药物小分子有效成分混匀孵育，所述药物小分子有效成分为能够逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型的小分子药物，收集得到过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒；
S3：将过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒与M2型巨噬细胞靶向分子孵育，通过膜磷脂交换使所述M2型巨噬细胞靶向分子交换至所述载药微颗粒的膜表面，收集得到所述工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂。
8.如权利要求7所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中，通过慢病毒转染、腺病毒转染、质粒转染或基因编辑方式制备稳定过表达所述肿瘤抗原的工程化巨噬细胞。
9.如权利要求7所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述过表达所述肿瘤抗原的载药微颗粒与所述M2型巨噬细胞靶向分子的质量比为(10-100)：1；
步骤S2和S3中，所述收集条件为：在4℃条件下，以500-20000g的离心力收集。
10.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，其包括如权利要求1至7任一项所述的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂；
优选地，所述治疗肿瘤的药物，包括所述工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂，还包括免疫检查点抑制剂，其中所述免疫检查点抑制剂为PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体和VISTA抗体中的一种或多种。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117070455A (zh) * | 2023-04-04 | 2023-11-17 | 山东大学 | 一种巨噬细胞治疗制剂及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用 |
| CN117070455B (zh) * | 2023-04-04 | 2024-05-31 | 山东大学 | 一种巨噬细胞治疗制剂及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109893515A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-06-18 | 华中科技大学 | 一种巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法 |
| CN111918967A (zh) * | 2018-02-12 | 2020-11-10 | 科迪亚克生物科学公司 | 用于巨噬细胞极化的方法和组合物 |
| CN113082223A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-07-09 | 郑州大学 | 纳米载体及含其的药物递送系统 |
| WO2022246112A1 (en) * | 2021-05-19 | 2022-11-24 | University Of Southern California | Chimeric antigen receptor-modified granulocyte-macrophage progenitors for cancer immunotherapy |
-
2022
- 2022-12-27 CN CN202211686017.8A patent/CN115814108A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111918967A (zh) * | 2018-02-12 | 2020-11-10 | 科迪亚克生物科学公司 | 用于巨噬细胞极化的方法和组合物 |
| US20200407725A1 (en) * | 2018-02-12 | 2020-12-31 | Codiak Biosciences, Inc. | Methods and compositions for macrophage polarization |
| CN109893515A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-06-18 | 华中科技大学 | 一种巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法 |
| CN113082223A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-07-09 | 郑州大学 | 纳米载体及含其的药物递送系统 |
| WO2022246112A1 (en) * | 2021-05-19 | 2022-11-24 | University Of Southern California | Chimeric antigen receptor-modified granulocyte-macrophage progenitors for cancer immunotherapy |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHAOJUN DUAN等: "Targeting macrophages in cancer immunotherapy", 《NATURE》, vol. 6, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 1 - 21 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117070455A (zh) * | 2023-04-04 | 2023-11-17 | 山东大学 | 一种巨噬细胞治疗制剂及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用 |
| CN117070455B (zh) * | 2023-04-04 | 2024-05-31 | 山东大学 | 一种巨噬细胞治疗制剂及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用 |
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