CN112538462A

CN112538462A - 一种用于nk细胞快速扩增的细胞膜及其应用

Info

Publication number: CN112538462A
Application number: CN202011563162.8A
Authority: CN
Inventors: 崔大祥; 梁辉; 倪健; 田静; 李雪玲; 沈琦; 高昂
Original assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112538462B

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种NK细胞快速扩增的细胞膜及其应用。本发明还包括该NK细胞的分选和扩增过程。本发明公开了一种细胞膜，是细胞膜表面表达4‑1BBL和IL‑15，本发明还涉及该细胞膜的制备方法。本发明建立了一套NK细胞的分离和快速高效扩增的方法，以PBMC（或以磁珠分离的NK细胞）为原始材料，通过特定细胞因子的刺激，使NK细胞在体外得到特异扩增的方法，获得NK细胞，用于恶性肿瘤的治疗。

Description

一种用于NK细胞快速扩增的细胞膜及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种NK细胞快速扩增的细胞膜及其应用。本发明还包括该NK细胞的分选和扩增过程。

背景技术

NK细胞(自然杀伤细胞，Natural killer cell)作为一种重要的先天性免疫效应细胞，是机体抗肿瘤的第一道防线。NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，存在于淋巴器官和外周组织中，临床将CD56+、CD16+淋巴样细胞鉴定为NK细胞。NK细胞与T细胞不同，属非特异性免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，和肿瘤细胞或被病毒感染的细胞初次相遇就可直接杀伤靶细胞，因此称之为自然杀伤细胞。

NK细胞杀伤靶细胞的方式主要有几种方式：天然细胞毒性（Naturalcytotoxicity）：NK细胞活化后释放穿孔素（perforin）和颗粒酶B(Granzyme B)，穿孔素在靶细胞表面穿孔，使颗粒酶B进入靶细胞发挥直接的广谱性杀伤作用；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）：特异性抗体通过其Fc段结合到NK细胞表面的Fc受体（CD16）上，把NK细胞导向靶细胞，赋予NK细胞特异性，是多种抗癌单克隆抗体的重要作用机理之一；NK细胞产生的细胞因子（NK cell produced factors）：活化的NK细胞分泌IFN-γ，TNF-α, GM-CSF等多种细胞因子，或直接作用于靶细胞，或通过进一步激活其他种类的免疫细胞攻击靶细胞； NK细胞介导的靶细胞凋亡（cell mediated apoptosis of target cell）：NK细胞表达可以诱导细胞凋亡的蛋白（FasL）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），可使靶细胞进入程序性凋亡状态。

目前，NK细胞的抗肿瘤效果在多种血液病恶性肿瘤的临床治疗中已获得了良好的治疗效果。如何有效的获得NK细胞并且快速扩增是利用NK细胞进行细胞治疗的关键。目前用于NK细胞治疗的细胞主要来源于自体分离的NK细胞，在体外通过细胞因子（IL-15，4-1BBL）和饲养层细胞促使NK细胞在2周左右获得快速扩增获得纯度较高的NK细胞，但是采用传统方法NK细胞的扩增效率较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种适于在体外快速扩增NK细胞的基质，为一种细胞膜。

本发明的再一目的在于：提供所述细胞膜的制备方法。

本发明的又一目的在于：提供一种使用所述细胞膜的方法。

针对上述问题，本发明提供了一种NK细胞快速扩增的方法，制备了一种可降解的生物膜结构，将特定的细胞因子通过生物工程的方法表达在膜表面，并且进一步的处理获得了表达细胞因子的膜结构，营造了体内细胞扩增的三维环境，有利于NK细胞的快速扩增。

一方面，本发明提供了一种细胞膜，所述的细胞膜源自细胞膜表面表达4-1BBL和IL-15的人类细胞。

本发明使用源自人类细胞的细胞膜作为NK细胞的扩增基质，可以大幅提高NK细胞的扩增效率。收集NK细胞时，源自人类细胞的细胞膜作为可降解材料，能够通过简易步骤去除，大大提高了后续处理的方便程度，也降低了细胞的损耗和污染概率。

所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。例如，在本发明的一个优选实施例中，所述的细胞膜源自人K562细胞。

在本发明的另一个优选实施例中，所述4-1BBL的氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。所述的IL-15的与跨膜蛋白连接；IL-15、连接物和跨膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2 所示。其核酸编码序列分别为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 1。

另一方面，本发明提供了所述的细胞膜的制备方法，包括：

（1）制备IL-15和4-1BBL蛋白的表达质粒；

（2）IL-15和4-1BBL蛋白的表达质粒转染细胞；

（3）收集并破碎目的蛋白表达成功的细胞，获得细胞膜碎片；

所述的细胞膜源自人类细胞。

较好的，所述的细胞膜碎片通过离心与杂质分离。也可以通过别的常规的分离方法，例如过滤，亲和层析，磁珠法，等等。

再一方面，本发明还提供了所述的细胞膜的应用，所述的细胞膜作为骨架或者基质，促进NK细胞的体外生长。

所述的应用包括以下步骤：

S1，制备表达IL-15和4-1BBL蛋白的质粒；

S2，表达IL-15和4-1BBL蛋白的质粒转染细胞；

所述的细胞为具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系或者单核系的可辨识的祖细胞；

S3，收集并破碎转染成功的细胞，获得细胞膜碎片；

S4，将步骤S3获得的细胞膜碎片、IL-15和4-1BBL蛋白加入培养NK细胞的基质或者容器；细胞膜与IL-15或者4-1BBL蛋白比例为1：2-2：1，摩尔比；

S5，在步骤S4获得的容器中加入NK细胞，NK细胞的接种密度为10⁴-5*10⁶ 个/ml。

其中，表达IL-15和4-1BBL蛋白的质粒可以通过下述方法制备：

获得编码IL-15和4-1BBL蛋白的核酸分子；

在IL-15序列和/或4-1BBL序列末端连接连接物；

将连接后的核酸分子构建入表达载体中；

编码IL-15、连接物、跨膜蛋白的核酸分子序列如SEQ ID NO 1所示,编码4-1BBL蛋白的核酸分子的序列如SEQ ID NO 3所示。

本发明的一个优选实施例中，获得NK细胞的方法如下：首先采用梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）；

其次，由于NK细胞为CD16+、CD56+、CD3-细胞，采用流式分选的方法从PBMC中分选NK细胞。

本发明通过建立了一套NK细胞的分离和快速高效扩增的方法，从PBMC（或以磁珠分离的NK细胞）为原始材料，通过特定细胞因子的刺激，使NK细胞在体外得到特异扩增的方法，获得NK细胞，用于恶性肿瘤的治疗。本发明使用表达细胞因子的细胞膜促进NK细胞的体外增殖，增殖效率比普通NK细胞培养方法提高了10000倍余，解决了目前临床推广应用上的数量、纯度、活性三大瓶颈。本发明制备获得可以在细胞膜表面高效表达的跨膜细胞因子的细胞系用于刺激NK细胞的高效扩增高效材料结构。

附图说明

图1是膜扩增NK细胞示意图；

图2是NK细胞采用不同的细胞因子铺板的扩增效率比较图。

具体实施方式

本发明主要是集中在快速扩增NK细胞为切入点，结合NK细胞表面的靶点，从细胞因子方面入手，根据我们在细胞治疗中以往的经验，将4-1BBL和IL-15在K562细胞膜表面表达，经过一系列处理获得了可以快速扩增NK细胞的以K562细胞为骨架的生物膜的人工抗原提呈细胞（aAPC），获得的嵌合在K562细胞膜上的4-1BBL和IL-15可实现NK细胞扩增的能力比常规方法更强。

实施例1

IL-15和4-1BBL表达质粒的合成和构建：

从NCBI的数据库中获取IL-15和4-1BBL的核酸和氨基酸序列，采用全基因合成的方法分别合成IL-15和4-1BBL分子，然后将获得的IL-15序列和4-1BBL分子分别通过双酶切的方法构建入PCDNA3.1分子中，将获得转染阳性的菌种扩大培养，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取PCDNA3.1-IL-15和4-1BBL的质粒。

核酸序列:( IL -15+linker+跨膜蛋白)

gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGATGAGAATTTCGAAACCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTTCTAAACAGTCATTTTCTAACTGAAGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGAGGCTCCTCCTCCTCCTCCGGCTCCTCCTCCTCCTGGGCCC TGGTGGCCGGCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGCCGCCGCCTGCGCCGTGTTCCTGgcggccgc（SEQ ID NO1）。

氨基酸序列：

MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSSSSSGSSSSWALVAGLLLLLLLAAACAVFL（SEQ ID NO 2）。

4-1BBL序列如下：

核酸序列，

gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAATAAgcggccgc（SEQ ID NO 3）。

对应的氨基酸序列，

MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE（SEQ ID NO 4）。

实施例2

K562细胞的培养的转染：

K562细胞的复苏和培养：

K562的原始细胞是一种具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。培养条件： 1640培养基 10%FBS，传代方法：维持细胞密度在10⁵-10⁶个/ml之间，每周换液2-3次。

电转染：

使用BIO-RAD的电转仪对PCDNA3.1-IL-15和4-1BBL的质粒电转，步骤如下：

0.2 cm电转杯，细胞密度为10x10^6 cells/ml，DNA用量为2μg，电转液的体积为100μl，电压为130V，电容为950μF。电转后迅速加入1640培养基，将细胞转入培养瓶中恢复培养。

实施例3

NK细胞扩增的细胞膜的制备

在K562细胞密度长到10⁹-10¹⁰个/ml的时候，收取细胞，使用PBS洗涤细胞，加入10mM tris盐酸溶液，放入4℃搅拌2小时，让细胞破碎，然后低温离心30分钟，收取沉淀，使用10mM tris盐酸溶液清洗3次，低温高速离心10分钟后，用PBS重悬沉淀，得到K562细胞膜的材料。

实施例4

K562细胞膜扩增NK细胞的效率

首先采用梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），NK细胞为CD16+、CD56+、CD3-细胞。采用流式分选的方法从PBMC中分选NK细胞，分别采用等摩尔浓度的K562细胞膜和单独的IL-15和4-1BBL蛋白分子处理T25的细胞培养瓶，将10⁵个/ml的NK细胞加入T25培养瓶中培养，联系培养7天后，对NK细胞计数，计算扩增效率。

试验结果显示，膜表达IL-15和4-1BBL蛋白的K562细胞膜扩增效率在7天内可以大于10⁹，扩增效率超过10000倍。

图1是膜扩增NK细胞示意图，免疫细胞的扩增需要不同的信号刺激，制备的可降解的生物膜具有不同的信号分子传递不同的信号。

图2是NK细胞采用不同的细胞因子铺板的扩增效率比较图，分别采用含有等摩尔浓度K562 细胞膜制备的4-1BBL和IL-15的游离的4-1BBL和IL-15的培养基培养NK细胞，计算不同方法对NK细胞的扩增效率。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

<120> 一种用于NK细胞快速扩增的细胞膜及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 664

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60

ggtgtgcagt gatgagaatt tcgaaaccac atttgagaag tatttccatc cagtgctact 120

tgtgtttact tctaaacagt cattttctaa ctgaagctgg cattcatgtc ttcattttgg 180

gctgtttcag tgcagggctt cctaaaacag aagccaactg ggtgaatgta ataagtgatt 240

tgaaaaaaat tgaagatctt attcaatcta tgcatattga tgctacttta tatacggaaa 300

gtgatgttca ccccagttgc aaagtaacag caatgaagtg ctttctcttg gagttacaag 360

ttatttcact tgagtccgga gatgcaagta ttcatgatac agtagaaaat ctgatcatcc 420

tagcaaacaa cagtttgtct tctaatggga atgtaacaga atctggatgc aaagaatgtg 480

aggaactgga ggaaaaaaat attaaagaat ttttgcagag ttttgtacat attgtccaaa 540

tgttcatcaa cacttcttga ggctcctcct cctcctccgg ctcctcctcc tcctgggccc 600

tggtggccgg cctgctgctg ctgctgctgc tggccgccgc ctgcgccgtg ttcctggcgg 660

ccgc 664

<210> 2

<211> 194

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Trp Ala Leu

165 170 175

Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val

180 185 190

Phe Leu

<210> 3

<211> 842

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60

ggtgtgcagt gtgaatacgc ctctgacgct tcactggacc ccgaagcccc gtggcctccc 120

gcgccccgcg ctcgcgcctg ccgcgtactg ccttgggccc tggtcgcggg gctgctgctg 180

ctgctgctgc tcgctgccgc ctgcgccgtc ttcctcgcct gcccctgggc cgtgtccggg 240

gctcgcgcct cgcccggctc cgcggccagc ccgagactcc gcgagggtcc cgagctttcg 300

cccgacgatc ccgccggcct cttggacctg cggcagggca tgtttgcgca gctggtggcc 360

caaaatgttc tgctgatcga tgggcccctg agctggtaca gtgacccagg cctggcaggc 420

gtgtccctga cggggggcct gagctacaaa gaggacacga aggagctggt ggtggccaag 480

gctggagtct actatgtctt ctttcaacta gagctgcggc gcgtggtggc cggcgagggc 540

tcaggctccg tttcacttgc gctgcacctg cagccactgc gctctgctgc tggggccgcc 600

gccctggctt tgaccgtgga cctgccaccc gcctcctccg aggctcggaa ctcggccttc 660

ggtttccagg gccgcttgct gcacctgagt gccggccagc gcctgggcgt ccatcttcac 720

actgaggcca gggcacgcca tgcctggcag cttacccagg gcgccacagt cttgggactc 780

ttccgggtga cccccgaaat cccagccgga ctcccttcac cgaggtcgga ataagcggcc 840

gc 842

<210> 4

<211> 254

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

Claims

1.一种细胞膜，其特征在于，所述的细胞膜为细胞膜表面表达4-1BBL和IL-15的人类细胞的细胞膜。

2.根据权利要求1所述的细胞膜，其特征在于，所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能够自发分化为红系、粒系或者单核系的可辨识的祖细胞。

3.根据权利要求2所述的细胞膜，其特征在于，所述的细胞膜源自人K562细胞。

4.根据权利要求1所述的细胞膜，其特征在于，所述4-1BBL的氨基酸序列如SEQ ID NO4 所示。

5.根据权利要求1所述的细胞膜，其特征在于，所述的IL-15的与跨膜蛋白连接；IL-15、连接物和跨膜蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO 2 所示。

6.一种权利要求1至5任一项所述的细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：

（1）制备IL-15和4-1BBL蛋白的表达质粒；

（2）IL-15和4-1BBL蛋白的表达质粒转染细胞；

（3）收集并破碎成功表达目的蛋白的细胞，制备细胞膜的碎片；

所述的细胞膜源自K562细胞。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的细胞膜碎片通过离心与杂质分离。

8.一种权利要求1至5任一项所述的细胞膜的应用，其特征在于，所述的细胞膜作为骨架或者基质，促进NK细胞的体外生长。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：

S1，制备表达IL-15和4-1BBL蛋白的质粒；

S2，表达IL-15和4-1BBL蛋白的质粒转染到K562细胞；

S3，收集并破碎转染成功的K562细胞，获得细胞膜碎片；

S4，将步骤S3获得的细胞膜碎片、IL-15和4-1BBL蛋白加入培养NK细胞的介质或者容器；细胞膜与IL-15或者4-1BBL蛋白比例为1：2-2：1，摩尔比；

S5，在步骤S4所述的容器或者介质中加入NK细胞，NK细胞的接种密度为10⁴-5*10⁶个/ml；

所述的NK细胞通过下列步骤获得：

采用梯度离心法分离外周血单个核细胞；根据NK细胞为CD16+、CD56+、CD3-细胞，采用流式分选的方法从外周血单个核细胞中分选NK细胞。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，表达IL-15和4-1BBL蛋白的质粒通过下述方法制备：

获得编码IL-15和4-1BBL蛋白的核酸分子；

在IL-15序列和/或4-1BBL核酸分子末端连接连接物；

将连接后的核酸分子构建入表达载体中；

编码IL-15、连接物、跨膜蛋白的核酸分子序列如SEQ ID NO 1所示，编码4-1BBL蛋白的核酸分子的序列为SEQ ID NO 3所示。