CN110628716A - 一种用于nk细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种用于nk细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法及其应用。所述脂质体表面通过亲和素‑生物素系统挂载了IL‑15片段、IL‑21片段、4‑1BBL片段，可以加入NK细胞扩增体系中作为Feeder，克服了现有NK feeder的缺点，显著减少细胞因子的加入，并增强其对肿瘤细胞的细胞毒活性。本发明为体外NK培养扩增提供了一种新策略，可以在14天中实现外周血NK细胞800～1000倍的扩增，并显著增强NK细胞的杀伤活性，为肿瘤或其他感染性疾病的过继性免疫治疗提供了新方法。

Description

一种用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方 法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫治疗和脂质体药物治疗领域，具体地说，是一种挂载有细胞因子和NK细胞活化配体片段的脂质体药物及其制备方法和应用。
背景技术
早在世纪70年代中期，研究人员就已揭示出NK细胞无需预先致敏即具有在体外裂解癌细胞系而的能力。此后大量研究表明NK细胞可在体内外杀伤多种不同类型的小鼠和人肿瘤细胞系及移植瘤。进而，在化合物诱导的肿瘤和转基因自发性模型中，证明了NK细胞可通过识别癌细胞表达配体的响应受体来识别恶化细胞，发挥免疫监视功能；NK细胞缺陷型小鼠，具有NK细胞受体配体的肿瘤细胞占主导地位。此外，通过荷瘤小鼠中的活体双光子成像观察，研究者明确了NK和肿瘤细胞之间的体内的动态相互作用，在癌症杀伤过程中， CTL与肿瘤细胞形成稳定的接触(“hug to die”)，而NK细胞与其靶细胞建立了快速接触(“kissto die”)。CTL还在细胞接触中表现出持续的钙通量反应，而NK细胞发生瞬时和/或有限的反应。
在人类中，NK细胞靶向杀伤肿瘤的证据来自同种异体造血干细胞移植 (HSCT)，用于治疗急性髓性白血病(AML)患者。NK细胞是HSCT后首先恢复的淋巴细胞群，其中可以产生供体来源的同种异体反应性NK细胞(至少一个KIR/HLA与受体错配)，产生移植物抗白血病(GvL)效果并防治肿瘤复发。HSCT后NK细胞的快速恢复对AML患者的临床预后有积极影响，移植后30天NK细胞计数作为移植预后的单一独立决定因素出现。更为重要的的证据来自于流行病学调查，对日本的3625名居民11年随访结果表明，NK细胞的细胞毒活性与癌症发病率呈负相关，高NK裂解活性的个体比低细胞毒活性的个体表现出更低的癌症发生率。因此，NK细胞回输是一种针对肿瘤或其他感染性疾病的过继性免疫治疗新方法。
但是NK细胞在大多数人中仅构成总淋巴细胞的很小一部分(5％～25％)，因此不容易获得足够的细胞用于治疗。因此，已经进行了许多努力来研究NK 细胞扩增以获得大量用于治疗的NK细胞。NK细胞扩增有许多可能的方法。有些是成功的，实现了超过千倍的扩增，而其他方法只能产生很少的扩增。多种因素都可能导致难以获得足够的细胞数量：内在因素是NK细胞谱系的变异、细胞条件或供体细胞的差异，其中一些供体的NK细胞可能更倾向于扩增，而另一些供体的NK细胞则难以在培养中存活，这与供体的免疫状态、生理条件密切相关；外在因素主要是培养条件(培养基，细胞因子，饲养细胞)和培养持续时间。在过继性细胞回输中，培养条件在NK细胞的扩增中至关重要，这确保了NK细胞可以在体外培养中维持增殖能力同时不丧失生理活性。
在培养体系中使用饲养细胞是另外一种显著改进NK细胞扩增活性的办法。最常见的饲养细胞是基因修饰的K562细胞，可通过基因工程改造的方法使其膜表面表达刺激分子和膜绑定的细胞因子来激活并扩增NK细胞，效果要由于单独使用可溶性细胞因子。Hiroyuki Fujisaki等(Fujisaki H,et al.Expansion of highly cytotoxic humannatural killer cells for cancer cell therapy.Cancer Res. 2009May 1；69(9):4010-4017)开发了工程化的K562细胞，加入膜绑定的IL-15 和41BB配体融合蛋白(K562-mb15-41BBL)，其目前在临床NK细胞疗法试验(NCT02123836)中使用。Denman等(Denman,C.J,et al.Membrane-bound IL-21promotes sustained ex vivo proliferation ofhuman natural killer cells.PloS one 7,e30264)开发了表达膜绑定IL-21的工程化K562，将NK细胞在膜绑定 IL-15的K562中培养变体中培养后再将饲养细胞更换为膜绑定IL-21的K562，使NK细胞的表型更为成熟且不发生衰老。
但是迄今为止，除了基于K562人工抗原提呈细胞的策略之外，尚没有较好的体外扩增NK细胞的方案。但K562作为饲养层细胞依然存在诸多问题， K562细胞是来源于人髓性白血病的细胞系，因此在作为饲养细胞前必须经过辐照或者丝裂霉素处理防止其增殖；但K562在培养体系中呈悬浮生长，会与 NK细胞混在在一起难以完全分离，因此通过该途径扩增的NK细胞在临床应用中具有潜在风险。
脂质体是双亲性脂分子在水相中进行自组装形成的双层膜脂小泡，脂质体不仅可以将特定物质(如药物和基因片段)包埋在脂质体内部，形成特定的运输系统；也可以将特定蛋白挂载在脂质体表面。最新有数项研究通过将脂质体表面负载生物活性分子，在动物模型中实现了有效治疗。如：Toita等(Toita R, et al.Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugatedliposomes in obese mice.Biomaterials,2016,110: 81-88)将IL-10分子挂载于脂质体表面用于治疗肥胖小鼠、控制其体内炎症； Francesca等(Giannoni F,et al.Clusteringof T cell ligands on artificial APC membranes influences T cell activationand protein kinase C theta translocation to the T cell plasma membrane.JImmunol,2005,174(6):3204-3211)将MHC-肽复合物以及粘附分子挂载于脂质体表面，成功构建了活化T细胞的人工抗原提呈细胞(aAPC)；Razazan等(Razazan A,et al.Conjugatednanoliposome with the HER2/neu-derived peptide GP2as an effective vaccineagainst breast cancer in mice xenograft model.PLoS One,2017,12(10):e0185099)将纳米抗体偶联在脂质体表面，用来特异性运载肿瘤抗原。
发明内容
本发明的目的在于通过将细胞因子IL-15和IL-21功能片断以及活化受体配体4-1BBL保卫功能段装载至人工脂质体表面，从而提供一种可加入NK细胞体外扩增体系中作为Feeder的生物药物，该脂质体药物可以显著减少细胞因子的加入，并增强其对肿瘤细胞的细胞毒活性，为肿瘤或其他感染性疾病的过继性免疫治疗提供了新方法。
为了实现上述目的，本发明设计的脂质体药物具有以下特征：①脂质体制备时需要掺入特殊膜脂分子构成挂载位点；②通过表达靶向挂载位点的单链抗体-链霉亲和素系统，在脂质体表面形成挂载中心；③所使用的蛋白片段需要进行有效的生物素化，从而可以连接至挂载中心。
本发明的第一方面，提供一种用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，携带挂载位点的脂质体制备：
制备人工脂质体，所述的人工脂质体由下列配方制备而成：磷脂酰胆碱、胆固醇、神经节苷脂GM2各5mg～50mg、1mg～20mg、0.1～2mg；之后每20μL 人工脂质体加入DSPE-PEG100～500mg，50℃水浴10min进行修饰；
步骤B，神经节苷脂GM2的单链抗体-链霉亲和素融合蛋白表达纯化：
链霉亲和素偶联的GM2单链抗体按VL-(G4S)3-VH-G3S-SA-GFP的方式合成全长，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；挂载元件连接FLAG标签与人 IgG1Fc段；所有蛋白均使用OptiCHOTM Express系统分泌表达；链霉亲和素偶联的GM2单链抗体使用亚氨基生物素琼脂糖珠纯化，挂载元件使用ProteinA柱纯化后，使用肠激酶切除Fc端，用FLAG柱进行二次亲和纯化；
步骤C，挂载元件的表达纯化：
挂载元件包括IL-15功能段、IL-21功能段和4-1BBL功能段；3个挂载元件分别以IL15-G4S-FLAG-Fc、IL21-G4S-FLAG-Fc与41BBL-G4S-FLAG-Fc融合蛋白的形式进行表达，其核酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示，其蛋白序列分别如SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6与SEQ ID No.7 所示；
步骤D，挂载元件的生物素化：
挂载元件的生物素化使用Sulfo-NHS-Biotin进行反应；
步骤E，脂质体药物装载：
步骤A制备的人工脂质体中加入步骤B制备的链霉亲和素偶联的GM2单链抗体融合蛋白，浓度为0.1～1ng/μL，4℃颠倒混匀过夜；将步骤C制备的生物素化的IL-15功能段、IL-21功能段和4-1BBL功能段等摩尔混合后，按 100:1～200:1的摩尔比与负载链霉亲和素偶联GM2单链抗体融合蛋白后的脂质体混合，室温颠倒混匀，透析去除未结合蛋白，完成脂质体药物的制备。
进一步的，所述的步骤A中，采用超声薄膜法、逆向蒸发法、梯度反向装载法、或双乳化法制备人工脂质体。优选超声薄膜法。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤A中，人工脂质体采用超声薄膜法制备：分别称取磷脂酰胆碱、胆固醇、神经节苷脂GM2各5mg～50mg、 1mg～20mg、0.1～2mg，于室温中在氯仿/甲醇(体积比5：1)溶液中过夜震荡溶解，使用旋转蒸发仪37℃抽干有机溶剂，使之在茄型烧瓶壁上形成均匀的脂质体膜，往瓶中充氮气5min，使残余有机溶剂充分挥发；加入pH＝6.5的PBS (0.5M)5mL，震荡至膜充分溶解，超声仪超声1～2min，至脂质体溶液分散为均匀、稳定的透明液体，得到人工脂质体；之后每20μL脂质体加入DSPE-PEG 100～500mg，50℃水浴10min进行修饰，增强其体内稳定性。
进一步的，所述的步骤B中，链霉亲和素偶联的GM2单链抗体按VL-(G4S)3 -VH-G3S-SA-GFP的方式合成全长，蛋白质的表达采用ExpiCHO系统，将GM2 的单链抗体-链霉亲和素融合蛋白克隆至pcDNA3.4载体后，转染CHO细胞； 37℃，8％CO2环境下振荡培养8天后，收集细胞悬液；5000rpm～6000rpm离心10～15min去除细胞后，使用等体积2×PBS稀释。
进一步的，所述的步骤B中，挂载元件使用Protein A柱进行第一轮纯化，完成纯化后使用Tris-HCl中和pH值至8.0，使用肠激酶切除Fc端，按0.2U 肠激酶/1mg总蛋白25℃过夜酶切，酶切产物使用FLAG亲和柱进行二次亲和纯化；纯化产物使用Tris-HCl中和至pH＝7.5，使用35kDa超滤管浓缩蛋白。
进一步的，所述的步骤C中，将所述的IL15-G4S-FLAG-Fc、 IL21-G4S-FLAG-Fc与41BBL-G4S-FLAG-Fc三个融合蛋白克隆至pcDNA3.4 载体后，转染CHO细胞；37℃，8％CO2环境下振荡培养5～10天后，收集细胞悬液；5000rpm～6000rpm离心10～15min去除细胞后，使用等体积2×PBS稀释；使用Protein A进行第一轮纯化；完成纯化后使用Tris-HCl中和pH值＝8.0，按0.2U肠激酶/1mg总蛋白25℃过夜酶切，酶切产物使用FLAG亲和柱纯化；纯化产物使用2×PBS中和至pH＝7.5，使用10kDa超滤管浓缩蛋白。
进一步的，所述的步骤D中，对步骤C制备的挂载元件定量后，将元件肽段与Sulfo-NHS-Biotin按摩尔比1:3～1:5在pH＝7.5～8.5PBS中室温反应 30min；使用10kDa透析袋去除未结合的Sulfo-NHS-Biotin，超滤浓缩生物素化的挂载元件。
进一步的，除了在脂质体膜表面负载肽段用于促进NK细胞活化和增强其细胞毒活性，所述的脂质体药物本身制备过程中也可封包化疗药物进一步提高肿瘤的体内杀伤效果。所述的化疗药物的包括但不限于烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、天然小分子化物、激素与激素拮抗剂。可以实现药物缓释，进一步提高肿瘤的杀伤效果。
进一步的，除了在脂质体膜表面负载肽段用于促进NK细胞活化和增强其细胞毒活性，所述的脂质体药物本身制备过程中也可封包抗生素和抗病毒药物，用于感染性疾病的治疗。所述的抗生素包括但不限于氨基己糖类抗生素、多肽类抗生素、多烯类抗生素、大环内酯抗生素、四环类抗生素和嘌呤类抗生素。所述的抗病毒药物包括但不限于非开环核苷类药物、开环核苷类药物、蛋白酶抑制剂药物、干扰素类药物、以及金刚烷等其他抗病毒药物。可以帮助免疫系统进一步清除异物或杀伤感染、转化的细胞。
进一步的，除了在脂质体膜表面负载肽段用于促进NK细胞活化和增强其细胞毒活性，所述的脂质体药物本身制备过程中也可封包细胞因子和趋化因子，包括IL-1β、IL-2、IL-8、IP-10、CCL2、CXCL2等，用于瘤内注射，促进冷肿瘤向热肿瘤转化。
进一步的，除了在脂质体膜表面负载肽段用于促进NK细胞活化和增强其细胞毒活性，所述的脂质体药物本身制备过程中也可挂载生物素化的抗体、生物素化的单链抗体或生物素化的纳米抗体，从而实现脂质体的靶向性，使其在特定组织器官中富集，或者与特定细胞发生相互作用。
本发明的第二方面，提供一种用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物，其采用如上任一所述的制备方法制备得到。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物在制备治疗肿瘤或感染性疾病的药物中的应用。
进一步的，所述的肿瘤主要为CAR-NK或CAR-T所针对的肿瘤类型，包括但不限于血液系统肿瘤，如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性组织细胞病等；包括但不限于实体肿瘤，如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、肝癌、胆管胆囊癌、胰腺癌、胃肠道间质瘤、头颈部癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤等。
进一步的，所述的感染性疾病包括但不限于肺炎伴感染性休克、腹膜炎、. 菌血症、脓毒症、败血症等。
本发明优点在于：
1、本发明提供了一种用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法及其应用，所述脂质体表面通过亲和素-生物素系统挂载了IL-15片段、IL-21片段、4-1BBL片段，可以加入NK细胞扩增体系中作为Feeder，克服了现有NK feeder的缺点，显著减少细胞因子的加入，并增强其对肿瘤细胞的细胞毒活性。
2、本发明为体外NK培养扩增提供了一种新策略，可以在14天中实现外周血NK细胞800～1000倍的扩增，并显著增强NK细胞的杀伤活性，为肿瘤或其他感染性疾病的过继性免疫治疗提供了新方法。
附图说明
图1为人工脂质体制备流程图。
图2为脂质体药物中各种元件的挂载模式图。
图3为使用红色荧光蛋白mCherry为质控分子检测挂载效率与脂质体直径(Scalebar：10μm)。
图4为脂质体药物对NK细胞的体外扩增效果。
图5为脂质体药物对NK细胞杀伤活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA 和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA 克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑， 1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV 卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：脂质体的设计与制备
实验方法：
人工脂质体的制备：人工脂质体采用超声薄膜法制备。分别按照比例称取磷脂酰胆碱(Sigma,V900485)、胆固醇(Sigma,C8667)、神经节苷脂GM2(Sigma, G4651)，室温在氯仿/甲醇(5：1)溶液中过夜震荡溶解，使用旋转蒸发仪37℃抽干有机溶剂，使之在茄型烧瓶壁上形成均匀的脂质体膜，往瓶中充氮气5min，使残余有机溶剂充分挥发。加入pH＝6.5的PBS(0.5M)5mL，震荡至膜充分溶解，超声仪超声1～2min，至脂质体溶液分散为均匀、稳定的透明液体，得到人工脂质体。之后每20μL脂质体加入DSPE-PEG 200mg，50℃水浴10min 进行修饰，增强其稳定性。
脂质体相关元件蛋白的设计、表达与纯化：链霉亲和素偶联的GM2单链抗体按VL-(G4S)3-VH-G3S-SA-GFP的方式合成全长，其中单链抗体scFv (VL+VH)序列来源于专利US5830470；挂载元件连接FLAG标签与人IgG1Fc 段；所有蛋白均使用OptiCHOTM Express系统分泌表达。链霉亲和素偶联的 GM2单链抗体使用亚氨基生物素琼脂糖珠纯化(PurKine,KTP20306)，挂载元件使用ProteinA柱(天地人和，SA012K)纯化后，使用肠激酶(上海雅心，REK08)切除Fc端，用FLAG柱(天地人和，SA042001)进行二次亲和纯化。挂载元件的生物素化使用Sulfo-NHS-Biotin(上海生工，C100213)进行反应。
人工脂质体的装载：人工脂质体200μL中加入100ng链霉亲和素偶联的 GM2单链抗体，4℃颠倒混匀过夜。荧光显微镜计数脂质体密度。将生物素化的IL-15功能段、IL-21功能段和4-1BBL功能段等摩尔混合后，按100:1～200:1 的摩尔比与脂质体混合，室温颠倒混匀30min，使用35KD透析袋透析去除未结合蛋白，完成脂质体制备。
实验结果：
人工脂质体采用超声薄膜法制备。磷脂酰胆碱、胆固醇、神经节苷脂GM2按比例分别溶解于氯仿/甲醇溶液，使用旋转蒸发仪抽干有机溶剂，使之在茄型烧瓶壁上形成均匀的脂质体膜，之后加入pH＝6.5的PBS震荡使质体膜充分水化，并通过超声法使脂质体溶液分散为均匀、稳定的透明液体(图1)。
IL-15功能段、IL-21功能段和4-1BBL功能段采用如图2中所示方案挂载至人工脂质体上：通过表达融合链霉亲和素蛋白(Streptavidin)的抗神经节苷脂GM2单链抗体，与膜上的GM2结合形成挂载支架，之后将生物素修饰的功能段与之共孵育，形成人工脂质体药物。
实施例2：基于GM2单链抗体SA融合蛋白的脂质体挂载效率与特异性检测
实验方法：
使用生物素化的红色荧光蛋白(mCherry)进行脂质体挂载效率测定。 mCherry(Abcam,ab199750)使用Sulfo-NHS-Biotin进行反应，进行生物素化。按实施例1中的方法挂载脂质体后，荧光检测挂载效率。未生物素化的mCherry 与脂质体共孵育后，透析去除未结合的mCherry，用于测定挂载特异性。
实验结果：
使用带有GFP标签的scFv亲和素融合蛋白和生物素化的mCherry蛋白测定该系统挂载效率，结果表明该系统具有较好的挂载效率，生物素化的mCherry 成功挂载到所有脂质体表面(图3左)；同时该系统具有很好的挂载特异性，未生物素化的mCherry不能挂载到脂质体表面(图3右)。此外脂质体直径分布较为均匀，其大小约为50-200nm(图3)。
实施例3：脂质体药物对NK细胞的体外扩增效果
实验方法：
50mL成人外周血用HBSS缓冲液稀释后，使用Ficoll分离PBMC。使用 CD56(APC)、CD16(FITC)抗体标记NK细胞并进行分选。分选后的细胞在重悬于SCGM培养基中，对照组加入终浓度为500U/mL重组人IL-15，脂质体处理组按1：1比例加入与NK细胞等量的人工脂质体。37℃、5％CO2条件下体外共培养。21天的观察周期内定时取样，使用流式细胞术进行细胞计数。当NK细胞密度大于2×106/mL时补充SCGM培养基，并加入终浓度为 500U/mL的重组人IL-15，或与细胞数相等的脂质体药物。
实验结果：
分离纯化的NK细胞的接种量均为5×107个，经过21天的扩增，对照组 NK细胞扩增了约40倍，而脂质体处理组细胞扩增了250倍以上(图4)。说明此培养方法能有效诱导NK细胞扩增。
实施例4：脂质体药物对NK细胞杀伤活性的提高
实验方法：
NK细胞的培养与处理：50mL成人外周血用HBSS缓冲液稀释后，使用 Ficoll分离PBMC。使用CD56(APC)、CD16(FITC)抗体标记NK细胞并进行分选。分选后的细胞在重悬于SCGM培养基中，对照组加入终浓度为 500U/mL重组人IL-15，脂质体处理组按1：1比例加入与NK细胞等量的人工脂质体。37℃、5％CO2条件下体外共培养。当NK细胞密度大于2×106/mL时补充SCGM培养基，并加入终浓度为500U/mL的重组人IL-15，或与细胞数相等的脂质体药物。
NK细胞杀伤效果检测：NK细胞、K562细胞的效靶比为10:1和5:1，杀伤时间为2hrs。靶细胞使用CSFE(sigma，150347)进行标记，每106个靶细胞中加入50μM的CSFE 10μL，37度避光孵育15min。冰冷PBS洗2次，使用杀伤培养基重悬细胞。效应细胞K562每孔为4万或8万，NK细为每孔40 万。按效靶比将500μL的CAR-NK细胞与靶细胞充分混匀，在细胞培养箱中杀伤2hrs。两小时之后，5000rpm离心5min，100μL PBS重悬细胞，加入5μL 7-AAD使用FACS检测杀伤效率。
实验结果：
比较IL-15处理的对照组对靶细胞的杀伤效果，脂质体药物处理的NK细胞具有更高的杀伤活性(图5)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法及其应用
<130> /
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2154
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atgcacttcc aggtgcagat cttcagcttc ctgctgatca gcgccagcgt gatcatgagc 60
cgcggccaga tcgtgctgac ccagagcccc gccatcatga gcgccagccc cggcgagaag 120
gtgaccatca cctgcagcgc cagcagcagc gtgagctaca tgcactggtt ccagcagaag 180
cccggcacca gccccaagct gtggatctac agcaccagca acctggccag cggcgtgccc 240
gcccgcttca gcggcagcgg cagcggcacc agctacagcc tgaccatcag ccgcatggag 300
gccgaggacg ccgccaccta ctactgccag cagcgcagca gctaccccta caccttcggc 360
ggcggcacca agctggagat caagcgcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 420
ggcggcggca gcatgggctg gagctggatc ttcctgttcc tgctgagcgg caccgccggc 480
gtgctgagcg aggtgcagct gcagcagagc ggccccgagc tggtgaagcc cggcgccagc 540
gtgaagatca gctgcaaggc cagcggctac accttcaccg actacaacat ggactgggtg 600
aagcagagcc acggcaagag cctggagtgg atcggctaca tctaccccaa caacggcggc 660
accggctaca accagaagtt caagagcaag gccaccctga ccgtggacaa gagcagcagc 720
accgcctaca tggagctgca cagcctgacc agcgaggaca gcgccgtgta ctactgcgcc 780
acctacggcc actactacgg ctacatgttc gcctactggg gccagggcac cctggtgacc 840
gtgagcgccg gcggcggcgg cagcatgcgc tgcaccatcg tgctgggcat ccgcgccgcc 900
agccccatca aggaggccct ggcccgcccc gccccccgcc ccggccgcct gcccagcatc 960
caccgcagcg gccgccgcaa catgcagcgc ctggagcacg tgctgcgccg cgtgaaggcc 1020
ggcaccggcg cccccatcga cttcagcggc acctggaaga acgagctggg cagcaccatg 1080
cgcatcgagc agagcggcga cagcgtgagc ggcacctacg agagcgccgt gagcgagaac 1140
ggcggcgcca ccagcggcca gctgagcggc tacgtggacg gcgacctgat cgccttcgtg 1200
gtgcactggg accagttcca ggccatcacc gcctgggtgg gccagggcgg ccccggcgcc 1260
agcagcgacc gcatcaacac cctgtggcag atgacccagc aggtggaggc cggcgaggag 1320
tgggccagca tcaacgccgg cgccgacatc ttcgtgaaga ccgtgagcaa gggcgaggag 1380
ctgttcaccg gcgtggtgcc catcctggtg gagctggacg gcgacgtgaa cggccacaag 1440
ttcagcgtga gcggcgaggg cgagggcgac gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 1500
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tggtgaccac cctgacctac 1560
ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagagc 1620
gccatgcccg agggctacgt gcaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 1680
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 1740
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctgggccaca agctggagta caactacaac 1800
agccacaacg tgtacatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 1860
atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctggccg accactacca gcagaacacc 1920
cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagagcgcc 1980
ctgagcaagg accccaacga gaagcgcgac cacatggtgc tgctggagtt cgtgaccgcc 2040
gccggcatca ccctgggcat ggacgagctg tacaagagcg gcgccgccgc cgccgccgcc 2100
gccgccgccg ccgagttccc cggcctggag aagctgggca gcaccggcag ccgc 2154
<210> 2
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
aactgggtga acgtgatcag cgacctgaag aagatcgagg acctgatcca gagcatgcac 60
atcgacgcca ccctgtacac cgagagcgac gtgcacccca gctgcaaggt gaccgccatg 120
aagtgcttcc tgctggagct gcaggtgatc agcctggaga gcggcgacgc cagcatccac 180
gacaccgtgg agaacctgat catcctggcc aacaacagcc tgagcagcaa cggcaacgtg 240
accgagagcg gctgcaagga gtgcgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagttcctg 300
cagagcttcg tgcacatcgt gcagatgttc atcaacacca gcggcggcgg cggcagcgac 360
tacaaggacg acgacgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg 420
ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 480
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccca ggtgaagttc 540
aactggtacg tggacggcgt gcaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg cgagcagcag 600
tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagaa ctggctggac 660
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 720
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 780
gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 840
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 900
cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 960
cgctggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1020
tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggcaag 1056
<210> 3
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
cagggccagg accgccacat gatccgcatg cgccagctga tcgacatcgt ggaccagctg 60
aagaactacg tgaacgacct ggtgcccgag ttcctgcccg cccccgagga cgtggagacc 120
aactgcgagt ggagcgcctt cagctgcttc cagaaggccc agctgaagag cgccaacacc 180
ggcaacaacg agcgcatcat caacgtgagc atcaagaagc tgaagcgcaa gccccccagc 240
accaacgccg gccgccgcca gaagcaccgc ctgacctgcc ccagctgcga cagctacgag 300
aagaagcccc ccaaggagtt cctggagcgc ttcaagagcc tgctgcagaa ggtgagcacc 360
ctgagcttca tcggcggcgg cggcagcgac tacaaggacg acgacgacaa gacccacacc 420
tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc 480
aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 540
gtgagccacg aggaccccca ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt gcaggtgcac 600
aacgccaaga ccaagccccg cgagcagcag tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg 660
ctgaccgtgc tgcaccagaa ctggctggac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac 720
aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgag 780
ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgc gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg 840
acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc 900
cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 960
ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc cgctggcagc agggcaacgt gttcagctgc 1020
agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgag cctgagcccc 1080
ggcaag 1086
<210> 4
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
agctggtaca gcgaccccgg cctggccggc gtgagcctga ccggcggcct gagctacaag 60
gaggacacca aggagctggt ggtggccaag gccggcgtgt actacgtgtt cttccagctg 120
gagctgcgcc gcgtggtggc cggcgagggc agcggcagcg tgagcctggc cctgcacctg 180
cagcccctgc gcagcgccgc cggcgccgcc gccctggccc tgaccgtgga cctgcccccc 240
gccagcagcg aggcccgcaa cagcgccttc ggcttccagg gccgcctgct gcacctgagc 300
gccggccagc gcctgggcgt gcacctgcac accgaggccc gcgcccgcca cgcctggcag 360
ctgacccagg gcgccaccgt gctgggcctg ttccgcgtgg gcggcggcgg cagcgactac 420
aaggacgacg acgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 480
ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagccgcacc 540
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg acccccaggt gaagttcaac 600
tggtacgtgg acggcgtgca ggtgcacaac gccaagacca agccccgcga gcagcagtac 660
aacagcacct accgcgtggt gagcgtgctg accgtgctgc accagaactg gctggacggc 720
aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 780
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgcgag 840
gagatgacca agaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 900
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 960
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagccgc 1020
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1080
acccagaaga gcctgagcct gagccccggc aag 1113
<210> 5
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr
115 120 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145 150 155 160
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
165 170 175
Gln Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Val His Asn Ala
180 185 190
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
195 200 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asn Trp Leu Asp Gly Lys Glu Tyr
210 215 220
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
225 230 235 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245 250 255
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260 265 270
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
275 280 285
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
290 295 300
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
305 310 315 320
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
325 330 335
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 6
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Val Ser Thr Leu Ser Phe Ile Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Gln Val Lys Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asn Trp Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
260 265 270
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 7
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly
1 5 10 15
Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly
35 40 45
Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg
50 55 60
Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro
65 70 75 80
Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu
85 90 95
Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu
100 105 110
Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu
115 120 125
Gly Leu Phe Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
130 135 140
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
165 170 175
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
180 185 190
Glu Asp Pro Gln Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Val
195 200 205
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
210 215 220
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asn Trp Leu Asp Gly
225 230 235 240
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
245 250 255
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
260 265 270
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
275 280 285
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
290 295 300
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
305 310 315 320
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
325 330 335
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
340 345 350
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
355 360 365
Pro Gly Lys
370

Claims (9)

1.一种用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A，携带挂载位点的脂质体制备：
制备人工脂质体，所述的人工脂质体由下列配方制备而成：磷脂酰胆碱、胆固醇、神经节苷脂GM2各5mg～50mg、1mg～20mg、0.1～2mg；之后每20μL人工脂质体加入DSPE-PEG 100～500mg，50℃水浴10min进行修饰；
步骤B，神经节苷脂GM2的单链抗体-链霉亲和素融合蛋白表达纯化：
链霉亲和素偶联的GM2单链抗体按VL-(G4S)3-VH-G3S-SA-GFP的方式合成全长，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；挂载元件连接FLAG标签与人IgG1Fc段；所有蛋白均使用OptiCHOTMExpress系统分泌表达；链霉亲和素偶联的GM2单链抗体使用亚氨基生物素琼脂糖珠纯化，挂载元件使用ProteinA柱纯化后，使用肠激酶切除Fc端，用FLAG柱进行二次亲和纯化；
步骤C，挂载元件的表达纯化：
挂载元件包括IL-15功能段、IL-21功能段和4-1BBL功能段；3个挂载元件分别以IL15-G4S-FLAG-Fc、IL21-G4S-FLAG-Fc与41BBL-G4S-FLAG-Fc融合蛋白的形式进行表达，其核酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示，其蛋白序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6与SEQ ID No.7所示；
步骤D，挂载元件的生物素化：
挂载元件的生物素化使用Sulfo-NHS-Biotin进行反应；
步骤E，脂质体药物装载：
步骤A制备的人工脂质体中加入步骤B制备的链霉亲和素偶联的GM2单链抗体融合蛋白，浓度为0.1～1ng/μL，4℃颠倒混匀过夜；将步骤C制备的生物素化的IL-15功能段、IL-21功能段和4-1BBL功能段等摩尔混合后，按100:1～200:1的摩尔比与负载链霉亲和素偶联GM2单链抗体融合蛋白后的脂质体混合，室温颠倒混匀，透析去除未结合蛋白，完成脂质体药物的制备。
2.根据权利要求1所述的用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，采用超声薄膜法、逆向蒸发法、梯度反向装载法、或双乳化法制备人工脂质体。
3.根据权利要求2所述的用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，人工脂质体采用超声薄膜法制备：分别称取磷脂酰胆碱、胆固醇、神经节苷脂GM2各5mg～50mg、1mg～20mg、0.1～2mg，于室温中在氯仿/甲醇体积比为5：1的溶液中过夜震荡溶解，使用旋转蒸发仪37℃抽干有机溶剂，使之在茄型烧瓶壁上形成均匀的脂质体膜，往瓶中充氮气5min，使残余有机溶剂充分挥发；加入pH＝6.5的0.5M的PBS5mL，震荡至膜充分溶解，超声仪超声1～2min，至脂质体溶液分散为均匀、稳定的透明液体，得到人工脂质体；之后每20μL脂质体加入DSPE-PEG100～500mg，50℃水浴10min进行修饰。
4.根据权利要求1所述的用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，链霉亲和素偶联的GM2单链抗体按VL-(G4S)3-VH-G3S-SA-GFP的方式合成全长，蛋白质的表达采用ExpiCHO系统，将GM2的单链抗体-链霉亲和素融合蛋白克隆至pcDNA3.4载体后，转染CHO细胞；37℃，8％CO2环境下振荡培养8天后，收集细胞悬液；5000rpm～6000rpm离心10～15min去除细胞后，使用等体积2×PBS稀释。
5.根据权利要求1所述的用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，挂载元件使用Protein A柱进行第一轮纯化，完成纯化后使用Tris-HCl中和pH值至8.0，使用肠激酶切除Fc端，按0.2U肠激酶/1mg总蛋白25℃过夜酶切，酶切产物使用FLAG亲和柱进行二次亲和纯化；纯化产物使用Tris-HCl中和至pH＝7.5，使用35kDa超滤管浓缩蛋白。
6.根据权利要求1所述的用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，将所述的IL15-G4S-FLAG-Fc、IL21-G4S-FLAG-Fc与41BBL-G4S-FLAG-Fc三个融合蛋白克隆至pcDNA3.4载体后，转染CHO细胞；37℃，8％CO2环境下振荡培养5～10天后，收集细胞悬液；5000rpm～6000rpm离心10～15min去除细胞后，使用等体积2×PBS稀释；使用Protein A进行第一轮纯化；完成纯化后使用Tris-HCl中和pH值＝8.0，按0.2U肠激酶/1mg总蛋白25℃过夜酶切，酶切产物使用FLAG亲和柱纯化；纯化产物使用2×PBS中和至pH＝7.5，使用10kDa超滤管浓缩蛋白。
7.根据权利要求1所述的用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物的制备方法，其特征在于，所述的步骤D中，对步骤C制备的挂载元件定量后，将元件肽段与Sulfo-NHS-Biotin按摩尔比1:3～1:5在pH＝7.5～8.5PBS中室温反应30min；使用10kDa透析袋去除未结合的Sulfo-NHS-Biotin，超滤浓缩生物素化的挂载元件。
8.一种用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物，其采用如权利要求1-7任一所述的制备方法制备得到。
9.一种如权利要求8所述的用于NK细胞扩增及增强杀伤活性的脂质体药物在制备治疗肿瘤或感染性疾病的药物中的应用。
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