CN115181727A - Nk细胞的扩增载体及其在在扩增培养nk细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NK细胞的扩增载体，可以安全高效的扩增NK细胞，进一步通过与特异性人工脂质体的融合，可以获得特异性复合脂质体，以实现靶向病毒或肿瘤的特异性NK细胞的高效安全扩增。本发明通过在脂质体扩增上添加特异性肿瘤抗原，可制备的肿瘤靶向性NK细胞，具有肿瘤杀伤率高，安全有效等优势；作为新型免疫细胞治疗方案，可通过与常规治疗方案联合使用增强抗肿瘤或病毒治疗效果。

Description

NK细胞的扩增载体及其在在扩增培养NK细胞中的应用

技术领域

本发明涉及NK细胞的扩增载体及其在在扩增培养NK细胞中的应用。

背景技术

NK细胞，又称为自然杀伤细胞，作为免疫系统的重要组成部分，是人体内抵御病毒、细菌等外源微生物感染，清除衰老、病变及癌变细胞，参与免疫调节，维护机体稳态的天然免疫屏障。人体内的NK细胞为CD3^-CD56⁺淋巴细胞群占外周血淋巴细胞总数10％～15％，以杀伤功能为主的CD56^dimCD16⁺亚群，是外周血中最主要的NK细胞。NK细胞表面表达多种抑制型和活化型受体，通过抑制与活化信号平衡，维持对宿主正常组织细胞的耐受和对异常细胞的杀伤。NK细胞识别病毒感染细胞后，可以通过快速释放穿孔素和颗粒酶或发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，直接或间接杀死病毒感染细胞。此外，NK细胞能够分泌促炎细胞因子IFN-γ、IFN-α/β、TNF-α，激活更广泛的免疫应答来控制病毒感染。研究发现，NK细胞具有免疫记忆功能，能够分化为抗原特异性的记忆NK细胞在再次受到病毒抗原刺激时，能发挥更强大的抗病毒能力。

NK细胞的活化受到细胞表面表达的激活受体和抑制受体的调控，这些受体可以识别来自于邻近正常细胞或癌变细胞所释放的配体。当来自NK细胞表面受体的激活信号强于抑制信号时，NK细胞就被激活；当来自NK细胞表面受体的激活信号弱于抑制信号时，NK细胞就被沉默。目前已发现多种激活受体和抑制受体，激活受体主要有NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46；抑制受体主要有KIR2DL1、KIR2DL3和NKG2A。

NK细胞的体外活化和大规模扩增是满足NK细胞临床应用的关键所在。目前，NK细胞的扩增主要依赖K562滋养细胞的刺激。K562滋养细胞异源表达的跨膜IL-21能促进NK细胞扩增2000倍以上，同时特异性的激活STAT3信号通路，保持扩增后NK细胞端粒酶的活性和端粒的长度。扩增后的NK细胞高水平表达NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46等激活受体，细胞杀伤功能显著增强。NK细胞体外扩增培养体系的建立，实现了大规模NK细胞的扩增和获取，为肿瘤病人的临床治疗带来了希望。经体外扩增的NK细胞高水平表达激活受体和杀伤效应蛋白，在体内和体外的抗肿瘤测试中展现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。虽然滋养细胞扩增NK细胞的效率非常高，其仍存在无法避免的诸多问题，如K562滋养细胞为肿瘤细胞，其在细胞制品中的残留将严重危害患者的健康；K562细胞的代谢物可能具有免疫抑制潜力，可能会影响NK细胞的活性。因此，开发替代K562滋养细胞的NK细胞体外扩增系统具有非常重要的临床意义和工业应用价值。

人工脂质体是一类由固态天然或合成的卵磷脂、甘油三酯等组成的亚微粒脂质单分子层结构系统。通过将药物包裹于纳米脂质体中构建药物递送系统系统，具有延长疗效、减少给药剂量、降低不良反应、改变给药途径、毒性低、生物相容性好、生物可降解等优点。同时，纳米脂质体可以在表面修饰相关的配体，使脂质体通过受体介导的方式进入细胞，从而有效提高靶器官的药物浓度，提高相应的生物利用度，减少毒副作用的发生。众所周知，经配体修饰的脂质体能够实现伪装或主动靶向，将药物定向地运送到靶器官而发挥药效。例如，经表面修饰后的脂质体可逃避巨噬细胞识别，或因修饰有特定的配体可与靶细胞的受体相结合，改变脂质体在体内的组织分布而到达特定的靶器官。然而，目前利用脂质体技术用于NK免疫细胞的体外激活和大规模扩增仍有待于研究。通过在人工脂质体表面挂载不同因子的蛋白片段已用于NK细胞的体外扩增，这一扩增方法的扩增效率仍弱于经典的K562滋养细胞扩增体系。因此，高效的NK细胞体外扩增系统仍有待于开发。

近2年来，新型冠状病毒的突然出现严重冲击世界各国的医疗卫生系统。截止目前，全球新冠病毒感染者已多达2.4亿人，死亡人数已达480万人病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸(DNA或RNA)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。病毒依赖宿主细胞而存活，其感染复制周期大致包括：吸附、穿入、脱壳、生物合成(病毒核酸复制；病毒蛋白质合成)、装配与释放。根据病毒核酸类型的不同，动物病毒可以分为三大类：DNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒、RNA病毒。其中，DNA病毒包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、肝炎病毒等，DNA和RNA逆转录病毒包括肉瘤病毒和艾滋病毒等，RNA病毒包括SARS冠状病毒、埃博拉病毒、流感病毒等。新冠病毒的治疗仍存在以下难点:病毒藏在细胞内，目前缺乏抗病毒特效药；病毒感染患者存在严重的免疫系统失调。目前针对病毒性传染病的防治主要以抗病毒抑制剂及特异性疫苗的研制与应用为主。然而，大多数病毒性疾病至今尚无特效抑制剂，而能够应用疫苗进行防治的病毒性疾病也很少。SARS-CoV-2作为全新发现的单股正链RNA病毒，依赖宿主细胞进行新病毒的合成。虽然目前COVID-19病毒的疫苗接种已经覆盖大部分国人，境外输入的病毒传播仍时有发生。针对COVID-19病毒的防控生物制剂仍有待开发。目前抗RNA病毒都是基于病毒复制过程依赖宿主细胞的RNA聚合酶等机理而研发特异性的RNA聚合酶抑制剂(小分子化合物，瑞德西韦)，而此类抑制剂的研发周期长、失败率高，使得开发针对逆转录酶的特异性抑制剂难度很大，此外，COVID-19病毒的RNA可以直接指导蛋白质合成，RNA聚合酶抑制剂对此根本无效。NK细胞具备天然的病毒识别和清除能力，已有研究表明，其在甲型流感病毒、乙肝病毒、艾滋病毒、丙肝病毒等多种病毒感染中也发挥重要作用。靶向病毒衣壳蛋白的NK细胞可以特异性的吞噬清除游离病毒，或杀伤病毒感染的宿主细胞，为治疗COVID-19病毒感染患者提供了潜在的靶点和途径。因此，研发和大规模制备病毒靶向性NK细胞应用于肆虐全球的新冠病毒治疗具有非常重要的临床意义和社会价值。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供NK细胞的扩增载体；这种扩增载体不仅具有高效的扩增效率，且有效规避了K562滋养细胞扩增体系中产生的残留和代谢物带来的副作用。

本发明采用如下技术方案：NK细胞的扩增载体，包括：从K562滋养细胞中提取的细胞膜成分。

进一步地，所述细胞膜成分为K562滋养细胞膜脂质体(mb-IL21脂质体)。

进一步地，还包括嵌合有肿瘤或病毒特异性抗原蛋白的人工脂质体。通过大量实验证明，脂质体扩增载体可以很好的实现NK细胞的体外激活和扩增，病毒靶向性NK细胞具有识别和杀伤病毒感染细胞的能力，从而快速和高效的降低细胞内病毒拷贝数，肿瘤靶向性NK细胞具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力，能够降低体内肿瘤负荷。

进一步地，所述mb-IL21脂质体与所述人工脂质体融合。其中mb-IL21脂质体高表达跨膜IL-21，CD137L，CD86，人工脂质体负载特异性抗原S蛋白或PSMA蛋白。K562滋养细胞膜脂质体以蛋白簇形式激活NK细胞的增殖，特异性抗原能够筛选扩增特异性NK细胞，最终实现病毒和肿瘤靶向特异性NK细胞的体外扩增。

进一步地，所述嵌合有肿瘤或病毒特异性抗原蛋白的人工脂质体，为：嵌合病毒衣壳蛋白的纳米脂质体，或为嵌合肿瘤特异性抗原的纳米脂质体；所述病毒为甲型肝炎病毒(NC_001489.1)、乙型肝炎病毒(NC_003977.2)、丙型肝炎病毒(NC_004102.1)、1型艾滋病毒(NC_001802.1)、2型艾滋病毒(NC_001722.1)、人乳头瘤病毒6型(HG793939.1)、人乳头瘤病毒11型(FR872717.1)、人乳头瘤病毒16型(NC_001526.4)、人乳头瘤病毒18型(NC_001357.1)、人乳头瘤病毒31型(J04353.1)、人乳头瘤病毒33型(M12732.1)、人乳头瘤病毒45型(KC470260.1)、人乳头瘤病毒52型(LC373207.1)、人乳头瘤病毒58型(FJ385268.1)、麻疹病毒(NC_001498.1)、狂犬病毒(NC_001542.1)、SARS冠状病毒(NC_004718.3)、埃博拉病毒(NC_006432.1)、新冠病毒COVID-19(MN908947.3)；所述肿瘤的类型包括但不限于：急性淋巴细胞白血病，急性髓系白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，肛门癌，星形细胞瘤，非典型畸胎/横纹肌样瘤，中枢神经系统瘤，基底细胞癌-皮肤癌(非黑色素瘤)，胆管癌，膀胱癌，骨肿瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，子宫颈癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性粒细胞性白血病(CML)，慢性骨髓增生性疾病，结肠癌，大肠癌，颅咽管瘤，皮肤T细胞淋巴瘤-蕈样肉芽肿，乳腺导管原位癌，胚胎性肿瘤，中枢神经系统瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤，食管癌，嗅神经母细胞，尤因肉瘤家族肿瘤，颅外生殖细胞瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管肿瘤，眼癌，骨纤维组织细胞瘤，骨肉瘤，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤-成人软组织肉瘤，生殖细胞瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌症，心脏肿瘤，肝癌，组织细胞增多症，朗格汉斯细胞，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，眼内黑色素瘤，胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)，卡波西氏肉瘤，肾癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，喉癌，白血病，唇及口腔癌，肝癌，小叶原位癌，肺癌，淋巴瘤，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，骨恶性纤维组织细胞瘤，骨肉瘤，髓母细胞瘤，髓上皮瘤，黑色素瘤，恶性间皮瘤，转移性鳞癌颈部肿瘤，口腔癌，多发性内分泌瘤综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤，慢性粒细胞性白血病，髓细胞白血病，多发性骨髓瘤，骨髓增生性疾病，鼻腔鼻窦肿瘤，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口腔癌，口腔癌，唇口咽癌，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤骨，卵巢癌胰腺癌，乳头状瘤，副神经节瘤，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺肿瘤，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，松果体实质肿瘤，垂体瘤，浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞(肾)癌症，肾盂和输尿管，移行细胞癌，呼吸道癌症，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，涎腺肿瘤，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠肿瘤，软组织肉瘤，鳞癌颈部肿瘤，原始神经外胚层肿瘤，T细胞淋巴瘤，睾丸癌，咽喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，滋养细胞肿瘤，输尿管及肾盂移行细胞癌，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。

进一步地，所述病毒衣壳蛋白为COVID-19病毒的S蛋白。COVID-19病毒S蛋白存在于病毒表面，是COVID-19病毒进入人体细胞的核心蛋白，S蛋白作为病毒的表面抗原易被NK细胞识别，从而被NK细胞吞噬而清除；而人体本身没有S蛋白，识别COVID-19病毒S蛋白的NK细胞不会造成脱靶效应。因此，可以针对COVID-19病毒S蛋白作为抗原，筛选和扩增病毒靶向特异性NK细胞。

进一步地，所述肿瘤特异性蛋白为肿瘤细胞表面的跨膜蛋白或短肽。

进一步地，所述从K562滋养细胞中提取的细胞膜成分，通过如下方法得到：

(1)采用低渗裂解缓冲液冰上孵育K562滋养细胞；

(2)用探针超声破碎机破碎。

(3)通过差速离心从细胞裂解液中分离细胞膜；

(4)将细胞膜沉淀清洗后，用微型挤出器通过聚碳酸酯多孔膜(800nm)进行挤出，得到K562滋养细胞膜脂质体(mb-IL21脂质体)。

本发明还涉及上述扩增载体在扩增培养NK细胞中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)基于亲和层析分离技术从K562滋养细胞中提取的细胞膜成分，尤其是分离得到的脂质体，可表达共刺激蛋白，提供NK细胞激活扩增所需的物理化学信号；

(2)相较于传统的滋养细胞体系和其他脂质体扩增体系，本发明可以实现更高效的NK细胞扩增效率；

(3)相较于传统的滋养细胞体系，基于脂质体扩增载体的NK细胞体外扩增体系，可以实现标准化临床级NK细胞的大规模生产，避免了传统滋养细胞方法带来的风险；

(4)通过在脂质体扩增载体上添加特异性病毒抗原，所制备的病毒特异性NK细胞具备清除游离新冠病毒或病毒感染细胞能力，特异性好，速度快，效果显著；

(5)通过在脂质体扩增上添加特异性肿瘤抗原，可制备的肿瘤靶向性NK细胞，具有肿瘤杀伤率高，安全有效等优势；

(6)作为新型免疫细胞治疗方案，可通过与常规治疗方案联合使用增强抗肿瘤或病毒治疗效果；

附图说明

图1脂质体扩增载体的粒径分布图。图A为K562滋养细胞膜来源的脂质体(mb-IL21脂质体)；图B为融合嵌合有病毒特异性抗原S蛋白的复合脂质体(mb-IL21-S蛋白复合脂质体)；图C为融合嵌合有肿瘤特异性抗原PSMA蛋白的复合脂质体(mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体)；

图2脂质体扩增载体的透射电镜图。图A为K562滋养细胞膜来源的脂质体(mb-IL21脂质体)；图B为融合嵌合有病毒特异性抗原S蛋白的复合脂质体(mb-IL21-S蛋白复合脂质体)；图C为融合嵌合有肿瘤特异性抗原PSMA蛋白的复合脂质体(mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体)；

图3Western blot检测脂质体扩增载体的蛋白表达情况图。图A为融合嵌合有病毒特异性抗原S蛋白的复合脂质体(mb-IL21-S蛋白复合脂质体)；图B为融合嵌合有肿瘤特异性抗原PSMA蛋白的复合脂质体(mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体)；

图4mb-IL21脂质体和人工生物素脂质体刺激NK细胞的扩增曲线。

图5NK细胞杀伤肝癌HepG2细胞的细胞活死率；

图6NK细胞扩增曲线图。图A为mb-IL21-S蛋白复合脂质体刺激NK细胞的扩增曲线；图B为mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体刺激NK细胞的扩增曲线；

图7mb-IL21-S蛋白复合脂质体扩增NK细胞前后表面激活性受体NKG2D表达水平；

图8mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体扩增NK细胞前后表面激活性受体NKG2D表达水平；

图9NK细胞杀伤假病毒侵染A549细胞的细胞活死率；

图10NK细胞杀伤前列腺癌LNCaP细胞的细胞活死率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1:扩增载体的获取及其结构特征

(1)K562滋养细胞膜成分提取

K562滋养细胞采用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基培养。当细胞密度达到80～90％时，将K562滋养细胞收集至离心管中，以500g的转速离心5分钟。离心结束后弃去培养液，用PBS重悬。取10×10⁶K562滋养细胞悬液于5mL离心管中，加入2mL的低渗裂解缓冲液冰上孵育30分钟。之后使用探针超声破碎机以70％的功率低温破碎30分钟。使用超速离心机通过差速离心从细胞裂解液中分离细胞膜，裂解液以10,000g的转速离心25分钟，上清液以100,000g的转速离心60分钟，得到细胞膜沉淀。

(2)K562滋养细胞膜脂质体(mb-IL21脂质体)制备

将(1)中的细胞膜沉淀用含0.2mM的EDTA的无核酸酶水进行清洗，并于-20℃下保存。将获得的K562滋养细胞膜沉淀置于超声波发生器中，以65W功率超声处理15分钟，之后使用AVANTI微型挤出器通过聚碳酸酯多孔膜(800nm)进行挤出，得到K562滋养细胞膜脂质体(mb-IL21脂质体)。

(3)人工脂质体的制备：分别按照比例称取磷脂酰胆碱(Sigma，V900485)、神经节苷脂G2(Sigma，G4651)、胆固醇(Sigma，C8667)，室温下用氯仿/甲醇(5:1)溶液重悬并震荡溶解过夜。待充分溶解后，使用旋转蒸发仪充分去除有机溶剂，脂质体则附着于烧瓶壁上。往瓶中充入氮气，使残余有机溶剂充分挥发。加入的0.5M PBS(pH＝6.5)5mL，震荡至膜充分溶解，使用超声仪超声1～2min，至脂质体溶液分散为均匀、稳定的透明液体，得到人工脂质体。

(4)人工S蛋白脂质体制备

每20μL人工脂质体加入200mg DSPE-PEG-Streptavidin-Biotin-Spike(磷脂聚乙二醇-S蛋白)50℃水浴10min进行修饰，增强其稳定性和负载特异性抗原。

(5)人工PSMA蛋白脂质体制备：

每20μL人工脂质体加入200mg DSPE-PEG-Streptavidin-Biotin-PSMA(磷脂聚乙二醇-PSMA蛋白)50℃水浴10min进行修饰，增强其稳定性和负载特异性抗原。

(6)人工生物素脂质体制备

人工脂质体200μL中加入100ng链霉亲和素偶联的GM2单链抗体，4℃颠倒混匀过夜。荧光显微镜计数脂质体密度。将生物素化的IL-15功能段、IL-21功能段和4-1BBL功能段等摩尔混合后，按100:1～200:1的摩尔比与脂质体混合，室温颠倒混匀30min，使用35KD透析袋透析去除未结合蛋白，完成脂质体制备。

(6)复合脂质体制备

将获得的K562滋养细胞膜脂质体与人工S蛋白脂质体或人工PSMA蛋白脂质体以1:2的比例进行混合，用超声波发生器以65W功率超声处理15分钟，使用AVANTI微型挤出器通过聚碳酸酯多孔膜(400nm)进行挤出，得到复合脂质体(mb-IL21-S蛋白复合脂质体、mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体)。

为了去除没有融合的过量人工脂质体囊泡，我们将上述复合脂质体进行亲和层析纯化。将复合脂质体与标记了TIM4的磁性凝胶微球共孵育1小时，之后利用洗涤缓冲液去除未融合的脂质体囊泡。利用含有EDTA的缓冲液多次冲洗磁性凝胶微球，释放复合脂质体。通过蛋白质印迹法对扩增载体囊泡的蛋白表达水平进行检测，如图3B所示，脂质体扩增载体上依然能够检测到mIL-21蛋白、CD86蛋白、4-1BBL蛋白、以及病毒特异性抗原spike蛋白或前列腺癌特异性抗原PSMA蛋白表达，能够减少了人工脂质体囊泡的污染。

利用粒径分析仪分别对K562滋养细胞膜脂质体(mb-IL21脂质体)和复合脂质体(mb-IL21-S蛋白复合脂质体、mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体)检测其粒径分布，如图1所示，所述制备的K562滋养细胞膜脂质体(mb-IL21脂质体)粒径约800nm，所述制备的复合脂质体(mb-IL21-S蛋白复合脂质体、mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体)粒径约400nm。进一步，我们采用透射电镜观察K562滋养细胞膜脂质体和复合脂质体的形态，如图2所示，K562滋养细胞膜脂质体和复合脂质体分别为约800nm和约400nm的球形，具有良好的粒径分布及形态结构。

进一步，我们通过蛋白质印迹法对mb-IL21脂质体、mb-IL21-S蛋白复合脂质体、mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体的细胞膜完整性进行检测，如图3所示，mIL-21蛋白、CD86蛋白、4-1BBL蛋白为K562滋养细胞表面特异性蛋白。由图中可以看出mb-IL21-S蛋白复合脂质体和mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体特异性表达K562滋养细胞所不具备的S蛋白和PSMA蛋白；复合脂质体的mIL-21蛋白、CD86蛋白、4-1BBL蛋白的表达量与mb-IL21脂质体相同，说明制备的复合脂质体扩增载体保留了K562滋养细胞表面蛋白。

实施例2:细胞膜成分、mb-IL21脂质体与人工生物素脂质体激活NK细胞的扩增性能和肿瘤杀伤效率比较

静脉采集50mL外周血后用PBS缓冲液进行稀释，使用Ficoll淋巴细胞分离液获取PBMC细胞。使用CD56磁珠对NK细胞进行标记进行细胞分选。分选后的细胞按照1×10⁶/mL重悬于NK细胞培养基中。分别评估细胞膜沉淀、mb-IL21脂质体，以及人工生物素脂质体对NK细胞的扩增效果。分别设置对照组和实验组如下：第一组：空白脂质体；第二组：K562滋养细胞；第三组：人工生物素脂质体；第四组：细胞膜沉淀；第五组：mb-IL21脂质体。

将五组扩增载体与NK细胞分别培养于37℃、5％CO₂培养箱中。隔天对NK细胞进行计数。如图4所示，经过21天的扩增，对照组(人工生物素脂质体组)NK细胞扩增了约800倍，而细胞膜沉淀扩增了20000倍以上，K562滋养细胞、mb-IL21脂质体均扩增了30000倍以上，说明细胞膜沉淀和mb-IL21脂质体也能有效诱导NK细胞扩增。

为了进一步比较细胞膜沉淀、mb-IL21脂质体、人工生物素脂质体激活NK细胞的肿瘤杀伤能力，我们将肝癌HepG2细胞作为靶细胞使用Calcein-AM进行标记，按照每10⁶个靶细胞中加入50μM的Calcein-AM 10μL，37度避光孵育30分钟，孵育结束后，用PBS洗涤细胞一次以去除残余的Calcein-AM。将NK细胞和肿瘤靶细胞按照10：1和1：1的效靶比进行孵育，共孵育4小时。孵育结束后，收集所有细胞，按照体积比例加入1/1000体积的死细胞染液PI。使用荧光显微镜观察NK细胞的肿瘤杀伤效率，统计肿瘤杀伤效率。如图5所示，与对照组(人工生物素脂质体组)相比，细胞膜沉淀、mb-IL21脂质体所激活的NK细胞对肝癌HepG2细胞具有更高的杀伤活性。

实施例3:病毒靶向NK细胞的制备

COVID-19病毒S蛋白存在于病毒表面，是COVID-19病毒进入人体细胞的核心蛋白。病毒失去了S蛋白将不再能够进一步感染人体细胞，因此S蛋白是多种抑制剂设计的靶标。

静脉采集50mL外周血后用PBS缓冲液进行稀释，使用Ficoll淋巴细胞分离液获取PBMC细胞。使用CD56磁珠对NK细胞进行标记进行细胞分选。分选后的细胞按照1×10⁶/mL重悬于NK细胞培养基中。分别评估其对NK细胞的扩增效果。

为了扩增病毒靶向的NK细胞，设置对照组和实验组如下：第一组：K562滋养细胞；第二组：人工S蛋白脂质体；第三组：mb-IL21脂质体；第四组：mb-IL21-S蛋白复合脂质体。

将NK细胞培养于37℃、5％CO2培养箱中。隔天对NK细胞进行计数，并使用流式细胞仪对NK细胞的纯度和NK细胞表面激活性受体的表达水平进行检测。当NK细胞密度大于5×10⁶/mL时补充NK细胞培养基，并按照比例加入终浓度为200U/mL的重组人IL-2。如图6A所示，经过14天的扩增，对照组NK细胞扩增了约2500倍，而mb-IL21脂质体、mb-IL21-S蛋白复合脂质体均扩增了4000倍以上，说明扩增载体能有效诱导NK细胞扩增。如图7所示，第0天时，NK细胞表面的激活性受体NKG2D表达水平较低。经过21天的扩增，NK细胞表面的激活性受体NKG2D表达水平都有显著的提高。

为了确定扩增载体所激活的NK细胞是否具有抗COVID-19病毒能力，我们首先以COVID-19病毒S蛋白过表达系统为模型，观察NK细胞杀伤病毒感染细胞的效果。我们将COVID-19病毒S蛋白质粒表达于A549细胞作为检测对象。将对照组和mb-IL21-S蛋白复合脂质体所激活的NK细胞按照不同比例加入表达COVID-19病毒S蛋白的A549细胞中，通过CCK-8细胞活性检测细胞的杀伤作用。测试结果如图9所示。与对照组(mb-IL21脂质体作为对照)相比，mb-IL21-S蛋白复合脂质体所激活的NK细胞表现出更好的抗病毒效果。

实施例4:肿瘤靶向NK细胞的制备

PSMA蛋白对前列腺癌LNCaP的特异性蛋白，本实施例以前列腺癌LNCaP为例说明融合脂质体的肿瘤靶向作用。

静脉采集50mL外周血后用PBS缓冲液进行稀释，使用Ficoll淋巴细胞分离液获取PBMC细胞。使用CD56磁珠对NK细胞进行标记进行细胞分选。分选后的细胞按照1×10⁶/mL重悬于NK细胞培养基中。分别评估其对NK细胞的扩增效果。

为了扩增肿瘤靶向的NK细胞，第一组：K562滋养细胞；第二组：人工PSMA蛋白脂质体；第三组：mb-IL21脂质体；第四组：mb-IL21-PSMA复合蛋白脂质体。

将NK细胞培养于37℃、5％CO2培养箱中。隔天对NK细胞进行计数，并使用流式细胞仪对NK细胞的纯度和NK细胞表面激活性受体的表达水平进行检测。当NK细胞密度大于5×10⁶/mL时补充NK细胞培养基，并按照比例加入终浓度为200U/mL的重组人IL-2。如图6B所示，经过14天的扩增，对照组NK细胞扩增了约2500倍，而mb-IL21脂质体、mb-IL21-PSMA蛋白复合脂质体均扩增了4000倍以上，说明扩增载体能有效诱导NK细胞扩增。如图8所示，第0天时，NK细胞表面的激活性受体NKG2D表达水平较低。经过21天的扩增，NK细胞表面的激活性受体NKG2D表达水平都有显著的提高。

将靶细胞使用Calcein-AM进行标记，按照每106个靶细胞中加入50μM的Calcein-AM 10μL，37度避光孵育30分钟，孵育结束后，用PBS洗涤细胞一次以去除残余的Calcein-AM。将NK细胞和肿瘤靶细胞按照10：1和1：1的效靶比进行孵育，共孵育4小时。孵育结束后，收集所有细胞，按照体积比例加入1/1000体积的死细胞染液PI。使用荧光显微镜观察NK细胞的肿瘤杀伤效率，统计肿瘤杀伤效率。如图10所示，与对照组(mb-IL21脂质体作为对照)相比，mb-IL21-S蛋白复合脂质体所激活的NK细胞对前列腺癌LNCaP细胞具有更高的杀伤活性。

根据以上实施例可知，通过将肿瘤或病毒特异性抗原蛋白嵌入到人工脂质体，并与本发明的mb-IL21脂质体融合得到的复合脂质体，即可实现病毒特异性NK细胞或肿瘤靶向性NK细胞的高效安全扩增。本领域技术人员基于本发明，至少可以获得如下病毒或肿瘤的复合脂质体，以实现具有高杀伤力的NK细胞的高效安全扩增：

病毒：甲型肝炎病毒(NC_001489.1)、乙型肝炎病毒(NC_003977.2)、丙型肝炎病毒(NC_004102.1)、1型艾滋病毒(NC_001802.1)、2型艾滋病毒(NC_001722.1)、人乳头瘤病毒6型(HG793939.1)、人乳头瘤病毒11型(FR872717.1)、人乳头瘤病毒16型(NC_001526.4)、人乳头瘤病毒18型(NC_001357.1)、人乳头瘤病毒31型(J04353.1)、人乳头瘤病毒33型(M12732.1)、人乳头瘤病毒45型(KC470260.1)、人乳头瘤病毒52型(LC373207.1)、人乳头瘤病毒58型(FJ385268.1)、麻疹病毒(NC_001498.1)、狂犬病毒(NC_001542.1)、SARS冠状病毒(NC_004718.3)、埃博拉病毒(NC_006432.1)；

肿瘤：急性淋巴细胞白血病，急性髓系白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，肛门癌，星形细胞瘤，非典型畸胎/横纹肌样瘤，中枢神经系统瘤，基底细胞癌-皮肤癌(非黑色素瘤)，胆管癌，膀胱癌，骨肿瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，子宫颈癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性粒细胞性白血病(CML)，慢性骨髓增生性疾病，结肠癌，大肠癌，颅咽管瘤，皮肤T细胞淋巴瘤-蕈样肉芽肿，乳腺导管原位癌，胚胎性肿瘤，中枢神经系统瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤，食管癌，嗅神经母细胞，尤因肉瘤家族肿瘤，颅外生殖细胞瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管肿瘤，眼癌，骨纤维组织细胞瘤，骨肉瘤，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤-成人软组织肉瘤，生殖细胞瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌症，心脏肿瘤，肝癌，组织细胞增多症，朗格汉斯细胞，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，眼内黑色素瘤，胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)，卡波西氏肉瘤，肾癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，喉癌，白血病，唇及口腔癌，肝癌，小叶原位癌，肺癌，淋巴瘤，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，骨恶性纤维组织细胞瘤，骨肉瘤，髓母细胞瘤，髓上皮瘤，黑色素瘤，恶性间皮瘤，转移性鳞癌颈部肿瘤，口腔癌，多发性内分泌瘤综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤，慢性粒细胞性白血病，髓细胞白血病，多发性骨髓瘤，骨髓增生性疾病，鼻腔鼻窦肿瘤，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口腔癌，口腔癌，唇口咽癌，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤骨，卵巢癌胰腺癌，乳头状瘤，副神经节瘤，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺肿瘤，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，松果体实质肿瘤，垂体瘤，浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞(肾)癌症，肾盂和输尿管，移行细胞癌，呼吸道癌症，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，涎腺肿瘤，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠肿瘤，软组织肉瘤，鳞癌颈部肿瘤，原始神经外胚层肿瘤，T细胞淋巴瘤，睾丸癌，咽喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，滋养细胞肿瘤，输尿管及肾盂移行细胞癌，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。

本领域技术人员可以预见，通过该方法获得靶向性NK细胞能够识别肿瘤细胞或病毒特异性抗原，实现对循环肿瘤细胞或游离病毒的吞噬清除，或杀伤病毒感染的宿主细胞，或杀伤癌变的细胞，具有有效的肿瘤或病毒清除能力。

作为本领域的公知常识，上述扩增载体在形成制剂时，一般是将其溶于PBS、生理盐水、细胞培养液等类体液中，以进行体内注射治疗或体外培养；或溶于PBS、生理盐水、去离子水等溶剂中，以作为喷剂使用。

Claims (9)

1.NK细胞的扩增载体，其特征在于，包括：从K562滋养细胞中提取的细胞膜成分。

2.根据权利要求1所述的扩增载体，其特征在于，所述细胞膜成分为K562滋养细胞膜脂质体(mb-IL21脂质体)。

3.根据权利要求1所述的扩增载体，其特征在于，还包括嵌合有肿瘤或病毒特异性抗原蛋白的人工脂质体。

4.根据权利要求3所述的扩增载体，其特征在于，所述mb-IL21脂质体与所述人工脂质体融合。

5.根据权利要求3所述扩增载体，其特征在于，所述嵌合有肿瘤或病毒特异性抗原蛋白的人工脂质体，为：嵌合病毒衣壳蛋白的纳米脂质体，或为嵌合肿瘤特异性抗原的纳米脂质体；所述病毒为甲型肝炎病毒(NC_001489.1)、乙型肝炎病毒(NC_003977.2)、丙型肝炎病毒(NC_004102.1)、1型艾滋病毒(NC_001802.1)、2型艾滋病毒(NC_001722.1)、人乳头瘤病毒6型(HG793939.1)、人乳头瘤病毒11型(FR872717.1)、人乳头瘤病毒16型(NC_001526.4)、人乳头瘤病毒18型(NC_001357.1)、人乳头瘤病毒31型(J04353.1)、人乳头瘤病毒33型(M12732.1)、人乳头瘤病毒45型(KC470260.1)、人乳头瘤病毒52型(LC373207.1)、人乳头瘤病毒58型(FJ385268.1)、麻疹病毒(NC_001498.1)、狂犬病毒(NC_001542.1)、SARS冠状病毒(NC_004718.3)、埃博拉病毒(NC_006432.1)、新冠病毒COVID-19(MN908947.3)；所述肿瘤的类型包括但不限于：急性淋巴细胞白血病，急性髓系白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，肛门癌，星形细胞瘤，非典型畸胎/横纹肌样瘤，中枢神经系统瘤，基底细胞癌-皮肤癌(非黑色素瘤)，胆管癌，膀胱癌，骨肿瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，子宫颈癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性粒细胞性白血病(CML)，慢性骨髓增生性疾病，结肠癌，大肠癌，颅咽管瘤，皮肤T细胞淋巴瘤-蕈样肉芽肿，乳腺导管原位癌，胚胎性肿瘤，中枢神经系统瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤，食管癌，嗅神经母细胞，尤因肉瘤家族肿瘤，颅外生殖细胞瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管肿瘤，眼癌，骨纤维组织细胞瘤，骨肉瘤，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤-成人软组织肉瘤，生殖细胞瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌症，心脏肿瘤，肝癌，组织细胞增多症，朗格汉斯细胞，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，眼内黑色素瘤，胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)，卡波西氏肉瘤，肾癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，喉癌，白血病，唇及口腔癌，肝癌，小叶原位癌，肺癌，淋巴瘤，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，骨恶性纤维组织细胞瘤，骨肉瘤，髓母细胞瘤，髓上皮瘤，黑色素瘤，恶性间皮瘤，转移性鳞癌颈部肿瘤，口腔癌，多发性内分泌瘤综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤，慢性粒细胞性白血病，髓细胞白血病，多发性骨髓瘤，骨髓增生性疾病，鼻腔鼻窦肿瘤，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口腔癌，口腔癌，唇口咽癌，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤骨，卵巢癌胰腺癌，乳头状瘤，副神经节瘤，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺肿瘤，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，松果体实质肿瘤，垂体瘤，浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞(肾)癌症，肾盂和输尿管，移行细胞癌，呼吸道癌症，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，涎腺肿瘤，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠肿瘤，软组织肉瘤，鳞癌颈部肿瘤，原始神经外胚层肿瘤，T细胞淋巴瘤，睾丸癌，咽喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，滋养细胞肿瘤，输尿管及肾盂移行细胞癌，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。

6.根据权利要求5所述的扩增载体，其特征在于，所述病毒衣壳蛋白为COVID-19病毒的S蛋白。

7.根据权利要求5所述的扩增载体，其特征在于，所述肿瘤特异性蛋白为肿瘤细胞表面的跨膜蛋白或短肽。

8.根据权利要求1所述的扩增载体，其特征在于，所述从K562滋养细胞中提取的细胞膜成分，通过如下方法得到：

采用低渗裂解缓冲液冰上孵育K562滋养细胞，

用探针超声破碎机破碎。

通过差速离心从细胞裂解液中分离细胞膜；

将细胞膜沉淀清洗后，用微型挤出器通过聚碳酸酯多孔膜(800nm)进行挤出，得到K562滋养细胞膜脂质体(mb-IL21脂质体)。

9.如权利要求1-8任一项扩增载体在扩增培养NK细胞中的应用。

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