CN117511886A - 冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法及其应用，通过将工程改造的减毒沙门氏菌装载于单核细胞或巨噬细胞中，随后借助液氮对菌株装载的单核细胞或巨噬细胞进行冷冻休克处理。本发明冷冻休克处理的菌株装载的免疫细胞的制备方法简单、容易操作，且解决了装载工程改造的减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的来源难题，具有很好的应用前景。这一策略通过避免细菌的暴露和异源刺激，提高了基于细菌的抗肿瘤治疗的生物安全性；而瘤内菌株的高滴度促进了抗肿瘤免疫反应，从而获得了更强的抗肿瘤效力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法及其应用。
背景技术
细菌疗法正在改变肿瘤治疗的治疗模式，这些治疗细菌在给药后因其自身的兼性厌氧特性以及实体肿瘤微环境特有特征，包括实体肿瘤内部乏氧环境，免疫抑制环境和大量坏死细胞释放出的养料，而能够在注射给药后实现于实体肿瘤部位的优先定殖(Gurbatri CR et al.,2020,Sci Transl Med,12(530)；Zhou S et al.,2018,Nat RevCancer,18(12):727-43；Suh S et al.,2019,Adv Sci,6(3):1801309)，随后是显著的肿瘤内免疫激活(Wu L et al.,Adv Drug Deliv Rev2022,187:114363)。然而，直接注射异源微生物通常都会在体内引发快速的免疫反应，导致机体产生不适和潜在的不良反应。现已有研究证明，活菌直接给药会对宿主产生毒性，从而限制了患者对细菌耐受的剂量和效果(WuL et al.,Adv Drug Deliv Rev 2022,187:114363；Gurbatri CR et al.,Science,2022,378(6622):858-864)。VNP20009是一种鼠伤寒沙门氏菌的减毒株(以下简述为VNP)，因其更低的生物毒性与临床前良好的抑瘤效果而受到广泛的关注(Clairmont C et al.,2000,JInfect Dis,181:1996-2002)。尽管通过两种基因(purI和msbB)的缺失/突变实现了VNP20009菌株较原沙门氏菌毒性的大幅降低，但在临床前小鼠实验中，借助VNP20009静脉或腹腔注射的抑瘤治疗仍会因为菌株在正常脏器中的存在与积累而带来一定程度的毒副作用，如肝脏损伤，脾脏肿大，小鼠体重骤降等。理想情况下，以细菌为基础的癌症治疗方法应该将细菌的脱靶或抗原刺激引起的毒性作用降至最低，以确保高度的生物相容性。
近些年来，多种类型的白细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞，T细胞等，因其对肿瘤区域独特的趋化效应而被用作有效的肿瘤药物递送载体(Xie Z et al.,2017,Small,13(10)；Xue J etal.,2017,Nat Nanotechnol,12(7):692-700；Huang B et al.,2015,SciTransl Med,7(291):291ra94)。一种理想的细胞药物载体应易于制备、且可快速获取，这对于以干细胞或原代细胞为主要来源的免疫细胞载体来说很难实现。因为这类细胞通常体外培养条件复杂且增殖效率低下。一些永生化的免疫细胞系，如巨噬细胞(MACS)系RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937，单核细胞(MC)系THP1，iBMMC，J-111，Mono-Mac-1，JOSK-M等，具有持续增殖和易于培养的特点，理论上可解决常规细胞治疗中细胞获取困难的痛点。然而，这些细胞系因其持续增殖的能力而伴随着潜在的致病性。通常，活细胞的结构会在死亡时解体，导致蛋白质和细胞因子的损失(Green DR et al.,Cold Spring Harb PerspectBiol.,2015；7(12):a006080)。此外，可能诱导细胞死亡的外部刺激，例如热或辐射，也会使蛋白质失活(Sanchez Y et al.,Science,1990；248(4959):1112-1115；Prise KM et al.,Lancet Oncol.,2005；6(7):520-528)。已有研究表明，将活肿瘤细胞经液氮速冻冷处理可在使其失去生长能力的同时，可保持其细胞结构的完整性以及膜上蛋白的生物活性(Ci Tet al.,Sci Adv.,2020；6(50):eabc3013；Meng J et al.,Nat Commun.,2023；14(1):4505)。
因此，能否通过液氮冷处理获得“死的”但“有功能的”永生化免疫细胞系，以消除细胞系致病性的同时，兼顾易获取性；进一步地，借助免疫细胞系装载细菌后再液氮冷处理，基于细胞的伪装保护及依赖细胞的肿瘤靶向递送，可避免细菌的脱靶及异源物质的直接大量暴露而引发的毒副反应；而菌株在免疫细胞内的刺激作用进一步促进了胞内抗肿瘤炎症因子与粘附因子的产生，对应更强的抗癌疗效与瘤内富集效应。
发明内容
本发明的目的是提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法及其应用，具体来说，是借助单核细胞/巨噬细胞等免疫细胞体外装载减毒沙门氏菌，随后用液氮快速冷处理获得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞，及其联合应用治疗肿瘤的方案。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：第一方面，本申请提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法。
第二方面，本申请提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法制得的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
第三方面，本申请提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
本发明的一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，包括如下步骤：所述冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞为永生化的单核细胞系或巨噬细胞系与减毒鼠伤寒沙门氏菌以MOI值1-100共培养，获得装载减毒沙门氏菌的工程化细胞，再经由液氮进行冷休克处理，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
单核细胞系/巨噬细胞系丧失了原有的潜在致病性，而胞内的减毒沙门氏菌可维持生物活性，在体外再度释放而出后，可在24小时达到生长平台期。相较单一注射冷休克处理的减毒沙门氏菌、以及冷休克处理的巨噬细胞与冷休克处理的减毒沙门氏菌二者的简单混合的方法相比较，借助冷冻休克巨噬细胞对菌体的伪装保护与靶向递送用于肿瘤治疗后，小鼠的肿瘤生长得到更显著抑制，存活时间显著延长。
进一步地，(1)将单核细胞系或巨噬细胞系中的任意一种细胞与减毒沙门氏菌共孵育：
将生长条件良好的所述单核细胞或巨噬细胞以1-100×105个/孔的比例接种于培养皿中，用不含抗生素的细胞培养液进行培养，从琼脂平板上挑取减毒沙门氏菌单克隆菌株，在LB型液体培养基中过夜活化，将生长到对数相的菌液5000-8000转/分钟、离心5-10min，弃上清将沉淀重悬于无菌生理盐水中，调节OD600为0.6-1.2后，将细菌加入装有上述细胞以MOI值1-100的培养皿中，共同培养20-150分钟；
(2)用Hoechst对细胞核进行染色后，在显微镜下观察细胞的形态变化；记录细胞与细菌共培养不同时间点，对应上述一种单核细胞/巨噬细胞的破碎百分率的变化；不同时间后，弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次，然后用添加50-125μg/ml庆大霉素的细胞培养液孵育20-60min、杀灭胞外菌株；弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次；收集细胞，获得负载减毒沙门氏菌菌株的活的上述一种单核细胞/巨噬细胞；为了检测单核细胞或巨噬细胞中有效装载的减毒沙门氏菌的数量，用细胞计数器检测不同时间点下、装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的活细胞的数量，随后在室温下用0.5％Triton X-100裂解细胞；将裂解液倍比稀释，涂于加有卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜；计数载于单核细胞/巨噬细胞内的活菌的数量；
(3)将上述制备的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的活细胞用500-1000微升无血清细胞冻存液重悬；细胞悬液直接在液氮中快速冷冻，放置6-18小时后取出，经37-42℃水浴化冻，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
使用液氮快速冷冻休克处理6-18小时便可消除细胞的致病性，但不影响细胞的肿瘤富集能力与胞内减毒沙门氏菌的生物活性。
进一步地，在步骤(1)或步骤(2)中，减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括但不限于前述已经申请发明的各菌株(ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta PharmaceuticaSinica B 2021，11(10):31653177；Signal Transduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ)，所述永生化的单核细胞系/巨噬细胞系包括THP1、iBMMC、J-111、Mono-Mac-1、JOSK-M、RAW264.7、J774.1、Ana-1、iBMD或U937中的任意一种；其中，所述单核细胞包括单核细胞系THP1、iBMMC、J-111、Mono-Mac-1或JOSK-M中的任意一种，所述巨噬细胞包括巨噬细胞系RAW264.7、J774.1、Ana-1、iBMDM或U937中的任意一种。
更进一步地，在步骤(2)中，以巨噬细胞系RAW264.7为例，在综合考虑菌株装载量与细胞完整性后，选择共培养时间60分钟为制备活的CELL/VNP细胞最优时间点，该时间下细胞内活菌的负载高，负载为每100个细胞装载257±27个菌株，且细胞完整性>90％。
本发明的制备方法制得的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
进一步地，冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞治疗剂量为0.4-40×106细胞，所述单位为细胞/只小鼠，对应实际减毒沙门氏菌菌量为0.1-10×107CFU，所述单位为CFU/只小鼠；冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞给药次数为单次给药。给药方式以静脉或腹腔注射为主。
进一步地，药物制剂包括静脉注射制剂、瘤内注射剂制或腹腔注射剂中的至少一种。冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞主要以静脉注射方式给药进行治疗，而就瘤种不同，还可经腹腔注射、瘤内注射方式给药。相较单一注射冷休克处理的减毒沙门氏菌，以及冷休克处理的巨噬细胞与冷休克处理的减毒沙门氏菌二者的简单混合，借助冷冻休克巨噬细胞对菌体的伪装保护与靶向递送作用而用于肿瘤治疗后，小鼠的肿瘤生长得到更显著抑制，存活时间显著延长。相较单一注射冷休克处理的减毒沙门氏菌，借助冷冻休克巨噬细胞对菌体的伪装保护与靶向递送，实现了肿瘤内沙门氏菌滴度提升110.9％，正常脏器的脱靶效应降低16.3％，肝脏病变区域减少90％。
经由细胞向肿瘤组织递送并释放的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其基因改造菌株是发挥该类药物抗肿瘤疗效的关键因素。
本发明应用与其他常规抗肿瘤药物或方法的联合应用。
有益效果：本发明冷冻休克处理的菌株装载的免疫细胞制备方法简单、容易操作，具有很好的应用前景。这一策略避免了细菌异源刺激物的体内大量暴露，提高了基于细菌的抗肿瘤治疗的生物安全性。瘤内菌株的高滴度也促进了抗肿瘤免疫反应，从而获得了更强的抗肿瘤效力。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)冷处理在去除原单核细胞系或巨噬细胞系潜在致病性的同时，维持其原有的瘤内富集能力，且对胞内菌株的活性和感染性几乎无影响，促进细菌在肿瘤中的积累。选择了兼性厌氧型细菌鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株(包括但不限于前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ)，因为其能够在单核细胞/巨噬细胞等免疫细胞内长期存活、液氮冷休克处理对其后续的生物活性无显著影响、菌株自身具有良好的肿瘤易定殖性和抑制肿瘤的效果。
(2)选择了液氮冷休克处理的永生化单核细胞系或巨噬细胞系，如巨噬细胞系RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等，单核细胞系THP1，iBMMC，J-111，Mono-Mac-1，JOSK-M等，因为其在冷处理前能够在体外快速增殖，且营养需求简单、研究背景清晰，可实现大量、快速的获取。在简单的液氮冷休克处理后，便可使该细胞系丧失病原性，实现高生物安全性。
(3)本发明的冷冻休克的永生化单核细胞系或巨噬细胞系制备方法可实现对这类工程细胞的快速获取、制备且细胞无致病性，而减毒沙门氏菌VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株(包括但不限于前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；Signal Transduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier ofMedicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ)是低毒易培养的细菌，成本低廉，因此本发明具有大规模推广应用的前景。液氮冷休克处理的永生化单核细胞系或巨噬细胞系装载减毒沙门氏菌VNP20009再使用，不仅在小鼠模型中验证了其较单一菌株使用显著提升的生物安全性，还展示出良好的抗肿瘤效果。
(4)冷处理的菌株装载单核细胞/巨噬细胞给药后可高效富集肿瘤内部，避免了细菌脱靶至正常脏器中，单核细胞/巨噬细胞的包裹伪装也有效避免了细菌的过早暴露。其最终通过释放胞内菌株以激活/调节免疫系统间接抑制肿瘤。
附图说明
图1为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞制备条件优化图；图1a为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞制备流程图。(单核细胞系或巨噬细胞系包括THP1、iBMMC、J-111、Mono-Mac-1、JOSK-M、RAW264.7、J774.1、Ana-1、iBMDM、U937，此处使用经典巨噬细胞系(RAW264.7)为实施例，但是使用其他细胞的效果均与RAW264.7相似)，先用减毒沙门氏菌VNP20009感染活巨噬细胞RAW264.7，获得了负载VNP的活的巨噬细胞(活的MACS/VNP)，然后用液氮冷冻处理12小时得到液氮处理的MACS/VNP细胞(冷处理的MACS/VNP)。冷处理的MACS/VNP细胞可以将VNP菌株靶向输送到肿瘤。最终获得的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞经静脉给药荷瘤小鼠，用于实现肿瘤的靶向治疗；图1b为本发明的活巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌VNP20009共培养前后显微观测图。RAW264.7与VNP20009以MOI 20进行共培养，使用细胞核染料Hoechst染色细胞核便于观察。可观测到VNP20009主动侵染巨噬细胞(红色箭头处)；图1c为本发明的活巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌VNP20009以MOI 20进行共培养不同时间(30/60/90/120/150分钟)后，每100个巨噬细胞内的VNP20009细菌总数，以及通过显微镜观测到的保持完整性巨噬细胞的占比变化；图1d为本发明活巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌VNP20009以MOI 20进行共培养不同时间(30/60/90/120/150分钟)后显微镜观测图。以活巨噬细胞RAW264.7作为对照，使用细胞核染料Hoechst染色细胞核便于观察(蓝色)，可观测到巨噬细胞周围的VNP20009(白色箭头处)，以及随着共培养时间增加，荷载细菌增多而导致破碎的细胞(红色箭头处)。
图2为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞胞内菌株释放性能评估图；图2a为本发明活巨噬细胞RAW264.7(活的MACS)、活巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌VNP20009共培养后获得的装载减毒沙门氏菌VNP20009的活的巨噬细胞(活的MACS/VNP)和冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)的共聚焦荧光显微镜图；RAW264.7与VNP20009以MOI 20进行共培养，使用细胞核染料DAPI染色细胞核(蓝色)，FITC-鬼臼蛋白标记肌动蛋白(绿色)便于观察。可观测到菌株荷载和低温休克都不会显著影响巨噬细胞的整体完整性，细胞内可以观察到完整的菌株VNP20009巨噬细胞(红色箭头处)；比例尺＝20μm；图2b为本发明活巨噬细胞RAW264.7(活的MACS)、装载减毒沙门氏菌VNP20009的活的巨噬细胞(活的MACS/VNP)和冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)的透射电镜和扫描电镜观测图；可观察到菌株荷载和低温休克都不会显著影响巨噬细胞的整体完整性，细胞内可以观察到菌株VNP20009巨噬细胞(红色箭头处)；比例尺＝5μm；图2c为本发明装载带红色荧光(RFP)减毒沙门氏菌VNP-RFP的活的巨噬细胞(活的MACS/VNP-RFP)和冷冻休克处理的装载带红色荧光(RFP)减毒沙门氏菌VNP-RFP的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP-RFP)内活菌株数量的变化图；有代表性的平板涂布结果(上图)，ns＝不显著；图2d为本发明实时监测6小时内装载带红色荧光(RFP)减毒沙门氏菌VNP-RFP的活的巨噬细胞(活的MACS/VNP-RFP)和冷冻休克处理的装载带红色荧光(RFP)减毒沙门氏菌VNP-RFP的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP-RFP)培养板中红色荧光(RFP)荧光强度变化图；图2e为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)胞内减毒沙门氏菌VNP20009释放过程透射电镜观测图(左、中)和胞内细菌释放过程示意图(右)，可以观测到细菌从细胞内到细胞外的移动(白色曲线)；冷处理的MACS/VNP细胞表面的缺口(橙色箭头处)；细胞外繁殖的细菌(蓝色箭头处)，比例尺左侧＝1μm，中间＝500nm(放大图)。
图3为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞所释放菌株的生物活性检测图；图3a为本发明从冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)中释放出来的VNP和未作处理的正常减毒沙门氏菌VNP20009在LB型液体培养基中的生长曲线图，培养温度为37℃；图3b为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)中释放出来的VNP和未作处理的正常减毒沙门氏菌VNP20009的扫描电镜观测图，比例尺＝1μm；图3c为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)中释放出来的VNP和未作处理的正常减毒沙门氏菌VNP20009分别感染肿瘤细胞(B16F10，LLC，4T1，A20，H22)1小时后细胞内化细菌数图；肿瘤细胞与不同的VNP均以MOI 100进行共培养，用PBS清洗和庆大霉素处理1小时以去除胞外残留的VNP后，用0.5％Triton X-100裂解细胞，稀释后涂板以计算内化细菌数；图3d为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)中释放出来的VNP和未作处理的正常减毒沙门氏菌分别与H22细胞共孵育4小时后，细胞通过Annexin V和PI染色进行的代表性流式分析图，并对凋亡细胞(Annexin V+细胞)的百分比进行了定量分析，H22细胞与不同的VNP均以MOI 100进行共培养，ns＝不显著，****P<0.0001。
图4为本发明冷冻休克处理的单核细胞系或巨噬细胞系潜在致病性评估图；图4a为本发明活巨噬细胞RAW264.7(活的MACS)、冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7(冷处理的MACS)和冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)不同时间点(0/12/24/36/48小时)的细胞存活率；CCK8法检测细胞存活率，a.u.为任意单位；图4b为本发明活巨噬细胞RAW264.7(活的MACS)和冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS)在体内接种后不同时间点(2/5/8/11/14天)的生物活性分析；可以观测到由于活的巨噬细胞细胞持续增殖而出现肿块的区域(黑色箭头处)；图4c为本发明活巨噬细胞RAW264.7(活的MACS)和冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS)在体内接种14天后细胞增殖活性的对比图；虚线圆内的区域表示接种的位置。
图5为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞瘤内富集性能评估图；图5a为本发明不同治疗方法(G#1-G#3)对H22荷瘤小鼠给药8小时后，各组代表性小鼠肿瘤的DIR荧光和生物光观测图(左)和各组小鼠肿瘤DIR荧光和生物光强度统计图(右)。使用DIR标记细胞使细胞发近红外荧光，使用的VNP-LuxCDABE菌株可自发生物光。G#1：冷冻休克处理并带DIR标记的巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌VNP-LuxCDABE简单混合；G#2：冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP-LuxCDABE的带DIR标记的巨噬细胞；G#3：多聚甲醛固定处理并带DIR标记的巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌VNP-LuxCDABE简单混合，ns＝不显著，*P<0.05,***P<0.001；图5b为本发明活巨噬细胞RAW264.7(活的MACS)、活巨噬细胞RAW264.7与带红色荧光(RFP)的减毒沙门氏菌VNP-RFP共培养后获得的装载带红色荧光(RFP)减毒沙门氏菌VNP-RFP的活的巨噬细胞(活的MACS/VNP-RFP)和冷冻休克处理的装载带红色荧光(RFP)减毒沙门氏菌VNP-RFP的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP-RFP)的共聚焦荧光显微镜图。可观测到各组细胞中CD11b(黄色)和CCR2(绿色)的表达，以及巨噬细胞内完整的菌的形态(白色箭头处)；比例尺＝10μm；图5c为本发明在活巨噬细胞RAW264.7(活的MACS)、装载减毒沙门氏菌VNP20009的活的巨噬细胞(活的MACS/VNP)和冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)中CD11b蛋白(上)和CCR2蛋白(下)表达的代表性流式细胞图。
图6为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞对胞内菌株肿瘤靶向性提升性能的评估图；图6a为本发明不同治疗方法(G2-G4)对H22荷瘤小鼠给药后不同时间(8小时/1天/3天/6天/12天)与肿瘤内细菌数量的关系图。G2：冷冻休克处理的减毒沙门氏菌(冷处理的VNP)；G3：冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的巨噬细胞(冷处理的MACS/VNP)；G4：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌简单混合(冷处理的MACS+冷处理的VNP)；下述描述组别相同。*P<0.05,**P<0.01；图6b为本发明不同治疗方法对H22荷瘤小鼠给药后特定时间点(8小时/1天/3天/6天/12天)，各组小鼠正常器官(包括心、肝、脾、肺、肾)与VNP20009细菌数量的关系图；图6c-g为本发明不同治疗方法对H22荷瘤小鼠给药后特定时间点(8小时/1天/3天/6天/12天)，各组小鼠心(c)、肝(d)、脾(e)、肺(f)和肾(g)的VNP20009细菌滴度统计图。
图7为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞体内生物安全性评估图；图7a为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠的安全性评价、肿瘤靶向及治疗试验示意图；G0：生理盐水组；G1：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7；G2：冷冻休克处理的减毒沙门氏菌；G3：冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞；G4：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌简单混合；下述描述组别相同；图7b为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药一天后，各组小鼠肝脏炎性病变的代表性图片；可观测到肝脏病理损害的位置(黑色箭头处)；比例尺＝10mm；图7c为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药一天后，各组小鼠肝脏炎性病变病灶数目的条形图。ns＝不显著，***P<0.001；图7d为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药一天后，各组小鼠肝脏炎性病变的代表性H&E染色的近距离观察图；可以观测到明显的肝损伤部位(黑色箭头处)，比例尺＝40μm；图7e为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药一天后，各组小鼠外周血血清中IL-6(左)和IL-10(右)浓度，ns＝不显著，*P<0.05,**P<0.01；图7f为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药一天后，各组小鼠外周血中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平，**P<0.01。
图8为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞对体内常规脏器影响评估图；图8为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药后，各组小鼠心、肾、肺和脾切片具有代表性的H&E染色的近距离观察图。G0：生理盐水组；G1：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7；G2：冷冻休克处理的减毒沙门氏菌；G3：冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞；G4：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌简单混合，比例尺＝40μm。
图9为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞体内生物安全性性能提升机制初步探究图；图9a为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药1小时后外周血中活化的中性粒细胞(CD11b高表达CD62L低表达)占比百分比变化的代表性流式对比图(左)和条形统计图(右)，G0：生理盐水组；G1：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7；G2：冷冻休克处理的减毒沙门氏菌；G3：冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的巨噬细胞；G4：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌简单混合；ns＝不显著，**P<0.01,***P<0.001；图9b为本发明冷冻休克巨噬细胞RAW264.7介导的肿瘤靶向递送VNP毒株示意图；冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7(冷处理MACS)的保护避免了由暴露的菌株触发的中性粒细胞激活(红叉处)，并能够在巨噬细胞的帮助下肿瘤内靶向释放细胞内菌株。
图10为本发明冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞体内抗肿瘤效应评估图；图10a为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药后特定时间点(0/3/6/9/12天)肿瘤体积统计曲线图，G0：生理盐水组；G1：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7；G2：冷冻休克处理的减毒沙门氏菌；G3：冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的巨噬细胞；G4：冷冻休克处理的巨噬细胞RAW264.7与减毒沙门氏菌简单混合；下述描述组别相同；ns＝不显著，*P<0.05；图10b为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药后肿瘤的倍增时间比较图，*P<0.05；图10c为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药12天后各组小鼠肿瘤重量统计图，ns＝不显著，*P<0.05，**P<0.01；图10d为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药12天后的肿瘤拍摄图；比例尺＝10mm；图10e为本发明不同治疗方法(G0-G4)对H22荷瘤小鼠给药后小鼠生存曲线图，当小鼠到达人道终点时，将小鼠安乐处死，ns＝不显著，*P<0.05，***P<0.001。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，包括如下步骤：所述冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞为永生化的单核细胞系或巨噬细胞系(包括THP1、iBMMC、J-111、Mono-Mac-1、JOSK-M、RAW264.7、J774.1、Ana-1、iBMDM、U937等)与减毒鼠伤寒沙门氏菌以MOI值1-100共培养，获得装载减毒沙门氏菌的工程化细胞，再经由液氮进行冷休克处理，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
单核细胞系或巨噬细胞系丧失了原有的潜在致病性，而胞内的减毒沙门氏菌可维持生物活性，在体外再度释放而出后，可在24小时达到生长平台期。相较单一注射冷休克处理的减毒沙门氏菌，以及冷休克处理的单核细胞系或巨噬细胞系与冷休克处理的减毒沙门氏菌二者的减毒混合，借助冷冻休克单核细胞或巨噬细胞对菌体的伪装保护与靶向递送用于肿瘤治疗后，小鼠的肿瘤生长得到更显著抑制，存活时间显著延长。
所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株(包括但不限于前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；Signal Transduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier ofMedicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ)；具备永生化增殖的单核细胞系/巨噬细胞系包括但不限于巨噬细胞系RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等，单核细胞系THP1，iBMMC，J-111，Mono-Mac-1，JOSK-M等。
使用液氮快速冷冻休克处理6-18小时便可消除单核细胞系或巨噬细胞系的致病性，但不影响细胞的肿瘤富集能力与胞内减毒沙门氏菌的生物活性。
在一些实施例中，本发明的一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)将单核细胞系或巨噬细胞系中的任意一种细胞与减毒沙门氏菌菌株VNP20009共孵育：
将生长条件良好的所述单核细胞或巨噬细胞以1-100×105个/孔的比例接种于培养皿中，用不含抗生素的细胞培养液进行培养，从琼脂平板上挑取减毒沙门氏菌单克隆菌株，在LB型液体培养基中过夜活化，将生长到对数相的菌液5000-8000转/分钟、离心5-10min，弃上清将沉淀重悬于无菌生理盐水中，调节OD600为0.6-1.2后，将细菌加入装有上述细胞以MOI值1-100的培养皿中，共同培养20-150分钟；
(2)用Hoechst对细胞核进行染色后，在显微镜下观察细胞的形态变化；记录细胞与细菌共培养不同时间点，对应上述一种单核细胞/巨噬细胞的破碎百分率的变化；不同时间后，弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次，然后用添加50-125μg/ml庆大霉素的细胞培养液孵育20-60min、杀灭胞外菌株；弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次；收集细胞，获得负载减毒沙门氏菌菌株的活的上述一种单核细胞/巨噬细胞；为了检测单核细胞/巨噬细胞中有效装载的减毒沙门氏菌的数量，用细胞计数器检测不同时间点下、装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞的活细胞的数量，随后在室温下用0.5％Triton X-100裂解细胞；将裂解液倍比稀释，涂于加有卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜；计数载于单核细胞/巨噬细胞内的活菌的数量；
(3)将上述制备的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞的活细胞用500-1000微升无血清细胞冻存液重悬；细胞悬液直接在液氮中快速冷冻，放置6-18小时后取出，经37-42℃水浴化冻，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
使用液氮快速冷冻休克处理6-18小时便可消除细胞的致病性，但不影响细胞的肿瘤富集能力与胞内减毒沙门氏菌的生物活性。
本申请实施例第二方面提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法制得的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
本申请实施例第三方面提供冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞系或巨噬细胞系的制备方法在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞系或巨噬细胞系治疗剂量为0.4-40×106，所述单位为细胞/只小鼠，对应实际减毒沙门氏菌菌量为0.1-10×107，所述单位为CFU/只小鼠。冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞给药次数为仅单次给药，给药方式以静脉注射为主。
所述冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞主要以静脉注射方式给药进行治疗，而就瘤种不同，还可经腹腔注射、瘤内注射方式给药。
相较单一注射冷休克处理的减毒沙门氏菌，以及冷休克处理的单核细胞系或巨噬细胞系与冷休克处理的减毒沙门氏菌二者的减毒混合，借助冷冻休克单核细胞/巨噬细胞对菌体的伪装保护与靶向递送用于肿瘤治疗后，小鼠的肿瘤生长得到更显著抑制，存活时间显著延长。以巨噬细胞系RAW264.7为例，相较单一注射冷休克处理的减毒沙门氏菌，借助冷冻休克巨噬细胞RAW264.7对菌体的伪装保护与靶向递送，实现了肿瘤内滴度提升110.9％，正常脏器的脱靶效应降低16.3％，肝脏病变区域减少90％。
所述经由单核细胞系/巨噬细胞系向肿瘤组织递送并释放的减毒鼠伤寒沙门氏菌是发挥该类药物抗肿瘤疗效的关键因素。
VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株(包括但不限于前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta PharmaceuticaSinica B 2021，11(10):31653177；Signal Transduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ)，具备永生化增殖的单核细胞系或巨噬细胞系包括但不限于巨噬细胞系RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等，单核细胞系THP1，iBMMC，J-111，Mono-Mac-1，JOSK-M等，均适用于此类制备与应用方案。
实施例1
液氮冷冻休克处理(以下简称冷处理)的减毒沙门氏菌装载单核细胞系或巨噬细胞系(冷处理CELL/VNP)制备
(1.1)液氮冷冻休克处理(以下简称冷处理)的减毒沙门氏菌装载巨噬细胞(冷处理MACS/VNP)制备
为了制备装载减毒沙门氏菌的巨噬细胞，将巨噬细胞系RAW264.7与减毒沙门氏菌菌株共孵育。具体来说，将生长条件良好的巨噬细胞RAW264.7以5×105个/孔的比例接种于6孔板中，用不含抗生素的细胞培养液进行培养。从琼脂平板上挑取减毒沙门氏菌单克隆菌株，在LB型液体培养基中过夜活化，将生长到对数相的菌液8000转/分钟离心5min，弃上清将沉淀重悬于无菌生理盐水中，调节OD600为1.0后，将细菌加入装有上述细胞(MOI 20)的6孔板中，共同培养不同时间。减毒沙门氏菌菌株可主动侵染细胞，而巨噬细胞也能够吞噬该菌株(图1a,b)。
为了在制备期间同时观察巨噬细胞的形态变化，用Hoechst(Solarbio，C0030，北京，中国)对细胞核进行染色后，在显微镜下观察细胞的形态变化。记录细胞与细菌共培养不同时间点对应巨噬细胞破碎百分率的变化。不同时间后，弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次，然后用添加75μg/ml庆大霉素的细胞培养液孵育30min。庆大霉素能够杀灭胞外菌株，而对胞内菌株没有明显影响。弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次。最后，收集细胞，便获得负载减毒沙门氏菌菌株的活巨噬细胞(活的MACS/VNP)。由于VNP20009菌株的自我保护机制，因此被装载于巨噬细胞内的菌株仍保持一定的生物活性。为了检测巨噬细胞中有效装载的减毒沙门氏菌菌株的数量，在细胞计数器的帮助下检测不同时间点下活的MACS/VNP细胞数量，随后在室温下用0.5％Triton X-100裂解细胞。将裂解液倍比稀释，涂于加有卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜。计数载于细胞内的活菌总数量。随着共孵育时间的延长，装载在巨噬细胞中的活菌株数量增加(图1c)。然而，巨噬细胞的完整性随着细菌装载负荷增多而被破坏(图1c,d)，这可能是由于长时间的载菌刺激造成的。最终，在综合考虑菌株装载量与细胞完整性后，选择共培养时间60分钟为制备活的MACS/VNP细胞最优时间点，因为该时间下细胞内活菌的负载高(每100个细胞装载257±27个菌株)，且细胞完整性高(>90％)(图1c)。
最后，将上述制备的活的MACS/VNP细胞用500-1000微升无血清细胞冻存液重悬。细胞悬液直接在液氮中快速冷冻，放置6-18小时后取出，经37-42℃水浴化冻，即获得液氮冷处理的VNP20009菌株负载巨噬细胞(冷处理MACS/VNP细胞)(图1a)。
本发明同时尝试了VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(1.2)液氮冷冻休克处理(以下简称冷处理)的减毒沙门氏菌装载巨噬细胞系(冷处理MACS/VNP)制备
为了制备装载减毒沙门氏菌的巨噬细胞，按照上述(1.1)的操作，将巨噬细胞系RAW264.7替换为其他巨噬细胞系J774.1，或Ana-1，或iBMDM，或U937与减毒沙门氏菌菌株共孵育。具体来说，将生长条件良好的巨噬细胞J774.1，或Ana-1，或iBMDM，或U937以5×105个/孔的比例接种于6孔板中，用不含抗生素的细胞培养液进行培养。从琼脂平板上挑取减毒沙门氏菌单克隆菌株，在LB型液体培养基中过夜活化，将生长到对数相的菌液8000转/分钟离心5min，弃上清将沉淀重悬于无菌生理盐水中，调节OD600为1.0后，将细菌加入装有上述细胞(MOI 20)的6孔板中，共同培养不同时间。减毒沙门氏菌菌株可主动侵染细胞，而巨噬细胞也能够吞噬该菌株，其结果与图1a,b相似。
为了在制备期间同时观察巨噬细胞的形态变化，用Hoechst对细胞核进行染色后，在显微镜下观察细胞的形态变化。记录细胞与细菌共培养不同时间点对应巨噬细胞破碎百分率的变化。不同时间后，弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次，然后用添加75μg/ml庆大霉素的细胞培养液孵育30min。弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次。收集细胞，便获得负载减毒沙门氏菌菌株的活巨噬细胞J774.1，或Ana-1，或iBMDM，或U937(活的MACS/VNP)。在细胞计数器的帮助下检测不同时间点下活的MACS/VNP细胞数量，随后在室温下用0.5％Triton X-100裂解细胞。将裂解液倍比稀释，涂于加有卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜。计数载于细胞内的活菌总数量。随着共孵育时间的延长，装载在巨噬细胞J774.1，或Ana-1，或iBMDM，或U937中的活菌株数量增加。然而，巨噬细胞J774.1，或Ana-1，或iBMDM，或U937的完整性随着细菌装载负荷增多而被破坏。检测的结果与上述(1.1)中的图1c,d相似。共培养时间60分钟为制备活的MACS/VNP细胞最优时间点，该时间下细胞内活菌的负载高，且细胞完整性高(>90％)。
将上述制备的活的MACS/VNP细胞用500-1000微升无血清细胞冻存液重悬。细胞悬液直接在液氮中快速冷冻，放置6-18小时后取出，经37-42℃水浴化冻，即获得液氮冷处理的减毒沙门氏菌菌株负载巨噬细胞(冷处理MACS/VNP细胞)。
本发明同时尝试了VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https:// doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(1.3)液氮冷冻休克处理(以下简称冷处理)的减毒沙门氏菌装载单核细胞系(冷处理MC/VNP)制备
为了制备装载减毒沙门氏菌的单核细胞，按照上述(1.1)的操作，将巨噬细胞系RAW264.7替换为单核细胞系THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M与减毒沙门氏菌菌株共孵育。具体来说，将生长条件良好的单核细胞THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M以5×105个/孔的比例接种于6孔板中，用不含抗生素的细胞培养液进行培养。从琼脂平板上挑取减毒沙门氏菌单克隆菌株，在LB型液体培养基中过夜活化，将生长到对数相的菌液8000转/分钟离心5min，弃上清将沉淀重悬于无菌生理盐水中，调节OD600为1.0后，将细菌加入装有上述细胞(MOI 20)的6孔板中，共同培养不同时间。减毒沙门氏菌菌株可主动侵染细胞，而单核细胞也能够吞噬该菌株，其结果与(1.1)、(1.2)中的结果相似。
为了在制备期间同时观察单核细胞的形态变化，用Hoechst对细胞核进行染色后，在显微镜下观察细胞的形态变化。记录细胞与细菌共培养不同时间点对应单核细胞破碎百分率的变化。不同时间后，弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次，然后用添加75μg/ml庆大霉素的细胞培养液孵育30min。弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次。收集细胞，便获得负载减毒沙门氏菌菌株的活单核细胞THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M(活的MC/VNP)。在细胞计数器的帮助下检测不同时间点下活的MC/VNP细胞数量，随后在室温下用0.5％Triton X-100裂解细胞。将裂解液倍比稀释，涂于加有卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜。计数载于细胞内的活菌总数量。随着共孵育时间的延长，装载在单核细胞THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M中的活菌株数量增加。然而，单核细胞THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M的完整性随着细菌装载负荷增多而被破坏。检测的结果与上述与(1.1)、(1.2)中的结果相似。共培养时间60分钟为制备活的MC/VNP细胞最优时间点，该时间下细胞内活菌的负载高，且细胞完整性高(>90％)。
将上述制备的活的MC/VNP细胞用500-1000微升无血清细胞冻存液重悬。细胞悬液直接在液氮中快速冷冻，放置6-18小时后取出，经37-42℃水浴化冻，即获得液氮冷处理的VNP20009菌株负载巨噬细胞(冷处理MC/VNP细胞)。
本发明同时尝试了VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
实施例2
冷处理的减毒沙门氏菌装载单核细胞系/巨噬细胞系(CELL/VNP)的生物活性评估
(2.1)冷处理的减毒沙门氏菌装载巨噬细胞的生物活性评估
(2.1.1)冷处理的MACS/VNP细胞及胞内菌株形态观测
为了比较液氮冷处理前后巨噬细胞的形态学变化，分别采用荧光显微镜，扫描电镜和透射电镜对上述制备的活的MACS、活的MACS/VNP和冷处理的MACS/VNP细胞进行拍照。
针对荧光显微镜观察细胞形态，用4％多聚甲醛固定活的MACS、活的MACS/VNP和冷处理的MACS/VNP细胞30分钟，用0.5％Triton X-100(Sigma-Aldrich,648462,St.Louis,MO,美国)穿膜处理。PBST洗涤3次后，加入Actin-Tracker Green-488(碧云天,C2201S)，37℃孵育1小时，DAPI(碧云天,C1005)染色。VNP-RFP菌株用红色荧光蛋白RFP实现细胞内示踪，使用荧光显微镜拍摄观察(Carl Zeiss,Axioplan 2,Oberkohen,德国)。针对扫描电镜(SEM)观察细胞形态，将活的MACS、活的MACS/VNP和冷处理的MACS/VNP细胞在2.5％异丙醇中预先固定在室温下2小时，并用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤。然后，将样品悬浮并包埋在1％琼脂糖中，用1％锇酸在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中固定2小时，室温下用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗几次。样品经一系列分级乙醇溶液脱水后，在临界点干燥机中干燥，最后在溅射涂布机上涂上金进行扫描电镜观察。针对透射电镜(TEM)观察细胞形态，将活的MACS、活的MACS/VNP和冷处理的MACS/VNP细胞在2.5％异丙醇中预先固定在4℃下2-4小时，并用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤。然后，将样品悬浮并包埋在1％琼脂糖中，用1％锇酸在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中固定2小时，室温下用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗几次。固定后，用一系列分级乙醇脱水，样品包埋在Epon812中，在60℃烤箱中聚合48小时，用超微切片机切片，厚度为60-80nm，用2％醋酸铀酰和2.6％柠檬酸铅双染色进行TEM观察。
荧光显微镜(图2a)和扫描电子显微镜(图2b)观察表明，胞内菌株的装载和液氮低温处理都不会显著影响细胞的完整性，细胞内可以观察到完整的菌株(图2b)。因此可以推测，这一细胞装载后再递送策略实现了有效的保护特性，因为细菌异源物质不再直接暴露在生物体内的环境中。
上述巨噬细胞指RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等巨噬细胞，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937的结果与RAW264.7的结果相似。
本发明同时尝试了VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https:// doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(2.1.2)冷处理的MACS/VNP细胞胞内菌株活性及其释放检测
细菌可以通过调节自身细胞膜的组成和冷休克蛋白的表达来获得抗寒性,接下来，检测冷处理的MACS/VNP细胞胞内菌株的生物活性。分别取等细胞数量的按照上述方法制备得到的活MACS/VNP细胞与冷处理MACS/VNP细胞，在室温下用0.5％Triton X-100裂解细胞。将裂解液倍比稀释，涂于添加卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜。分别计数平板上的单克隆菌株数并比较。结果表明液氮冷处理并不影响细胞内菌株的活性，这些胞内菌株在条件恢复后可快速恢复原有的生物活性(图2c)。随后，利用实验室已有的可表达RFP红色荧光蛋白的VNP20009菌株(VNP-RFP)，按照上述方法制备活的MACS/VNP-RFP和冷处理的MACS/VNP-RFP细胞。将制备好的两种细胞分别添加到96孔板(1×104个细胞/200μL/孔)中，通过酶标仪测定每孔中RFP荧光强度(激发光550nm、发射光585nm)随孵育时间的变化。通常，检测到的总荧光强度与孔内菌株数目正相关。在孵育的第3小时，便可于冷处理的MACS/VNP-RFP细胞组中检测到显著的菌株增殖(图2d)。菌株的释放可能是由于胞内菌株的持续增殖和运动所致。将获得体外孵育不同时间(0/2/4h)的冷处理的MACS/VNP细胞，用4％多聚甲醛固定后，按上述描述方法进行透射电镜拍照胞内菌株状态变化。可以更直观的观测到于孵育2小时拍摄到的“胞内菌经由细胞释放”，以及随后于孵育4小时拍摄到的“细菌在胞外增殖”(图2e)。
这些结果证实冷处理的MACS/VNP细胞胞内减毒沙门氏菌菌株未丧失生物活性，并可在适宜条件下经由胞内释放而出，迅速增殖。与活的MACS/VNP组相比，冷处理的MACS/VNP组菌株释放时间更早，这暗示借助后者的抗肿瘤治疗或可实现更迅速的菌株释放与药效发挥(图2c)。
为了检测冷处理MACS/VNP细胞释放出的减毒沙门氏菌菌株增殖活性与形态变化，获得冷处理MACS/VNP细胞后，用0.5％Triton X-100裂解细胞释放胞内菌株。收集上清液中的VNP菌株，即为释放菌株。随后采用Bioscreen C软件(OY Growth 175Curves Ab Ltd.,芬兰)检测正常菌株与释放菌株两种不同菌株在LB培养基上的生长曲线。简单地说，用10μL减毒沙门氏菌悬浮液(OD600＝1.0)感染1mL LB培养基，每孔加入300μL溶液到Bioscreen C多孔板上。37℃多孔板孵育30小时。每隔30分钟，使用600nm波长的棕色滤光片测定OD值。同期按照上述描述的制备方法，分别获得正常菌株与释放菌株的固定样本，进行扫描电镜拍摄。结果证实，正常菌株与释放菌株具有相近的增殖生长特性，在24小时左右可生长至平台期(图3a)。而两种菌株的外观形态也均无显著差异(图3b)。
沙门氏菌可以通过其鞭毛实现细胞侵染和运动活性，从而诱导受侵染细胞的凋亡或焦亡。接下来分别检测由冷处理MACS/VNP细胞释放出来的减毒沙门氏菌菌株侵染肿瘤细胞与诱导其凋亡的能力变化。针对细菌侵染能力检测，分别将正常VNP菌株与释放VNP菌株以MOI 100感染H22肿瘤细胞(小鼠肝癌细胞)1小时，感染后用PBS清洗细胞，再用75μg/mL庆大霉素作用30min去除胞外残留菌株。用0.5％的Triton X-100裂解细胞，通过将细胞裂解稀释涂布在LB型平板上以确定内化的VNP菌株数量。针对细菌诱导凋亡能力检测，将肿瘤细胞(2.0×105)接种于12孔板上，贴壁培养6～8h。然后，收集正常的减毒沙门氏菌或释放的减毒沙门氏菌菌株，在MOI为100的情况下与细胞共同培养4h。将平板中的所有细胞取出，清洗，再重悬在结合缓冲液中，然后用1μg的实验室自制的APC偶联Annexin V蛋白进行染色，避光冰上孵育30分钟。最后使用1μL的碘化丙啶(PI，25g/mL)加入所有制备的样品中，轻轻混合后借助流式细胞仪检测。结果表明，正常的减毒沙门氏菌或释放的减毒沙门氏菌菌株都可有效的侵染肿瘤细胞，二者的侵染效率无显著差异(图3c)。此外，相较生理盐水组仅不到5％的凋亡细胞，正常的VNP或释放的减毒沙门氏菌菌株均可诱导肿瘤细胞发生显著的凋亡，且凋亡水平均高于15％，而二者间无显著差异(图3d)。
这些结果表明，经胞内释放的减毒沙门氏菌菌株在生长速度、菌株形态、感染和诱导肿瘤细胞坏死方面与正常减毒沙门氏菌菌株没有显著差异。因此，这些释放的减毒沙门氏菌菌株当存在于肿瘤内时，能够以经典的方式重塑肿瘤微环境，促使肿瘤消退。此外，为获得更佳的递送与治疗效果，建议可再将从液氮中新鲜获得的冷处理的MACS/VNP细胞在37℃的培养液中孵育10-20分钟，以简单恢复胞内菌株生物活性，再用于后续研究/治疗。
上述巨噬细胞指RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等巨噬细胞，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937的结果与RAW264.7的结果相似。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https:// doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(2.2)冷处理的减毒沙门氏菌装载单核细胞的生物活性评估
(2.2.1)冷处理的MC/VNP细胞及胞内菌株形态观测
为了比较液氮冷处理前后单核细胞(MC)的形态学变化，分别采用荧光显微镜，扫描电镜和透射电镜对上述制备的活的MC、活的MC/VNP和冷处理的MC/VNP细胞进行拍照。
针对荧光显微镜观察细胞形态，用4％多聚甲醛固定活的MC、活的MC/VNP和冷处理的MC/VNP细胞30分钟，用0.5％Triton X-100穿膜处理。PBST洗涤3次后，加入Actin-Tracker Green-488，37℃孵育1小时，DAPI染色。VNP-RFP菌株用红色荧光蛋白RFP实现细胞内示踪，使用荧光显微镜拍摄观察。针对扫描电镜观察细胞形态，将活的MC、活的MC/VNP和冷处理的MC/VNP细胞在2.5％异丙醇中预先固定在室温下2小时，并用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤。然后，将样品悬浮并包埋在1％琼脂糖中，用1％锇酸在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中固定2小时，室温下用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗几次。样品经一系列分级乙醇溶液脱水后，在临界点干燥机中干燥，最后在溅射涂布机上涂上金进行扫描电镜观察。针对透射电镜观察细胞形态，将活的MC、活的MC/VNP和冷处理的MC/VNP细胞在2.5％异丙醇中预先固定在4℃下2-4小时，并用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤。然后，将样品悬浮并包埋在1％琼脂糖中，用1％锇酸在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中固定2小时，室温下用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗几次。固定后，用一系列分级乙醇脱水，样品包埋在Epon812中，在60℃烤箱中聚合48小时，用超微切片机切片，厚度为60-80nm，用2％醋酸铀酰和2.6％柠檬酸铅双染色进行TEM观察。
荧光显微镜和扫描电子显微镜观察的结果与上述(2.1.1)、(2.1.2)中的结果相似，胞内菌株的装载和液氮低温处理都不会显著影响细胞的完整性，细胞内可以观察到完整的菌株。
上述单核细胞为THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M等。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。(2.2.2)冷处理的MC/VNP细胞胞内菌株活性及其释放检测。
细菌可以通过调节自身细胞膜的组成和冷休克蛋白的表达来获得抗寒性,接下来，检测冷处理的MC/VNP细胞胞内菌株的生物活性。分别取等细胞数量的按照上述方法制备得到的活MC/VNP细胞与冷处理MC/VNP细胞，在室温下用0.5％Triton X-100裂解细胞。将裂解液倍比稀释，涂于添加卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜。分别计数平板上的单克隆菌株数并比较。结果与上述(2.1.2)中的结果相似，即液氮冷处理并不影响细胞内菌株的活性，这些胞内菌株在条件恢复后可快速恢复原有的生物活性。利用可表达RFP红色荧光蛋白的减毒沙门氏菌菌株(VNP-RFP)，按照上述方法制备活的MC/VNP-RFP和冷处理的MC/VNP-RFP细胞。将制备好的两种细胞分别添加到96孔板(1×104个细胞/200μL/孔)中，通过酶标仪测定每孔中RFP荧光强度(激发光550nm、发射光585nm)随孵育时间的变化。通常，检测到的总荧光强度与孔内菌株数目正相关。在孵育的第3小时，便可于冷处理的MC/VNP-RFP细胞组中检测到显著的菌株增殖，其结果与与上述(1.2)中的结果相似。菌株的释放可能是由于胞内菌株的持续增殖和运动所致。将获得体外孵育不同时间(0/2/4h)的冷处理的MC/VNP细胞，用4％多聚甲醛固定后，按上述描述方法进行透射电镜拍照胞内菌株状态变化。直观地观测孵育2小时的“胞内菌经由细胞释放”，以及孵育4小时的“细菌在胞外增殖”，其结果与上述(2.1.2)中的结果相似。
结果证实冷处理的MC/VNP细胞胞内减毒沙门氏菌菌株未丧失生物活性，并可在适宜条件下经由胞内释放而出，迅速增殖。与活的MC/VNP组相比，冷处理的MC/VNP组菌株释放时间更早。
为了检测冷处理MC/VNP细胞释放出的减毒沙门氏菌菌株增殖活性与形态变化，获得冷处理MC/VNP细胞后，用0.5％Triton X-100裂解细胞释放胞内菌株。收集上清液中的减毒沙门氏菌菌株，即为释放菌株。随后采用Bioscreen C软件检测正常菌株与释放菌株两种不同菌株在LB培养基上的生长曲线。简单地说，用10μL VNP20009悬浮液(OD600＝1.0)感染1mL LB培养基，每孔加入300μL溶液到Bioscreen C多孔板上。37℃多孔板孵育30小时。每隔30分钟，使用600nm波长的棕色滤光片测定OD值。同期按照上述描述的制备方法，分别获得正常菌株与释放菌株的固定样本，进行扫描电镜拍摄。结果与上述(2.1.2)中的结果相似：正常菌株与释放菌株具有相近的增殖生长特性，在24小时左右可生长至平台期。而两种菌株的外观形态也均无显著差异。
沙门氏菌可以通过其鞭毛实现细胞侵染和运动活性，从而诱导受侵染细胞的凋亡或焦亡。接下来分别检测由冷处理MS/VNP细胞释放出来的减毒沙门氏菌菌株侵染肿瘤细胞与诱导其凋亡的能力变化。针对细菌侵染能力检测，分别将正常减毒沙门氏菌菌株与释放减毒沙门氏菌菌株以MOI 100感染肿瘤细胞(B16F10，LLC，4T1，A20，H22)1小时，感染后用PBS清洗细胞，再用75μg/mL庆大霉素作用30min去除胞外残留菌株。用0.5％的Triton X-100裂解细胞，通过将细胞裂解稀释涂布在LB型平板上以确定内化的VNP菌株数量。针对细菌诱导凋亡能力检测，将肿瘤细胞(2.0×105)接种于12孔板上，贴壁培养6～8h。然后，收集正常的减毒沙门氏菌或释放的减毒沙门氏菌菌株，在MOI为100的情况下与细胞共同培养4h。将平板中的所有细胞取出，清洗，再重悬在结合缓冲液中，然后用1μg的实验室自制的APC偶联Annexin V蛋白进行染色，避光冰上孵育30分钟。最后使用1μL的碘化丙啶(PI，25g/mL)加入所有制备的样品中，轻轻混合后借助流式细胞仪检测。结果与上述(1.2)中的结果相似，正常的减毒沙门氏菌或释放的减毒沙门氏菌菌株都可有效的侵染肿瘤细胞，二者的侵染效率无显著差异。相较生理盐水组仅不到5％的凋亡细胞，正常的减毒沙门氏菌或释放的减毒沙门氏菌菌株均可诱导肿瘤细胞发生显著的凋亡，且凋亡水平均高于15％，而二者间无显著差异。
这些结果与上述(2.1.2)中的结果相似，即经胞内释放的减毒沙门氏菌菌株在生长速度、菌株形态、感染和诱导肿瘤细胞坏死方面与正常减毒沙门氏菌菌株没有显著差异。因此，这些释放的减毒沙门氏菌菌株当存在于肿瘤内时，能够以经典的方式重塑肿瘤微环境，促使肿瘤消退。
上述单核细胞为THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M等。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
实施例3
冷处理减毒沙门氏菌装载单核细胞系或巨噬细胞系(CELL/VNP)的细胞生物活性检测(3.1)冷处理减毒沙门氏菌装载巨噬细胞的细胞生物活性检测
(3.1.1)细胞体内外增殖能力检测
通常，永生化的细胞系具备可快速增殖的能力，因此在使用这类细胞作为载体时需要考虑其强增殖能力对机体造成的潜在毒副作用。接下来检测液氮冷处理巨噬细胞系的体内外增殖活性。针对体外增殖检测，选取新鲜制备的、状态良好的活的MACS、冷处理的MACS与冷处理的MACS/VNP细胞，以每孔5×103细胞接种到96孔板中，每孔加入DMEM完全培养基100μL，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，并在特定时间点使用酶标仪(BioTek)进行检测。每组每个时间点设置5个重复孔，在特定时间用新鲜配置的含10％CCK-8溶液(碧云天生物技术公司，C0039)的DMEM培养基替换96孔板中原有培液，继续培养2h。将96孔板取出用酶标仪检测，在450nm处测量各组细胞的吸光值，记录每组复孔在0h、12h、24h、36h和48h的数据结果。检测结果表明，相较活的MACS细胞快速增殖(24小时内增殖了～75％，48小时内增殖了～163％)，冷处理的MACS与冷处理的MACS/VNP细胞在48小时内无明显增殖。因此可基本推断冷休克处理使得巨噬细胞系丧失了增殖活性(图4a)。随后，使用BALB/c小鼠进行细胞体内致病性实验。将活的MACS或冷处理的MACS细胞经皮下注射到BALB/c小鼠右侧腋下(每只小鼠1×106个细胞)，每1-2天拍照观察腋下有无肿块形成。结果表明，活的MACS细胞在注射后的第5天便观测到肿块突起，且随着时间的推移肿块不断变大(图4b)。与之对应的是，注射冷处理MACS细胞的小鼠无可观测到的肿块，且在第14天解剖后也未观察到明显肿块(图4c)。这表明同体外检测结果一致，活的MACS细胞在体内可持续增殖，而冷处理的MACS细胞不具备体内再增殖的活性。
在传统的细胞治疗中，实现快速且便利地获得足够的细胞用于患者治疗仍是该类疗法的主要挑战。而液氮处理的巨噬细胞系在确保易于快速大量获得的同时，失去了原有的致病性。因此，可以推测液氮处理的巨噬细胞系将具有更广泛的应用价值。
上述巨噬细胞指RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等巨噬细胞，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937的结果与RAW264.7的结果相似。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(3.1.2)细胞体内肿瘤靶向富集能力检测
在发明人以前围绕减毒沙门氏菌抗肿瘤研究发表的论文和申请的专利中，使用最多的肿瘤模型依次是B16F10(黑色素瘤)，LLC(肺癌细胞)，4T1(乳腺癌细胞)，A20(淋巴瘤细胞)；H22(肝癌细胞)是发明人使用最少的肿瘤模型。本发明使用了B16F10，LLC，4T1，A20，H22五种肿瘤模型。
肿瘤细胞皮下荷瘤小鼠模型的建立
肿瘤细胞在DMEM细胞培养基中生长至指数生长期后，收集细胞腹腔注射Balb/c小鼠(6周龄，雌性，2×106个细胞每只小鼠)，并于3-5天小鼠腹腔肿大后，安乐处死小鼠，取小鼠腹腔液中的H22细胞。将获得的肿瘤细胞PBS清洗2-3次，再用PBS重悬细胞将细胞终浓度调整为1×107个/mL。每只Balb/c小鼠接种100μL于小鼠腋下脂肪垫处，即1×106个/只。接种后小鼠饲养于清洁级动物房中，待小鼠肿瘤体积生长至约80-120mm3时进行后续实验。
给药方式：荷瘤小鼠随机分组后，使用近红外(NIR)荧光染料DIR(Abbkine,BMD0074,武汉,中国)处理不同的冷处理巨噬细胞30min，以产生DIR标记的细胞。DIR标记的冷处理细胞用4％多聚甲醛室温固定1小时，使细胞表面蛋白质变性失活，获得固定的冷处理细胞作为对照。经尾静脉注射给药上述不同细胞一次，给药量为冷处理VNP株(1.0×107个/只)和/或细胞(4.0×106个/只)，包括冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)，冷处理MACS/VNP和固定后的冷处理MACS/VNP细胞。上述VNP20009菌株使用实验室早期构建得的VNP-LuxCDABE菌株，该菌株可自发生物光以用于体内示踪。
在将上述细胞经尾静脉注射至荷瘤小鼠体内。用活体成像系统(PerkinElmer，Lumina III，Waltham，MA，美国)检测不同方式处理后小鼠肿瘤中LuxCDABE和DIR的荧光信号。可于注射后的8小时，在冷处理MACS+VNP和冷处理MACS/VNP细胞组观测到显著的DIR信号，对应固定后的冷处理MACS/VNP细胞组DIR信号微弱。此外，冷处理MACS/VNP细胞组较另外两组的LuxCDABE显著更高，这暗示其对应更高的菌株滴度(图5a)。由此可见，借助冷处理巨噬细胞进行的菌株肿瘤靶向递送，确实经由巨噬细胞的肿瘤靶向作用，实现了菌株更有效的肿瘤内富集。
随后检测冷处理细胞表面的蛋白含量变化。CD11b等细胞黏附分子和CCR2等趋化因子受体在巨噬细胞锚定肿瘤部位中起着至关重要的作用。为了测试CD11b和CCR2是否仍然存在于细胞表面，收集了活的MAC、活的MACS/VNP和冷处理的MACS/VNP细胞，并用荧光显微镜和流式细胞仪分析CD11b和CCR2在细胞表面的表达。针对荧光显微镜分析，将上述细胞重悬在1％BSA中，分别用蛋白质特异性抗体，包括CD11b抗体(ABclonal，A1581，武汉，中国)、CCR2抗体(Proteintech，16153-1-AP，武汉，中国)，进行孵育。用PBST洗涤2～3次后，用FITC标记的荧光二抗(Absin，Asp20004，上海，中国)示踪一抗，最后使用荧光显微镜(CarlZeiss，Axioplan 2，Oberkohen，德国)观察标记情况。针对流式细胞仪分析，将上述细胞重悬在细胞染色缓冲液中，分别用CD11b-APC(BD，553312)和CCR2-AF647(Biolegend，cloneSA203G11)在4℃避光条件下染色30min，离心收集沉淀物，用PBS洗涤1～2次。PBS重悬后用流式细胞仪分析细胞表面荧光。结果表明，活的MACS、活的MACS/VNP和冷处理的MACS/VNP细胞表面均可检测到较高的CD11b和CCR2蛋白含量。(图5b,c)
表面整合素和趋化因子受体，包括CD11b和CCR2，加上无序和弯曲的微米直径的肿瘤毛细血管所对应的更强的捕获效应，可能是实现冷处理MACS/VNP细胞在肿瘤部位高效聚集的重要原因。总之，这些结果证实本发明所描述的液氮冷处理的巨噬细胞可有效富集于肿瘤区域，并实现有效的抗肿瘤细菌递送。
上述巨噬细胞指RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等巨噬细胞，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937的结果与RAW264.7的结果相似。
B16F10，LLC，4T1，A20肿瘤模型的结果与H22肿瘤模型非常相近。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(3.2)冷处理减毒沙门氏菌装载单核细胞的细胞生物活性检测
(3.2.1)细胞体内外增殖能力检测
通常，永生化的细胞系具备可快速增殖的能力，因此在使用这类细胞作为载体时需要考虑其强增殖能力对机体造成的潜在毒副作用。接下来检测液氮冷处理单核细胞系的体内外增殖活性。针对体外增殖检测，选取新鲜制备的、状态良好的活的MC、冷处理的MC与冷处理的MC/VNP细胞，以每孔5×103细胞接种到96孔板中，每孔加入DMEM完全培养基100μL，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，并在特定时间点使用酶标仪进行检测。每组每个时间点设置5个重复孔，在特定时间用新鲜配置的含10％CCK-8溶液的DMEM培养基替换96孔板中原有培液，继续培养2h。将96孔板取出用酶标仪检测，在450nm处测量各组细胞的吸光值，记录每组复孔在0h、12h、24h、36h和48h的数据结果。检测结果与上述(3.1.1)中的结果相似，相较活的MC细胞快速增殖(24小时内大约增殖～75％，48小时内大约增殖～160％)，冷处理的MC与冷处理的MC/VNP细胞在48小时内无明显增殖；冷休克处理使得巨噬细胞系丧失了增殖活性。
使用BALB/c小鼠进行细胞体内致病性实验。将活的MC或冷处理的MC细胞经皮下注射到BALB/c小鼠右侧腋下(每只小鼠1×106个细胞)，每1-2天拍照观察腋下有无肿块形成。结果与上述(3.1.1)中的结果相似，活的MC细胞在注射后的第5天便观测到肿块突起，且随着时间的推移肿块不断变大。注射冷处理MACS细胞的小鼠无可观测到的肿块，在第14天解剖后也未观察到明显肿块。活的MC细胞在体内可持续增殖，而冷处理的MACS细胞不具备体内再增殖的活性。
液氮处理的单核细胞系在确保易于快速大量获得的同时，失去了原有的致病性。因此，液氮处理的单核细胞系将具有更广泛的应用价值。
上述单核细胞为THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M等。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https:// doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(3.2.2)细胞体内肿瘤靶向富集能力检测
本发明使用了B16F10，LLC，4T1，A20，H22五种肿瘤模型。
肿瘤细胞皮下荷瘤小鼠模型的建立
肿瘤细胞在DMEM细胞培养基中生长至指数生长期后，收集细胞腹腔注射Balb/c小鼠(6周龄，雌性，2×106个细胞每只小鼠)，并于3-5天小鼠腹腔肿大后，安乐处死小鼠，取小鼠腹腔液中的H22细胞。将获得的肿瘤细胞PBS清洗2-3次，再用PBS重悬细胞将细胞终浓度调整为1×107个/mL。每只Balb/c小鼠接种100μL于小鼠腋下脂肪垫处，即1×106个/只。接种后小鼠饲养于清洁级动物房中，待小鼠肿瘤体积生长至约80-120mm3时进行后续实验。
给药方式：荷瘤小鼠随机分组后，使用近红外(NIR)荧光染料DIR处理不同的冷处理巨噬细胞30min，以产生DIR标记的细胞。DIR标记的冷处理细胞用4％多聚甲醛室温固定1小时，使细胞表面蛋白质变性失活，获得固定的冷处理细胞作为对照。经尾静脉注射给药上述不同细胞一次，给药量为冷处理减毒沙门氏菌株(1.0×107个/只)和/或细胞(4.0×106个/只)，包括冷处理MC+冷处理VNP(两者的简单混合物)，冷处理MC/VNP和固定后的冷处理MC/VNP细胞。上述减毒沙门氏菌菌株使用实验室已构建的、可自发生物光以用于体内示踪的VNP-LuxCDABE菌株。
在将上述细胞经尾静脉注射至荷瘤小鼠体内。用活体成像系统检测不同方式处理后小鼠肿瘤中LuxCDABE和DIR的荧光信号。注射后的8小时，结果与上述(3.1.2)中的结果相似，在冷处理MC+VNP和冷处理MC/VNP细胞组观测到显著的DIR信号，对应固定后的冷处理MC/VNP细胞组DIR信号微弱。冷处理MC/VNP细胞组较另外两组的LuxCDABE显著更高，这暗示其对应更高的菌株滴度。借助冷处理巨噬细胞进行的菌株肿瘤靶向递送，确实经由单核细胞的肿瘤靶向作用，实现了菌株更有效的肿瘤内富集。
随后按照与上述(3.1.2)中的方法，检测冷处理细胞表面的蛋白含量变化。单核细胞(如THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M)，如同巨噬细胞，也表达CD11b等细胞黏附分子和CCR2等趋化因子受体。为了测试CD11b和CCR2是否仍然存在于细胞表面，收集了活的MC、活的MC/VNP和冷处理的MC/VNP细胞，并用荧光显微镜和流式细胞仪分析CD11b和CCR2在细胞表面的表达。针对荧光显微镜分析，将上述细胞重悬在1％BSA中，分别用蛋白质特异性抗体，包括CD11b抗体、CCR2抗体，进行孵育。用PBST洗涤2～3次后，用FITC标记的荧光二抗示踪一抗，最后使用荧光显微镜观察标记情况。针对流式细胞仪分析，将上述细胞重悬在细胞染色缓冲液中，分别用CD11b-APC和CCR2-AF647在4℃避光条件下染色30min，离心收集沉淀物，用PBS洗涤1～2次。PBS重悬后用流式细胞仪分析细胞表面荧光。结果与上述(3.1.2)中的结果相似，活的MC、活的MC/VNP和冷处理的MC/VNP细胞表面均可检测到较高的CD11b和CCR2蛋白含量。
这些结果证实本发明所描述的液氮冷处理的单核细胞可有效富集于肿瘤区域，并实现有效的抗肿瘤细菌递送。
上述单核细胞为THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M等。
B16F10，LLC，4T1，A20肿瘤模型的结果与H22肿瘤模型的结果相似。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
实施例4
冷处理的减毒沙门氏菌装载单核细胞/巨噬细胞(CELL/VNP)的抗癌生物安全性评估
(4.1)冷处理的减毒沙门氏菌装载巨噬细胞抗癌生物安全性评估
本发明使用了B16F10，LLC，4T1，A20，H22五种肿瘤模型。
肿瘤细胞皮下荷瘤小鼠模型建立参照实施例3中描述进行。
给药方式：荷瘤小鼠随机分组后，经尾静脉注射给药不同细胞一次，给药量为冷处理VNP菌株(1.0×107个/只)和/或细胞(4.0×106个/只)，包括冷处理MACS，冷处理VNP菌株，冷处理MACS/VNP和冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)。仅注射生理盐水作为阴性对照。
细菌在荷瘤小鼠上的组织分布
将上述药物给药荷瘤小鼠8小时，1天，3天，6天，12天后，随机处死小鼠，在无菌环境下取荷瘤小鼠的肿瘤和其他器官(包括心、肝、脾、肺、肾)，分别称重后置于2mL PBS中使用组织匀浆机进行匀浆(频率：60Hz；时间：100s)。不同组织按不同梯度稀释后涂布在LB平板中并倒置于37℃细菌培养箱中培养12h，进行菌落计数，并比较分析不同组别中VNP20009菌株在小鼠组织中的数量差异。
本发明中，检测细菌在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤组织中的滴度。冷处理MACS，冷处理减毒沙门氏菌菌株，冷处理MACS/VNP和冷处理MACS+冷处理减毒沙门氏菌三组均可观察到菌株在肿瘤内的高度富集，而在正常脏器中也出现了不同程度的富集。其中3组在第6天菌达到了相关最高的瘤内菌株滴度。因此，以第6天为代表性时间点着重描述。冷处理VNP菌株组中，正常脏器(包括心、肝、脾、肺、肾)中细菌滴度为4.664，肿瘤中细菌滴度为7.044；冷处理MACS/VNP组中，正常脏器中细菌滴度为3.903，肿瘤中细菌滴度为7.813；冷处理MACS+冷处理VNP组中，正常脏器中细菌滴度为4.474，肿瘤中细菌滴度为6.938(图6a-g)。由此可见，冷处理减毒沙门氏菌菌株组与冷处理MACS+冷处理VNP组在正常脏器和肿瘤组织中的细菌滴度都未有显著差异。而相较上述两组，冷处理MACS/VNP组在正常脏器中的细菌滴度显著降低的同时，肿瘤组织中的细菌滴度显著升高。三组间的这一差异在其它时间点也同样存在。由此可见，借助冷处理MACS细胞的装载再递送确实可以提升减毒沙门氏菌菌株的肿瘤靶向性，降低对正常脏器的脱靶。而只是将冷处理MACS细胞与冷处理VNP菌株的简单混合无法获得这一效果。突出了本发明策略的有效性。
急性毒性评估：分别将生理盐水，冷处理MACS，冷处理减毒沙门氏菌VNP菌株，冷处理MACS/VNP和冷处理MACS+冷处理减毒沙门氏菌VNP共五组经静脉给药H22肿瘤荷瘤小鼠，并在1天后进行小鼠眼眶取血(约200μL)，收集全血。全血在室温下放置30分钟，然后在3000转/分下离心15分钟。收集上清液血清进行IL-6/IL-10细胞因子检测，以及包括ALT与AST在内的血生化检测。小鼠细胞因子检测试剂盒：IL-6试剂盒(BYabscience，BY-EM220188,南京，中国)和IL-10试剂盒(Liankebio,，EK210，杭州，中国)。同时解剖获取小鼠的正常脏器(包括心、肝、脾、肺、肾)进行拍照观察以及HE染色观察(图7a)。
观察结果发现，冷处理VNP菌株与冷处理MACS+冷处理VNP组都引发了显著的肝脏损伤，表现为肝脏表面出现明显的灶点(图7b)，HE染色可观察到明显的坏死区域(图7c)。与机体炎症程度呈正相关的细胞因子(IL-6/IL-10)以及生化指标(ALT/AST)均显著升高(图7e,f)。与之相对的是，冷处理MACS/VNP上述所有损伤指标都获得了显著缓解。具体来说，生理盐水组对应肝脏急性病灶平均数量为0个，血清中IL6与IL10平均浓度为11.3pg/mL与85.8pg/mL，血清中ALT与AST平均浓度为34.5U/L与29.3U/L；冷处理VNP菌株组对应肝脏急性病灶平均数量为10个，血清中IL6与IL10平均浓度为27.4pg/mL与116.0pg/mL，血清中ALT与AST平均浓度为134.9U/L与141.3U/L；冷处理MACS+冷处理VNP组对应肝脏急性病灶平均数量为11个，血清中IL6与IL10平均浓度为22.1pg/mL与111.3pg/mL，血清中ALT与AST平均浓度为144.3U/L与153.1U/L；冷处理MACS/VNP组对应肝脏急性病灶平均数量为1个，血清中IL6与IL10平均浓度为10.9pg/mL与94.3pg/mL，血清中ALT与AST平均浓度为55.3U/L与59.2U/L。而上述几组在其余脏器(包括心、脾、肺、肾)的HE中则未观察到显著性差异(图8)。由此可见，借助冷处理MACS细胞的装载再递送确实可以降低减毒沙门氏菌菌株所致的毒副作用，提升生物安全性。而只是将冷处理MACS细胞与冷处理减毒沙门氏菌菌株的简单混合无法获得这一效果。突出了本发明策略的有效性。
为了初步探究冷处理MACS细胞的装载再递送确实可以降低VNP菌株所致毒副作用，提升菌株肿瘤瘤内富集的可能原因，检测给药后小鼠循环系统中的免疫细胞激活情况。考虑到中性粒细胞是清除外来细菌的强效主力，同时也是引发机体不良反应的主要免疫细胞，主要检测中性粒细胞的激活情况。在将不同给药处理后的小鼠完全麻醉后，摘眼球取小鼠全血并加入抗凝血剂。使用外周血淋巴细胞分离试剂盒(Solarbio，P8620)获取外周血淋巴细胞，通过40μm细胞筛去除细胞团块，获得单细胞悬浮液。将细胞用以下抗小鼠抗体染色:CD11b-APC(BD,553312)、Ly6G-BV421(BD,562737)和CD62L-PE(BD,553151)。具体而言，将收集到的外周血淋巴细胞重悬于含1％的BSA的Hanks缓冲液中，然后加入上述CD11b、Ly6G和CD62L抗体检测小鼠外周血中活化的中性粒细胞。4℃孵育30min后，用缓冲液洗涤细胞2-3次，去除未结合抗体后，借助流式细胞仪上机检测。检测结果表明，冷处理MACS+冷处理VNP组外周血中中性粒细胞活化百分率较高(～23.5％)，而冷处理MACS/VNP组外周血中中性粒细胞活化百分率显著降低(～7.6％)(图9a)。激活的中性粒细胞将通过吞噬与分泌炎症因子快速清除游离的细菌，而这些炎症因子也将对机体造成不良影响。
由此可见，借助冷处理MACS细胞的“伪装保护”作用，确实能够通过减少菌株异源物质的大量暴露而降低对外周血中其它免疫细胞的强效激活。这既避免了菌株被快速的清除，也避免了大量、快速激活的免疫细胞对机体造成的损伤作用(图9b)。也再次证明本发明提升减毒沙门氏菌临床转化应用的巨大潜力。
上述巨噬细胞指RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等巨噬细胞，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937的结果与RAW264.7的结果相似。
B16F10，LLC，4T1，A20肿瘤模型的结果与H22肿瘤模型的结果相似。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(4.2)冷处理的减毒沙门氏菌装载单核细胞抗癌生物安全性评估
本发明使用了B16F10，LLC，4T1，A20，H22五种肿瘤模型。肿瘤细胞皮下荷瘤小鼠模型建立参照实施例3中描述进行。
给药方式
荷瘤小鼠随机分组后，经尾静脉注射给药不同细胞一次，给药量为冷处理VNP菌株(1.0×107个/只)和/或细胞(4.0×106个/只)，包括冷处理MC，冷处理VNP菌株，冷处理MC/VNP和冷处理MC+冷处理VNP(两者的简单混合物)。仅注射生理盐水作为阴性对照。
细菌在荷瘤小鼠上的组织分布
将上述药物给药荷瘤小鼠8小时，1天，3天，6天，12天后，随机处死小鼠，在无菌环境下取荷瘤小鼠的肿瘤和其他器官(包括心、肝、脾、肺、肾)，分别称重后置于2mL PBS中使用组织匀浆机进行匀浆(频率：60Hz；时间：100s)。不同组织按不同梯度稀释后涂布在LB平板中并倒置于37℃细菌培养箱中培养12h，进行菌落计数，并比较分析不同组别中减毒沙门氏菌菌株在小鼠组织中的数量差异。
本发明中，检测细菌在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤组织中的滴度，结果与上述(4.1)中的结果相似。冷处理MC，冷处理减毒沙门氏菌VNP菌株，冷处理MC/VNP和冷处理MC+冷处理VNP三组均可观察到菌株在肿瘤内的高度富集，而在正常脏器中也出现了不同程度的富集。其中3组在第6天菌达到了相关最高的瘤内菌株滴度。在第6天的冷处理减毒沙门氏菌VNP菌株试验组中，正常脏器(包括心、肝、脾、肺、肾)中细菌滴度约为4.5-4.8，肿瘤中细菌滴度为6.9-7.1；冷处理MC/VNP组中，正常脏器中细菌滴度为3.8-4.0，肿瘤中细菌滴度为7.7-7.9；冷处理MC+冷处理VNP组中，正常脏器中细菌滴度为4.3-4.5，肿瘤中细菌滴度为6.8-7.0(与上述4.1中的结果相似)。冷处理减毒沙门氏菌VNP菌株组与冷处理MC+冷处理VNP组在正常脏器和肿瘤组织中的细菌滴度都未有显著差异；冷处理MC/VNP组在正常脏器中的细菌滴度显著降低的同时，肿瘤组织中的细菌滴度显著升高。三组间的这一差异在其它时间点也同样存在。由此可见，借助冷处理MC细胞的装载再递送确实可以提升减毒沙门氏菌菌株的肿瘤靶向性，降低对正常脏器的脱靶。而只是将冷处理MC细胞与冷处理VNP菌株的简单混合无法获得这一效果。
急性毒性评估
分别将生理盐水，冷处理MC，冷处理VNP菌株，冷处理MC/VNP和冷处理MC+冷处理VNP共五组经静脉给药H22肿瘤荷瘤小鼠，并在1天后进行小鼠眼眶取血(约200μL)，收集全血。全血在室温下放置30分钟，然后在3000转/分下离心15分钟。收集上清液血清进行IL-6/IL-10细胞因子检测，以及包括ALT与AST在内的血生化检测；同时解剖获取小鼠的正常脏器(包括心、肝、脾、肺、肾)进行拍照观察以及HE染色观察。
结果与上述(4.1)中的结果相似：冷处理VNP菌株与冷处理MC+冷处理VNP组肝脏表面出现明显的灶点，都引发了显著的肝脏损伤，HE染色可观察到明显的坏死区域；IL-6/IL-10以及ALT/AST均显著升高。而冷处理MC/VNP组，上述损伤指标都获显著缓解。而上述几组在其余脏器(包括心、脾、肺、肾)的HE中则未观察到显著性差异。因此，借助冷处理MC细胞的装载再递送确实可以降低VNP菌株所致的毒副作用，提升生物安全性。而只是将冷处理MC细胞与冷处理VNP菌株的简单混合无法获得这一效果。
为了探究冷处理MC细胞的装载再递送确实可以降低减毒沙门氏菌菌株所致毒副作用，提升菌株肿瘤瘤内富集的可能原因，检测给药后小鼠循环系统中的免疫细胞激活情况。考虑到中性粒细胞是清除外来细菌的强效主力，同时也是引发机体不良反应的主要免疫细胞，主要检测中性粒细胞的激活情况。在将不同给药处理后的小鼠完全麻醉后，摘眼球取小鼠全血并加入抗凝血剂。使用外周血淋巴细胞分离试剂盒获取外周血淋巴细胞，通过40μm细胞筛去除细胞团块，获得单细胞悬浮液。将收集到的外周血淋巴细胞重悬于含1％的BSA的Hanks缓冲液中，然后加入上述CD11b、Ly6G和CD62L抗体检测小鼠外周血中活化的中性粒细胞。4℃孵育30min后，用缓冲液洗涤细胞2-3次，去除未结合抗体后，借助流式细胞仪上机检测。检测结果与上述(4.1)中的结果相似，冷处理MC+冷处理VNP组外周血中中性粒细胞活化百分率较高(22～25％)，而冷处理MC/VNP组外周血中中性粒细胞活化百分率显著降低(7.5～7.8％)。激活的中性粒细胞将通过吞噬与分泌炎症因子快速清除游离的细菌，而这些炎症因子也将对机体造成不良影响。
由此可见，借助冷处理MC细胞的“伪装保护”作用，确实能够通过减少菌株异源物质的大量暴露而降低对外周血中其它免疫细胞的强效激活。这既避免了菌株被快速的清除，也避免了大量、快速激活的免疫细胞对机体造成的损伤作用。也再次证明本发明提升减毒沙门氏菌临床转化应用的巨大潜力。
上述单核细胞为THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M等。B16F10，LLC，4T1，A20肿瘤模型的结果与H22肿瘤模型的结果相似。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https:// doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
实施例5
冷处理的减毒沙门氏菌装载单核细胞或巨噬细胞(CELL/VNP)的抗癌生物安全性评估(5.1)冷处理的减毒沙门氏菌装载巨噬细胞抗癌效应评估
实验动物小鼠选用6周龄雌性BALB/c小鼠(常州动物中心)。本发明使用了B16F10，LLC，4T1，A20，H22五种肿瘤模型。肿瘤细胞皮下荷瘤小鼠模型建立参照实施例3中描述进行。待小鼠肿瘤长至约80-120mm3后，小鼠被随机分配到不同的组别中，每组7-8只。给药方式：经尾静脉注射给药不同细胞一次，给药量为冷处理VNP株(1.0×107个/只)和/或细胞(4.0×106个/只)，包括冷处理MACS，冷处理VNP菌株，冷处理MACS/VNP和冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)。仅注射生理盐水作为阴性对照。肿瘤体积的计算按照公式V＝length×width2×0.52计算获得。每隔一段时间对特定组别小鼠进行肿瘤大小的量取并经计算后用于绘制肿瘤生长曲线图。数值以Mean±SD表示。
生理盐水组的肿瘤倍数生长时间为1.128天、冷处理MACS组的肿瘤倍数生长时间为1.344天、冷处理VNP20009菌株组的肿瘤倍数生长时间为1.403天，冷处理MACS/VNP组的肿瘤倍数生长时间为1.793天，冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)组的肿瘤倍数生长时间为1.556天(图10a,b)。与生理盐水组相比，冷处理MACS组的肿瘤倍数生长时间延长19.1％，冷处理VNP20009菌株组的肿瘤倍数生长时间延长24.4％，冷处理MACS/VNP组的肿瘤倍数生长时间延长59.0％；与冷处理减毒沙门氏菌组相比，冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)组的肿瘤倍数生长时间延长10.9％，冷处理MACS/VNP组的肿瘤倍数生长时间延长27.8％；与冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)组相比，冷处理MACS/VNP组的肿瘤倍数生长时间延长15.2％，冷处理MACS装载VNP菌株后的肿瘤倍数生长时间是两者疗效加和的理论值的1.15倍，因此，冷处理MACS/VNP组确实也产生了协同增效的治疗效果。
在将治疗后的小鼠于第12天处死后，解剖获得肿瘤称重拍照。结果发现，相较生理盐水组的平均肿瘤重量1.34克，冷处理MACS组的平均肿瘤重量为2.355克、冷处理VNP菌株组的平均肿瘤重量为0.91克，冷处理MACS/VNP组的平均肿瘤重量为0.47克，冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)组的平均肿瘤重量为0.65克。后四组的平均肿瘤重量均不同程度的降低。而相较冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)组，冷处理MACS/VNP组对应的平均肿瘤重量是其72.3％(图10c,d)。此外，相较冷处理MACS+冷处理VNP(两者的简单混合物)组，冷处理MACS/VNP组对应的小鼠生存时间也获得了显著延长(图10e)。这些都再次证明，冷处理MACS/VNP组确实产生了协同增效的治疗效果。
上述巨噬细胞指RAW264.7，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937等巨噬细胞，J774.1，Ana-1，iBMDM，U937的结果与RAW264.7的结果相似。
B16F10，LLC，4T1，A20肿瘤模型的结果与H22肿瘤模型的结果相似。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
(5.1)冷处理的减毒沙门氏菌装载单核细胞抗癌效应评估
实验动物小鼠选用6周龄雌性BALB/c小鼠(常州动物中心)。本发明使用了B16F10，LLC，4T1，A20，H22五种肿瘤模型。肿瘤细胞皮下荷瘤小鼠模型建立参照实施例3中描述进行。待小鼠肿瘤长至约80-120mm3后，小鼠被随机分配到不同的组别中，每组7-8只。给药方式：经尾静脉注射给药不同细胞一次，给药量为冷处理VNP株(1.0×107个/只)和/或细胞(4.0×106个/只)，包括冷处理MC，冷处理VNP菌株，冷处理MC/VNP和冷处理MC+冷处理VNP(两者的简单混合物)。仅注射生理盐水作为阴性对照。肿瘤体积的计算按照公式V＝length×width2×0.52计算获得。每隔一段时间对特定组别小鼠进行肿瘤大小的量取并经计算后用于绘制肿瘤生长曲线图。数值以Mean±SD表示。
结果与上述(5.1)中的结果相似。与生理盐水组相比，冷处理MC组的肿瘤倍数生长时间明显延长约15％，冷处理VNP20009菌株组的肿瘤倍数生长时间延长约20％，冷处理MC/VNP组的肿瘤倍数生长时间延长约50％；与冷处理减毒沙门氏菌组相比，冷处理MC+冷处理VNP(两者的简单混合物)组的肿瘤倍数生长时间延长约10％，冷处理MC/VNP组的肿瘤倍数生长时间延长约30％；与冷处理MC+冷处理VNP(两者的简单混合物)组相比，冷处理MC/VNP组的肿瘤倍数生长时间延长20％，冷处理MACS/VNP组产生了协同增效的治疗效果。
在将治疗后的小鼠于第12天处死后，解剖获得肿瘤称重拍照。结果与上述(5.1)中的结果相似。冷处理MC/VNP组确实产生了协同增效的治疗效果。
上述单核细胞(MC)为THP1，或iBMMC，或J-111，或Mono-Mac-1，或JOSK-M等。B16F10，LLC，4T1，A20肿瘤模型的结果与H22肿瘤模型的结果相似。
上述沙门氏菌是指VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，包括前述已经申请发明的各菌株：ZL201110232776.2，ZL201110220676.8，ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，ZL202210182222.4，202010182038.0，202210070594.8，202210181929.9，202210182870.X，202210182455.4，202210268084.1，202210268141.6，2023102136359；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；SignalTransduction and Targeted Therapy 2023，8:134；Frontier of Medicine,https://doi.org/10.1007/s11684-022-0925-2；phoP/phoQ。结果表明各VNP20009基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株均显示出与VNP20009底盘菌相同的结果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述试验例的限制，上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤：所述冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞为永生化的单核细胞系或巨噬细胞系与减毒鼠伤寒沙门氏菌以MOI值1-100共培养，获得装载减毒沙门氏菌的工程化细胞，再经由液氮进行冷休克处理，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：(1)将单核细胞系或巨噬细胞系中的任意一种细胞与减毒沙门氏菌共孵育：
将生长条件良好的所述单核细胞或巨噬细胞以1-100×105个/孔的比例接种于培养皿中，用不含抗生素的细胞培养液进行培养，从琼脂平板上挑取减毒沙门氏菌单克隆菌株，在LB型液体培养基中过夜活化，将生长到对数相的菌液5000-8000转/分钟、离心5-10min，弃上清将沉淀重悬于无菌生理盐水中，调节OD600为0.6-1.2后，将细菌加入装有上述细胞以MOI值1-100的培养皿中，共同培养20-150分钟；
(2)用Hoechst对细胞核进行染色后，在显微镜下观察细胞的形态变化；记录细胞与细菌共培养不同时间点，对应上述一种单核细胞或巨噬细胞的破碎百分率的变化；不同时间后，弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次，然后用添加50-125μg/ml庆大霉素的细胞培养液孵育20-60min、杀灭胞外菌株；弃上清液，用无菌PBS洗涤2～3次；收集细胞，获得负载VNP20009菌株的活的上述一种单核细胞或巨噬细胞；为了检测单核细胞或巨噬细胞中有效装载的减毒沙门氏菌的数量，用细胞计数器检测不同时间点下、装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的活细胞的数量，随后在室温下用0.5％Triton X-100裂解细胞；将裂解液倍比稀释，涂于加有卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜；计数载于单核细胞或巨噬细胞内的活菌的数量；
(3)将上述制备的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的活细胞用500-1000微升无血清细胞冻存液重悬；细胞悬液直接在液氮中快速冷冻，放置6-18小时后取出，经37-42℃水浴化冻，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
3.根据权利要求1或2所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：在步骤(1)或步骤(2)中，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，所述永生化的单核细胞系/巨噬细胞系包括THP1、iBMMC、J-111、Mono-Mac-1、JOSK-M、RAW264.7、J774.1、Ana-1、iBMD或U937中的任意一种；其中，所述单核细胞包括单核细胞系THP1、iBMMC、J-111、Mono-Mac-1或JOSK-M中的任意一种，所述巨噬细胞包括巨噬细胞系RAW264.7、J774.1、Ana-1、iBMDM或U937中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，在综合考虑菌株装载量与细胞完整性后，选择共培养时间60分钟为制备活的CELL/VNP细胞最优时间点，该时间下细胞内活菌的负载高，负载为每100个细胞装载257±27个菌株，且细胞完整性>90％。
5.权利要求1所述的制备方法制得的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
6.权利要求1所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞治疗剂量为0.4-40×106细胞，所述单位为细胞/只小鼠，对应实际减毒沙门氏菌菌量为0.1-10×107CFU，所述单位为CFU/只小鼠；冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞给药次数为单次给药。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物制剂包括静脉注射制剂、瘤内注射剂制或腹腔注射剂中的至少一种。
9.权利要求6所述的应用与其他常规抗肿瘤药物或方法的联合应用。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117959263A (zh) * | 2024-04-01 | 2024-05-03 | 吉林大学 | 一种促进胞葬效应的载药冷冻巨噬细胞的制备及应用 |
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