CN110922490B - 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用 - Google Patents

分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌表达IL7、CCL21的CAR表达载体、以及导入此表达载体的T细胞，NK细胞及干细胞的构建。兼具超强的存活能力，以及T淋巴细胞、树突状细胞招募能力和肿瘤细胞杀伤活性及更优异的免疫诱导效果。IL7能够促进T细胞增殖，维持T细胞内稳定；CCL‑21可以募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞、和树突状细胞进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应(如癌症记忆T细胞)，从而显著提高有效率和缓解率、降低治疗缓解后的复发率。

Description

分泌白介素7和趋化因子21的CAR表达载体及应用
技术领域
本发明属于生物技术工程领域，涉及到分泌IL7和CCL21的嵌合抗原受体表达载体，导入此表达载体的T细胞、NK细胞及具有分化潜能的干细胞的构建与应用(此处以针对多发性骨髓瘤的CAR-T细胞疗法为例)。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是骨髓内浆细胞异常克隆扩增的恶性肿瘤，目前我国M 每年新增病例10余万人，且发病率逐年上升，已经超过急性白血病位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。目前针对MM的标准治疗包括昂贵的免疫调节药物、蛋白酶抑制剂和自体干细胞移植。但即使得到缓解后仍易复发，且病情进展迅速，5年存活率不及25％。MM被认为是一种不可治愈的疾病，迫切需要研发新的治疗方法/药物。
CAR-T的基本原理主要是利用通过基因工程技术在T细胞表面装上定位导航装置CAR(肿瘤嵌合抗原受体)，将T细胞这个普通“战士”改造成“超级战士”，即CAR-T细胞；CAR-T细胞利用其CAR专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，从而高效地杀灭肿瘤细胞。CAR是 CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。另外，基于iPSC的CAR-T疗法可能是未来的理想途径，即提取患者的T细胞，将T 细胞重编程成为诱导多能干细胞(T-iPS细胞)，对T-iPS细胞进行大量的、精准的基因修饰，再将基因修饰的iPS细胞分化成T细胞，最后回输到患者身上。人iPS细胞具有自我更新能力，这种方法获取的T细胞是“年轻”的细胞。另外还可以对iPS细胞进行改造，使其变成通用型细胞。CAR-NK是一种有独特优势的细胞疗法，因为它不需要与特定病人进行匹配，由iPSCs分化而来的NK 细胞可以达到批量化，以此实现细胞治疗的标准化。此外，NK细胞不会引发类似细胞因子释放综合征CRS、神经毒性等的毒副作用。
近年来，靶向CD19的第二代CAR-T细胞治疗难治/复发性B细胞恶性肿瘤已在美国用于临床，其中急性B淋巴母细胞白血病完全缓解率70％以上、B细胞型非霍奇金淋巴瘤完全缓解率40％以上。但目前第二代CAR-T疗法存在严重毒副作用(如最常见的细胞因子释放综合征和神经毒性，甚至死亡)、以及初治无效(10-20％)、缓解后高复发率(30-50％)，且对实体瘤疗效不佳等重大难题。
发明内容
针对上述背景技术中CAR-T疗法初始治疗无效、易复发等缺陷和难题，发明了一种分泌表达IL7、CCL21的嵌合抗原受体T细胞、NK细胞、干细胞(以靶向BCMA的第四代CAR-T细胞为例)，兼具存活能力，T淋巴细胞、树突状细胞招募能力和肿瘤细胞杀伤活性，且较以往的工程改造细胞有更优异的免疫诱导效果，从而降低初治无效率和缓解后再度复发率。
通过基因工程技术构建plenti-BCMA-IL7-CCL21质粒载体，然后利用高滴度的慢病毒规模化生产工艺包装出慢病毒载体以转导T细胞，培养五天后通过流式分别检测anti-BCMA CAR的表达率，体外验证CAR-T细胞对表达BCMA 阳性细胞的体外杀伤作用。
与现有技术相比，本发明涉及如下优点：
1.本发明通过第四代CAR-T细胞分泌IL7细胞因子(见SEQ ID NO.3的核苷酸序列编码，SEQ ID NO.4氨基酸序列)促进T细胞增殖，维持T细胞内稳定，即增强CAR-T细胞存活能力。
2.本发明通过第四代CAR-T细胞分泌CCL21(见SEQ ID NO.1核苷酸序列编码，或SEQ ID NO.2氨基酸序列)，能募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞、以及DC进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应。
本发明中的第四代CAR-T细胞除了CD3ζ传导的第一信号和4-1BB共刺激分子传导的第二信号，增加了第三信号(IL7细胞因子和CCL-21趋化因子)。 IL7能够促进T增殖，维持T细胞内稳定，增强其存活能力，CCL-21可以募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞、和DC(树突状细胞)进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应(如癌症记忆T细胞)，从而显著提高有效率和缓解率、降低治疗缓解后的复发率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1是靶向BCMA的第四代CAR的示意图；
图2是利用第三代慢病毒包装体系制备CAR慢病毒颗粒，以MOI＝40感染人原代T细胞，流式细胞术检测anti-BCMA CAR在T细胞膜上的表达情况；
图3是表达荧光素酶以及GFP荧光报告基因的MM1S细胞株的构建；
图4是CAR-T细胞增殖能力的检测。
图5是CCL21趋化功能的验证。
图6是通过荧光素酶法体外验证不同效靶比条件下第二代anti-BCMA CAR，和第四代anti-BCMA CAR-IL7-CCL21细胞对表达荧光素酶的MM1S细胞的杀伤活性；
图7是通过尾静脉注射表达荧光素酶的MM1S细胞小鼠体内成瘤，然后分别注射不同的CAR-T细胞验证体内杀伤活性。
图8是anti-BCMA CAR-IL7-CCL21-T细胞分泌IL7和CCL21能力的检测。
图9是第四代CAR-T细胞(分泌IL7和CCL21)疗法使复发/难治性多发性骨髓瘤患者完全缓解。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本实施例未注明具体条件的实验方法，一般按照常规条件。
主要实验材料：
EcoRI-HF、MluI-HF、NdeI限制性内切酶(NEB公司)，无缝克隆酶(和元生物)，高保真Prime GXL STAR酶(TAKARA公司)，TransStbl3感受态细胞(全式金生物科技有限公司)，Plasmid Mini Kit I(OMEGA)，
Figure BSA0000196595420000041
Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)，DMEM、RPMI-1640、Opti-MEM培养基、Gibco FBS(Thermo Fisher Scientific)，Sanger测序(上海桑尼生物有限公司)，Nacl、酵母粉、蛋白胨、EDTA、NaOH(上海生工生物工程股份有限公司)，引物(江苏金唯智生物科技有限公司)。
一、构建重组质粒
①构建Plenti-anti-BCMA CAR-IL7-CCL21重组质粒：
IL7-CCL21由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物设计均按照引物设计原则设计扩增目的DNA片段，由江苏金唯智生物科技有限公司合成。
BCMA F TCGTGAGCTAGCCCCGGGGCCACCATGGCCCTGCCTGTC
IL7 F GGCAGCGGCGCCACCAACT
IL7 R AGTTGGTGGCGCCGCTGCCCCTGGGAGGCAGGGCTTGCAT
CCL21 R TTGTITAAACACGCGTTCAGGAGCTCCTCCTCTTCATCTTA
使用引物BCMA F、IL7R以及IL7F、CCL21R分别扩增出人工合成片段 anti-BCMACAR(hCD8 leader-VL1-Linker-VH1-CD8hinge-CD8TM-41BB-CD3ζ) 和IL7-CCL21人工合成片段，扩增条件为(98℃：10s， 60℃：15s，68℃：1kb/min) *35循环，扩增体系见表1。使用1％琼脂糖凝胶获得目的片段，然后用XYGENE 胶回收试剂盒分别回收(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。取两片段胶回收产物各1μl为模板，用BCMA F和CCL21 R为引物，扩增目的片段hCD8 leader-VL1-Linker-VH1-CD8hinge-CD8TM-41BB-CD3ζ-P2A-IL7-CCL21，扩增体系如表(3)所示，(98℃：10s，60℃：15s，68℃：3min)*35cycle，使用 1％琼脂糖凝胶获得目的片段目的条带大小为2497bp。使用SmaI，Mlul-HF限制性内切酶双酶切载体PB vector，反应条件为25℃3h，37℃3h，65℃20min，酶切体系如表(5)，载体和目的片段通过无缝克隆连接，无缝体系如表(4)，然后进行质粒转化(无缝克隆产物在冰上放置5min后，将其转入100微升 TransStbl3感受态中，冰上放置30min，42℃45s，再冰上5min，加入500微升 LB，在37℃，225rpm/min摇床中活化1h，然后5000rpm/min 20℃离心5min，弃去上清，将剩余菌液混匀后涂板，37℃培养12-14小时)，挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用SmaI，Mlul-HF限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表5，使用1％琼脂糖凝胶观察目的片段条带大小依次为：7.3kb，2.4kb。最后进行Sanger测序。
Figure BSA0000196595420000061
表(1)：PCR体系
Figure BSA0000196595420000062
表(2)：胶回收步骤
Figure BSA0000196595420000063
Figure BSA0000196595420000071
表(3)：重叠PCR体系
Figure BSA0000196595420000072
表(4)：无缝克隆体系
Figure BSA0000196595420000073
表(5)：限制性酶切体系
二、利用Plenti载体质粒及辅助质粒转导293T细胞以包装慢病毒，并将包装出的慢病毒转染Jurkat细胞以计算病毒滴度
(1)在15cm细胞皿中培养293T细胞，等待293T细胞长满至全视野70％时，用1.5mlPBS重悬60ugPEI，1.5ml PBS重悬总质量为20ug的Plenti载体质粒及辅助质粒；
(2)室温静置5min，将PBS-PEI混合液加至PBS-DNA混合液中，室温静置 20min；
(3)准备OPTI-DMEM全培于37℃培养箱中复温，吸弃293T细胞中的DMEM 原培养基，将OPTI-DMEM沿皿壁加入到293T细胞；
(4)将PEI-DNA-PBS混合液加至培养皿中，37℃培养48h；
(5)收集上清液中的慢病毒于50ml离心管，再加20ml培养基孵育24h，以收集72h内的病毒；
(6)1500rpm离心5min去除细胞碎片，或用针筒通过0.45um过滤器过滤后， 3000×g离心12-14h，4℃以浓缩病毒；
(7)吸弃上清，以1∶200-1∶400加入Vivo全培或AIM-V全培(最好加1％HEPES)，重悬病毒；
(8)将病毒分装于1.5ml Ep管中，保存于-80℃，避免反复冻融(冻融使滴度降低一个数量级)，剩少许病毒用于下步的病毒滴度检测实验；
(9)jurkat细胞1500rpm离心5min后，弃上清，1ml 1640培养基重悬，计数；
(10)于96孔板中加入0.5x106jurkat细胞，以1∶50、1∶500、1∶1000、1∶2000等梯度比例加入病毒，再补充培养基至每孔总体积为200ul；
(11)每孔加入0.1ul PolybreneB蛋白促转导(0.1ul/200ul体系)；
(12)将96孔板经1200g，90min，32℃离心，离心后，于37℃培养箱孵育4h；
(13)将96孔板各孔的jurkat细胞悬液吹打混匀后转至1.5mlEp管中，1500rpm 离心5min后，弃上清，用1ml 1640全培重悬后转至24孔板中扩大培养48h， 37℃。
三、密度梯度离心法分离健康人的外周血单个核细胞(PBMC)，慢病毒转染T 细胞并检测T细胞表面CAR表达情况
(1)取健康人外周血10ml至EDTA-Na2抗凝管，与DPBS按照1∶1的比例混匀；
(2)取四只15ml无菌离心管，分别加入5ml Ficoll分离液，将外周血与DPBS 的混合液缓慢加至Ficoll分离液面上，注意不要破坏液面；
(3)水平离心800g，20min，25℃，加减速度均调到“0”；
(4)离心后用巴氏吸管将离心管中的白色絮状层即PBMC层吸出，置于新的无菌离心管中，加入PBS，将PBMC离心洗两遍；
(5)1500rpm/min，5min水平离心，弃掉上清，加入1ml Buffer1(DPBS含 5％FBS)重悬计数PBMC；
(6)用流式细胞术确定PBMC中CD3阳性细胞的比例。在细胞悬液中以 CD3/CD28dynabeads∶CD3阳性细胞＝3∶1的比例加入CD3/CD28 beads(106 个CD3阳性细胞加30ulbeads)，4℃以1rpm速度旋转摇晃30min使磁株与细胞充分接触结合；
(7)30分钟以后，在试管中加足够(大于1ml)Buffer1，然后把试管放于磁力架上左右旋转1～2分钟，吸弃上清；
(8)配制Vivo完全培养基：Vivo空培+5％FBS+1％HEPES+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸+1∶30谷氨酰胺+1∶10000 IL-2+1∶2000 IL-7+1∶2000 IL-15，并用Vivo 全培重悬细胞与磁珠，计数；
(9)加培养基使CD3阳性细胞浓度在0.5-1x106/ml之间。铺板细胞浓度为 0.5～1.0×106/ml，置于37℃培养箱培养；
(10)T细胞培养24-36h，5％CO2，37℃；
(11)在24-36h内，以MOI值＝5、20、40、80转导CAR慢病毒载体，MOI(病毒感染复数)＝[病毒滴度x病毒体积(ml)]/细胞数；
(12)1200xg，90min，4℃离心后，在37℃培养箱孵育至96孔板长满细胞后转至24孔板中，1，3，5日计数监测细胞生长状况，绘其生长曲线，5-7天时测CAR 转导率。结果如图2所示。
四、MM1S-Luc-GFP细胞系建立。
MM1S细胞转导表达luc-GFP慢病毒，第二天观察其GFP绿色荧光表达情况，继续培养，最后通过流式细胞术分选GFP阳性细胞，进一步进行培养，最后分析，结果如图3所示。
五、CAR-T细胞体外增殖能力。
不同慢病毒按照MOI＝40感染T细胞，分别在第1天，第3天，第5天，第7天计算T细胞的绝对数量，如图4-A，并在第7天时通过显微镜记录不同CAR-T细胞的生长情况如图4-B。
六、CCL21对T细胞的趋化作用。
CAR-T细胞培养5天后，取不同的细胞上清加入到transwell下室中， transwell小室(5um)中加入染有CFSE的未转导CAR的T细胞，37℃ 5％CO2培养2h，荧光显微镜下观察T细胞从小室迁移到下室的细胞，如图5。
具体操作如下：
1)提前准备Loadingbuffer(PBS含0.5％FBS)，并用其将CFSE稀释成 5uM。2)从细胞培养箱取出T细胞，1500rpm离心5min，留取上清备用，沉淀用1ml Buffer I重悬，在DynaMagTM-5磁力架上脱磁。3)2min中后将细胞悬液吸出，1500rpm离心5min，用X-VIVO完全培养基重悬计数。4) 1500rpm离心5min。5)用5uMCFSE重悬(10M细胞加1ml的CFSE)混匀，将其吸到1.5mlEP管中，避光，旋转10min。6)加入1ml冷的完全培养基终止染色。7)完全培养基洗涤三次。8)用X-VIVO完全培养基重悬并计数。9)transwell小室轻轻放到24孔板中，在下室中加入400ul步骤(2) 中的上清，注意不要有气泡。10)小室中加入染过CFSE的T细胞，0.2M/100ul。11)将24孔板放到5％CO2 37℃培养箱培养2个小时。12) 2h后，取出24孔板，荧光显微镜下拍照，随机拍取3个视野。
七、通过荧光素酶法检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用
(1)培养MM1S-Luc-GFP细胞至对数生长状态，取一定细胞数离心沉淀后计数；
(2)96孔平底不透明白板中加入104个MM1S-Luc-GFP细胞，培养基补充至 100uL；
(2)anti-BCMA CAR、anti-BCMA CAR-IL7-CCL21 CAR-T细胞与 MM1S-Luc-GFP细胞数比例设定为2∶1、5∶1、10∶1、20∶1，将相应的CAR-T细胞加入每孔混合培养；
(4)设置Mock细胞组，T细胞的数目与上述(3)中CAR-T细胞数相同；
(5)同时设置两个对照，阴性对照为MM1S-Luc-GFP细胞在水中培养；阳性对照为在培养基加入1640完全培养基，两者均不加Mock细胞或CAR-T细胞，作为细胞杀伤的最小和最大化背景值，即Kmin和Kmax。
(6)培养4小时后，96孔板以1500rpm速度离心5min，弃掉上清，用培养基洗一次后重悬细胞；
(7)每孔加入0.5mM的D-荧光素，避光静置10min后，在酶标仪用化学发光模式(Luminometric Measurement)检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms； (8)统计各孔的荧光强度值K，比较CAR-T与Mock细胞对MM1S-Luc-GFP 细胞的杀伤效率％，计算公式为：杀伤效率％＝(Kmin-K)/(Kmin-Kmax)x100％，结果如图6所示。
八、小鼠白血病模型建立1)将转导了luciferase的MM1S细胞用PBS洗三遍后，用PBS重悬，显微镜下计数，将细胞调至20M/ml的浓度。2)将5～6 周龄的雌性NSG小鼠从笼内取出，固定于小鼠固定器上。3)用酒精棉球轻轻擦拭小鼠尾静脉，使其充盈。4)用一次性的胰岛素注射器沿尾静脉进针，将4M 的细胞缓慢推入尾静脉中。5)按压注射器针孔几分钟至针孔不再出血。6)将小鼠放回笼中，定期观察。结果如图7所示
九、生物发光成像1)将仪器及电脑打开，进入软件2)启动麻醉机：检查麻醉剂罐内药品量，打开氧气罐，调节氧流量至1.5L，将诱导麻醉流量计开至最大，挥发罐的浓度调至5％，开始废气吸收装置。3)小鼠腹腔注射底物(200ul底物/只)，3min后将小鼠放入麻醉室进行麻醉。4)待小鼠呼吸平稳后，将小鼠放至成像室进行成像。
十、CAR-T细胞分泌IL7和CCL21能力的检测。
在anti-BCMA CAR-IL7-CCL21-T慢病毒感染T细胞后第2天和第5天留取细胞上清，用ELISA试剂盒检测培养上清中IL7分子和CCL21分子的分泌情况，如图8。
具体操作如下：
1、ELISA检测IL7：
1)T细胞培养第二天，沿孔壁轻轻吸取20ul上清液，300g离心10分钟去除沉淀物，恢复至室温备用。2)检测前将所有试剂恢复至室温，并准备1X洗液、1X缓冲液。3)用蒸馏水重溶人IL7标准品，轻柔的漩涡震荡，确保充分混匀，重溶后标准品浓度为1000pg/ml。4)准备7个1.5mlEP管，取250ul 浓缩的人IL7标准品，加入250ul细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度 (500pg/ml)。在每个试管中加入250ul细胞培养基。使用高浓度标准品做1∶1 系列稀释。每次移液时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。 5)将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口。6) 加入300μl1×洗液静置浸泡30秒。弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干。7)标准品孔加入100ul2倍倍比稀释的标准品。空白孔复孔加入100ul标准品稀释液。8)样本孔加入80μl1×检测缓冲液和20ul样本。9)每孔加入50ul稀释的检测抗体。10)使用封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育 2小时。11)弃掉液体，每孔加入300ul洗液洗板，洗涤6次。每次洗板，在吸水纸上拍干。12)每孔加入100ul稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。13)使用新的封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育45分钟。14) 重复步骤8。15)每孔加入100ul显色底物TMB，避光，室温孵育5-30分钟。16)每孔加入100ul终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。17)在30分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长。
2、ELISA检测CCL21
1)T细胞培养第二天，沿孔壁轻轻吸取20ul上清液，300g离心10分钟去除沉淀物，恢复至室温备用。2)检测前将所有试剂恢复至室温，并准备1X洗液、1X缓冲液。3)用标准品&标本通用稀释液重溶人CCL21标准品，轻柔的漩涡震荡，确保充分混匀，重溶后标准品浓度为1000pg/ml。4)准备7个1.5mlEP管，取250ul浓缩的人CCL21标准品作为标准曲线的最高浓度 (500pg/ml)。在每个试管中加入250ul标准品&标本通用稀释液。使用高浓度标准品做1∶1系列稀释。每次移液时，确保充分混匀。以标准品&标本通用稀释液作为标准曲线的零浓度。5)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。 6)空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品 (100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。7)提前20分钟准备生物素化抗体工作液。8)洗板5次。9)空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔， 37℃孵箱孵育60分钟。10)提前20分钟准备酶结合物工作液，避光室温 (22-25℃)放置。11)洗板5次。12)空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱，避光孵育30 分钟。13)打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。14)洗板5次。15)加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15分钟。16) 加入终止液100ul/孔，混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。
十一、Anti-BCMA CAR-IL7-CCL21-T细胞治疗复发/难治性多发性骨髓瘤临床试验研究。
这是一项开放性、非随机化、多中心的单臂I期临床试验，针对复发/难治性多发性骨髓瘤，评估Anti-BCMA CAR-IL7-CCL21-T细胞的有效性。例如，复发/难治性多发性骨髓瘤伴随髓外肿瘤的患者接受上述第四代CAR-T细胞治疗后获得完全缓解(结果如图9所示)。
具体试验流程如下：
①符合入选标准的受试者签署知情同意书。
②患者入组后提供少量外周血(＜10mL)进行体外预实验，需进行T细胞慢病毒转导和体外扩增能力评估。
③淋巴细胞清除性化疗：氟达拉滨(30mg/m2体表面积，4天)和环磷酰胺 (500mg/m2，2天)静脉输入。淋巴细胞预处理后3天内静脉灌注CAR-T细胞。
④CAR-T细胞制备：首先采集患者外周血单个核细胞，并用抗CD3/CD28抗体包被的磁珠富集和激活T细胞，然后用表达CAR的慢病毒进行转导；随后，扩增转导T细胞，洗涤并配制成悬浮液；通过无菌等质检后，以悬浮液的形式装载在输液袋中备用。
⑤CAR-T细胞输入剂量：2-5x106个CAR-T/kg体重，CAR-T细胞比例不低于 10％，CAR-T细胞中活细胞比例不低于90％，中央型记忆T细胞(CD45RO+ CCR7+)比例不低于20％。
⑥静脉输入：输液体积为10-50ml，速度为10ml/分钟。
⑦样品采集：采集患者输入CAR-T后第1、4、10、14、21和28天的外周血，通过RT-PCR法检测CAR基因的表达。
⑧病情监测与疗效评估：4周内密切注意细胞因子释放综合征的发生，8周内观察神经系统毒性。第4周、12周进行疗效评价，随访1-2年。
⑨疗效评价标准：常规体检、CT、PET-CT等，参照有关评估标准，客观疗效评分为完全缓解(CR)，部分缓解(PR)，稳定(SD)，疾病复发(CR)或疾病进展(PR)。
十二、统计学分析所有实验数据均以均数±标准差(±SD)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异显著，具有统计学意义。作图采用Graphpad prism6.0软件。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Figure ISA0000196595440000011
Figure ISA0000196595440000021
Figure ISA0000196595440000031
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Claims (1)

1.一种分泌白介素-7和趋化因子-21的嵌合抗原受体CAR-T细胞、CAR-NK细胞或CAR-干细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括BCMA抗原结合结构域的第一信号，跨膜结构域、细胞内传导结构域的第二信号，和分泌IL-7和CCL-21的第三信号，所述嵌合抗原受体的结构为anti-BCMA-scfv-CD8hinge-CD8TM-41BB-CD3ζ-IL7-CCL21。
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