CN109504660A

CN109504660A - 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN109504660A
Application number: CN201811303109.7A
Authority: CN
Inventors: 高基民; 李帆帆
Original assignee: Wenzhou Qixing Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Wenzhou Qixing Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: CN109504660B

Abstract

本申请提供了一种针对恶性肿瘤表面Nectin‑4双靶点的第四代嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞(表达IL‑7和CCL19)的构建与应用。本发明以Nectin‑4抗原的两个空间表位为靶点，构建的第四代CAR‑T用于治疗表达Nectin‑4抗原的恶性实体瘤，以解决CAR‑T在治疗实体瘤时的免疫逃逸问题；并且构建第四代CAR‑T可增强其增殖能力和持续存活能力，从而有效治疗实体瘤，并为实体瘤术后复发/转移的有效防治提供新策略。

Description

一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及到针对恶性肿瘤表面Nectin-4双靶点的第四代嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞(表达IL-7和CCL19)的构建与应用。

背景技术

随着全球环境因素的不断恶化，无论发达国家或发展中国家，恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈上升趋势，恶性肿瘤已成为人类生命健康的最大危害。中国2015年约有430万人确诊癌症，280万人因癌症去世，其中大多数为实体瘤 (如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、膀胱癌等)，预计到2020年，中国每年将有550万新发癌症病例，其中死亡人数将达400万。由于传统治疗方法的固有缺陷以及全球生物高新技术的火热发展，人们对新疗法的出现期待已久。而生物治疗作为刚崭露头角的全新治疗理念，由于其所具有的特有优点，必将为癌症患者所广泛接受。

CAR-T疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案。其通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。近几年，CAR-T疗法在治疗恶性血液肿瘤中取得的成果是有目共睹的(如针对难治性/复发性急性B淋巴母细胞白血病的Kymriah和针对难治性/复发性非何杰金氏淋巴瘤的Yescarta去年已在美国上市)，但至少50％以上的会复发率，且CAR-T细胞治疗实体瘤效果不佳，主要原因是存在缺乏合适的靶抗原、CAR-T细胞在体内持续时间短、免疫逃逸、免疫抑制肿瘤微环境等颇具挑战的问题。因此，目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造的T细胞自身安全性来讲都至关重要。

Nectin-4是属于Nectin蛋白家族的I型跨膜蛋白，其胞外区由三个Ig样结构域(V-C-C型)组成，与钙粘蛋白共同参与了粘附连接的形成和维持。Nectin-4 在人胚胎细胞普遍表达，但在成人正常组织中却几乎不表达。Nectin-4在非小细胞肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌细胞表面呈高表达，且在这些上皮源性恶性肿瘤的发生、浸润及转移过程中发挥关键性作用，可成为治疗癌症的可靠靶点。靶向Nectin-4的抗体偶联药物Enuteumabvedotin因在81例晚期膀胱癌的 I期临床试验中疗效出色(例如，铂类化疗耐药的患者中客观反应率41％，其中19例肝转移患者中的有效率为47％；甚至在32例PD-1/PD-L1抑制剂治疗无效的患者中有效率达44％)，从而在2018年3月获得了FDA突破性疗法认定，目前正在临床研究中用于治疗患有实体瘤的患者。

本发明中的第四代CAR-T细胞在CD3ζ传导的第一信号和4-1BB共刺激分子传导的第二信号的基础上，选择IL-7和CCL-19细胞因子作为第三信号。细胞因子在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中发挥重要作用。其中，IL-7在促进T细胞增殖同时可以维持 T细胞稳定，CCL-19可以募集外周T细胞及DC(树突状细胞)进入淋巴组织，进而解决CAR-T细胞在体内持续时间短、免疫抑制肿瘤微环境等颇具挑战的问题。

发明内容

本发明主要是基于CAR-T细胞治疗恶性实体瘤时存在缺乏合适的靶抗原、 CAR-T细胞在体内持续时间短、抗原逃逸等颇具挑战的难题而提供的一种针对恶性肿瘤表面Nectin-4抗原两个表位的第四代嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞 (表达IL-7和CCL19)的构建及应用。

通过基因工程技术构建plenti-Nectin4CAR1-P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19 质粒载体，然后利用高滴度，高纯度的慢病毒规模化生产工艺包装出慢病毒载体以转染T细胞，培养五天后通过流式分别检测两种CAR的表达率，并通过不同方法检测CAR-T细胞对Nectin4阳性细胞的体外杀伤作用。

本发明采用以下技术方案：

一种第四代CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合X靶标抗原的anti-X scFv1和anti-X scFv2，X为Nectin4；所述胞内信号传导区为CD8α-41BB-CD3ζ；所述细胞因子信号区为Y和Z，Y为IL7，Z为 CCL19。

进一步地，利用X靶标抗原在恶性肿瘤细胞中表达，但在正常细胞中不表达，构建的双靶点CAR-T细胞只识别表达X靶标抗原的肿瘤细胞，而不识别正常细胞。

进一步地，所述T细胞中CAR结合的抗原表位位于靶标抗原X的lgV样结构域。

根据本发明的又一发明目的，提供了一种第四代CAR-T细胞细胞的构建方法，包括如下步骤：

步骤1、构建表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒载体；

步骤2、慢病毒包装：得到表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒；

步骤3、慢病毒感染T细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增T细胞，利用步骤2得到的表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒感染T细胞，得到表达X CAR1&CAR2-Y-Z的T细胞,即X双靶点的第四代CAR-T细胞。

进一步地，所述构建CAR表达载体的过程中，包括步骤如下：

步骤1、构建表达Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19慢病毒载体：将Nectin4 CAR1和Nectin4CAR2基因序列分别克隆到Plenti载体EcoRI和MluI位点之间，所获得的载体命名为Plenti-Nectin4CAR1和Plenti-Nectin4CAR2；将 Plenti-Nectin4CAR2基因序列通过NdeI位点酶切，将IL7-CCL19融合基因克隆到Plenti-Nectin4CAR2序列下游NdeI和MluI位点之间，所获得的载体命名为 Plenti-Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19；

步骤2、慢病毒包装：293T细胞培养于含10％FBS和1％青链双抗的DMEM 培养基，细胞贴壁后密度达到70％，细胞换成含10％FBS的OPTI-MEM培养基；质粒按Plenti-Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19：Plp1：Plp2：PMD2G＝18： 9：4：3比例混合后加到PBS中混匀，PEI加到等量PBS中混匀，静置5分钟后，将两者混合后静置20分钟，均匀加到293T细胞中；细胞恒温培养箱培养 48小时后，收集上清，1500rpm室温离心10min，弃细胞沉淀，上清过0.45um 滤膜，即为表达Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19的慢病毒，-80℃保存备用；

步骤3、慢病毒感染T细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增T细胞，利用步骤2得到的表达Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19慢病毒感染T细胞，得到表达Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19的T细胞。

根据本发明的另一发明目的，上述的第四代CAR-T细胞在治疗表达 Nectin4靶标抗原的恶性肿瘤中的应用。

由上述技术方案可以看出，本发明具有以下有益效果：

一.本发明涉及到的CAR-T细胞针对的靶点是恶性肿瘤细胞表面的 Nectin-4抗原，而目前针对该靶点的疗法只有作为抗体偶联药物Enuteumab vedotin获得了FDA疗法认定。

二.本发明以Nectin-4的两个抗原表位为靶点，减少了靶向“压力”治疗下形成免疫逃逸而引起恶性肿瘤复发。

三.本发明中的第四代CAR-T是将IL-7以及CCL-19基因转入CAR-T细胞，其中CCL-19可以募集外周T细胞及DC(树突状细胞)进入淋巴组织，而IL-7在促进T细胞增殖同时可以维持T细胞稳定。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是通过免疫组化检测人源性恶性肿瘤组织中Nectin4的表达情况。

图2是通过流式细胞术检测人源性恶性肿瘤细胞表面Nectin4抗原的表达情况。

其中，HT1376(人膀胱癌细胞株)，PANC/1(人胰腺癌细胞株)，HCCLM3 (人肝癌细胞株)，MB453、MB231、MCF7(人乳腺癌细胞株)。

图3是三种CAR的示意图。

其中，a.Plenti-Nectin4CAR1-IL7-CCL19重组质粒b.Plenti-Nectin4 CAR2-IL7-CCL19重组质粒c.Plenti-Nectin4CAR1-P2A-Nectin4 CAR2-IL7-CCL19重组质粒。

图4是利用第三代慢病毒包装体系制备CAR病毒颗粒(滴度为 5x10e8TU/ml)，以MOI＝40感染人原代T细胞，流式细胞术检测Nectin4CAR 在T细胞膜上的表达情况。

图5是通过RTCA(实时无细胞标记分析技术)体外验证E:T＝20：1条件下第四代CAR-T细胞对Nectin4阳性的人膀胱癌细胞HT1376的杀伤作用，以未转导病毒的T细胞和CD19CAR-T为对照,比较Nectin4CAR1-IL7-CCL19、 Nectin4CAR2-IL7-CCL19、Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19三种第四代CAR-T 的体外杀伤效果。

图6是通过荧光素酶法体外验证不同效靶比条件下Nectin4 CAR1-IL7-CCL19、Nectin4CAR2-IL7-CCL19、Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19 这三种第四代CAR-T细胞对Nectin4阳性并通过慢病毒转染使其表达荧光素酶的人膀胱癌细胞HT1376的杀伤作用。

图7是构建Plenti-Nectin4CAR1和Plenti-Nectin4CAR2重组质粒的相关电泳图。

其中，a.pUC57-Nectin4CAR1-Amp和pUC57-Nectin4CAR2-Amp重组质粒经EcoRI-HF和MluI-HF限制性内切酶双酶切分别得目的条带1458bp、1464bp. b.Plenti vector经EcoRI-HF和MluI-HF限制性内切酶双酶切得目的条带7302bp. c.Plenti-Nectin4CAR1重组质粒经AFLII-HF酶切得目的条带2033bp、3071bp、 3656bp，Plenti-Nectin4CAR2重组质粒经AFLII-HF酶切得目的条带2033bp、 3077bp、3656bp。

图8是构建Plenti-Nectin4CAR2-IL7-CCL19重组质粒的相关电泳图。

其中，a.左图为PCR扩增P2A-IL7-T2A-CCL19片段得目的条带1010bp，右图为Plenti-Nectin4CAR2重组质粒经NdeI和MluI-HF限制性内切酶双酶切得目的条带8740bp.b.Plenti-Nectin4CAR2-IL7-CCL19重组质粒经SmaI和 MluI-HF双酶切得目的条带2422bp、7298bp。

图9是构建Plenti-Nectin4CAR1-IL7-CCL19重组质粒的相关电泳图。

其中，a.左图为PCR扩增P2A-IL7-T2A-CCL19片段得目的条带973bp，右图为PCR扩增P2A-Nectin4CAR1片段得目的条带1488bp.b.重叠PCR扩增 Nectin4CAR1-IL7-CCL19片段得2442bp.c.Plenti-Nectin4CAR1-IL7-CCL19重组质粒经AFLII-HF酶切得目的条带2033bp、3656bp、4025bp。

图10是构建Plenti-Nectin4CAR1-P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19重组质粒的相关电泳图。

其中，a.左图为PCR扩增Nectin4CAR1-P2A片段得目的条带1513bp，右图为PCR扩增P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19片段得目的条带2461bp.b.重叠 PCR扩增Nectin4CAR1-P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19片段得3957bp.c. Plenti-Nectin4CAR1-P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19重组质粒经EcoRI-HF酶切得目的条带3222bp、8007bp。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

主要实验材料：

EcoRI-HF、MluI-HF、NdeI限制性内切酶(NEB公司)，无缝克隆酶(和元生物)，高保真Prime GXL STAR酶(TAKARA公司)，TransStbl3感受态细胞(全式金生物科技有限公司)，Plasmid Mini Kit I(OMEGA)， Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)，DMEM、RPMI-1640、Opti-MEM培养基、Gibco FBS(Thermo Fisher Scientific)，Sanger测序(上海桑尼生物有限公司)，Nacl、酵母粉、蛋白胨、EDTA、NaOH(上海生工生物工程股份有限公司)，引物(江苏金唯智生物科技有限公司)。

一、构建重组质粒

(1)构建Plenti-Nectin4CAR1和Plenti-Nectin4CAR2重组质粒：

Nectin4CAR1(hCD8leader-VL1-Linker-VH1-CD8hinge-CD8TM-41BB-CD3ζ) (SEQID NO.8)和Nectin4CAR2(hCD8 leader-VL2-Linker-VH2-CD8hinge-CD8TM-41BB-CD3ζ)(SEQ ID NO.9)核苷酸序列经合成优化后已添加5'UTR(EcoRI)和3'UTR(MluI)，故使用EcoRI-HF 和MluI-HF限制性内切酶双酶切以上两个合成优化的重组质粒pUC57-Amp和载体Plenti vector，反应条件为37℃3h，65℃20min，酶切体系如表7。酶切产物经过1％琼脂糖凝胶电泳获得载体片段，见图7(a)和图7(b)，然后用XYGENE 胶回收试剂盒回收Nectin4CAR1、Nectin4CAR2目的片段和Plenti载体片段(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。载体片段和目的片段通过T4克隆， 16℃16-24h，65℃10min，然后进行质粒转化(T4克隆产物在冰上放置5min后，将其转入50ul TransStbl3感受态中，冰上放置30min，42℃45s，再冰上5min，加入500ul LB，在37℃，225rpm/min摇床中活化1h，然后5000rpm/min 20℃ 离心5min，弃去上清，将剩余菌液混匀后涂板，37℃培养12-14小时)。挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用AFLII-HF 限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表7，使用1％琼脂糖凝胶观察目的片段如图7(c)，最后进行Sanger测序。

(2)构建Plenti-Nectin4CAR1-IL7-CCL19和Plenti-Nectin4CAR2-IL7-CCL19 重组质粒：

使用引物CD3ζ-P2A F、CCL19 R扩增出人工合成片段 P2A-IL7-T2A-CCL19(SEQ IDNO.10)，扩增条件为(98℃10s，60℃15s， 68℃1min)*35循环，扩增体系见表3。使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段见图8(a.左图)，获目的条带1010bp，然后用XYGENE胶回收试剂盒回收 P2A-IL7-T2A-CCL19片段(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。Plenti-Nectin4CAR2重组质粒经NdeI和MluI-HF限制性内切酶双酶切后，使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段见图8(a.右图)，获目的条带8740bp，然后用XYGENE胶回收试剂盒回收目的片段(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。 P2A-IL7-T2A-CCL19胶回收片段和Plenti-Nectin4CAR2胶回收片段通过无缝克隆连接，然后进行质粒转化，挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min， 12h-14h，质粒提取，最终用AFLII-HF限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表 7。使用1％琼脂糖凝胶电泳观察目的片段如图8(b)，最后进行Sanger测序。故构建出Plenti-Nectin4 CAR2-IL7-CCL19重组质粒。

使用引物CAR1F、P2A-CD3ζR扩增出Nectin4 CAR1-P2A片段，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃1.5min)*35循环；使用引物IL7F、CCL19R 扩增出P2A-IL7-T2A-CCL19片段，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃1min) *35循环，扩增体系见表3。使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段见图9(a.左图)和图9(a.右图)，分别获目的条带1.5kb、1kb，然后用XYGENE胶回收试剂盒回收(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。取两胶回收产物各1μl为模板，用CAR1F和CCL19R为引物，扩增目的片段Nectin4 CAR1-IL7-CCL19，扩增体系如表4所示，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃2.5min)*35cycle，使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段如图9(b)，目的条带大小为2442bp。 Nectin4 CAR1-IL7-CCL19胶回收片段和①中Plenti载体胶回收片段通过无缝克隆连接，然后进行质粒转化。挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min， 12h-14h，质粒提取，最终用AFLII-HF限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表 7，使用1％琼脂糖凝胶电泳观察目的片段如图9(c)，最后进行Sanger测序。故构建出Plenti-Nectin4 CAR1-IL7-CCL19重组质粒。

(3)构建Plenti-Nectin4CAR1-P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19重组质粒：

使用引物CAR1F、CAR1-P2A R扩增出Nectin4CAR1-P2A片段，扩增条件为(98℃10s，,60℃15s，68℃1.5min)*35循环，引物P2A-CAR2F、CCL19R 扩增出P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19片段，扩增条件为(98℃10s，60℃15s， 68℃2.5min)*35循环，扩增体系见表3。使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段见图10(a)，获目的条带1.5kb和2.5kb，然后用XYGENE胶回收试剂盒分别回收目的片段(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。取两胶回收产物各1μl 为模板，用CAR1F和CCL19R为引物，扩增目的片段Nectin4CAR1-P2A-Nectin4 CAR2-IL7-CCL19，扩增体系如表4所示，扩增条件为(98℃10s，60℃15s， 68℃4min)*35cycle，使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段如图10(b)，目的条带大小为3,957。Nectin4CAR1-P2A-Nectin4CAR2-IL7-CCL19胶回收片段和①中 Plenti载体胶回收片段通过无缝克隆连接，然后进行质粒转化。挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用AFLII-HF限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表7，使用1％琼脂糖凝胶电泳观察目的片段如图10(c)，最后进行Sanger测序。

表1.引物序列

SEQ ID NO.11氨基酸序列来自WO 2017/042210Al，SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列来自ENFORTUMAB VEDOTIN(CAS:1346452-25-2)，SEQ ID NO. 13氨基酸序列源自人源性IL7和CCL19序列，核苷酸序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成，最终以质粒干粉形式保存。

表2.胶回收

表3.PCR体系

表4.重叠PCR体系

表5.T4克隆体系

表6.无缝克隆体系

表7.限制性酶切体系

二、利用Plenti载体质粒及辅助质粒转导293T细胞以包装慢病毒，并将包装出的慢病毒转染Jurkat Cell以计算病毒滴度

(1)293T细胞培养于含10％FBS和1％青链双抗的DMEM培养基，细胞贴壁后密度达到70％，准备含10％FBS的OPTI-DMEM全培于37℃ 培养箱中复温，吸弃293T细胞中的DMEM原培养基，将OPTI-DMEM沿皿壁加入到293T细胞；

(2)用1.5ml PBS重悬60ugPEI，1.5ml PBS重悬总质量为20ug的Plenti 载体质粒及辅助质粒；质粒按Plenti-Nectin4CAR1&CAR2-IL7-CCL19：Plp1： Plp2：PMD2G＝18：9：4：3比例混合；

(3)室温静置5min，将PBS-PEI混合液加至PBS-DNA混合液中，室温静置20min；

(4)准备OPTI-DMEM全培于37℃培养箱中复温，吸弃293T细胞中的DMEM原培养基，将OPTI-DMEM沿皿壁加入到293T细胞；

(5)将PEI-DNA-PBS混合液加至培养皿中，37℃培养48h；

(6)收集上清液中的慢病毒于50ml离心管；

(7)1500rpm离心5min去除细胞碎片，再用针筒通过0.45um过滤器过滤后，3000×g离心12-14h，4℃以浓缩病毒；

(8)吸弃上清，以1:200-1:400加入Vivo全培或AIM-V全培(最好加 1％HEPES)，重悬病毒；

(9)将病毒分装于1.5ml Ep管中，保存于-80℃，避免反复冻融(冻融使滴度降低一个数量级)，剩少许病毒用于下步的病毒滴度检测实验；

(10)jurkat细胞1500rpm离心5min后，弃上清，1ml 1640培养基重悬，计数；

(11)于96孔板中加入0.5x106jurkat细胞，以1:50、1:500、1:1000、1:2000 等梯度比例加入病毒，再补充培养基至每孔总体积为200ul；

(12)每孔加入0.1ul PolybreneB蛋白促转导(0.1ul/200ul体系)；

(13)将96孔板经1200g，90min，32℃离心，离心后，于37℃培养箱孵育4h；

(14)将96孔板各孔的jurkat细胞悬液吹打混匀后转至1.5mlEp管中， 1500rpm离心5min后，弃上清，用1ml 1640全培重悬后转至24孔板中扩大培养48h，37℃。

三、密度梯度离心法分离健康人的外周血单个核细胞(PBMC)，慢病毒转染T细胞并检测T细胞表面CAR表达情况

(1)取健康人外周血10ml至EDTA-Na2抗凝管，与DPBS按照1:1 的比例混匀；

(2)取四只15ml无菌离心管，分别加入5ml Ficoll分离液，将外周血与DPBS的混合液缓慢加至Ficoll分离液面上，注意不要破坏液面；

(3)水平离心800g，20min，25℃，加减速度均调到“0”；

(4)离心后用巴氏吸管将离心管中的白色絮状层即PBMC层吸出，置于新的无菌离心管中，加入PBS，将PBMC离心洗两遍；

(5)1500rpm/min，5min水平离心，弃掉上清,加入1ml Buffer1(DPBS 含5％FBS)重悬计数PBMC；

(6)用流式细胞术确定PBMC中CD3阳性细胞的比例。在细胞悬液中以CD3/CD28dynabeads:CD3阳性细胞＝3:1的比例加入CD3/CD28 beads(106个CD3阳性细胞加30ulbeads)，4℃以1rpm速度旋转摇晃 30min使磁株与细胞充分接触结合；

(7)30分钟以后，在试管中加足够(大于1ml)Buffer1，然后把试管放于磁力架上左右旋转1～2分钟，吸弃上清；

(8)配制Vivo完全培养基：Vivo空培+5％FBS+1％HEPES+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸+1:30谷氨酰胺+1:10000IL-2+1:2000IL-7+1:2000 IL-15，并用Vivo全培重悬细胞与磁珠，计数；

(9)加培养基使CD3阳性细胞浓度在0.5-1x106/ml之间。铺板细胞浓度为0.5～1.0×106/ml，置于37℃培养箱培养；

(10)T细胞培养24-36h，5％CO2，37℃；

(11)在24-36h内，以MOI值＝5、20、40、80转导CAR慢病毒载体， MOI(病毒感染复数)＝[病毒滴度x病毒体积(ml)]/细胞数；

(12)1200xg，90min，4℃离心后，在37℃培养箱孵育至96孔板长满细胞后转至24孔板中，1,3,5日计数监测细胞生长状况，绘其生长曲线，5-7 天时测CAR转导率。结果如图4所示。

四、RTCA法检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用

(1)E-Plate 16准备:在E-Plate 16的孔中加入50μl培养基，将E-Plate 16放到RTCA Station上，开始检测基线(Background)，确定所选择的孔接触正常，所有孔的CellIndex低于0.063；

(2)取出E-Plate 16，在孔中加入100μl混合均匀的HT1376人膀胱癌细胞悬液，使每孔中细胞数目为10000cells/50μl，将E-Plate 16置于超净台中室温放置30min后放置培养箱中的RTCA Station上，过夜检测细胞增殖曲线；

(3)过夜后取出E-Plate 16，置于超净台中，将CAR-T细胞及对照细胞分别按照E:T＝20:1加入各孔中；

(4)设置Mock细胞组，T细胞的数目与上述(3)中CAR-T细胞数相同；

(5)同时设置两个对照，阴性对照为HT1376细胞在培养基中培养；阳性对照为在培养基加入2.5％的Triton-X 100，两者均不加Mock细胞或CAR-T细胞，作为细胞杀伤的最小和最大化背景值；

(6)将E-Plate 16放到RTCA Station上培养48h后，观察曲线变化，结果如图5所示。

五、通过荧光素酶法检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用

(1)培养Nectin4-Luc-HT1376细胞至对数生长状态，取一定细胞数离心沉淀后计数：

(2)96孔平底不透明白板中加入10⁴个Nectin4-Luc-HT1376细胞，培养基补充至100uL；培养4-6小时使细胞贴壁生长：

(3)Nectin4CAR1-IL7-CCL19、Nectin4CAR2-IL7-CCL19、Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19三种第四代CAR-T细胞与Nectin4-Luc-HT1376细胞数比例设定为5:1、10:1、20:1和40:1，将相应的CAR-T细胞加入每孔混合培养：

(4)设置Mock细胞组，T细胞的数目与上述(3)中CAR-T细胞数相同：

(5)同时设置两个对照，阴性对照为Nectin4-Luc-HT1376细胞在培养基中培养；阳性对照为在培养基加入2.5％的Triton-X 100，两者均不加 Mock细胞或CAR-T细胞，作为细胞杀伤的最小和最大化背景值，即 Kmin和Kmax；

(6)培养12小时后，96孔板以1500rpm速度离心5min，弃掉上清，用培养基洗一次后重悬细胞；

(7)每孔加入0.5mM的D-荧光素，避光静置10min后，在酶标仪用化学发光模式(Luminometric Measurement)检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms；

(8)统计各孔的荧光强度值K，比较CAR-T与Mock细胞对 Nectin4-Luc-HT1376细胞的杀伤效率％，计算公式为：杀伤效率％＝(Kmin-K)/(Kmin-Kmax)x100％，结果如图6所示。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 温州启星生物技术有限公司

<120> 一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atacgacgct ttacatatgc aggccctgcc tcctaggggc agcggcgcca ccaact 56

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttgtttaaac acgcgttcag gagctcctcc tcttcatctt a 41

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gagctagccc cggggaattc gccaccatgg ctttacccgt tacagccc 48

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tcgccagcct gcttgagcag gctgaagttg gtggctccgg agccacgagg gggtaaagct 60

tgcatgtgt 69

<210> 5

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctcaagcagg ctggcgatgt ggaagagaac cccggcccca tggctttacc cgttaccgct 60

ttat 64

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ggcagcggcg ccaccaact 19

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

agttggtggc gccgctgcca cgagggggta aagcttgca 39

<210> 8

<211> 1464

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gaattcgcca ccatggcttt acccgttaca gccctcttat tacctctggc tttattatta 60

catgctgctc gtcctcaagt tcaactgaaa caatccggcc ccggactggt gcagcctagc 120

caatctttaa gcatcacttg tacagtgtcc ggcttctctt taacaaacta tggagtgcac 180

tgggtcagac agagccccgg aaagggttta gagtggctgg gcgtcatttg gtccggcgga 240

agcaccgact ataatgccgc tttcatctct cgtctgtcca ttagcaagga caccagcaag 300

tcccaagttt tcttcaagat gaactcttta caagctgatg ataccgccat ctactactgt 360

gctcgtgagc tgattcacgc catggataac tggggccaag gtacctccgt cacagtgagc 420

agcggaggag gcggatccgg aggcggcggc tccggcggcg gcggcagcga tattcaaatg 480

acacagagcc ccgcttcttt aagcgtgtcc gtgggcgaga cagtgaccat cacttgtcgt 540

gccagcgaga atatctactc caatctggct tggtatcagc agaagcaagg caactcccct 600

cagctgctgg tgttcgccgc tacaaatctg gccgatggcg tgcctagcag attcagcgga 660

agcggatccg gaacacagta ctctttaaag atcaattctt tacagagcga agacttcggc 720

acctactatt gccagcactt ttggggcacc cccaccttcg gaggaggcac caaactggag 780

atcaagacaa ccacccccgc ccctagaccc cccacacccg ctcctaccat cgccagccag 840

cctctgtctt taaggcccga agcttgtagg cccgctgctg gaggagctgt gcacacaagg 900

ggcctcgact tcgcttgtga catctacatc tgggcccctc tggccggaac atgcggagtg 960

ttattactgt ccctcgtgat taccctctac tgcaagaggg gtcgtaagaa gctgctgtac 1020

atcttcaagc agcccttcat gaggcccgtg cagactaccc aagaagaaga cggatgctct 1080

tgtcgtttcc ccgaagagga ggagggaggc tgcgagctga gagtcaagtt ttctcgttcc 1140

gccgatgccc ccgcctatca gcaaggtcaa aaccagctgt acaacgagct gaatttaggt 1200

cgtagggagg agtacgacgt gctggataaa aggaggggtc gtgaccccga aatgggcgga 1260

aaaccccgta ggaaaaatcc ccaagaaggt ttatacaatg agctgcagaa ggataagatg 1320

gccgaggcct atagcgagat cggcatgaag ggcgagagga gaagaggaaa gggccacgac 1380

ggactgtatc aaggtttaag caccgccacc aaagacacat acgacgcttt acacatgcaa 1440

gctttacccc ctcgttgaac gcgt 1464

<210> 9

<211> 1470

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gaattcgcca ccatggcttt acccgttacc gctttattac tgcctctggc tttactgctc 60

cacgctgcca gacccgaagt gcagctggtg gaaagcggcg gcggactcgt ccagcccggt 120

ggctctttaa gactgagctg cgccgccagc ggcttcacct tcagctccta caacatgaac 180

tgggtgagac aagctcccgg aaaaggttta gagtgggtga gctacatttc ctcctcttcc 240

tccaccatct attacgccga cagcgtgaaa ggtcgtttca ccatctctcg tgacaatgcc 300

aaaaactctt tatctttaca gatgaactct ctgagagacg aggataccgc cgtgtactac 360

tgtgccagag cctactatta cggcatggac gtgtggggcc aaggtacaac cgtcacagtg 420

agctccggag gaggaggatc tggtggagga ggcagcggag gtggaggaag cgatatccag 480

atgacacagt cccctagctc cgtgtccgcc agcgtgggag atcgtgtcac aattacatgt 540

cgtgcctccc aaggtatcag cggatggctg gcttggtacc agcagaaacc cggtaaggcc 600

cccaaatttc tgatctacgc cgccagcaca ctgcaatccg gcgtgccttc tcgttttagc 660

ggcagcggta gcggcaccga ttttacttta accatctcct ccctccaacc cgaggatttc 720

gccacctact actgccagca agctaacagc tttcccccta cattcggcgg cggcaccaag 780

gtggagatca agaccaccac ccccgctcct agacccccta cccccgctcc cacaatcgcc 840

agccaacctt tatccctcag acccgaagct tgcagacccg ctgccggagg agccgtgcac 900

actcgtggcc tcgatttcgc ttgtgacatc tatatctggg cccctctggc tggcacatgc 960

ggagtgctgc tcctctcttt agtgattact ttatactgca agagaggtcg taagaagctg 1020

ctctatattt ttaagcagcc cttcatgagg cccgtgcaga caacccaaga agaggacggc 1080

tgctcttgtc gtttccccga ggaagaggaa ggcggatgcg agctgagggt gaaattttct 1140

cgttccgccg acgcccccgc ctaccagcaa ggtcaaaacc agctgtacaa cgagctgaat 1200

ttaggcagaa gggaggagta cgacgtgctc gacaagagga ggggaaggga tcccgagatg 1260

ggcggcaagc ctaggaggaa gaatccccaa gaaggcctct acaacgagct ccagaaggat 1320

aagatggccg aagcctacag cgagatcggc atgaagggcg agaggagaag gggcaagggc 1380

cacgatggtt tatatcaagg tttatccaca gccaccaagg acacatacga cgctttacat 1440

atgcaagctc tgcctcctcg ttgaacgcgt 1470

<210> 10

<211> 957

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ggcagcggcg ccaccaactt ttctttactg aagcaagccg gtgacgtgga ggagaacccc 60

ggccccatgt tccacgtgtc cttcagatac atcttcggtt taccccctct cattttagtg 120

ctgctgcccg ttgccagcag cgactgcgac atcgaaggca aagacggcaa gcagtatgaa 180

agcgtgctga tggtgtccat cgaccagctg ctcgactcca tgaaggagat cggcagcaac 240

tgtttaaaca acgaattcaa cttcttcaag aggcacatct gtgacgccaa caaggagggc 300

atgtttttat tcagagccgc tcgtaagctg aggcagtttt taaaaatgaa ctccaccggc 360

gacttcgatt tacatctgct gaaggtgtcc gagggcacca ccattttact gaattgcacc 420

ggccaagtta agggaagaaa gcccgctgct ttaggcgaag cccagcccac aaagtcttta 480

gaggagaaca aatctttaaa ggagcagaag aagctgaacg acctctgctt tttaaaaagg 540

ctgctgcaag aaatcaagac atgctggaac aagattttaa tgggcaccaa agaacacggc 600

tccggcgaag gcagaggctc tttactgact tgtggagacg tggaagagaa ccccggtccc 660

atggctctgc tgctcgcttt atctttactg gtgctgtgga caagccccgc ccctacttta 720

agcggaacca acgacgccga ggactgctgt ttaagcgtga cccaaaagcc catccccggt 780

tacatcgtga ggaactttca ctacttatta atcaaggatg gctgtcgtgt gcccgctgtg 840

gtgttcacca ctttaagagg cagacagctg tgcgctcctc ccgaccagcc ttgggtggag 900

agaatcatcc agaggctgca gaggaccagc gctaagatga agaggaggag ctcctga 957

<210> 11

<211> 481

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

35 40 45

Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

85 90 95

Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala

100 105 110

Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Ile His Ala Met Asp Asn Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

145 150 155 160

Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg

165 170 175

Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln

180 185 190

Gly Asn Ser Pro Gln Leu Leu Val Phe Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp

195 200 205

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser

210 215 220

Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

245 250 255

Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

260 265 270

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

275 280 285

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

290 295 300

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

305 310 315 320

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

325 330 335

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

340 345 350

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

355 360 365

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg

<210> 12

<211> 483

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

85 90 95

Lys Asn Ser Leu Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

180 185 190

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln

195 200 205

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

210 215 220

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

245 250 255

Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

275 280 285

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

290 295 300

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

305 310 315 320

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

325 330 335

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

340 345 350

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

355 360 365

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

370 375 380

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

385 390 395 400

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

405 410 415

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

420 425 430

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

435 440 445

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

450 455 460

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

465 470 475 480

Pro Pro Arg

<210> 13

<211> 318

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe

20 25 30

Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp

35 40 45

Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met

50 55 60

Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn

65 70 75 80

Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala

85 90 95

Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln

100 105 110

Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys

115 120 125

Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys

130 135 140

Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu

145 150 155 160

Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys

165 170 175

Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile

180 185 190

Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu

195 200 205

Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu

210 215 220

Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu

225 230 235 240

Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys

245 250 255

Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys

260 265 270

Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg

275 280 285

Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln

290 295 300

Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser

305 310 315

Claims

1.一种第四代CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，其特征在于：

所述胞膜外抗原结合区为用于结合X靶标抗原的anti-X scFv1和anti-X scFv2，X为Nectin4；

所述胞内信号传导区为CD8α-41BB-CD3ζ；

所述细胞因子信号区为Y和Z，Y为IL7，Z为CCL19。

2.根据权利要求1所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于：利用X靶标抗原在恶性肿瘤细胞中表达，但在正常细胞中不表达，构建的双靶点CAR-T细胞只识别表达X靶标抗原的肿瘤细胞，而不识别正常细胞。

3.根据权利要求1所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于：所述T细胞中CAR结合的抗原表位位于靶标抗原X的lgV样结构域。

4.权利要求1-3任一权利要求所述的第四代CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1、构建表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒载体；

步骤2、慢病毒包装：得到表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒；

5.根据权利要求所4述的CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：所述构建表达X CAR1&CAR2-Y-Z慢病毒载体的过程中，包括步骤如下：

步骤1、构建表达Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19慢病毒载体：将Nectin4 CAR1和Nectin4 CAR2基因序列分别克隆到Plenti载体EcoRI和MluI位点之间，所获得的载体命名为Plenti-Nectin4 CAR1和Plenti-Nectin4 CAR2；将Plenti-Nectin4 CAR2基因序列通过NdeI位点酶切，将IL7-CCL19融合基因克隆到Plenti-Nectin4 CAR2序列下游NdeI和MluI位点之间，所获得的载体命名为Plenti-Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19；

步骤2、慢病毒包装：293T细胞培养于含10％FBS和1％青链双抗的DMEM培养基，细胞贴壁后密度达到70％，细胞换成含10％FBS的OPTI-MEM培养基；质粒按Plenti-Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19：Plp1：Plp2：PMD2G＝18：9：4：3比例混合后加到PBS中混匀，PEI加到等量PBS中混匀，静置5分钟后，将两者混合后静置20分钟，均匀加到293T细胞中；细胞恒温培养箱培养48小时后，收集上清，1500rpm室温离心10min，弃细胞沉淀，上清过0.45um滤膜，即为表达Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19的慢病毒，-80℃保存备用；

步骤3、慢病毒感染T细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增T细胞，利用步骤2得到的表达Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19慢病毒感染T细胞，得到表达Nectin4 CAR1&CAR2-IL7-CCL19的T细胞。

6.权利要求1-3任一权利要求所述的第四代CAR-T细胞在治疗表达Nectin4靶标抗原的恶性肿瘤中的应用。