CN105518143A - 融合蛋白分子和它的使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了融合分子的复合物，包含一个细胞因子部分和一个靶点导向部分。细胞因子部分包含一个或是多个细胞因子。靶点导向部分包含一个或是多个配体。此配体是能够识别例如位于细胞和病毒颗粒等靶点上受体的多肽、蛋白或小分子。靶点导向部分将融合分子导向靶点，从而使细胞因子部分在靶点部位发挥其功能，因此该过程可增强细胞因子的活性。也提供了所述复合物治疗疾病的相关用途，例如包括但不仅限于癌症及源于病毒性感染引发的疾病等。

Description

融合蛋白分子和它的使用方法
本发明要求于2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/802,169的优先权。本发明也要求于2012年6月4日提交的美国临时申请No.61/655,428的优先权，现已放弃。这两个申请均通过整体引用合并入本申请中。
技术领域
本发明涉及包含细胞因子部分和靶子导向部分的融合分子。细胞因子部分包含一个或多个细胞因子。靶子导向部分包含一个或多个配体。每个配体是能够识别靶子(包括但不局限于，细胞或病毒颗粒)表面受体的小肽、蛋白、或小分子。
背景技术
细胞因子，例如淋巴因子、趋化因子和生长因子，是由包括淋巴细胞、单核细胞在内的多种类型的细胞产生，在人类生理和疾病控制中有广泛的作用。这几种细胞因子在临床上证明能够有效的治疗多种疾病。
例如，白细胞介素-2(IL-2)，作为一种细胞因子已经被美国食品及药物管理局(FDA)以及世界上其它机构批准，在临床上可用于治疗转移性肾癌和恶性转移性黑色素瘤。然而，目前市场上的IL-2的治疗窗由于存在副作用而有着一定的局限性，比如毛细血管渗漏综合症(CLS)。IL-2的作用机制是通过促进整个生理循环中T细胞的增殖而发挥作用，而不是特异性的针对原发性和转移性肿瘤。因此，如果IL-2能够靶向作用于肿瘤细胞，那么其治疗窗会增加。
美国专利USRE33653E描述了一个IL-2突变体的复合物和使用方法。US4935356A描述了在大肠杆菌中表达和纯化IL-2的方法。US8580267B2公布了一种用化疗药物结合免疫细胞因子治疗肿瘤的方法，即由细胞因子(例如IL-2)、与肿瘤新生血管抗原结合的抗体(例如腱糖蛋白tenascin-C)、联合治疗的化疗药物(例如替莫唑胺)的联合治疗。EP0229998B1描述了一种融合蛋白，该蛋白至少包含IL-2的一部分(与IL-2的C端和N端的氨基酸序列基本一致)，但其不具有生物学活性，同时不包含IL-2至少前100个氨基酸。
干扰素蛋白α(IFN-α)由白细胞产生，主要参与病毒感染引起的先天性免疫应答。IFN-α蛋白包含13个亚型：IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。编码这些IFN-α分子的基因成簇排列于第9号染色体上。美国专利US7611700B2描述了具有蛋白酶抗性的修饰后的IFN-α多肽。
LeeJH等人描述了“KISS1基因，这是一种新型的抑制人类恶性黑色素瘤转移的基因”(LeeJH，etal.JournaloftheNationalCancerInstitute，Vol.88(23)：1731-1737(1996))。据报道，KISS1编码至少4个功能性的多肽产物：Kisspeptin-54(又名转移抑制素)、Kisspeptin-14、Kisspeptin-13、Kisspeptin-10，分别含有54、14、13、10个氨基酸(KotaniMetal.J.Biol.Chem.Vol.276(37)：34631-34636(2001)；OhtakiT.etal.，NatureVol.411(6837)：613-671(2001))。四种产物均含有相同的10个氨基酸，C端均为酰胺化的氨基酸，但N端长度不同。它们是KISS1R(一个G蛋白偶联受体)的功能性配体(US6699965B1)。KISS1/KISS1R与包括青春期启动在内的生殖系统的发育相关(PopaSMetal.，Annu.Rev.Physiol.Vol70：213-38(2008))。据报道，Kisspeptins能够抑制肿瘤细胞的转移(LeeJHandWelchDR，Int.J.Cancer.Vol.71(6)：1035-1044(1997))。转移抑制素衍生物还具有卓越的生物学活性(例如：癌细胞转移抑制活性、癌细胞生长抑制活性等)(详情见US6800611B2，US7625869B2，US8361968B2，US8592379B2)。US7112662B2描述了一个抗转移抑制素抗体及其使用方法，从而转移抑制素及其衍生物可被高度灵敏性地特异量化。
融合蛋白或嵌合蛋白(由不同来源的几个部分组成)是由两个或多个编码单独蛋白的基因整合编码而产生。美国专利US8076288B2记述了融合多肽有降低血糖的活性。US7569384B2公布了白蛋白融合蛋白。
发明内容
本发明涉及一个融合分子的复合物，包含一个细胞因子部分和一个靶子导向部分。细胞因子部分由一个或多个细胞因子组成。靶子导向部分由一个或多个配体组成。每个配体为能够识别靶标(包括但不局限于细胞或病毒颗粒等)上受体的多肽、蛋白或者的小分子。靶子导向部分把融合分子带到靶标上，因此使细胞因子在靶位上发挥作用。从而细胞因子的活性能够得到加强。
在本发明的一种实施方式中，细胞因子是IL-2的一部分或者一个突变体。或者趋化因子可以是GM-CSF、TNF-alpha、IFN-alpha、IFN-beta或IFN-gamma。
在某些实施例中，有的融合蛋白的配体部分至少包含一个Kisspeptin的片段或突变体。该部分把融合分子带到靶子免疫细胞上，细胞因子部分刺激免疫细胞的增殖，从而增强了对靶子的免疫应答。
在另一些实施例中，有的融合分子的配体部分至少包含一个内皮素-1、内皮素-2或内皮素-3的片段或突变体，细胞因子部分包含至少一个IL-2，或TNF-alpha，或IFN-alpha，或INF-beta，或INF-gamma的片段或突变体。
本发明还公布了用细胞因子-配体融合蛋白治疗人类疾病的方法。在某些方面，引起转移性肾癌或转移性黑色素瘤等人类癌症的肿瘤细胞是靶点。另外，病毒感染的细胞及病毒颗粒也是靶点。细胞因子-配体融合蛋白用来治疗某种或者多种由病毒感染引起的疾病。
在接下来的细述及附件的声明中会进一步揭示本发明的其他方面和优点。上述所提及的实施例的一个、多个或所有特点可能会结合到本发明中形成新的内容。
附图说明
图1是本发明中一个细胞因子-配体融合分子案例的原理图。
具体实施方式
本发明涉及包含一个功能部分和靶点导向部分的融合分子。功能部分包含一个或多个细胞因子。靶点导向部分包含一个或多个表达或附着在靶细胞上的受体所对应的配体。配体是一个多肽、蛋白或者小分子。靶点包括肿瘤细胞、病毒感染的细胞或病毒颗粒等。配体-细胞因子融合蛋白增强了免疫应答。靶点导向部分使融合蛋白在靶细胞位点处聚集，功能部分在靶位点处发挥作用，从而提高了融合蛋白抗靶细胞的活性。
在本发明的一种实施方式中，细胞因子至少是以下白介素的一部分或者是白介素突变体：IL2、IL15、IL4、IL13、IL7、IL9、IL21、IL3、IL5、GM-CSF、IL6、IL11、IL27、IL30、IL31(+nonILOSM、LIF、CNTFCTF1)、IL12、IL23、IL27、IL35、IL14、IL16、IL32、IL34、IL10/IL22、IL19、IL20、IL24、IL26、IL28A、IL28B、IL29、IL1A、IL1B/IL1F2、1Ra/IL1F3、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1F10、IL1F11、IL1G、IL17A、IL17B和IL25。
在另一种实施方式中，上述IL-2至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO:1).
在另一种实施方式中，细胞因子包含至少一个TNF家族的因子，上述TNF家族包括TNFA/TNFSF2、Lymphotoxin(TNFB/LTA,TNFC/LTB)、TNFSF4、TNFSF5/CD40LG、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF13B及EDA。
在另一种实施方式中，上述TNFA包含至少下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQIDNO:3).
在另一种实施方式中，细胞因子至少包含干扰素的一部分或干扰素突变体，上述干扰素包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21、IFNB1、IFNK、IFNW1和IFNG。
在本发明的另一种实施方式中，上述IFNA1至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLGCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQIDNO:5).
在另一种实施方式中，上述IFNA2至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQIDNO:6).
在另一种实施方式中，上述IFNB1至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQIDNO:7).
在另一种实施方式中，上述IFNG至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQIDNO:8).
在另一种实施方式中，上述内皮素-3至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突变体。CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(SEQIDNO:9)
在另一种实施方式中，细胞因子至少包含以下一个趋化因子：CCL1、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1/KC、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8/IL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CX3CL1、XCL1和XCL2。
在另一种实施方式中，有的细胞因子至少包含以下一个趋化因子：KITLG、CSF和SPP1。
在另一种实施方式中，趋化因子为GM-CSF，或TNF-alpha，或IFN-alpha，或FN-beta，或IFN-gamma。
在另一种实施方式中，有的细胞因子至少包含生长因子的一个片段或者突变体，生长因子选自包含肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌移动因子、骨形态发生蛋白(BMPs)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素(EPO)、纤维母细胞生长因子(FGF)、神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促移行因子；肌生成抑制蛋白(GDF-8、神经生长因子(NGF)和其他神经营养因子、血小板源生长因子(PDGF)、促血小板生成素(TPO)、转变生长因子α(TGF-α)、转变生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt信号通路、胎盘生长因子(PlGF)。
在另一种实施方式中，有的配体部分至少包含内皮素-1、内皮素-2或内皮素-3的一部分或其突变体，细胞因子部分至少包含IL-2，或TNF-alpha，或IFN-alpha，或INF-beta，或INF-gamma的一部分或其突变体。
在另一种实施方式中，有的配体包含能结合一个或多个受体的肽段或蛋白的一部分或其突变体，这些受体包括：在肝炎病毒(HAV，或HBV，或HCV)感染之前或之后，表达在肝细胞表面的受体、乙型肝炎病毒表面抗原(HBVsAg)、人体免疫缺损病毒gp120(HIV)、人体免疫缺损病毒gp41(HIV)、或人类流感病毒的血凝素、SARS冠状病毒膜粒蛋白E2、SARS冠状病毒纤突蛋白、SARS冠状病毒血球凝集素酯酶糖蛋白。
在另一种实施方式中，配体包含能结合下列一个或多个受体的肽段或蛋白：BMPR1B(骨形态生成蛋白IB型受体)、CDH3(钙粘素-3，CDHP)、CDH19(钙粘素-19)、CDH2(神经性钙粘素，NCAD)、SLC7A5(LAT1)、STEAP1(六次跨膜的上皮前列腺抗原)、MUC16(CA125)、KISS1R(GPR54)、CLDN3(闭合蛋白-3)、CLDN4(闭合蛋白-4)、CLDN18(闭合蛋白-18)、MPF(MPF,MSLN,SMR，巨噬细胞促进因子，间皮素)、SLC34A2(NAPI-3B,NPTIIb,Napi3b溶质运载蛋白家族34(磷酸钠)，第二个成员：II型钠依赖的磷酸转运蛋白3b)、IL13RA2(IL13受体α2)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、Se2ma5b(FLJ10372,KIAA1445,Mm.42015,SEMA5B,SEMAG,脑信号蛋白5b的Hlog,sema结构域,七个血小板反应蛋白重复(1型和类1型-)，跨膜区(TM)和短胞浆区，(脑信号蛋白)5B)、TMEFF1(脑肿瘤抑癌蛋白1抗体)、PSCAhlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKENcDNA2700050C12,RIKENcDNA2700050C12基因)、ETBR(内皮素B型受体)、MSG783(RNF124,假定蛋白FLJ20315)、CACNA1A(CAV2.1)，STEAP2(PCANAP1,STAMP1,STMP,前列腺癌关联基因1，六次跨膜的前列腺上皮细胞抗原2，六次跨膜的前列腺蛋白)、TMEFF2(癌肿瘤抑癌蛋白2抗体)、TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体电位阳离子通道，M亚家族，成员4)、OR52E1(嗅觉感受器，52家族，E亚家族，成员1)、OR52E2(嗅觉感受器，52家族，E亚家族，成员2，PSGR)、CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎癌细胞衍生的生长因子)、CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/爱泼斯坦巴尔病毒受体)或Hs.73792)、CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关的受体β)，B29)、FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(包含磷酸酶锚定蛋白1a的SH2结构域)，SPAP1B，SPAP1C)、HER2、NCA、MDP、IL20Rα、Brevican、EphB2R、ASLG659、PSCA、GEDA、BAFF-R(B细胞激活因子受体，BLyS受体3，BR3)、CD22(B细胞CD22-B同型受体)、MET(met原癌基因，肝细胞生长因子受体)、CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关受体α，与Igβ蛋白共价结合在IgM分子表面形成复合物的B细胞特异性蛋白(CD79B)，转化涉及B细胞分化的信号)、CXCR5(伯基特淋巴瘤细胞受体1，被趋化因子CXCL13激活的G蛋白偶联受体，在淋巴细胞移动和体液防御过程中有功能，在HIV-2感染及艾滋病、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病的发病过程中起作用)、HLA-DOB(II类(Ia抗原)组织相容性复合体(MHC)的β亚基，能够结合肽类并将其展示在CD4+T淋巴细胞表面)、P2X5(嘌呤受体P2X配体门控离子通道5，该离子通道的开关能够被细胞外的ATP控制，可能和突触传导和神经发生相关，缺乏该离子通道会引起特发性逼尿肌不稳定的症状)、CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)、LY64(淋巴细胞抗原(RP105)，属于富亮氨酸重复家族(LRR)的I型膜蛋白，调控B细胞的激活和凋亡，其功能的丧失会增加系统性红斑狼疮的发病几率)、FcRH1(类Fc受体蛋白1，是免疫球蛋白Fc结构域的假定受体，其包含C2型类Ig结构域和ITAM结构域，在B淋巴细胞的分化过程中发挥一定的作用)、IRTA2(免疫球蛋白超家族移位受体2是一个假定的免疫受体，可能影响B细胞的发育和淋巴瘤的生成，移位引起的该受体的失控会使一些B细胞形成恶性肿瘤)和TENB2(假定的跨膜多糖蛋白，与生长因子和卵泡抑素的EGF/调蛋白家族相关)。
在一些实施方式中，有的融合蛋白中的配体部分至少包含了Kisspeptin的一部分或其突变体。Kisspeptin部分靶向目标形成融合分子，细胞因子部分在靶点激活免疫细胞的增殖，从而增强了对靶细胞的免疫反应。
在另一种实施方式中，上述配体至少包含Kisspeptin氨基酸序列(SEQIDNO:2)的一部分或其突变体。
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO:2).
在另一种实施方式中，上述细胞因子是IL2，至少包含SEQIDNO:1氨基酸序列的一部分或为其突变体，
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO:1),上述配体至少包含了Kisspeptin氨基酸序列(SEQIDNO:2)的一部分或其突变体。
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO:2).
在另一种实施方式中，上述因子TNFA至少包含
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRR
ANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQIDNO:3)氨基酸序列的一部分或其突变体，配体至少包含了Kisspeptin氨基酸序列
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO:2)的一部分或其突变体。
在另一种实施方式中，上述因子IFNA1至少包含
MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLGCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQIDNO:5)氨基酸序列的一部分或其突变体，配体至少包含了Kisspeptin氨基酸序列
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO:2)的一部分或其突变体。
在另一种实施方式中，上述因子IFNA2至少包含
MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQIDNO:6)氨基酸序列的一部分或其突变体，配体至少包含了Kisspeptin氨基酸序列
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO:2)的一部分或其突变体。
在另一种实施方式中，上述因子IFNB1至少包含
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQIDNO:7)氨基酸序列的一部分或其突变体，配体至少包含了Kisspeptin氨基酸序列
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO:2)的一部分或其突变体。
在另一种实施方式中，上述因子IFNG至少包含
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQIDNO:8)氨基酸序列的一部分或其突变体，配体至少包含了Kisspeptin氨基酸序列
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO:2)的一部分或其突变体。
在另一种实施方式中，上述因子IL2至少包含SEQIDNO:1氨基酸序列的一部分或者是其突变体，配体至少包含了内皮素-3氨基酸序列(SEQIDNO:9)的一部分或其突变体。
在本发明的一些实施方式中，本发明的靶点是肿瘤细胞。本发明中的融合蛋白的靶点导向部分包含配体的一部分或者是其突变体，该配体与在肿瘤细胞中表达的或者粘附在表面上的受体相对应。
在一个优选的实施方式中，融合分子至少包含IL-2的一部分或突变体，及Kisspeptin的一部分或突变体，或KISS1R的配体。
在另一个优选的实施方式中，融合分子至少包含IL-2的一部分或者突变体，还至少包含内皮素受体A或内皮素受体B的一部分(不局限于内皮素-1，或内皮素-2，或内皮素-3)。配体至少包含CD27，或CD70的一部分或者突变体。另一方面，本发明中，功能部分至少包含白细胞介素-2的一部分或突变体。本发明揭示了配体-细胞因子融合蛋白用于治疗人类癌症的方法。
在另一种实施方式中，靶子是病毒感染的细胞或者病毒颗粒。融合蛋白的靶子导向部分至少包含配体的一部分，该配体与表达或附着在被病毒感染细胞上的受体相对应，例如但不局限于表达在被肝病毒(HAV，或HBV，或HCV)感染的肝细胞上的受体。有的融合蛋白的靶子导向部分至少包含病毒颗粒表面抗原或衣壳蛋白的一部分或突变体，例如但不局限于乙型肝炎病毒表面抗原(HBVsAg)，或人类免疫缺损病毒(HIV)抗原gp120，或人类免疫缺损病毒(HIV)抗原gp41，或人类流感病毒血球凝集素，或SARS冠状病毒膜粒蛋白E2，或SARS冠状病毒纤突蛋白，或SARS冠状病毒血球凝集素酯酶糖蛋白。功能部分是干扰素α，或干扰素β，或干扰素γ，或白细胞介素-2。本发明还揭示了配体-细胞因子融合蛋白用于治疗人类病毒性疾病的方法。
本发明示范图解模型如图1所示，融合蛋白至少包含一个靶子导向部分和一个细胞因子部分。这些功能部分可以用多种连接部分(liner)直接融合到一起。
下面对复合物的突变体进一步讨论。
在一种实施方式中，融合分子至少包含一个靶子导向部分(一个与肿瘤细胞上受体相对应的多肽或蛋白配体)和一个细胞因子，如图1所示。
在另一种实施方式中，一个靶子导向部分融合不止一个细胞因子部分。细胞因子部分可以相同，也可以不同。靶点导向部分可以在N端，或C端，或两个细胞因子中间。
在另一种实施方式中，一个细胞因子可以融合多个靶子导向部分。靶子导向部分可以相同，也可以不同。细胞因子部分可以在N端，或C端，或在靶子导向部分中间。
在另一种实施方式中，多个靶子导向部分可以融合多个细胞因子。靶子导向部分可相同或不同。细胞因子亦可相同或不同。细胞因子部分可以在N端，或C端或在靶子导向部分之间。细胞因子部分可以相邻或者分散在靶子导向部分之间。靶子导向部分可以在一起或者分散在细胞因子之间。
细胞因子-受体配体融合后可以构入另一个部分，例如抗体，或人白蛋白或其它能够延长融合蛋白半衰期的蛋白。
本发明一方面提供了包含一个靶子导向部分和一个细胞因子部分的融合蛋白。另一方面，本发明提供了一个使用该融合蛋白治疗疾病的方法。本发明还提供了所需的装备、计量单位、药剂成分、药品和成品。
通过现在的那些熟练的技术，本发明中的几个实例的范围和精神可能实现。下面非示例内容对本发明进行了详细的描述。接下来的示例进一步解释了本发明，当然，不应该被解释为以任何方式限制其范围。
复合物成分包含功能部分和靶点导向部分
融合分子包含至少一个细胞因子部分，例如一个具有生物学活性的淋巴因子和至少一个靶点导向部分，例如与表达在靶细胞或者靶病毒颗粒表面上受体对应的多肽或蛋白配体。配体-细胞因子融合蛋白提供了一个放大的免疫反应。配体部分使融合蛋白靶向靶细胞上的靶位点，细胞因子刺激免疫细胞在靶位处增殖，从而增加了对靶细胞的免疫反应。
例如，有的靶点导向部分至少包含一个与表达在靶细胞上的受体相对应的多肽配体。靶点导向部分对靶细胞上受体的亲和力在fM至μM范围之间(包括：10fM至1pM，1pM至10pM，100pM至10nM，10nM至1μM，1μM至100μM)。在有的实例中，靶点导向部分对受体的亲和力范围大约在10-14M至10-5M之间。
在另一实施例中，有的复合物包含了KISS1基因产物的一部分或突变体(例如但不局限于Kisspeptin或转移抑制素)作为靶点导向部分，白细胞介素-2作为细胞因子部分。有的靶点导向部分包含内皮素-3的片段或突变体，细胞因子部分包含白细胞介素-2的片段或突变体。
本发明的某些方面，融合分子由本领域技术人员在多种表达系统中制备，包括但不限于，大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞，并且由本领域技术人员用多种工艺技术纯化，包括但不限于柱层析。
在另一些实施方式中，有的靶点导向部分包含一个与表达在靶细胞上的受体相对应的蛋白配体。靶点导向部分对靶细胞上受体的亲和力在fM至μM范围之间(包括：大约10fM至1pM，1pM至100pM，100pM至10nM，10nM至1μM，1μM至100μM)。在有的实例中，靶点导向部分对受体的亲和力范围大约是在10-14M至10-5M之间。
例如，有一个合成分子包含CD27(肾细胞癌上CD70的配体)的一个片段或突变体和一个白细胞介素2作为细胞因子部分。
本发明的某些方面，融合分子由本领域技术人员在多种表达系统中制备，包括但不限于，大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞，并且由本领域技术人员用多种工艺技术纯化，包括但不限于柱层析。
例如，有的靶点导向部分包含一个与表达在靶细胞上的受体相对应的小分子配体。靶点导向部分对靶细胞上受体的亲和力在fM至μM范围之间(包括：大约10fM至1pM，1pM至100pM，100pM至10nM，10nM至1μM，1μM至100μM)。在有的实例中，靶点导向部分对受体的亲和力范围大约是在10-14M至10-5M之间。
本发明的某些方面，融合分子由本领域技术人员在多种表达系统中制备，包括但不限于，大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞，并且由本领域技术人员用多种工艺技术纯化，包括但不限于柱层析。
本发明所述的复合物可以作为药物中的成分。药物成分中包含医药上能够接受的载体。有的成分用小玻璃瓶(密封的玻璃瓶)或运输设备存放。
在一些实施例中，药物成分包含一种缓冲物质，例如但不局限于：磷酸盐(如磷酸钠)，甘氨酸或双甘氨肽缓冲液，等渗性介质(如氯化钠或甘油)，用苯酚和/或间甲酚作为保护剂。在一些情况下，会加入一些等张介质(像甘露醇和山梨醇)。有的药物组分中还包含了5-150mM的氯离子。
在一些实施例中，药物成分是液体组分，融合分子的含量大约在0.001mM至15mM范围内。像苯酚或间甲苯或两者混合物的酚类组分也包含在组分内，总浓度大约在5mM至50mM范围内，视情况可加入10mM至200mM的氯离子。
在一些实施例中，药物组分的pH在2.0至10.0之间，例如：约2.0-3.0，约3.0-4.0，约4.0-5.0，约5.0-6.0，约6.0-7.0，约7.0-8.0，约8.0-9.0，约9.0-10.0。
各成分的使用方法
此处所提及的成分能够被用于治疗疾病。例如，优选的IL2-Kisspeptin融合蛋白能够治疗转移性肾癌或转移性黑色素瘤等疾病。
该成分可以单独使用或与其他有同种功效的合适的介质共同使用。例如，该成分可以结合到化学疗法或靶向化疗等其他疗法中。
该成分能通过任意适合的途径传递。成分可通过静脉注射、腹腔内注射、皮下注射、肌内注射、容器或泵设备、皮肤贴或吸入等手段传递。
有的成分每天给药一次或几天一次。例如，有的组分每两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月或每四个月给药一次。
最佳药效的给药剂量与多种因素有关，包括患者的年龄、体重、身体状况、与其他药结合使用及患病的程度。具体的剂量由那些了解细胞因子分子复合物的且有一定经验的人决定。
装备，单位剂量，成品
本发明还提供了装备、单位剂量和成品中所包含的所描述的组分。装备、单位剂量和成品中有含有有效成分的小玻璃瓶(封口玻璃瓶)。
实施例1.在哺乳动物细胞中表达IL2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IL2-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IL-2(氨基酸序列为SEQIDNO:1)的C端(desAla1andC125S)。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白用熟练使用的色谱柱纯化。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例2.在大肠杆菌中表达IL2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IL2-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IL-2(氨基酸序列为SEQIDNO:1)的C端(desAla1andC125S)。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽-α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例3.在哺乳动物细胞中表达带linker的IL2-Kisspeptin融合蛋白
T本例叙述了融合了一个linker的IL2-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IL-2(氨基酸序列为SEQIDNO:1)的C端(desAla1andC125S)。一个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例4.在大肠杆菌中表达带linker的IL2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了融合了一个linker的IL2-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IL-2(氨基酸序列为SEQIDNO:1)的C端(desAla1andC125S)。一个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例5.在哺乳动物细胞中表达TNFA-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了TNFA-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到TNFA(氨基酸序列为SEQIDNO:3)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例6.在大肠杆菌中表达TNFA-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了TNFA-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到TNFA(氨基酸序列为SEQIDNO:3)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例7.在哺乳动物细胞中表达带有linker的TNFA-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了带有一个linker的TNFA-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到TNFA(氨基酸序列为SEQIDNO:3)的C端。一个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例8.在大肠杆菌中表达带有linker的TNFA-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了带有一个linker的TNFA-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到TNFA(氨基酸序列为SEQIDNO:3)的C端。一个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例9.在哺乳动物细胞中表达IFNA1-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNA1-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNA1(氨基酸序列为SEQIDNO:5)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例10.在大肠杆菌中表达IFNA1-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNA1-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNA1(氨基酸序列为SEQIDNO:5)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例11.在哺乳动物细胞中表达带有linker的IFNA1-Kisspeptin融合蛋白
一本例叙述了IFNA1-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNA1(氨基酸序列为SEQIDNO:5)的C端。个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例12.在大肠杆菌中表达带有linker的IFNA1-Kisspeptin融合蛋白
一本例叙述了IFNA1-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNA1(氨基酸序列为SEQIDNO:5)的C端。一个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例13.在哺乳动物细胞中表达IFNA2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNA2-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNA2(氨基酸序列为SEQIDNO:6)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例14.在大肠杆菌中表达IFNA2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNA2-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNA2(氨基酸序列为SEQIDNO:6)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例15.在哺乳动物细胞中表达带有linker的IFNA2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNA2-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNA2(氨基酸序列为SEQIDNO:6)的C端。个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例16.在大肠杆菌中表达带有linker的IFNA2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNA2-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNA2(氨基酸序列为SEQIDNO:6)的C端。一个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例17.在哺乳动物细胞中表达IFNB1-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNB1-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNB1(氨基酸序列为SEQIDNO:7)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例18.在大肠杆菌中表达IFNB1-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNB1-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNB1(氨基酸序列为SEQIDNO:7)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例19.在哺乳动物细胞中表达带有linker的IFNA2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNB1-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNB1(氨基酸序列为SEQIDNO:7)的C端。个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例20.在大肠杆菌中表达带有linker的IFNA2-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNB1-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNB1(氨基酸序列为SEQIDNO:7)的C端。一个linker(例如但不局限于:GGGSGGGS(SEQIDNO:4))插入到两个部分中间。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在大肠杆菌中表达。将融合片段构建在含有受LacZ抑制因子调控的T3和T7启动子的质粒上表达。为了促进融合蛋白C端的酰胺化，一个甘氨肽α羟化单氧酶双功能酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶将融合蛋白的最后一个甘氨酸转变为酰胺基，形成了C端被酰胺化的融合蛋白。表达被IPTG诱导。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例21.在哺乳动物细胞中表达IFNG-Kisspeptin融合蛋白
本例叙述了IFNG-Kisspeptin(例如但不局限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备方法。Kisspeptin-54(氨基酸序列为SEQIDNO:2a)融合到IFNG(氨基酸序列为SEQIDNO:8)的C端。融合通过熟练的DNA克隆技术而实现，两个部分有/无linker连接的融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人胚肾细胞(HEK)293细胞表达。融合蛋白用含有CMV启动子的表达载体瞬时转染CHO或HEK293表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。在哺乳动物细胞中，SEQIDNo.2a中的最后一个甘氨酸被酰胺化，产生了C端被酰胺化修饰的融合蛋白。
实施例22.在大肠杆菌中表达IFNG-Kisspeptin融合分子
本实例描述了IFNG-Kisspeptin(比如，但不仅限于Kisspeptin-54)融合蛋白的制备。Kisspeptin-54的氨基酸序列是
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRFG(SEQIDNO:2a)融合在IFNG氨基酸序列的C末端
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQIDNO:8).这种融合分子的制备是通过成熟的DNA克隆和在大肠杆菌中表达而制备的。表达载体是在LacZ阻遏物下控制下的T3和T7来启动的。为促进融合蛋白的C末端的酰胺化，一种双功能的酶胎酰甘氨酸α酰胺化物单养酶会共表达在大肠杆菌中。这种酶能够将最后的氨基酸甘氨酸转化为氨基化合物，导致融合蛋白的C末端变为RF-amide。融合蛋白是通过IPTG来诱导表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的。
实施例23.在哺乳动物细胞中表达带linkerIFNG-Kisspeptin融合分子
本实例介绍了制备带linker的IFNG-Kisspeptin(比如，但不仅限于Kisspeptin-54)融合分子的方法。Kisspeptin-54的氨基酸序列是
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRFG(SEQIDNO:2a)融合在IFNG氨基酸的C末端
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQIDNO:8).在这两部分之间，alinker的序列但不仅限于GGGSGGGS(SEQIDNO:4)被插入。在两部分之间有或没有linker的融合分子会被通过成熟的DNA克隆技术在中国仓鼠的卵巢癌(CHO)细胞和人胚肾(HEK)293细胞中表达，融合蛋白连同包含CMV的启动子表达载体和是通过瞬时转染到中国仓鼠的卵巢癌(CHO)细胞和人胚肾(HEK)293细胞中来表达，融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的，在哺乳动物细胞中，最后的氨基酸甘氨酸在(SEQIDNo:2a)中的被转变为一个amide，导致融合蛋白的C末端是一个RF-amide。
实施例24.在大肠杆菌中表达带linkerIFNG-Kisspeptin的融合分子
这个实例描述了带linker的IFNG-Kisspeptin(比如，但不仅限于，Kisspeptin-54)融合分子的方法。Kisspeptin-54的氨基酸序列是
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRFG(SEQIDNO:2a)融合在IFNG氨基酸序列的C末端
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQIDNO:8).在这两部分之间，一个linker序列比如但不仅限于GGGSGGGS(SEQIDNO:4)被插入。这个融合分子会通过技术成熟的DNA克隆和在大肠杆菌中表达制备出来。构建在LacZ的阻遏物的控制下的包含T3和T7启动子表达载体。为促进融合蛋白的C末端的酰胺化，一个双功能的酶称为肽酰甘氨酸α酰胺化物单氧酶会在大肠杆菌中共表达。这个酶可以使最后的氨基酸甘氨酸转变为amide，导致在融合分子的C末端有一个RF-amide。融合分子用IPTG诱导表达。融合蛋白是通过技术成熟的柱层析法来纯化的，
实施例25.在哺乳动物中表达IL2-endthelin融合分子
这个实例是描述了制备IL2-endothelin(比如，但不只限于，Endothelin-3)融合分子的方法。内皮素-3的氨基酸序列是CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(SEQIDNO:9)融合在IL-2(desAla1andC125S)氨基酸序列的C末端
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO:1).这两部分之间有或没有一个linker的融合分子会通过成熟的DNA克隆在中国仓鼠卵巢癌(CHO)细胞和人胚肾(HEK)293细胞中表达。包含CMV的启动子表达载体的融合蛋白通过瞬时转染到CHO和HEK293细胞中表达。融合蛋白通过技术成熟的柱层析法来纯化。
实施例26.在大肠杆菌中表达IL2-内皮素融合分子
实例描述了准备IL2-内皮素的方法(比如但不只限于，内皮素-3)融合物。内皮素-3的氨基酸序列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(SEQIDNO:9)融合在
IL-2的C末端(desAla1andC125S)氨基酸序列是
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO:1)。融合分子会通过成熟的DNA克隆且在大肠杆菌中表达制备出来。表达载体的构建是在LacZ阻遏物的控制下包含了T3或是T7的启动子构建的。融合分子是在IPTG的诱导下表达的。融合蛋白是通过成熟的柱层析法进行纯化的。
实施例27.在哺乳动物细胞表达带linker的IL2内皮素的融合分子
本例子描述的是制备带linker的IL2内皮素融合分子(比如，但不只限于，内皮素3)的方法。内皮素3的氨基酸序列是CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(SEQIDNO:9)融合到IL2(desAla1和C125S)C末端氨基酸序列的
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO:1)。在这两部分之间，linker的序列是比如但不只限于GGGSGGGS(SEQIDNO:4)被插入。这个融合分子会通过成熟的DNA克隆，两个部分的包括或未包括linker在中国仓鼠卵巢癌细胞或是人的胚肾(HEK)293细胞表达。融合蛋白用包含CMV的启动子表达载体通过瞬间转染到CHO或HEK293中表达。融合蛋白用成熟的柱层析法来纯化。在哺乳动物的细胞，末端氨基酸G在(SEQIDNo:2a)转变为一个amide，导致在融合蛋白的C末端有RF-amide。
实施例28.在大肠杆菌中表达带linker的IL2-内皮素融合分子
这个实例描述的是制备带linker的IL2-内皮素的(比如，但不只限于，内皮素-3)融合分子的方法。内皮素-3的氨基酸序列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(SEQIDNO:9)融合到IL2的C-末端(desAla1andC125S)氨基酸序列是
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO:1)。在这两部分之间，一个linker的序列是比如但不只限于GGGSGGGS(SEQIDNO:4)被插入，这个融合分子是通过成熟的DNA克隆且在大肠杆菌中表达制备出来的。表达载体构建包含T3和T7启动子在lacZ的阻遏物下调控的。为促进在融合蛋白在C末端的酰胺化，一个功能性的被称为酰肽甘氨酸的α的酰胺化物单养酶会在大肠杆菌中共表达，这个酶能够使最后的氨基酸甘氨酸转变为氨基化合物，结果导致融合蛋白的C末端为RF-amide。融合分子用TPTG诱导表达，融合蛋白用娴熟的柱层析法来纯化。
实施例29.IL2和IL2-Kisspeptin融合的活性
IL2-Kisspeptin(例如但不只限于，Kisspeptin-54)克隆到pCDNA3.1，且瞬时转染到HEK293细胞中，用可区分的标签亲和纯化同时在保养的CTLL-2细胞中检测IL2的活性。CTLL-2在DMEM培养基中培养，同时补充热灭活的胎牛血清，然后连续稀释IL2,IL2-Kisspeptin或Kisspeptin。CTLL-2细胞数目用MTT比色法去测量。
表1.用MTT比色法衡量IL2的活性
蛋白 IL2(aldesleukin) IL2-Kisspeptin-54 Kisspeptin-54
EC50(pM) 31.24+1.463 32.73+1.942 N/A*
*:N/A:Noactivitydetected
实施例30.IL2-Kisspeptin的融合蛋白的效价且Kisspeptin激活KISS1R
CHO-K1/KISS1R稳定细胞系和亲本的CHO-K1细胞用Galpha16转染。钙流检测用钙流荧光检测，就像以前所提到的那样(Kotanietal,(2001)JournalofBiologicalChemistry,Vol276:34631)。
表2.效能检测用钙敏感的荧光染料
*:N/A:未能检测到
实施例31.在杀死Kisspeptin表达肿瘤细胞的方面IL2-Kisspeptin融合分子是优越于IL2。
融合蛋白的细胞毒性用Daudilymphoma细胞和Daudi/KISS1R(达吴迪稳定表达的KISS1R)细胞系检测。首先，外周血单核细胞(PBMCs)在96孔板中培养，细胞培养同时细胞贴壁生长未贴壁生长的细胞会被冲洗掉。细胞贴壁生长的是被用做效应细胞。靶细胞(效应细胞：靶细胞＝15)用IL2-Kisspeptin融合蛋白，IL2，或Kisspeptins在室温培养，然后增加到效应细胞。平板在37℃培养40小时。上清转移到新的平板然后采取手段从破裂的细胞中释放出来乳酸脱氢酶提取出来。
表3.Kisspeptin表达杀死肿瘤细胞的能力
*:N/A:未能检测到
为了更好的理解上述的发明，在一些细节上是通过说明或举例的方法描述，很明显对于这些成熟方法的细微修改和调整将使其更加的优化。因此，这些描述和实例被归纳为发明的范围。
工业实用性
本发明所阐述的细胞因子融合分子包含一个细胞因子部分和一个靶点部分。靶点部分引导融合分子结合到靶点的相关结合位点，从而使细胞因子发挥其功能，因此，该过程增强了细胞因子的活性。细胞因子融合蛋白是可以被用做治疗人类的疾病的。
序列表

Claims (43)

1.一个包含融合分子的复合物，所述的融合分子包含至少一个细胞因子部分连接到至少一个靶点导向部分，其中所述的细胞因子部分包含一个或是多个细胞因子，且所述靶点导向部分包含一个或是多个配体。
2.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子包含至少白介素的一个片段或是突变体，其中所述的白介素从IL2；IL15；IL4；IL13；IL7；IL9；IL21；IL3；IL5；GM-CSF；IL6；IL11；IL27；IL30；IL31(+nonILOSM，LIF，CNTF，CTF1)；IL12；IL23；IL27；IL35；IL14；IL16；IL32；IL34；IL10/IL22；IL19；IL20；IL24；IL26；IL28A；IL28B；IL29；IL1A；IL1B/IL1F2；1Ra/IL1F3；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1F10；IL1F11；IL1G；IL17A；IL17B和IL25这些亚型中选择的。
3.权利要求2所述的复合物，其中所述的IL2至少包含氨基酸序列
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO：1)的一个片段或是突变体。
4.权利要求1所述的复合物，其中所述的的细胞因子包含至少一个TNF(肿瘤坏死因子)家族成员，上述的TNF家族包括TNFA/TNFSF2；淋巴毒素(TNFB/LTA，TNFC/LTB)；TNFSF4；TNFSF5/CD40LG；TNFSF6；TNFSF7；TNFSF8；TNFSF9；TNFSF10；TNFSF11；TNFSF13B和EDA。
5.权利要求4所述的复合物，其中所述的TNFA包含氨基酸序列
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQIDNO：3)的至少一个片段或是突变体。
6.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子至少包含干扰素的一个片段或是突变体，其中的干扰素包括IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNA8；IFNA10；IFNA13；IFNA14；IFNA16；IFNA17；IFNA21；IFNB1；IFNK；IFNW1和IFNG。
7.权利要求6所述的复合物，其中所述的IFNA1包含氨基酸序列
MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLGCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQIDNO：5)的至少一个片段和突变体。
8.权利要求6所述的复合物，其中所述的IFNA2包含氨基酸序列
MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQIDNO：6)的至少一个片段或突变体。
9.权利要求6所述的复合物，其中所述的IFNB1包含氨基酸序列
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQIDNO：7)的至少一个片段或是突变体。
10.权利要求6所述的复合物，其中所述的IFNG包括至少氨基酸序列
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQIDNO：8)一个片段或是突变体。
11.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子包含至少一个趋化因子，从这些分子中选择出来的包含CCL1；CCL2/MCP-1；CCL3/MIP-1α；CCL4/MIP-1β；CCL5/RANTES；CCL6；CCL7；CCL8；CCL9；CCL11；CCL12；CCL13；CCL14；CCL15；CCL16；CCL17；CCL18；CCL19；CCL20；CCL21；CCL22；CCL23；CCL24；CCL25；CCL26；CCL27；CCL28；CXCL1/KC；CXCL2；CXCL3，CXCL4；CXCL5；CXCL6；CXCL7；CXCL8/IL8；CXCL9；CXCL10；CXCL11；CXCL12；CXCL13；CXCL14；CXCL15；CXCL16；CXCL17；CX3CL1；XCL1和XCL2。
12.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子包含至少一个从KITLG；CSF和SPP1这些分子中选择出来的趋化因子。
13.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子包含至少以下生长因子的一个片段或是突变体：肾上腺髓质素(AM)；血管生成素(Ang)；自分泌运动因子；骨形成蛋白(BMPs)；脑衍生神经营养因子(BDNF)；表皮生长因子(EGF)；红细胞生成素(EPO)，纤维母细胞生长因子(FGF)；神经营养因子(GDNF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；生长分化因子9(GDF9)；肝细胞生长因子(HGF)；肝癌衍生的生长因子(HDGF)；胰岛素样生长因子(IGF)；促移行因子；肌生成抑制蛋白(GDF-8)；神经生长因子(NGF)和其它的神经生长因子；血小板源生长因子(PDGF)；促血小板生成素(TPO)；转化生长因子-α(TGF-α)；血管内皮生长因子(VEGF)；Wnt信号通路；胎盘生长因子(PlGF)。
14.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体是一个能够识别靶点包括细胞或是病毒颗粒上的受体的多肽，蛋白或是小分子。
15.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体包含一个片段或是变异的多肽或是蛋白结合一个或是多个受体从以下团体中选择的包含在肝细胞上表达的受体在感染了肝炎病毒之前或是之后(HAV或HBV或HCV)，乙型肝炎病毒的表面抗原(HBVsAg)；人体免疫缺陷病毒(HIV)的gp120及gp41蛋白；或是人类流感病毒的血凝素；SARS冠状病毒的膜粒蛋白质E2；SARS冠状病毒的纤突蛋白，SARS冠状病毒血细胞凝集素糖蛋白。
16.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体包含能和至少以下受体之一结合的的多肽或是蛋白的一个片段和突变体：BMPR1B(骨形成蛋白I型受体B)；CDH3(钙粘蛋白3，CDHP)；CDH19(钙粘蛋白19)；CDH2(神经钙粘蛋白，NCAD)；SLC7A5(LAT1)；STEAP1(六个横跨膜的上皮前列腺抗原)；MUC16(CA125)；KISS1R(GPR54)；CLDN3(封闭蛋白-3)；CLDN4(封闭蛋白-4)；CLDN18(密封蛋白-18)；MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核细胞其余的因素，间皮素)；SLC34A2(NAPI-3B，NPTIIb，Napi3b溶质运载蛋白家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠/磷共转运通道基因3b)；IL13RA2(IL13受体α2)；PSMA前列腺特异性膜抗原)；Se2ma5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5bHlog，semadomain，七种血小板反应蛋白重复(类型1和类型1相似的)，跨膜区域(TM)和短的胞浆区，(脑信号蛋白)5B)；TMEFF1(脑肿瘤抑癌蛋白-1)；PSCAhlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKENcDNA2700050C12，RIKENcDNA2700050C12gene)；ETBR(内皮素B型受体)；MSG783(RNF124，假定蛋白FLJ20315)；CACNA1A(CAV2.1)，STEAP2(PCANAP1，STAMP1，STMP，前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六种横跨膜的上皮抗原2，六种横跨膜的前列腺蛋白)；TMEFF2(脑肿瘤抑癌蛋白-2)；TrpM4(BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬时感受器点位阳离子通道，M亚科，成员4)；OR52E1(嗅觉器官受体，52科，E亚科，成员1)；OR52E2(嗅觉感受器，52科，E亚科，成员2，PSGR)；CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸形肿瘤衍生的生长因子)；CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EpsteinBarrvirus受体)或Hs.73792)；CD79b(CD79B，CD79.beta.，IGb(免疫球蛋白相关的beta)，B29)；FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(SH2领域包括磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)；HER2；NCA；MDP；IL20R.alpha.；短蛋白聚糖；EphB2R；ASLG659；PSCA；GEDA；BAFF-R(B细胞激活因子受体，BLyS受体3，BR3；CD22(B-细胞受体CD22-B同型)；MET(甲硫氨酸原癌基因，肝细胞生长因子受体)；CD79a(CD79A，CD79.alpha.，免疫球蛋白相关联的α，一种B细胞特异的蛋白与Igβ共价相连(CD79B)在IgM分子的表面形成一个复合物，在B细胞的分化中转导信号)；CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，一种G蛋白偶联受体是通过CXCL13趋化因子激活，在淋巴细胞的迁移和体液防御方面有作用，在HIV-2的感染和在AIDS，淋巴瘤，骨髓瘤白血病的发展过程中有作用)；HLA-DOB(MHCII型分子(Ia抗原)的β亚基结合在多肽上然后呈递给CD4+T淋巴细胞)；P2X5(嘌呤受体P2X配体依赖性离子通道5，一种是通过细胞外的ATP门控的离子通道，可能是参与突出传导和神经形成，缺点是可能导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理)；CD72(B-分化的抗原CD72，Lyb-2)；LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，I型的膜蛋白隶属于富含亮氨酸的重复序列家族，调控B细胞的激活和凋亡，功能缺失会增加患者的系统性红斑狼疮的发病活动)；FcRH1(Fc受体样蛋白1一种假定蛋白免疫球蛋白Fc结构域包含C2类型的Ig-like的和ITAM结构域，可能在B淋巴细胞的分化中起到作用)；IRTA2(免疫球蛋白超家族受体迁移相关联的2，一种假定免疫受体在可能的B细胞的发育和淋巴瘤的形成有作用；放松管制的基因易位在B细胞恶性肿瘤细胞发生)；和TENB2(假定的跨膜的蛋白多糖，和EGF/调蛋白的家族生长因子和卵泡抑制相关)。
17.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体至少包含以下白介素的一个片段或是突变体：IL2；IL15；IL4；IL13；IL7；IL9；IL21；IL3；IL5；GM-CSF；IL6；IL11；IL27；IL30；IL31(+nonILOSM，LIF，CNTF，CTF1)；IL12；IL23；IL27；IL35；IL14；IL16；IL32；IL34；IL10/IL22；IL19；IL20；IL24；IL26；IL28A；IL28B；IL29；IL1A；IL1B/IL1F2；1Ra/IL1F3；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1F10；IL1F11；IL1G；IL17A；IL17B和IL25。
18.权利要求17所述的复合物，其中所述的IL2至少包含以下氨基酸序列
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO：1)中一个片段或是突变体。
19.权利要求1所述的复合物，其中上述的配体包含至少一个TNF家族成员，该TNF家族包括TNFA/TNFSF2；淋巴毒素(TNFB/LTA，TNFC/LTB)；TNFSF4；TNFSF5/CD40LG；TNFSF6；TNFSF7；TNFSF8；TNFSF9；TNFSF10；TNFSF11；TNFSF13B和EDA。
20.权利要求19所述的复合物，其中上述的TNFA至少包含以下氨基酸序列的一个片段或是突变体：
RSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQIDNO：3)。
21.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体至少包含以下干扰素的一个片段或是突变体：IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNA8；IFNA10；IFNA13；IFNA14；IFNA16；IFNA17；IFNA21；IFNB1；IFNK；IFNW1和IFNG。
22.权利要求所述的21复合物，其中所述的IFNA1至少包含以下氨基酸序列的一个片段或是突变体：
MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLGCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQIDNO：5)。
23.权利要求21所述的复合物，其中所述的IFNA2至少包含以下氨基酸序列的一个片段或突变体：
MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQIDNO：6)。
24.权利要求21所述的复合物，其中所述的IFNB1至少包含以下氨基酸序列的一个片段或突变体：
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQIDNO：7)。
25.权利要求21所述的复合物，其中所述的IFNG至少包含以下氨基酸序列的一个片段或突变体：
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQIDNO：8)。
26.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体至少包含以下一个趋化因子：CCL1；CCL2/MCP-1；CCL3/MIP-1α；CCL4/MIP-1β；CCL5/RANTES；CCL6；CCL7；CCL8；CCL9；CCL11；CCL12；CCL13；CCL14；CCL15；CCL16；CCL17；CCL18；CCL19；CCL20；CCL21；CCL22；CCL23；CCL24；CCL25；CCL26；CCL27；CCL28；CXCL1/KC；CXCL2；CXCL3，CXCL4；CXCL5；CXCL6；CXCL7；CXCL8/IL8；CXCL9；CXCL10；CXCL11；CXCL12；CXCL13；CXCL14；CXCL15；CXCL16；CXCL17；CX3CL1；XCL1和XCL2。
27.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体至少包含一个以下趋化因子：KITLG；CSF和SPP1。
28.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体至少包含以下一个生长因子的片段或是突变体：肾上腺髓质素(AM)；血管生成素(Ang)；自分泌运动因子；骨形成蛋白(BMPs)；脑衍生神经营养因子(BDNF)；表皮生长因子(EGF)；红细胞生成素(EPO)；纤维母细胞生长因子(FGF)；胶质源性神经营养因子(GDNF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；生长分化因子9(GDF9)，肝细胞生长因子(HGF)；肝癌衍生生长因子(HDGF)；胰岛素样生长因子(IGF)，促移动因子；肌生成抑制蛋白(GDF-8)；神经生长因子(NGF)和其它的神经营养因子，血小板源生长因子(PDGF)；促血小板生成素(TPO)；转化生长因子α(TGF-α)；转化生长因子β(TGF-β)；肿瘤坏死因子α(TNF-α)；血管内皮生长因子(VEGF)；Wnt信号通路；胎盘生长因子(PlGF)。
29.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子是IL2至少包含以下氨基酸序列的一个片段或是突变体：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO：1)，同时所述的配体至少包含有以下氨基酸序列的Kisspeptin的一个片段或突变体：
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO：2)。
30.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子是包含以下氨基酸序列的TNFA的一个片段或是突变体：
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQIDNO：3)，同时所述的配体至少包含有以下氨基酸序列的Kisspeptin的一个片段或突变体：
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO：2)。
31.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子是IFNA1，包含氨基酸序列的
MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLGCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQIDNO：5)至少一个片段或是突变体，同时所述的配体至少包含有以下氨基酸序列的Kisspeptin的一个片段或突变体：
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO：2)。
32.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子是IFNA2，包含至少以下氨基酸序列
MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQIDNO：6)一个片段或是突变体，同时所述的配体至少包含有以下氨基酸序列的Kisspeptin的一个片段或突变体：GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO：2)。
33.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子是IFNB1，包含至少以下氨基酸序列
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQIDNO：7)一个片段或是突变体，同时所述的配体至少包含有以下氨基酸序列的Kisspeptin的一个片段或突变体：GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO：2).。
34.权利要求1所述的复合物，其中所述的细胞因子是IFNG，包含至少以下氨基酸序列
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQIDNO：8)的一个片段或是变异，同时所述的配体至少包含有以下氨基酸序列的Kisspeptin的一个片段或突变体：
GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF(SEQIDNO：2)。
35.权利要求1所述的复合物，其中所述的配体包含有以下氨基酸序列的
CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(SEQIDNO：9)内皮素3的至少一个片段或是突变体。
36.权利要求35所述的复合物，其中所述的细胞因子是IL2，包含以下氨基酸序列
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQIDNO：1)的至少一个片段或是突变体，且所述的配体包含氨基酸序列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(SEQIDNO：9)的内皮素3的一个片段或一个突变体。
37.根据任意一个前述权利要求的复合物，其中的融合分子还包括能够延长融合蛋白的半衰期的另一部分，比如Fc，或是人血清蛋白或是其它蛋白。
38.在个体中治疗疾病的方法包含给予一个有效的数量的权利要求的1-37的复合物。
39.权利要求38所述的方法，其中的疾病是癌症。
40.权利要求38所述的方法，其中所述的疾病是一个病毒性的疾病。
41.权利要求38-40中任意一项所述的方法，其中复合物的给予达到有效的剂量。
42.权利要求38-41中任意一项所述的方法，其中的复合物是执行静脉注射，肌肉注射，皮下注射，或是输液。
43.权利要求38-42中任意一项所述的方法，其中的个体是人。
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