CN112957472A - 靶向ccl19/ccr7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了靶向CCL19/CCR7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途，属于生物医药技术领域。本发明提供了具有免疫增强作用的CCL19蛋白及敲减其受体CCR7表达的调节剂AAV‑shRNA‑CCR7(shCCR7)在促进提升CD8+T细胞的比例及HBV抗原特异性T细胞活化及凋亡，加速HBV清除方面的应用。可用于加速HBV慢性感染的哺乳动物体内HBV的清除，对制备HBV预防性药物或者治疗性疫苗提供了理论基础。

Description

靶向CCL19/CCR7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途

技术领域

本发明涉及靶向CCL19/CCR7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途，属于生物医药技术领域，具体涉及免疫调节剂及其用途。

背景技术

全世界大约有2.5亿人长期感染乙型肝炎病毒(HBV)，极有可能发展为肝脂肪变性，肝硬化，终末期肝衰竭或肝细胞癌^(1,2)。当前批准的治疗策略，包括干扰素-α(IFN-α)，核苷和核苷酸类似物，在维持长期HBV“根除”方面仅提供有限的功效^(1,3,4)，不良事件的发生导致治疗终止或依从性差⁽⁵⁾。在初发性HBV感染中，病毒在大约90％的成年人中被完全根除，其余个体发展为病毒持久性和疾病进展。对乙肝病毒感染的免疫防御是复杂的，其机制已引起相当大的关注，这可能是对抗慢性乙型肝炎(CHB)的一种有希望的方法。HBV反应CD8+T细胞反应在感染开始时在病毒清除中起着关键作用，而这些反应在慢性感染(称为CD8+T细胞衰竭)期间后期变得相当弱^(2,6,7)。

在我们之前关于先天免疫的研究中，诸如样受体(Toll Like Receptor，TLR)等因子通过启动细胞内信号通路来产生干扰素(IFN)和其他细胞因子，从而被确定为HBV去除的第一条防线，从而诱导HBV反应的免疫反应⁽⁸⁾。趋化因子也认为是先天免疫和适应性免疫之间的重要环节，可以激活先天免疫反应^(9,10)。

趋化因子19(CCL19)是一种维持免疫平衡的药物，它协调CCR7表达的炎症性T淋巴细胞和树突细胞的招募和沿化学梯度的转运^(10,11)，也参与T细胞免疫反应和抗肿瘤免疫⁽¹²⁾。因此，CCL19和受体CCR7能够参与调节免疫反应，在HBV感染的过程中，HBV病毒的HBx蛋白通过模拟自噬受体分子参与免疫逃逸反应，而没有发生真正意义上的病毒感染细胞的凋亡及清除。HBx蛋白也会作用于CCL19和受体CCR7轴的下游信号而降低信号蛋白的表达，导致在急性感染阶段的抗病毒免疫反应降低(抑制感染的细胞凋亡)，最终导致慢性HBV感染⁽¹³⁾；相反，CCR7下游分子的信号被抑制会促发细胞凋亡，而清除病毒。因此，在病毒感染的过程中，减少CCR7分子的表达，也可能成为清除病毒感染的一个手段，但与CCL19免疫调节剂的调节机制是不同的。

肝脏是免疫耐受的器官，肝脏的实质细胞及非实质细胞有抑制免疫细胞活化的作用，如果有细胞因子可以打破这种免疫耐受，将有助于预防HBV等肝脏病原体的感染或加速感染病原体的清除。细胞因子作为免疫调节剂在抗病毒治疗中是广泛使用的，比如IFN-α在抗HBV治疗及抗新型冠状病毒治疗中都在《治疗指南》中被推荐⁽¹⁶⁾，趋化因子CCL19是人体内正常存在的一种特殊的细胞因子，常规了解到的功能是它能够促使含有其受体CCR7分子的淋巴细胞定向迁移，增强免疫反应，也可以作为分子佐剂或免疫增强剂，增强抗艾滋病毒HIV-1及2型疱疹病毒HSV-2的抗病毒免疫^(14,15)，但其在HBV免疫清除中的作用还尚未揭晓。

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发明内容

本发明通过研究CCL19在体外和体内对HBV慢性感染的作用，提供了免疫调节剂CCL19和shCCR7在HBV预防性药物或者治疗性疫苗中的新用途。

本发明的第一个目的是提供(a)或(b)在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用；其中：

(a)趋化因子CCL19和/或趋化因子受体CCR7；

(b)靶向CCL19和/或CCR7的免疫调节剂。

在一种实施方式中，所述免疫调节剂包括但不限于靶向CCL19的免疫激活剂。

在一种实施方式中，所述免疫调节剂包括但不限于靶向CCR7的抑制剂。

在一种实施方式中，所述靶向CCL19的物质为携带CCL19基因的表达载体；编码所述CCL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，所述携带CCL19基因的表达载体为pcDNA3.1(+)-CCL19。

在一种实施方式中，所述靶向CCR7的物质为携带靶向CCR7的shRNA的表达载体。

在一种实施方式中，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

含有CCL19免疫激活剂和/或CCR7抑制剂的注射制剂。

有益效果：本发明提供了免疫调节剂CCL19和shCCR7在HBV预防性药物或者治疗性疫苗中的新用途。本发明通过体外细胞实验和动物实验证明了CCL19具备如下作用：

(1)促进临床乙肝病毒(HBV)感染者体内的CD8+T细胞产生HBc特异性干扰素(IFN-γ)；

(2)使肝内产生高水平的CD8⁺T淋巴细胞；

(3)介导血液及脾脏的PD-1⁺CD8⁺T细胞增加；

(4)调节抗原响应性CD8+T细胞凋亡，调节性T细胞(Treg)和分泌细胞因子；

可作为HBV预防性药物或治疗性疫苗的有效成分，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1A图为HBV感染者的淋巴细胞经体外CCL19蛋白刺激后产生CCR7^-/+CD8⁺T细胞和HB_C抗原特异性的干扰素情况；B图为急性HBV感染者(AHB)、肝癌患者(Hepatoma)、慢性HBV感染者(CHB)以及健康对照人群(HC)的淋巴细胞在CCL19蛋白刺激下产生IFN-γ的情况；其中，LY294002是干扰素信号通路PI3K分子的特异性阻断剂。

图2A图为CCL19使HBV慢性感染的小鼠体内产生了更高水平的枯否细胞(KCs)细胞(CD11c⁺F4/80⁺)；B图为HBV慢性感染的小鼠2周后肝组织内的各种免疫细胞的比例；C图为各实验组T细胞的亚型的比例(CD4⁺T和CD8⁺T细胞)。

图3A图为建模后2周和4周血液和脾脏CD4+及CD8+淋巴细胞表面PD-1及CCR7表达的分析；B图为各组小鼠淋巴细胞CCR7的表达情况。C图为外周血淋巴细胞PD-1⁺的情况；D图为脾细胞PD-1⁺CD8⁺T细胞的阳性情况。

图4为CCL19蛋白体外刺激肝脏实质细胞和非实质细胞而介导T细胞活化的情况；肝脏非实质细胞包括血管内皮细胞(LSECs)和枯否细胞(KCs)。

图5A图为CCL19蛋白促进抗原响应性CD8+T细胞的凋亡；B图为CCL19蛋白促进CD8+Treg细胞下调；C为CCL19蛋白促进CCL19过表达小鼠的脾细胞分泌更多的抗病毒细胞因子(TNF-a和IFN-γ)。

图6为CCL19分子表达及CCR7分子敲减均对CHB小鼠抗原的清除作用；包括HBV病毒的表面抗原(HbsAg)、E抗原(HBeAg)，HbsAg抗原阳性小鼠的比例和HBV病毒的DNA拷贝数。

图7为表达CCL19的重组质粒pcDNA3.1(+)-CCL19图谱。

具体实施方式

实施例1免疫调节剂CCL19和shCCR7用于HBV慢性感染的病人外周血淋巴细胞

慢性乙肝病人肝脏中的病毒之所以不能被清除，主要是肝脏是个免疫耐受器官，同时乙肝病人体内存在CD8+T淋巴细胞耗竭，将免疫调节剂CCL19和免疫调节剂shCCR7在HBV慢性感染的病人外周血淋巴细胞(PBMC)上进行功能验证。具体步骤为：

(1)提取外周血淋巴细胞，加入到24孔板内，每孔1×10⁶个/500ml的淋巴细胞，CCL19组用人CCL19蛋白(10ng/孔)刺激72小时，HBc组加入HBV特异性抗原HBc多肽(10ng/孔)刺激72h；HBc+CCL19组用人CCL19蛋白(10ng/孔)和HBV特异性抗原HBc多肽刺激72h；HBc+CCL19+L294002组用人CCL19蛋白(10ng/孔)和HBV特异性抗原HBc多肽(10ng/孔)和LY294002蛋白药物(10ng/孔)刺激72h，观察生成抗原特异性的细胞因子情况；分别用CCL19、HBC多肽、LY294002蛋白药物用流式细胞术检测外周血分泌IFN-γ⁺的CD8⁺T淋巴细胞，CCL19蛋白可以促使HBV慢性感染病人外周血CD8⁺T细胞分泌抗病毒细胞因子IFN-γ，外周血淋巴细胞转染装载shCCR7分子的慢病毒载体(LV-shCCR7)，可以降低CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的功能。(图1)

实施例2小鼠模型的建立

用慢性HBV感染的C57/BJ小鼠构建HBV感染小鼠模型，经高压尾静脉注射HBV1.2质粒，10ng/只，HBV1.2质粒为台湾大学陈培哲教授惠赠，感染小鼠的具体操作参考文献LinYJ,Huang LR,Yang HC,Tzeng HT,Hsu PN,Wu HL,et al.Hepatitis B virus coreantigen determines viral persistence in a C57BL/6mouse model.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America(2010)107(20):9340-5.doi:10.1073/pnas.1004762107。

用按上述方法构建的HBV感染小鼠模型构建CCL19高表达及其受体CCR7减低表达的模型。

(1)CCL19分子高表达慢性HBV感染小鼠模型：将本实验室构建的pcDNA3.1(+)上重组表达鼠CCL19的质粒(质粒图谱如图7所示，编码CCL19的核苷酸序列为：ATGGCCCCCCGTGTGACCCCACTCCTGGCCTTCAGCCTGCTGGTTCTCTGGACCTTCCCAGCCCCAACTCTGGGGGGTGCTAATGATGCGGAAGACTGCTGCCTGTCTGTGACCCAGCGCCCCATCCCTGGGAACATCGTGAAAGCCTTCCGCTACCTTCTTAATGAAGATGGCTGCAGGGTGCCTGCTGTTGTGTTCACCACACTAAGGGGCTATCAGCTCTGTGCACCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGATCGCATCATCCGAAGACTGAAGAAGTCTTCTGCCAAGAACAAAGGCAACAGCACCAGAAGGAGCCCTGTGTCTTGA)通过高压尾静脉注射到小鼠体内(10ug/只)，在注射前及注射7天后采血，通过ELISA法及RT-PCR法，检测CCL19的表达情况，证明CCL19在体内表达增高。RT-PCR法相对定量所用的引物为：CCL19,5’-CTG CCT GTC TGT GAC CCA GCG CCC C-3’(sense)和5’-ACTTCT TCA GTC TTC GGA TGA TGC G-3’(antisense)，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；及β-actin,5’-GCG AGC ACA GAG CCT CGC CTT TG-3’(sense)和5’-GAT GCCGTG CTC GAT GGG GTA C-3’(antisense)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

(2)CCR7受体敲减的小鼠模型：为将CCR7的部分序列设计成shRNA，并装载到腺相关病毒AAV病毒载体上，CCR7 shRNA序列合成引物为：5’-GCG UCA ACC CUU UCU UGU ATT-3’(sense)和5’-GAC GCA GUU GGG AAA GAA CAU-3’(antisense)，核苷酸序列分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。将shCCR7扩增的双链连接到AAV载体上，通过高压尾静脉给HBV慢性感染小鼠模型C57BL/6小鼠注射(2×10⁸TU/ml)shCCR7，构建CCR7敲减的HBV慢性感染小鼠模型，注射前采血及注射7天后采血验证，证明CCR7受体分子表达减低。同时检测CCL19 mRNA的表达情况，结果显示小鼠血细胞内表达的mRNA在第一周时为最高，后面连续观察8周，mRNA的表达量递减，shCCR7注射小鼠的结果显示1，2，3周前逐周略微升高，而后又逐渐减少。

以等量的PBS注射HBV慢性感染小鼠为对照组小鼠模型。

实施例3免疫调节剂CCL19和shCCR7用于HBV慢性感染的小鼠

将免疫调节剂CCL19和免疫调节剂shCCR7在HBV慢性感染的小鼠上进行功能验证，分别检测实施例2构建的对照组小鼠模型、CCR7敲减的HBV慢性感染小鼠模型和CCL19分子高表达慢性HBV感染小鼠模型作用一段时间后的肝非实质细胞的构成比例、免疫调剂及对细胞的作用。

(1)免疫调节剂作用后2周时肝非实质细胞的构成比例变化：CCL19高表达小鼠的KCs细胞(F4/80+，CD11c-)比例显著提高(约70％)，CCR7分子敲减导致KCs细胞的比例下降(约60％)，在CHB小鼠各组中的比例差异不明显(约50％)(图2A-2B)。然而，与PBS+HBV和CCL19+HBV组相比，shCCR7+HBV小鼠在肝脏中单细胞、T细胞、B细胞和粒细胞水平明显下降，CCL19表达增加提升了T细胞的比例，更重要的是，CD8⁺T细胞的绝对百分比增长是最明显的(41.8％)(图2C)，而敲减CCR7组的CHB鼠产生了明显减少的CD8⁺T细胞和亚类(26.4％)(图2C)。结果表明，CCL19可以促进肝内CD8⁺T细胞比例的增加，这可能是通过增强细胞免疫促进HBV免疫清除反应的一个重要原因。

(2)免疫调节剂对小鼠体内PD-1⁺CD8⁺T细胞的作用：随着HBV的特异性及非特异性清除，病毒效应性T淋巴细胞的数量将大大减少，主要由程序化细胞凋亡蛋白PD-1调节凋亡程序，之后建立记忆性T细胞群体或慢性感染。PD-1+CD8+T已被证实在急性HBV感染早期会短暂升高，PD-1的动态下降与HBV自限性感染及记忆性CD8+T细胞发育相关。通过本CHB小鼠模型，用流式细胞术检测小鼠的外周血和脾细胞PD-1的表达，发现CCL19+HBV组的外周血PD-1⁺CD8⁺T细胞在HBV感染后第2周和第4周时明显减少，尤其地4周与HBV慢性感染鼠有显著性差异(P<0.001)，而在第4周的脾脏中PD-1⁺CD8⁺T细胞高于其他组(P<0.001)(图3)。

(3)免疫调节剂对小鼠肝脏APC中的CD8+T细胞的作用：体内肝脏的APC(包括肝脏实质细胞和非实质细胞)是主要抑制免疫细胞发挥功能的主要细胞，通过体外实验验证，体外纯化的肝实质细胞、KCs细胞及LSECs细胞经CCL19蛋白(外加CD3/CD28单克隆抗体激活)刺激24小时后，与淋巴细胞(脾脏来源)共孵育，48小时后比较加CCL19和未加CCL19蛋白各组小鼠淋巴细胞分泌抗病毒细胞因子的量，结果显示：与阴性对照组NC相比，CCL19+HBc可以促进肝实质细胞(Hepatocytes)和非实质细胞(LSECs+KCs)介导淋巴细胞产生抗病毒细胞因子增多(图4)，简言之，CCL19分子可促进肝脏APC中的CD8+T细胞激活。

(4)免疫调节剂对CHB小鼠CD4+及CD8+T细胞抗原特异性细胞凋亡的作用：细胞凋亡是免疫活化后的一种程序性死亡，还有助于清除损伤和不必要的细胞。与PBS+HBV组小鼠比较(60％)，CCL19分子高表达(CCL19+HBV)及CCR7分子敲减(shCCR7+HBV)小鼠的脾细胞经体外培养及乙肝病毒核心蛋白肽(HBc)刺激均产生了显著的CD8⁺T细胞晚期凋亡(82％)。并且这两种制剂作用的小鼠体内产生的免疫抑制的T细胞(Treg)的比例均较低(<8％，P<0.001)(图5)。

(5)免疫调节剂对小鼠HBV感染后的病毒清除作用：检测实施例2构建的CCL19分子高表达小鼠模型体内CCL19蛋白含量，及CCR7受体敲减的小鼠模型体内CCR7受体分子含量，结果显示，CCL19蛋白的增加和CCR7的减少可以维持1个月以上。按周观察小鼠体内的HBV特异性表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、HBsAg阳性鼠及肝脏HBV DNA的阳性情况，结果显示，预先注射免疫激活剂及免疫调节剂的小鼠体内HBV出现了加速清除(图6)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 无锡市第五人民医院

<120> 靶向CCL19/CCR7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgcctgtct gtgacccagc gcccc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acttcttcag tcttcggatg atgcg 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgagcacag agcctcgcct ttg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatgccgtgc tcgatggggt ac 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgucaaccc uuucuuguat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacgcaguug ggaaagaaca u 21

<210> 7

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggcccccc gtgtgacccc actcctggcc ttcagcctgc tggttctctg gaccttccca 60

gccccaactc tggggggtgc taatgatgcg gaagactgct gcctgtctgt gacccagcgc 120

cccatccctg ggaacatcgt gaaagccttc cgctaccttc ttaatgaaga tggctgcagg 180

gtgcctgctg ttgtgttcac cacactaagg ggctatcagc tctgtgcacc tccagaccag 240

ccctgggtgg atcgcatcat ccgaagactg aagaagtctt ctgccaagaa caaaggcaac 300

agcaccagaa ggagccctgt gtcttga 327

Claims (9)

1.(a)或(b)在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用；其中：

(a)趋化因子CCL19和/或趋化因子受体CCR7；

(b)靶向CCL19和/或CCR7的免疫调节剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫调节剂包括但不限于靶向CCL19的免疫激活剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫调节剂包括但不限于靶向CCR7的抑制剂。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶向CCL19的物质为携带CCL19基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，编码所述CCL19基因的核苷酸序列如SEQID NO.7所示。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述携带CCL19基因的表达载体为pcDNA3.1(+)-CCL19。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶向CCR7的物质为携带靶向CCR7的shRNA的表达载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

9.含有CCL19免疫激活剂和/或CCR7抑制剂的注射制剂。

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