CN108949692A - 表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，包括如下步骤：序列选取；构建含嵌合抗原受体的pCDH载体；将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中；慢病毒的包装；表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备。本发明还提供了一种上述嵌合抗原受体T淋巴细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。本发明以肿瘤特异性抗原为靶点，并辅助表达CXCL10和CCL21分子，既可实现对肿瘤细胞的靶向作用，又可抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，最大程度杀伤实体瘤，实现了对实体瘤的免疫治疗新突破。

Description

表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的 构建方法及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗技术与基因工程改造技术领域，尤其涉及一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用。
背景技术
2017年初，国家癌症中心发布了中国最新癌症数据，每一项数据都用客观的事实告诉我们：中国正在面临着一场抗癌战争。每天约1万人诊断癌症，每分钟约7人确诊患癌。目前，最常见的癌症治疗方法是化疗、放疗、肿瘤手术，以及前列腺癌和乳腺癌的激素治疗。然而，其他类型的治疗方法也开始起作用了：这些疗法本身或与其他疗法结合在一起，有助于更有效地战胜癌症，理想情况下，这些疗法的副作用也更少。癌症治疗的创新旨在解决一系列的问题，这些问题通常会面临医疗服务提供者和患者的问题，包括积极的治疗，伴随不良的副作用，治疗后的肿瘤复发，手术，或两者兼而有之，以及对广泛使用的治疗有弹性的侵袭性癌症。CAR-T，嵌合抗原受体T细胞，是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一，和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。
嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。CAR-T细胞在治疗血液癌症方面表现出非凡的功效，在实体肿瘤的治疗中，CAR-T细胞的浸润、积累和存活是清除肿瘤的关键，在这方面，CAR-T细胞免疫疗法可发展的空间还很大。
EpCAM属于单次跨膜I型糖蛋白，EpCAM基因位于人染色体2p21，基因长度14kbp，相对分子量40kDa，其分子结构由胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构3部分构成，其主要编码一种肿瘤相关抗原，多数表达与正常上皮细胞和上皮源性恶性肿瘤细胞。EpCAM参与调节细胞间粘附、迁移、增殖及信号传导。EpCAM的过表达导致Wnt-β-连环蛋白信号通路这一经典的肿瘤信号通路的激活，通过Wnt级联反应激活原癌基因e-myc和cyclinA/E的表达，诱导细胞的增殖。多项研究证据表明，EpCAM在多种肿瘤组织中呈高水平表达，在肿瘤细胞的增殖中扮演着重要角色，因此EpCAM成为前列腺癌免疫靶向治疗的重要靶点。
人表皮生长因子受体2(HER2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。作为预后和预测生物标志物，大约15–30％的乳腺癌和10–30％的胃/食管癌会发生HER2基因扩增或过表达。HER2的过度表达也可见于其他肿瘤如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈部。HER2靶向治疗极大的改善了HER2阳性乳腺癌、胃/食管癌患者的预后。
Glypican-3(GPC3)蛋白为硫酸肝素糖蛋白家族成员之一，CPC3相对分子质量约为66×103，它富含一段包括14个半胱氨酸残疾的独特序列，在N末端有一种分泌型信号蛋白，C端通过与糖基磷脂酰肌醇共价结合而锚定于细胞膜上，且硫酸乙酰肝素链插入点的位置均由C端最末50个氨基酸决定，是该链靠近细胞膜。CPC3在在调控细胞生长和分化方面起重要作用，与肝癌的发生、发展密切相关，有报道称，肝癌组织中GPC3阳性率达到74.5％。所以GPC3在肝癌组织中特异性高表达的特性，可作为肝癌治疗的新靶点。
CXCL10属于CXC趋化因子超家族的非ELR类,此类细胞因子能够趋化淋巴细胞或造血干细胞，抑制血管的生成。CXCL10又称干扰素诱导蛋白(IP10)，是在外源性和内源性炎性因子等刺激下，由成纤维细胞、内皮细胞、树突状细胞、脂肪细胞等多种细胞分泌、表达的细胞因子。目前，越来越多的研究证明，CXCL10能够发挥抗肿瘤作用，其机制主要通过三种途径实现：CXCL10能够直接抑制肿瘤细胞的增殖，能趋化免疫效应细胞至肿瘤发生部位，能抑制肿瘤血管生成。
CCL21是CC类趋化因子，又称为6Ckine或刺激淋巴组织趋化因子，是CCR7的配体之一，CCL21对某些人T细胞株和外周血淋巴细胞具有高效的化学驱动作用，但对单核细胞和中性粒细胞没有趋化作用，提示它对淋巴细胞具有特异性。CCL21主要通过诱导淋巴细胞和DC细胞增殖以及抑制肿瘤血管生成来发挥抗肿瘤作用。
目前，CAR-T免疫治疗已在血液肿瘤中取得了卓著的成效，但在实体瘤的治疗中面临着肿瘤异质性与免疫抑制微环境的瓶颈，CAR-T细胞在实体瘤内浸润情况决定着CAR-T细胞的功效。
因此，为了改变免疫抑制微环境，招募其他免疫效应细胞到达肿瘤位置，发挥联合抗肿瘤细胞，急需一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞，来实现分泌CXCL10和CCL21，从而使机体免疫细胞被招募至肿瘤部位进行杀伤肿瘤。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，包括如下步骤：
(1)序列选取：
选取CXCL10和CCL21作为目标序列；其中，CXCL10的DNA序列如SEQID NO:1所示，CXCL10的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体：
构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构，整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成；
在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，克隆进入pCDH载体中，得含嵌合抗原受体的pCDH载体；
(3)将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中：
直接将CXCL10及CCL21表达序列进行合成后，克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体，接着对其进行酶切，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定，最终获得含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体；
(4)慢病毒的包装：
先培养293T细胞，再使用Opti-MEM作为转染试剂，通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞；培养一段时间后，进行病毒的收集，并通过超速离心进行浓缩与纯化；
(5)表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备：
在获取供者的抗凝外周血后，离心去除血浆，获取血细胞，再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后，再转移至CD3/CD28anti-body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养；其中，在培养的第2-4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，即可获得目标所需的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中通过NCBI官方网站上获取CXCL10和CCL21的DNA序列作为目标序列。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中实体瘤特异性抗原具体为：表皮生长因子受体3型突变体EGFRvⅢ、人表皮生长因子受体2HER2、EpCAM上皮细胞粘附分子、白介素13受体α2IL13RA、癌胚抗原CEA、间皮素MSLN、成纤维细胞激活蛋白FAP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3、卵泡刺激素受体FSHR、人前列腺特异性膜抗原PSMA、神经节苷脂GD2。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中在嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，其中，前段粘性末端为XbaI酶的酶切位点，末端粘性末端为NotI酶的酶切位点。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中通过NotI与BamH1-F两种限制性内切酶进行酶切。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中慢病毒包装体系具体为商业化的pCDH的慢病毒载体系统，包含1个表达质粒与3个辅助质粒，其中的表达质粒即为步骤(2)中使用的原始PCDH载体；于步骤(4)中使用时，四个质粒的比例为GAG：REV：VSV：含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体＝10:5:2:5:4。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中培养一段时间指培养7天。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中使用含有IL2的KBM581培养基进行培养的整个培养流程为14天，在培养的第4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，病毒感染复数MOI值为10。
作为本发明的优选方式之一，所述病毒感染复数MOI值为10指：慢病毒：T细胞＝10:1。
一种使用上述方法得到的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。
本发明相比现有技术的优点在于：为了改变免疫抑制微环境，招募其他免疫效应细胞到达肿瘤位置，发挥联合抗肿瘤细胞，本发明以肿瘤特异性抗原为靶点，并辅助表达CXCL10和CCL21分子，既可以实现对肿瘤细胞的靶向作用，又可以抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，最大程度杀伤实体瘤，实现了对实体瘤的免疫治疗新突破。
附图说明
图1是实施例1中pCDH-Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-T2A-CXCL10-CCL21质粒载体的载体图谱；
图2是实施例1中CAR-T细胞扩增增殖曲线图；
图3是实施例1中CCLX10-CCL21-HER2.CAR-T细胞分泌的CCLX10及CCL21含量表示图；
图4是实施例1中单个核细胞PBMC、HER2.CAR-T细胞以及CCLX10-CCL21-HER2.CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率比较图；
图5是实施例2中表pCDH-Anti-EpCAM scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-CCLX10-CCL21质粒载体的载体图谱；
图6是实施例2中EpCAM-CAR病毒与CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞扩增增殖曲线图；
图7是实施例2中CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞分泌的CCLX10及CCL21含量表示图；
图8是实施例2中单个核细胞PBMC、EpCAM.CAR-T细胞以及CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率比较图；
图9是实施例3中pCDH-Anti-GPC3scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-CCLX10-CCL21质粒载体的载体图谱；
图10是实施例3中GPC3-CAR病毒与CCLX10-CCL21-GPC3.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞扩增增殖曲线图；
图11是实施例3中CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞分泌的CCLX10及CCL21含量表示图；
图12是实施例3中单个核细胞(PBMC)为对照组，GPC3.CAR-T细胞与CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率比较图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种表达CXCL10和CCL21的HER2靶点的CAR-T细胞的构建方法，包括如下步骤：
1、序列选取：
CXCL10和CCL21的核酸序列来自于Genebank数据库(NM_001565.3和NM_002989.3)；其中，CXCL10的DNA序列具体如SEQ ID NO:1所示，CXCL10的DNA序列具体如SEQID NO:2所示。
2、pCDH-Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ与pCDH-Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-T2A-CXCL10-CCL21载体的构建：
(1)HER2.CAR基因(序列如SEQ ID NO:3所示)是采用二代CAR的组成方式，整个HER2.CAR由识别HER2分子的scFv片段、CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成。
识别HER2分子的scFv片段是Anti-HER2的抗体分子轻链与重链组成单链分子。
CD8αhinge region/Transmembrane(CD8αhinge/TM)，CD8α铰链区和跨膜区；其中，CD8α铰链区是一段柔性区域，含有大量脯氨酸；CD8α跨膜区主要将胞外区和胞内区锚定在细胞膜上。Genebank数据库中查得CD8α铰链区和跨膜区序列NM_001768(1301..1507)。
CD137属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，表达于活化的T细胞上，是T细胞协同刺激因子，配体为4-1BBL，两者结合后可刺激T细胞的活化和增殖。
CD3ζ胞内区是将胞外接收的信号传递至胞内，并将活化信号传递到核内，激活T细胞的增殖。CD3ζ含有3个免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif，ITAM)。
Anti-HER2scFv的具体序列基于山东兴瑞生物科技有限公司的专利(专利号：CN107488636A)，CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ具体序列来源于诺华制药有限公司的专利(专利号：WO2012079000)。
(2)在上述Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ基因序列的两端加入酶切位点粘性末端(前段粘性末端为XbaI酶的酶切位点，末端粘性末端为NotI酶的酶切位)，整个序列由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成；接着，用xbaⅠ限制性内切酶和NotⅠ限制性内切酶分别酶切合成的Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ基因片段以及pCDH-EF1α-MCS空载体(SBIcat#CD502A-1)，37℃酶切30min后，1％琼脂糖(上海生工cat#A600434)凝胶电泳鉴定酶切结果。
接着，使用T4连接酶(NEB cat#N0202)连接酶切后的pCDH-CMV-MCS空载体与Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ，16℃过夜连接，得pCDH-Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ载体。
(3)直接将T2A-CXCL10-CCL21表达序列合成(由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成)后，克隆进入pCDH-Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ载体，接着通过NotI与BamH1-F两种限制性内切酶酶切，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定，最终获得pCDH-Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-T2A-CXCL10-CCL21质粒载体，载体图谱见图1；
T2A peptide间隔区，是一类编码约20个氨基酸左右的核酸序列，它能够阻止翻译过程中氨基酸形成共价键结构，但不影响翻译的持续进行；翻译结束后进行“顺式水解反应”；2A peptide的共有元件为D(V/I)ExNPGP，x为任意氨基酸，水解的部位位于：GP之间，本发明中所用的T2A peptide间隔区氨基酸序列为：5’-GSGEGRGSLLTCGDVEENPGPR，核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3、慢病毒包装及滴度检测
(1)慢病毒包装
将慢病毒包装细胞系293T(美国模式菌种收集中心ATCC：CRL-11268)接种于含有DMEM(TaKaRa公司)+10％FBS(ExCell Bio公司)培养皿中，37℃，5％C02条件下过夜培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。将pCDH-Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-T2A-CXCL10-CCL21质粒载体和pCDH-Anti-HER2scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ质粒载体(约10ug)分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，轻轻混匀，置37℃，5％C02培养箱中培养12h，加入7mL含10％FBS的DMEM液体于细胞培养瓶，继续培养，72h后，收集上清。采用超速离心机12000g，4℃离心30min，去除细胞碎片，收获病毒后使0.45μm滤器(MiIIipore公司)过滤，再进行浓缩，即获得浓缩过的重组CXCL10-CCL21-Her2.CAR病毒液以及Her2.CAR病毒液，-70℃低温箱中保存备用。
(2)荧光定量PCR检测病毒滴度
第一天，以1x 105/ml接种293T细胞于96孔培养板,100μL/孔，培养液含10％胎牛血清的DMEM，37℃，5％CO2培养。第二天，弃50μL/孔培养上清，补加40μL/孔新鲜上述培养液，加10μL/孔的病毒原液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃,5％C02培养。感染48h后，荧光定量PCR仪检测拷贝数，计算滴度(U/mL)＝拷贝数x稀释倍数，控制病毒使用时的滴度为5x107U/mL。
4、T细胞的培养和CXCL10-CCL21-Her2.CAR病毒液以及Her2.CAR慢病毒转染T细胞
(1)T细胞的复苏：液氮中取出PBMC细胞一支，迅速放入37℃水浴锅中迅速溶解，待细胞冰块只有黄豆大小时，将PBMC细胞转入已预热的RPMI1640培养基中，300g离心5min，去除上清液，KBM581无血清培养基将PBMC细胞重悬，加入至1ug/ml anti-CD3、2ug/ml anti-CD28预包被的培养瓶中，37℃5％CO2培养。
(2)第4天，将T细胞转入Retronectin预包被的慢病毒中，MOI值为10(慢病毒：T细胞＝10:1)，37℃5％CO2培养，即可获得CXCL10-CCL21-HER2.CART细胞和HER2.CART细胞。
5、CAR-T细胞体外增殖及维持能力：
在使用CCLX10-CCL21-HER2.CAR慢病毒感染T细胞后，分别在第2、4、6、8、10、12天的时间点进行CAR-T细胞数目分析，分析采用流式细胞术，以CD3分子作为门控，使用特异性识别anti-HER2.scFv的抗体耦联荧光分子进行流式标记来计算CAR-T细胞数目。HER2.CAR病毒与CCLX10-CCL21-HER2.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞扩增增殖曲线如图2所示。
图2中HER2.CAR-T细胞为HER2.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞，CCLX10-CCL21-HER2.CAR-T细胞为CCLX10-CCL21-HER2.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞；由图2可知，CCLX10及CCL21的表达序列对HER2.CAR分子的表达以及CAR-T细胞的扩增无显著影响。
6、表达CCLX10及CCL21效果评估：
先单独培养HER2+MDA-MB-231细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)、HER2CAR-T细胞、CCLX10-CCL21-HER2.CAR-T细胞，再分别收集各种细胞进行共培养，具体方法同上述杀伤功能检测。设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，在37℃5％CO2培养箱中共培养10小时，收集200μL共培养上清液，进行ELISA检测，检测项目包括CCLX10及CCL21，检测结果见图3。由图3可知，CCLX10及CCL21只在CCLX10-CCL21-HER2.CAR-T效应细胞中有大量分泌，而在其他三组实验中未表达。
7、细胞杀伤实验效果评估：
(1)别培养HER2+MDA-MB-231细胞及PBMC细胞；
(2)实验开始前4天，MOI＝10的HER2.CAR和CCLX10-CCL21-HER2.CAR的病毒感染PBMC细胞，培养72-96h后可安排开始实验；
(3)收集靶细胞(HER2+MDA-MB-231)5x105cells和效应细胞(CART细胞)3x106cells，800g，6min离心，弃上清；
(4)用1ml 1xPBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；
(5)重复步骤(3)一次；
(6)用700ul培养基(1640培养基+10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％FBS)重悬靶细胞；
(7)设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；
(8)250xg，5min平板离心；
(9)37℃5％CO2培养箱中培养4小时；
(10)250xg，5min平板离心；
(11)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；
(12)避光孵育25分钟；
(13)每孔加入50ul终止液；
(14)酶标仪检测490nm吸光度；
(15)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；
(16)将步骤15中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)X100％。结果如图4所示，单个核细胞(PBMC)为对照组，HER2.CAR-T细胞与CCLX10-CCL21-HER2.CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果相似，说明表达CCLX10及CCL21并没有显著影响效应细胞的杀伤能力。
实施例2
本实施例的一种表达CXCL10和CCL21的CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞的构建方法：
CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞的构建方法和流程与实施例1中CCLX10-CCL21-HER2.CAR-T细胞基本相同，主要不同之处在于：以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构中的“实体瘤特异性抗原靶点”由实施例1中的“HER2靶点”替换为“EpCAM靶点”。本实施例中EpCAM靶点的scFv片段序列基于四川大学的抗-EpCAM抗体的专利(专利号：CN107602703A)所公布的抗体序列(具体序列如SEQ ID NO:5所示)。
pCDH-Anti-EpCAM scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ、pCDH-Anti-EpCAMscFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-CCLX10-CCL21中的CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ以及CCLX10、CCL21的序列同实施例1的序列；pCDH-Anti-EpCAM scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ及pCDH-Anti-EpCAMscFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-CCLX10-CCL21质粒载体的合成、构建(载体图谱见图5)、验证方法和流程、EpCAM.CAR与CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR的慢病毒包装、纯化与滴度测定方法、EpCAM.CAR-T与CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞的制备方法与实施例1相同。
CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞的相关性能实验如下：
1、CAR-T细胞体外增殖及维持能力：
在使用CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR慢病毒感染T细胞后，分别在第2、4、6、8、10、12天的时间点进行CAR-T细胞数目分析，分析采用流式细胞术，以CD3分子作为门控，使用特异性识别anti-EpCAM.scFv的抗体耦联荧光分子进行流式标记来计算CAR-T细胞数目。EpCAM-CAR病毒与CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞扩增增殖曲线如图6所示，图6中EpCAM.CAR-T细胞为EpCAM-CAR慢病毒制备的CAR-T细胞，CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞为CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞，从图6可以看出，CCLX10及CCL21的表达序列对CD19-CAR分子的表达以及CAR-T细胞的扩增无显著影响。
2、表达CCLX10及CCL21效果评估：
LS174-T结肠腺癌细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)作为靶细胞，先单独培养LS174-T细胞、EpCAM CAR-T细胞、CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞，再分别收集各种细胞进行共培养，具体方法同上述杀伤功能检测。设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，在37℃5％CO2培养箱中共培养10小时，收集200μL共培养上清液，进行ELISA检测，检测项目包括CCLX10及CCL21。从图7中可以看出，CCLX10及CCL21只在CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T效应细胞中有大量分泌，而在其他三组实验中未表达。
4、细胞杀伤实验效果评估：
(1)分别培养LS174-T细胞及PBMC细胞；
(2)实验开始前4天，MOI＝10的EpCAM.CAR和CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR的病毒感染PBMC细胞，培养72-96h后可安排开始实验；
(3)收集靶细胞(LS174-T)5x105cells和效应细胞(CART细胞)3x106cells，800g，6min离心，弃上清；
(4)用1ml 1xPBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；
(5)重复步骤3一次；
(6)用700ul培养基(1640培养基+10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％FBS)重悬靶细胞；
(7)设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；
(8)250xg，5min平板离心；
(9)37℃5％CO2培养箱中培养4小时；
(10)250xg，5min平板离心；
(11)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；
(12)避光孵育25分钟；
(13)每孔加入50ul终止液；
(14)酶标仪检测490nm吸光度；
(15)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸
光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校
正对照吸光值的均值。
(16)将步骤(15)中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)X100％。结果如图8所示，单个核细胞(PBMC)为对照组，EpCAM.CAR-T细胞与CCLX10-CCL21-EpCAM.CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果相似，说明表达CCLX10及CCL21并没有显著影响效应细胞的杀伤能力。
实施例3
本实施例的一种表达CXCL10和CCL21的CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞的构建方法：
CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞的构建方法和流程与实施例1中CCLX10-CCL21-HER2.CAR-T细胞相同基本相同，主要不同之处在于：以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构中的“实体瘤特异性抗原靶点”由实施例1中的“HER2靶点”替换为“GPC3靶点”。本实施例GPC3靶点的scFv片段序列参照专利文献US7919086B2中对应的GPC3抗体的对应的VL fragment核酸序列(具体序列如SEQ ID NO:6所示)。
pCDH-Anti-GPC3scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ及pCDH-Anti-GPC3scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-CCLX10-CCL21中的CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ以及CCLX10、CCL21的序列同实施例1的序列；pCDH-Anti-GPC3scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ、pCDH-Anti-GPC3scFv-CD8αhinge/TM-CD137-CD3ζ-CCLX10-CCL21质粒载体的合成、构建(具体构成如下图9)、验证方法和流程、GPC3.CAR与CCLX10-CCL21-GPC3.CAR的慢病毒包装、纯化与滴度测定方法、GPC3.CAR-T与CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞的制备方法与实施例1相同。
CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞的相关性能实验如下：
1、CAR-T细胞体外增殖及维持能力：
在使用CCLX10-CCL21-GPC3.CAR慢病毒感染T细胞后，分别在第2、4、6、8、10、12天的时间点进行CAR-T细胞数目分析，分析采用流式细胞术，以CD3分子作为门控，使用特异性识别anti-GPC3.scFv的抗体耦联荧光分子进行流式标记来计算CAR-T细胞数目。GPC3-CAR病毒与CCLX10-CCL21-GPC3.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞扩增增殖曲线如图10所示，图10中GPC3.CAR-T细胞为GPC3.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞，CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞为CCLX10-CCL21-GPC3.CAR慢病毒制备的CAR-T细胞，从图10可以看出，CCLX10及CCL21的表达序列对GPC3.CAR分子的表达以及CAR-T细胞的扩增无显著影响。
2、表达CCLX10及CCL21效果评估：
先单独培养靶细胞HepG2细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)、GPC3.CAR-T细胞、CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞，再分别收集各种细胞进行共培养，具体方法同上述杀伤功能检测。设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，在37℃5％CO2培养箱中共培养10小时，收集200μL共培养上清液，进行ELISA检测，检测项目包括CCLX10及CCL21。从图11中可以看出，CCLX10及CCL21只在CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T效应细胞中有大量分泌，而在其他三组实验中未表达。
3、细胞杀伤实验效果评估：
(1)分别培养HepG2细胞及PBMC细胞；
(2)实验开始前4d，MOI＝10的GPC3-CAR和CCLX10-CCL21-GPC3.CAR的病毒感染PBMC细胞，培养72-96h后可安排开始实验；
(3)收集靶细胞(HepG2)5x105cells和效应细胞(CAR-T细胞)3x106cells，800g，6min离心，弃上清；
(4)用1ml 1xPBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；
(5)重复步骤3一次；
(6)用700ul培养基(1640培养基+10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％FBS)重悬靶细胞；
(7)设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；
(8)250xg，5min平板离心；
(9)37℃5％CO2培养箱中培养4小时；
(10)250xg，5min平板离心；
(11)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；
(12)避光孵育25分钟；
(13)每孔加入50ul终止液；
(14)酶标仪检测490nm吸光度；
(15)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。
(16)将步骤(15)中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比；杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)X100％。结果如图12所示，单个核细胞(PBMC)为对照组，GPC3.CAR-T细胞与CCLX10-CCL21-GPC3.CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果相似，说明表达CCLX10及CCL21并没有显著影响效应细胞的杀伤能力。
使用上述实施例方法得到的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞，可以辅助表达CXCL10和CCL21分子，既可以实现对肿瘤细胞的靶向作用，又可以抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，最大程度杀伤实体瘤，实现了对实体瘤的免疫治疗新突破。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽古一生物科技有限公司
<120> 表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用
<130> 2018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaatcaaa ctgccattct gatttgctgc cttatctttc tgactctaag tggcattcaa 60
ggagtacctc tctctagaac tgtacgctgt acctgcatca gcattagtaa tcaacctgtt 120
aatccaaggt ctttagaaaa acttgaaatt attcctgcaa gccaattttg tccacgtgtt 180
gagatcattg ctacaatgaa aaagaagggt gagaagagat gtctgaatcc agaatcgaag 240
gccatcaaga atttactgaa agcagttagc aaggaaaggt ctaaaagatc tccttaa 297
<210> 2
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggctcagt cactggctct gagcctcctt atcctggttc tggcctttgg catccccagg 60
acccaaggca gtgatggagg ggctcaggac tgttgcctca agtacagcca aaggaagatt 120
cccgccaagg ttgtccgcag ctaccggaag caggaaccaa gcttaggctg ctccatccca 180
gctatcctgt tcttgccccg caagcgctct caggcagagc tatgtgcaga cccaaaggag 240
ctctgggtgc agcagctgat gcagcatctg gacaagacac catccccaca gaaaccagcc 300
cagggctgca ggaaggacag gggggcctcc aagactggca agaaaggaaa gggctccaaa 360
ggctgcaaga ggactgagcg gtcacagacc cctaaagggc ca 402
<210> 3
<211> 1668
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccgaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agccagggcg gtccctgaga 120
ctctcctgta cagcttctgg atctgacatt aatgattatc ctattagctg gttccgccag 180
gctccaggga aggggctgga gtgggtaggt ttcattaata gcggtgggtc tacatggtac 240
gcctcgtggg tgaaaggcag attcaccatc tcaagagatg attccaaaag catcgcctat 300
ctgcaaatga acagcctgaa aaccgatgac acagccactt atttctgtgc tagaggatac 360
tccacgtatt atggtgattt taatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcgagc 420
ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gaagcgacgt tgtgatgacc 480
cagtctcctt cctctctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccaagcc 540
agtcagagta ttgatagcaa tttggcctgg tttcagcaga aaccagggaa agcccctaac 600
ctcctgatct atagggcgtc taatttagct agtggggtcc cgtcaaggtt cagcggcagt 660
ggatctggga cagaattcac tctcaccatc agcagcctgg gaagagaaga tgctgcaact 720
tattactgtc ttggaggagt tggaaatgtt tcttacagaa cttcgttcgg ccaagggacc 780
aaggtggaaa tcaaaaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttaac cacgacgcca gcgccgcgac 1020
caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc 1080
ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca 1140
tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt 1200
actgccaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1260
gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1320
ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1380
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1440
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1500
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1560
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1620
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1668
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60
cctagg 66
<210> 5
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagatcaaag gtggtggtgg ttctggcggc 360
ggcggctccg gtggtggtgg ttctgaggtg cagctgctcg agcagtctgg agctgagctg 420
gtaaggccta ggacttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggatacgc cttcactaac 480
tactggctag gttgggtaaa gcagaggcct ggacatggac ttggatggat tggagatatt 540
ttccctggaa gtggtaatat ccactacaat gagaagttca agggcaaagc cacactgact 600
gcagacaaat cttcgagcac agcctatatg cagctcagta gcctgacatt tgaggactct 660
gctgtctatt tctgtgcaag actgaggaac tgggacgagc ctatggacta ctggggccaa 720
gggaccacgg tcaccgtctc ctcc 744
<210> 6
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300
cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaaggcg ggggggggag cggcgggggc 360
ggcagcgggg gcggggggtc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggagctga ggtgaagaag 420
cctggggcct cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cgactatgaa 480
atgcactggg tgcgacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggagc tcttgatcct 540
aaaactggtg atactgccta cagtcagaag ttcaagggca gagtcacgct gaccgcggac 600
gaatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga gatctgagga cacggccgtg 660
tattactgta caagattcta ctcctatact tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 720
tcctca 726

Claims (10)

1.一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)序列选取：
选取CXCL10和CCL21作为目标序列；其中，CXCL10的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，CXCL10的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体：
构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构，整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成；
在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，克隆进入pCDH载体中，得含嵌合抗原受体的pCDH载体；
(3)将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中：
直接将CXCL10及CCL21表达序列进行合成后，克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体，接着对其进行酶切，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定，最终获得含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体；
(4)慢病毒的包装：
先培养293T细胞，再使用Opti-MEM作为转染试剂，通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞；培养一段时间后，进行病毒的收集，并通过超速离心进行浓缩与纯化；
(5)表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备：
在获取供者的抗凝外周血后，离心去除血浆，获取血细胞，再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后，再转移至CD3/CD28anti-body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养；其中，在培养的第2-4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，即可获得目标所需的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中通过NCBI官方网站上获取CXCL10和CCL21的DNA序列作为目标序列。
3.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中实体瘤特异性抗原具体为：表皮生长因子受体3型突变体EGFRvⅢ、人表皮生长因子受体2HER2、EpCAM上皮细胞粘附分子、白介素13受体α2IL13RA、癌胚抗原CEA、间皮素MSLN、成纤维细胞激活蛋白FAP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3、卵泡刺激素受体FSHR、人前列腺特异性膜抗原PSMA、神经节苷脂GD2。
4.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中在嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，其中，前段粘性末端为XbaI酶的酶切位点，末端粘性末端为NotI酶的酶切位点。
5.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中通过NotI与BamH1-F两种限制性内切酶进行酶切。
6.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中慢病毒包装体系具体为商业化的pCDH的慢病毒载体系统，包含1个表达质粒与3个辅助质粒，其中的表达质粒即为步骤(2)中使用的原始PCDH载体；于步骤(4)中使用时，四个质粒的比例为GAG：REV：VSV：含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体＝10:5:2:5:4。
7.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中培养一段时间指培养7天。
8.根据权利要求1所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中使用含有IL2的KBM581培养基进行培养的整个培养流程为14天，在培养的第4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，病毒感染复数MOI值为10。
9.根据权利要求8所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，所述病毒感染复数MOI值为10指：慢病毒：T细胞＝10:1。
10.一种使用如权利要求1-9任一所述的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法得到的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。
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