CN105779480A - 一种携带多位点突变型egfr新抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法和应用 - Google Patents

一种携带多位点突变型egfr新抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体，其构建方法是将野生型EGFR基因酶连到重组腺相关病毒载体中，然后再将EGFR基因中R108K，A289V，S492R，G598V，G719S，S768I，T790M，C797S和L858R位点的碱基进行突变得到重组载体。本发明制备的重组腺相关病毒AAV6具有安全性高、侵染能力强的特点，尤其对于DC细胞具有很好的嗜性；本发明的靶向多位点突变型EGFR新抗原的AAV6‑DC‑CTL细胞免疫治疗方法能有效杀伤EGFR新抗原阳性的肿瘤细胞，并靶向多种突变类型EGFR抗原的肿瘤患者，适用范围广且副作用很小。

Description

一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载 体及构建方法和应用
技术领域
本发明属于重组腺相关病毒载体的构建方法技术领域，具体涉及一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法和该载体在抗肿瘤细胞免疫治疗领域的应用。
背景技术
肿瘤细胞具有无限的增殖能力，其原因在于失控的生长因子信号刺激或异常的生长因子受体表达。表皮细胞生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是一个跨膜蛋白，其胞内结构域属于酪氨酸激酶成员；当EGFR与其配体表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor，EGF)结合后，可激活RAS-RAF-MAPK，PI3K-AKT和PLCγ信号转导途径，从而启动促有丝分裂信号级联反应。EGF/EGFR信号通路的异常激活还会导致肿瘤血管新生和肿瘤转移。研究表明，大多数的上皮细胞肿瘤都表现为EGF/EGFR信号通路的失控，例如大约40-80％的非小细胞肺癌、80-100％的胶质细胞瘤、25-77％的结肠癌中都过表达EGFR；并且EGFR的表达量还与肿瘤的不良预后密切相关。因此，EGFR是一个重要的肿瘤治疗靶点。
目前靶向EGFR的肿瘤治疗药物主要包括两大类：anti-EGFR的单克隆抗体和抑制EGFR激酶活性的小分子。单克隆抗体药物(如Cetuximab和Panitumumab)通过与失活态EGFR的胞外结构域结合，从而封闭其与配体EGF的结合位点，阻止配体诱导的EGFR酪氨酸激酶活性。而小分子药物(如Erlotinib和Gefitinib)的作用机制在于它们能竞争性地与EGFR的胞内激酶催化结构域结合，从而抑制EGFR的自磷酸化和下游信号转导。现在已有数十种靶向EGFR 的药物已经研发出来，在临床试验中表现出了良好的疗效。其中单克隆抗体类药物Cetuximab和Panitumumab，小分子药物Erlotinib和Gefitinib已经成功上市用于治疗转移性非小细胞肺癌、结肠癌、头颈部鳞癌和胰腺癌，但是随着临床使用越来越多其耐药性的问题也随之产生。
随着研究的深入，EGFR靶向治疗耐药性的发生机制逐渐被阐释清楚。临床治疗中EGFR抑制剂抵抗的产生主要由内在的和获得性的因素所导致。内在的因素主要包括EGFR基因的拷贝数、EGFR蛋白的表达量、PI3K/AKT信号通路的异常、K-RAS基因的突变以及EGFR基因的突变。研究发现，Cetuximab对于携带野生型K-RAS基因的转移性结肠癌是有效的，而对于携带突变型K-RAS基因的肿瘤是无效的。PIK3CA基因的突变引起AKT信号转导激活，并导致转移性结肠癌患者对于Panitumumab或Cetuximab靶向治疗产生耐药性。EGFR基因的突变情况与EGFR抑制剂的敏感性密切相关。EGFR基因点突变L858R让非小细胞肺癌细胞对于Gefitinib具有更高的敏感性，而获得性突变T790M则导致患者产生耐药性。目前针对T790M突变导致的耐药性问题，人们又研发了第二代、第三代EGFR抑制剂(如Afatinib、AZD9291、Rociletinib等)，并在临床试验中取得了一定的疗效。然而第三代EGFR抑制剂也面临着新的问题。12例携带T790M的肺癌患者经Rociletinib治疗后，一部分患者的T790转变为野生型并产生耐药性。AZD9291会引发EGFR基因的另一个获得性突变C797S，对于携带C797S突变型EGFR的患者来说目前尚无有效性药物。因此，EGFR基因的点突变尤其是获得性突变是EGFR靶向治疗耐药性发生的主要原因之一，而耐药性是制约靶向治疗效果的关键。
免疫治疗是继手术、放疗、化疗和靶向治疗之后出现的革命性肿瘤疗法，也是近年来肿瘤领域的研究热点。目前靶向EGFR的细胞免疫治疗主要是基于 嵌合型抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)。研究表明，靶向EGFR的CAR-T细胞能有效靶向杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞，并在动物模型中能有效抑制神经胶质瘤细胞的生长。CAR-T治疗的副作用在于“On-target，off-tumor”效应，由于一些EGFR在正常组织中也有少量表达，所以CAR-T治疗可能会导致正常组织的损伤。使用亲和力较低的CAR-T(Nimotuzumab-CAR)能大大减少副作用的发生。由于肿瘤患者通常携带各种EGFR突变体，而正常组织中表达的是野生型EGFR。因此，靶向EGFR突变体的CAR-T治疗则具有明显的优势，使用EGFRvIII作为靶点的CAR-T治疗能有效杀伤携带EGFRvIII抗原的神经胶质瘤细胞，并能抑制肿瘤的复发。除了CAR-T之外，靶向EGFR的CAR-NK治疗也能显著延长荷瘤小鼠的寿命。CAR的设计依赖于靶向EGFR的单克隆抗体，但目前还没有针对EGFR点突变的特异性抗体，因此基于CAR的细胞免疫治疗对于携带EGFR点突变的肿瘤还不适用。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法和应用。由于多种肿瘤中存在EGFR的点突变，且突变的位点在不同肿瘤类型、不同肿瘤患者中存在一定的差异，因此本发明构建了一种携带多位点突变型EGFR新抗原的重组腺相关病毒载体。
为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，是将野生型EGFR基因酶连到重组腺相关病毒载体中，然后再将EGFR基因中R108K，A289V，S492R，G598V，G719S，S768I，T790M，C797S和L858R位点的碱基进行突变得到重组载体。
进一步地，上述所述构建方法具体包括以下步骤：
(1)体外克隆野生型EGFR基因；
(2)将pAAV-MCS载体和步骤(1)中得到的野生型EGFR基因分别用限制性内切酶SalI和Xho I进行双酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带野生型EGFR基因的重组腺相关病毒载体pAAV-EGFRWT；
(3)通过点突变试剂盒或PCR的方法将pAAV-EGFRWT中R108K，A289V，S492R，G598V，G719S，S768I，T790M，C797S和L858R位点的碱基进行突变，得到携带多位点突变型EGFR基因的重组腺相关病毒载体pAAV-EGFRMUT；
(4)测序鉴定。
进一步地，步骤(1)中所述的野生型EGFR完整基因片段(3660bp)的克隆方法是：使用Trizol从人表皮癌细胞株A431中提取总mRNA，逆转录得到总cDNA，以cDNA为模版，在正义链引物
5’-CACGTCGACCTGACTCCGTCCAGTATTGA-3’(具体见SEQID-1)和反义链引物5’-TTTCTCGAGCATACTATCCTCCGTGGTCAT-3’(具体见SEQID-2)的引导下进行PCR反应制得。
进一步地，PCR反应体系为：10μL 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)，4μL dNTPMixture(2.5mM each)，1μL Primer F，1μL Primer R，2μL cDNA，0.5μL PrimeSTAR HS DNAPolymerase，31.5μL dH2O。
进一步地，PCR反应条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸4分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存5分钟。
进一步地，步骤(2)中将野生型EGFR基因酶连到pAAV-MCS载体上的方法是：EGFRWTDNA片段和pAAV-MCS载体分别进行SalI和Xho I的双酶切， 胶回收并测定浓度，然后按照摩尔数10：1的比例将酶切后的EGFRWT和pAAV-MCS进行连接反应，然后将连接产物转化到感受态细菌TOP10中，涂平板挑取单克隆，最后通过测序鉴定出序列完全正确的重组载体即为pAAV-EGFRWT。
进一步地，步骤(3)中pAAV-EGFRWT碱基突变反应过程为：以pAAV-EGFRWT为模板，在下述9对突变引物的引导下依次进行点突变反应，构建多位点突变型EGFR重组质粒pAAV-EGFRMUT；所用突变引物如下：
R108K-F：GAAAACCTGCAGATCATCAAAGGAAATATGTACTACGAA(具体见SEQID-3)；
R108K-R：TTCGTAGTACATATTTCCTTTGATGATCTGCAGGTTTTC(具体见SEQID-4)；
A289V-F：CAAATACAGCTTTGGTGTCAC CTGCGTGAAGAAGT(具体见SEQID-5)；
A289V-R：ACTTCTTCACGCAGGTGACACCAAAGCTGTATTTG(具体见SEQID-6)；
S492R-F：
CGGTCAGAAAACCAAAATTATACGCAACAG-AGGTGAAAACAGCTG(具体见SEQID-7)；
S492R-R：CAGCTGTTTTCACCTCTGTTGCGTATAATTTTGGTTTTCTGACCG(具体见SEQID-8)；
G598V-F：CAAGACCTGCCCGGCAGTAGT CATGGGAGAAAACA(具体见SEQID-9)；
G598V-R：TGTTTTCTCCCATGACTACTGCCGGGCAGGTCTTG(具体见 SEQID-10)；
G719S-F：CAAAAAGATCAAAGTGCTGAGCTCCGGTGCGTTCGGCAC(具体见SEQID-11)；
G719S-R：GTGCCGAACGCACCGGAGCTCAGCACTTTGATCTTTTTG(具体见SEQID-12)；
S768I-F：AGCCTACGTGATGGCCATCGTGGACAACCCCCACG(具体见SEQID-13)；
S768I-R：CGTGGGGGTTGTCCACGATGGCCATCACGTAGGCT(具体见SEQID-14)；
T790M-F：CACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCG(具体见SEQID-15)；
T790M-R：CGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTG(具体见SEQID-16)；
C797S-F：AGCTCATGCCCTTCGGCAGCCTCCTGGACTATGTC(具体见SEQID-17)；
C797S-R：GACATAGTCCAGGAGGCTGCCGAAGGGCATGAGCT(具体见SEQID-18)；
L858R-F：GATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTG(具体见SEQID-19)；
L858R-R：CACCCAGCAGTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTGATC(具体见SEQID-20)。
进一步地，突变反应体系为5μL 10×Reaction buffer，2μL Sample plasmid(10ng/μL，total 20ng)，1μL primer(F)(10pmol/μL)，1μL primer(R)(10pmol/μL)， 2μLdNTP mixture(each 2.5mM)，1μL Muta-direct Enzyme,38μL dH2O。反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸8分钟，共15个循环；最后4℃保存5分钟。
本发明构建的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的应用，是将该重组载体与辅助载体pHelper，pAAV-RC6共转染293AAV细胞制备重组腺相关病毒AAV6，然后侵染DC细胞并诱导特异性杀伤性T细胞，使用AAV6-DC-CTL细胞免疫治疗方法对EGFR新抗原阳性的肿瘤细胞进行杀伤，对EGFR新抗原抗原阳性的肿瘤患者进行治疗。
所述AAV6-DC-CTL细胞免疫治疗技术，其核心是使用制备好的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒AAV6侵染单核-树突状细胞(感染复数MOI：20,000vgs/cell)，48小时后重复侵染一次；然后将此DC细胞与T细胞共培养(细胞个数比为1：10)诱导产生特异性的抗肿瘤活性T细胞；一个星期以后再用AAV6侵染过的DC细胞去刺激T细胞，最后T细胞经过大量扩增，并按照1-3×109cells/m2对多位点突变型EGFR新抗原阳性的肿瘤患者进行回输治疗。
本发明提供的一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法和应用，具有以下有益效果：
(1)本发明制备的重组腺相关病毒AAV6具有安全性高、侵染能力强的特点，尤其对于DC细胞具有很好的嗜性。
(2)本发明的靶向多位点突变型EGFR新抗原的AAV6-DC-CTL细胞免疫治疗方法能有效杀伤EGFR新抗原阳性的肿瘤细胞，并靶向多种突变类型EGFR抗原的肿瘤患者，适用范围广且副作用很小。
(3)按照中和血清类型的不同，重组腺相关病毒可分为11种血清型，不同血清型的重组腺相关病毒表现出不同的组织侵染能力，并且利用AAV6-DC-CTL细胞免疫治疗技术平台，针对多位点突变型EGFR新抗原进行了相关的载体构建、病毒制备和肿瘤杀伤的研究和探索，这对于抗肿瘤的细胞免疫治疗领域来说具有重要的意义。
附图说明
图1为PCR克隆EGFR基因的琼脂糖电泳结果图。
图2为pAAV-MCS质粒的结构示意图。
图3为重组载体pAAV-EGFRMUT的PCR鉴定结果图。
图4为定量PCR测定AAV6病毒基因组滴度的实验结果图。
图5为AAV-DC-CTL细胞免疫治疗的流程图。
图6为树突状细胞表面分子流式分析结果图。
图7为流式细胞仪测定T细胞活化标志物OX40、4-1BB的分析结果图。
图8为CTL细胞体外杀伤肿瘤细胞的分析结果图。
具体实施方式
实施例1重组载体pAAV-EGFRMUT的构建及鉴定
一、材料及来源
1、p AAV-MCS质粒：从美国Cell Biolabs公司购买。
2、A431细胞：从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买。
3、基因扩增引物：根据NCBI数据库中EGFR基因的mRNA序列设计(NM_005228.3)。
4、D NA定点突变试剂盒：购自上海赛百盛基因技术有限公司。
二、构建携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体
本发明使用限制性内切酶将载体的多克隆位点切开，再运用DNA连接技术将EGFRWT基因与载体进行连接反应，得到pAAV-EGFRWT重组载体；然后再通过9个点突变反应得到pAAV-EGFRMUT重组载体，具体过程包括以下步骤：
(1)获取总cDNA，具体方法为：采用Trizol试剂(Life technology公司)从人表皮癌细胞株A431中提取细胞总RNA；首先离心收集细胞(1×107cells)，加入1mL Trizol，按照其操作说明进行提取，RNA沉淀用50μL DEPC-H2O溶解，并测定其浓度，以1μg RNA为模板，进行逆转录反应，逆转录反应体系(20μL)为：1μL Oligo(dT)18，2μL dNTP Mix(10mM each)，1μL RevertAid M-MuL V，1μL RNase Inhibitor，4μL 5×Reaction Buffer；所用试剂盒为Thermo Scientifi公司购买，反应条件为42℃，1小时，得到cDNA，-20℃保存待用；
(2)PCR克隆EGFRWT基因，具体方法为：以上述cDNA为模板，在正义链引物(F):5’-CACGTCGACCTGACTCCGTCCAGTATTGA-3’(具体见SEQID-1)和反义链引物(R)：5’-TTTCTCGAGCATACTATCCTCCGTGGTCAT-3’(具体见SEQID-2)的引导下进行RCR扩增反应，得到EGFRWT基因；PCR扩增体系为：10μL 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，1μL Primer F，1μL Primer R，2μL cDNA，0.5μL PrimeSTAR HS DNAPolymerase，31.5μL dH2O。扩增条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸4分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存5分钟，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在3660bp的位置出现了一条预期的特异性条带(如图1所示)，将该目的条带进行回收纯化处理；
(3)构建pAAV-EGFRWT重组载体：分别对质粒pAAV-MCS(如图2所示)和EGFRWT基因进行限制性内切酶反应，纯化后进行酶连反应，所用限制性内切酶为Sal I和Xho I，均购自NEB公司，酶切反应体系为：1μg pAAV-MCS质粒或EGFRWT基因；1μL Sal I，1μL Xho I，5μL 10×NEB Buffer以及适量去离子水，总体积为50μL；反应条件为：37℃，1.5小时，反应结束后使用AxygenTMAxyprepTMPCR Clean-up Kit试剂盒进行纯化处理，并测定浓度，最后使用T4DNA连接酶进行连接反应，反应体系为：1μL T4DNALigase(购自TaKaRa公司)，2μL 10×Reaction Buffer，0.3pmol EGFRWT基因片段，0.03pmol pAAV-MCS质粒片段，以及适量的去离子水，总体积为20μL；反应条件为16℃，过夜；
(4)转化及涂板：将连接反应产物(5μL)导入至100μL感受态细菌TOP10(天根生物科技公司)中，冰浴30分钟，在42℃热激90秒，然后冰上放置两分钟，加入400μL LB培养基，置于摇床中复苏45分钟(150r/min)；最后取100μL菌液涂在含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃细菌培养箱培养过夜；
(5)质粒提取：挑取单克隆置于5mL LB/Amp培养基，37℃摇床中培养16小时(200r/min)，然后收集细菌，使用Endo-Free Plasmid Mini Kit I试剂盒提取质粒；
(6)点突变反应构建pAAV-EGFRMUT重组载体：以pAAV-EGFRWT为模板，在各突变引物的引导下依次进行9个点突变反应，构建多位点突变型EGFR重组质粒pAAV-EGFRMUT，突变位点为R108K，A289V，S492R，G598V，G719S，S768I，T790M，C797S，L858R，反应体系为：5μL 10×Reaction buffer，2μL Sample plasmid(10ng/μL，total 20ng)，1μL primer(F)(10pmol/μL)，1μL primer(R)(10pmol/μL)，2μL dNTP mixture(each 2.5mM)，1μL Muta-directEnzyme,38μL dH2O。反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸8分钟，共15个循环；最后4℃保存5分钟，所用突变引物如下：
R108K:AGA-AAA
F:GAAAACCTGCAGATCATCAAAGGAAATATGTACTACGAA(具体见SEQID-3)
R:TTCGTAGTACATATTTCCTTTGATGATCTGCAGGTTTTC(具体见SEQID-4)
A289V:GCC-GTC
F:CAAATACAGCTTTGGTGTCACCTGCGTGAAGAAGT(具体见SEQID-5)
R:ACTTCTTCACGCAGGTGACACCAAAGCTGTATTTG(具体见SEQID-6)
S492R:AGC-CGC
F:CGGTCAGAAAACCAAAATTATACGCAACAGAGGTGAAAACAGCTG(具体见SEQID-7)
R:CAGCTGTTTTCACCTCTGTTGCGTATAATTTTGGTTTTCTGACCG(具体见SEQID-8)
G598V:GGA-GTA
F:CAAGACCTGCCCGGCAGTAGTCATGGGAGAAAACA(具体见SEQID-9)
R:TGTTTTCTCCCATGACTACTGCCGGGCAGGTCTTG(具体见SEQID-10)
G719S:GGC-AGC
F:CAAAAAGATCAAAGTGCTGAGCTCCGGTGCGTTCGGCAC(具体见SEQID-11)
R:GTGCCGAACGCACCGGAGCTCAGCACTTTGATCTTTTTG(具体见SEQID-12)
S768I:AGC-ATC
F:AGCCTACGTGATGGCCATCGTGGACAACCCCCACG(具体见SEQID-13)
R:CGTGGGGGTTGTCCACGATGGCCATCACGTAGGCT(具体见SEQID-14)
T790M:ACG-ATG
F:CACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCG(具体见SEQID-15)
R:CGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTG(具体见SEQID-16)
C797S:TGC-AGC
F:AGCTCATGCCCTTCGGCAGCCTCCTGGACTATGTC(具体见SEQID-17)
R:GACATAGTCCAGGAGGCTGCCGAAGGGCATGAGCT(具体见SEQID-18)
L858R:CTG-CGG
F:GATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTG(具体见SEQID-19)
R:CACCCAGCAGTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTGATC(具体见SEQID-20)
三、重组载体的鉴定
1、PCR鉴定：以提取的质粒为模板，使用上述提到的正义链引物(F)(具体见SEQID-1)和反义链引物(R)(具体见SEQID-2)进行PCR反应，产物中出现EGFR特异性片段则表明重组质粒构建成功；PCR扩增体系和反应条件与上述提及的一致，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％)，观察在3660bp处是否出现一条特异性条带(如图3所示)。
由图3可知，在3660bp处出现一条特异性条带，说明重组载体构建成功。
2、DNA测序鉴定：将提取的质粒送样测序，测序引物为：
CMV-F：5’-CGCAAAT-GGGCGGTAGGCGTG-3’(具体见SEQID-21)；
Reverse：5'-TAAAGCATCGAGATCGCAGG-3'(具体见SEQID-22)。
使用NCBI Blast进行序列比对，测序得到的序列与EGFR基因序列100％吻合，并且相应位点的突变也与预期一致，进一步证明上述构建的pAAV-EGFRMUT重组载体是正确的。
实施例2重组腺相关病毒的制备
一、材料及来源
1、实施例1构建的pAAV-EGFRMUT重组载体。
2、辅助载体pAAV6-RC6和pHelper：均购自Cell Biolabs公司。
3、293AAV细胞：购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
4、Polyethylenimine(PEI)：购自Polysciences公司(Cat#23966)。
5、OPTI-MEM培养基：购自Life technology公司。
6、OptiPrepTMDensity Gradient Medium(碘克沙醇)和Benzonase：购自Sigma公司。
二、重组腺相关病毒(AAV6)的制备及鉴定
本实施例的重组腺相关病毒AAV6，其制备方法是将重组载体pAAV-EGFRMUT和辅助载体pAAV6-RC6、pHelper共转染到293AAV细胞中，收集病毒颗粒并纯化鉴定，具体过程包括以下步骤：
(1)质粒提取：制备符合临床使用级别和数量的质粒pAAV-EGFRMUT，pAAV6-RC6，pHelper；
(2)细胞转染：使用聚醚酰亚胺(PEI)转染法将上述三种质粒共转染到293AAV细胞中，转染前24小时，细胞传代至15cm dish中(密度3×105cells/mL)，培养基(DMEM高糖，购自Hyclone)体积为22.5mL(不含抗生素)；转染前3-4小时换液(20mL)，转染体系包括：在1.7mL EP管中加入500μL OPTI-MEM(37℃预热)，然后按摩尔比1:1:1的比例加入如下质粒，13μg pHelper，7.5μg pAAV-RC6，7.5μg pAAV-EGFRMUT；然后再加入110μL PEI(1mg/mL)，PEI与DNA的比例为4:1(v:w)；将DNA/PEI混合溶液简单地漩涡震荡混匀，然后室温放置15分钟后将DNA/PEI混合溶液逐滴加入培养皿中，并轻轻的旋转培养皿以便转染混合物能均匀的分布到培养基中(DMEM高糖，购自Hyclone)；
(3)病毒收集：将转染好的细胞置于CO2培养箱中培养72小时，然后收集细胞，在乙醇+干冰和37℃水浴中反复冻融三次，在细胞裂解液中加入核酸酶Benzonase(终浓度50U/mL)，37℃孵育30分钟；3700g离心20分钟(4℃)收集上清，即为病毒粗提液；
(4)病毒的纯化：使用不连续的碘克沙醇密度梯度离心法(iodixanol gradients)纯化病毒粗提液；402,000g离心1小时(4℃)，收集病毒浓缩层液体；使用肝素亲和层析法进一步纯化AAV6；
(5)病毒的鉴定：通过定量PCR的方法鉴定AAV6的颗粒数(viral genomes，vgs)。以pAAV-EGFRMUT重组质粒作为标准品，测定质粒浓度并计算拷贝数：拷贝数(Copies/μL)＝质粒浓度(ng/μL)×10-9×6.02×1023(阿伏伽德罗常数)/质粒分子量。以107、106、105和104拷贝数质粒作标准曲线计算AAV6的基因组滴度。所用引物为：
正义链引物：5’-CGCCTGCTTGAG-TTCTACCT-3’(具体见SEQID-23)；
反义链引物：5’-GGAGACAGGAGCTGATGGAG-3’(具体见SEQID-24)。
如图4所示，标准曲线能很好地拟合拷贝数和扩增循环数(CT)，而本发明的AAV6样品的CT值为19.0，由此可计算出其拷贝数为6.4×1010(样品稀倍数为106)。
实施例3pAAV-EGFRMUT重组载体导入树突状细胞的肿瘤杀伤实验
一、材料及来源
1、重组腺相关病毒(AAV6)：按实施例2进行制备。
2、AIM-V细胞培养基：购自Lonza公司。
3、细胞因子：GM-CSF、IL-4、IL-2和TNFα，均购自Peprotech公司。
4、CD3抗体(OKT3)：购自Life Technology公司。
5、CD80、CD86、OX40和4-1BB流式检测抗体：购自eBioscience公司。
二、AAV6侵染树突状细胞
如图5所示，本实施例pAAV-EGFRMUT重组载体导入树突状细胞的肿瘤杀 伤实验的整个过程包括以下步骤：
1、取肿瘤患者外周血50-150mL，使用淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞(PBMC)，使用AIM-V培养基重悬，置于37℃细胞培养箱中培养2小时；
2、将悬浮细胞转移至新的培养皿，PBS洗涤三次，贴壁细胞即为单核细胞(monocyte)；悬浮细胞即淋巴细胞，使用含IL-2(20IU/mL)和OKT3(100ng/mL)的AIM-V培养基继续培养；
3、在单核细胞中加入制备好的重组腺相关病毒(感染复数MOI：20,000vgs/cell)，同时加入GM-CSF(50ng/mL)和IL-4(100ng/mL)，37℃培养4小时；
4、去除步骤3中旧的培养基，补充含GM-CSF(50ng/mL)、IL-4(100ng/mL)和TNFα(50ng/mL)的AIM-V培养基，继续培养5天，即可收获成熟的树突状细胞；
5、将成熟的树突状细胞与T淋巴细胞共培养(DC细胞与T细胞的数量比为1：10)，培养基为含IL-2(20IU/mL)的AIM-V；7天后再用AAV6侵染过的DC细胞去刺激T淋巴细胞；
6、树突状细胞表面分子CD80、CD86的检测，使用流式细胞仪进行定量分析，以确定树突状细胞的功能。
如图6所示，树突状细胞表面CD80、CD86的表达均显著升高，阳性率分别为88.1％和90.3％，图中灰色曲线区域为抗体同型阴性对照。
三、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外杀伤实验
1、成熟的树突状细胞与T淋巴细胞共培养(1：10)结束后，使用流式细 胞仪分析细胞表面OX40、4-1BB分子的表达性。
如图7所示，流式测定的结果为表面分子OX40、4-1BB的表达阳性率分别43.9％、30.1％，这表明成熟的树突状细胞可刺激T细胞的激活。激活的CTL细胞用于后续体外杀伤实验。
2、使用51Cr(铬-51)释放实验方法检测CTL细胞与肿瘤细胞共培养一定时候后肿瘤细胞的死亡率。具体实验步骤为：
A、标记靶细胞：取培养对数生长期的靶细胞4×106/mL，加入100-200uCi 51Cr，37℃水浴2小时，每隔15min振摇一次；然后用含5％FBS的RPMI-1640(购自Hyclone)培养液洗涤三次，除去游离的51Cr。所用靶细胞包括：携带EGFR突变体的肿瘤细胞株H3255(非小细胞肺癌)、U251(神经胶质瘤)、HT29(结肠癌)、TE-1(食管癌)和PANC-1(胰腺癌)，以及不表达EGFR的肿瘤细胞株Hela(宫颈癌)。
B、CTL与肿瘤细胞共培养：标记后的靶细胞按照1×103/well的密度铺在96孔板中，然后加入CTL细胞(CTL细胞与靶细胞数量比为10:1)，37℃5％CO2培养箱培养，共培养时间为4小时。
C、测定：每孔吸出50μL培养上清置于检测管中，在γ-计数仪上测定上清液的每分钟放射性活性(cpm值)。杀伤活性＝(实验孔cpm平均值-自然释放孔cpm平均值)/(最大释放孔cpm平均值-自然释放孔cpm平均值)。
如图8所示，使用AAV6-DC-CTL可有效杀伤EGFR抗原阳性的肿瘤细胞，细胞死亡率为65％-85％，而对EGFR抗原阴性的肿瘤细胞没有杀伤作用。

Claims (10)

1.一种携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，将野生型EGFR基因酶连到重组腺相关病毒载体中，然后再将EGFR基因中R108K，A289V，S492R，G598V，G719S，S768I，T790M，C797S和L858R位点的碱基进行突变得到重组载体。
2.根据权利要求1所述的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)体外克隆野生型EGFR基因；
(2)将pAAV-MCS载体和步骤(1)中得到的野生型EGFR基因分别用限制性内切酶Sal I和Xho I进行双酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带野生型EGFR基因的重组腺相关病毒载体pAAV-EGFRWT；
(3)通过点突变试剂盒或PCR的方法将pAAV-EGFRWT中R108K，A289V，S492R，G598V，G719S，S768I，T790M，C797S和L858R位点的碱基进行突变反应，得到携带多位点突变型EGFR基因的重组腺相关病毒载体pAAV-EGFRMUT；
(4)测序鉴定。
3.根据权利要求2所述的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的野生型EGFR基因是通过以下方法制得的：使用Trizol从人表皮癌细胞株A431中提取总mRNA，逆转录得到总cDNA，以cDNA为模版，在正义链引物
5’-CACGTCGACCTGACTCCGTCCAGTATTGA-3’和反义链引物
5’-TTTCTCGAGCATACTATCCTCCGTGGTCAT-3’的引导下进行PCR反应制得。
4.根据权利要求3所述的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：10μL5×PrimeSTAR Buffer，4μL dNTPMixture，1μL Primer F，1μL Primer R，2μL cDNA，0.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase，31.5μL dH2O。
5.根据权利要求3所述的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸4分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存5分钟。
6.根据权利要求2所述的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中将野生型EGFR基因酶连到pAAV-MCS载体上的方法是：EGFRWT DNA片段和pAAV-MCS载体分别进行Sal I和Xho I的双酶切，胶回收并测定浓度，然后按照摩尔数10：1的比例将酶切后的EGFRWT和pAAV-MCS进行连接反应，然后将连接产物转化到感受态细菌TOP10中，涂平板挑取单克隆，最后通过测序鉴定出序列完全正确的重组载体即为pAAV-EGFRWT。
7.根据权利要求2所述的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中pAAV-EGFRWT碱基突变反应过程为：以pAAV-EGFRWT为模板，在突变引物的引导下依次进行点突变反应，构建多位点突变型EGFR重组质粒pAAV-EGFRMUT；所用突变引物如下：
R108K-F：GAAAACCTGCAGATCATCAAAGGAAATATGTACTACGAA；
R108K-R：TTCGTAGTACATATTTCCTTTGATGATCTGCAGGTTTTC；
A289V-F：CAAATACAGCTTTGGTGTCAC CTGCGTGAAGAAGT；
A289V-R：ACTTCTTCACGCAGGTGACACCAAAGCTGTATTTG；
S492R-F：
CGGTCAGAAAACCAAAATTATACGCAACAGAGGTGAAAACAGCTG；
S492R-R：CAGCTGTTTTCACCTCTGTTGCGTATAATTTTGGTTTTCTGACCG；
G598V-F：CAAGACCTGCCCGGCAGTAGTCATGGGAGAAAACA；
G598V-R：TGTTTTCTCCCATGACTACTGCCGGGCAGGTCTTG；
G719S-F：CAAAAAGATCAAAGTGCTGAGCTCCGGTGCGTTCGGCAC；
G719S-R：GTGCCGAACGCACCGGAGCTCAGCACTTTGATCTTTTTG；
S768I-F：AGCCTACGTGATGGCCATCGTGGACAACCCCCACG；
S768I-R：CGTGGGGGTTGTCCACGATGGCCATCACGTAGGCT；
T790M-F:CACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCG,
T790M-R：CGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTG；
C797S-F：AGCTCATGCCCTTCGGCAGCCTCCTGGACTATGTC；
C797S-R：GACATAGTCCAGGAGGCTGCCGAAGGGCATGAGCT；
L858R-F：GATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTG；
L858R-R：CACCCAGCAGTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTGATC。
8.根据权利要求7所述的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，所述的突变反应体系为10×Reaction buffer5μL，浓度为10ng/μL的Sample plasmid 2μL，浓度为10pmol/μL的primer F 1μL，浓度为10pmol/μL的primer R1μL，2μL dNTP mixture，1μL Muta-direct Enzyme,38μL dH2O；反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸8分钟，共15个循环；最后4℃保存5分钟。
9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法构建出的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体。
10.权利要求9所述的携带多位点突变型EGFR新抗原基因的重组腺相关病毒载体在抗肿瘤细胞免疫疗法方面的应用。
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